BRPI0905853B1

BRPI0905853B1 - Processo para a produção de proteínas recombinantes, melhorando a incorporação de fosfato.

Info

Publication number: BRPI0905853B1
Application number: BRPI0905853-2A
Authority: BR
Inventors: Saurabh Garg; Mayank Kumar Garg; Sulekha Joshi; Bimal Kumar; Anuj Goel; Chittnalli Ramegowda Naveen Kumar; Sanjay Tiwari; Mukesh Babuappa Patale; Harish Iyer
Original assignee: Biocon Limited
Priority date: 2008-02-06
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2019-03-26
Also published as: EP2565272A3; JP5587795B2; US20100317056A1; IL207402A0; US9255285B2; IL221379A0; KR20100118592A; KR101283734B1; RU2491345C2; JP2011510677A; BRPI0905853A2; MY161108A; CN101983242B; IL207402A; CN103642843B; MX349413B; RU2012145969A; EP2247737B1; EP2565272A2; SG188126A1

Abstract

meios de fermentação e processos destes. a presente invenção demonstra a utilidade de amidas de ácido carbônico como ureia ou seus derivados, carbamatos, carbodiimidas e tiocarbamidas como suplementos nitrogenosos em meios de fermentação para produção de proteínas recombinantes para atingir taxas de bioconversão elevadas e peptídeos semelhantes à insulina e análogos de insulina, exendina e enzimas como lipase usando sistemas de expressão fúngica induzíveis por metanol, como pichia.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção demonstra a utilidade de amidas de ácido carbônico como ureia ou seus derivados, carbamatos, carbodiimidas e tiocarbamidas como suplementos nitrogenosos em meios de fermentação para produção de proteínas recombinantes para atingir taxas de bioconversão elevadas e peptídeos semelhantes à insulina e análogos de insulina, exendina e enzimas como lipase usando sistemas de expressão fúngica induzíveis por metanol, como Pichia. Os aspectos significativos 10 da invenção especialmente relacionam-se a um processo de fermentação improvisado com parâmetros de meios nutricionais otimizados responsáveis por produção maior de produto em períodos de produção mais curtos. O princípio da presente invenção pode também ser aplicado para produção de uma ampla variedade de proteínas e metabólitos secundários através da fermentação de um 15 organismo de expressão adequado.

HISTÓRICO E ESTADO DA TÉCNICA DA INVENÇÃO:

Sistemas de expressão à base de levedura como Pichia pastoris são comumente usados para expressar proteínas recombinantes Cregg, J. M. et al., in Dev. Ind. Microbiol. 29:33-41; 1988. O sistema de expressão de P. pastoris usa o promotor de 20 álcool oxidase induzida por metanol (AOX1), que controla o gene que codifica a expressão de álcool oxidase, a enzima que catalisa a primeira etapa no metabolismo do metanol Cregg J. M. et al., em Bio/Technology 11: 905-910; 1993. P. pastoris tem potencial para altos níveis de expressão, secreção eficiente de proteína extracelular, modificações pós-traducionais como glicosilação e crescimento a altas 25 densidades celulares no meio mínimo em culturas de biorreator.

O processo de fermentação de lote alimentado usando Pichia pastoris é descrito em

Petição 870180153173, de 21/11/2018, pág. 10/11

V»

2/42 “Diretrizes de Processo de Fermentação de Pichia” da Invitrogen Co. (San Diego, CA), denominado, doravante, no presente, como controle. Para a produção de proteínas recombinantes, Pichia pastoris transformado é cultivada a uma biomassa de densidade celular alta desejada em glicerol como fonte de carbono. A fase de produção é iniciada pela alimentação do metanol, que serve como indutor e única fonte de carbono à cultura. Durante a geração de biomassa e a fase de produção, a amônia é usada para controlar o pH, que serve como fonte de nitrogênio.

Apesar das várias vantagens conferidas pelos Sistemas de Expressão de Levedura, ainda há a necessidade de otimização do ambiente físico-químico nutricionalmente influenciado para produção de proteína recombinante eficiente e máxima nos biorreatores. Atingir alta produtividade específica é altamente desejável. Pode ser obtida por otimização da composição de meios iniciais, estratégia de alimentação de metanol e parâmetros físico-químicos de processo. Há relatórios em que sulfato de amônio, fosfato de amônio, fosfato de diamônio, nitrato de potássio, ureia, licor íngreme do milho, farelo de soja, farelo de semente de algodão, melado de cano e beterraba, peptonas, hidrolisados de farelo etc. foram usados como fonte de nitrogênio para crescimento de bactéria, levedura e fungo. O uso de diferentes fontes de carbono e nitrogênio para crescimento de um micróbio é um estado da técnica.

Entretanto, a combinação favorável de fontes de carbono e nitrogênio especialmente definidas para produção eficiente de proteínas recombinantes, peptideos e enzimas não foi divulgada na literatura do estado da técnica. Por exemplo, a WO/2007/005646 divulga a produção de etanol per se, cultivando leveduras recombinantes no meio de crescimento complexo, contendo carboidratos complexos, bem como uma variedade de fontes de nitrogênio mais baratas como

3/42 licor íngreme do milho, extrato de milho, levedura autolisada e ureia. Ainda, esse processo não utiliza o maquinário induzível por metanol para crescimento ou produção diferente do processo desenvolvido na presente invenção para produção de proteínas recombinantes. De forma semelhante, uma patente norte americana 4.288.554 descreve um processo de fermentação contínua para simplesmente crescimento de uma espécie de Candida não-GMO, usando ureia em combinação com outras fontes de nitrogênio e meio de sal basal. Não há sugestão ou aprendizagem que for onde a ureia possa ser usada durante o processo de fermentação (lote, lote alimentado, contínuo) usando Pichia pastoris GMO induzível por metanol para produção eficiente de proteínas recombinantes e peptídeos semelhantes à insulina humana e seus análogos ou enzimas semelhantes à lipase.

Foi surpreendentemente descoberto que o uso de meio de fermentação definido, caracterizado por adição controlada de certas fontes nitrogenosas ricas e prontamente solúveis, como ureia, ainda em concentração otimizada com relação às concentrações residuais de ureia, bem como concentração residuais de amônia, gerada a partir da hidrólise da ureia possibilita maior produtividade de produto e, dessa forma, menor tempo de produção.

A produção de proteínas recombinantes usando E. coli. foi conhecida por anos e o sistema de expressão é claramente estudado e compreendido. O sistema de expressão à base de E. coli. foi amplamente usado para a produção de moléculas como GCSF, HGH, Estreptoquinase e muitos outros produtos biológicos semelhantes. Para a produção de proteínas recombinantes, E. coli. transformada é cultivada a uma biomassa de densidade celular alta desejada em dextrose como fonte de carbono. A fase de produção é iniciada por indução, usando um indutor exigido e, então, a cultura é apenas mantida com alimentação mínima de nutrientes

4/42 até o final da fermentação.

Culturas fúngicas tem sido usadas há muito tempo para a produção de bioentidades valiosas como enzimas e outras moléculas de consumo. Culturas fúngicas como Rhizopus, Aspergillus, Penicillium etc. foram usadas na fermentação clínica para a produção de ampla variedade de enzimas semelhantes à lipases, amilases, dextranases etc. que são usadas nas indústrias de alimentos, tecidos, couro e outras. Actinomicetos, conhecidos como cavalos de carga para produção de antibióticos, tem sido usados extensivamente para a produção de diversos metabólitos secundários, benéficos para o tipo humano. Uma das principais propriedades dos fungos e actinomicetos é sua propriedade de “bioconversão”, como hidroxilação, esterificação etc. A principal vantagem é que as bioconversões são específicas de alvo e produtos com pureza relativamente alta podem ser obtidos. Um exemplo clássico é a conversão de compactina em pravastatina.

Melhorias metodológicas conhecidas na técnica incluem medidas relacionadas com a tecnologia de fermentação, como agitação ou fornecimento de oxigênio ou modificação relacionada com a composição dos meios de nutriente, como as concentrações de açúcar modificadas durante a fermentação, alterações do processamento down-stream ou alterações relacionadas com as propriedades intrínsecas do próprio microorganismo etc.

Foi surpreendentemente descoberto que o uso de meio de fermentação, caracterizado pela adição controlada de certas fontes nitrogenosas ricas e prontamente solúveis como ureia permite maior produtividade e/ou maior taxa de bioconversão e, dessa forma, menor tempo de produção.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO:

O principal objetivo da presente invenção é obter um meio de fermentação para

5/42 produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos desta pela fermentação, usando espécies fúngicas induzíveis por metanol.

