ES2197938T3

ES2197938T3 - Promotor de actinomiceto.

Info

Publication number: ES2197938T3
Application number: ES96308648T
Authority: ES
Inventors: Serizawa Sankyo Company Limited Nobufusa; Watanabe Sankyo Company Limited Ichiro
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1995-11-29
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2016-11-29
Also published as: HK1004490A1; EP0776974A3; HUP9603300A3; CN1158897A; NO965072L; ATE239086T1; EP0776974A2; CZ291991B6; EP0776974B1; HUP9603300A2; NO965072D0; AU7402396A; PT776974E; CA2191503A1; CZ348096A3; DK0776974T3; TW562858B; RU2140984C1; HU9603300D0; MX9605938A

Abstract

UNA SECUENCIA DE LONGITUD 1KBP DE LA REGION 5''-NO CODIFICADORA, DEL GEN QUE CODIFICA PARA EL CITOCROMO P-450{SUB,SCA-2} EN EL ACTINOMICETO STREPTOMYCES CARBOPHILUS, TIENE ACTIVIDAD PROMOTORA DE LA TRANSCRIPCION, INDUCIBLE POR SUSTRATO. CUANDO LA REGION DE 1KPB SE ACORTA, LA ACTIVIDAD DE TRANSCRIPCION SE CONVIERTE EN CONSTITUTIVA, Y LOS PROMOTORES ACORTADOS, PUEDEN UTILIZARSE VENTAJOSAMENTE EN SISTEMAS DE EXPRESION, ESPECIALMENTE EN AQUELLOS QUE EXPRESAN P-450{SUB,SCA-2}, EN PRESENCIA DE ML-236B, PARA PRODUCIR PRAVASTATINA SODICA.

Description

Promotor de actinomiceto.

La presente invención se refiere a una nueva forma del promotor de la transcripción asociado con el gen que codifica al citocromo P-450 presente en el Streptomyces carbophilus, a vectores conteniendo este promotor, al uso de dichos vectores en la expresión de proteínas, especialmente la P-450_{sca-2}, a células huésped que contienen dichos vectores, a sistemas de expresión que comprenden dichas células y al uso de tales proteínas y sistemas de expresión. Además, la presente invención permite la producción a escala industrial de proteínas útiles usando este promotor.

En los últimos años, los progresos en el campo de la ingeniería genética han hecho posible introducir y expresar genes externos en varios microorganismos. Un área de particular progreso ha sido la relativa a la Escherichia coli (E. coli) utilizada como huésped para la producción de proteínas recombinantes, y las técnicas resultantes están siendo introducidas para su uso comercial en la industria. Más recientemente, se han realizado progresos considerables en la investigación con levaduras como alternativas industriales a la E. coli.

Los actinomicetos (y en particular el género Estreptomicetos) son microorganismos procariotas comúnmente utilizados en la producción de antibióticos. El ADN heterólogo se introduce generalmente en Actinomicetos utilizando un sistema huésped-vector desarrollado por Hopwood y col. en los años ochenta [c.f. Hopwood, D.A., y col., (1987), ``Methods in Enzymology'', 153; 116-166, Academic Press, New York]. Esta técnica permitió una considerable investigación y desarrollo para desarrollar sistemas de vectores de expresión en Actinomicetos. Un ejemplo de promotor de la transcripción útil en vectores de expresión en Actinomicetos es tipA, un promotor inducible por el antibiótico tiostrepton [c.f. Murakami, T., y col., (1989), J. Bacteriol., 171, 1459].

La pravastatina sódica, utilizada en el tratamiento de la hiperlipidemia, tiene el efecto farmacológico útil de ser capaz de reducir el colesterol sérico [c.f. Arai, y col., (1988), Ann. Rep. Sankyo Res. Lab., 40, 1-38]. La pravastatina sódica se produce principalmente por hidroxilación microbiológica de ML-236B sódico, una sustancia producida por un hongo filamentoso, Penicillium citrinum. Generalmente, la hidroxilación se realiza en presencia del actinomiceto Streptomyces carbophilus. Se ha demostrado que el agente responsable de la actividad hidroxilante es un citocromo del tipo P-450_{sca} (de ahora en adelante abreviado como ``P-450_{sca}'') [c.f. Serizawa, y col., (1990), Biochimica et Biophysica Acta, 1084, 35-40].

Matsuoka y col. purificaron un citocromo P-450_{sca} a partir de Streptomyces carbophilus el cual era capaz de catalizar la hidroxilación de ML-236B sódico en la posición 6. Este P-450_{sca} se caracterizó en las tres formas en que existía, P-450_{sca-1}, P-450_{sca-2} y P-450_{sca-3} [c.f. Matsuoka, y col., (1989), Eur. J. Biochem., 184, 707-713 y EP-A-0 281 245], aunque no se estableció si estos representaban isotipos o productos de genes diferentes.

Serizawa y col., clonaron y expresaron ADN codificante de P-450_{sca-2} de Streptomyces carbophilus [c.f. patente japonesa Kokai No. Hei 6-70780 y Watanabe, I., y col., (1995), Gene, 163, 81-85]. El ADN, junto con una porción de 1013 pdb de la región 5' no codificante del gen P-450_{sca-2}, se clonó en un plásmido multicopia, pIJ702, y se empleó para transformar Streptomyces lividans TK21. Los Streptomyces lividans TK21 transformados convirtieron ML-236B en pravastatina sódica incluso más rápidamente que S. carbophilus, demostrando así que el fragmento de 1013 pdb poseía una elevada actividad promotora. El fragmento de 1013 pdb de la región 5'-no codificante no fue secuenciado.

Simultáneamente, también se demostró que la expresión de P-450_{sca} está sujeta a inducción de la transcripción por el substrato, esto es, se observó que ML-236B y fenobarbital aumentan la expresión de P-450 tanto como 30 veces. Esto fue establecido por la técnica de ``Northern blotting'', que reveló que no había transcripción en ausencia de ML-236B, pero encontró tres transcritos en presencia de ML-236B sódico. Los niveles de transcripción se incrementaban durante un periodo de seis horas hasta una velocidad máxima en presencia de un substrato.

El ADN que codifica a P-450_{sca-2} tiene 1233 pdb de longitud, mientras que la región promotora tiene casi la misma longitud, con 1013 pdb, haciendo la transformación considerablemente más difícil que si sólo la ``Open Reading Frame'' (ORF, pauta de lectura abierta) fuese utilizada en la transformación. Sin embargo, reducir la longitud de este complejo promotor inducido por el substrato muy probablemente convertiría al promotor en inútil. Además, la transformación de un huésped con un vector conteniendo tanto la ORF como la región 1013 pdb ya ha sido realizado con éxito, por lo que no se vio la necesidad de acortar la ORF o la región 5' no codificante.

Sin embargo, las seis horas de desfase hasta alcanzar la máxima producción de P- 450 sigue siendo un problema, siendo este desfase un problema importante en las aplicaciones industriales.

Ahora, nosotros hemos descubierto que una reducción de la región 5' no codificante asociada con el gen que codifica P-450_{sca-2} sorprendentemente no sólo elimina el efecto amplificador de substrato de ML-236B, sino que también incrementa la efectividad del promotor.

Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un ADN con actividad promotora de la transcripción, correspondiendo el ADN a: (i) parte, pero no toda la región 5' no codificante de 1013 pdb inmediatamente adyacente a una ORF de Streptomyces carbophilus que codifica al citocromo P-450_{sca-2}, o (ii) un mutante o variante del mencionado ADN; comprendiendo dicho ADN como mínimo la secuencia de 74 pdb desde el nucleótido 355 a 428 de SEC. ID. NO. 1; teniendo dicho ADN una mayor actividad promotora que la antedicha región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud, y no necesitando inducción de la transcripción por el substrato.

El ADN particular y preferiblemente tiene actividad promotora de la transcripción en, al menos, una cepa de Streptomyces carbophilus y/o en, al menos, una cepa de Streptomyces lividans.

Ventajosamente, la presente invención proporciona un promotor de la transcripción para que una proteína sea expresada en un actinomiceto, preferentemente un estreptomiceto, lo que permite una expresión significativa de la proteína en un sistema de expresión adecuado sin que la transcripción tenga que ser inducida por un substrato para la proteína. Tal expresión es ventajosamente constitutiva.

La presente invención también proporciona: una secuencia de ADN para todo o parte de dicho promotor; ADN con toda o parte de la actividad de dicho promotor; vectores comprendiendo dichos promotores; células huésped transformadas por dichos vectores; y procedimientos para producir proteínas recombinantes utilizando dichas células huésped.

Una ventaja particular de la presente invención es que se presenta un procedimiento para producir pravastatina sódica utilizando un huésped que expresa una proteína P-450 recombinante cuya transcripción está controlada por dicho promotor.

Esencialmente, los presentes inventores han establecido que reducir el tamaño de la región 5' no codificante asociada con un gen de P-450 de S. carbophilus, particularmente la región 5' no codificante asociada con el gen P-450_{sca-2}, tiene poco o ningún efecto en la velocidad máxima de promoción de la transcripción, y que la reducción de tamaño también elimina ventajosamente la necesidad para inducción por el substrato. El efecto de la inducción por substrato es un efecto positivo, por lo que la eliminación de dicho efecto haría esperar un promotor que únicamente promovería la transcripción en un nivel basal. En lugar de eso, las regiones promotoras acortadas actúan significativamente mejor que el nivel basal asociado con el promotor de 1013 pdb de longitud. Incluso longitudes tan cortas como 74 pdb todavía tienen una actividad ventajosa comparada con el promotor de 1013 pdb de longitud.

Además, la velocidad de transcripción de los promotores de longitud reducida parece ser constitutiva, de manera que se alcanzan inmediatamente niveles elevados de transcripción, en lugar de tener que esperar para lograr una velocidad máxima de expresión sobre un período de seis horas después de la exposición a ML-236B, u otro substrato apropiado. Esto es particularmente importante en la industria.

La región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud con actividad promotora de la transcripción y que es adyacente a P-450 ORF también es referida aquí como el promotor 5'; es el promotor asociado con el gen P-450_{sca-2} de S. carbophilus.

Aunque el promotor 5' es referido como de una longitud de 1013 pdb, esto es sólo la longitud aproximada de una región que se extiende 5' desde la región de inició de la transcripción (transcription start region, tsr) de la ORF. El tsr se encuentra aproximadamente en la posición 384 de SEC. ID. NO. 1, y el codon de iniciación ATG inmediatamente sigue a la posición 428. La parte terminal de la región que contiene el promotor 5' es el sitio SacI situado 1013 pdb arriba de la ORF. El sitio SacI de esta región fue descrito por Watanabe y col. (supra), quienes no determinaron la longitud del promotor 5'. Para facilitar su mención, el promotor 5' se refiere aquí como si tuviese una longitud de 1013 pdb, ya que es sustancialmente correcto y no constituye una parte esencial de esta invención, como se verá más claro posteriormente. En cualquier caso, los promotores de la presente invención deben ser más cortos que la longitud total de 1013 pdb del promotor 5'.

La región 5' de 1013 pdb adyacente al gen P-450_{sca-2} no contiene necesariamente la región promotora completa para este gen, aunque el tamaño de la región sugiere que sí. De hecho, el promotor no parece que ocupe una región bien definida, debido al hecho de que nosotros hemos establecido que una región de longitud tan corta como 74 pdb todavía tiene una actividad comparable o mejor a la del promotor 5' de 1013 pdb original. Sin embargo, también en los promotores de la presente invención la actividad promotora es mejor cuando tienen un exceso de unas 160 pdb, preferentemente 300 pdb o más.

Los ADN de la presente invención, también referidos aquí como los promotores de la presente invención, corresponden al promotor 5' de 1013 pdb, a condición de que sean más cortos que la longitud de 1013 pdb del promotor 5'. La reducción en longitud puede ser efectuada por cualquier técnica, tales como la eliminación de porciones usando endonucleasas de restricción, la construcción de secuencias específicas, pero más cortas, o la digestión desde los finales 3' o 5' de la secuencia, incluyendo combinaciones de las técnicas anteriores.

Se comprenderá que los promotores de la presente invención generalmente deben ser de dos hebras (double stranded, ds) para exhibir actividad promotora, aunque se comprenderá que la presente invención también prevé cualquiera de las hebras complementarias constituyendo los promotores de la invención. La presente invención además se extiende a porciones de los promotores de la presente invención o porciones de cada una o de ambas hebras complementarias que puedan ser finalmente utilizadas para construir un promotor de la invención.

Especialmente, hemos encontrado que la digestión 5'proporciona excelentes resultados, de manera que incluso una porción de 74 pdb localizada en el final 3' de la secuencia del promotor todavía tiene una actividad superior. Por consiguiente, en un ejemplo óptimo, el ADN de la presente invención corresponde al promotor 5' parcialmente digerido en la dirección 5' \to 3'. No hay una longitud mínima del ADN promotor, siempre que el ADN todavía posea la necesaria actividad promotora.

Aunque se observa una buena actividad promotora en promotores de longitudes menores a 100 pdb, especialmente en el final 3', parece que hay una mejora significativa en la actividad con longitudes entre 158 y 320 pdb. El fragmento de 320 pdb tiene una actividad promotora unas cinco veces mayor que el fragmento de 158 pdb. Ambos fragmentos son fragmentos terminales 3' del promotor 5' de 1013 pdb. Esta diferencia de actividad promotora no es crucial en la presente invención, debido al hecho de que una longitud de 152 pdb (la diferencia entre ambas longitudes) tiene un mínimo efecto en la transformación o en la expresión.

Si un experto quisiera identificar la longitud precisa del promotor donde está la transición entre mayor y menor actividad, el procedimiento necesario sería sencillo y fácilmente evidente para la persona experta. Sin embargo, no puede haber ninguna ventaja identificando tal longitud, ya que no hay diferencia práctica ni ninguna ventaja entre utilizar una secuencia de promotor de 158 pdb y 320 pdb.

Se comprenderá que generalmente se prefiera utilizar un promotor con una actividad significativamente alta, más que con una actividad baja, de manera que pueda alcanzarse la transcripción máxima. Sin embargo, podría ocurrir que la velocidad de transcripción utilizando un promotor con actividad mayor sea indeseablemente alta, y que se agoten demasiados recursos del huésped en la manufactura de proteínas. En tal caso, sería deseable un promotor menos activo.

Nosotros también hemos establecido que hay una longitud para el promotor entre 428 pdb y el total 1013 pdb donde se pierde la dependencia de la inducción por substrato. Aunque esta longitud específica de 428 pdb fue obtenida por digestión terminal 5', es completamente posible que cualquier secuencia de 428 pdb, o similar, entre la secuencia total de 1013 pdb pueda servir como promotor.

