ES2198078T3 - Utilizacion de lisofosfatidiletanolamina (18:1) y de lisofosfatidilinositol para retrasar el periodo de maduracion y aumentar la maduracion de las frutas. - Google Patents
Utilizacion de lisofosfatidiletanolamina (18:1) y de lisofosfatidilinositol para retrasar el periodo de maduracion y aumentar la maduracion de las frutas.Info
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Abstract
Un método para retrasar la senescencia en la fruta y otros tejidos vegetales, incluyendo dicho método la etapa de aplicar en la fruta y en otros tejidos vegetales una composición que consiste en lisofosfatidilinositol o lisofosfatidiletanolamina (18:1) o una combinación de ellos.
Description
Utilización de lisofosfatidiletanolamina (18:1) y
de lisofosfatidilinositol para retrasar el periodo de maduración y
aumentar la maduración de las frutas.
Actualmente se están utilizando diversos agentes
químicos y biológicos en los cultivos de fruta a nivel comercial
para controlar el período de maduración de la fruta. Dichos agentes
se pueden emplear para diversos propósitos. Uno de dichos
propósitos consiste en sincronizar la maduración de la fruta para
ayudar a una recogida de la fruta eficaz desde el campo. Otro
propósito consiste en prevenir la caída de la fruta, de manera que
la fruta permanezca en la planta hasta el período del tiempo de
maduración apropiado. Otro propósito de los agentes de maduración
de la fruta consiste en mejorar el desarrollo del color de la
fruta, de manera que la fruta tenga un color mejor y más uniforme,
tal como lo esperan los consumidores del comercio de fruta al por
menor. En los Estados Unidos, es una práctica habitual tratar muchos
tipos de frutas con uno o más de dichos agentes durante los
procesos de cultivo.
Algunos de los agentes que se han venido
utilizando para controlar la maduración de la fruta son agentes
puramente sintéticos que han resultado tener el efecto deseado
sobre la fruta en concreto. Desgraciadamente, debido a cuestiones
relacionadas con su potencial toxicidad y oncogenicidad, se han
prohibido muchos de estos agentes químicos sintéticos para la
maduración de la fruta, o se ha recortado bastante su uso como
consecuencia de la resistencia comercial o por parte del consumidor
a dichos productos. El agente más popular que se utiliza
actualmente para mejorar la maduración de la fruta es ethephon, un
compuesto sintético que se vende con el nombre de Ethrel, marca
registrada de Rhone-Poulenc Ag. Co. (Research
Triangle Park, NC). A pesar de que este agente estimula la
maduración, también hace que la fruta se ablande. Por lo tanto, la
fruta tratada con ethephon tiene una vida en almacenamiento bastante
insuficiente. Existe una necesidad crítica de contar con un agente
de maduración que sea seguro para el medio ambiente y que no haga
que las frutas se ablanden. Por otra parte, los consumidores están
dispuestos a pagar un precio de primera clase por frutas maduradas
en la planta. No obstante, las frutas maduradas en la planta no se
pueden transportar durante largas distancias, ya que estas frutas
se ablandan y presentan una vida en almacenamiento escasa. Por
consiguiente, sería beneficioso mejorar la vida en almacenamiento de
las frutas maduradas en la planta.
Asimismo, existe un enorme interés en la
industria de los vegetales (sobre todo en las industrias de las
verduras frescas y las flores cortadas) por hallar un producto
seguro para el medio ambiente que retarde la senescencia y que
favorezca la vida en almacenamiento o en el jarrón. Actualmente, se
están utilizando compuestos tóxicos para el medio ambiente, como
por ejemplo tiosulfato de plata, para aumentar la duración en el
jarrón de las flores cortadas. No obstante, el uso de tiosulfato de
plata está siendo recortado como consecuencia de la preocupación
por el medio ambiente. Por consiguiente, es deseable desarrollar
alternativas al tiosulfato de plata que tengan más posibilidades de
ser aceptadas sin problemas por los intereses comerciales y el
público consumidor.
Las lisofosfatidiletanolaminas (en adelante
denominadas ``LPE'') consisten en un grupo de compuestos que se
presentan como prometedores en el control de la maduración de la
fruta, la mejora de la estabilidad de la fruta durante el
almacenamiento, y el aumento de la vida en almacenamiento de la
fruta almacenada. En las patentes EE.UU. Nº 5.126.155 y 5.110.341
se describen métodos para utilizar LPE purificadas a partir del
huevo (en adelante denominadas ``LPEhuevo'') para mejorar la
maduración de la fruta y su estabilidad. Las LPE se derivan de
fosfatidiletanolamina, un lípido que se encuentra normalmente en
las membranas de célula. Fosfatidiletanolamina es un fosfolípido con
dos fracciones de ácido graso que abunda en la yema de huevo. La
eliminación de un ácido graso de la fosfatidiletanolamina mediante
fosfolipasa A_{2} produce LPE.
Las LPE también están presentes de forma natural
en el tejido animal y vegetal, siendo especialmente abundante en la
yema de huevo y el tejido del cerebro. Está distribuido en el
comercio por Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama).
Existen numerosos ácidos grasos diferentes que se pueden encontrar
en LPE purificadas de fuentes naturales. Los ácidos grasos pueden
variar en cuanto a la longitud de cadena, así como por su grado de
insaturación. No obstante, no se ha examinado la eficacia relativa
de diversas especies de LPE ni tampoco la de diferentes tipos de
lisofosfolípidos distintos a LPE en el control de la maduración de
la fruta y la mejora de la estabilidad de la fruta.
En las patentes estadounidenses Nº 5.110.341 y
5.126.155 se describe el uso de lisofosfolípidos naturales y
fosfolípidos que contienen etanolamina para mejorar las
características de maduración y almacenamiento de la fruta. Se
describe el uso de lisofosfatidiletanolamina derivada de yema de
huevo.
En Farag, K.M. y cols., Physiologia Plantarum,
vol, 87 nº 4.1993, páginas 515-512 se describe el
uso de lisofosfatidiletanolamina para retardar la senescencia de
las hojas y frutas de la tomatera.