Outro objetivo importante da presente invenção é obter um meio de fermentação para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos desta pela fermentação, usando microorganismos.

Ainda, outro objetivo importante da presente invenção é obter um meio de fermentação para a produção de metabólitos secundários pela fermentação, usado microorganismos.

Ainda outro objetivo importante da presente invenção é obter um processo de produção de produtos de proteína recombinante ou não-recombinante, seus derivados ou análogos destes.

Ainda outro objetivo importante da presente invenção é obter um processo para produção de metabólitos secundários.

Ainda outro objetivo importante da presente invenção é obter um processo de bioconversão de compactina em pravastatina.

Ainda outro objetivo importante da presente invenção é obter um produto de proteína recombinante.

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO:

Conformemente, a presente invenção relaciona-se a um meio de fermentação para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos destas por fermentação, usando espécies fúngicas induzíveis por metanol, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; um meio de fermentação para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos destas por fermentação, usando microorganismos, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma

6/42 concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; um meio de fermentação para a produção de metabólitos secundários por fermentação, usando microorganismos, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; um processo para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos destas, que compreende em propagar uma espécie fúngica que expressa insulina induzível por metanol em um meio de fermentação, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; um processo para produção de produtos de proteína recombinante ou não-recombinante, seus derivados ou análogos destas, que compreende em propagar microorganismos que expressam proteína induzível ou não-induzível em um meio de fermentação, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; um processo para produção de metabólitos secundários que compreende em propagar um microorganismo em um meio de fermentação, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; um processo de bioconversão de compactina em pravastatina, conversão está efetuada em um meio, caracterizado pelo fato de conter uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico; e um produto de proteína recombinante, obtido conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS:

FIGURA 1: Comparação de perfil de biomassa de precursor IN-105 com/sem adição de ureia.

FIGURA 2: Comparação de perfil de concentração de produto de precursor IN-105 com/sem adição de ureia.

7/42

FIGURA 3: Comparação de perfil de biomassa de precursor de Insulina com/sem adição de ureia.

FIGURA 4: Comparação de perfil de concentração de produto de precursor de Insulina com/sem adição de ureia.

FIGURA 5: Comparação de perfil de biomassa de precursor de Glargina com/sem adição de ureia.

FIGURA 6: Comparação de perfil de concentração de produto de precursor de Glargina com/sem adição de ureia.

FIGURA 7: Comparação de perfil de biomassa de precursor de Exendina com/sem adição de ureia.

FIGURA 8: Comparação de perfil de concentração de produto de precursor de Exendina com/sem adição de ureia.

FIGURA 9: Comparação de perfil de concentração de produto de enzima lipase com/sem adição de ureia.

FIGURA 10: Perfis de biomassa resultantes de várias concentrações de ureia durante fermentação com precursor IN-105.

FIGURA 11: Perfis de Concentração de Produto resultantes de várias concentrações de ureia durante fermentação com precursor IN-105.

FIGURA 12: Perfis de biomassa resultantes de várias concentrações de ureia durante fermentação com precursor de Insulina.

FIGURA 13: Perfis de Concentração de Produto resultantes de várias concentrações de ureia durante fermentação com precursor de insulina.

FIGURA 14: Concentração de Ureia Residual e concentração máxima de produto para produção de IN-105.

FIGURA 15: Concentração de Ureia Residual e concentração máxima de produto

8/42 para produção de precursor de Insulina.

FIGURA 16: Comparação de perfil de biomassa de precursor IN-105 com taxa de alimentação de metanol de ~20g/L/h.

FIGURA 17: Comparação de perfil de concentração de produto de precursor IN-105 com taxa de alimentação de metanol de ~20g/L/h.

FIGURA 18: Estudo de compostos diferentes de ureia, Teste de outros compostos semelhantes com relação a seu impacto mediante produtividade de fermentação de Pichia.

FIGURA 19: Efeito da ureia mediante concentração residual de ions de fosfato no caldo, Efeito da ureia mediante metabolismo de fosfato pela estirpe

FIGURA 20: Perfil de crescimento de cultura para produção de Pravastatina

FIGURA 21: Título de Pravastatina com adição de ureia.

FIGURA 22: Conversão percentual de Compactina em Pravastatina com adição de ureia

FIGURA 23: Comparação de \NC\N de produção de G-CSF em E. coli

FIGURA 24: Efeito da ureia na produtividade específica de GCSF

FIGURA 25: Comparação de WCW para produção de estreptoquinase em E. coli.

FIGURA 26: Efeito da ureia na produtividade específica de Estreptoquinase

FIGURA 27: Efeito da ureia na produção de lipase usando uma Rhizomucor sp

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO:

A presente invenção relaciona-se a um meio de fermentação para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos destas por fermentação, usando espécies fúngicas induzíveis por metanol, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

Em outra configuração da presente invenção, a amida de ácido carbônico é

9/42 selecionada do grupo compreendendo ureia ou seus derivados como dimetilureia, dietilureia, N-acetilfenil ureia, isopropilpilideneureia, fenilureia ou combinação destes.

Ainda, em outra configuração da presente invenção, a amida de ácido carbônico é ureia.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a amida de ácido carbônico é adicionada na forma de líquido, borrifo, pó ou pelota.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a concentração residual de amida de ácido carbônico é de até 1M.

Ainda em outra configuração da presente invenção, concentrações de sais basais e elementos de traço são variadas de 0,1X a 5X do meio de controle, mantendo a concentração residual de amida de ácido carbônico de até 1M.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a captação de fosfato é melhorada.

Ainda em outra configuração da presente invenção, as espécies fúngicas induzível por metanol que expressam o produto de insulina recombinante são selecionadas do grupo compreendendo Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp. ou Hansenula polymorpha.

A presente invenção relaciona-se a um meio de fermentação para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos destas por fermentação, usando microorganismos, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

A presente invenção relaciona-se a um meio de fermentação para produção de metabólitos secundários por fermentação, usando microorganismos, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

10/42

Em outra configuração da presente invenção, a amida de ácido carbônico é selecionada do grupo compreendendo ureia ou seus derivados como dimetilureia, dietilureia, N-acetilfenil ureia, isopropilpilideneureia, fenilureia ou combinação destes. Ainda, em outra configuração da presente invenção, a amida de ácido carbônico é ureia.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a concentração residual de amida de ácido carbônico é de até 10g/L.

Ainda em outra configuração da presente invenção, os microorganismos são selecionados do grupo compreendendo E. coli, Streptomyces sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp, Penillium sp e Rhizomucor sp.

A presente invenção relaciona-se a um processo para produção de proteínas recombinantes, seus derivados ou análogos destas que compreende em propagar uma espécie fúngica que expressa insulina induzível por metanol em um meio de fermentação, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

Ainda em outra configuração da invenção imediata, o produto de insulina recombinante produzido é IN-105.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o produto de insulina

11/42 recombinante produzido é um precursor de insulina, insulina ou seus análogos ou derivados desta.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o produto de insulina recombinante é insulina glargina.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a proteína recombinante produzida é um peptídeo cíclico ou não-cíclico.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o peptídeo recombinante é exendina.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a proteína recombinante produzida é uma enzima.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o produto de enzima recombinante produzido é lipase.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a proteína recombinante produzida é selecionada de um grupo compreendendo um precursor de insulina, insulina ou seus análogos ou derivados desta, glargina, exendina, carboxipeptidase e lipase.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a espécie fúngica induzível por metanol é Pichia pastoris.

Ainda em outra configuração da presente invenção, a taxa de alimentação de metanol é de até 20g/L do caldo por h.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o título de produto máximo

12/42 obtido é acima de 0,1 g/L.

A presente invenção relaciona-se a um processo de produção de produtos de proteína recombinante ou não-recombinante, seus derivados ou análogos destes, que compreende em propagar um microorganismo que expressa proteína induzível ou não-induzível em um meio de fermentação, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o produto de proteína recombinante produzido é G-CSF.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o produto recombinante produzido é estreptoquinase.

Ainda em outra configuração da presente invenção, o produto de proteína é lipase.

A presente invenção relaciona-se a um meio de produção de metabólitos secundários que compreende em propagar um microorganismo em um meio de fermentação, meio este caracterizado pelo fato de consistir de uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

Em outra configuração da presente invenção, o metabólito secundário produzido é pravastatina.

A presente invenção relaciona-se a um processo de bioconversão de compactina em pravastatina, conversão está efetuada em um meio, caracterizado pelo fato de o referido meio conter uma concentração eficaz de uma amida de ácido carbônico.