Como se describió anteriormente, la pérdida de la dependencia de la inducción por substrato es muy ventajosa. Sin embargo, al mismo tiempo, la longitud exacta para la que ocurre esto no es importante. Nosotros demostramos que la actividad de un promotor teniendo una longitud de 428 pdb es equivalente a, o algo superior que, la actividad total del promotor 5' de 1013 pdb, al menos después de la inducción por substrato durante una hora. Así, un promotor de menos de la mitad de la longitud del promotor original funciona al menos tan bien como el original, pero sin el requerimiento de la inducción por substrato. Esto significa que cualquier procedimiento en el que la velocidad de expresión es un factor está inmediatamente favorecido. Longitudes mayores que 428 kp se convierten en difíciles de manejar, sin beneficiar al usuario. Además, en determinado punto, los promotores más largos también son objeto de inducción por substrato, negando otra vez así la ventaja que representan los promotores más cortos de la presente invención.

De acuerdo con esto, el ADN de la presente invención es preferentemente de una longitud que muestre actividad promotora básicamente equivalente o mayor que la de los fragmentos 3' de 320 y/o el 428 pdb del promotor 5'. En particular, nosotros preferimos que la longitud del promotor no sea tan larga como para que esté sujeto a inducción por substrato.

El término ``inducción por substrato'' es bien conocido en el estado de la técnica. Esencialmente, ciertos productos de expresión son frecuentemente sólo necesarios en la naturaleza cuando un cierto substrato está presente y sobre el que pueden actuar. En la ausencia de dicho substrato el organismo estaría malgastando recursos expresando a producto. De acuerdo con esto, varios sistemas en la naturaleza se han desarrollado de forma que la expresión del producto sólo tiene lugar en la presencia del substrato.

En el caso P-450_{sca-2}, esto se logra por un substrato, tal como ML-236B, actuando en el lugar del promotor para inducir la transcripción de ARNm. De ningún modo es cierto que el substrato natural para el citocromo P-450_{sca} es el ML-236B. Podría haber otros substratos, incluyendo cualquiera de los substratos deseados, si son diferentes de ML-236B, que pueden inducir al promotor 5'. Otro ejemplo más de un substrato adecuado para inducir al promotor 5' es fenobarbital, como se describió anteriormente. Sin embargo, la naturaleza exacta del inductor para el promotor 5' no es importante en la presente invención, y no será discutida más.

Aunque la presente invención no está limitada por la teoría parece probable que, sorprendentemente, la inducción de los citocromos P-450_{sca-2} por el substrato de alguna forma supera un bloque de transcripción. Reducir el tamaño de la región promotora de 1013 pdb, especialmente por digestión del extremo final del promotor 5', parece servir para eliminar el bloque. Por esta razón, nosotros creemos que no hay una longitud particular de promotor en la que la inducción por substrato se reanude, más bien la actividad del promotor desciende cuando se aumenta la longitud después de un cierto punto, ya que el bloque promotor de la transcripción se regenera. La inducción por substrato podría empezar a ser efectiva de forma directamente proporcional a la regeneración del bloque promotor de la transcripción, o podría ser sólo posible una vez que se haya alcanzado cierta longitud. En cualquier ejemplo, se prefieren promotores con actividad no reducida debido a una longitud aumentada por encima de alrededor de 500 pdb. En otras palabras, no se prefieren promotores que tiene una longitud excesiva de aproximadamente 500 pdb, en particular un exceso de 428 pdb, y que muestran una reducción en la actividad.

El ADN de la presente invención corresponde a la parte, o partes del promotor 5'. Por el término ``corresponde'' se quiere decir que el ADN de la invención tiene un tipo similar de actividad promotora que la del promotor 5', en que se puede utilizar para promover la transcripción de la ORF del citocromo P-450_{sca}. El nivel al que tal promoción ocurre no es una característica esencial de la presente invención, y los niveles de actividad promotora de los promotores de la presente invención se describen aquí.

Los promotores de la invención pueden corresponder directamente a parte o partes del promotor 5'. En una simple realización, el promotor 5' podría ser digerido a partir del extremo terminal 5', de forma que el promotor resultante de la invención tenga la misma secuencia que la porción restante 3' del promotor 5'. Si el promotor 5' se digiere a partir del extremo terminal 5' y una porción también es eliminada por digestión con endonucleasas y ligación, con lo que el promotor resultante de la invención corresponderá directamente a las dos partes importantes del promotor 5'. En ambos ejemplos, el promotor resultante tiene secuencias idénticas a una o más porciones del promotor 5'.

El promotor de la presente invención tendrá generalmente uno o más secuencias similares o idéntica a las del promotor 5'. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos de los promotores de la invención no necesita corresponder directamente a los del promotor 5'. Aunque generalmente se prefiere que los promotores de la invención tengan en gran parte una secuencia homóloga a las porciones relevantes del promotor 5' con los que se correlacionan, esto no es esencial. El único requerimiento es que muestre la actividad promotora requerida.

Los promotores de la presente invención pueden variar tanto como se desee a partir del promotor 5' original, siempre que el promotor resultante aún muestre la actividad promotora requerida. En general, será poco ventajoso variar la secuencia, y no hay garantía de que alterando la secuencia de bases se consiga otra cosa que no sea destruir o disminuir la actividad promotora. Sin embargo, una cierta modificación de la secuencia de bases es poco probable que tenga un efecto significante, especialmente ya que no se requiere para que la secuencia de bases codifique una proteína.

Modificaciones de la secuencia de bases ocurrirán generalmente durante el procedimiento de transformación, o se harán por conveniencia, como introducir un lugar de restricción, por ejemplo. Así, la presente invención prevé promotores que varían de esta parte o partes de la secuencia del promotor 5' con la que están relacionadas mediante, por ejemplo, eliminaciones, inversiones, inserciones y sustituciones. Variaciones en la secuencia natural del promotor 5' pueden ocurrir también en la naturaleza, y promotores de la invención basados en estas variantes son también revistos.

Otras diferencias y alteraciones en la secuencia y medios para llevarlas a cabo serán realmente evidentes para los expertos en la materia. Los promotores de la presente invención que varíen de esa manera, siempre que no sea de forma natural, se referirán a partir de aquí como mutantes, de manera que se prevén tanto mutantes como variantes. Sin embargo, se reconocerá que la expresión ``correspondiendo a una parte pero no a toda la región no codificante 5' de 1013 pdb inmediatamente adyacente a una ORF de Streptomyces carbophilus, que codifica al citocromo P-450'' abarca tales mutantes y variantes siempre que el ADN comprenda al menos la secuencia de 74 pdb desde el nucleótido 355 al 428 de SEC ID NO. 1.

Como normal general, mutantes y variantes adecuados se pueden hibridar a 60ºC en 6 x SSC con ADN teniendo la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1 de la lista de secuencias. El ADN por el que mutantes y variantes hibridan podría o no formar parte de una secuencia más larga.

Como ha sido discutido, los promotores de la presente invención muestran una actividad superior a la del promotor 5' de 1013 pdb. Esto necesariamente no significa que el nivel de transcripción de la ORF sujeto a promoción por un promotor de la invención sea más alto que el promovido por el promotor 5' de 1013 pdb cuando es inducido por el substrato. En cambio, a menudo ocurre que la promoción constitutiva por un promotor de la invención sirve para asegurar que los niveles de actividad protéica sean todavía más elevados después de un periodo de una hora, por ejemplo, que aquéllos obtenidos con el promotor 5' después de una hora de inducción por substrato. Esta producción constitutiva puede ser mucho más deseable que, por ejemplo, un desarrollo lento que alcance luego niveles por debajo de aquellos que son requeridos o útiles.

Aunque los ADN de la presente invención son muy útiles con los citocromos P-450_{sca}, se apreciará que ellos pueden utilizarse en combinación con cualquier secuencia adecuada para ser expresada en cualquier huésped procariota adecuado. En particular, los promotores de la presente invención podrían ser usados en huéspedes actinomicetos adecuados, especialmente en estreptomicetos. Los promotores de la invención corresponden a parte o partes de un promotor derivado de S. carbophilus, de manera que la actividad promotora requerida se pone de manifiesto si un promotor de la invención es capaz de promover la transcripción de una ORF del citocromo P-450_{sca}.

A partir de lo anterior, se comprenderá que hay más promotores proporcionados por la invención cuando están operativamente unidos a una ORF adecuada. También proporciona vectores, tales como plásmidos, conteniendo los promotores de la invención, especialmente cuando el promotor está operativamente asociado con una ORF, y huéspedes conteniendo tales vectores.

Los vectores no necesitan necesariamente ser vectores de expresión. Estos otros vectores podrían ser utilizados para multiplicar los promotores de la invención, o proveer de una librería accesible. Sin embargo, se prefieren los vectores de expresión, y particularmente, se prefieren sistemas de expresión que comprendan un huésped y un vector de expresión de la invención.

Actualmente, se prefiere emplear S. lividans cuando se utiliza un actinomiceto como célula huésped para la expresión de productos a partir de ADN heterólogo. En el caso de citocromos P-450_{sca}, especialmente P-450_{sca- 2}, S. lividans también expresa el sistema de transferencia electrónica necesario para permitir al citocromo tomar parte en la hidroxilación de ML-236B. Sin embargo, cualquier otra proteína adecuada o producto de la expresión podría también ser expresado vía un sistema de expresión conteniendo un promotor de la invención.

Generalmente, no se prefiere expresar un ADN eucariota en procariotas, tal como S. lividans, debido a que ciertos sucesos post-traducción que ocurren de forma natural en eucariotas, pueden no tener lugar en procariotas, tal como la glicosilación. Sin embargo, esto no evita la expresión de productos eucariotas en los sistemas de la presente invención, siempre que se entienda que cualquier modificación post-traducción que no ocurra de forma natural en el sistema de expresión no tendrá lugar, a menos que se busque específicamente.

Los sistemas de expresión de la presente invención son especialmente útiles para expresar productos de expresión procariotas en gran cantidad. Los productos de expresión pueden ser producidos incluso en cantidades mayores, si se utilizan plásmidos multicopia, tales como pIJ702, en el sistema de expresión.

Los sistemas de expresión de la presente invención son particularmente más útiles para la expresión de productos que normalmente son expresados después de inducción por substrato. Tales sistemas se pueden usarse en procedimientos para la producción de ciertas sustancias, tales como antibióticos. Tales procedimientos son posibles, por ejemplo, cuando el producto de expresión tiene actividad para convertir un substrato en un producto final, o en una intermedio más avanzado, o incluso para descomponer un substrato. Tal procedimiento podría implicar co-cultivar el sistema de expresión, si se necesita, con un sistema que produzca el substrato con el que actuar.

En circunstancias donde el producto del sistema de expresión de la invención es normalmente inducido por el substrato, co-cultivar con el sistema de expresión productor de substrato estaría normalmente sujeto a un desfase, así es necesario esperar para que el sistema de expresión para producir suficiente producto de expresión. Utilizando los sistemas de expresión de la presente invención esto no es un problema importante, ya que el producto es automáticamente sintetizado por el sistema sin la necesidad de inducción por substrato, eliminado de esta forma el desfase.

Se apreciará que los sistemas de expresión de la presente invención son en particular aplicables a la expresión de citocromos P-450, especialmente citocromos P-450_{sca}y más especialmente el citocromo P-450_{sca-2.}P- 450_{sca-2} es expresado por S. carbophilus, como se describe anteriormente, y S. carbophilus es ventajosamente co-cultivado con Penicillium citrinum en la producción de pravastatina sódica. En este sistema, P-450_{sca-2} sirve para hidroxilar el substrato ML-236B expresado por Penicillium citrinum, pero sólo después de un tiempo mientras que ML-236B induce transcripción de P-450_{sca-2}. Utilizando un sistema de expresión de la presente invención, no es necesario por más tiempo tener un desfase en la producción de pravastatina sódica, y esto lleva a importantes ventajas importantes en la producción industrial de pravastatina sódica.

Algunas realizaciones preferidas de la presente invención son las siguientes.

Los promotores preferidos de la siguiente invención hibridan con ADN teniendo una secuencia de nucleótidos de 1 a 428 o de 1 a 320 de SEC ID NO. 1.

Se prefieren los promotores que tienen la secuencia de nucleótidos de 1 a 428 de SEC ID NO. 1. También se prefieren los promotores que tienen una secuencia de nucleótidos de 1 a 320 de SEC ID NO. 1. La presente invención además proporciona mutantes y variantes de tales promotores.

También proporciona vectores de ADN recombinante que comprenden promotores de la invención, particularmente donde estos vectores además comprenden ADN que codifica un polipéptido deseado bajo el control del promotor, y en donde el vector es capaz de expresar el polipéptido en una célula huésped adecuada. Se prefiere que el polipéptido sea el citocromo P-450_{sca-2}.

La invención también proporciona células huésped transformadas por dichos vectores. Las células huésped preferidas son actinomicetos, particularmente Streptomyces lividans. Particularmente se prefiere Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

La presente invención además proporciona un procedimiento para producir un polipéptido deseado, tal y como se define anteriormente, implicando el procedimiento cultivar una célula huésped transformada, como se define anteriormente, bajo condiciones que permitan producción del polipéptido para producir el polipéptido, y recuperar el polipéptido.

La presente invención además proporciona un procedimiento para producir la pravastatina sódica que comprende el cultivo de la cepa TK21 de Streptomyces lividans transformada por un vector de expresión de la invención codificando a P-450_{sca-2}, en un medio conteniendo ML-236B sódica y bajo condiciones que permitan la producción del citocromo P-450_{sca-2}, y permitiendo a la ML-236B sódica ser convertida en pravastatina sódica en las células transformadas por la acción catalítica del citocromo P-450_{sca-2} producido allí, y después recuperando la pravastatina sódica de dichos transformantes y/o dicho medio. Se prefiere que la cepa transformante sea Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299). Se prefiere también que ML-236B sea producido por Penicillium citrinum que es co-cultivado con dicha cepa.

El promotor 5' no es homólogo a ningún promotor conocido, ya sea de un actinomiceto, o cualquier otra fuente. En común con otros promotores, los promotores de la invención producen la iniciación de la transcripción de ADN que codifica para una proteína o polipéptido en ARNm. Esta es la primera parte de la biosíntesis intracelular de proteínas o polipéptidos (estos términos son utilizados de forma intercambiable a partir de aquí). Así, los promotores de la invención son promotores de la transcripción, refiriéndose esta función a la actividad promotora de la transcripción. El promotor 5', y los promotores con las secuencias de 428, 320, 158, 101 y 74 pdb de SEC. ID NO. 1, tienen esta actividad.