En Farag, K.M. y cols., Hort. Technology, vol. 3,
Nº 1.1993 páginas 62-65, se describe el uso de
lisofosfatidiletanolamina natural como agente de maduración de la
fruta del tomate.
La presente invención se refiere a un método para
retrasar la senescencia de la fruta o los tejidos vegetales. Dicho
método implica la aplicación sobre la fruta u otros tejidos de la
planta, ya sea antes o después de la cosecha, de una composición
que contiene un lisofosfolípido y un agente activante. La
composición contiene una cantidad de un lisofosfolípido que es
eficaz para retrasar la senescencia de la fruta y otros tejidos
vegetales. El lisofosfolípido contenido en la composición es
lisofosfatidilinositol y /o lisofosfatidiletanolamina (18:1).
Además de contener el lisofosfolípido, la composición puede
contener también un agente activante, como por ejemplo etanol,
Tergitol® o Sylgard® 309.
Por otra parte, la presente invención se refiere
a un método para mejorar la maduración y estabilidad de la fruta.
Dicho método implica la aplicación sobre las plantas enteras, antes
de la cosecha, de una composición que contiene un lisofosfolípido y
un agente activante. La composición contiene una cantidad de
lisofosfolípido que es eficaz para mejorar la maduración y
estabilidad de la fruta. El lisofosfolípido contenido en la
composición es lisofosfatidilinositol y/o lisofosfatidiletanolamina
(18:1). Además de contener el lisofosfolípido, la composición puede
contener también un agente activante, como etanol, Tergitol® o
Sylgard® 309.
La figura 1 es un gráfico en el que se muestra la
inhibición de la actividad de la enzima PLD (fosfolipasa) en
calabaza parcialmente purificada con varias concentraciones de LPE
con diferentes cadenas de acilo.
La figura 2 es un gráfico en el que se muestra la
especificidad estructural de LPE (18:1) para su inhibición de la
actividad de PLD de calabaza parcialmente purificada.
La figura 3 es un gráfico en el que se muestra la
inhibición de la actividad de PLD en calabaza parcialmente
purificada en función de la concentración de LPE.
La figura 4 es un gráfico en el que se muestra el
efecto de la concentración de sustrato sobre la inhibición de PLD
en calabaza parcialmente purificada mediante LPE (18:1).
La figura 5 es un gráfico en el que se muestra el
efecto de diferentes lisofosfolípidos sobre la actividad de PLD en
calabaza parcialmente purificada.
La figura 6 es un gráfico en el que se muestra el
contenido en clorofila relativo de hojas tratadas con LPA, LPC,
LPEhuevo o LPI.
La presente invención se refiere a un método para
mejorar la maduración y estabilidad de la fruta y para retrasar la
senescencia de la fruta y otros tejidos vegetales utilizando LPE
(18:1) y/o lisofosfatidilinositol (en adelante denominado ``LPI'').
Tal como se utiliza aquí, el término ``lisofosfolípidos'' se
refiere a derivados de fosfolípidos que tienen un ácido graso único
eliminado mediante fosfolipasa A_{2}. Tal como se utiliza aquí,
el término ``tejidos vegetales'' se refiere a cualquier parte u
órgano de una planta viva. Entre los ejemplos se incluyen fruta,
flores, raíces, tallos, hipocótilos, hojas, peciolos, pétalos,
etc.
El método de la presente invención implica el
tratamiento de fruta u otros tejidos vegetales antes o después de
la cosecha con una composición que contiene LPI y/o LPE (18:1).
Preferiblemente, la composición contiene un
vehículo aceptable para el lisofosfolípido, como por ejemplo agua.
No obstante, se pueden utilizar también otros vehículos como por
ejemplo disolventes orgánicos. La composición contiene una cantidad
de lisofosfolípido que es eficaz para mejorar la maduración y
estabilidad de la fruta, así como para retrasar la senescencia de la
fruta y otros tejidos vegetales. Más específicamente, la cantidad
de lisofosfolípido en la composición puede oscilar entre 0,5 y 1000
mg por cada litro de la composición, preferiblemente entre 1 y 500
mg por cada litro de la composición, siendo incluso más preferible
entre 5 y 250 mg por litro de la composición, siendo incluso más
preferible de 5 a 100 mg por cada litro de la composición. La
composición se puede aplicar a la fruta o los tejidos vegetales como
un rociado o simplemente en forma líquida.
Además de contener los lisofosfolípidos, la
composición puede incluir también uno o más compuestos activantes.
Tal como se utiliza aquí, el término ``compuestos activantes'' se
refiere a agentes que mejoran la absorción de humectabilidad y la
eficacia del ingrediente activo, que es el lisofosfolípido. Entre
los ejemplos de compuestos activantes que se pueden utilizar en el
método de la presente invención se incluyen etanol, Tergitol® y
Sylgard® 309 (comercializado por Dow Corning Co., Midland, MI).
Los compuestos activantes están presentes en una cantidad
comprendida entre 0,05 y 2,0% v/v de la composición.
El lisofosfolípido, LPE (18:1) es una especie de
LPE que tiene un ácido graso de 18 átomos de carbono que contiene
un solo enlace doble. Se ha observado que LPE (18:1) es
particularmente superior a otras especies de LPE para promover la
maduración de la fruta y retrasar la senescencia de la fruta y los
tejidos vegetales. Se ha observado que LPI es comparable con LPE
(18:1) y que es superior a otras LPE distintas a LPE (18:1) para
mejorar la maduración de la fruta y retrasar la senescencia de la
fruta y los tejidos vegetales.
Tal como se describe en las patentes EE.UU.
5.126.155 y 5.110.341, LPE es eficaz para mejorar la maduración y
estabilidad de la fruta. El mecanismo exacto a través del cual se
consiguen estos efectos tan sólo se comprende parcialmente. En la
patente EE.UU. 5.126.155 y 5.110.341 se describe que según lo
observado, LPE estimula la producción de etileno y que suprime la
respiración de la fruta. Se especula así que estos efectos podrían
explicar la mejor maduración y estabilidad de la fruta tratada con
LPE. Se observó asimismo que el retraso de la senescencia de la
fruta tratada con LPE y los tejidos vegetales está relacionada con
una menor infiltración de electrolitros a través de membranas (5).
