ES2197582T3

ES2197582T3 - Nuevo triglicerido y composiciones que lo contienen.

Info

Publication number: ES2197582T3
Application number: ES99304789T
Authority: ES
Inventors: Kengo Akimoto; Toshiaki Yaguchi; Shigeaki Fujikawa
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2004-01-01
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: DE69906875D1; EP0965578A1; JP2000008074A; JP4175698B2; DE69906875T2; EP0965578B1; DK0965578T3; CA2275060C; CA2275060A1; US6248909B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN NUEVO TRIGLICERIDO Y UNA COMPOSICION QUE CONTIENE DICHO TRIGLICERIDO CON UNA ESTRUCTURA DEL TIPO DE LA LECHE MATERNA. DICHO TRIGLICERIDO PRESENTA UN ACIDO GRASO SATURADO DE 16-18 ATOMOS DE CARBONO EN POSICION 2, EN POSICION 1 Y/O 3; EL CUAL ES AL MENOS UN ACIDO GRASO INSATURADO EN OM 6, OM 9 U OM 3, OBTENIDO SOMETIENDO A TRANSES TERIFICACION UN GLICERIDO QUE LLEVA UNIDO EN POSICION 2 UN ACIDO GRASO SATURADO DE 16 A 18 ATOMOS DE CARBONO, UTILIZANDO UNA LIPASA Y UN ACIDO GRASO INSATURADO EN OM 6, OM 9 U OM 3.

Description

Nuevo triglicérido y composiciones que lo contienen.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un triglicérido novedoso y a una composición que comprende el mismo, y, más especialmente, a un triglicérido que tiene un ácido graso saturado que tiene de 16 a 18 átomos de carbono en la posición 2 del triglicérido, y que tiene ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 y/u \omega3 en las posiciones 1 y/o 3.

2. Técnica relacionada

La mayoría de los lípidos obtenidos hasta la fecha son grasas neutras que comprenden una mezcla de triglicéridos en la que diversos ácidos grasos se ligan aleatoriamente con enlace éster a las posiciones 1, 2 y 3 del triglicérido. Se ha demostrado que dichos lípidos presentan diferentes propiedades de absorción y actividades fisiológicas según diferencias de las posiciones de enlace de los ácidos grasos. Los lípidos en que ácidos grasos específicos están ligados a posiciones predeterminadas del triglicérido (lípidos estructurados) han atraído considerable atención recientemente.

Por ejemplo, Endo et al. describen, en JAOCS, vol. 74, nº 9 (1997), p. 1.041, numerosos triglicéridos con mezclas de grupos acilo, incluidos los ácidos grasos insaturados eicosapentaenoico y docosahexanoico. Endo et al. estudiaron la resistencia de las diferentes estructuras de los triglicéridos a la oxidación; por ejemplo, durante su almacenamiento o tratamiento.

Daubert y Baldwin describieron, en JACS, vol. 66, nº 9, 1944, p. 1.507, métodos sintéticos para producir triglicéridos que tuvieran grupos ácidos grasos insaturados linoleicos.

Miyashita et al., en Chem. Abstr. 113, 1990, 147.859x, comunicaron un estudio de la susceptibilidad de los monohidropenóxidos de los triacilgliceroles a sustancias entre las que se incluye la lipasa pancreática. Se usaron triacilgliceroles mixtos de los grupos palmitoil/lineoloil y linolenoil.

La publicación de patente examinada japonesa nº 4-12920 describe un triglicérido que tiene la propiedad de digestión y absorción satisfactoria en el que un ácido graso que tiene entre 8 y 14 átomos de carbono está ligado a la posición 2 del triglicérido y ácidos grasos que tienen 18 ó más átomos de carbono están ligados a las posiciones 1 y 3. Además, dado que se sabe que los 2-monoglicéridos son de una forma que es absorbida muy fácilmente por el cuerpo humano, la publicación de patente examinada japonesa nº 5-87497 describe un triglicérido en el que un ácido graso altamente insaturado \omega3 u \omega6 que tiene una función fisiológica está ligado a la posición 2, mientras que ácidos grasos saturados fácilmente hidrolizables por enzimas del tracto digestivo están ligados a las posiciones 1 y 3. Sin embargo, no se describe ni hay indicación de la relación entre las propiedades fisiológicas y la estructura de los triglicéridos de la leche materna humana que tienen ácidos grasos insaturados.

Por otro lado, con respecto a la función fisiológica de los ácidos grasos, la atención se ha centrado en los últimos años en el ácido araquidónico y el ácido docosahexaenoico. Dichos ácidos grasos están contenidos en la leche materna humana y se ha comunicado que son útiles para el desarrollo del lactante (Advances in Polyunsaturated Fatty Acid Research, Elsevier Science Publishers, 1993, pp. 261-264) e importantes para el crecimiento y el desarrollo cerebral del lactante (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1.073-1.077 (1993), Lancet, 344, 1.319-1.322 (1994)).

Varios organismos oficiales han recomendado valores de ingesta (prematuros: ácido araquidónico: 60 mg/kg, ácido docosahexaenoico: 40 mg/kg; lactantes normales: ácido araquidónico: 20 mg/kg, ácido docosahexaenoico: 20 mg/kg de peso corporal/día (OMS-FAO (1994)). En varios países de Europa se han comercializado formulaciones para prematuros que contienen ácido docosahexaenoico y ácido araquidónico producidos por fermentación mezclados como triglicéridos. Sin embargo, no se han considerado las posiciones de enlace del ácido araquidónico ni/o del ácido docosahexaenoico de los triglicéridos añadidos a dichas formulaciones.

La estructura de triglicéridos de la leche materna humana se predice que sea tal que haya una alta proporción de triglicéridos en los que el ácido palmítico (16:0) esté ligado a la posición 2 del triglicérido, y una alta proporción de triglicéridos en los que un ácido graso altamente insaturado o ácido graso de cadena media esté ligado a las posiciones 1 y 3 (Christie, W.W. (1986): The Positional Distribution of Fatty Acids in Triglycerides, Analisis of Oils and Fats, Hamilton, R. J. y Russell, J. B. eds., pp. 313-339, Elsevier Applied Science, Londres). Sin embargo, se trata de meras suposiciones basadas en los resultados del análisis de los ácidos grasos de los triglicéridos, mientras que aún no se ha intentado el aislamiento y análisis estructural de los triglicéridos de la leche materna humana.

Además, aunque se han añadido a la formulación triglicéridos que contienen ácido araquidónico producido por fermentación para permitir que la composición de ácidos grasos se aproxime en mayor grado a la composición de la leche materna humana, según se ha descrito anteriormente, dado que la estructura de dichos triglicéridos que contienen ácido araquidónico es tal que hay una alta proporción de triglicéridos en que el ácido palmítico y otros ácidos grasos saturados están ligados en las posiciones 1 y 3, mientras que los ácidos grasos insaturados están ligados en la posición 2 (J.J. Myher, A. Kuksis, K. Geher, P.W. Park y D.A. Diersen-Schade, Lipids, 31, pp. 207-215 (1996)), la estructura es diferente de la estructura de los triglicéridos presumida en la leche materna humana.

Así, pues, existe un fuerte deseo de desarrollar lípidos de los que se presuma que tienen la estructura de glicéridos de la leche materna humana, y más específicamente, de triglicéridos de los que se haya confirmado fiablemente que tienen una estructura en la que un ácido graso saturado que tenga de 16 a 18 átomos de carbono esté ligado en la posición 2 del triglicérido, mientras que ácidos grasos altamente insaturados o ácidos grasos de cadena media estén ligados en las posiciones 1 y 3.