Se apreciará que los promotores de la presente invención puedan tener uno o más pares de bases adicionales ligados en tándem upstream y/o downstream (contracorriente y/o a corriente). Tales secuencias adicionales están únicamente limitadas porque no deberían reintroducir una cantidad sustancial de inducción por substrato y también porque deberían retener una cantidad útil de la actividad promotora.

Los polipéptidos bajo el control de los promotores de la invención podrían ser como los descritos anteriormente. Se valorará que puedan tener cualquier secuencia de aminoácidos, como, por ejemplo: una forma natural, variante o polimérica de una proteína nueva o conocida; una forma fusionada de dos o más proteínas; o un polipéptido de nuevo diseño. Como se describe anteriormente, el polipéptido de elección es el citocromo P-450_{sca-2}.

En relación con los vectores, se valorará que el vector a transformar sea uno capaz de replicarse a si mismo en una célula huésped adecuada. Así, el vector debería contener una secuencia de auto-replicación, o replicón. En el caso de actinomicetos, el vector de elección es pIJ702.

En relación con el huésped, no hay una limitación particular otra que adecuarse al vector escogido. En general, cualquier célula huésped puede utilizarse, tales como las que se recogen de la naturaleza o las que pueden ser adquiridas por compra o transferencia. Las células huésped de elección son Actinomicetos, preferiblemente Streptomyces carbophilus o Streptomyces lividans, y, sobre todas la cepa TK21 de Streptomyces lividans.

En un procedimiento para la producción de pravastatina sódica, tal y como se ha definido anteriormente, que comprende el cultivo de una cepa transformada de Streptomyces lividans en presencia de ML-236B sódica, la pravastatina sódica resultante puede ser recuperada por métodos conocidos.

En una realización directa, los promotores de la presente invención podrían obtenerse clonando el ADN de Streptomyces carbophilus, utilizando la metodología de Watanabe, y col. [Gene, (1995), 163, 81-85]. Una cepa de elección de la Streptomyces carbophilus a partir de la que los promotores de la invención pueden ser clonados es la Streptomyces carbophilus SANK 62585 (FERM BP-1145).

En la presente realización, una librería genómica podría preparase a partir del ADN genómico total de la Streptomyces carbophilus, utilizando pUC18 (que puede ser obtenido de Takara Shuzo Ltd., Japón), por ejemplo, como un vector de clonación. Se apreciará que dichas librerías y vectores forman una parte de la presente invención. Una sonda de oligonucleótidos podría ser sintetizada basándose, por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos N-terminal predicha de P-450_{sca-2}. Esta sonda de oligonucleótidos puede ser utilizada para identificar un clon de la librería que codifique al menos una parte de P-450_{sca-2}. Como la proteína N-terminal está codificada por el extremo terminal 5' de la ORF, entonces es probable que cualquier clon identificado por este método pueda también tener una cantidad significante de la región 5' no traducida y no codificante, que es donde el promotor 5' está localizado. Un método de selección adecuado utilizando la librería y la sonda de oligonucleótidos es el método de hibridación de colonias [c.f. Maniatis, T. y col., (1982), ``Molecular Cloning - A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York - algunos métodos referidos a partir de aquí que no estén acompañados por ninguna referencia específica estarán generalmente descritos en ``Molecular Cloning - A Laboratory Manual''].

Incluso si el clon identificado por este o cualquier otro método contiene sólo una porción del promotor de la presente invención, todavía puede obtenerse un clon completo. Una sonda marcada puede prepararse a partir del clon obteniendo sólo una porción de ADN deseado. Esta sonda marcada puede ser utilizada como plantilla para una selección posterior de la librería genómica, para identificar y aislar un clon conteniendo, como mínimo, tanto promotor 5' como se necesite.

Se apreciará que la presente invención contempla el aislamiento de clones que comprenden o el total del promotor 5' o sólo una parte del promotor 5'. Si se obtiene la secuencia total, después esta puede ser procesada, como por subclonación, para obtener un promotor de la presente invención. Si se obtiene una secuencia parcial, entonces esta podría también procesarse posteriormente, como se hace con la secuencia total o podría bastar como promotor de la invención sin ningún cambio sustancial en su secuencia.

También se apreciará que el método sugerido anteriormente para la clonación y preparación de un promotor de la presente invención no es el único método que se puede utilizar, y que otros métodos adecuados pueden resultar fácilmente obvios para aquellos que son expertos en la materia. Cualquiera de los pasos, o incluso la metodología completa, puede ser cambiada. Por ejemplo, en lugar de utilizar una sonda correspondiente a la secuencia N-terminal de P-450_{sca-2}, puede utilizarse una sonda preparada a partir del extremo terminal 3' del promotor 5'. Los vectores no están particularmente limitados, y cualquier vector de clonación adecuado puede ser utilizado, tales como otros vectores comercialmente disponibles, incluyendo pBR322.

De acuerdo con la presente invención, se apreciará que los promotores de la presente invención pueden ser sintetizados químicamente, utilizando la información dada en SEC. ID NO. 1. Si los promotores de la presente invención tienen que ser sintetizados químicamente, entonces esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, por el método del triéster fosfito [c.f. Hunkapillar, M., y col., (1984), Nature, 310, 105-111]. También es posible emplear semisíntesis, por ejemplo, utilizando una combinación de técnicas de clonación e ingeniería utilizando la información que se da aquí. Métodos adecuados para dicha semisíntesis son conocidos dentro del área.

Volviendo al método originalmente descrito de la presente invención por selección de una librería, el ADN promotor puede ser obtenido a partir del clon que contiene la secuencia deseada por métodos bien conocidos por aquellos especialistas en el estado de la técnica [c.f. Maniatis, T. y col., (1982), supra]. Por ejemplo, la fracción de ADN plasmídico puede ser aislada y el ADN promotor puede ser aislado del ADN plasmídico, utilizando uno o más enzimas de restricción.

La cepa de elección que sirve como fuente para el promotor 5' es la Streptomyces lividans SANK 62795. Esta cepa se depositó de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos de Noviembre 21, 1995, en el National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, con el número de acceso FERM BP-5299. El Streptomyces lividans SANK 62795 es un actinomiceto que contiene el vector de ADN recombinante pSCA1013-\Delta(1013/428) el cual, a su vez, contiene ADN con actividad promotora de la transcripción y que consiste en la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1 de la lista de secuencias, junto con el ADN que codifica para el citocromo P-450_{sca-2}, siendo el plásmido capaz de producir la proteína en células de actinomiceto a través de la actividad del promotor de 428 pdb.

En el apéndice Listado de Secuencias, la fuente de SEC. ID NO. 1 se da como S. carbophilus SANK 62585 teniendo el número de acceso FERM BP-1145. Esta fue la fuente original del promotor 5' de 1013 pdb, a los cuales corresponden los promotores más cortos de la presente invención, y se depositó en el Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos de 5 de Septiembre de 1985.

Tanto S. lividans 62795 como S. carbophilus 62585 son ejemplos típicos de S. lividans y S. carbophilus, respectivamente, y pueden ser cultivados como se describe en Hopwood, D.A., y col., (1985), ``Genetic Manipulation de Streptomyces: A Laboratory Manual'', The John Innes Foundation, Norwich, UK, que también describe propiedades físicas típicas de estas cepas. Estas dos cepas pueden ser seleccionadas para resistencia a tiostrepton.

De acuerdo con una parte preferido de la presente invención, un promotor de transcripción con la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1 de la lista de secuencias se aísla cultivando Streptomyces lividans SANK 62795, seguido de recuperación de pSCA1013-\Delta(1013/428) a partir de la células y digestión del plásmido con enzimas de restricción.

Si se desea, se puede determinar la secuencia de nucleótidos de cualquier ADN clonado, por ejemplo por el método de modificación química de Maxam-Gilbert [c.f. Maxam, A.M., y Gilbert, W., (1980), Methods in Enzymology, 65, 499-599] o por el método de terminación de la cadena dideoxi utilizando el fago M13 [c.f. Messing, J., y Vieira, J., (1982), Gene, 19, 269-276].

Si se desea establecer si una secuencia específica de ADN hibrida con ADN que contenga toda o parte de la secuencia de nucleótidos 1 - 428 de SEC ID NO. 1 de la lista de secuencias, entonces se podría determinar como se indica a continuación.

Específicamente, el ADN a testar se somete primero a electroforesis en gel de agarosa tanto como sea necesario. El ADN es después transferido a una membrana de nitrocelulosa o nilón, y a continuación el ADN absorbido en la membrana se fija por un tratamiento con calor por irradiación ultravioleta. Entonces, se usa una sonda. La sonda tiene la longitud deseada de la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1, y se marca con, por ejemplo, un isótopo radioactivo, como es ^{32}P, biotina, digoxigenina o un enzima, y se prepara habitualmente de acuerdo con el primer método al azar [c.f. Feinberg, A.P., y col., (1983), Anal. Biochem., 132, 6-13] o con el método de traducción de muesca [c.f. Maniatis, T., y col., (1982), supra].

La membrana de nitrocelulosa o nilón se sumerge en una solución de hibridación conteniendo la sonda y después se incuba a una temperatura adecuada y predeterminada, tal y como 60ºC. A continuación de la incubación, la membrana se lava y la sonda puede ser detectada utilizando métodos apropiados para el marcador utilizado.

La disolución de hibridación contendrá normalmente SSC (citrato sódico-solución salina; 1 x SSC contiene cloruro sódico 0.15 M y citrato sódico 15 mM en agua desionizada). La concentración de SSC preferida en la disolución de hibridación es 4-8 x SSC, y más preferiblemente es 6 x SSC. La temperatura de incubación preferida es de 30 a 70ºC, y más preferiblemente 60ºC.

El ADN hibridado con ADN conteniendo toda o parte de la secuencia nucleotídica 1 a 428 de SEC ID NO. 1 del listado de secuencias, podría ser clonado a partir de varias librerías genómicas por el método descrito. Se apreciará que más promotores de la presente invención hibridarán con ADN teniendo la secuencia 428 más que con la de 320 u otras secuencias más cortas, pero la longitud de la secuencia escogida para los experimentos de hibridación puede ser directamente elegida por aquellos expertos en la materia utilizando la información dada aquí.

Tal y como se describió anteriormente, el ADN obtenido de esta manera podría modificarse artificialmente por métodos bien conocidos en el campo, tal como la sustitución, la eliminación o la inserción de uno o más nucleótidos en un lugar deseado, por ejemplo una mutagénesis específica [c.f. Mark, D.F., y col., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666]. Se entenderá que la presente invención se extiende a tal ADN, siempre que este posea la requerida actividad promotora de la transcripción.

Para confirmar que el ADN obtenido como se describe anteriormente tiene actividad promotora de la transcripción, se construye y se expresa en un huésped adecuado un vector contendiendo el ADN unido en tánden a una ORF. Para empezar (i) se construye un vector ADN recombinante, en donde el ADN que codifica una proteína adecuada está ligado operativamente al supuesto ADN promotor y se inserta en un vector adecuado, tal como un plásmido pIJ702 de actinomiceto [c.f. Katz, E., y col., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2703- 2714], y después (ii) se transforma con el vector una célula huésped adecuada, que deja al vector replicarse tal y como Streptomyces lividans en el caso de un vector preparado a partir de pIJ702, y se establece el nivel de expresión de la proteína codificada por el ADN codificante.

En la técnica indicada anteriormente, la transformación puede llevarse a cabo de acuerdo con Hopwood, y col., [c.f. Hopwood, D.A., y col., (1985), ``Genetic Manipulation de Streptomyces: A Laboratory Manual'', The John Innes Foundation, Norwich, UK] cuando el transformante es, por ejemplo, un estreptomiceto. Se apreciará que el gen utilizado para ensayar la actividad promotora no debería usualmente estar presente o expresado en el huésped antes de la transformación.

Los niveles de transcripción pueden ser directamente establecidos por la técnica de absorción de Northern, por ejemplo. En la absorción de Northern o hibridación de Northern [c.f. Maniatis, T., y col., supra], la célula huésped se cultiva después de la transformación. Después, el ARN se extrae y se purifica a partir de la célula y se somete a electroforesis en gel de agarosa, y, luego, el ARN se absorbe en una membrana de nitrocelulosa o nilón, por ejemplo. Una sonda (ADN, ARN o oligonucleótidos sintéticos) puede ser marcada con un radioisótopo, tal como ^{32}P, biotina, digoxigenina o con un enzima específicamente detectando el gen para la proteína. Esta sonda puede ser después utilizada para detectar el ARNm transcrito a partir del gen, por hibridación.

Los niveles de transcripción también pueden determinarse directamente por ARN- PCR [Polymerase Chain Reaction, c.f. Innis, M.A., y col., (1990), ``PCR PROTOCOLS'', Academic Press, Nueva York]. En primer lugar, se prepara el ARN se prepara en primer lugar de forma similar a la de la hibridación de Northern. Después, utilizando transcriptasa reversa, se sintetiza ADNc a partir de ARNm, que funciona como plantilla. La transcripición reversa podría utilizar, como cebador, bien un oligo(dT), el cual tiende a ser no-específico, o bien un oligonucleótido con una secuencia homóloga a la porción del gen que codifica a la proteína a expresar. Utilizando este ADNc como plantilla, se puede llevar a cabo una reacción de polimerasas en cadena utilizando dos oligonucleótidos cebadores. Los cebadores son complementarios a las hebras opuestas de la ORF, y los lugares con los que son complementarios tienen posiciones separadas en el gen, así que las hebras generadas por PCR son capaces de hibridar entre sí. Después de que la reacción se deje reaccionar durante un cierto tiempo, el ADNds resultante se somete a electroforesis y se detecta en nitrocelulosa, por ejemplo, para determinar el nivel de transcripción de ADN deseado, basado en la presencia o ausencia de una banda con la longitud esperada.

Los niveles de expresión del producto se pueden establecer determinando la actividad fisiológica de la proteína producida. Así, por ejemplo, podría prepararse un vector de ADN recombinante en donde el ADN que codifica a una proteína con una actividad determinada, como un enzima, se conecta operativamente, por ligación, al extremo 3' terminal del supuesto promotor. Los niveles de expresión de la ORF conectada al supuesto promotor pueden entonces ser ensayados de manera apropiada al producto de expresión.