Por lo tanto, los autores de la invención han sospechado que LPE
puede regular un proceso clave de deterioro de la membrana en la
senescencia y envejecimiento de la planta.
La mayor infiltración de electrolitos durante la
senescencia de la planta ha sido achacada a la rotura de los
fosfolípidos de membrana (1,2). La menor infiltración de
electrolitos en las hojas, flores y frutas tras la cosecha tratadas
con LPE sugiere que LPE puede proteger la integridad de la membrana
inhibiendo la degradación de lípidos de la membrana (3). En función
de la cinética de liberación de diversos productos lipolíticos
in vivo y in vitro, se ha propuesto la fosfolipasa D
(en adelante denominada ``PLD'') como mediadora de la degradación
selectiva de los fosfolípidos de membrana, que es un evento rápido
y temprano que se produce en tejidos en senescencia
(4-9). Se observó un aumento en la expresión PLD en
los tejidos de la hoja en senescencia y se caracterizó la expresión
de PLD a través de modos complejos incluyendo un aumento de PLD
asociada a membrana, expresión diferencial de variantes de PLD y
cambios en las cantidades de proteínas de PLD y ARNm (10).
Tal como se ha descrito aquí, los autores de la
presente invención han demostrado que el lisofosfolípido LPE puede
inhibir la actividad de PLD parcialmente purificada en una manera
altamente específica en plantas. Tal como demuestran los ejemplos
que se exponen más adelante, los lisofosfolípidos LPE (18:1) y LPI
son inhibidores particularmente fuertes de la PLD. Por otra parte,
el tratamiento de plantas con LPE (18:1) o LPI va asociado a una
menor producción de etileno. Se ha observado que LPI es
particularmente eficaz para retrasar la senescencia de las hojas,
tal como lo pone de manifiesto el alto contenido en clorofila de
las hojas en senescencia tratadas con LPI en comparación con un
control, y también en comparación con hojas tratadas con LPE o LPC.
En consecuencia, los lisofosfolípidos, como por ejemplo LPE (18:1) y
LPI son agentes particularmente atractivos para retrasar la
senescencia de la fruta y tejidos vegetales. Los autores de la
invención también han demostrado asimismo que LPE (18:1) y LPI son
particularmente eficaces para mejorar la maduración y estabilidad
de la fruta.
A continuación, se exponen ejemplos de la
presente invención.
Ejemplo
1a
Se obtuvieron lisofosfolípidos naturales
purificados de yema de huevo, hígado bovino, y soja y LPE sintético
con diferentes cadenas de acilo (14:0, 16:0, 18:0, 18:1) de Avanti
Polar Lipids (Alabaster, Alabama). Se obtuvieron todos los demás
productos químicos de fosfolípido y materiales utilizados de Sigma
(St. Louis, MO). Se disolvieron los fosfolípidos y ácido graso en
cloroformo: metanol: KOH (1N) (95:5:1, v/v). Después de añadir
agua, se desprendieron disolventes orgánicos por fluido de gas
nitrógeno. Se ajustaron las concentraciones de la solución de
reserva en 1 mM con agua antes de añadirla a la mezcla de reacción
de PLD. Se preparó la solución de LPE para tratar fruta y tejidos
vegetales a granel por sonicación del polvo de LPE suspendido en
agua sin el uso de disolventes orgánicos.
Se disolvió PLD de calabaza parcialmente
purificada, utilizado normalmente para investigar aspectos
bioquímicos y fisiológicos de PLD (11,12), en Tris 50 mM (pH 8,0) y
se añadió a la mezcla de reacción con una concentración final de 0,6
\mug/ml con el fin de examinar el efecto de LPE sobre la
actividad de PLD.
Además de PLD de calabaza parcialmente
purificada, los autores de la invención también investigaron el
efecto de LPE en la actividad de PLD asociado a membrana y PLD
soluble, que se obtuvieron de dos fuentes vegetales, es decir
calabaza (Brassica oleracea L. Blue Vintage) y semilla de
ricino (Ricinus communis L. cv Hale). Se cultivaron plantas
de la semilla de ricino en tiestos de plástico que contenían una
mezcla de vermiculita y parlay (1:1, v/v), que fueron subirrigadas
a 22ºC con solución nutriente Hoagland bajo luces fluorescentes
blancas frías (150 \mumoles min^{-1} m^{-2}) con fotoperíodo
de 14 h (10). Se obtuvo calabaza de mercado fresca.
Ejemplo
1b
Se recogieron hojas totalmente expandidas de
plantas de semilla de ricino de dos meses y calabaza, se congelaron
rápidamente en nitrógeno líquido, y se homogeneizó con un mortero y
una maza enfriados con hielo (13). Se añadió un tampón de
extracción que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) KCl
10 mM, EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM y DTT 2 mM a las muestras en polvo.
Después de triturarlo durante 5 minutos más, se centrifugó el
homogenato a 6.000 g durante 10 minutos para eliminar los restos.
Se centrifugó el sobrenadante a 100.000 g durante 30 minutos para
fraccionar el extracto en PLD asociado a membrana y soluble. Se
recogió el sobrenadante resultante como la fracción soluble y el
pelet como la fracción de membrana. Se lavó la fracción de membrana
una vez con tampón de extracto para eliminar las sustancias
contaminantes solubles. Se añadieron las muestras de PLD solubles y
PLD asociado a membrana a las mezclas de reacción a una
concentración final de 100 \mug/ml y 10 \mug/ml,
respectivamente.
Ejemplo
1c
Se sometió a ensayo la actividad de PLD de
calabaza parcialmente purificada midiendo el contenido en fósforo
incluido en fosfatidiletanol (en adelante denominado ``PEOH'') y
ácido fosfatídico (en adelante denominado ``PA'') liberado de la
fosfatidil colina de sustrato (en adelante denominada ``PC'') (13).
Para este ensayo, se secaron 20 \mumoles de PC de huevo en
cloroformo bajo una corriente de gas nitrógeno. Se emulsionó el
lípido en 1 ml de H_{2}O por sonicación a temperatura ambiente.
