ES2198163T3 - Composicion destinada a la prevencion y tratamiento de la ateroesclerosis. - Google Patents

Abstract

Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento de la ateroesclerosis por administración oral de la misma, comprendiendo un compuesto activo seleccionado del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta2-glicoproteína-1 b2GPI, derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

Description

Composición destinada a la prevención y tratamiento de la ateroesclerosis.

La presente invención se refiere a una composición que induce la tolerancia inmunológica y oral de acuerdo con el preámbulo de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 y concierne también al uso de una composición que induce una tolerancia inmunológica y oral administrada oralmente de acuerdo al preámbulo de las reivindicaciones 14, 15 y 17.

La ateroesclerosis y sus secuelas clínicas representan uno de las afrentas más peligrosas en la sociedad Occidental en términos de morbilidad y mortalidad. Así pues, no es sorprendente que se hayan dedicado esfuerzos inmensos para investigar su etiopatogénesis con el fin de proporcionar medios para retardar o parar su progresión indolente temprana. Aunque no existe una respuesta definitiva ha llegado a ser aparente que no es un sólo mecanismo individual el responsable del desarrollo de la placa ateroesclerótica como se supuso antes en referencia a la desregulación del balance lipídico.

Los clínicos usan la expresión ateroesclerosis para definir un proceso histopatológico que resulta en una obstrucción de las arterias en diferentes partes del cuerpo. La obstrucción esta causada por una acumulación de células diferentes de varios orígenes que van almacenando grandes cantidades de grasas procedentes de la circulación. La grasa que principalmente consiste de lipoproteínas de baja densidad (LDL) colesterol ``malo'', es el material principal que se deposita en las paredes de los vasos. En los estados avanzados de la ateroesclerosis, las zonas llenas de lípidos empiezan a acumular calcio. La deposición de calcio presta a las arterias rigidez y menor flexibilidad, es por esta razón que tienen apariencia pedregosa, una apariencia que nos ha conducido a la expresión bien conocida de ``esclerosis de las arterias'' (ateroesclerosis). Cuando las arterias involucradas bloquean el flujo sanguíneo al corazón, la persona se ve afectada por un ``ataque al corazón'', cuando las arterias del cerebro ocluyen, la persona experimenta un derrame cerebral. Cuando las arterias estrechan las extremidades, el resultado es un dolor severo, que disminuye la movilidad física y posiblemente provoca la necesidad de una amputación.

Está claro que la progresión de las enfermedades mencionadas anteriormente no son detectables durante muchos años y sólo se manifiestan en estados avanzados. Cuando estas manifestaciones llegan a ser detectables es mucho más difícil ofrecer un remedio, debido al estado avanzado de la enfermedad.

Como se mencionó anteriormente, ateroesclerosis es el resultado del depósito de grasa en las paredes de los vasos sanguíneos, creando así un estrato de placa ateroesclerótica, dicho estrato obstruye el flujo de sangre a los órganos vitales, conduciendo así a accidentes cerebrovasculares, infartos de miocardio o enfermedades de los vasos sanguíneos periféricos. Loa factores de riesgo conocidos para la progresión rápida de la condición incluyen hipertensión, diabetes, sobrepeso, fumar y carencia de ejercicio físico.

En estudios recientes parece que factores infecciosos como Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Bar (EBV) y Chlamydia pneumonia podrían estar también implicados en la progresión de la ateroesclerosis. Este hecho se ha demostrado por la relación de ateroesclerosis con la gingivitis, además de la correlación entre la obstrucción de los vasos y restenosis y los títulos de autoanticuerpos para los antígenos anti-CMV, o partículas infecciosas encontradas en la placa ateroesclerótica.

En la década pasada se acumularon evidencias contundentes que soportan la teoría que la ateroesclerosis tiene un componente autoinmune infeccioso significativo.

En una enfermedad autoinmune el sistema inmune ataca los componentes del cuerpo (autoantígenos), además de atacar a los invasores externos. Las enfermedades autoinmunes se clasifican como enfermedades mediadas por autoanticuerpos o enfermedades mediadas por células. Las enfermedades autoinmunes mediadas por autoanticuerpos típicas miastenia gravis y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), mientras que enfermedades mediadas por células típicas son la Tiroiditis de Hashimoto y Diabetes tipo I.

Implicación de la red inmune en la ateroesclerosis

El reconocimiento que los procesos mediados por el sistema inmune prevalecen en las lesiones ateroescleróticas a partir de la observación consistente de linfocitos y macrófagos en las primeras etapas, denominado las bandas gruesas. Estos linfocitos que incluyen una población predominante de linfocitos CD4^{+} (el resto son linfocitos CD8^{+}) encontraron ser más abundantes que los macrófagos en las primeras lesiones, comparado con las lesiones más avanzadas, en donde esta proporción tiende a invertirse. Estos resultados plantean preguntas como si ellos reflejaran una sensibilización inmune primaria a un posible antígeno o estando alternativamente como un mero epifenómeno de un daño del tejido local inducido previamente. Independientemente de los factores responsables del reclutamiento de estas células inflamatorias a la placa temprana parecen exhibir un estado activado manifestado por la expresión concomitante de HLA-DR MHC de clase II y el receptor de la interleucina (IL) como el antígeno común leucocítico (CD45R0) y la integrina del antígeno 1 muy tardía (VLA-1).