En el ejemplo en que dicho plásmido codifica al citocromo P-450_{sca-2}, y el plásmido es compatible con S. lividans, entonces el plásmido puede ser introducido en una cepa de Streptomyces lividans no produciendo P-450_{sca- 2}, y el transformante puede ser cultivado en presencia de ML-236B sódica. La cantidad de pravastatina sódica producida es indicativa del nivel de expresión de P-450_{sca-2} promovido por el supuesto promotor.

Se apreciará que los métodos para ensayar los productos de expresión pueden ser adaptados específicamente a los productos relevantes. Por ejemplo, el supuesto promotor podría ser operativo unido a un gen resistente a un fármaco, tal y como el gen de la cloramfenicol acetil transferasa [c.f. Gorman, C.M., y col., (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 1044-1051], o a un gen de la luciferasa [c.f. de Wet, J.R., y col., (1987), Mol. Cell. Biol., 7, 725-737], los cuales pueden ser detectados por métodos bien conocidos en el campo. También podrían utilizarse otros métodos para ensayar la expresión vía la actividad del producto de expresión.

Otro método para determinar la expresión, por ejemplo, es por reconocimiento del producto utilizando un anticuerpo adecuado. De nuevo, un vector de expresión conteniendo el supuesto promotor operativamente unido a la ORF se prepara y transforma en un huésped adecuado y se cultiva bajo condiciones adecuadas para la expresión. El medio de cultivo, o un homogeneizado de las células transformadas, se expone a un anticuerpo, y se cuantifica la cantidad de antígeno-anticuerpo. Las técnicas de medida adecuadas incluyen el radioinmunoensayo [c.f. Berson, R.S., y col., (1973), ``Methods in Investigative y Diagnostic Endocrinology'', Vol. 2A, 2B, North-Holly Publishing Co., Amsterdam], inmunoensayo enzimático [c.f. Engvall, E., (1980), Methods in Enzymology, 70(A), 419-439], Western blotting [c.f. Harlow, E., y col., (1988), ``Antibodies - A Laboratory Manual'', p. 471, Cold Spring Harbour Laboratory, New York] y la immunoprecipitación [c.f. Kessler, S.W., y col., (1981), ``Methods in Enzymology'', 73(B), 442-459], dependiendo de cómo se desee medir la interacción, y de si el anticuerpo o antígeno está marcado de alguna manera. En cualquier caso, se apreciará que la presente discusión de estas técnicas no es exhaustiva, y otros métodos serán realmente aparentes a aquellos especialistas en el campo.

También se apreciará que muchos otros métodos para determinar la actividad promotora de la transcripción del supuesto o del real promotor de la presente invención estarán disponibles y serán aparentes a aquellos especialistas en el campo, y la presente invención engloba todos estos métodos. Por ejemplo, cuando la proteína a expresarse tenga una propiedad característica diferente de la actividad o antigenicidad, se pueden usar métodos determinados por dicha propiedad, para ensayar directa o indirectamente tal actividad.

Una vez que se haya establecido que el ADN deseado para su uso como promotor de la presente invención tiene la necesaria actividad como promotor, se podría utilizar para preparar un vector de expresión para cualquier proteína deseada y adecuada. Cualquier huésped adecuado podría utilizarse para este propósito, y el huésped podría o no ser el mismo huésped que el que se utilizo para establecer si el ADN presentaba actividad promotora. La proteína no está restringida como su secuencia y podría tener cualquier secuencia de aminoácidos. Como se describió anteriormente, dichas secuencias pueden ser seleccionadas a partir, pero no están limitadas a ello, de: una forma natural, variante o polimérica de una proteína (o un péptido) nueva o conocida; la forma fusionada de dos o más tipos de diferentes proteínas (o péptidos); o un polipéptido de nuevo diseño. Como se ha indicado previamente, el citocromo P-450_{sca-2} es el producto de expresión de elección, un vector adecuado pSCA1013-\Delta(1013/428), y aislado dicho vector de Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299).

Se apreciará que los términos ``producto de expresión'', ``proteína'' y ``polipéptido'' son generalmente intercambiables, y se utilizan de esta manera. En ciertas circunstancias, el polipéptido traducido del ADN original no es el producto final, si no una forma intermedia del producto final siendo necesarias modificaciones post-traducción para obtener el producto deseado. En el caso de P-450_{sca-2}, se necesita incorporar hierro en un anillo de hemo de la proteína para generar el producto de expresión final. Así, mientras los términos ``producto de expresión'', ``proteína'' y ``polipéptido'' se utilicen como sinónimos aquí, las diferencias entre los términos se reconocerá por la persona experta en la materia en el contexto relevante.

Fuera de los actinomicetos, ejemplos de huéspedes adecuados para los promotores de la presente invención incluyen procariotas como Escherichia coli y Bacillus subtilis.

En el caso de que se utilice como huésped una cepa que no sea un actinomiceto, o que la cepa de actinomiceto seleccionada no sea apropiada para el tipo de vector, entonces se apreciará que el vector debe incluir un replicón adecuado para la cepa en cuestión, tal como uno originado en una especie que sea compatible con el huésped. Se necesitan un vector plasmídico conteniendo el origen de la replicación y secuencias de regulación adecuadas al huésped. Si el promotor de la presente invención no funciona en un huésped determinado, y no se modifique fácilmente por el especialista en la materia para que funcione, aun en presencia de otras secuencias de control adecuadas, entonces tal situación puede ser de uso limitado. Por ejemplo, tal situación puede ser de utilidad para multiplicar el promotor. Se apreciará que, cuando dichas modificaciones y/o secuencias control apropiadas sean fácilmente asequibles y/o reconocidas por aquellos especialistas en la materia, entonces tales situaciones están incluidas en la presente invención.

Aunque los vectores de expresión de la presente invención no necesitan más características que aquellas necesarias para la expresión en un huésped de determinado, se apreciará que un criterio incorporado de selección puede ser útil. Tal criterio incluye aquellos donde el plásmido confiere al huésped propiedades como la selectividad de expresión y transformación, de forma que el fenotipo se modifique.

Un método de transformación adecuado para el uso con un actinomiceto implica preparar el cultivo de actinomicetos en esferoplastos utilizando lisozimas. Después, se adiciona una solución tampón conteniendo vectores de ADN recombinante y polietilenglicol, para introducir el vector dentro de las células huésped, utilizando por ejemplo cualquiera de los métodos de Thompson or Hopwood [c.f. Thompson, C.J., y col., (1982), J. Bacteriol., 151, 668-677 or Hopwood, D.A., y col., (1985), ``Genetic Manipulation de Streptomyces: A Laboratory Manual'', The John Innes Foundation, Norwich], por ejemplo. Un gen resistente a tiostrepton se utiliza frecuentemente como marcador selectivo en la transformación de plásmidos [c.f. Hopwood, D.A., y col., (1987), ``Methods in Enzymology'' 153, 116, Academic Press, New York], pero la presente invención no esta limitada a esto.

Si se desea transformar la E. coli para expresar un producto bajo el control de un promotor de la presente invención, entonces un método general apropiado es aquel en el que un vector de ADN recombinante se adiciona a células competentes. Las células competentes se preparan generalmente en presencia de sales tales y como cloruro cálcico, cloruro magnésico y cloruro de rubidio [c.f. Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol. 166, 557-580]. Un método alternativo implica la electroporación, la cual implica el uso de pulsos de alto voltaje aplicados a una suspensión que contiene el huésped E. coli y el vector de expresión, causando así la incorporación del vector dentro de las células[c.f. Electroporation: Dower, W.J., y col., (1988), Nucleic Acid Res., 16, 6127 y Calvin, N.M., y col., (1988), J. Bacteriol., 170, 2796].

Los marcadores selectivos adecuados, por ejemplo aquellos que confieren un fenotipo particular al huésped, incluyen a genes marcadores de resistencia a fármacos como los que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina. Sin embargo, muchos más serán aparentes para aquellos especialistas en la materia, y la presente invención, como en todos los otros casos que proporcionan ejemplos específicos, no está limitada aquí.

En el caso en que se pretenda que la B. subtilis sea la célula huésped, entonces un método adecuado es aquel en el que las células huésped se preparen dentro de protoplastos utilizando lisozimas. Después se adiciona a los protoplastos, una solución tampón conteniendo vectores de ADN recombinante y polietilenglicol, seguido de incorporación del vector en las células huésped por electroporación (supra) [c.f. Cheng, S., y col., (1979), Mol. Gen. Genet., 168, 111]. En un ejemplo ideal, un marcador resistente a fármacos, tal como resistente a cloramfenicol, se utiliza como marcador selectivo para la línea celular transformada, pero se apreciará que se puedan utilizar otros marcadores selectivos.

Independientemente del huésped, el transformante deseado puede cultivarse utilizando métodos bien conocido para aquellos expertos en la materia, con el polipéptido producido por el cultivo intracelular, extracelularmente, o de ambas maneras. El medio que se utiliza en los cultivos puede seleccionarse adecuadamente a partir de varios tipos de medios comúnmente utilizados para las células huésped relevantes. En general, las condiciones de cultivo que son aceptadas como normales para un huésped particular pueden también ser empleadas para la expresión del polipéptido deseado, sujeto a las modificaciones requeridas, por ejemplo, por las propiedades del polipéptido.

Por ejemplo, los nutrientes típicos del actinomiceto incluyen glucosa, sacarosa, almidón, glicerol, jarabe de almidón, molasas y aceite de haba de soja para su uso como fuente de carbono. Como fuente de nitrógeno son adecuados, polvo de haba de soja, germen de trigo, extracto de carne, peptona, licor empapado de maíz, levadura seca y sulfato amónico. Además de lo anterior, pueden también utilizarse convenientemente en combinación cuando sean necesarios, sales inorgánicas como cloruro sódico, cloruro de potasio, carbonato o fosfato cálcico, y aditivos para ayudar al crecimiento de los microorganismos o promover la producción del polipéptido deseado.

De nuevo, las técnicas de cultivo generalmente apropiadas para el huésped en cuestión también son aplicables a los microorganismos transformados, incluyendo métodos tales como el cultivo líquido y el cultivo profundo, adecuado para la producción a escala industrial.

Nosotros preferimos que las condiciones de cultivo, a menos que generalmente esté contraindicado, o especificado en el presente documento, impliquen temperaturas entre 20 y 37ºC, y preferentemente entre 26 y 28ºC.

El producto de expresión bajo el control de un promotor de la presente invención se produce, generalmente intra o extracelularmente, y ocasionalmente de ambas maneras. El producto puede ser aislado, purificado y recuperado por varios procedimientos, que son bien conocidos por aquellos especialistas en el estado de la técnica particularmente aquellos procedimientos que confían en las propiedades físicas o químicas del polipéptido. En el caso en el que el polipéptido se exprese externamente, el polipéptido puede ser aislado, purificado y recuperado del sobrenadante resultante al centrifugar el medio de cultivo, por ejemplo para eliminar células.

Para aislar y purificar un polipéptido que se ha acumulado dentro de las células, entonces primero las células se suspenden en una disolución conteniendo un inhibidor de proteasas y después se homogenizan utilizando los medios comúnmente conocidos por aquellos especialistas en la materias, por ejemplo, un homogenizador ultrasónico.

Aunque, en general no es necesario para la elucidación de la presente invención, se apreciará que ejemplos de métodos específicos para el aislamiento, purificación y recolección de los polipéptidos incluyen técnicas tales como la precipitación de proteínas, ultrafiltración, cromatografía en tamiz molecular (filtración en gel), absorción cromatográfica, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, varios tipos de cromatografía líquida adecuada, incluyendo cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), diálisis y combinaciones de éstas.

En cualquier caso, se apreciará que el polipéptido deseado puede ser fácilmente producido a escala industrial, en alto rendimiento y elevada pureza, utilizando la presente invención.

También se apreciará que es posible ensayar la actividad del polipéptido producido por transformación de células huésped de la presente invención utilizando una muestra preparada impurificada o parcialmente purificada. P- 450_{sca-2} se puede obtener de Streptomyces lividans de la forma descrita anteriormente, y utilizarse directamente en la producción de pravastatina sódica, por ejemplo. El sistema de transporte de electrones necesario está presente en las células de S. lividans, de forma que es relativamente directo obtener un microorganismo huésped transformado que catalice la hidroxilación en la posición 6 de ML-236B sódica.

En la presente realización, el promotor típicamente se utiliza para ayudar a que se exprese el citocromo, pero este puede ser utilizado para la producción de, por ejemplo, pravastatina sódica. La pravastatina sódica producida mediante el procedimiento puede entonces ser recuperada por el método de Serizawa, y col. [c.f. Serizawa, N., y col., (1983), J. Antibiotics, 36, 608]. Streptomyces lividans SANK 62795 (FERM BP-5299) podría ser utilizada de esta manera.

La descripción de la presente invención será ahora ampliada con referencia a los siguientes Ejemplos, siendo los Ejemplos ilustrativos de la presente invención. Los métodos, preparaciones, disoluciones y semejantes que no estén específicamente definidos se pueden encontrar en ``Molecular Cloning - A Laboratory Hybook'' (supra). Todas las disoluciones son acuosas a menos que se especifique lo contrario.

En los siguientes Ejemplos se hace referencia a las figuras 1 a 5 en las que:

La Figura 1 es un esquema para la construcción de un plásmido pSCA1013- \Delta(1013/428), conteniendo 428 pdb de la región 5'-no codificante del gen P-450_{sca-2}.

La Figura 2 es un esquema para la construcción de plásmidos que contienen los promotores de la invención de 320, 158, 101 y 74 pdb [pSCA1013 \Delta(1013/320), pSCA1013-\Delta(1013/158), pSCA1013-\Delta(1013/101) y pSCA1013-\Delta(1013/74), respectivamente] obtenidos a partir del final 3' de la región 5' no codificante del gen P-450_{sca-2.}

La Figura 3 es un mapa de restricción del plásmido, pSCA1013- \Delta(1013/428), obtenido en la Figura 1;

La Figura 4 es un mapa de restricción del plásmido, pSCA101, conteniendo parte del gen P-450_{sca-2} junto con el promotor 5' de 1013 pdb, y

La Figura 5 es un esquema para la construcción de un plásmido, pSCA205, conteniendo el promotor 5' de 1013 pdb y la ORF de P-450_{sca-2}.

En los Ejemplos, demostramos que fue posible producir un polipéptido deseado en un microorganismo huésped utilizando un promotor de la presente invención.