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Em outra configuração da presente invenção, a amida de ácido carbônico é selecionada do grupo compreendendo ureia ou seus derivados como dimetilureia, dietilureia, N-acetilfenil ureia, isopropilpilideneureia, fenilureia ou combinação destes. Ainda em outra configuração da presente invenção, a bioconversão de compactina em pravastatina é de, no mínimo, 35%.

A presente invenção relaciona-se a um produto de proteína recombinante, obtido conforme acima.

Em outra configuração da presente invenção, o produto de proteína recombinante obtido é selecionado de um grupo compreendendo um precursor de insulina, insulina ou seus análogos ou derivados desta, glargina, exendina, carboxipeptidase e lipase.

A invenção fornece uma composição de nutriente para uso em formulação de um meio de fermentação, cuja composição compreende componentes nitrogenosos, como amidas de ácido carbônico como ureia e formas relacionadas ou derivados mencionados anteriormente, juntamente com um ou mais componentes de outros meios de fermentação que foram especificamente otimizados para obter insulina ou análogos relacionados maiores de produções de produto derivado em períodos de tempo de produção mais curtos.

Foi surpreendentemente descoberto que o uso de um meio de fermentação particular, suplementado com certas fontes nitrogenadas como amidas de ácido carbônico como ureia e formas relacionadas ou derivados em concentrações específicas não afetam o crescimento das células de levedura, particularmente ajudam na melhoria da produtividade.

O componente nitrogenoso adicional como ureia pode ser adicionado na forma de líquido, borrifo, pó ou pelota.

O centro da invenção reside no fato de que a produtividade da insulina ou o

14/42 processo de fermentação de análogo de insulina por Pichia sp. é influenciada amplamente pelo conteúdo de ureia do meio de cultura. Portanto, a produção do produto é consideravelmente aumentada, especialmente nos períodos de tempo de fermentação reduzidos pela adição de um componente nitrogenoso como ureia no meio de cultura.

De acordo com a configuração mais preferida da invenção, a adição de ureia ao meio de fermentação melhora a taxa de consumo de um componente importante “fosfato”, que, por sua vez, melhora a produtividade. Foi descoberto que quanto mais rápido o consumo de fosfato, menor é o tempo do ciclo de fermentação e, assim, maior é a produtividade. Dessa forma, este é o metabolismo recentemente observado da ureia jutamente com fosfato que aumenta a taxa de expressão de proteína ou peptídeo sem afetar o perfil de crescimento e reduz o tempo de fermentação.

De acordo com outro aspecto da invenção, a adição de ureia permite a recuperação de produto elevada no final da fermentação em qualquer pH.

A presente invenção, com isso, permite maiores produções de produto de proteína, menores tempos de ciclo de produção, melhor utilização dos nutrientes alimentados em um processo e, no geral, reduz custos de capital e produção.

Uma estirpe microbiana adequada para um processo de fermentação industrial usando um meio quimicamente definido pode ser qualquer estirpe selvagem, que produza um composto valioso de interesse, considerando-se que a referida estirpe selvagem tenha um bom desempenho de crescimento.

Leveduras preferidas para uso como organismo de produção incluem, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., ou Hansenula polymorpha.

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Além disso, uma estirpe microbiana adequada para um processo de fermentação industrial usando um meio quimicamente definido pode ser uma estirpe que é obtida e/ou melhorada pela submissão de uma estirpe original de interesse a um tratamento mutagênico clássico ou à transformação de DNA recombinante, também com a provisão de que o a estirpe microbiana mutante ou transformada resultante tenha um bom desempenho de crescimento em um meio quimicamente definido. Isso dependerá, portanto, do desempenho de crescimento da estirpe original em um meio quimicamente definido se as estirpes mutantes ou transformadas resultantes devem ter um desempenho de crescimento melhorado ou semelhante em um meio quimicamente definido conforme comparado com aquele da estirpe original.

Como um perito da técnica conhecería, a concentração favorável dos suplementos de amida de ácido carbônico variariam de clone para clone, apesar do resultado final ser obter título maior em menor tempo em todos os casos.

“Meios de fermentação” ou “meio de fermentação” referem-se ao meio-ambiente no qual a fermentação é realizada, que inclui os substratos de fermentação e outras matérias-primas, utilizadas pelos microorganismos de fermentação para produzir o produto terapêutico específico.

“Componentes nitrogenosos” são substratos, matérias-primas ou componentes que são uma fonte de nitrogênio absorvível no meio de fermentação.

De acordo com um aspecto significativo da invenção, o componente nitrogenoso preferido nos meios de fermentação é amidas de ácido carbônico, como ureia. Esta incluir compostos contendo N-CO-N ou grupos relacionados. O uso de derivados de ureia como dimetilureia, dietilureia, N-acetil-N-fenilureia, Isopropilideneureia, N-fenil ureia e os semelhantes ou combinações destes é contemplado pela presente invenção.

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A “quantidade eficaz” empregada é aquela quantidade de ureia ou seus derivados, que, de acordo com a invenção, quando introduzida no meio de fermentação, uma quantidade/produção apreciável da proteína é produzida, ainda, em períodos de tempo menores sem afetar o crescimento das células de levedura.

“Organismo de Fermentação” refere-se a quaisquer microorganismos adequados para uso em um processo de fermentação desejado. Exemplos de microorganismos de fermentação incluem organismos fúngicos, como leveduras. Exemplos de organismos de fermentação no contexto da presente invenção são Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., ou Hansenula polymorpha.

A invenção pode ser adequada para qualquer expressão de peptídeo recombinante usando espécies fúngicas induzíveis por metanol, mas não são peptídeos, proteínas, insulina, precursores de insulina, derivados de insulina ou análogos de insulina recombinantemente expressados, limitados.

O termo “recombinante”, conforme usado aqui para descrever uma proteína ou polipeptídeo significa um polipeptídeo produzido por expressão de um polinucleotídeo recombinante. O termo “recombinante”, conforme usado aqui em referência às células, significa células que podem ser ou foram usadas como receptoras para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência e incluem progênie da célula original, que foi transfectada. Deverá ser compreendido que a progênie de uma célula original simples pode não ser completamente idêntica na morfologia e no complemento de DNA genômico ou total ao original devido à mutação acidental ou deliberada.

O termo “polipeptídeo”, “proteína”, “peptídeo” refere-se a um polímero de aminoácidos e não se refere a uma extensão específica do produto; dessa forma,

17/42 peptídeos, oligopeptídeos e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Esse termo também não se refere a ou exclui modificações pósexpressão do polipeptídeo embora modificações químicas ou pós-expressão desses polipeptídeos podem ser incluídas ou excluídas como configurações específicas. Em uma configuração, a molécula é um polipeptídeo ou seus análogos relacionados ou derivados deste. Preferivelmente, o polipeptídeo é um peptídeo cíclico. De acordo com outra configuração preferida, o polipeptídeo é um peptídeo não-cíclico. Ainda em outra configuração preferida, o polipeptídeo é selecionado do grupo compreendendo exendina, eptifibatida, atosiban, enzimas como lipase, carboxipeptidase e as semelhantes.

A insulina é um polipeptídeo de 51 aminoácidos, que são distribuídos entre duas cadeias de aminoácido: a cadeia A com 21 aminoácidos e a cadeia B com 30 aminoácidos. As cadeias são conectadas uma a outra por 2 pontes dissulfeto. Isso inclui o uso não apenas de insulinas que ocorrem naturalmente, mas também de derivados e análogos de insulina. O composto de insulina pode, por exemplo, ser um composto de insulina de mamífero, como insulina humana ou um derivado ou análogo de composto de insulina.

Derivados de insulina são derivados de insulinas que ocorrem naturalmente, ou seja, insulinas humanas ou insulinas animais, que diferem da insulina que ocorre naturalmente correspondente, de outra forma, idêntica, pela substituição de, no mínimo, um resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente e/ou adição de, no mínimo, um resíduo de aminoácido e/ou resíduo orgânico. Entende-se que o termo insulina define um polipeptídeo composto de uma cadeia B e A. O derivado de insulina pode ser, no mínimo, 60% homólogo a uma insulina que ocorre naturalmente. O derivado de insulina pode ser ainda mais homólogo, como, no

18/42 mínimo, aproximadamente 75% ou, no mínimo, aproximadamente 90%, homólogo a uma insulina que ocorre naturalmente. No geral, derivados de insulina tem uma ação levemente modificada em comparação com insulina humana.