Una mezcla de ensayo de enzima patrón contenía 100 mM Mes/NaOH (pH
6,5), CaCl_{2} 50 mM, SDS 0,5 mM, 20 \mul de sustrato (0,4
\mumoles de PC), 1% de etanol y 20 \mul de PLD en un volumen
total de 200 \mul (14). A continuación, se incubó la mezcla de
ensayo a 30ºC durante 30 minutos en el baño de agua. Se detuvo la
reacción añadiendo 750 \mul de cloroformo:metanol (1:2). Se
añadió cloroformo (200 \mul) a la mezcla seguido de 200 \mul de
KCl (2M). Después de agitar con torbellino, se separaron las fases
de cloroformo y acuosa por centrifugado a 12.000 g durante 5
minutos. Se recogió la fase de cloroformo y se secó. Se disolvieron
las muestras secas en 50 \mul de cloroformo antes de detectarlas
en una placa de TLC (gel de sílice G). Se reveló la placa con
disolvente de cloroformo:metanol:NH_{4}OH (65:35:5). Se
visualizaron lípidos sobre las placas por exposición a vapor de
yodo. Se rasparon manchas que correspondían a los patrones de
lípido PEOH, PA y PC en viales y se determinaron las cantidades
midiendo el contenido en fósforo tal como describe Rouser y cols.
(15). Se utilizó PEOH, el producto de la reacción de
transfosfatidilación como indicador de la actividad de PLD en lugar
de PA, el producto de la reacción hidrolítica, ya que el primero no
se metaboliza fácilmente.
Se midieron la actividad de PLD asociada con la
membrana y las fracciones solubles obtenidas de tejidos de calabaza
y semilla de ricino determinando la liberación de PA y PEOH radio
etiquetado del sustrato PC (10). Para este propósito, se mezclaron
0,4 \muCi de L-3-fosfatidilcolina,
1,2-di[1-C^{14}] palmitol
(Amersham (Arlington Heights, IL)) con 20 \mumoles de PC de huevo
en cloroformo. Las condiciones de ensayo y separación de producto
de reacción fueron las mismas que las antes descritas. Se determinó
cuantitativamente la radioactividad en PEOH, PA y PC raspado de TLC
por espectroscopía de centelleo.
Ejemplo
1d
Se ha observado que el tratamiento después de la
cosecha de tejidos de fruta con LPEhuevo (que está purificado del
huevo y consiste principalmente en LPE 16:0 y LPE 18:0) retrasa la
senescencia y mejora la vida en almacenamiento de las frutas
(3,16). No obstante, el impacto de las diferentes cadenas de acilo
de LPE sobre la senescencia de la fruta no ha sido investigado. En
el estudio de la presente invención, de forma complementaria al
efecto de las diferentes cadenas de acilo de LPE sobre la actividad
de PLD, los autores de la invención investigaron el efecto de
diferentes cadenas de acilo de LPE sobre la producción de etileno
de frutas de arándano. Se recogieron frutas de arándano totalmente
maduras (Vaccinium macrocarpon Ait ``Stevens'') durante la
estación del otoño y se mantuvieron en una cámara fría. Se
sumergieron frutas de arándano después de recogerlas seleccionadas
al azar (15 bayas por muestra) en soluciones de LPE con diferentes
cadenas de acilo (100 \muM) durante 30 minutos, después se
secaron al aire y se dejaron a temperatura ambiente (26 \pm 2ºC).
Al cabo de dos días, se incubaron las bayas en un tarro de vidrio
sellado durante 24 horas con el fin de medir la producción de
etileno. Se determinó cuantitativamente el etileno con un aparato
de cromatografía de gases equipado con un detector de ionización de
llama (Shimadzu 9AM, Shimadzu Corporation, Kioto, Japón) (3).
Ejemplo
1e
Para evaluar la eficacia relativa de diversas
especies de lisofosfolípidos en el retraso de la senescencia de las
hojas, se aplicaron soluciones de tratamiento que contenían ácido
lisofosfatídico (LPA), lisofosfatidilcolina (LPC), LPE, LPI, o agua
sobre las hojas. Se midió el contenido en clorofila de cada muestra
a través de métodos convencionales (10) tras una senescencia de
ocho días. El contenido de clorofila relativo se expresó como el
porcentaje del control.
Ejemplo
1f
Los autores de la invención estudiaron si LPE, un
fosfolípido natural, actúa como mediador de lípido biológicamente
activo inhibiendo la actividad PLD in vitro de una manera
específica. Se sometieron a ensayo los efectos de inhibición de LPE
sobre PLD de calabaza parcialmente purificada utilizando PC como
sustrato. Se inhibió la actividad de PLD a través de LPE con
diferentes cadenas de acilo, a concentraciones de 40 a 200 \muM
(figura 1). El grado de inhibición aumentó con la longitud y la
insaturación de cadenas de acilo. LPE con una cadena de acilo de
18:1 fue el inhibidor más eficaz entre las especies sometidas a
ensayo y la actividad de PLD resultante fue 16% y 11% del control a
las concentraciones de LPE de 40 y 200 \muM, respectivamente. Por
otra parte, LPE 14:0, que raramente está presente en los tejidos
vegetales, presentó un efecto muy escaso. Sería interesante someter
a ensayo los efectos de LPE con otras cadenas de acilo, incluyendo
18:2 y 18:3, pero estas formas de LPE no están comercializadas en
el momento actual. Una espectacular inhibición de PLD mediante LPE
(18:1), en comparación con otras moléculas de LPE ensayadas,
sugiere que es necesaria la configuración específica de LPE para
este efecto inhibidor.
Se sometió a ensayo el efecto de diferentes
componentes de moléculas LPE sobre la actividad de PLD para
determinar si era necesaria alguna especificidad estructural para
la inhibición de LPE. El grupo de cabeza (etanolamina) y la cadena
de acilo (ácido graso 18:1) por sí mismos no tuvieron ningún efecto
inhibidor sobre la actividad de PLD (Figura 2). Estos resultados
indican que tan solo la molécula de LPE intacta es capaz de inhibir
PLD, y la pérdida de cualquiera de los componentes estructurales
tiene como resultado una completa ineficacia lo que indica, por
tanto, su especificidad estructural. De hecho, la
fosfatidiletanolamina (PE) presentó cierto efecto estimulador sobre
la actividad PLD. En presencia de 200 \muM PE, la actividad de
PLD fue 126% del control (figura 2). Dado que PE es por sí mismo un
sustrato preferencial de PLD (17), el aumento de la actividad de
PLD podría explicarse por su efecto estimulador directo sobre PLD
y/o una hidrólisis preferencial de PE mediante PLD.