En el curso de la reacción inflamatoria en los estados tempranos de la lesión ateroesclerótica puede ser que cualquier acontecimiento que se inicia primero que nos lleva a la producción de varias citocinas por las células locales (es decir, células endoteliales, macrófagos, células de la musculatura lisa y células inflamatorias), o puede ser que esta reacción sea una forma del sistema inmune de la defensa del cuerpo contra el proceso azaroso. Las citocinas que han mostrado estar desreguladas en las células residentes incluyen

\hbox{TNF- \alpha }

, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8. IFN-\gamma y péptido-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1). El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que se expresa en todos los constituyentes celulares en las placas ateroescleróticas también demostró estar sobreexpresado, esto posiblemente intensifica la reacción inflamatoria preexistente por un soporte co-estimulante en forma de un factor mitogénico y quimiotáctico. Muy recientemente, Uyemura K, Demer LL, Castle SC y al. Cross regulatory roles of IL-12 and IL-10 in atheroesclerosis. J. Clin Invest 1996 97; 2130-2138 clarificaron el patrón de citoquinas de los linfocitos T tipo 1 en lesiones ateroescleróticas en humanos ejemplificadas por una expresión fuerte del mRNA del IFN-\gamma pero no del mRNA de la IL-4 en comparación con las arterias normales. Además, se encontró que la IL-12 un factor de crecimiento de los linfocitos T producido sobretodo por monocitos activados y un inductor selectivo del patrón de citoquinas Th1, estaba sobreexpresado en las lesiones como manifestaba la abundancia de su forma de heterodímero principal de mRNA p70 y p40 (proteína inducible dominante).

Similar a la fuerte evidencia del dominio del sistema inmune celular en la placa ateroesclerótica, hay también amplios datos que apoyan la implicación del sistema inmune humoral local. Así, la deposición de inmunoglobulinas y componentes del complemento se mostraron en las placas además de la expresión potenciada de los receptores C3b y c3Bi en los macrófagos residentes.

Pruebas valiosas respecto a la contribución de la inflamación mediada inmune en la progresión de ateroesclerosis viene de modelos animales. Así, parece que los ratones inmunodeprimidos (deficiente MHC de clase I) tienden a desarrollar ateroesclerosis acelerada comparado con ratones inmunocompetentes. Adicionalmente, el tratamiento de los ratones C57BL/6 (Emeson EE, Shen ML. Accelerated atheroesclerosis in hyperlipidemic C57BL/6 mice treated with cyclosporine A. Am J Pathol 1993; 142: 1906-19159) y conejos blancos de Nueva Zelanda (Roselaar SE, Schonfeld G, Daugherty A. Enhanced development of atheroesclerosis in cholesterol fed rabbits by supression of cell mediated inmunity. J. Clin Invest 1995; 96: 1389-1394) con ciclosporina A, que es un supresor potente de la transcripción de IL-2 resultando en una ateroesclerosis potenciada significativamente bajo ``burdeon'' lipoproteínas ``normales''. Estos últimos estudios pueden aclarar los papeles posibles del sistema inmune como comprometido en contrarrestar el proceso inflamatorio perpetuado en la placa ateroesclerótica.

La ateroesclerosis no es una enfermedad autoinmune clásica, aunque algunas de estas manifestaciones como la producción de la placa que obstruye los vasos sanguíneos puede relacionarse con los efectos del sistema inmune. En la enfermedad autoinmune clásica, uno puede definir también muy claramente el ataque de autoantígenos por el sistema inmune, puede definir la parte del sistema inmune que ataque el autoantígeno (autoanticuerpo o células) que pertenecen al sistema inmune y se denominan linfocitos. Sobre todo se puede demostrar que por transferencia pasiva de estos componentes del sistema inmune la enfermedad puede ser inducida en animales sanos, o en el caso de humanos la enfermedad puede ser transferida de una madre embarazada enferma a su descendiente. Mucho de lo dicho anteriormente no predomina en la ateroesclerosis. Además, la enfermedad definitivamente tiene factores de riesgo comunes como hipertensión, diabetes, carencia de actividad física, fumar y otros, la enfermedad afecta a la gente mayor y tienen una preponderancia genética diferente a las enfermedades autoinmunes clásicas.

El proceso de inducir tolerancia oral se conoce desde principios de siglo por reducir reacciones alérgicas. Al paciente alérgico, se le aporta una dosis baja del alergeno conocido y la tolerancia inmune del cuerpo se restituye y no aparece ninguna reacción alérgica.

Tolerancia oral en enfermedades autoinmunes

En enfermedades autoinmunes la tolerancia oral es un término denotado para describir despuntadamente la respuesta inmune en una enfermedad autoinmune. La tolerancia producida aportando a un animal el antígeno ``incriminado'', puede invalidar el desarrollo de la enfermedad debido a un efecto paralizante en la respuesta inmune. Los inventores presentes han mostrado recientemente que la administración oral de \beta2GPI humana antes de la inmunización con esta molécula, resultó en mejora del síndrome equivalente antifosfolípidico (APS).