Ao produzir insulina e derivados de insulina por engenharia genética, um precursor de insulina, “pró-insulina”, compreendendo cadeias B, C e A é frequentemente expressado. A referida pró-insulina pode ser convertida em insulina ou um derivado de insulina por remoção enzimática ou química da cadeia C após enovelamento adequado e correto e formação das pontes dissulfeto. O derivado da pró-insulina pode ser, no mínimo, 60% homólogo na cadeia B e A de uma pró-insulina que ocorre naturalmente. O peptídeo C de conexão, entretanto, pode ser escolhido como sendo totalmente diferente de qualquer peptídeo C que ocorre naturalmente. O derivado de pró-insulina pode ser ainda mais homólogo, como, no mínimo, aproximadamente 75% ou, no mínimo, aproximadamente 90%, homólogo a uma pró-insulina que ocorre naturalmente.

De acordo com certas configurações da invenção, o produto de insulina recombinante é IN-105. O produto terapêutico resultante especialmente relaciona-se à molécula IN-105. O IN-105 é uma molécula de insulina, conjugada no épsilon do aminoácido Lisina na posição B29 da cadeia B de insulina com um oligômero ampifílico de fórmula estrutural CH₃O-(C4H₂O)3-CH2-CH2-COOH. A molécula pode ser monoconjugada em A1, B1 e B29, diconjugada em várias combinações de A1, B1 e B29 ou triconjugada em várias combinações de A1, B1 e B29.

De acordo com outro aspecto da invenção, a proteína recombinante produzida através de fermentação, utilizando o meio de fermentação da presente invenção é um peptídeo cíclico ou não-cíclico.

De acordo com outro aspecto da invenção, a proteína recombinante produzida

19/42 através de fermentação, utilizando o meio de fermentação da presente invenção é uma enzima.

Em um aspecto da invenção, o protocolo de fermentação pode compreender três fases: Lote, lote alimentado (opcional) e fase de indução de metanol.

De acordo com o aspecto mais significativo da invenção, o meio de fermentação usado no contexto da invenção subjetiva compreende os seguintes componentes. Ainda configurado está o processo de preparação do meio.

COMPOSIÇÃO DO MEIO:

Componentes	Quantidade (g/L)
CaSO₄.2H₂O	0,93
MgSO₄7H₂O	29,8
K₂SO₄	36,4
KOH	4,13
Glicerol	40
H₃PO₄ (Densidade-1,7)	22,95
Ureia	6,0

Os componentes individuais foram dissolvidos em volume mínimo de água na 10 sequência acima mencionada e esterilizados em 121°C durante 1 hora. A solução de sal de traço e D-biotina (pré-esterilizada por filtração) foram adicionadas assepticamente ao meio, cada uma na taxa de 4,35ml/L de meio (densidade da solução de sais de traço é 1,05 e aquela da D-biotina é 1,0).

COMPOSIÇÃO DA SOLUÇÃO DE SAL DE TRAÇO:

Componentes (Sais)	Quantidade (g/L)
Sulfato de cobre, CuSO₄.5H₂O	6,0
Iodeto de sódio, Nal	0,08
Sulfato de manganês, MnSO₄.H₂O	3,0
Molibdato de sódio, Na₂MoO₄.2H₂O	0,20
Ácido bórico, H₃BO₃	0,02
Cloreto de cobalto, CoCI₂.6H₂O	0,50
Cloreto de zinco, ZnCI₂	20,0
Sulfato ferroso, FeSO₄.7H₂O	65,0
Ácido sulfúrico, H₂SO₄	5,0mL

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Todos os sais foram dissolvidos um por um em água potável e foram esterilizados por filtração através de aparato de filtração de grau estéril.

Preparação de solução de biotina:

D-Biotina 0,2 g/L

A biotina foi dissolvida em água potável e esterilizada por filtração através de aparato de filtração de grau estéril.

Alimentação de Extrato de Levedura e Peptona de Soja:

Adicionalmente, alimentação de Extrato de Levedura e Peptona de Soja (YEP) também foi adicionada durante a fermentação. Deve ser preparada conforme segue:

Componentes	Cone. (g/L)
Peptona de Soja	100
Extrato de levedura	50

Os componentes foram dissolvidos e o volume foi composto com água potável conforme exigido. A solução foi, então, esterilizada em 121°C-123°C durante 90 minutos. A densidade da alimentação de YEP foi de aproximadamente 1,05. Alimentação de Metanol:

12,0ml de solução de sal de traço, 12mL de soluções de D-biotina e 40g de Ureia foram adicionados por litro de metanol antes da alimentação.

PROCESSO DE FERMENTAÇÃO:

O processo de fermentação inclui uma fase de crescimento de célula de lote, uma fase de lote de alimentação de glicerol opcional e fase de indução de metanol.

FASE DE CRESCIMENTO DE CÉLULA DE LOTE

Monitoramento e controle de lote

Parâmetros fermentadores de produção são inicialmente estabelecidos e controlados conforme segue:

Temperatura: 30° ± 2°C pH : 5±0,2

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DO : >10%

Tempo de Execução : 22-24hr

FASE DE INDUÇÃO DE METANOL (MIP)

A alimentação de metanol foi iniciada imediatamente após o final da fase de Lote. O metanol foi esterilizado (online) por filtração, usando um filtro de grau estéril comercialmente disponível.

No início da MIP, o pH foi ajustado para 4,0 + 0,1 ou 6,0 + 0,1 ou 6,3 + 0,1, dependendo da expressão da proteína no meio (Varia de produto para produto, bem como de clone para clone), e a temperatura foi ajustada para aproximadamente 18 24 graus C (varia de produto para produto e também de clone para clone) Simultaneamente, outra alimentação, alimentação de extrato de levedura e Peptona de Soja (YEP) também foi iniciada no fermentador na taxa de 0,4g/L/h do volume inicial.

Monitoramento e controle de MIP

Temperatura: 18 a 30°C (varia de produto para produto, bem como de clone para clone) pH : 3,0 to 7,0

DO : >1% (usado para controle da concentração de metanol no caldo)

Tempo de Execução : 5 - 8 dias (varia de clone para clone) pH de ensaio : 1 - 9,5 (dependendo do tipo da proteína)

De acordo com outro aspecto da invenção, o inoculo é preparado por cultivo de cultura de estoque de glicerol liofilizado ao meio de glicerol mínimo (MGY). Os meios fermentadores basais foram derivados de “Diretrizes do processo de Pichia de controle” contém ácido ortofosfórico, sulfato de cálcio desidratado, sulfato de potássio, sulfato de magnésio heptaidratado, hidróxido de potássio, glicerol, sais de

22/42 traço e D-biotina. O meio de cultura de nutriente também deve conter compostos conhecidos em quantidades pequenas ou de traço, que são comumente incorporados nos meios de cultura de fermentação, como compostos solúveis em água de Ca, Mg, Mn, Fe, K, Co, Cu, Zn, B, Mo, Br e I. Outros sais de traço podem também estar presentes. Solução de sais de traço da presente invenção especialmente incluem sulfato cúprico pentaidratado, iodeto de sódio, sulfato de manganês monoidratado. Molibdato de sódio diidratado, ácido bórico, cloreto de cobalto hexaidratado, cloreto de zinco, sulfato ferroso heptaidratado. Embora a concentração de cada componente do meio tenha sido otimizada especificamente para cada produto, abaixo constam os meios de controle:

MEIOS DE CONTROLE

Meio de Sais Basais de Fermentação:

Para um litro, misturar juntamente os seguintes componentes:

Ácido fosfórico : 85% (26,7 ml)

Sulfato de cálcio : 0,93 g

Sulfato de potássio :18,2 g

Sulfato de magnésio-7H2O :14,9 g

Hidróxido de potássio :4,13g

Glicerol : 40,0 g

Água a 1 litro

Adicionar ao fermentador com água ao volume adequado e esterilizar.

Sais de Traço PTM1

Misturar juntamente os seguintes componentes:

Sulfato cúprico 5H2O 6,0 g

0,08 g

Iodeto de sódio

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Sulfato de manganês - H2O

3,0 g

Molibdato de sódio - 2H2O

0,2 g

Ácido bórico

0,02 g

Cloreto de cobalto

0,5 g

Cloreto de zinco

20,0 g

Sulfato ferroso - 7H2O 65,0 g

Biotina

0,2 g

Ácido sulfúrico

5,0 ml

Água a um volume final de 1 litro

Filtrar, esterilizar e armazenar em temperatura ambiente.

Pode haver um precipitado turvo mediante a mistura desses componentes. Os meios podem ser filtrados, esterilizados e usados.

Além do meio de controle acima, ureia é incluída em diferentes concentrações.