La inhibición de PLD mediante LPE fue dependiente
de dosis (figura 3). LPE (18:1) presentó un considerable efecto
inhibidor a la concentración de 10 \muM teniendo como resultado
un 50% de la actividad del control y un aumento gradual de la
inhibición al aumentar la concentración hasta 200 \muM. Las
concentraciones de LPE de 10 y 200 \muM reflejan porcentajes de
0,5 y 10% en moles del total de fosfolípido en las mezclas de
reacción, respectivamente.
Para caracterizar la inhibición de PLD, se
analizaron los efectos de la concentración del sustrato sobre la
inhibición de PLD en presencia y ausencia de LPE (figura 4). Las
condiciones de ensayo normales utilizan la concentración de
saturación del sustrato (PC 2 mM). Se mantuvo el efecto de
inhibición de LPE (18:1) incluso a una concentración del sustrato 4
mM. El Km aparente para PLD fue 1,7 mM y no cambió en presencia de
LPE. No obstante, la presencia de LPE (18:1) tuvo como resultado un
espectacular descenso en Vmax (2,0 \mumoles min^{-1} mg^{.1}
proteína). Estos resultados sugieren una inhibición no competitiva
de PLD mediante LPE.
Dado que PLD está presente no solamente en una
forma soluble en el citosol, sino también en una forma asociada a
membrana, los autores de la invención determinaron la inhibición
in situ de LPE sobre PLD asociada a membrana extraída de las
hojas de semilla de ricino y calabaza. Las actividades específicas
de PLD de calabaza soluble y asociada a membrana disminuyeron a 59%
y 51% del control en presencia de LPE (18:1), respectivamente (tabla
1). La actividad de PLD de semilla de ricino soluble y asociada a
membrana también disminuyó a un 31% y un 30% del control,
respectivamente. Estos resultados indican que ambas actividades de
PLD tanto soluble como asociada a membrana son inhibidas por LPE.
La inhibición de PLD asociada a membrana y fracciones solubles fue,
sin embargo, menos pronunciado que la inhibición de PLD de calabaza
parcialmente purificada a través de LPE (figura 1 y tabla 1). Tal
vez esto se deba a la presencia de ciertos factores de
interferencia o a la presencia de otras formas de PLD que son menos
sensibles a LPE. Se ha sugerido, por lo tanto, que la purificación
parcial de PLD es crítica para caracterizar el mecanismo regulador
de PLD (18). Por esta razón, en este estudio, los autores de la
presente invención han utilizado PLD de calabaza parcialmente
purificada, que está comercializada. No obstante, el efecto
inhibidor observado de LPE sobre PLD soluble y asociado a membrana
extraído de los tejidos de la hoja corrobora los resultados
obtenidos con PLD parcialmente purificada.
| PLD soluble | PLD asociado a membrana | |||
| Calabaza | Semilla de | Calabaza | Semilla de | |
| ricino | ricino | |||
| Control | 45,2 \pm 3,5 | 10,2 \pm 0,1 | 368,8 \pm 6,5 | 153,8 \pm 8,5 |
| LPE 18:1 | ||||
| (200 \muM) | 23,1 \pm 16 | 31 \pm 0,1 | 217,0 \pm 13,0 | 47,0 \pm 3,6 |
| Relación | ||||
| (LPE/control) | 0,51 | 0,30 | 0,59 | 0,31 |
Previamente, se había observado que LPEhuevo
(extraído de yema de huevo) retrasa la senescencia de la fruta, tal
como lo indica una menor velocidad de la producción de etileno en
comparación con el control (3). Dado que los autores de la
invención han observado que la eficacia inhibidora de LPE sobre PLD
dependía de la longitud y la insaturación de la cadena de acilo de
LPE (figura 1), se sometieron a ensayo los efectos de LPE con
diferentes cadenas de acilo sobre la senscencia de la fruta. Se
trataron frutas de arándano con LPE con longitudes de cadena de
14:0, 16:0, 18:0 y 18:1, y se llevó un seguimiento de la producción
de etileno de estas frutas. La inhibición de la producción de
etileno aumentó con la longitud de cadena de acilo y la
insaturación de LPE (tabla 2). LPE (18:1) tuvo como resultado el
descenso más espectacular (40%) en la producción de etileno 2 días
después del tratamiento. Resulta interesante observar que este
modelo de inhibición de la producción de etileno mediante diferentes
tipos de LPE fue similar al modelo de inhibición de PLD mediante
diversos tipos de LPE (figura 1). Estos resultados indican que la
inhibición de la actividad de PLD y la producción de etileno
depende correspondientemente de la longitud de cadena de acilo y la
insaturación de LPE. Estos resultados sugieren que LPE (18:1) es
superior a otras especies de LPE sometidas a ensayo en la inhibición
de LPE y el retraso de la senescencia de la fruta.
Inhibición de producción de etileno en frutas
de arándano mediante LPE (100 \muM) con diferentes cadenas de
acilo. Los valores son la media \pm SE (error típico) de estas
replicaciones.
| Control | LPE 14:0 | LPE 16:0 | LPE 18:0 | LPE 18:1 | |
| Etileno | 1,78 \pm 0,38 | 1,78 \pm 0,11 | 1,65 \pm 0,05 | 1,27 \pm 0,05 | 1,06 \pm 0,13 |
| (nl hr^{-1} g^{-1}) | |||||
| % relativo | 100 | 100,0 | 92,7 | 71,3 | 59,6 |
Para determinar si la inhibición de PLD podría
darse a lo largo de una amplia variedad de lisofosfolípidos, se
comparó el efecto inhibidor de LPE sobre PLD con la inhibición
mediante lisofosfolípidos relacionados presentes en las células
vegetales (figura 5). La lisofosfatidilcolina (en adelante
denominada ``LPC''), lisofosfatidilglicerol (en adelante denominado
``LPG'') y lisofosfatidilserina (en adelante denominado ``LPS'') no
afectaron significativamente a la actividad de PLD. No obstante,
LPI presentó efectos de inhibición en cierto modo similares a los
de LPE. En cambio, el ácido lisofosfatídico (en adelante denominado
``LPA'') aumentó significativamente la actividad de PLD (figura 5).