Resumen de la invención

Así el objeto de la presente invención es proporcionar un triglicérido novedoso que tiene en la posición 2 un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono, y en las posiciones 1 y 3 ácidos grasos insaturados, en el que al menos uno de dichos ácidos grasos insaturados es un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3; o un triglicérido novedoso que tiene en la posición 2 un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono, que tiene en una de las posiciones 1 y 3 un ácido graso saturado de 4 a 18 átomos de carbono, y que tiene en otra posición de las posiciones 1 y 3 un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3; y una composición que contiene dicho triglicérido novedoso.

Como consecuencia de una investigación concienzuda para resolver los referidos problemas, los inventores de la presente invención han hallado que puede fabricarse triglicérido que se estima que es del tipo de los de la leche materna humana a partir de un glicérido del que se ha determinado claramente que tiene un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono en la posición 2, permitiendo que la lipasa que actúa específicamente sobre los enlaces éster en las posiciones 1 y 3 actúe sobre dicho glicérido en presencia de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 o un éster del mismo, con el resultado de que la transesterificación se produce sólo en las posiciones 1 y 3, de modo que se obtiene un triglicérido que tiene en la posición 1 y/o 3 ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 u \omega3. Más aún, al comparar el triglicérido resultante con triglicérido obtenido de la leche materna humana, los presentes inventores también han determinado por primera vez que, de hecho, un triglicérido que tiene un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono está presente en la posición 2 del triglicérido y ácidos grasos altamente insaturados en las posiciones 1 y 3 están presentes en la leche materna humana, conduciendo, de este modo, a la consumación de la presente invención.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un triglicérido novedoso, así como un producto alimentario, un sustituto de la leche humana, un alimento para animales, un producto nutricional terapéutico, una preparación farmacéutica y un reactivo estándar analítico que contienen un triglicérido.

Según el primer aspecto de la presente invención, se proporciona un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
 \rlap{\hskip6cm(I)\hss} \cr  |\cr 
CH _{2} O  -  R ^{2} \cr}

donde R^{1} y R^{2} son grupos acilo de ácidos grasos insaturados que tienen de 18 a 22 átomos de carbono, dichos grupos acilo pueden estar oxidados, y n representa un número entero de 14 a 16, y al menos uno de R^{1} y R^{2} es un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 definido más adelante; o bien, un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
 \rlap{\hskip6cm(II)\hss} \cr  |\cr 
CH _{2}   -  CO-(CH _{2} )   _{m}   -  CH _{3} \cr}

donde R^{3} representa un grupo acilo de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 definido más adelante que tiene de 18 a 22 átomos de carbono, dicho grupo acilo puede estar oxidado, n representa un número entero de 14 a 16, y m representa un número entero de 2 a 16.

El ácido graso que está presente en las posiciones 1 y/o 3 del triglicérido de la presente invención es un ácido graso insaturado \omega3, \omega6 y/u \omega9. Más específicamente, los ácidos grasos insaturados \omega3 incluyen:

\newpage

ácido 9,12,15-octadecatrienoico (ácido \alpha-linolénico) [18:3, \omega3];

ácido 6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico) [18:4, \omega3];

ácido 11,14,17-eicosatrienoico (ácido dihomo-\alpha-linolénico) [20:3, \omega3];

ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico [20:4, \omega3],

ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico [20:5, \omega3];

ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico [22:5, \omega3]; y

ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico [22:6, \omega3].

Asimismo, los ácidos grasos insaturados \omega6 incluyen:

ácido 9,12-octadecadienoico (ácido linoleico) [18:2, \omega6];

ácido 6,9,12-octadecatrienoico (ácido \gamma-linolénico) [18:3, \omega6];

ácido 8,11,14-eicosatrienoico (ácido dihomo-\gamma-linolénico) [20:3, \omega6];

ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico) [20:4, \omega6];

ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico [22:4, \omega6]; y

ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico [22:5, \omega6];

Igualmente, los ácidos grasos insaturados \omega9 incluyen:

ácido 6,9-octadecadienoico [18:2, \omega9];

ácido 8,11-eicosadienoico [20:2, \omega9]; y

ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead) [20:3, \omega9].

Igualmente, los residuos acilo pueden ser residuos acilo hidroxilados, epoxidados, o hidroxiepoxidados.

El ácido graso que está presente en la posición 2 del triglicérido novedoso de la presente invención es un ácido graso que tiene de 16 a 18 átomos de carbono, como ejemplos de éste se incluyen el ácido palmítico (16:0) y el ácido esteárico (18:0).

Entre los triglicéridos representativos de la presente invención se incluyen:

Triglicérido de 1,3-diaraquidonil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-docosahexaenoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1,3-didocosahexaenoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-(dihomo-\gamma-linolenil)-3-docosahexaenoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-docosahexaenoil-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-(dihomo-\gamma-linolenil)-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-(dihomo-\gamma-linolenil)-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1,3-bis(dihomo-\gamma-linolenil)-2-palmitoilo,

triglicérido de 1,3-bis(5,8,11-eicosatrienoil)-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-(5,8,11-eicosatrienoil)-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-(5,8,11-eicosatrienoil)-2-palmitoilo, y

triglicérido de 1-docosahexaenoil-3-(5,8,11-eicosatrienoil)-2-palmitoilo.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un producto alimentario, un sustituto de la leche humana, un alimento para animales, un producto nutricional terapéutico y una preparación farmacéutica y un reactivo estándar analítico que contienen un triglicérido según el primer aspecto; un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

donde R^{1} y R^{2} son grupos acilo que pueden estar oxidados, de ácidos grasos insaturados que tienen de 18 a 22 átomos de carbono, y n representa un número entero de 14 a 16, y al menos uno de R^{1} y R^{2} es un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3; o

un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

donde R^{3} representa un grupo acilo, que puede estar oxidado, de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 que tiene de 18 a 22 átomos de carbono y n representa un número entero de 14 a 16, y m representa un número entero de 2 a 16.

El triglicérido novedoso de la presente invención puede fabricarse permitiendo que una lipasa que actúa específicamente sobre los enlaces éster de las posiciones 1 y 3 del triglicérido actúe sobre un triglicérido que tenga un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono ligado en la posición 2, dando lugar a la transesterificación con un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 o un éster del mismo.

Si bien entre los ejemplos de triglicérido que tiene un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono ligado a la posición 2 se incluyen la tripalmitina (en la que el ácido palmítico (16:0) está ligado en las posiciones 1, 2 y 3) y la triestearina (en la que el ácido esteárico (18:0) está ligado en las posiciones 1, 2 y 3), no es necesario que todos los ácidos grasos ligados con enlace éster del triglicérido sean el mismo. Cualquier ácido graso o cualquier combinación de ácidos grasos que tengan de 4 a 18 átomos de carbono pueden ligarse en las posiciones 1 ó 3, siempre que un ácido graso saturado que tenga de 16 a 18 átomos de carbono se ligue en la posición 2 del triglicérido.

Dado que el aceite o las grasas que tienen ácidos saturados de 16 o más átomos de carbono como ácidos grasos constituyentes tienen un punto de fusión elevado, puede ser necesario elevar la temperatura de reacción. Por ejemplo, en el caso de usar tripalmitina, aunque variando según la composición de la mezcla de reacción, la reacción podría tener que llevarse a cabo a entre 50 y 70ºC. Sin embargo, una temperatura tan alta podría causar la inactivación del enzima y la desnaturalización del ácido graso insaturado añadido para la transesterificación. Por tanto, se prefiere usar inicialmente aceite o grasa que tenga en las posiciones 1 y/o 3 ácidos grasos de punto de fusión bajo de 8 a 12 átomos de carbono, ácido oleico, ácido linoleico, etc. para la transesterificación y que la transesterificación se lleve a cabo a una temperatura de 45ºC o menor.