La tolerancia oral se aplicó en el área de las enfermedades autoinmunes, en que una reacción autoinmune se realizó contra el autoantígeno y existía una necesidad por restaurar la tolerancia del sistema inmune al autoantígeno.

Esto se realizó administrando a un sujeto dosis bajas de autoantígeno. Hasta ahora, se comunicaron varios modelos de animales en que la tolerancia oral se restituyó, incluyendo la prevención del desarrollo de encefalomielitis alérgica experimental (EAE), que es el equivalente a la esclerosis múltiple (MS), administrando a un sujeto una proteína de la membrana nerviosa llamada proteína básica de mielina (MBP), además de prevenir la artritis adyuvante y artritis de colágeno, administrando a un sujeto colágeno y HSP-65, respectivamente. Una compañía ubicada en Boston llamada Autoinmune realizó varios experimentos humanos para prevenir la diabetes, esclerosis múltiple, artritis reumatoide y uveitis. Los resultados de los experimentos humanos han sido menos impresionantes que los no humanos, al menos ha habido un éxito en la prevención de la artritis.

Componentes antigénicos A. Lipoproteína de baja densidad oxidada

LDL es un complejo de proteínas de alto peso molecular, incluyendo apoliproteína B, lípidos neutros y polares y antioxidantes lipofílicos (vitamina E y \beta carotenos). La oxidación-modificación de LDL con la resultante formación de neoepítopos dentro de la molécula nativa (dentro del dominio Apo B) conduce a su reconocimiento por el receptor del limpiador de macrófagos. Es posible que todos estos componentes celulares en la placa ateroesclerótica (es decir, células endoteliales, macrófagos, células de la musculatura lisa, linfocitos) sean capaces de aumentar la peroxidación lipídica con la producción de varios grados de oxidación de LDL, no se ha determinado todavía la contribución relativa de cada uno. Independientemente de los papeles precisos de estas células parece que el balance entre las fuerzas oxidante y antioxidante al nivel de las paredes de los vasos determina el grado de la exposición a LDL oxidadas con los efectos nocivos siguientes. Las LDL oxidadas tienen derivados activos como lisofosfatidilcolina (LPC) y, a pesar de tener un peso molecular bajo, todavía conservan algunas de estas actividades biológicas.

La lisofosfatidilcolina (LPC) se expresa en las placas ateroescleróticas humanas. Es una sustancia biológica activa que puede inducir las primeras etapas de la aterogénesis. Ciertamente es más potente que las LDL oxidadas.

La influencia in-vivo e in-vitro en conjunto de las LDL oxidadas y sus sub-productos en el desarrollo de la placa están más allá del alcance de la presente invención, aunque es importante indicar la relación conocida entre las LDL oxidadas y el sistema inmune.

Se sabe que las LDL oxidadas son quimiotácticas para los linfocitos T y los monocitos. Las LDL oxidadas y sus subproductos se conocen por inducir la expresión de factores como factor 1 quimiotáctico del monocito, secreción del factor estimulador de colonias y propiedades activadoras de plaquetas, todos estos son estimulantes de crecimiento potentes.

La implicación activa de la respuesta inmune celular en la ateroesclerosis ha sido verificada recientemente por Stemme S, Faber B, Holm J. Linfocitos T a partir de placas ateroescleróticas humanas reconocen lipoproteínas de baja densidad oxidadas. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 3893-97, que aislaron los CD4^{+} en placas clones que responden a las LDL oxidadas como estímulo. Los clones correspondientes a las LDL oxidadas (4 fuera de 27) produjeron principalmente interferón \gamma mejor que IL-4. Queda ver si los clones de los linfocitos T anteriores representan el mero contacto del sistema inmune celular con el inmunogen fuerte estimulante (LDL oxidada) o esta reacción proporciona medios para combatir el proceso ateroesclerótico indolente aparentemente.

Los datos relativos a la implicación de los mecanismos hummorales y sus medios son mucho más controvertidos. Varios informes asociaron niveles incrementados de anticuerpos contra LDL oxidadas con la progresión de la ateroesclerosis (expresado por el grado de estenosis carotide, gravedad de la enfermedad vascular periférica etc.). Sin embargo, estos datos no se reprodujeron por otros científicos, a lo mejor debido a la pérdida de estandarización con respecto a los experimentos usados para la determinación de los anticuerpos contra LDL. En cualquier caso parece haber consenso en cuanto a la presencia de anticuerpos de LDL oxidadas en forma de inmunocomplejos en la placa de ateroeslerosis, aunque no se estableció el verdadero significado de este hallazgo.

Se hipotetizó que los anticuerpos de las LDL oxidadas jugaban un papel activo en el metabolismo de las lipoproteínas. Así, se conoce que los inmunocomplejos de las LDL oxidadas y sus correspondientes anticuerpos son captados más eficientemente por los macrófagos en suspensión comparado con las LDL oxidadas. No se han deducido conclusiones de este hallazgo consistente en la patogénesis y ateroesclerosis y aún existe la pregunta de si la captación acelerada de las LDL oxidadas es beneficiosa o perjudicial.