Por ejemplo, a una concentración de 200 \muM de LPI y LPA, la
actividad de PLD fue 31% y 169% del control, respectivamente. El
único lisofosfolípido sintético sometido a ensayo en la figura 5 fue
LPA. Todos los demás lisofosfolípidos fueron de fuentes naturales
que contenían principalmente ácidos grasos 16:0 o 18:0. Además de
LPA (16:0) (figura 5), los autores de la invención también
sometieron a ensayo LPA (18:1) y observaron resultados similares de
los dos tipos de LPA. En el este estudio, LPE pero no LPC presentó
un fuerte efecto inhibidor sobre PLD (figura 5). Estos resultados
indican que el efecto regulador de lisofosfolípidos individuales
sobre la enzima PLD es muy específico y estructuralmente
selectivo.
Además de LPE, los resultados sugieren que LPI
puede ser también un mediador de lípidos para retardar la
senescencia en plantas.
Se observó que el contenido en clorofila de las
hojas en senescencia tratadas con LPI era mucho más alto que el de
las hojas tratadas con LPA, LPC o LPEhuevo (Figura 6). Los
resultados indican que LPI es particularmente eficaz en el retraso
de la senescencia de la hoja.
Compendiando el ejemplo 1, según han podido saber
los autores de la invención, este es el primer estudio en el que se
muestra una regulación inhibidora específica de PLD mediante LPE
(18:1) y LPI, que apunta directamente a la actividad de la enzima
PLD. Se trata de un hallazgo importante ya que no hay inhibidores
específicos conocidos de PLD en plantas y animales (19). Asimismo,
se ha demostrado que el tratamiento de plantas de fruta con LPE
(18:1) reduce la producción de etileno más que las especies LPE con
longitudes de cadena de acilo más cortas o un mayor grado de
saturación. Dado que tanto el etileno como PLD están asociados a la
senescencia de las plantas, es razonable esperar que LPE (18:1) y
LPI sean particularmente eficaces para retrasar la senescencia de la
fruta y los tejidos vegetales, en mayor grado que otras especies de
LPE.
Se recogieron espigas en floración de dragón
(Antirrhinum majus L. c.v. Potomac Blanco) y se
distribuyeron desde el cultivador comercial durante toda la noche
(20). Al recibirlas, se cortaron las puntas de los tallos de las
espigas bajo agua destilada y se dejaron que se rehidrataran
durante 2 horas. Después de la rehidratación, se recompusieron las
espigas a una longitud de 40 cm y se arrancaron las hojas a 18 cm
en la parte de debajo de la espiga. De esta forma se evitó que las
hojas fueran una fuente de la contaminación bacteriana y fúngica en
el jarrón. Se agruparon todas las espigas y se seleccionaron al azar
para su tratamiento. Se prepararon LPE (18:1), LPI y LPEhuevos en
agua destilada. Se aplicó sonicación para facilitar la disolución
de LPE y otros lisifosfolípidos en agua.
Para el tratamiento con LPE, se mantuvo el
extremo cortado de las espigas durante 24 horas en una solución de
LPE a diferentes concentraciones. A continuación, se transfirieron
a agua destilada y se mantuvieron en ese agua durante 3 semanas. Se
observaron las espigas para determinar la apertura de sus capullos
florales y también para detectar síntomas de senescencia
(marchitamiento y empardecimiento). Cuando el cuello de la flor se
marchitó, se consideró que la flor no se podía comercializar. Se
consideró que la espiga se podía comercializar siempre y cuando
permaneció turgente (no marchita) y cuando más de un 50% de las
flores permaneciera sana. Al final del estudio, se determinó el
contenido en agua de las hojas de espiga como indicador de
turgencia y salud de las hojas midiendo la relación entre el peso
fresco y el peso seco.
Tal como se muestra en la tabla 3 a continuación,
el tratamiento con LPEhuevo (LPE purificado de huevo) pudo retrasar
la senescencia en comparación con el control; en el primero de 37 a
52% de espigas se marchitaron, mientras que en el control, un 76%
de ellas se marchitaron al cabo de 7 días de tratamiento. El
tratamiento con LPE (18:1) y LPI resultó particularmente eficaz en
aumentar la vida en el jarrón de las flores de dragón; solamente un
30 a 39% y un 15 a un 22% de las espigas se marchitaron
respectivamente en estos dos tratamientos. LPE (18:1) y LPI no
solamente aumentaron la vida en el jarrón de la flor, sino que
también aumentaron la sensibilidad de las flores a estos lípidos.
Por ejemplo, 5 mg/L de LPI y LPE (18:1) proporcionaron una mayor
prolongación de la vida en el jarrón de la flor, que 25 mg/L de
LPEhuevo, lo que indica que LPI y LPE (18:1) son formas más activas
entre los lisofosfolípidos para retrasar la senescencia. Las flores
tratadas con LPI y LPE (18:1) siguieron siendo comerciables durante
13 días, mientras que las flores tratadas con agua y las flores
tratadas con LPE huevo siguieron siendo comerciales durante 4 días y
7 días, respectivamente. El contenido en agua en la hoja de las
espigas tratadas con LPE (18:1) y LPI fue mayor que el de las
tratadas con LPEhuevo y agua a los 18 días del tratamiento. Los
datos se corresponden con una mejor vida en almacenamiento de las
flores tratadas con LPE (18:1) y LPI. Estos datos corroboran que
LPE (18:1) y LPI son superiores a LPEhuevo.
| Tratamiento | Espigas con las | Contenido en | Vida en jarrón** de |
| flores marchitas al | agua de la hoja al | espigas (días) | |
| cabo de 7 días (% | cabo de 18 días | ||
| del total) | (peso fresco/peso | ||
| seco) | |||
| Media \pm SE* | Media \pm SE* | ||
| Control (agua) | 75,5 \pm 10,3 | 5,79 \pm 0,18 | 4 |
| LPEhuevo | |||
| 5 mg/L | 52,3 \pm 9,5 | 6,77 \pm 0,44 | -- |
| 10 | 50,0 \pm 15,5 | -- | -- |
| 25 | 36,7 \pm 5,55 | -- | 7 |
| LPE 18:1 | |||
| 5 mg/L | 34,5 \pm 5,5 | 7,81 \pm 0,22 | -- |
| 10 | 30,0 \pm 5,5 | -- | 12 |
| 25 | 38,7 \pm 8,5 | -- | -- |
| LPI | |||
| 5 mg/L | 21,6 \pm 7,0 | 7,57 \pm 0,52 | -- |
| 10 | 15,0 \pm 11,5 | -- | 13 |
| 25 | 17,8 \pm 7,5 | -- | -- |
* Los datos son la media \pm SE (error típico)
de dos experimentos independientes. Se realizó cada experimento
con 12 espigas por tratamiento.