De acordo com ainda outro aspecto da invenção, a geração de biomassa durante a fase de lote ocorre até o glicerol estar presente no meio inicial. Ainda, a geração de biomassa não é crítica e é realizada em apenas alguns casos.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, após a biomassa desejada ser atingida, a cultura é induzida por alimentação contínua de metanol e ureia. Durante a alimentação de metanol, solução de extrato de levedura e peptona também é alimentada.

De acordo com ainda outro aspecto, a taxa de alimentação de metanol é de até 20g/ L/h. Como qualquer artesão qualificado conhecería, otimizações da taxa de alimentação para melhorar adicionalmente os níveis de produção são contempladas pela presente invenção.

Ao mesmo tempo em que a invenção agora será descrita em conexão com certas

24/42 configurações preferidas nos seguintes exemplos, de modo que aspectos desta pode ser mais completamente compreendidos e apreciados. Não se propõe limitar a invenção a essas configurações particulares. Pelo contrário, propõe-se cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes que possam estar incluídos no escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas. Dessa forma, os seguintes exemplos que incluem configurações preferidas servirão para ilustrar a prática da presente invenção, sendo compreendido que as características mostradas são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa de configurações preferidas da presente invenção apenas e são apresentados na causa de fornecer o que é considerado ser a descrição mais útil e prontamente compreendida dos procedimentos de fermentação, bem como dos princípios e aspectos conceituais da invenção.

A invenção fornece uma composição de nutriente para uso em formulação de um meio de fermentação, cuja composição compreende componentes nitrogenosos, como carbamidas como ureia e formas relacionadas ou derivados como carbamatos, carbodiimidas, tiocarbamidas, juntamente com um ou mais componentes de outros meios de fermentação que foram especificamente otimizados para obter maiores produções de produto em períodos de tempo de produção mais curtos.

A invenção, dessa forma, torna possível obter melhores produções de produtos de proteína recombinante como insulina, glargina IN105, exendina, lipase e carboxipeptidase durante o processo de fermentação (lote, lote alimentado, contínuo) usando Pichia pastoris GMO induzível por metanol, permitida através de adição de ureia sem afetar o crescimento das células de levedura.

De acordo com um aspecto da invenção, o componente nitrogenoso que especificamente causa impacto nos rendimentos e no tempo de produção são

25/42 amidas de ácido carbônico, como ureia ou seus derivados e compostos relacionados mencionados anteriormente.

De acordo com outro aspecto da invenção, leveduras preferidas para uso como organismos de produção incluem, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp., ou Hansenula polymorpha.

A presente invenção demonstra a utilidade de amidas de ácido carbônico como ureia ou seus derivados, carbamatos, carbodiimidas e tiocarbamidas como suplementos nitrogenosos em meios de fermentação para produção de proteínas para atingir taxas de bioconversão elevadas usando E. coli, Actinomicetos e culturas fúngicas. Os aspectos significativos da invenção especialmente relacionam-se a um processo de fermentação improvisado com parâmetros de meios nutricionais otimizados responsáveis por maior produção. O princípio da presente invenção pode também ser aplicado para produção de uma ampla variedade de proteínas e metabólitos secundários através da fermentação de um organismo de expressão adequado.

A invenção fornece uma composição de nutriente para uso em formulação de um meio de fermentação, no qual a composição compreende componentes nitrogenosos, como carbamidas como ureia e formas relacionadas ou derivados como carbamatos, carbodiimidas, tiocarbamidas, juntamente com um ou mais componentes de outros meios de fermentação que foram especificamente otimizados para obter maiores produções de produto em períodos de tempo de produção mais curtos.

A invenção, dessa forma, torna possível obter melhores produções de produtos de proteína, como GCSF, Estreptoquinase, HGH e outros durante o processo de fermentação (lote, lote alimentado, contínuo) usando E. coli induzível, permitido

26/42 através de adição de ureia sem afetar o crescimento de células de levedura.

A invenção também torna possível melhorar a taxa de bioconversão para obter melhores produções de produto como Pravastatina durante o processo de fermentação (lote, lote alimentado, contínuo) usando actinomicetos e/ou culturas fúngicas.

A invenção imediata também aumenta a taxa de produção de enzimas como Lipase, amilases, celulases nos processos de lote ou lote alimentado usando culturas fúngicas.

De acordo com um aspecto da invenção, o componente nitrogenoso que especificamente causa impacto nos rendimentos e no tempo de produção são amidas de ácido carbônico, como ureia ou seus derivados e compostos relacionados mencionados anteriormente.

De acordo com outro aspecto da invenção, microorganismos preferidos são estirpes da família Enterobacteríaceae, preferivelmente para uso como organismo de produção, incluem, entre outros, E. coli.

De acordo com outro aspecto da invenção, microorganismos preferidos são estirpes de actinomicetos e/ou família fúngica, incluindo, entre outros, Streptomyces sp, actinoplanes sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp e Penicillium sp

Outros objetos, características, vantagens e aspectos da presente invenção se tornarão aparentes aos peritos a partir da seguinte descrição. Deve-se compreender, entretanto, que a seguinte descrição e os exemplos específicos, ao mesmo tempo em que indica configurações preferidas da invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração. Várias alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção divulgada se tornarão prontamente aparentes aos peritos a partir da leitura da seguinte descrição e da leitura de outras partes da presente divulgação.

27/42

A invenção fornece uma composição de nutriente para uso em formulação de um meio de fermentação, no qual a composição compreende componentes nitrogenosos, como amidas de ácido carbônico como ureia e formas relacionadas ou derivados mencionados anteriormente, juntamente com um ou mais componentes de outros meios de fermentação que foram especificamente otimizados para obter produto de proteína desejado ou metabólitos secundários.

Foi surpreendentemente descoberto que o uso de um meio de fermentação particular, suplementado com certas fontes nitrogenadas como amidas de ácido carbônico como ureia e formas relacionadas ou derivados em concentrações específicas não afetam o crescimento do organismo de fermentação, particularmente ajudam na melhoria da produtividade.

Uma estirpe microbiana adequada para um processo de fermentação industrial pode ser qualquer estirpe selvagem, que produza um composto valioso de interesse, considerando-se que a referida estirpe selvagem tenha um bom desempenho de crescimento.

Além disso, uma estirpe microbiana adequada para um processo de fermentação industrial pode ser uma estirpe que é obtida e/ou melhorada pela submissão de uma estirpe original de interesse a um tratamento mutagênico clássico ou à transformação de DNA recombinante, também com a provisão de que a estirpe microbiana mutante ou transformada resultante tenha um bom desempenho de crescimento. Isso dependerá, portanto, do desempenho de crescimento da estirpe original se as estirpes mutantes ou transformadas devem ter um desempenho de crescimento melhorado ou semelhante conforme comparado com aquele da estirpe

28/42 original.

O processo de fermentação usando o meio de fermentação imediato é melhorado, com relação a um ou mais dos parâmetros selecionados do grupo, consistindo da concentração do produto (produto por volume), a produção do produto (produto formado por fonte de carbono consumida) e a formação do produto (produto formado por volume e tempo), ou quaisquer outros parâmetros de processo e combinações destes.

Como um perito reconhecería, a concentração favorável dos suplementos de amida de ácido carbônico variariam de clone para clone, apesar do resultado final ser obter título maior em menor tempo em todos os casos.

Os meios de Fermentação na presente invenção devem conter substratos de carbono adequados. Os substratos adequados podem incluir, entre outros, monossacarídeos, como glicose e frutose, oligossacarídeos, como lactose ou sucrose, polissacarídeos, como amido ou celulose ou misturas desta e outros componentes licor íngreme de milho, melado de beterraba, glicerol e cevada de malta. Adicionalmente, o substrato de carbono pode também ser substratos de um carbono, como dióxido de carbono ou metanol para o qual conversão metabólica em intermediários bioquímicos principais foi demonstrada. Assim, contemplou-se que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode abranger uma ampla variedade de carbono, contendo substratos e apenas serão limitada pela escolha do organismo. Além de uma fonte de carbono adequada, os meios de fermentação

29/42 devem conter minerais, sais, tampões e outros componentes adequados, conhecidos pelos peritos, adequados para o crescimento das culturas e promoção da expressão da proteína ou produto final desejado.

Fontes nitrogenosas adequadas podem incluir, entre outros, farinha de soja, farinha de semente de algodão, peptonas, extrato de levedura, caseína, caseína hidrolisada, licor íngreme de milho e sais inorgânicos de íon de amônio, nitratos e nitritos.