Datos importantes como el significado del sistema inmune humoral en la aterogénesis vienen de modelos animales. Se encontró que la hiperinmunización de los conejos deficientes en receptores de las LDL con LDL oxidadas homólogas, resultó en la producción de altos niveles de anticuerpos de LDL anti-oxidadas y se asoció con una reducción significante en la amplitud de las lesiones ateroescleróticas comparadas con un grupo control hiperinmunizado con un tampón fosfato salino (PBS). Una disminución en la formación de la placa se logró por inmunización de ratones con liposomas ricos en colesterol con la producción concomitante de anticuerpos anti-colesterol, todo este efecto se acompañó por una reducción del 35% en los niveles de colesterol de las lipoproteínas de baja densidad. Los inventores presentes demostraron que en ratones knock out apoE, las inmunizaciones repetidas con LDL oxidadas homólogas daban lugar a la producción de anticuerpos LDL anti-oxidadas y a una ateroesclerosis reducida.

B. Proteína de choque térmico (HSP) 60/65

Un componente antigénico principal adicional para la iniciación y perpetuación de la lesión inflamatoria culminando en una ateroesclerosis mejorada es la proteína de choque térmico 60 Kd. Esta proteína mitocondrial es un miembro de la familia HSP que está constituida por 24 proteínas que muestra altos niveles de secuencias homólogas entre especies diferentes. Estas proteínas, como su nombre implica están sobre-reguladas en respuesta a varias situaciones de estrés incluyendo la exposición a radicales libres, calor, estrés por cizalladura mecánica, infecciones, citocinas. La importancia teleológica de la HSP proviene de sus papeles protectores contra el despliegue de las proteínas celulares precipitado por estímulos de estrés. Este papel condujo a su designación como ``chaperonas'' moleculares. Sin embargo, estos efectos favorables aparentemente de HSP puede ser una espada de doble filo, desde que la sobreexpresión puede, bajo ciertas condiciones promover una reacción autoinmune con el resultante daño del tejido. Los mecanismos responsables para el daño mediado inmune HSP no se saben completamente y se presume que los neoepítopos crípticos están expuestos al sistema inmune sin considerar a éstos como propios siguiendo su desregulación. Alternativamente, se sugirió que existe una reacción cruzada entre la HSP extraña y la HSP propia introducidas después de infecciones que actúan como señal de un ataque inmune contra sus propias estructuras.

HSP 60 es una proteína distintiva que constituye una ``clase'' separada en la familia HSP mencionada anteriormente, junto con la HSP 65, abasteciendo un ámbito diferenciado para plegar un subconjunto de proteínas in-vivo.

Existe una similitud entre la HSP60 mamífera y HSP65 bacteriana que permite el reconocimiento cruzado por efectores inmunes del huésped.

Se suministra la ayuda para la implicación de HSP en la autoinmunidad por estudios que documentan autoanticuerpos mejorados así como respuesta celular a la HSP 60/65 en varias enfermedades autoinmunes.

La unión entre la HSP65 y la ateroesclerosis se alcanzó inicialmente después de un trabajo pionero conducido por el grupo de George Wick a principio de los 1990s (Xu Q, Dietrich H, Steiner HJ& al. Induction of atheroesclerosis in normocholesterolemic mice rabbits by immunization with heat shock protein 65. Artherioesclerosis thrombosis 1992; 12: 789-799). Encontraron que los conejos inmunizados con antígenos diferentes desarrollaron ateroesclerosis, suministrando la preparación usada para la inmunización que contenía el adyuvante de Freund completo (CFA). Hasta que el constituyente principal de CFA es el mycobacterium tuberculosis matado por calor el componente principal del cual es el HSP-65, razonaron que la respuesta inmune hacia este componente condujo al desarrollo de la ateroesclerosis. Esta hipótesis se confirmó cuando los animales subsiguientemente se inmunizaron sólo con HSP-65 y exhibieron una ateroesclerosis pronunciada. Se debe acentuar que no se notaron diferencias entre los grupos respecto al perfil de la lipoproteína. El trabajo adicional conducido después por el grupo de Wick reveló que los linfocitos T extraídos de las lesiones de los conejos inducidos a desarrollar ateroesclerosis se encontró que sobreexpresaban HSP-65 en comparación con la sangre periférica a partir de los animales respectivos así atestiguado para una reacción inmune localizada y restringida en los alrededores del vaso arterial estresado. Los inventores presentes han recalcado los hallazgos de Wick, mostrando que inmunización HSP-65 (o Mycobacterium tuberculosis) de ratones ingenuos resultaron en la formación acelerada de bandas de grasa.

Estos hallazgos fueron más sostenidos cuando la implicación del mecanismo inmune humoral en la respuesta a la HSP65 se observó en pacientes inflingidos con ateroesclerosis. Por lo tanto, una correlación se estableció entre altos niveles de anticuerpos anti-HSP65 y del ancho de la carótida estimado sonográficamente en un cribado de individuos sanos.