Ejemplo 1 Aislamiento del Promotor de P-450_{sca-2} y Construcción de un Plásmido Vector para la Expresión del Citocromo P-450_{sca-2} (1-1) Construcción de los plásmidos pSCA101 y pSCA108

Los plásmidos pSCA101 y pSCA108 se construyeron clonando diferentes fragmentos de la región que contiene el promotor y el gen de P-450_{sca-2}, derivando estos fragmentos del ADN genómico de Streptomyces carbophilus de acuerdo con el método descrito por Watanabe y colaboradores [c.f. Watanabe, I., y col., (1995), Gene, 163, 81-85 y Patente Japonesa Kokai No. Hei 6-70780]. La Figura 4 es un mapa del plásmido pSCA101. Este plásmido se construyó por la unión del fragmento de 1,7 kpdb PvuII, derivado del ADN genómico de Streptomyces carbophilus, al lugar PvuII de pBR322 (obtenido de Takara Shuzo Ltd., Japón). Este fragmento de 1,7 kpdb contiene la totalidad del promotor 5' del gen P-450_{sca-2} y el ADN que codifica el final 5' del gen. El plásmido pSCA108 se preparó por ligación de un fragmento SacI de 2.0 kpdb, derivado del ADN genómico de Streptomyces carbophilus, al lugar SacI de pUC18 (obtenido de Takara Shuzo Ltd., Japón). Este fragmento de 2.0 kpdb contiene toda la región que codifica al gen del citocromo P-450_{sca-2}.

Los detalles de las técnicas indicadas anteriormente son los siguientes.

(1-2) Construcción de pSCA106

Utilizando 100 unidades de PvuII, 10 \mug de ADN pSCA101 se digirieron a 37ºC durante 3 horas. La digestión se llevó a cabo en el tampón de restricción suministrado con el enzima (Takara Shuzo). Específicamente, el tampón utilizado fue tampón H, tal y como suministra Takara Shuzo, Japón. En los siguientes Ejemplos, como en éste, donde se utilizan enzimas de restricción pero no se especifica la fuente y/o el tampón, el enzima es suministrado por Takana Shuzo y utilizado de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, y el tampón es tampón H, K o L, según convenga, tal y como suministra Takara Shuzo.

Los productos de la reacción de digestión se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa 1% peso/volumen, colocándose dicho gel de agarosa en una cubeta de electroforesis por inmersión conteniendo una solución acuosa de tampón Tris-HCl 90 mM, ácido bórico 90 mM y EDTA 2,5 mM (pH 8,3), y realizada a 100 V durante 3 horas.

Después de la electroforesis, el gel se agitó en una solución acuosa de bromuro de etidio (0,5 \mug/ml) durante 20 minutos, para teñir el ADN. Una porción de agarosa conteniendo el fragmento de interés de 1,7 kpdb se cortó del gel utilizando una cuchilla. La irradiación con UV de larga longitud de onda permitió identificar los fragmentos de ADN teñidos. El fragmento cortado de 1,7 kpdb se transfirió a un tubo de diálisis (límite de permeabilidad: 12000-14000 Da, Gibco) el cual posteriormente se cerró. A continuación, este tubo cerrado se situó, en una cubeta de electroforesis por inmersión conteniendo una disolución acuosa de tampón Tris-HCl 90 mM (pH 8,3), ácido bórico 90 mM y ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) 2,5 mM.

El fragmento de ADN se extrajo de la porción del gel de agarosa con una corriente de 100 V durante 2 horas. A continuación, la disolución resultante en el tubo de diálisis se trató con una mezcla 50 : 50 v/v de fenol y cloroformo para llevar a la fase orgánica resultante las posibles proteínas contaminantes. Este método es de rutina y bien conocido por las personas especializadas en este trabajo. Seguidamente, el ADN se recuperó de la fase acuosa por la técnica estándar de precipitación en etanol, y secado a presión reducida [c.f. ``Molecular Cloning - A Laboratory Manual'', supra]. Este método de recuperación de ADN a partir de agarosa, tal como ha sido descrito anteriormente, se refiere en el presente documento como ``excisión''.

Utilizando 10 unidades del enzima de restricción SmaI, se digirieron 10 \mug de pUC119 ADN (Takara Shuzo) a 25ºC durante 3 horas. El ADN digerido se trató con una mezcla 50 : 50 v/v de fenol y cloroformo (indicado de ahora en adelante simplemente como fenol-cloroformo) y se recuperó por precipitación en etanol de forma similar a como se ha descrito anteriormente, y el ADN recuperado se secó y evaporó a presión reducida.

Los extremos cortados del plásmido lineal se desfosforilaron utilizando 4 unidades de fosfatasa alcalina (Toyobo). La reacción de defosforilación se llevó a cabo a 37ºC durante 30 minutos en 200 \mul de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, preparado en agua destilada). A continuación, la solución se trató con fenol-cloroformo y el ADN desfosforilado se recuperó de la fase acuosa por precipitación en etanol y se secó a presión reducida.

Una cantidad de 50 ng del fragmento de 1,7 kpdb de PvuII obtenido anteriormente se adicionó a 100 ng del ADN desfosforilado SmaI pUC119 en 50 \mul de tampón ligasa (cloruro de magnesio 6,6 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 0.1 mM y Tris-HCl 66 mM, pH 7,6, preparado en agua destilada) conteniendo 1800 unidades de T4 ADN ligasa (Takara Shuzo), y la reacción de ligación se llevó a cabo durante 2 horas. Las células competentes de la cepa HB101 de E. coli se transformaron con una parte de la solución de la reacción de ligación de acuerdo con el método de Hanahan [c.f. Hanahan, D., (1980), J. Mol. Biol., 166, 557-580]. Las células transformadas resultantes se cultivaron en medio L (10 g/litro de triptona, 5 g/litro de extracto de levadura y 5 g/litro de cloruro sódico, hecho en agua destilada), conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina.

Las células crecieron en medio L y fueron después sembradas en medio sólido L a 37ºC, y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina. A continuación, las colonias seleccionadas con esta técnica, se propagaron en medio sólido, y el ADN plasmídico se preparó a partir de un número seleccionado de transformantes. El ADN plasmídico de cada transformante se digirió con los enzimas de restricción apropiados y el ADN resultante se analizó por electroforesis en gel de agarosa para confirmar la identidad del transformante que contenía el plásmido esperado. El plásmido preparado de esta forma se denominó pSCA106.

(1-3) Construcción del pSCA111

El plásmido pSCA111 contiene la región promotora 5' del gen P-450_{sca-2}, a partir del plásmido pSCA106, ligado al gen estructural de P-450_{sca-2}, derivado de pSCA108. El protocolo fue el siguiente.

10 \mug de ADN pSCA108 obtenidos anteriormente se digirieron con 100 unidades de SacI a 37ºC durante 5 horas en el tampón suministrado con el kit (Takara Shuzo). Los productos resultantes de la digestión se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% peso/volumen, y se cortó del gel un fragmento de ADN SacI de 2.0 kpdb.

A al vez, 10 \mug de ADN pSCA106, obtenido anteriormente, se digirieron a 37ºC durante 3 horas con 100 unidades de SacI en el tampón suministrado con el kit. Los productos de la digestión se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% peso/volumen, y un fragmento SacI de 4 kpdb se cortó del gel.

El final del fragmento SacI de 4 kbp, así obtenido, se desfosforiló de forma similar a la descrita en la sección (1-2). Después de la defosforilación, la solución se trató con fenol-cloroformo y el ADN se recuperó de la fase acuosa por precipitación en etanol, y se secó a presión reducida.

100 ng del fragmento de ADN SacI de 4 kpdb resultante desfosforilado y 50 ng del fragmento de ADN SacI de 2,0 kpdb obtenido en la primera parte de esta sección, el cual contiene el gen estructural de P-450_{sca-2}, se mezclaron en tampón ligasa conteniendo 1800 unidades de T4 ADN ligasa en un volumen final de 50 \mul, y la reacción de ligación se dejó durante 2 horas a 16ºC. Células competentes de la cepa HB101 de E. coli se transformaron con una porción de la reacción de ligación, de forma similar a la descrita en la sección anterior y se obtuvo pSCA11.

(1-4) Construcción del pSCA212

A partir de ADN pSCA111 obtenido en 1-3, se digirieron 10 \mug de ADN con 100 unidades de XbaI y 100 unidades de PstI durante 3 horas a 37ºC. El ADN digerido resultante se trató con fenol-cloroformo y el ADN se recuperó de la fase acuosa por precipitación en etanol y se secó a presión reducida.

A continuación, la región contracorriente del gen P-450_{sca-2} contenido en pSCA111 se eliminó en la dirección 5'\to3' como describió Henikoff [c.f. Henikoff, S., (1984), Gene, 28, 351-359]. Doscientas unidades de exonucleasa III (Takara Shuzo) se añadieron a 10 \mug de ADN pSCA111 en 100 \mul de tampón exonucleasa (Tris-HCl 50 mM, cloruro de magnesio 5 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, pH 8,0, preparado en agua destilada), y la reacción se dejó durante 5 minutos a 37ºC. Después de este tiempo, la reacción se paró calentando a 65ºC durante 5 minutos y después la solución de la reacción se trató con fenol-cloroformo. El ADN se recuperó de la fase acuosa por precipitación en etanol y se secó a presión reducida.

El ADN seco resultante se trató con 50 unidades de nucleasa de semillas de mung (Takara Shuzo) en 40 \mul de tampón acetato 30 mM (pH 5,0), conteniendo cloruro sódico 100 mM, acetato de zinc 1 mM y glicerol al 5% (v/v) durante 30 minutos a 37ºC. De nuevo, el ADN se trató con fenol-cloroformo, se recuperó de la fase acuosa por precipitación en etanol y se secó a presión reducida.

El ADN precipitado se trató con 5 unidades de T4 ADN polimerasa (Takara Shuzo) en 10 \mul de tampón T4 ADN polimerasa [Tris-HCl 33 mM, acetato potásico 66 mM, acetato magnésico 10 mM, 0,5 mM ditiotreitol, albúmina de suero bovino 0,1 mg/ml (Takara Shuzo), pH 7,9, hecho en agua] a 37ºC durante 5 minutos. Posteriormente, el ADN así tratado se trató con fenol-cloroformo, se extrajo por precipitación en etanol y se secó a presión reducida.

La combinación del tratamiento con nucleasa de semillas de mung y polimerasa T4 ADN aseguró que el fragmento de ADN no tuviese pegados los finales 5' o 3'.

Después, el ADN se trató con 10 unidades de fosfatasa alcalina llevado a un volumen final de 400 \mul de tampón de fosfatasa alcalina (Tris-HCl 50 mM, cloruro de magnesio 1 mM, pH 9,0, preparado en agua destilada) durante 30 minutos a 37ºC. El producto de la reacción se trató a continuación con fenol-cloroformo, se extrajo por precipitación en etanol y se secó a presión reducida.

El ADN resultante se mezcló con 100 ng del linker (del que forma la unión) fosforilado XbaI (Takara Shuzo) en tampón ligasa conteniendo 1800 unidades de ligasa T4 ADN llevado a un volumen final de 50 \mul, y la reacción de ligación se dejó durante 2 horas a 16ºC. Las células competentes de la cepa HB101 de E. coli se transformaron con una porción de la reacción de ligación, de forma similar a la descrita en la sección anterior (1-2), y se obtuvo pSCA212.

(1-5) Construcción del plásmido pSCA301

Diez \mug de plásmido multicopia pIJ702 [c.f. Katz, E., y col., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2703-2714] se digirieron a 37ºC durante 3 horas con 100 unidades de SacI y 100 unidades de SphI en tampón H. Los productos de la digestión se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% peso/volumen, y el fragmento de ADN correspondiente a 5,4 kpdb se cortó del gel.

Como parte del procedimiento de clonación, fue necesario preparar un oligonucleótido de doble-hebra con los lugares de desconexión interna HindIII y EcoRI, así como finales de ADN adecuados para la unión a los sitios SacI y SphI. Dicho oligonucleótido de doble hebra se preparó por recocido de dos oligonucleótidos de hebra simple descritos más abajo. Ambos oligonucleótidos fueron sintetizados por el método de fosforamidita, utilizando un sintetizador de ADN (Model 380, Applied Biosystems) [c.f. Beaucage, S.L., y col., (1981), Tetrahedron Letters, 22, 1859-1862]. Las secuencias son:

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 SEC ID NO. 2 \+
5'-GATCTAAGCTTGAATTCGCATG-3'\cr  SEC
ID NO. 3 \+
5'-CGAATTCAAGCTTA-3'\cr}

Catorce \mumol de cada oligonucleótido se mezclaron conjuntamente en un tampón TE hasta un volumen final de 400 \mul. La mezcla se calentó a 100ºC durante 5 minutos, y después gradualmente se enfrió hasta 25ºC. Un oligonucleótido de doble hebra se formó entre los dos oligonucleótidos de cadena simple complementarios.

100 ng del oligonucleótido de doble cadena así obtenido se mezclaron con 1 \mug del fragmento de 5,4 kpdb de pIJ702 el cual había sido digerido con SacI y SphI en tampón ligasa conteniendo 1800 unidades de ligasa T4 ADN hasta un volumen final de 100 \mul, y la reacción de ligación se dejó durante 2 horas a 16ºC. Una porción de la reacción de ligación se transformó en esferoplastos preparados a partir de cepas TK21 de Streptomyces lividans. Los transformantes resultantes se cultivaron en presencia de tiostrepton para seleccionar células que contuviesen al plásmido. El procedimiento usando cepas TK21 de Streptomyces lividans está descrito en el método indicado abajo [1]. Entonces, el ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a tiostrepton de acuerdo con el método indicado abajo [2].

Método [1]

Transformación de cepas TK21 de Streptomyces lividans

La transformación de Streptomyces lividans TK21 se llevó a cabo de acuerdo con el método de Thompson [c.f. Thompson, C.J., y col., (1982), J. Bacteriol., 151, 668-677]. Los detalles de las disoluciones utilizadas están indicados al final de este protocolo.

Una línea de la cepa TK21 de Streptomyces lividans [c.f. Hopwood, D.A., y col., (1983), J. Gen. Microbiol., 129, 2257-2269] se inoculó en 20 ml de medio líquido GPY y se cultivó durante 3 días a 28ºC, con agitación, a 120 rpm. Después de este tiempo, las células en este medio de precultivo líquido se resuspendieron utilizando un homogenizador de Teflon® y 5 ml de medio líquido se diluyeron en 110 ml de medio S-GGC^{Y}, y las células crecieron durante 24 horas más en un matraz Sakaguchi a 28ºC, con agitación, a 120 rpm. Pasado este tiempo, las células en el medio de cultivo fueron recogidos por centrifugación (10 minutos, 4ºC, 1,600 x g). El pellet (gránulo) resultante se lavó con tampón P y se centrifugó otra vez (10 minutos, 4ºC, 1,600 x g) para obtener un pellet y el lavado se realizó dos veces más.