De acordo com um aspecto significativo da invenção, o suplemento preferido nos meios de fermentação é amidas de ácido carbônico, como ureia. Esta incluiría compostos contendo N-CO-N ou grupos relacionados. O uso de derivados de ureia como dimetilureia, dietilureia, N-acetil-N-fenilureia, Isopropilideneureia, N-fenil ureia e os semelhantes ou combinações destes é contemplado pela presente invenção.

A “quantidade eficaz” empregada é aquela quantidade de ureia ou seus derivados, que, de acordo com a invenção, quando introduzida no meio de fermentação, uma quantidade/produção apreciável do produto é produzida, ainda, em períodos de tempo menores sem afetar o crescimento das células de levedura.

“Organismo de Fermentação” refere-se a quaisquer microorganismos adequados para uso em um processo de fermentação desejado. De acordo com outro aspecto da invenção, microorganismos preferidos são estirpes de bactéria, actinomicetos e/ou espécies fúngicas, preferivelmente para uso como organismo de produção, incluindo, entre outros, E. coli, Streptomyces sp, actinoplanes sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp, Penicillium sp

O termo “recombinante”, conforme usado aqui para descrever uma proteína ou polipeptídeo significa um polipeptídeo produzido por expressão de um

30/42 polinucleotídeo recombinante. O termo “recombinante”, conforme usado aqui em referência às células, significa células que podem ser ou foram usadas como receptoras para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência e incluem progênie da célula original, que foi transfectada. Deverá ser compreendido que a progênie de uma célula original simples pode não ser completamente idêntica na morfologia e no complemento de DNA genômico ou total ao original devido à mutação acidental ou deliberada.

O termo “polipeptídeo”, “proteína”, “peptídeo” refere-se a um polímero de aminoácidos e não se refere a uma extensão específica do produto; dessa forma, peptídeos, oligopeptídeos e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Esse termo também não se refere a ou exclui modificações pósexpressão do polipeptídeo embora modificações químicas ou pós-expressão desses polipeptídeos podem ser incluídas ou excluídas como configurações específicas. Em uma configuração, a molécula é um polipeptídeo ou seus análogos relacionados ou derivados deste. Preferivelmente, o polipeptídeo é um peptídeo cíclico. De acordo com outra configuração preferida, o polipeptídeo é um peptídeo não-cíclico. De acordo com outro aspecto da invenção, a proteína recombinante é produzida através de fermentação, utilizando o meio de fermentação da presente invenção.

Uma das configurações da presente invenção relaciona-se à produção de GCSF (Fator estimulante de Colônia de Granulócito). O fator estimulante de colônia de granulócito (GCSF) é uma proteína farmaceuticamente ativa, que regula a proliferação, diferenciação e ativação funcional de granulócitos neutrofílicos (Metcalf, Blood 67:257 (1986); Yan, et al. Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, et al. Blood 81(11): 3158-3163 (1993); Roberts, et al., Expt'1 Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben, et al. Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF é considerado a proteína

31/42 natural ou recombinante, preferivelmente humana, conforme obtido de qualquer fonte convencional, como tecidos, síntese protéica, cultura celular com células naturais ou recombinantes. Qualquer proteína que tenha a atividade de GCSF, como muteínas ou, de outra forma, proteínas modificadas, é abrangida.

Um metabólito secundário” é um composto, derivado de metabólitos primários, que é produzido por um organismo, não é um metabólito primário e não é exigido para crescimento do microorganismo sob condições padrão. Compostos de metabólito secundário podem ser convertidos em compostos úteis por conversão química subsequente ou biotransformação subsequente. Como tal, fornecer disponibilidade melhorada desses compostos intermediários ainda levaria à produção melhorada do último composto útil, que este mesmo pode ser referido, no presente, como um metabólito secundário.

Em um aspecto da invenção, o protocolo de fermentação pode compreender duas fases: Lote e lote alimentado (opcional)

A presente invenção é, ainda, definida nos seguintes Exemplos. Deve-se compreender, entretanto, que esses Exemplos, ao mesmo tempo em que indicam configurações preferidas da invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e desses Exemplos, um perito pode verificar as características essenciais desta invenção e sem se separar do espírito e do escopo da mesma, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Esses exemplos não devem ser interpretados para limitar o escopo da invenção. Os seguintes Exemplos representam configurações preferidas da presente invenção.

EXEMPLO 1:

Dois lotes fermentadores foram usados, com o uso de Pichia pastoris para

32/42 expressão do precursor IN105. Em um lote (experimento n² 1), metade da potência dos meios de controle é coletada como meio inicial exceto glicerol. Após o uso de lote, metanol é alimentado em uma taxa de alimentação de aproximadamente 8g/L/h. A fermentação é continuada durante ~ 8 dias. Concentração máxima do produto atingida a 3,0g/L dentro de 7 dias e estabilizada. Em outro lote (experimento n² 2), a composição dos mesmos meios é usada e adicionalmente 0,1 M de ureia é adicionado ao fermentador. Após o uso de lote, metanol juntamente com 4% w/v de ureia é alimentado. A fermentação é continuada durante 8 dias. Concentração máxima do produto atingida a 3,5 dentro de 7 dias. Não houve diferença significativa observada no perfil de crescimento da célula. Perfis de biomassa e concentração de perfil do experimento acima são representados na Figura 1 e 2, respectivamente.

EXEMPLO 2:

A expressão do precursor de Insulina com ureia foi estudada usando fermentação de Pichia pastoris para verificar a taxa de expressão do produto. Neste estudo, a composição dos meios de controle foi usada e metanol com 4% de ureia foi alimentado na maior taxa de 20g/L/h. Neste estudo, concentração máxima do produto atingida de 4,21 g/L em 137 como contra 4,26g/L em 182 horas quando ureia não foi adicionada ao fermentador. Nenhuma diferença no perfil de crescimento de célula foi observada, indicando que a adição de ureia ao fermentador aumentou a taxa de expressão do produto, sem afetar o perfil de crescimento e reduziu o tempo de fermentação. Perfis de biomassa e concentração de perfil do experimento acima são representados na Figura 3 e 4, respectivamente.

EXEMPLO 3:

Dois lotes fermentadores foram usados, com o uso de Pichia pastoris para expressão do precursor de Glargina. Em um lote (experimento n² 1), metade da

33/42 potência dos meios de Controle é coletada como meio inicial exceto glicerol. Após o uso de lote, metanol é alimentado em uma taxa de alimentação de 8g/L/h. A fermentação é continuada durante 10 dias. A concentração máxima do produto é atingida em 1,03g/L dentro de 10 dias e estabilizada. Em outro lote (experimento n²2), a composição dos mesmos meios é usada e adicionalmente 0,1M de ureia é adicionado ao meio de fermentação inicial. Após o uso de lote, metanol juntamente com 4% de ureia é alimentado. A fermentação foi continuada durante 9 dias. Concentração máxima do produto atingida a 1,75 dentro de 9 dias. Não houve diferença significativa observada no perfil de crescimento da célula. Perfis de biomassa e concentração de perfil do experimento acima são representados na Figura 5 e 6, respectivamente.

EXEMPLO 4:

Dois lotes fermentadores foram usados, com o uso de Pichia pastoris para expressão do precursor de Exendina. Em um lote (experimento n² 1), metade da potência dos meios de Controle é coletada como meio inicial exceto glicerol com lote alimentado com glicerol. Após o uso de lote alimentado com glicerol, metanol é alimentado em uma taxa de alimentação de 11g/L/h. A fermentação é continuada durante 6 dias. Concentração máxima do produto atingida em 0,74g/L dentro de 6 dias e estabilizada. Em outro lote (experimento n² 2), a composição dos mesmos meios é usada e adicionalmente 0,1M de ureia é adicionado ao fermentador. Após o uso de lote, metanol com 4% de ureia é alimentado. A fermentação foi continuada durante 5 dias. Concentração máxima do produto atingida a 0,78 dentro de 5 dias. Não houve diferença significativa observada no perfil de crescimento da célula. Perfis de biomassa e concentração de perfil do experimento acima são representados na Figura 7 e 8, respectivamente.

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EXEMPLO 5:

Dois lotes fermentadores foram usados, com o uso de Pichia pastoris para expressão da enzima, Lipase. Em um lote (experimento n⁹ 1), metade da potência dos meios de Controle é coletada como meio inicial exceto glicerol. Após o uso de lote, metanol é alimentado em uma taxa de alimentação de aproximadamente 6g/L/h. A fermentação é continuada durante ~ 8 dias. Produto máximo atingido a aproximadamente 1650 χ 10^Λ6 Unidades de Lipase dentro de 7 dias e estabilizada. Em outro lote (experimento n⁹ 2), a composição dos mesmos meios é usada e adicionalmente 0,1 M de ureia é adicionado ao fermentador. Após o uso de lote, metanol juntamente com 4% w/v de ureia é alimentado. A fermentação foi continuada durante 8 dias. Quantidade máxima de produto atingida a aproximadamente 2500 χ 10^Λ6 Unidades de Lipase dentro de 7 dias e estabilizada. Não houve diferença significativa observada no perfil de crescimento da célula. O perfil de Produto total resultante do experimento acima é representado na Figura 9.