Estos hallazgos se consolidaron recientemente por ensayos in-vitro designados para evaluar la influencia de la HSP-60/65 en cultivos de células endoteliales. Consecuentemente, se mostró que la incubación de las células endoteliales con HSP-65 induce su adhesividad a los monocitos y granulocitos que son dependientes de concentración y tiempo. Además, se demostró que este efecto está mediado por la sobreexpresión en células endoteliales de E-selectina (C62E) E-selectina, molécula-1 de adhesión a la célula vascular (CD106) y molécula-1 de adhesión intracelular (CD54).

Fosfolípidos y \beta2GPI como componentes autoantígenicos en la ateroesclerosis

Los inventores presentes encontraron que la producción de anticardiolipina en los ratones knockout del receptor LDL por inmunización con anticuerpos anticardiolipina humanos (aCL) resultó en la ateroesclerosis temprana acelerada. Esta observación es consistente con los datos circunstanciales que se acumularon respecto al papel proaterogénico posible de los anticuerpos anticardiolipina en ateroesclerosis.

\beta2GPI es una molécula que se confirmó como el blanco de aCL a partir de pacientes con enfermedades autoinmunes. Anticuerpos anti-\beta2GPI se demostró que daban lugar a APS experimental y activa las células endoteliales y plaquetas. Los inventores presentes mostraron que ratones deficientes de LDL-RD transgénicos inmunizados con \beta2GPI desarrollan anticuerpos respectivos y que la formación de bandas de grasa tempranas estaba potenciada por la acumulación local de linfocitos CD4^{+}. Así, \beta2GPI puede servir como blanco antigénico de la respuesta autoinmune en la ateroesclerosis.

En ambos modelos de enfermedades animales y humanas se encontró una correlación entre el título de anticuerpos contra los autoantígenos HSP 60-65 y LDL oxidadas y el nivel de ateroesclerosis. Las LDL oxidadas se producen en el cuerpo por la oxidación de LDLs nativas y se consideran un factor nocivo de ateroesclerosis. En respuesta a dicha toxina, se producen anticuerpos anti-LDL oxidados. La \beta2GPI es una proteína natural en la sangre humana que juega un papel en el proceso de coagulación y HSP65 es el resultado de varios estímulos de estrés.

En experimentos realizados con ratones que tienen una predisposición para el desarrollo de ateroesclerosis (ratones knock-out LDL-R), se demostró una reducción del treinta por ciento en la condición ateroesclerótica por administrar a los ratones dosis bajas de LDL oxidadas.

Además, el hecho de que el sistema inmune esté implicado en la inducción de ateroesclerosis, como la implicación clara del sistema inmune (linfocitos y autoanticuerpos), apunta a la capacidad para tratar la enfermedad induciendo una tolerancia oral con autoantígenos, por ejemplo., LDL oxidada, HSP60/65 y \beta2GPI.

La patente estadounidense No. 5.348.945 revela un método para combatir la mortalidad en una célula o tejido bajo estrés. El método comprende el contacto de la (HSP70) proteína 70 de choque térmico con la célula o tejido en una cantidad efectiva para potenciar la supervivencia de la célula o tejido. El método puede emplearse en la batalla contra la ateroesclerosis, restenosis tras angioplastia y daño nervioso en sujetos animales o humanos en necesidad de tal tratamiento. Se revela también una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de HSP70 en una formulación aceptable farmacéuticamente.

Aunque HSP70 Y HSP60 pertenecen a una familia de 24 proteínas de choque térmico altamente conservadas, representan dos características distintas completamente. Su mecanismo, por ejemplo, no aparece actuar conjuntamente en controlar la protección del estímulo estresante.

HSP70 se patentó inicialmente por su inducción pronunciada durante la exposición a calor y otras afrentas más peligrosas como precondición isquémica. Ciertamente la sobreexpresión de HSP70 en animales transgénicos se asocia con la protección de peligros más graves.

Por consiguiente, la Patente estadounidense No. 5.348.945, no enseña o sugiere el tema de la invención presente.

La composición que induce tolerancia oral e inmunológica de la presente invención se define en la parte característica de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 4 y el uso de composiciones que inducen tolerancia oral e inmunológica administrados oralmente se define en la parte característica de las reivindicaciones 14, 15, 16 y 17.

Así, de acuerdo con la presente invención ahora se proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento de ateroesclerosis por administración oral de las mismas, comprendiendo un compuesto activo seleccionado del grupo lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de las mismas y mezclas de las mismas, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

En un descubrimiento preferido de la presente invención se proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento del ataque al corazón mediante la administración oral de las mismas, comprendiendo un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con vehículos aceptables farmacéuticamente para la administración oral.

En otra realización preferida de la presente invención se proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento de angioplastia - restenosis mediante la administración oral de las mismas, que comprende un compuesto activo seleccionado a partir del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL oxidada), proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1, derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con vehículos aceptables farmacéuticamente para la administración oral.