Se resuspendió un gramo del pellet de células lavadas en 10 ml de tampón P y después un mismo volumen de tampón P, conteniendo 20 mg/ml de lisozima, se adicionó a la suspensión de células y la mezcla se cultivó con agitación generosa durante 1,5 horas a 30ºC y 120 rpm. Esto dio lugar a la formación de esferoplastos Streptomyces lividans TK21.

La suspensión de esferoplastos se filtró dos veces, cada vez a través de 8 piezas de gasa, y después se centrifugó durante 10 minutos a 4ºC y 1,600 x g para obtener un pellet. Los esferoplastos del pellet se lavaron dos veces con tampón P, como antes y recolectados por centrifugación durante 10 minutos a 4ºC y 1.600 x g. El pellet se resuspendió en 0,8 ml de tampón P y se dejó en hielo. 20 \mul de la reacción de ligación se adicionaron a 100 \mul de la suspensión de esferoplastos, y la suspensión se dejó en hielo durante 2 minutos más, después de este tiempo 500 \mul de tampón P conteniendo 20% (peso/volumen) de polietilenglicol 1540 se adicionaron a la suspensión. La suspensión se dejó en hielo durante 2 minutos más, y después se adicionaron 5ml de tampón P. Cien \mul de esta suspensión se colocaron suavemente en una capa en una placa de 10 ml de medio regenerativo conteniendo 2% (peso/volumen) de bactoagar, y las células crecieron en este medio sólido a 28ºC durante aproximadamente 20 horas. Cinco ml de medio líquido de regeneración, conteniendo bactoagar 0,7% (peso/volumen) y tiostrepton 75 \mug/ml, se calentaron a 45ºC, y se colocaron en una placa de agar. La placa se incubó a 28ºC, y las cepas resistentes a tiostrepton se aislaron después de 3 a 5 días.

La composición de los medios y tampones utilizados en el procedimiento para la transformación indicada anteriormente se muestran a continuación. En todos los casos se utilizó agua destilada como disolvente.

a)

Medio GPY
Glucosa	20 g/litro (p/v)
Polipeptona	10 g/litro (p/v)
Extracto de levadura	1 g/litro (p/v) (pH 7,0-7,2)

b)

Medio S-GGC^{Y}
Solución A
Sacarosa	340 g/litro (p/v)
Glicerol	4 g/litro (p/v)
Glicina	1 g/litro (p/v)
Ácido casamínico	4 g/litro (p/v)
Extracto de levadura	1 g/litro (p/v)
Sulfato magnésico- 7 hidrato	1 g/litro (p/v)
Cloruro cálcico-2 hidrato	0,1 g/litro (p/v)
Solución con trazas de sales metálicas^{e)}	4 ml/litro (v/v)
Solución B
Dihidrogenofosfato potásico	20 g/litro (p/v)
Hidrogenofosfato dipotásico-12 hidrato	80 g/litro (p/v)

Las soluciones A y B se esterilizaron por separado y 100 ml de A se mezclaron con 10 ml de B.

c)

Tampón P
Sacarosa	102 g/litro (p/v)
Sulfato potásico	0,248 g/litro (p/v)
Cloruro magnésico-6 hidrato	2,00 g/litro (p/v)
Solución con trazas de sales metálicas^{e)}	1,98 ml/litro (v/v)
Dihidrogenofosfato potásico	49,5 g/litro (p/v)
Cloruro cálcico-1 hidrato	3,64 g/litro (p/v)
TES (pH 7,2)	5,67 g/litro (p/v)

d)

Medio de regeneración
Sacarosa	100 g/litro (p/v)
Glucosa	9,69 g/litro (p/v)
Ácido casamínico	96,9 mg/litro (p/v)
Extracto de levadura	1,94 g/litro (p/v)
Extracto de malta	4,84 g/litro (p/v)
Sulfato potásico	243 mg/litro (p/v)
Cloruro magnésico-6 hidrato	9,84 g/litro (p/v)
Dihidrogenofosfato potásico	48,4 mg/litro (p/v)
Cloruro cálcico-2 hidrato	2,85 g/litro (p/v)
TES (pH 7.2)	5,56 g/litro (p/v)
Solución con trazas de sales metálicas^{e)}	1,94 ml/litro (v/v)
Hidróxido sódico	0,00484 N
L-prolina	2,91 g/litro (p/v)
DL-norleucina	48,4 mg/litro (p/v)
L-tirosina	0,969 g/litro (p/v)

e)

Solución con trazas de sales metálicas
Cloruro de cinc	40 mg/litro (p/v)
Cloruro de hierro (II)-6 hidrato	200 mg/litro (p/v)
Cloruro de cobre (II)-2 hidrato	10 mg/litro (p/v)
Cloruro de manganeso (II)-4 hidrato	10 mg/litro (p/v)
Borato sódico-10 hidrato	10 mg/litro (p/v)
Molibdato amónico-4 hidrato	10 mg/litro (p/v)

Método [2]

Preparación de ADN plamídico a partir de Actinomyces

La cepa resistente a tiostrepton obtenida en el método indicado anteriormente [1] creció durante 3 días a 28ºC y a 200 rpm en un incubador agitador (Tokyo Dennetsu Keiso Co. Ltd., Japón) en 100 ml de medio GPY, conteniendo 25 \mug/ml de tiostrepton. Las células en el medio de cultivo fueron después granuladas por centrifugación a 4,000 x g y 4ºC durante 10 minutos. El pellet resultante se resuspendió en 4 ml de tampón 25 mM de Tris-HCl (pH 8.0) conteniendo 10 mg/ml de lisozima (Sigma), glucosa 50 mM y EDTA 10 mM y se incubó a 30ºC durante 1 hora. Pasado este tiempo, la suspensión de células se mezcló con 8 ml de una solución de dodecilsulfato sódico al 1% (p/v) conteniendo hidróxido sódico 0.2 M. La mezcla resultante se agitó y se dejó reposar durante 10 minutos en hielo. Después, 6 ml de una disolución acuosa 3 M de acetato sódico (pH 4,8) se adicionaron a la mezcla, la cual se mezcló y se centrifugó a 11.000 x g, a 4ºC durante 15 minutos.

El total del sobrenadante resultante se colocó en una columna Qiagen 500 (Funakoshi), que había sido previamente calibrada con 10 ml de tampón de absorción [ácido 3-(N- morfolino)-propanosulfónico (``MOPS'') 50 mM, cloruro sódico 750 mM, etanol 15% (v/v), Triton® 0,15% (v/v) X-100, (pH 7,0), preparado en agua]. A continuación, la columna se lavó con 30 ml de tampón de lavado [MOPS 50 mM, cloruro sódico 1 M, etanol 15% (v/v), pH 7,0, preparado en agua], y después el ADN plamídico fue eluído de la columna utilizando 15 ml de tampón de elución [Tris-HCl 50 mM, cloruro sódico 1,25 M, etanol 15% (v/v), pH 8,5, preparado en agua].

10.5 ml de isopropanol se adicionaron al eluído resultante, y esta mezcla se centrifugó durante 15 minutos (11.000 x g, 4ºC) para precipitar el ADN. El ADN precipitado se resuspendió en 400 \mul de tampón TE, al cual se le adicionaron a continuación 5 \mul de 2 mg/ml de ribonucleasa A (Sigma), para eliminar cualquier ARN contaminante, dejando la reacción proceder durante 30 minutos a 37ºC. Pasado este tiempo, el ADN se trató con fenol-cloroformo y se precipitó por tratamiento de la fase acusa con etanol. El ADN plasmídico precipitado se secó a presión reducida.

(1-6) Construcción de pSCA1013-\Delta(1013/428)

Diez \mug de ADN pSCA301 obtenido en el apartado (1-5) indicado anteriormente se digirieron con 100 unidades de EcoRI y 100 unidades de HindIII durante 3 horas a 37ºC en tampón H. El producto resultante de la digestión se trató con fenol-cloroformo y el ADN se extrajo de la fase acuosa por precipitación en etanol. El ADN precipitado se secó a presión reducida.

En paralelo, 10 \mug de pSCA212 se digirieron con 100 unidades de EcoRI y 100 unidades de HindIII a 37ºC durante 3 horas en tampón H. Los productos de la digestión se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1% peso/volumen, y se cortó del gel el fragmento de ADN de 2,2 kpdb que codifica el gen del citocromo P-450_{sca-2}.

200 ng del fragmento de ADN pSCA212 de 2,2 kpdb así obtenido se adicionaron a 100 ng del fragmento de ADN pSCA301 EcoRI-HindIII en 100 \mul de tampón ligasa conteniendo 1800 unidades de T4 ligasa ADN, y la reacción de ligación se llevó a cabo a 16ºC durante 2 horas. Pasado este tiempo, el ADN de la reacción de la ligasa se transformó en Streptomyces lividans como se describe en el método anterior [1], y la cepa resistente a tiostrepton de Streptomyces lividans obtenida por este método se denominó SANK 62795. El ADN plasmídico se obtuvo a partir de esta cepa por el método anterior [2], y este plásmido se nombró pSCA1013-\Delta(1013/428).

El procedimiento de esta sección se indica en la Figura 1, y el mapa del plásmido resultante se muestra en la Figura 3. El plásmido pSCA1013- \Delta(1013/428) obtenido es capaz de replicarse en Actinomyces spp. Contiene aproximadamente 0.4 kpdb de ADN derivado del promotor 5' del gen del citocromo P-450_{sca-2}, e incluye toda la secuencia codificada de P-450_{sca-2}.

(1-7) Construcción de pSCA205

Diez \mug de pSCA111, como se obtienen en el Ejemplo 1-3, se trataron con HindIII a 37ºC durante 5 horas en tampón H, después de este tiempo la solución de reacción se trató con fenol-cloroformo y se precipitó en etanol y el ADN precipitado se secó a presión reducida. El término HindIII de pSCA111 se hizo romo utilizando un kit de truncaje de ADN (Takara Shuzo). La fracción roma se trató con fenol-cloroformo y el ADN se precipitó con etanol y se secó a presión reducida.

El ADN resultante se disolvió en 200 \mul de tampón TE, y 4 unidades de fosfatasa alcalina (Toyobo) se adicionaron a la disolución. Después, esta disolución se incubó a 37ºC durante 30 minutos para desfosforilar los extremos romos. El fragmento desfosforilado se trató con fenol-cloroformo, se recuperó de la fase acuosa por precipitación en etanol, y se secó a presión reducida.

16,5 ng del linker SacI se adicionaron a 100 ng de pSCA111 defosforilado y romo, y el fragmento se cicló utilizando un kit de ligación ADN (Takara Shuzo) para formar el plásmido pSCA112 en el cual el lugar HindIII de pSCA111 está sustituido por un lugar SacI (ver Figura 5).

Con el objetivo de obtener un fragmento SacI de 2,8 kpdb de a partir de pSCA112 conteniendo el gen estructural de P-450_{sca-2} y su promotor, pSCA112 se digirió parcialmente con SacI como se indica a continuación. 22,1 \mug de pSCA112 se trataron con 1250 unidades de SacI a 37ºC durante 22 horas en tampón L. Los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1% peso/volumen y se cortó un fragmento de 2,8 kpdb. Este fragmento se transfirió a un tubo de diálisis y se eluyó con un tampón 1 x TBE a 150 V durante 1,5 horas para obtener el fragmento de 2.8 kpdb SacI. La disolución conteniendo el fragmento SacI se trató con fenol-cloroformo y el ADN se precipitó con etanol y se secó a presión reducida.

La totalidad del ADN resultante se disolvió en tampón TE tampón conteniendo 1 g/ml de cloruro de cesio y, a continuación, se adicionó bromuro de etidio hasta 0,1 mg/ml. La disolución resultante se centrifugó a 50,000 x g a 15ºC durante 2 horas para aislar el fragmento SacI de 2,8 kpdb. Después, el pellet se extrajo tres veces con isopropanol saturado con cloruro sódico y conteniendo tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), para eliminar el bromuro de etidio. Después del lavado se realizó una diálisis durante toda la noche en tampón TE a 4ºC. La fracción resultante se precipitó en etanol, después se lavó con disolución acuosa de etanol 70% v/v y se secó a presión reducida para proporcionar 76 \mug de fragmento SacI (2,8 kbp) parcialmente purificado.

Este fragmento SacI parcialmente purificado estaba contaminado con un fragmento de ADN de 3,2 kpdb derivado originalmente de pUC119. Para eliminar dicho fragmento, 75 \mug del fragmento SacI (2,8 kbp) parcialmente purificado se trataron con 205 unidades de PvuI a 37ºC durante 12 horas en tampón K. El producto de reacción fue después sometido a electroforesis en gel de agarosa 1% peso/volumen para obtener el fragmento de 2,8 kpdb SacI. El fragmento cortado del gel se dializó como antes pero, esta vez, durante sólo 1 hora, para eluir el fragmento de ADN. La disolución de diálisis se trató con fenol-cloroformo y el ADN se precipitó y se secó a presión reducida.

El ADN seco se disolvió en 2 ml de tampón TE conteniendo cloruro de cesio 1 g/ml seguido de adición de bromuro de etidio hasta 0.1 mg/ml. La disolución resultante se centrifugó a 120.000 rpm (650.000 x g) a 15ºC durante 2 horas para aislar el fragmento SacI de 2,8 kpdb. A continuación, el aislado se extrajo tres veces con isopropanol saturado con cloruro de sodio y conteniendo tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), para eliminar el bromuro de etidio. Después de este lavado, el fragmento se sometió a diálisis en tampón TE a 4ºC durante toda la noche. El ADN dializado se precipitó con etanol, se lavó con preparación acuosa de etanol al 70% v/v y se secó a presión reducida. El ADN seco se disolvió en 20 \mul de tampón TE. El rendimiento final fue de 9,8 \mug del fragmento SacI (2.8 kpdb) conteniendo el gen estructural P-450_{sca-2} y su promotor.

En paralelo, 200 \mug de pIJ702 se trataron con 300 unidades de SacI a 37ºC durante 20 horas en tampón L. La disolución se trató con fenol-cloroformo y la fase acuosa se trató con etanol para precipitar el ADN y el ADN precipitado se secó a presión reducida. El ADN se disolvió en 800 \mul de tampón TE y después se añadieron 80 unidades de fosfatasa alcalina al medio de reacción y se dejó a 37ºC durante 30 minutos. Pasado este tiempo, la solución se trató de nuevo con fenol-cloroformo y la fase acuosa se trató con etanol para precipitar el ADN que se secó a presión reducida. El ADN seco se disolvió en tampón TE conteniendo 1 g/ml de cloruro de cesio, seguido de adición bromuro de etidio hasta 0,1 mg/ml. La disolución resultante se centrifugó a 120.000 rpm (650.000 x g) a 15ºC durante 2 horas para aislar pIJ702 tratado con SacI.