** Vida en jarrón: días cuando > 50% de las
espigas siguieron siendo comerciables.
Se trataron espigas en floración de clavel
(Dianthus caryophyllus L. c.v. Sim blanco) obtenidas de un
productor comercial con diversos lípidos, tal como se ha descrito
en el caso anterior con los dragones. Al igual que con las flores
dragones, LPI y LPE (18:1) a 25 mg/L resultaron superiores a
LPEhuevo y el control en cuando a la prolongación de la vida en el
jarrón de los claveles (tabla 4). LPEsoja (LPE purificada de soja)
también proporcionó una mejor vida en almacenamiento que LPEhuevo
(LPE purificado de huevo). LPEsoja consiste en un 64% de LPE
insaturado, como por ejemplo LPE (18:1), LPE (18:2) y LPE (18:3) y
un 30% de LPE saturado como por ejemplo LPE (16:0) y LPE (18:0), y
un 2% de LPI (distribuido por Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster,
Alabama), mientras que LPEhuevo contiene sobre todo (> 94%) de
LPE saturado, como por ejemplo LPE (16:0) y LPE (18:0). Este
resultado corrobora las conclusiones de los autores de la invención
de que LPE (18:1) y LPI son superiores a otras especies LPE en lo
que se refiere a prolongar la vida en el jarrón de las flores.
| Tratamiento | Flores comerciables al cabo de 6 días de |
| tratamiento (% del total) | |
| * Media \pm SE | |
| Control | 27,5 \pm 3,3 |
| (agua) | |
| LPEhuevo | 30,8 \pm 3,3 |
| LPE 18:1 | 41,7 \pm 8,3 |
| LPI | 44,2 \pm 8,3 |
| LPE soja | 41,7 \pm 83 |
* Los datos son la media \pm SE (error típico)
de 36 flores por tratamiento. (9 flores/replicaciones)
Se recogieron frutas verdes maduras de tomate
(Lycopersicon esculentum c.v H9144) de plantas de tres
meses. Se sumergieron las frutas recogidas en las soluciones de
lisofosfolípido indicadas en la tabla 5 a continuación, a una
concentración de 100 mg/L en etanol al 1% durante 20 minutos. Se
sumergieron los tomates de control en agua destilada que contenía
etanol al 1%. Después de la inmersión, se almacenaron las frutas a
temperatura ambiente durante 3 semanas. Se midió la producción de
gas etileno 7 días después del tratamiento. La velocidad de
producción de etileno de las frutas aumentó gradualmente a medida
que las frutas empezaron a madurar. Mientras que las verdes maduras
el día 0 no presentaron producción de etileno, las frutas de
control sin tratar produjeron etileno a una velocidad de 1,26
nl/g.hr^{-1} al cabo de 7 días de tratamiento (véase la tabla 5 a
continuación). Las frutas tratadas con LPEhuevo presentaron una
producción de etileno similar al control. En cambio, tanto las
frutas tratadas con LPE (18:1) como las tratadas con LPI
presentaron una supresión de la producción de etileno, y esta
velocidad fue únicamente la mitad que la de control, en las frutas
tratadas con LPEhuevo, la supresión de la producción de etileno fue
paralela a la prolongación de la vida en almacenamiento de las
frutas. En correspondencia con estas expectativas, los porcentajes
de frutas podridas al cabo de 3 días de incubación indicaron
también que LPE (18:1) y LPI son particularmente más eficaces que
LPEhuevo y que el control para extender la vida en almacenamiento
de los tomates. Se observó que LPE soja resultó mejor que LPE huevo
en lo que se refiere a prolongar la vida en almacenamiento de las
frutas (frutas podridas: 24% en LPE huevo y 15% en LPE soja).
| Tratamiento* | Producción de etileno | Frutas podridas al cabo |
| tras 7 días (nl/g.h^{-1}) | de 3 días (% del total) | |
| Media \pm SE** | ||
| Control | 1,26 \pm 0,21 | 37,2 |
| LPE huevo | 1,22 \pm 0,22 | 24,4 |
| LPE (18:1) | 0,70 \pm 0,20 | 7,7 |
| LPI | 0,71 \pm 0,40 | 17,5 |
| LPE soja | 0,74 \pm 0,10 | 15,0 |
* Todas las soluciones se prepararon en etanol al
1% (v/v)
** Los datos son la media \pm SE (error típico)
de dos experimentos independientes.
Cada experimento tuvo 9 frutas por
tratamiento.
Ethephon, también conocido como Ethrel (Ethrel es
una marca registrada de Rhone-Poulenc Ag. Co.