El triglicérido de la presente invención que tiene en la posición 2 un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono puede tener en cualquiera de las posiciones 1 y 3 un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 según se han definido anteriormente. Un triglicérido que tiene un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 sólo en una de las posiciones 1 ó 3 puede convertirse en un triglicérido correspondiente que tenga los mismos o diferentes ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 u \omega3 en ambas posiciones, 1 y 3.

Por ejemplo, pueden obtenerse triglicéridos que tengan ácido graso saturado en la posición 2 y ácido graso insaturado en una de las posiciones 1 ó 3 cultivando los géneros Crypthecodenium, Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, Japonochytorium o Haliphthoros.

A partir de dichos triglicéridos puede aislarse, por ejemplo, el triglicérido 1,2-dipalmitoil-3-docosahexaenoil. Cuando una lipasa específica de las posiciones 1 y 3 actúa sobre dicho glicérido dando lugar a la transesterificación con un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 o un éster del mismo, el docosahexanoato de la posición 3 no es transesterificado, mientras que sólo el palmitato de la posición 1 se transesterifica para proporcionar un triglicérido que tiene ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 en la posición 1, ácido palmítico en la posición 2 y ácido docosahexaenoico en la posición 3. Más especialmente, si se usa ácido araquidónico como dicho ácido graso insaturado que será transesterificado, se obtiene un triglicérido que tiene ácido araquidónico en la posición 1, ácido palmítico en la posición 2 y ácido docosahexaenoico en la posición 3.

En la presente invención, puede usarse una lipasa que actúa específicamente sobre las posiciones 1 y 3 del triglicérido como catalizador. Aunque no hay limitaciones específicas sobre dicha lipasa, ejemplos de la misma son la lipasa producida por un microorganismo que pertenezca al género Rhizopus, Rizomucor, Mucor, Penicillium, Aspergillus, Humicola, o Fusarium, así como lipasa pancreática porcina. También pueden usarse productos comercialmente disponibles para obtener dicha lipasa.

Ejemplos de lipasa disponibles comercialmente son la lipasa de Rhizopus delemar (Tanabe Pharmaceutical, Dalipase), lipasa de Rhizomucor miehei (Novo Nordisk, Ribozyme IM), lipasa de Aspergillus niger (Amano Pharmaceutical, Lipase A), lipasa de Humicola lanuginosa (Novo Nordisk, Lipolase), lipasa de Mucor javanicus (Amano Pharmaceutical, Lipase M)y lipasa de Fusarium heterosporum. Dichas lipasas pueden usarse en su forma nativa, o en la forma de lipasa que ha sido inmovilizada en Cellite, resina de intercambio iónico, o un portador cerámico.

La cantidad de agua añadida al sistema de la reacción es extremadamente importante. La transesterificación no avanza en ausencia absoluta de agua, mientras que, si la cantidad de agua es excesiva, se produce hidrólisis, se reduce la tasa de recuperación de triglicérido, o se produce la transferencia espontánea del grupo acilo en un glicérido parcialmente acilado, dando lugar a la transferencia del ácido graso saturado de la posición 2 a la posición 1 ó 3. Así, al usar un enzima inmovilizado que no tenga agua ligada, es eficaz activar primero el enzima usando un sustrato al que se haya añadido agua antes de llevar a cabo la reacción, y luego usar un sustrato al que no se añade agua durante la reacción. Con el fin de activar el enzima en reacciones por etapas debería usarse para pretratar el enzima un sustrato que contenga agua a entre el 0 y el 1.000% (porcentaje en peso) de la cantidad de enzima añadido, y en el caso de activación por un método de columna, debería permitirse que un sustrato saturado de agua fluyera continuamente a través de la columna.

Por ejemplo, la cantidad de agua en una reacción por etapas para activar lipasa de Rhizopus delemar (Tanabe Pharmaceutical, Dalipase) inmovilizada en Cellite o un portador cerámico es de 10 a 200% (porcentaje en peso) de la cantidad de enzima añadido. Sin embargo, la cantidad de agua requerida para la activación de un enzima para la reacción de transesterificación está muy influida por el tipo de enzima usado. Por ejemplo, el agua no es un requisito sustancial si se usa lipasa de Rhizomucor miehei (Novo Nordisk, Lipozyme IM), sino que, por el contrario, ha de extraerse todo exceso de agua. El exceso de agua debería extraerse hidrolizando un triglicérido que no perjudique la reacción primaria para el sustrato.

La cantidad de lipasa usada en una reacción por etapas puede determinarse de acuerdo con las condiciones de la reacción. Aunque no hay limitaciones especiales sobre la cantidad de lipasa, es adecuado de 1 a 30% (porcentaje en peso) de la mezcla de la reacción es adecuado cuando se usa, por ejemplo, lipasa de Rhizopus delemar o lipasa de Rhizomucor miehei inmovilizada en Cellite o un portador cerámico.

La transesterificación en una reacción por etapas se efectúa de acuerdo con el método descrito a continuación. A saber, se añade un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 o un éster del mismo a un triglicérido que tiene un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono ligados en la posición 2. Ejemplos de ésteres de ácidos grasos que pueden usarse incluyen ésteres de metilo, ésteres de etilo, ésteres de propilo y ésteres de butilo. La relación entre triglicérido / ácido graso o triglicérido / éster de ácido graso usados como materiales de partida es, convenientemente, de 1:0,5-20. Una cantidad adecuada de lipasa activada o deshidratada que actúe específicamente sobre las posiciones 1 y 3 (normalmente 5.000 a 50.000 U/g; 1 U de lipasa es la cantidad de enzima que libera 1 \mumol de ácido graso por minuto usando aceite de oliva como sustrato) se añade al sustrato, y a continuación se lleva a cabo la transesterificación durante de 2 a 100 horas a 20 a 72ºC, mientras se agita o sacude.

El referido enzima inmovilizado puede usarse repetidamente. A saber, la reacción puede continuarse dejando el enzima inmovilizado en el recipiente de reacción después de la reacción y sustituyendo la mezcla de reacción por mezcla de reacción recién preparada que comprenda sustrato. Además, para la transesterificación por un método de columna, puede permitirse a una mezcla de reacción que contenga sustrato fluir continuamente a una velocidad de 0,05 a 20 ml/h por gramo de enzima.

Además, el contenido del triglicérido buscado puede aumentarse efectuando la transesterificación repetidamente. A saber, se permite que una lipasa que actúe específicamente sobre las posiciones 1 y 3 del triglicérido actúe en presencia de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 o un éster del mismo para obtener una mezcla de reacción en la que los ácidos grasos de las posiciones 1 y 3 son transesterificados para proporcionar ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 y/u \omega3.

A continuación, el triglicérido se purifica de dicha mezcla de reacción de acuerdo con el método que se describirá más adelante, y se efectúa otra vez la transesterificación con ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 o un éster usando dicho triglicérido purificado como material de partida. El contenido del triglicérido buscado puede aumentarse drásticamente repitiendo dicha transesterificación, y la transesterificación debería repetirse preferiblemente de 2 a 5 veces.

En la transesterificación que usa una lipasa inmovilizada convencional, un grupo acilo del ácido graso ligado en la posición 2 de un glicérido parcialmente esterificado formado por hidrólisis que se produce como reacción lateral se transfiere a otra posición. En la presente invención, la hidrólisis puede suprimirse casi completamente y la cantidad de glicérido parcialmente esterificado formada es aproximadamente 1%, solucionándose, así, el problema de la técnica anterior. Además, si el contenido de agua contenido en el sustrato no es mayor de varios miles de ppm, se puede ignorar la hidrólisis que se produce como reacción lateral, y no es necesario un control exacto del contenido de agua del sustrato.