El pellet resultante se extrajo tres veces con isopropanol saturado con cloruro de sodio y conteniendo tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), para eliminar el bromuro de etidio. El fragmento se sometió a diálisis en tampón TE a 4ºC durante la noche. Después, este ADN dializado se precipitó en etanol, se lavó con una preparación acuosa de etanol 70% v/v y se secó a presión reducida. El procedimiento anterior proporcionó 37 \mug de SacI y pIJ702 tratado con fosfatasa alcalina.

2,4 \mug del fragmento SacI de 28 kpdb preparados a partir de pSCA112 se añadieron a SacI y pIJ702 tratado con fosfatasa alcalina en tampón TE. Los dos fragmentos se ligaron con un kit de unión de ADN (Takara Shuzo). Streptomyces lividans TK 21 se transformó con el plásmido resultante, y el plásmido se purificó a partir del transformante por el método de Hopwood (Hopwood y col., ``Genetic Manipulation de Streptomyces - A Laboratory Manual'' : John Innes Institute, Norwich, 1985). Este plásmido fue llamado pSCA205.

Ejemplo 2 Secuenciación de Nucleótidos

El ADN plasmídico obtenido según el Ejemplo 1 se preparó por secuenciación por desnaturalización alcalina utilizando el método de Zhang [c.f. Zhang, H. y col., (1988), Nucleic Acids Res., 16, 1220]. La desnaturalización se llevó a cabo incubando 5 \mug de ADN plasmídico durante 5 minutos a 37ºC en 20 \mul de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) conteniendo EDTA 0,2 mM de hidróxido sódico 0,2 M. El ADN se recuperó de esta disolución por precipitación en etanol. El ADN precipitado se lavó con etanol 70% (v/v), y se secó a presión reducida. El ADN resultante se utilizó como plantilla para la secuenciación de nucleótidos.

La secuenciación del ADN se llevó a cabo utilizando un kit 7-deazasecuenasa, versión 2.0 (Toyobo). Los resultados indican que la región 5' del gen del citocromo P-450_{sca-2} presente en el plásmido pSCA1013-\Delta(1013/428) tiene una longitud de 428 pdb. Esta secuencia se reproduce como SEC ID NO. 1, nucleótidos nos. 1-428.

Ejemplo 3 Producción y cuantificación de la pravastatina sódica

Se inocularon por separado colonias individuales de cada una de las cepas de Streptomyces lividans SANK 62795, S. lividans TK21/pSCA205 y TK21 en frascos Erlenmeyer de 500 ml a partir de un medio sólido, conteniendo cada uno 100 ml de medio de levadura [glucosa 2% (p/v), peptona 1% (p/v), extracto de levadura (Difco) 0,1% (p/v), pH 7,0, preparado con agua destilada] conteniendo 20 \mug/ml de tiostrepton. Los cultivos se cultivaron durante 3 días con agitación a 28ºC y 200 rpm. Cinco ml de cada medio de cultivo se inocularon en lotes separados de 100 ml de medio de levadura conteniendo 20 \mug/ml de tiostrepton y cada uno se cultivó durante 24 horas más a 28ºC y 200 rpm. Pasado este tiempo, se adicionó ML-236B sódico hasta una concentración final de 500 \mug/ml [c.f. Endo, A., y col., (1976), J. Antibiotics, 29, 1346 y Serizawa, N., y col., (1983), J. Antibiotics, Vol.XXXVI, No 7, 887-891] y se continuó el cultivo con agitación a 28ºC y 200 rpm durante 1 hora más. Pasado este tiempo, se tomó una porción de cada uno de los medios de cultivo que se utilizó para medir la producción de pravastatina sódica. Cada muestra se analizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia en las siguientes condiciones operacionales:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Columna: \+ Cartucho Radial pack  C18 (Waters)\cr  Disolvente: \+
tampón fosfato 0,1% p/v conteniendo acetonitrilo 30% v/v y\cr  \+
trietilamina 0,1% v/v, pH 3,2\cr  Flujo: \+ 1 ml/min\cr  Longitud de
onda de detección: \+ 237 nm\cr  Tiempo de retención de la
pravastatina sódica: \+ 11,9
minutos\cr}

También se realizó la cromatografía de una cantidad conocida de pravastatina sódica, en condiciones idénticas a las descritas anteriormente, para utilizarlas como condiciones de referencia estándar [c.f. Serizawa, N., y col., (1983), J. Antibiotics, 36, 608]. La cantidad de pravastatina sódica producida por las diferentes cepas de S. lividans se calculó por comparación del área del pico de pravastatina de la tabla de detección con el área del pico de pravastatina de una cantidad conocida de pravastatina estándar.

La cepa de Streptomyces lividans SANK 62795 produjo 51 \mug/ml de pravastatina sódica, S. lividans TK21/pSCA205 produjo 11 \mug/ml de pravastatina sódica mientras que la cepa de Streptomyces lividans TK21 no produjo pravastatina sódica en cantidades detectables. Esto demuestra claramente la ventaja de los promotores de la presente invención.

Ejemplo 4 Construcción de los Plásmidos pSCA1013-\Delta(1013/320), pSCA1013- \Delta(1013/158), pSCA1013-\Delta(1013/101) y pSCA1013-\Delta(1013/74)

Para caracterizar mejor la región del promotor del gen P-450_{sca-2}, se prepararon unos plásmidos que contenían fragmentos diferentes de la región 5' del promotor unida al gen estructural de P-450_{sca-2}. De aquí en adelante, el término ``P-450_{sca- 2}'' se utilizará para referirse al gen estructural que codifica la secuencia intacta de amino ácido de P-450_{sca-2}.

Los plásmidos de este Ejemplo, esto es, pSCA1013-\Delta(1013/320), pSCA1013- \Delta(1013/158), pSCA1013-\Delta(1013/101) y pSCA1013-\Delta(1013/74), se prepararon como se indica a continuación (en la Figura 2 se ilustran en forma de diagrama los detalles de la preparación). Cada uno de los plásmidos tiene insertados promotores 5' digeridos en la dirección 5'\to3', preparados de forma similar a la descrita en el Ejemplo 1-4. Debido a que la longitud del fragmento digerido no se puede predecir con exactitud después de la digestión con exonucleasa III, cada plásmido contiene un promotor de diferente longitud.

1) Construcción de pSCA1013-\Delta(1013/320)

El pSCA213 se obtuvo a partir de ADN pSCA111 mediante un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1-4 (ver Figura 2). El ADN pSCA213 se digirió con EcoRI y HindIII, y los productos de la digestión se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1% peso/volumen, y un fragmento de ADN EcoRI-HindIII de aproximadamente 2,1 kpdb, conteniendo el gen P-450_{sca-2} y la región del promotor 5' se cortó del gel. El ADN cortado se trató con fenol-cloroformo, se recuperó de la fase acuosa mediante precipitación en etanol, y el ADN precipitado se secó a presión reducida.

100 ng de pSCA301 se digirieron con EcoRI y HindIII, y se prepararon como se describió en el Ejemplo 1-6. Este ADN se adicionó a aproximadamente 200 ng del fragmento de 2,1 kpdb EcoRI-HindIII obtenido anteriormente en tampón ligasa conteniendo 1800 unidades de ligasa ADN T4 hasta un volumen final de 100 \mul, y la reacción se dejó durante 2 horas a 16ºC. Pasado este tiempo, el ADN ligado se transformó en Streptomyces lividans, tal y como se describió anteriormente en el método [1]. La cepa de Streptomyces lividans resistente a tiostrepton obtenida por este procedimiento se llamó TK21/pSCA1013- \Delta(1013/320). El ADN plasmídico se obtuvo a partir de esta cepa por el método [2] indicado anteriormente, y este plásmido se nombró pSCA1013- \Delta(1013/320).

2) Construcción de pSCA1013-\Delta(1013/158)

El plásmido pSCA214 se obtuvo a partir de ADN pSCA111 por un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1-4 (Ver Figura 2). De forma similar al apartado 1) anterior, pSCA214 se digirió con EcoRI y HindIII para obtener un fragmento de ADN EcoRI-HindIII de aproximadamente 1,93 kpdb de longitud conteniendo el gen P-450_{sca-2} y una región 5' del promotor. Este fragmento se utilizó para transformar pSCA301 tal y como se describió anteriormente en 1).

La cepa de Streptomyces lividans resistente a tiostrepton obtenida se denominó pSCA1013-\Delta(1013/158). El ADN plasmídico se obtuvo a partir de esta cepa por el método indicado anteriormente [2], y este plásmido se nombró pSCA1013-\Delta(1013/158).

3) Construcción del plásmido pSCA1013-\Delta(1013/101)

El plásmido pSCA215 se obtuvo a partir de ADN pSCA111 por un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1-4 (Ver Figura 2). De forma similar al apartado 1) anterior, pSCA215 se digirió con EcoRI y HindIII para obtener un fragmento de ADN EcoRI-HindIII de aproximadamente 1.87 kpdb de longitud conteniendo el gen P-450_{sca-2} y una región 5' del promotor. Este fragmento se utilizó para transformar pSCA301 tal y como se describió anteriormente en 1).

La cepa obtenida de Streptomyces lividans resistente a tiostrepton se denominó TK21/pSCA1013-\Delta(1013/101). El ADN plasmídico se obtuvo a partir de esta cepa por el método indicado anteriormente [2], y este plásmido se llamó pSCA1013-\Delta(1013/101).

4) Construcción de pSCA1013-\Delta(1013/74)

El plásmido pSCA216 se obtuvo a partir de ADN pSCA111 por un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1-4 (Ver Figura 2). De forma similar a la indicada anteriormente en 1), pSCA216 se digirió con EcoRI y HindIII para obtener un fragmento de ADN EcoRI-HindIII de aproximadamente 1,85 kpdb de longitud conteniendo el gen P-450_{sca-2} y una región 5' del promotor. Este fragmento se utilizó para transformar pSCA301 tal y como se describió anteriormente en 1).

La cepa obtenida de Streptomyces lividans resistente a tiostrepton se denominó TK21/pSCA1013-\Delta(1013/74). El ADN plasmídico se obtuvo a partir de esta cepa por el método anterior [2], y el plásmido se llamó pSCA1013- \Delta(1013/74).

5) Determinación del Tamaño y la Secuencia de Nucleótidos de los Fragmentos del Promotor

La longitud de los fragmentos del promotor 5' presentes en cada uno de los plásmidos pSCA1013-\Delta(1013/320), pSCA1013-\Delta(1013/158), pSCA1013- \Delta(1013/101) y pSCA1013-\Delta(1013/74) se determinó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2.

En el plásmido pSCA1013-\Delta(1013/320), el ADN que codifica a la región 5' de P-450_{sca-2} presentó una longitud de 320 pdb, correspondiendo a los nucleótidos de números 109-428 de la SEC ID NO. 1.

El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/158), el ADN que codifica a la región 5' de P-450_{sca-2} presentó una longitud de 158 pdb, correspondiendo a los nucleótidos de números 271-428 de la SEC ID NO. 1.

El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/101), el ADN que codifica a la región 5' de P-450_{sca-2} presentó una longitud de 101 pdb, correspondiendo a los nucleótidos de números 328-428 de la SEC ID NO. 1.

El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/74), el ADN que codifica a la región 5' de P- 450_{sca-2} presentó una longitud de 74 pdb, correspondiendo a los nucleótidos números 355-428 de la SEC ID NO. 1.

6) Producción de Pravastatina Sódica mediada por plásmido

La producción de pravastatina sódica se midió de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3 para las siguientes cepas: Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013- \Delta(1013/320), Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013- \Delta(1013/158), Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013-\Delta(1013/101), y Streptomyces lividans TK21/pSCA1013- \Delta(1013/74). La cepa TK 21 de Streptomyces lividans se usó como control. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

Cepa S. Lividans	Pravastatina Sódica (\mug/ml)
TK 21/ pSCA1013-\Delta(1013/320)	52
TK 21/ pSCA1013-\Delta(1013/158)	12
TK 21/ pSCA1013-\Delta(1013/101)	17
TK 21/ pSCA1013-\Delta(1013/74)	16
TK 21	0

Así, se puede ver que todos los promotores 5' de los plásmidos preparados en este ejemplo muestran una actividad promotora útil.

Ejemplo 5 Inducción de la Transcripción por ML-236B determinada por ``Northern Blotting'' i) Preparación de ARN Total

Se cultivaron las siguientes cepas de S. lividans, que son S. Lividans TK21/pSCA205, S.lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/428), S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/320), S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/158), S. lividans TK21/

\allowbreak

pSCA1013- \Delta(1013/101) y S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/74) de forma similar a la descrita en el Ejemplo 3.

Como en el Ejemplo 3, se adicionó ML-236B sódico al cultivo hasta una concentración final de 500 \mug/ml para los experimentos. Los controles, o experimentos negativos, se prepararon de la misma forma, pero sin adicionar ML- 236B. En este punto, después de la adición de ML-236B a los test experimentales, se continuó el cultivo a 28ºC y 200 rpm durante una hora. Después de este tiempo, el medio de cultivo se centrifugó a 4ºC y 4.000 x g durante 10 minutos y los pellets se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a temperaturas inferiores a -80ºC.