En otra realización preferida de la presente invención se proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento del derrame cerebral mediante administración oral de las mismas, que contiene un compuesto activo seleccionado del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL oxidada), proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

En realizaciones aún más preferidas de la presente invención se proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica, donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad modificada, o donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), o donde dicho compuesto activo es un derivado activo de la lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), o donde dicho compuesto activo es una proteína 60/65 (HSP 60/65) de choque térmico, o donde dicho compuesto activo es la beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1).

La presente invención proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica, donde dicho derivado activo es la lisofosfatidilcolina (LPC).

La presente invención también proporciona una composición que induce tolerancia oral e inmunológica, donde dicha LDL es una malondialdehído LDL (MDA-LDL).

En otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de ateroesclerosis en un sujeto, composición que induce tolerancia oral inmunológica un compuesto activo seleccionado a partir del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

En una realización preferida se proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de un ataque al corazón en un sujeto, y de una composición que induce tolerancia oral inmunológica que contiene un compuesto activo seleccionado del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

En una realización más preferida se proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de angioplastia tras restenosis en un sujeto, de una composición que induce tolerancia oral inmunológica que contiene un compuesto activo seleccionado del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), proteína 60/65 (HSP 60/65) de choque térmico, beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de las mismas, en combinación con un transportador aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

En otra realización aún más preferida se proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de derrame cerebral en un sujeto, de una composición que induce tolerancia oral inmunológica que contiene un compuesto activo seleccionado del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

En otras realizaciones de la presente invención se proporciona el uso, para la fabricación del medicamento, para la prevención y/o tratamiento de ateroesclerosis en un sujeto, donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad modificada, o donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), o donde dicho compuesto activo es un derivada activo de una lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL ox), o donde dicho compuesto activo es una proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), o donde dicho derivado activo es beta_{2}-glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1).

La presente invención además proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la prevención, y/o tratamiento de un medicamento para la ateroesclerosis en un sujeto, donde dicho derivado activo es lisofosfatidil colina (LPC).

La presente invención además proporciona el uso, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento, un medicamento para la ateroesclerosis en un sujeto, donde dicha LDL es malondialdehído LDL (MDA-LDL).

El término ``derivado funcional'' tal como se usa aquí se entiende que incluye proteínas marcadas, proteínas conjugadas, proteínas quiméricas fusionadas y receptores purificados en forma soluble, así como fragmentos, delecciones, y sustituciones conservativas de dichas proteínas.

La existencia de una respuesta inmune contra LDL ox en ateroesclerosis y correlación entre la reacción de LDL ox y la gravedad de la enfermedad, en combinación con la evidencia que una vacuna activa de LDL ox en ratones y conejos puede prevenir el desarrollo de la ateroesclerosis ha conducido a los presentes inventores a concluir que la inducción de la tolerancia inmune por administración de LDL ox a sujetos humanos puede resultar en una proporción reducida de la progresión de la ateroesclerosis. Debe mencionarse que los mecanismos de inducir tolerancia inmune por administración oral son posiblemente mediados vía una estimulación y producción de citocina TGFB y el desarrollo de los linfocitos-T supresores no específicos.

La tolerancia oral de la presente invención puede ampliarse para proporcionar un efecto de supresión bystandard: es decir, bloqueando otras respuestas auto-inmunes (no antígeno específico) (contra uno mismo) que ocurren en la proximidad de la placa ateroesclerótica y contribuyendo a su progresión.

Debe notarse que la ambición de la presente invención es inducir la tolerancia o paralizar la respuesta inmune hacia la HSP65, más bien que para alcanzar una mera elevación en el suero para ayudar al despliegue de la proteína

Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención combina tolerancia oral, LDL ox y ateroesclerosis, que es una enfermedad causada en parte por factores inmunes. LDL ox se ha descrito que induce una reacción inmune en ratones y conejos (en contraste para inducir tolerancia inmune) de los antígenos LDL ox y una mejora en la condición de la ateroesclerosis. En estos modelos de animales LDL ox no se ha descrito que se experimentara con administración oral y nunca sugirieron tolerancia oral.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral de acuerdo con la presente invención se prepararon por métodos conocidos per se y la administración de la misma es por métodos conocidos de administración oral.

Una cantidad efectiva para tratar los trastornos aquí descritos depende de los factores usuales como de la naturaleza y gravedad de la misma y el peso del mamífero.

Para la administración oral, se prefiere que el ingrediente activo se administre en la forma de una composición unidosis.

Tales composiciones se preparan por mezcla y se adaptaron adecuadamente para la administración oral en forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones líquidas orales, polvos, gránulos, etc.

Comprimidos y cápsulas para la administración oral se presentan usualmente en una dosis unitaria, y contienen excipientes convencionales tales como aglutinantes, excipientes, diluyentes, agentes comprimibles, disgregantes, colorantes, aromatizantes, y agentes humectantes. Los comprimidos pueden estar recubiertos de acuerdo con métodos bien conocidos en el campo.