Es más, a diferencia de la disminución de la actividad del enzima después de varios usos en reacciones en disolvente orgánico o reacciones a 50ºC o más que usan un enzima inmovilizado en un proceso convencional, la inactivación del enzima no se produce en un sistema de reacción de la presente invención, en el que la reacción se lleva a cabo a 45ºC o menos, y no se usa disolvente orgánico, lo que hace posible usar el enzima más de 20 veces en reacciones por etapas, y durante más de 100 días en reacciones en columna.

Debido al uso de un sustrato simple en la presente invención, los triglicéridos obtenidos en la reacción comprenden unas pocas especies de moléculas. Por tanto, el triglicérido buscado puede aislarse fácilmente por métodos habituales tales como cromatografía líquida, destilación molecular, fraccionamiento por membrana aguas abajo o superfraccionamiento al vacío, o una combinación de los mismos. Los triglicéridos fabricados en la presente invención son triglicéridos en los que se liga ácido graso insaturado en las posiciones 1 y/o 3, y dichos triglicéridos existen en forma de mezcla con glicéridos de partida sin reaccionar, ácido graso insaturado sin reaccionar o éster del mismo, y ácidos grasos o ésteres de los mismos liberados por transesterificación desde las posiciones 1 y/o 3 del triglicérido de partida formado.

Por tanto, la purificación del triglicérido buscado, que tiene ácidos grasos insaturados ligados en las posiciones 1 y/o 3 y un ácido graso saturado de 16 a 18 átomos de carbono ligado en la posición 2, puede efectuarse por desacidificación alcalina, destilación por vaporización, destilación molecular, fraccionamiento por membrana aguas abajo, superfraccionamiento al vacío, cromatografía de columna, extracción por disolvente o separación de membrana, o una combinación de los mismos, para extraer los referidos ácidos grasos liberados por la transesterificación y los ácidos grasos sin reaccionar.

Dado que un triglicérido obtenido en la presente invención que tenga un resto de ácido palmítico ligado en la posición 2 y restos de ácido araquidónico y/o ácido docosahexaenoico en las posiciones 1 y 3 se considera que tiene la misma estructura de triglicérido que se encuentra en la leche materna humana, puede usarse eficazmente para formulaciones para prematuros, formulaciones para lactantes, suplementos lácteos, o formulaciones para mujeres gestantes o lactantes. A saber, un triglicérido de la presente invención que tenga ácido palmítico en la posición 2 y ácido araquidónico y/o ácido docosahexaenoico en las posiciones 1 y/o 3 puede añadirse al proceso de fabricación o al producto acabado de una formulación tal como una formulación para prematuros, formulación para lactantes o suplemento lácteo, una formulación para obtener productos que se aproximan más aún a la leche materna humana.

La presente invención no sólo proporciona triglicéridos que tienen los mismos ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 u \omega3 en las posiciones 1 y 3, que es la misma estructura que la de los triglicéridos de la leche materna humana y útil como fuente de ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 y \omega3, sino también triglicéridos que tienen distintos restos ácidos grasos insaturados \omega6, \omega9 u \omega3 en las posiciones 1 y 3, tales como triglicérido que tenga un ácido graso insaturado \omega6, tal como el ácido araquidónico, en la posición 1, y un ácido graso insaturado \omega3 tal como ácido docosahexaenoico en la posición 3, que es más útil como fuente de ácidos grasos insaturados porque una molécula de triglicérido proporciona dos ácidos grasos insaturados diferentes.

Además de la formulación para administrar a prematuros y lactantes, otros posibles usos de los triglicéridos de la presente invención incluyen su adición a la leche, leche de soja, y otros productos lácteos, así como su adición a productos que usen aceites o grasas. Ejemplos de productos que usan aceites o grasas son alimentos naturales tales como la carne, el pescado, los aceites y grasas de frutos secos, la comida china, los fideos, sopas y otros alimentos a los que se añade aceite o grasa durante su preparación, comida japonesa frita, alimentos fritos, requesón de soja frito, arroz frito, rosquillas, confitería frita y otros alimentos en los que se usa aceite o grasa como medio de calentamiento, mantequilla, margarina, mayonesa, aderezo de ensalada, chocolate, fideos instantáneos, caramelo, galletas, helado y otros alimentos aceitosos o alimentos a los que se añadan grasas o aceites durante su elaboración, y bollos rellenos de dulce de soja y otros alimentos sobre los que se rocíe aceite o grasa, o que se revistan de aceite o grasa, durante la fase final de su elaboración.

Otros ejemplos son pan, fideos, arroz, confitería, alimentos elaborados a partir de los mismos, y otros productos agrícolas, vino de arroz, vino de arroz medicinal y otros alimentos fermentados, vino de arroz endulzado, vinagre, salsa de soja, pasta de soja fermentada, aderezo de ensalada, yogur, jamón, panceta, embutido, mayonesa y otros productos alimentarios cárnicos, pescado prensado, marisco frito, pastel de pescado y otros productos alimentarios marinos, y zumos de frutas, refrescos, bebidas para deportistas, bebidas alcohólicas, té y otras bebidas.

Además, en el caso de usarse como alimentos saludables o alimentos funcionales, si bien la forma puede ser la de las formas farmacéuticas indicadas más adelante o la de los alimentos o bebidas indicados anteriormente, también pueden tener una forma elaborada tal como la de alimentos líquidos naturales, alimentos nutricionales semidigeridos, alimentos o bebidas nutritivos componentes, que contengan proteínas (aunque proteínas tales como la proteína láctea, proteína de soja, y albúmina de clara de huevo, que tienen aminoácidos equilibrados y un alto valor nutritivo, se usan comúnmente como fuentes de proteínas, también pueden usarse sus productos de descomposición, oligopéptidos de la clara del huevo, hidrolizados de soja, o mezclas de aminoácidos individuales), azúcares, lípidos, oligoelementos, vitaminas, emulgentes, aromas, etcétera.

Los productos alimentarios y bebidas de la presente invención pueden elaborarse y producirse de acuerdo con métodos de producción ordinarios añadiendo una cantidad prescrita de triglicérido de la presente invención. La cantidad de la adición varía de acuerdo con la forma farmacéutica, la forma del producto alimentario y las propiedades físicas. Si bien la cantidad añadida es preferiblemente de 0,01 a 50% en general, no hay limitaciones especiales sobre dicha cantidad. Además, en el caso de su ingesta como alimento saludable o alimento funcional, el triglicérido de la presente invención puede administrarse a pacientes en la forma de alimento funcional elaborado in situ añadiendo un triglicérido novedoso de la presente invención durante la elaboración de los alimentos hospitalarios bajo la supervisión de un nutricionista de acuerdo con el régimen dietético prescrito por un facultativo basado en la función fisiológica y concentración de los ácidos grasos altamente insaturados ligados en las posiciones 1 y 3 del triglicérido de la presente invención.

En el caso de usar el triglicérido de la presente invención como producto farmacéutico, la forma de administración puede ser cualquier forma siempre que la administración oral o parenteral se efectúe adecuadamente, ejemplos de tales formas son soluciones para inyección, soluciones para transfusión, polvos, gránulos, comprimidos, cápsulas, píldoras de cobertura entérica, pastillas, preparados líquidos internos, suspensiones, emulsiones, jarabes, preparados líquidos externos, apósitos, gotas nasales, inhaladores, ungüentos, lociones y supositorios. Dichas formas pueden usarse o bien solas o en combinación, de acuerdo con los síntomas.

Cada una de dichas preparaciones puede prepararse usando un auxiliar conocido que pueda usarse normalmente en el campo de la preparación farmacéutica, incluidos, vehículos, aglutinantes, antisépticos, estabilizadores, agentes de descomposición, lubricantes y correctores, preparándose el fármaco primario según el objetivo de acuerdo con métodos habituales.