Tres gramos de cada pellet congelado se convirtieron en polvo en un mortero previamente enfriado en nieve carbónica. Este polvo se colocó en un tubo de centrífuga con 15 mL de solución de guanidina-tiocianato (Fluka) [4M de guanidina-tioisocianato (Fluka), 4% (p/v) de Sarcosyl (Sigma), 0,1%(p/v) de Antifoam A (Sigma), EDTA^{.}2 sódico 20 mM, 2-mercaptoetanol 4 mM y ácido cítrico 3 sódico 25 mM (pH 7,0)], y se agitó vigorosamente. Los restos celulares se homogeneizaron durante 30 minutos utilizando un homogenizador polytron. Después, este homogeneizado se centrifugó a 9.000 rpm (10.000 x g) y 4ºC durante 15 minutos. El sobrenadante así obtenido se centrifugó otra vez a 9.000 rpm (10.000 x g) y 4ºC durante 15 minutos. Siete ml de cada fracción sobrenadante resultante se colocaron cuidadosamente en 3 ml de cloruro de cesio 5,7 M conteniendo EDTA^{.}2 sódico 0,1 M que había sido previamente colocado en un tubo de ultracentrifugación (13 PA: Hitachi Koki Co., Ltd) y se centrifugaron a 4ºC y 30.000 (40000 x g) durante 15 horas. Pasado este tiempo, el pellet resultante se disolvió en 0,3 ml de tampón Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) conteniendo EDTA^{.}2 sódico (``tampón TE'') 1 mM y 30 ml de tampón de ácido acético/acetato sódico 3 M (pH 5,2) y después se adicionó 1 ml de etanol a la preparación resultante. Esta preparación se centrifugó a 14500 rpm (18.000 x g) y 4ºC durante 5 minutos. El pellet se secó a presión reducida y se disolvió en 40 \mul de tampón TE para utilizarlo como muestra total de ARN en las siguientes etapas.

ii) Preparación de la Sonda

Diez \mug de pSCA205 se digirieron con 100 unidades de PvuII a 37ºC durante 3 horas en tampón H, y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1% p/v para escindir un fragmento de PvuII 0,49 kpdb. El fragmento de ADN resultante se purificó utilizando fenol-cloroformo, el ADN se precipitó con etanol, y se secó a presión reducida. 500 ng de este fragmento de ADN se marcaron con ^{32}P-dCTP (6000 Ci/mmoles) utilizando un kit de traducción de muesca (Amersham). El fragmento PvuII-marcado (0,49 kbp) resultante se precipitó en etanol dos veces para eliminar ^{32}P-dCTP que no hubiera reaccionado. La sonda resultante se disolvió en 400 ml de tampón TE y se conservó a una temperatura inferior a -20ºC.

iii) Hibidación de Northern

Diez \mug de cada ARN total se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1,2% p/v a 100 V durante 4 horas en tampón MOPS 20 mM (Sigma) conteniendo formaldehído 0,92 M, acetato sódico 8 mM y EDTA 1 mM (pH 7,0). Pasado este tiempo, el gel se agitó despacio en acetato amónico 0,1. Después, el gel se agitó durante una hora en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) conteniendo acetato amónico 1 M. El ARN total se transfirió a una Membrana-Nailon (PALL Ultrafiltration Corp.) y se fijó por métodos estándar. Entonces, la Membrana- Nailon se colocó en 30 ml de 5 x SSPE (cloruro sódico 180 mM, EDTA^{.}2 sódico 0,1 mM, dihidrofosfato sódico^{.}2H_{2}O 18,6 mM y hidrofosfato disódico^{.}12H_{2}O 101 mM) conteniendo formamida 50% v/v formamida, 2,5 x solución de Denhart [0,2 g/l de albúmina sérica bovina, 0,2 g/l de Ficol 400 (Pharmacia) y 0,2 g/l de polivinil pirrolidona] y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón a 42ºC durante 4 horas. La Membrana-Nilón se hizo reaccionar con 100 \mul del fragmento de ADN marcado preparado anteriormente (0,49 kbp), que codifica parte de P-450_{sca-2}, a 42ºC durante la noche en 30 ml de 5 x SSPE conteniendo formamida 50% v/v, 1 x solución de Denhart, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón y dodecilsulfato sódico 0,1% v/v (SDS). Después de este procedimiento, la Membrana-Nilón se lavó dos veces con 2 x SSPE conteniendo SDS 0,1% p/v durante 5 minutos a temperatura ambiente, y luego se lavó otra vez con 1 x SSPE conteniendo SDS 0,1% v/v a 55ºC durante 10 minutos y después, finalmente, se lavó con 0,1 x SSPE conteniendo SDS 0,1% v/v a 55ºC durante 15 minutos. Después, la membrana se secó y la producción comparada de mARN transcrito de 1,8 kpdb a partir del gen P-450_{sca-2} se cuantificó utilizando el Analizador de Imagen BA 100 (Fuji film). Los valores obtenidos para el control negativo de S. lividans TK21/pSCA205 se definió como 1 y los valores de los otros resultados se evaluaron de acuerdo con el anterior. Los resultados se muestran en la siguiente tabla

TABLA 2

	ML-236B sódico
	ausente	presente
S. lividans TK21/pSCA205	1,0	26
S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/428)	31	32
S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/320)	36	31
S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/158)	4,8	8,9
S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/101)	7,6	15
S. lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/74)	2,2	1,3

Considerando los datos anteriores, se puede ver claramente que la actividad del promotor de la región 5' no codificante (1013 bp) intacta es dependiente de la inducción por ML-236B sódico (S. lividans TK21/pSCA205). Por el contrario, los promotores de la invención no requieren tal inducción. También se puede deducir que el presente Ejemplo ensaya niveles de transcripción, niveles de expresión que necesariamente retrasan la transcripción.

(1): INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Sankyo Company, Limited

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(B): CALLE: 5-1, Nihonbashi Honcho 3-chome, Chuo-ku

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(C): CIUDAD: Tokio

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(E): PAÍS: Japón

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(F): CÓDIGO POSTAL: 103

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(G): TELÉFONO: 81-3-5255-7111

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Promotor Actinomiceto

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A): TIPO DE SOPORTE: Floppy disk

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO)

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(vi): FECHA DE SOLICITUD PREVIA:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: JP Hei 7-310247

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-NOV-1995

\vskip0.666000\baselineskip

(2): INFORMATION PARA SEC ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 428 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

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(C): NÚMERO DE HEBRAS: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGíA: linear

\vskip0.333000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.333000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.333000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Streptomyces carbophilus

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CEPA: SANK 62585

\vskip0.333000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 1:

1

100

\vskip0.666000\baselineskip

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2:

\vskip0.333000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

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(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: linear

\vskip0.333000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRICIÓN: /desc = `` ADN Sintético''

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.333000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.333000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCTAAGCT TGAATTCGCA TG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2): INFORMACION PARA SEC ID NO: 3:

\vskip0.333000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: linear

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

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(A): DESCRIPCIÓN: /desc = ``ADN Sintético''

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTI-SENTIDO: NO

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

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\dddseqskip

CGAATTCAAG CTTA

\hfill

14

Claims

1. ADN con actividad promotora de la transcripción, correspondiendo el ADN a: (i) una parte pero no toda la region 5' no codificante de 1013 pdb de longitud inmediatamente contigua a una ORF de Streptomyces carbophilus, que codifica al citocromo P-450_{sca-2}, o (ii) un mutante o variante del citado ADN; comprendiendo dicho ADN como mínimo la secuencia de 74 pdb desde el nucleótido 355 al 428 de SEC ID NO. 1; teniendo dicho ADN una actividad promotora mayor que la de la región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud mencionada, y no requiriendo inducción de la transcripción por el substrato.

2. ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene actividad promotora de la transcripción en al menos una cepa de Streptomyces carbophilus.

3. ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que tiene actividad promotora de la transcripción en al menos una cepa de Streptomyces lividans.

4. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la actividad promotora mencionada es constitutiva.

5. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el mencionado ADN es al menos de 74 pdb de longitud.

6. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el mencionado ADN es al menos de 300 pdb de longitud.

7. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, que tiene una longitud de menos de 100 pdb.

8. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que sea directamente equivalente a la mencionada región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud a la cual se le hayan eliminado pares de bases mediante métodos seleccionados entre endonucleasas de restricción, ingeniería, digestión a partir del final de la región 5' no codificante, y combinaciones de estos.

9. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que sea directamente equivalente a la mencionada región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud que haya sido parcialmente digerida en la dirección 5'\to3'.

10. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que tenga doble hebra.

11. Una hebra de ADN que sea una hebra simple del ADN de cualquier reivindicación anterior.

12. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprenda una secuencia continua de la secuencia SEC. ID.NO. 1, empezando a partir de 428 y continuando todo o parte del camino hasta la base número 1.

13. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que tenga una longitud suficiente para que pueda mostrar actividad promotora al menos en gran parte equivalente a la del ADN insertado seleccionado a partir del grupo que consiste en los ADN insertados de 320 y de 428 pdb de los plásmidos pSCA1013- \Delta(1013/428) y pSCA1013-\Delta(1013/320), respectivamente.

14. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior teniendo una secuencia total que es sustancialmente idéntica a la secuencia de la citada región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud a la que dicho ADN corresponde.

15. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que tenga una secuencia total que comparta en gran parte la secuencia de al menos una secuencia de bases de la mencionada región 5' no codificante de 1013 de longitud a la que dicho ADN pertenece.

16. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que se hibrida a 60ºC en 6 x SSC con ADN comprendiendo la secuencia de nucleótidos 109 a 428 de SEC ID NO. 1.

17. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que se hidrida a 60ºC en 6 x SSC con ADN comprendiendo la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1.

18. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que sea capaz de mostrar suficiente actividad promotora para asegurar un nivel total de expresión más elevado después de un periodo de una hora que el nivel total de expresión obtenido con la citada región 5' no codificante de 1013 bp de longitud que haya sido sometida a una hora de inducción por el substrato.

19. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, teniendo uno o más pares de bases adicionales unidas en tándem a él al menos en uno de sus finales.

20. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 y 8 a 19, que tenga la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1.

21. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6 y 8 a 19, que tenga la secuencia de nucleótidos 109 a 428 de SEC ID NO. 1.

22. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 19, que tenga la secuencia de nucleótidos 271 a 428 de SEC ID NO. 1.

23. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 19, que tenga la secuencia de nucleótidos 328 a 428 de SEC ID NO. 1.

24. ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5 y 7 a 19, que tenga la secuencia de nucleótidos 355 a 428 de SEC ID NO. 1.

25. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, cuando se obtenga a partir de Streptomyces lividans SANK 62795 teniendo el número de acceso FERM BP-5299.

26. ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en unión promotora de la transcripción operativa con una figura de lectura abierta.

27. Una secuencia de ADN comprendiendo ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, a condición de que dicho ADN no esté comprendido en dicha secuencia de ADN de manera que proporcione una versión completa de la mencionada región 5' no codificante de 1013 pdb de longitud.

28. Un vector conteniendo ADN de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.

29. Un vector de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicho vector es capaz de expresar una proteína, en una célula huésped adecuada, siendo dicha proteína codificada por un sistema de lectura abierta en unión operativa con dicho ADN.

30. Un vector de acuerdo con la reivindicación 29, donde dicha proteína es el citocromo P-450_{sca-2}.

31. Un vector según alguna de las reivindicaciones de 28 a 30, el cual confiere un fenotipo seleccionable en el huésped.

32. Un huésped trasformado con un vector según alguna de las reivindicaciones 28 a 32, en donde el ADN que tiene actividad promotora de la transcripción está en unión operativa promotora de la transcripción con un sistema de lectura abierta adicional.

33. Un sistema de expresión que comprende el huésped de la reivindicación 32 y el cual expresa una proteína codificada por el mencionado sistema de lectura abierta adicional cuando el huésped mencionado se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína.

34. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 33, en donde dicho huésped es un huésped procariota.

35. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicho huésped es seleccionado entre un grupo formado por Escherichia coli, Bacillus subtilis y Streptomyces spp.

36. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicho huésped es un huésped actinomiceto.

37. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicho huésped es un huésped estreptomiceto.

38. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 34, en donde dicho huésped es un huésped Streptomyces lividans.

39. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 38, en donde dicho huésped es la cepa TK21 de Streptomyces lividans.

40. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 39, donde dicho huésped es una cepa transformada de S. lividans, y la figura de lectura abierta es ADN heterólogo.

41. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 40, para expresar proteínas procariotas.

42. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 41, donde dicho vector es un vector de expresión multicopia.

43. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 42, donde dicho vector multicopia es pIJ702.

44. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 43, para la expresión de productos que de forma natural sólo se expresan después de inducción por substrato.

45. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 44, donde dicha proteína es un antibiótico.

46. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 45, el cual es co-cultivado con un sistema que produce un substrato para dicho producto de expresión.

47. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 46, en donde el citocromo P-450 es dicho producto de expresión.

48. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 47, en donde el citocromo P-450_{sca} es dicho producto de expresión.

49. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 48, en donde el citocromo P-450_{sca-2} es dicho producto de expresión.

50. Un sistema de expresión según alguna de las reivindicaciones 33 a 49, en donde la proteína a expresar es un citocromo P-450_{sca} y el huésped es una cepa de S. lividans la cual también expresa un sistema de transferencia electrónica que permite a dicho citocromo tomar parte en la hidroxilación de cualquier ML-236B presente en el sistema.

51. Un procedimiento para producir pravastatina sódica que implica cultivar el sistema de expresión de la reivindicación 50, llevándose a cabo dicho cultivo en presencia de ML-236B sódica y bajo condiciones que permitan la producción del citocromo, permitiendo que dicho ML-236B sódico sea convertido en pravastatina sódica por la acción catalítica de dicho citocromo P-450_{sca-2}, y recuperando después la pravastatina sódica del cultivo.

52. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 51, en donde dicho huésped es o Streptomyces lividans SANK 62795 con el número de acceso FERM BP-5299 o Streptomyces lividans TK21.

53. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 51 ó 52, en donde la mencionada ML-236B es producida por Penicillium citrinum que es co-cultivado con dicho huésped.

54. Un procedimiento para producir una proteína deseada, implicando dicho procedimiento implica cultivar un huésped transformado de acuerdo con la reivindicación 32 en condiciones que permitan la producción de dicha proteína para producir la proteína, y recuperar la proteína.

55. Un sistema de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 50, donde el citado sistema de lectura abierta codifica cualquier secuencia de aminoácido adecuada.

56. Un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 55, en donde la mencionada secuencia de aminoácidos se selecciona a partir de: una forma natural, variante o polimérica de una proteína; una forma fusionada de dos o más proteínas diferentes; y combinaciones de éstas.

57. Streptomyces lividans SANK 62795 con el número de acceso FERM BP-5299.

58. El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/428).

59. El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/320).

60. El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/158).

61. El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/101).

62. El plásmido pSCA1013-\Delta(1013/74).

63. Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013-\Delta(1013/428).

64. Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013-\Delta(1013/320).

65. Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013-\Delta(1013/158).

66. Streptomyces lividans TK 21/pSCA1013-\Delta(1013/101).

67. Streptomyces lividans TK21/pSCA1013-\Delta(1013/74).

68. Un promotor de la transcripción con la secuencia de nucleótidos 1 a 428 de SEC ID NO. 1 obtenida cultivando Streptomyces lividans SANK 62795 con el número de acceso FERM BP-5299, recuperando pSCA1013-\Delta(1013/428) a partir de células y digiriendo el plásmido con enzimas de restricción.