Excipientes adecuados para su uso incluyen celulosa, manitol, lactosa y otros agentes similares. Disgregantes adecuados incluyen almidón, polivinilpirrolidina y derivados de almidón como glicolato de almidón sódico. Lubricantes adecuados incluyen, por ejemplo, esterato magnésico. Agentes humectantes aceptables farmacéuticamente incluyen laurilsulfato sódico.

Estas composiciones orales sólidas pueden prepararse por métodos convencionales de mezclado, llenado o compresión. Operaciones de mezclado repetidas pueden usarse para distribuir el agente activo a través de estas composiciones empleando cantidades grandes de excipientes. Tales operaciones, son, naturalmente, convencionales en la materia.

Preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones oleosas o acuosas, soluciones, emulsiones, jarabes, o elixires, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitución con agua o con otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes suspensores, por ejemplo, sorbitol, jarabe, metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitano, o acacia; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, esteres de aceites como éster de glicerina, propilenglicol, o alcohol etílico, conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico, y si se desea aromatizantes convencionales o agentes colorantes.

Otras formulaciones orales también incluyen formulaciones de liberación sostenida convencionales como comprimidos o gránulos con recubrimiento entérico.

Descripción de realizaciones preferidas

Mientras que la invención será ahora descrita en relación con ciertas realizaciones preferidas en los siguientes ejemplos de modo que aspectos de la misma podrán ser entendidos completamente y apreciados, no se pretende limitar la invención a estas realizaciones en particular. Por el contrario, se pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes tal como pueden incluirse en el alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexadas. Así, los siguientes ejemplos que incluyen realizaciones preferidas servirán par ilustrar la práctica de esta invención, se entiende que los detalles mostrados están a modo de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención solamente y se presentan para proporcionar lo que se cree es más útil y una descripción fácilmente comprensible de procedimientos de formulación, así como principios y aspectos conceptuales de la invención.

Materiales y métodos Animales

Ratones LDL-RD de 12 semanas (híbridos entre las cepas C57BL/6J y 129Sv) se crearon por recombinación homóloga. Los ratones se adquirieron de los Laboratorios The Jackson (Bar-Harbor ME). Los ratones LDL-RD se usaron desde que tenían altos niveles de colesterol en la dieta alimentaria (que son similares a los valores humanos) y desarrollan ateroesclerosis significativa sólo cuando se alimentaron con una dieta rica en grasas. Los ratones LDL-RD también se alimentaron con una dieta alimentaria normal que contiene un 4,5% de grasa por peso (0,02% de colesterol) o una dieta aterogénica (Harlan, Teklad Premier Laboratory Diets, Madison, WI) que contiene: 1,25% de colesterol, 7,5% de caseína y 0,5% (peso) de colato de sodio. Los ratones se mantuvieron en ciclos de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad y pudieron acceder a comida y agua ad libitum.

Aislamiento de LDL, oxidación y caracterización

La sangre para el aislamiento de las lipoproteínas se recogió en EDTA (1 mg/ml) tras 12 horas de ayuno. LDL (densidad= 1,019-1,063 g/l) se aisló del plasma después del ajustamiento de densidad con Kbr-, por ultracentrifugación preparativa a 50,000 rpm/min durante 22 horas, usando el rotor de tipo 50. Las preparaciones de LDL se lavaron por ultracentrifugación, dializadas contra un pH 7,4, 0,15 mol/L EDTA, pasado a través de un filtro Acrodisc (tamaño de poro

\hbox{0,22 um}

) para eliminar los agregados, y se guardaron bajo nitrógeno en la oscuridad.

La oxidación LDL se realizó por incubación de LDL pre-dializadas (1 mg de proteína/ml en PBS libre de EDTA) con sulfato de cobre (10\muM) durante 24 horas a 37ºC. Se confirmó la oxidación de lipoproteínas por análisis de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) que mide los equivalente a malondialdehído (MDA) mediante la prueba de peroxidación lipídica y también por análisis del contenido en dienos conjugados en la lipoproteína.

Determinación de los títulos de anticuerpos de LDL anti-oxidadas

Se realizó la preparación de LDL oxidada con cobre y nativa. Placas de poliestireno de 96 pocillos (Nunc Maxisorp, Dinamarca) se recubrieron cada una con LDL Ox, LDL nativa (a una concentración de

\hbox{5  \mu g/ml}

en PBS) o PBS toda la noche a 4ºC. Después de lavar cuatro veces con PBS que contiene un 0,05% de Tween y 0,001% de aprotinina (Sigma, USA) las placas se bloquearon con albumina de suero bovino al 2% (BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las fracciones de suero se diluyen a 1:50 en PBS 0,05% Tween 0,2% BSA. Después de una incubación toda la noche adicional las placas se lavaron y la IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson InmunoResearch laboratory Inc., USA) se añadió y diluyó a 1:10.000 en PBS 0,05% Tween-0,2% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado amplio, se añadió 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato (Sigma) en 50 mM de un tampón de carbonato que contiene 1 mM MgCl_{2} pH 9,8 como sustrato. La reacción se paró después de 30 minutos añadiendo 1M de NaOH. El color se leyó a una longitud de onda de 405 nm en un lector ELISA Titertek (S.L.T. Laboratory Instruments, Vienna, Austria) y los resultados se expresaron como D.O. a 405 nm. El título de anticuerpos LDL anti-oxidados se calculó sustrayendo el valor obtenido de la unión a la LDL nativa o de la unión a LDL Ox.