Aunque la dosis varía según el objetivo de la administración, los ácidos grasos ligados en las posiciones 1 y 3 del triglicérido (actividad fisiológica, concentración, etc.) y el estado del paciente que recibe la administración (sexo, edad, peso corporal, etc.), la dosis normal para adultos en el caso de administración oral es de 0,01 mg a 10 g, preferiblemente de 0,1 mg a 2 g, y más preferiblemente de 1 mg a 200 mg por día como cantidad total de lípido estructurado de la presente invención, y en el caso de administración parenteral, de 0,001 mg a 1 g, preferiblemente de 0,01 mg a 200 mg, y más preferiblemente de 0,1 mg a 100 mg por día como cantidad total de lípido estructurado de la presente invención, y dichas dosis pueden ajustarse convenientemente dentro de los intervalos referidos.

Asimismo, el triglicérido de la presente invención puede ser un triglicérido que no haya sido aislado o sintetizado previamente, y puede usarse como una sustancia estándar analítica.

Ejemplos

A continuación se ofrece una explicación detallada de la presente invención por medio de sus ejemplos.

Asimismo, los ácidos grasos y triglicéridos se indican con las siguientes abreviaturas en los presentes ejemplos por motivos de comodidad. En primer lugar, se usan las siguientes como abreviaturas de un sola letra que representan ácidos grasos: 8: ácido caprílico, P: ácido palmítico, A: ácido araquidónico, M: ácido de Mead, D: ácido docosahexaenoico. A continuación se describen los triglicéridos con tres letras, que constan de una abreviatura de una sola letra que representa el ácido graso ligado en la posición 1, una abreviatura de una sola letra que representa el ácido graso ligado en la posición 2, y una abreviatura de una sola letra que representa el ácido grado ligado en la posición 3. Así, la estructura de los triglicéridos se describe según se muestra en el siguiente ejemplo: 8P8 (triglicérido que tiene ácido caprílico ligado en la posición 1, ácido palmítico ligado en la posición 2, y ácido caprílico ligado en la posición 3).

Ejemplo 1

Usando una mezcla de sustrato de tripalmitina (PPP) y ácido caprílico 1:2 (peso/peso), se colocó una mezcla de reacción que comprendía 10,5 g de dicha mezcla de sustrato y 1,2 g de lipasa inmovilizada de Rhizomucor miehei (Novo Nordisk, Lipozyme IM60) en un frasco de tapa de rosca y se incubó mientras se agitaba (140 veces/minuto) durante 48 horas a 50ºC. Después de la reacción, la mezcla de reacción fue sustituida por una mezcla de sustrato nueva, dejándose sólo el enzima inmovilizado, y se llevó a cabo la siguiente reacción en las mismas condiciones. La reacción se llevó a cabo durante 4 ciclos, usando repetidamente el mismo enzima inmovilizado, y se recogieron las respectivas mezclas de reacción.

Se añadieron 70 ml de KOH 0,5 N (solución en etanol al 20%) a cada mezcla de reacción (10,5 g) y después de extraer la fracción de glicérido con 100 ml de hexano, se eliminó el disolvente con un evaporador y se recuperó el glicérido. Como consecuencia del análisis de la composición del glicérido con Iyatroscan (Yatron), aunque un 8% de diglicérido estaba contenido en el producto del primer ciclo de reacción, el contenido de glicéridos parcialmente esterificados de los glicéridos del segundo ciclo de reacción y posteriores resultó ser 1% o menor. La composición de ácido graso de las fracciones glicérido de los ciclos de reacción 2º a 4º fue de 45,1% de ácido caprílico y 54,9% de ácido palmítico.

La transesterificación se repitió usando las fracciones de glicérido de los ciclos de reacción 2º a 4º como material inicial con el fin de aumentar la proporción de intercambio de ácido caprílico. Se añadieron 3,5 g del glicérido preparado y 7 g de ácido caprílico al Lipozyme IM60 (1,2g) usado en la referida reacción, después de lo cual se llevó a cabo la reacción mientras se agitaba durante 48 horas a 30ºC (5º ciclo). Después de la reacción, se sustituyó la mezcla de reacción por una mezcla de sustrato nueva y la reacción se llevó a cabo otra vez bajo las mismas condiciones (6º ciclo). Las fracciones de glicérido se recuperaron de las mezclas de reacción 5ª y 6ª por extracción con hexano (total 4,8 g). La composición de ácidos grasos de la fracción glicérido resultante (% en moles) fue de 64,2% de ácido caprílico y 35,8% de ácido palmítico. Los glicéridos parcialmente esterificados contenidos en dicha fracción glicérido 8P8 ascendían al 1% o menos, y como consecuencia de analizar con una columna ODS (Wakosil-II 3C18, 4,6 x 150 mm, dos columnas) usando acetona/acetonitrilo (1:1, vol./vol.) como solvente de elución, se determinó que la pureza del 8P8 era del 93%.

Se llevó a cabo otra vez la transesterificación (7º ciclo) durante 48 horas a 30ºC usando el 8P8 resultante (3,5 g) y 7 g de ácido araquidónico (pureza: 90%) como materiales iniciales, con el Lipozyme IM60 usado en las referidas reacciones. Después de la reacción, se extrajo la mezcla de reacción con hexano bajo condiciones alcalinas para obtener una fracción glicérido (4,8 g). Cuando se analizó la composición de ácidos grasos de la fracción glicérido, los contenidos de ácido caprílico, ácido palmítico, ácido \gamma-linolénico y ácido araquidónico eran de 38,5, 23,1, 2,4 y 34,0% en moles, respectivamente. Como consecuencia del fraccionamiento de dicho glicérido por cromatografía líquida de alto rendimiento usando acetona/acetonitrilo (1:1, vol/vol) como disolvente de elución y una columna ODS (SH-345-5, 20 x 500 mm, YMC), las cantidades de 8PA y APA resultaron 0,72 y 0,44 g, respectivamente.

Ejemplo 2

Se preparó 8P8 llevando a cabo la reacción a una escala 100 veces mayor que en el método descrito en el Ejemplo 1, y se usó como material inicial.

Se inmovilizó lipasa de Rhizopus delemar (Tanabe Pharmaceutical, Talipase) en un portador cerámico (SM-10, NGK) de acuerdo con el método descrito en J. Ferment. Bioeng., 81, 299-303 (1996). Después de llenar una columna con 10 g del enzima inmovilizado (31.000 U/g), se permitió fluir 100 ml de una mezcla 1:2 (peso/peso) de aceite de soja hidratado y ácido caprílico a un caudal de 3 ml/h a 30ºC para activar el enzima inmovilizado.

A continuación, se permitió fluir 50 ml de aceite de soja sin agua y después de eliminar el exceso de agua se sometió a transesterificación una mezcla 1:4 (peso/peso) de 8P8 y éster etílico de ácido araquidónico (pureza: 90%) mientras se le permitía fluir bajo las mismas condiciones. Se destilaron 100 g de mezcla de reacción a vacío elevado, y después de recoger la fracción glicérido como residuo, se extrajo ésta con hexano bajo condiciones alcalinas de acuerdo con el Ejemplo 1. A continuación se extrajo el disolvente con un evaporador para obtener 35,7 g de extracto de hexano. Cuando la relación de composición de triglicérido y éster de ácido graso contenidos en ese extracto de hexano se analizó con Iyatroscan, se halló que la relación era de 91:9. Además, como consecuencia del análisis de la composición de ácidos grasos, los contenidos de ácido caprílico, ácido palmítico, ácido \gamma-linolénico, ácido dihomo-\gamma-linolénico y ácido araquidónico resultó ser de 24,4; 34,5; 1,5; 2,6; y 37,0% en moles, respectivamente.