EXEMPLO 6:

O efeito da concentração de ureia nos lotes de metanol coletados para produção do precursor IN105 com 1, 2, 3 e 5% de ureia em metanol durante lote alimentado de metanol foi estudado. Os parâmetros remanescentes foram mantidos os mesmos como no Exemplo 1. Concentração máxima de produto atingida a 3,0, 3,2, 2,5, 3,3, 3,5 e 2,8g/L em ~7 dias em lotes com 0, 1, 2, 3, 4 e 5% de ureia, respectivamente, em metanol. Melhor produtividade foi observada quando 4% de ureia foram usados em metanol durante fase de indução com metanol. Perfis de biomassa e concentração do produto são ilustrados na Figura 10 e 11, respectivamente.

EXEMPLO 7:

Em outro estudo com 20g/L/h de taxa de alimentação de metanol, a concentração de

35/42 ureia foi variada para verificar a concentração de ureia mais eficaz, permitindo a concentração máxima de precursor de insulina. Concentração máxima do produto atingida a 4,26, 4,03, 3,39, 4,16, 4,21 e 5,31 g/L em 182, 166, 140, 164, 137 e 170 horas, respectivamente, nos lotes em que metanol é alimentado com concentração de 0, 1, 2, 3, 4 e 5% de ureia, respectivamente. Perfis de biomassa e concentração do produto são ilustrados na Figura 12 e 13, respectivamente. O estudo indicou que a adição de ureia aumentou a taxa de produção de precursor de insulina, a taxa de expressão sendo a mais alta quando o metanol é alimentado com 5% de ureia.

EXEMPLO 8:

Lotes do estudo foram estudados onde, durante a fase de indução com metanol, concentração de ureia residual é mantida em diferentes níveis de 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,2 e 1,5M no sobrenadante livre da célula e o efeito na produtividade foi estudado. Todos os lotes foram coletados com parâmetros semelhantes e composição dos meios como no Exemplo 1. Ureia residual foi mantida por alimentação de estoque de ureia separadamente. Resultados indicam que o produto máximo foi atingido quando a ureia é mantida com a variação de 1M no sobrenadante livre da célula durante a fermentação completa do lote. Concentração máxima do produto de 4,46g/L é atingida quando a ureia residual é mantida em aproximadamente 0,5M.

Nesse experimento, a alimentação total de ureia foi equivalente a 0, 0,2, 0,5, 0,9, 1,2, 1,8, 2,3 e 2,9M de volume de caldo final nos estudos onde a ureia residual foi mantida em 0, 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 1,2 e 1,5M, respectivamente. Os resultados são representados na Figura 14.

EXEMPLO 9:

Também foi realizado estudo com fermentação de precursor de Insulina. Nesse estudo, metanol foi alimentado na taxa de 20g/L/h. Na fermentação de precursor de

36/42 insulina, foi observado que a concentração do produto foi mais alta quando concentração residual de 0,7M foi mantida. Nesse experimento, a alimentação total de ureia foi equivalente a 0,0, 1,6, 2,7, 3,5, 7,0, 8,8, 11,7 e 13,3M de volume de caldo final no estudo onde a ureia residual foi mantida em 0, 0,1, 0,3, 0,5, 0,7, 1,0, 1,2 e 1,5M, respectivamente. Os resultados indicaram que a cultura consumiria quantidades significativas de ureia conforme representado na Figura 15.

EXEMPLO 10:

Outro lote de IN 105 foi usado com meios de Controle padrão e com ~ 20g/L/h de metanol com 4% de ureia. Nesse estudo, concentração de produto de 3,71 g/L atingida em 113 horas como contra uma produção de 3,76g/L em 183 horas quando não houve nenhuma alimentação de ureia ao fermentador. Os resultados do estudo são ilustrados na Figura 16 e 17.

EXEMPLO 11:

No conjunto adicional de experimentos, ureia foi substituída por vários outros compostos para observar seus efeitos na produtividade da fermentação. Dessa forma, em lotes separados, tioureia, diimidas, carbodiimidas, tiocarbamidas foram testadas em concentração de 1%. Observou-se que todos estes melhoraram a produtividade com relação ao controle conforme mostrado na Figura 18.

EXEMPLO 12:

Em um experimento, observou-se que a alimentação de ureia durante a fermentação aumenta a captação de fosfato pela levedura, resultando em depleção do fosfato no meio mais antecipadamente do que um lote onde a alimentação de ureia não foi realizada. Dessa forma, o consumo mais rápido de fosfato e a produtividade mais alta (g/L/h) é um resultado da troca metabólica atingida devido à incorporação de ureia nos protocolos de fermentação padrão ou com Pichia para produção de

37/42 peptídeos e proteínas.

EXEMPLO 13:

O meio de crescimento foi preparado contendo farinha de soja a 5,0 gramas, Dextrose monoidratada a 20,0 gramas, Peptona de soja a 5,0 gramas, CaCO3 a 1,0 grama, K2HPO4 a 0,1 grama em 1000ml de água. O pH desse meio de semeadura foi ajustado para 6,8 + 0,1 com uma solução de NaOH. O meio de inóculo esterilizado foi inoculado com uma suspensão de cultura em frasco de esporo, Streptomyces sp (BICC 6826) e incubado em 28+1° C durante 48 horas sob condições aeróbicas. A semente cultivada é, então, transferida para o meio de fermentação contendo farinha de soja a 37,5 gramas, Dextrose Monoidratada a 22,5 gramas, Farinha de Semente de Algodão a 3,75 gramas, licor íngreme de milho a

7.5, NaCI a 7,5 e SAG Anti-espuma a 0,5 grama em 1000ml de água (ph ajustado para 7,0 + 0,1). Após 48 horas de incubação, a solução de compactina estéril foi adicionada juntamente com pequenas quantidades de dextrose. Após cada 24 horas, um dos frascos de diversos frascos semelhantes é coletado para verificar a bioconversão de compactina em pravastatina. O procedimento foi repetido a cada 24 horas até um total de 3,0g/L de Compactina ter sido alimentado.

Antes do início dos experimentos usando o meio de fermentação modificado, níveis diferentes de ureia foram adicionados ao meio de fermentação para estabelecer o nível de toxicidade de ureia para o organismo. Uma concentração de 0,0, 0,5, 1,0,

1.5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 e 4,0g/L foi adicionada ao frasco contendo o meio de fermentação, então, incubado conforme discutido acima. Após 48 horas de incubação, o crescimento em cada um dos frascos foi monitorado. Os dados são mostrados na Figura 20.

Concentrações maiores de 3,0g/L de ureia mostrou inibição no crescimento da

38/42 cultura. O estudo quando repetido mostrou resultados semelhantes. Dessa forma, concentração abaixo de 3,0g/L foi coletada para verificação do efeito de ureia na bioconversão.

Conforme descrito anteriormente, um exercício semelhante foi realizado com o meio de produção contendo ureia como um constituinte adicional. A concentração de ureia no meio de produção foi mantida em 0,0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 e 3,0g/L e foi adicionada no momento da inoculação.

Após 48 horas de incubação, solução de Compactina estéril foi alimentada juntamente com alimentação de dextrose. A bioconversão foi estimada após 24 horas através da coleta de um dos múltiplos frascos usados sob condições semelhantes. Esse procedimento foi repetido a cada 24 horas até 3g/l de compactina ter sido alimentada cumulativamente. A bioconversão foi estimada com relação à Compactina total consumida para a formação de Pravastatina. Os resultados do experimento com relação ao título e a conversão percentual são mostrados na Figura 21 e 22, respectivamente.

Os frascos com a concentração de ureia a 1,5g/L mostraram conversão máxima de compactina em pravastatina de 85,4% conforme comparado com o frasco de controle com 59,5% de conversão.