(Research Triangle Parck, NC)) es una formulación acuosa que se
descompone en etileno y cuyo uso está bastante extendido para
aumentar al máximo el rendimiento de frutas de tomate maduras en
operaciones de recogida de una sola vez. La presente invención
demuestra que LPE (18:1) es superior a LPE huevo y otros
lisofosfolípidos en la protección de hojas frente a la senescencia
de la hoja inducida por ethephon. Se cultivaron plantas de tomate
c.v H9144 en un invernadero durante dos meses y medio para que
sirvieran como fuentes de muestras de hoja. Se pulverizaron las
plantas por escorrentía con ethephon a 1000 mg/L o con ethephon más
mezclas de lisofosfolípidos tal como se muestra más adelante en la
tabla 6. Se prepararon soluciones de lisofosfolípido a 50 mg/L en
etanol al 1% (v/v) y se mezclaron con ethephon (1000 mg/L). Se
pulverizaron las plantas de control con ethephon en solitario en
etanol al 1% (v/v). Se determinó cuantitativamente la senescencia
de las hojas tratadas de 10 a 14 días tras el tratamiento a través
de la medida de clorofila y el contenido en proteínas. El tejido de
las hojas pulverizadas con ethephon presentó una considerable
pérdida de clorofila y del contenido en proteínas tal como se
indica en la tabla 6 más adelante. LPE huevo retardó
significativamente la senescencia inducida por ethephon. LPE (18:1)
presentó un retraso mucho mejor de la senescencia de la hoja
causado por ethephon. LPI presentó un escaso efecto de retraso en
la senescencia de la hoja inducida por ethephon. Estos resultados
demuestran que LPE (18:1) funciona incluso mejor que otras formas de
LPE para este fin.
| Tratamiento* | Contenido en clorofila | Contenido en proteína |
| (mg/g peso en seco) | (mg/g peso en seco) | |
| Media \pm SE** | Media \pm SE** | |
| Ethephon (E) | 3,65 \pm 0,25 | 58,8 \pm 14,7 |
| E + LPE huevo | 5,88 \pm 2,04 | 81,9 \pm 17,6 |
| E + LPE (18:1) | 8,40 \pm 2,70 | 100,0 \pm 20,0 |
| E + LPI | 4,12 \pm 0,55 | 60,0 \pm 14,7 |
* Se prepararon todas las soluciones en etanol al
1% (v/v)
** Los datos son la media \pm SE (error típico)
de tres experimentos independientes. Se recogieron los datos de 10
a 14 días después del tratamiento.
Se llevó a cabo este experimento para comparar
los efectos de LPE huevo, LPE (18:1) y LPI en la maduración de la
fruta. Se cultivaron plantas de tomate c.v H9478 en tiestos durante
dos meses y medio con luces fluorescentes. Se pulverizaron todas
las plantas en el estado de maduración que tenían aproximadamente
un 10% de sus frutas con una solución que contenía 100 mg/L de
diferentes lisofosfolípidos como LPE huevo, LPE (18:1) o LPI. Todas
las soluciones contenían etanol al 1% y 0,05% de Sylgard 309 (Dow
Corning Co., Midland, MI) como agentes activantes. Los plantas de
control recibieron agua destilada que contenía 1% de etanol y 0,05%
de Sylgard 309. Se recogieron las frutas 10 días después del
tratamiento y se graduaron en verdes, parcialmente rojas y rojas
(lo que indica una total maduración). LPE huevo aumentó la
maduración de la fruta de forma significativa en comparación con el
control tal como se ha descrito anteriormente en las patentes
EE.UU. 5.126.155 y 5.110.341 (véase tabla 7). No obstante, se
observó que LPI y LPE (18:1) eran más eficaces que LPE huevo. LPI y
LPE (18:1) mejoraron también la estabilidad de la fruta al
prolongar la vida en almacenamiento de las frutas después de
haberlas recogido en comparación con el control y LPE huevo (véase
Tabla 7).
| En la recogida | 3 semanas | |||
| después de la | ||||
| cosecha | ||||
| Tratamiento* | Verde | Parcialmente | Rojo | Frutas blandas |
| Rojo | (no | |||
| comerciables) | ||||
| (% en peso del total) | (% peso del | |||
| total) | ||||
| Control | 33,2 | 13,2 | 53,6 | 47,8 |
| LPE huevo | 22,8 | 15,9 | 61,3 | 36,6 |
| LPE (18:1) | 22,9 | 11,7 | 65,4 | 33,0 |
| LPI | 18,3 | 11,7 | 70,1 | 25,6 |
* Se prepararon todas las soluciones en etanol al
1% (v/v) y 0,05% de Sylgard 309. Se realizaron aplicaciones de
pulverización 10 días antes de la recogida.
** Los datos son la media que representa tres
experimentos independientes.
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Claims (13)
1. Un método para retrasar la senescencia en la
fruta y otros tejidos vegetales, incluyendo dicho método la etapa
de aplicar en la fruta y en otros tejidos vegetales una composición
que consiste en lisofosfatidilinositol o lisofosfatidiletanolamina
(18:1) o una combinación de ellos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la
composición incluye además un agente activante.
3. El método de la reivindicación 1 en el que la
composición es una solución acuosa.
4. El método de la reivindicación 1 en el que la
composición se aplica antes o después de la cosecha.
5. El método de la reivindicación 1 en el que la
composición contiene una cantidad efectiva de
lisofosfatidilinositol, lisofosfatidiletanolamina (18:1) o
combinaciones de ellos para retrasar la senescencia de la fruta y
otros tejidos vegetales.
6. El método de la reivindicación 1 en el que la
composición contiene de 0,5 a 1000 mg por litro de
lisofosfatidilinositol, lisofosfatidiletanolamina (18:1) o
combinaciones de ellos.
7. El método de la reivindicación 2, en el que el
agente activante es etanol, TERGITOL® o SYLGARD® 309.
8. Un método para mejorar la maduración y
estabilidad de las frutas, incluyendo dicho método la etapa de
aplicar antes de la cosecha a todos los tejidos de la planta una
composición que consiste en lisofosfatidilinositol o
lisofosfatidiletanolamina (18:1) o una combinación de ellos.
9. El método de la reivindicación 8 en el que la
composición incluye además un agente activante.
10. El método de la reivindicación 8 en el que la
composición es una solución acuosa.
11. El método de la reivindicación 8, en el que
la composición contiene una cantidad eficaz de
lisofosfatidilinositol, lisofosfatidildietanolamina (18:1) o
combinaciones de ellos para mejorar la maduración y estabilidad de
la fruta.
12. El método de la reivindicación 8 en el que la
composición contiene de 0,5 a 1000 mg por litro de
lisofosfatidilinositol, lisofosfatidiletanolamina (18:1) o
combinaciones de ellos.
13. El método de la reivindicación 9 en el que el
agente de activación es etanol, TERGITOL® o SYLGARD® 309.
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