Ejemplo 3

Con el fin de eliminar el exceso de agua contenido en la lipasa inmovilizada de Rhizomucor miehei (Novo Nordisk, Lipozyme IM60) usada en el Ejemplo 1, se colocaron 100 ml de una mezcla de reacción que comprendía 12 g de dicho enzima inmovilizado y 60 g de SUNTGA-25 (Suntory) en un frasco de tapa de rosca y se dejaron reaccionar mientras se agitaba durante 48 horas a 30ºC (1º ciclo). Después de dejar sólo el enzima inmovilizado, añadiendo el 8P8 (12 g) preparado en el Ejemplo 2 y 48 g éster etílico de ácido de Mead (pureza: 90%), y sustituyendo completamente el espacio superior del frasco por nitrógeno, se llevó a cabo la transesterificación dos veces mientras se agitaba durante 72 horas a 30ºC (2º y 3º ciclos).

Después de la reacción, se combinaron las mezclas de reacción de los ciclos 2º y 3º y se usaron del mismo modo que en el Ejemplo 2 100 g de la mezcla de reacción combinada para recuperar la fracción glicérido como residuo después de destilar a vacío elevado. A continuación, después de extraer con hexano bajo condiciones alcalinas de acuerdo con el Ejemplo 1, se eliminó el hexano con un evaporador para obtener 24,1 g de fracción glicérido. Cuando la relación de composición de triglicérido y éster de ácido graso contenidos en esta fracción se analizó con Iyatroscan, se halló que era de 92:8. Cuando se cuantificaron los contenidos de éster de ácido graso y cada triglicérido a partir del área de máximos de un refractómetro diferencial efectuando cromatografía líquida de alta resolución de acuerdo con el Ejemplo 1, se determinó que el contenido de MPM era de 12,0%.

La composición de ácidos grasos de dicha fracción comprendía ácido caprílico, ácido palmítico y ácido de Mead a 31,2; 35,7 y 33,1% en moles, respectivamente.

El triglicérido transesterificado resultante se transesterificó adicionalmente con éster etílico de ácido de Mead para aumentar la proporción de intercambio de éster. Se añadieron 12 g de triglicérido transesterificado y 48 g de éster etílico de ácido de Mead al referido enzima inmovilizado y se hicieron reaccionar mientras se agitaba durante 72 horas a 30ºC (4º ciclo). Después de la reacción, se destilaron 55 g de la mezcla de reacción usando el método descrito anteriormente para obtener 12,3 g de fracción glicérido. La composición de ácidos grasos de dicha fracción comprendía ácido caprílico, ácido palmítico y ácido de Mead a 5,2; 38,6 y 56,1% en moles, respectivamente.

Ejemplo 4

Con el fin de extraer el exceso de agua contenido en la lipasa inmovilizada de Rhizomucor miehei (Novo Nordisk, Lipozyme IM60) usada en el Ejemplo 1, se colocó una mezcla de reacción que comprendía 2 g de dicho enzima inmovilizado y 10 g de SUNTGA-25 (Suntory) en un frasco de tapa de rosca de 20 ml y se hizo reaccionar mientras se agitaba durante 48 horas a 30ºC (1º ciclo). Mientras se dejaba sólo elenzima inmovilizado en el recipiente de reacción, se añadieron 8P8 (12 g) preparado en el Ejemplo 2 y 8 g de mezcla de ácido graso obtenida por hidrólisis de SUNTGA-25, a lo que siguió la sustitución completa por nitrógeno y la transesterificación mientras se agitaba durante 48 horas a 30ºC (2º y 5º ciclos). Después de la reacción, los glicéridos extraídos con hexano de las mezclas de reacción de los ciclos 2º a 5º se combinaron y usaron como sustrato para una transesterificación adicional.

Se añadieron 2 g de triglicérido transesterificado y 10 g de la mezcla de ácido grado obtenida del SUNTGA-25 al recipiente de reacción que contenía el referido enzima inmovilizado y se hizo reaccionar mientras se agitaba durante 48 horas a 30ºC (6º y 7º ciclos). Las fracciones glicérido se extrajeron de las mezclas de reacción de los ciclos 6º y 7º y a continuación se hizo reaccionar nuevamente de modo similar usándolas como sustrato de la transesterificación (8º ciclo). Se analizó la composición de ácidos grasos de triglicérido obtenida al repetir tres veces la transesterificación, así como la composición de ácidos grasos ligados en las posiciones 1 y 3 y en la posición 2. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

(unidades: % en moles)

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|}\hline
 Tipos de ácido  \+\multicolumn{3}{|l|}{Lípidos estructurados
novedosos}\\\dddcline{2}{4}  graso  \+ Total  \+ Posiciones 1, 3  \+
Posición 2 \\\hline  8:0  \+ 9  \+ 9  \+ 2 \\\hline  16:0  \+ 34  \+
6  \+ 96 \\\hline  18:1 (n-9)  \+ 11  \+ 16  \+ 0
\\\hline  18:2 (n-6)  \+ 15  \+ 22  \+ 1 \\\hline 
18:3 (n-6)  \+ 2  \+ 3  \+ 1 \\\hline  20:3
(n-6)  \+ 1  \+ 3  \+ 0 \\\hline  20:4
(n-6)  \+ 15  \+ 23  \+ 0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Ejemplo 5

La proporción de APA de todos los triglicéridos de la leche materna humana se analizó por cromatografía líquida de alta resolución usando el APA obtenido en el Ejemplo 1 como patrón de referencia. Se usó un detector de dispersión de luz por evaporación (DDL31, EUROSEP Instruments) como detector, junto una columna ODS (Cosmosil, 4,6 x 250 mm, Nakaraitesk) y se usó como eluyente un gradiente de acetona/acetonitrilo (1:1, vol/vol) hasta 100% de acetona. Como consecuencia, se confirmó que la proporción de APA de todos los triglicéridos de la leche materna humana era de 0,1 a 0,6 de porcentaje en peso. Sobre la base del contenido de ácido araquidónico de la leche materna humana (aproximadamente 0,5 a 1,0%, sobre la base de la relación en peso de los aceites o grasas de la leche materna humana), se consideró que entre el 10 y el 50% del ácido araquidónico de la leche materna humana estaba presente en forma de APA.

Ejemplo 6

Se preparó una formulación que contenía triglicérido del tipo de la leche materna humana mezclando 0,3 g de lípido estructurado novedoso obtenido en el Ejemplo 1 (APA o 8PA) en 100 g de leche en polvo. La proporción de ácido araquidónico a total de ácidos grasos de dicha formulación era de 0,8% en el caso de mezclar en APA y del 0,4% en el caso de mezclar en 8PA.

Ejemplo 7

400 g de la presente preparación de triglicérido preparados en volumen grande de acuerdo con el mismo procedimiento del Ejemplo 4 y purificados, 48 g de lecitina de yema de huevo purificada, 20 g de ácido oleico, 100 g de glicerina concentrada y 40 ml de hidróxido de sodio 0,1 N se dispersaron con un homogeneizador, y se añadió agua destilada para inyección al homogeneizado hasta obtener un volumen líquido total de 4 litros. La mezcla así obtenida se emulsionó con un emulgente pulverizado a alta presión para preparar una emulsión lípida. Después de introducir partes alícuotas de 200 ml de dicha emulsión lípida en bolsas de plástico, las bolsas de plástico se esterilizaron usando vapor a alta presión durante 20 minutos a 121ºC para obtener un agente de transfusión lípido.