EXEMPLO 14:

A expressão de fator estimulante de colônia de Granulócito (GCSF) com ureia foi estudada usando fermentação de E. coli para verificar a taxa de expressão de produto. O meio usado no estudo consistiu de um meio pré-semeadura, meio de semeadura e o meio de produção. O meio pré-semeadura consistiu de peptona de Soja a 10,Og, NaCI a 10,Og, extrato de levedura a 10,Og em 1000ml de água. O meio de semeadura consistiu de 1,2g de sulfato de amônio, 2,4g de sulfato de magnésio,

39/42

10g de extrato de levedura, 11g de DMH, 5g de K2HPO4, 40ml de sais de traço em 1000ml de água. O meio de produção consistiu de dextrose monoidratada a 11g, sulfato de amônio a 2,4g, Sulfato de magnéio a 4,8g, extrato de levedura a 20g, K2HPO4 a 10g, sais de traço a 40ml em 1000ml de água. O pH é ajustado para 7,0 com amônia. Após a fase de lote estar concluída, a biomassa é o fermentador [sic] é aumentada pela alimentação contínua de dextrose e extrato de levedura. A massa celular é, então, induzida e usada durante outras 8 horas para a produção do produto de interesse.

Três lotes fermentadores foram coletados para estabelecer o efeito da ureia nos processos de fermentação de E. coli. O primeiro lote (experimento n° 1) foi o lote de controle sem qualquer adição de ureia. Os meios usados são descritos acima. O lote foi induzido em ~ 180g/L de WCW. A fermentação foi continuada até 8 horas após a indução. O produto máximo atingido foi 6,6g/L com uma atividade específica de 0,028g/wcw. No segundo lote (experimento n^a 2), 1g/L de ureia foi adicionado ao fermentador além do meios descritos acima. O lote foi alimentado com a alimentação tendo quantidades semelhantes de ureia (1 g/L). O lote foi induzido em ~ 180g/L de \NC\N e a fermentação foi continuada durante 8 horas após a indução e o produto obtido foi 7,4g/L com uma atividade específica de 0,033g/WCW. O terceiro lote (experimento n² 3) foi usado de forma semelhante ao experimento n² 2, mas com 2g/L de ureia. O produto máximo atingido foi 6,58g/L com a atividade específica de 0,032g/wcw.

Como os resultados mostram, nenhuma diferença no perfil de crescimento de célula foi observada, indicando que a adição de ureia ao fermentador aumentou a formação de produto, sem afetar o perfil de crescimento. Um aumento geral de aproximadamente 18% na produtividade específica foi obtido. Perfis de WCW

40/42 resultando do experimento acima são representados na Figura 23 e o perfil de produtividade específica na Figura 24.

EXEMPLO 15:

Um experimento semelhante foi realizado usando E. coli como o sistema de expressão para a produção de Estreptoquinase. O meio usado é o mesmo que aquele mencionado no Exemplo 13 e a concentração de ureia testada também é a mesma. Conforme descrito no Exemplo 14, três lotes semelhantes foram coletados com Og/K, 1g/L e 2g/L de ureia. O lote de controle sem ureia (experimento n² 1) forneceu a produtividade final de 7,06g/L após 8 horas de indução com a produtividade específica de 0,026g/wcw. O título máximo foi atingido em lote de 1 g/L de ureia (experimento n² 2), tendo produtividade de 10,5g/L e produtividade específica de 0,041g/wcw. Surpreendentemente, o lote com 2g/L de ureia (experimento n² 3) forneceu apenas 6,56g/L de produto com produtividade específica de 0,022g/wcw. Para esse produto, um aumento na concentração de ureia maior de 1 g/L resultou em uma queda acentuada na produtividade específica e no título.

Como no Exemplo 2, não houve variação significativa na WCW dos três estudos, que claramente indicou que o aumento na produtividade é o resultado da formação de produto elevada e não vinculado às variações na biomassa. Um aumento geral de aproximadamente 57% na produtividade específica foi obtido. Perfis de WCW resultando do experimento acima são representados na Figura 25. O perfil de título é representado na Figura 26.

EXEMPLO 16:

Rhizomucor sp (BICC 362) que é conhecida por produzir enzima lipase também mostrou melhoria na produtividade com a adição da ureia no meio. A Lipase gerada

41/42 a partir dessa cultura pode ser extensivamente usada para reações de bioconversão como esterificação e hidrólise. Dois lotes de fermentação (volume de 10L) foram coletados com esse processo, um sem adição de ureia e o outro com 0,5g/L de ureia. Um estudo com maior concentração de ureia (1 g/l) também foi realizado, que resultou em menores produtividades e um consumo muito alto de sóda cáustica para manter o pH. O meio de crescimento de rhizomucor sp (BICC 362) consiste de Maida a 41,4g, sucrose a 10g, peptona a 3,06g, sulfato de amônio a 2g, extrato de levedura a 2g, fosfato de potássio a 0,85g, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio e cloreto de sódio a 1g cada. O meio completo é composto com até 1L de água. A semeadura cultivada (10% v/v) é transferida para o meio de produção, consistindo de dextrose a 12,5g, peptona de soja a 37,5g, farinha de soja a 25, fosfato de potássio a 2,5, sulfato de magnésio a 0,625, óleo de soja a 12,5g em 1000ml de água. O pH do meio é ajustado para 6,0 e, então, mantido em 6,0 durante todo o lote com adição de soda cáustica.

A adição de ureia (0,5g/l) mostrou um aumento na taxa de produção de lipase conforme comparado com o lote de controle. Concentração maior de ureia mostrou menores produtividades. Os dados são mostrados na Figura 27.

Deve-se compreender que esta invenção não é limitada à metodologia, protocolos, linhagens celulares, espécies ou gêneros particulares ou componentes de meios descritos, já que podem variar. Deve-se também compreender que a terminologia aqui usada é para fins de descrição apenas de configurações particulares e não é proposta para limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A descrição acima é para fins de aprendizado da pessoa com capacidade ordinária na técnica de como praticar a presente invenção e não é proposta para detalhar todas aquelas modificações e variações óbvias desta que se

42/42 tornarão aparentes ao trabalhador qualificado mediante a leitura da descrição.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a produção de proteínas recombinantes, melhorando a incorporação de fosfato para produzir um título máximo de produto de 0,1 g/L, caracterizado pelo fato do processo de fermentação compreender:

a) propagar uma espécie fúngica que expressa insulina induzível por metanol;

b) manter a concentração residual de ureia entre 0,3 e 1M;

c) manter a taxa de alimentação de metanol entre 6 g/L/h e 20 g/L/h; e

d) manter a concentração de:

sais basais por litro:

i. Ácido fosfórico (85%): de 2,67 mL -133,5 mL, ii. Sulfato de cálcio: de 0,093 g - 4,65 g, iii. Sulfato de potássio: de 1,82 g - 91 g, iv. Sulfato de magnésio-7H2O: de 1,49 g - 74,5 g,

v. Hidróxido de potássio: de 0,413 g - 20,65 g, vi. Glicerol: de 4 g - 200 g;

e oligoelementos por litro:

vii. Sulfato cúprico-5H2O: de 0,6 g - 30 g, viii. Iodeto de sódio: de 0,008 g - 0,4 g, ix. Sulfato de manganês-H2O: de 0,3 g -15 g,

x. Molibdato de sódio-2H2O: de 0,02 g -1 g,

XI. Ácido bórico: de 0,002 g - 0,1 g, xii. Cloreto de cobalto: de 0,05 g - 2,5 g, xiii. Cloreto de zinco: 2 g -100 g, xiv. Sulfato ferroso-7 H2O: de 6,5 g - 325 g, xv. Biotina: de 0,02 g -1 g

Petição 870180153173, de 21/11/2018, pág. 6/11
2/3 xvi. Ácido Sulfúrico: de 0,5 mL - 25 mL.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a ureia ser selecionada do grupo que consiste em ureia ou dimetilureia, dietilureia, Nacetilfenilureia, isopropilpiridenureia, fenilureia ou combinações dos mesmos.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a ureia é adicionada na forma liquida, pulverizada, em pó ou pastilha.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proteína recombinante produzida ser IN-105.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a proteína recombinante produzida ser um precursor de insulina ou insulina.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela proteína recombinante produzida ser insulina glargina.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela proteína recombinante produzida ser um péptico cíclico ou não cíclico.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a proteína recombinante produzida ser exendina.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína recombinante produzida ser uma enzima.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a proteína recombinante produzida ser lipase.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante produzida é selecionada de um grupo que compreende um precursor de insulina, insulina, glargina, exendina, carboxipeptidase e lipase.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as espécies fúngicas indutíveis em metanol que expressam o produto de insulina

Petição 870180153173, de 21/11/2018, pág. 7/11

3/3 recombinante serem selecionadas do grupo compreendendo Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomycescerevisiae, Kluyveromyces sp., ou Hansenula polymorpha.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela espécie fúngica induzível por metanol ser Pichia pastoris.