Ejemplo 8

La preparación de triglicéridos obtenida en el Ejemplo 3 se formuló en forma de preparación de inyección emulsionada de acuerdo con métodos habituales. El contenido de la preparación de triglicéridos de la preparación de inyección emulsionada era del 10% (peso/volumen). Se añadió 1,2% (peso/volumen) de lecitina de yema de huevo como emulgente, y la presión osmótica se ajustó con glicerina para que fuera isotónica con la sangre.

Ejemplo 9

Se asignaron aleatoriamente cerdos machos recién nacidos (peso corporal > 1 kg) a cuatro grupos de 6 animales (asignándose los hermanos a grupos diferentes). Todos los grupos se criaron con la formulación. Los cuatro grupos constaban de un grupo en el que no se añadió a la formulación el triglicérido que contenía ácido araquidónico (grupo de la formulación), un grupo en el que se añadió SUNTGA-25 (Suntory) a la formulación en forma de ácido araquidónico que contenía triglicérido a una concentración de 1 g/litro (grupo SUN), un grupo en el que el APA obtenido por el método del Ejemplo 1 se añadió a la formulación a una concentración de 0,4 g/litro (grupo APA), y un grupo en el que el 8PA obtenido por el método del Ejemplo 1 se añadió a la formulación a una concentración de 0,82 g/litro (grupo 8PA). Los grupos SUN, APA y 8PA se ajustaron de modo que la cantidad de ácido araquidónico de la formulación fuera aproximadamente igual. En la Tabla 2 se indica la composición de todos los ácidos grasos de SUNTGA-25 (abreviado SUN en la Tabla), APA y 8PA, junto con la composición de ácidos grasos en la posición 2 del triglicérido 1.

TABLA 2

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline
 Ácido  \+\multicolumn{3}{|l|}{Total ácidos grasos
}\+\multicolumn{3}{|l|}{Ácidos grasos en la posición 2}\\  graso 
\+\multicolumn{3}{|l|}{}\+\multicolumn{3}{|l|}{  }\\\hline 
 \+ SUN  \+ APA  \+ 8PA  \+ SUN  \+ APA  \+ 8PA \\\hline  8:0  \+ 0 
\+ 0  \+ 33,3  \+ 0  \+ 0  \+ 0 \\\hline  14:0  \+ 0,4  \+ 0  \+ 0 
\+ 0  \+ 0  \+ 0 \\\hline  16:0  \+ 15,0  \+ 33,3  \+ 33,3  \+ 0,9 
\+ 100,0  \+ 100,0 \\\hline  18:0  \+ 6,4  \+ 0  \+ 0  \+ 0  \+ 0 
\+ 0 \\\hline  18:1 n  -  9  \+ 14,3  \+ 0  \+ 0  \+
12,4  \+ 0  \+ 0 \\\hline  18:2 n  -  6  \+ 25,1  \+ 0 
\+ 0  \+ 36,0  \+ 0  \+ 0 \\\hline  18:3 n  -  6  \+ 2,2
 \+ 0  \+ 0  \+ 2,7  \+ 0  \+ 0 \\\hline  20:0  \+ 0,5  \+ 0  \+ 0 
\+ 0,5  \+ 0  \+ 0 \\\hline  20:3 n  -  6  \+ 3,1  \+ 0 
\+ 0  \+ 3,6  \+ 0  \+ 0 \\\hline  20:4 n  -  6  \+ 27,1
 \+ 66,7  \+ 33,4  \+ 36,5  \+ 0  \+ 0 \\\hline  22:0  \+ 2,0  \+ 0 
\+ 0  \+ 1,3  \+ 0  \+ 0 \\\hline  24:0  \+ 3,9  \+ 0  \+ 0  \+ 6,1 
\+ 0  \+ 0
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

Los ácidos grasos se indican como (número de átomos de carbono : número de enlaces dobles) y se representan como: 16:0 ácido palmítico, 18:0 ácido esteárico, 18:1 n-9 ácido oleico, 18:2 n-6 ácido linoleico, 18:3 n-6 ácido \gamma-linolénico, 20:3 n-6 ácido dihomo-\gamma-linolénico, 20:4 n-6 ácido araquidónico.

Después de mantener en ayunas a los animales durante de 10 a 12 horas, en el 18º día de la dosificación, se recogieron muestras de sangre, y se extirpó el hígado y los pulmones (que se conservaron a -80ºC hasta su análisis). Las composiciones de ácidos grasos del plasma y el hígado resultaron afectadas por los ácidos grasos presentes en las formulaciones, y cuando se compararon los grupos de las formulaciones, aunque el contenido de ácido araquidónico de los grupos SUN, APA y 8PA fue superior, no se observaron diferencias significativas entre dichos grupos en lo que respecta al contenido de ácido araquidónico. Se cree que ello es debido a que los tejidos usados fueron afectados directamente por los ácidos grasos dietéticos. Por tanto, se analizó la composición de ácidos grasos del fosfolípido de los pulmones. Dichos resultados se muestran en la Tabla 3.

(Tabla pasa a la página siguiente)

TABLA 3

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|}\hline
 Ácido graso  \+\multicolumn{4}{|l|}{Composición de ácidos grasos
del fosfolípido pulmonar}\\\hline   \+ Grupo de  \+ Grupo SUN  \+
Grupo APA  \+ Grupo 8PA \\   \+ formulación \+ \+ \+ \\\hline  16:0 
\+ 31,0 \pm 0,5  \+ 29,2 \pm 0,3  \+ 30,3 \pm 0,4  \+ 32,7 \pm 0,5
\\\hline  18:0  \+ 13,4 \pm 0,2  \+ 13,2 \pm 0,3  \+ 11,6 \pm 0,5 
\+ 12,5 \pm 0,4 \\\hline  18:1 n-9  \+ 23,7 \pm 0,5 
\+ 23,0 \pm 0,2  \+ 22,8 \pm 0,4  \+ 23,1 \pm 0,3 \\\hline  18:2
n-6  \+ 12,1 \pm 0,3  \+ 12,7 \pm 0,2  \+
12,4 \pm 0,3  \+ 12,6 \pm 0,2 \\\hline  20:4 n-6  \+
8,1 \pm 0,2  \+ 9,1 \pm 0,1  \+ 10,5 \pm 0,3  \+ 10,2 \pm 0,2
\\\hline  22:5 n-3  \+ 2,2 \pm 0,1  \+ 2,1 \pm 0,1 
\+ 2,4 \pm 0,2  \+ 1,9 \pm 0,1 \\\hline  22:6 n-3 
\+ 0,8 \pm 0,1  \+ 0,7 \pm 0,1  \+ 0,8 \pm 0,1  \+ 0,8 \pm 0,1
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

No hubo diferencias significativas en las proporciones de ácido araquidónico en la composición de ácido graso del fosfolípido pulmonar. La proporción de ácido araquidónico entre los fosfolípidos del grupo SUN puede predecirse que sea mayor que en el grupo de la formulación. Sin embargo, a pesar de contener la misma cantidad de ácido araquidónico, las proporciones de ácido araquidónico entre los fosfolípidos pulmonares de los grupos APA y 8PA fueron significativamente mayores que en el grupo SUN. Este resultado se considera que es debido a las características posicionales del triglicérido lípido estructurado de la presente invención.

Claims

1. Un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

donde R^{1} y R^{2} son grupos acilo, que pueden estar oxidados, de ácidos grasos insaturados que tienen de 18 a 22 átomos de carbono, y n representa un número entero de 14 a 16,

caracterizado porque el ácido graso insaturado que tiene de 18 a 22 átomos de carbono se selecciona entre:

ácido 9,12-octadecadienoico (ácido linoleico) 18:2, \omega6

ácido 6,9,12-octadecatrienoico (ácido \gamma-linolénico) 18:3, \omega6

ácido 8,11,14-eicosatrienoico (ácido dihomo-\gamma-linolénico) 20:3, \omega6

ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico) 20:4, \omega6

ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico 22:4, \omega6

ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico 22:5, \omega6

ácido 6,9-octadecadienoico 18:2, \omega9

ácido 8,11-eicosadienoico 20:2, \omega9

ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead) 20:3, \omega9

ácido 9,12,15-octadecatrienoico (ácido \alpha-linolénico) 18:3, \omega3

ácido 6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico) 18:4, \omega3

ácido 11,14,17-eicosatrienoico (ácido dihomo-\alpha-linolénico) 20:3, \omega3

ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico 20:4, \omega3

ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico 20:5, \omega3

ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico 22:5, \omega3, y

ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico 22:6, \omega3.

2. Un triglicérido según la reivindicación 1, en el que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} son diferentes.

3. Un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

donde R^{3} representa un grupo acilo, que puede estar oxidado, de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 que tiene 18 a 22 átomos de carbono, y n representa un número entero de 14 a 16, y m representa un número entero de 2 a 16,

caracterizado porque el ácido graso insaturado que tiene 18 a 22 átomos de carbono se selecciona entre:

\newpage

ácido 9,12-octadecadienoico (ácido linoleico) 18:2, \omega6

ácido 6,9,12-octadecatrienoico (ácido \gamma-linolénico) 18:3, \omega6

ácido 8,11,14-eicosatrienoico (ácido dihomo-\gamma-linolénico) 20:3, \omega6

ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico (ácido araquidónico) 20:4, \omega6

ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico 22:4, \omega6

ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico 22:5, \omega6

ácido 6,9-octadecadienoico 18:2, \omega9

ácido 8,11-eicosadienoico 20:2, \omega9

ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead) 20:3, \omega9

ácido 9,12,15-octadecatrienoico (ácido \alpha-linolénico) 18:3, \omega3

ácido 6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico) 18:4, \omega3

ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico 20:4, \omega3

ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico 20:5, \omega3

ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico 22:5, \omega3, y

ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico 22:6, \omega3.

4. Un triglicérido según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que un grupo acilo oxidado es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado o hidroxiepoxidado.

5. Un triglicérido según la reivindicación 1, 2 ó 3, seleccionado entre:

triglicérido de 1,3-diaraquidonil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-docosahexaenoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-(dihomo-\gamma-linolenil)-3-docosahexaenoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-docosahexaenoil-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-(dihomo-\gamma-linolenil)-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-(dihomo-\gamma-linolenil)-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1,3-bis(dihomo-\gamma-linolenil)-2-palmitoilo,

triglicérido de 1,3-bis (5,8,11-eicosatrienoil)-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-(5,8,11-eicosatrienoil)-3-octanoil-2-palmitoilo,

triglicérido de 1-araquidonil-3-(5,8,11-eicosatrienoil)-2-palmitoilo, y

triglicérido de 1-docosahexaenoil-3-(5,8,11-eicosatrienoil)-2-palmitoilo.

6. Un producto alimentario que contiene un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

donde R^{1} y R^{2} son grupos acilo, que pueden estar oxidados, de ácidos grasos insaturados que tienen de 18 a 22 átomos de carbono, y n representa un número entero de 14 a 16, y al menos uno de R^{1} y R^{2} es un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3.

7. Un producto alimentario según la reivindicación 6, en el que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} del triglicérido son diferentes.

8. Un producto alimentario que contiene un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

donde R^{3} representa un grupo acilo, que puede estar oxidado, de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 que tiene de 18 a 22 átomos de carbono, n representa un número entero de 14 a 16, y m representa un número entero de 2 a 16.

9. Un producto alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que cualquier grupo acilo oxidado del triglicérido es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado o hidroxiepoxidado.

10. Un producto alimentario que contiene un triglicérido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Un producto alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que es un alimento funcional, alimento suplementario nutricional, formulación para prematuros, formulación para lactantes, alimento para bebés, alimento para el embarazo o alimento para personas mayores.

12. Un sustituto de la leche humana que contiene un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

donde R^{1} y R^{2} son grupos acilo que pueden estar oxidados, de ácidos grasos insaturados que tienen de 18 a 22 átomos de carbono, y n representa un número entero de 14 a 16, y al menos uno de R^{1} y R^{2} es un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3.

13. Un sustituto de la leche humana según la reivindicación 12, en el que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} del triglicérido son diferentes.

14. Un sustituto de la leche humana que contiene un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

donde R^{3} representa un grupo acilo, que puede estar oxidado, de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 que tiene de 18 a 22 átomos de carbono y n representa un número entero de 14 a 16 y m representa un número entero de 2 a 16.

15. Un sustituto de la leche humana según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que cualquier grupo acilo oxidado del triglicérido es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado o hidroxiepoxidado.

16. Un sustituto de la leche humana que contiene triglicérido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

17. Comida para animales que contiene triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

18. Comida para animales según la reivindicación 17, en la que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} del triglicérido son diferentes.

19. Comida para animales que contiene triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

20. Comida para animales según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en la que cualquier grupo acilo oxidado del triglicérido es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado o hidroxiepoxidado.

21. Comida para animales que contiene un triglicérido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

22. Un producto nutricional terapéutico que contiene al menos un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

donde R^{1} y R^{2} son grupos acilo, que pueden estar oxidados, de ácidos grasos insaturados que tienen de 18 a 22 átomos de carbono, y n representa un número entero de 14 a 16, y al menos uno de R^{1} y R^{2} es un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3,

y un portador neutral apto para administración oral, intraintestinal o parenteral.

23. Un producto nutricional terapéutico según la reivindicación 22, en el que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} del triglicérido son diferentes.

24. Un producto nutricional terapéutico que contiene al menos un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

donde R^{3} representa un grupo acilo, que puede estar oxidado, de un ácido graso insaturado \omega6, \omega9 u \omega3 que tiene de 18 a 22 átomos de carbono y n representa un número entero de 14 a 16 y m representa un número entero de 2 a 16,

y un portador neutro apto para administración oral, intraintestinal o parenteral.

25. Un producto nutricional terapéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que cualquier grupo acilo oxidado del triglicérido es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado o hidroxiepoxidado.

26. un producto nutricional terapéutico que contiene al menos un triglicérido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un portador neutro apto para administración oral, intraintestinal o parenteral.

27. Una preparación farmacéutica que contiene al menos un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

28. Una preparación farmacéutica según la reivindicación 27, en la que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} del triglicérido son diferentes.

29. Una preparación farmacéutica que contiene al menos un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

30. Una preparación farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en la que cualquier grupo acilo oxidado del triglicérido es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado, o hidroxiepoxidado.

31. Una preparación farmacéutica que contiene al menos un triglicérido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

32. Un reactivo analítico estándar que comprende triglicérido representado por la siguiente fórmula general (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{1} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (I)\cr  |\cr 
CH _{2} O-R ^{2} \cr}

33. Un reactivo analítico estándar según la reivindicación 32, en el que el grupo acilo R^{1} y el grupo acilo R^{2} del triglicérido son diferentes.

34. Un reactivo analítico estándar que comprende un triglicérido representado por la siguiente fórmula general (II):

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 CH _{2} O-R ^{3} \cr  |\cr 
CHO-CO-(CH _{2} ) _{n} -CH _{3} 
\qquad \qquad (II)\cr  |\cr 
CH _{2} O-CO-(CH _{2} ) _{m} -CH _{3} \cr}

35. Un reactivo analítico estándar según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en el que cualquier grupo acilo oxidado del triglicérido es un grupo acilo hidroxilado, epoxidado o hidroxiepoxidado.

36. Un reactivo analítico estándar que comprende triglicérido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.