Los ensayos de inhibición se realizaron para confirmar la especificidad de los anticuerpos LDL anti-oxidadas y comprobar una posible reacción cruzada con HSP-un inmunogen importante en ateroesclerosis. Se determinó la concentración de suero de ratón inmunizado HSP-65 que daba la mitad de la unión máxima a LDL oxidadas y se aplicaron inhibidores diferentes (es decir, HSP-65, LDL oxidadas, albumina de suero bovino) en concentraciones crecientes.

Detección de anticuerpos anti-HSP-65

Se cubrieron con HSP-65 recombinante (1\mug/ml) en una solución tampón de fosfatos (PBS, pH 7,2) placas ELISA de 96 pocillos de fondo plano (Nunc Maxisorp, Dinamarca) por incubación toda la noche a 4ºC. Después de lavados con 0,02% de PBS Tween al 0,2% y bloqueo con 1% BSA en PBS, se añadió suero a diluciones diferentes (1:50, 1:100, 1:200, en PBS) se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió IgG anti-ratón de conejo conjugada con peroxidasa (Dako Ltd, High Wycombe, UK) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente seguido de 4 lavados con PBS/Tween. Finalmente, se añadió 100 \mul de un tampón de fosfato citrato (0,1 M, pH 4,2) que contiene 0,53 mg/ml del ácido 2,2-azino-bis-3-etilbenztiazolina-6-sulfónico (ABTS; Sigma), y la absorbancia se midió después de 30 minutos a 490 nm en un lector ELISA Titertek.

Detección de los anticuerpos anti-fosfolípidos

Se realizó un ELISA modificada para determinar la reactividad de los anticuerpos humanos y de ratón a PL. Las placas microtituladas (Nunc, Maxisorp, Dinamarca) se cubrieron con un PL aniónico [cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), fosfatidinilinositol (PI)] y fosfatidilcolina (PC), todas de Sigma Chemicals Co, St.Louis, Mo, a una concentración de 50 \mug/mol y se disolvieron en etanol, excepto PC (cloroformo-metanol, 1:3). Las placas se secaron al vacío y se bloquearon con TBS que contiene un 0,5% de gelatina. Las placas se lavaron luego tres veces con TBS y se añadieron concentraciones diferentes de preparaciones de ratón a los pocillos tratados con \beta2GPI humana (5ug/ml durante 30 minutos) o 0,1% de gelatina/TBS sólo. La unión de los anticuerpos se detectó con fosfatasa alcalina conjugada anti-ratón de cabra y la adición del sustrato (p-nitro-fenilfosfato). Se expresaron los resultados como absorbancia a 405 nm (OD_{405}).

Detección de los anticuerpos anti-\beta2GPI

Se incubó un \mug/ml \beta2GPI o un DM diferente toda la noche en un tampón de bicarbonato de 50 mM, pH 9,6 a 4ºC en placas de poliestireno de 96 pocillos (Nunc). Después de 3 lavados con TBS, se realizó el bloqueo con 0,5 % gelatina/TBS durante 2 horas (como para una ELISA anti-PL). Las placas se lavaron luego tres veces y se añadió suero murino (diluido en 1:100 en gelatina/TBS) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de 3 lavados, la IgG anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina respectivamente diluida en 0,1% gelatina/TBS (1:10.000) se añadió durante 2 horas. Después de 3 lavados adicionales, se añadió el sustrato p-nitrofenilfosfato en un tampón de carbonato sódico a pH 9,8 y se leyó la absorbancia a 405 nm.

Ensayos de proliferación de los linfocitos del bazo

Se extrajeron los bazos de los ratones bajo sacrificio, y se aislaron los linfocitos. Se incubaron 1x10^{6} células por ml por triplicado durante 72 horas en 0,2 ml de un medio de cultivo en pocillos microtitulados en presencia de concentraciones diferentes de HSP-65, LDL-Ox, \beta2GPI o ovalbúmina. Se midió la proliferación se midió por la incorporación de timidina [^{3}H] en DNA durante las 12 horas finales de la incubación. Los resultaron se computaron como índice de estimulación (S.I); la proporción del cpm significativo del antígeno sobre el cpm de trasfondo del medio obtenido en ausencia del antígeno.

Determinación del nivel de citocinas

Se extrajeron las células del bazo después del sacrificio y se incubaron linfocitos mononucleares del bazo durante 3 días con LDL ox, HSP-65 o ovalbúmina seguidamente se recogió el sobrenadante. Se determinó el perfil de citocina (IL-4, IL-10, IFN-\gamma, y TGF-\beta) en el cultivo sobrenadante de los linfocitos mononucleares del bazo.

Ejemplos Ejemplo 1

Los ratones usados en este experimento se llamaron ratones (LDL-RD) deficientes del receptor LDL. Estos animales tienen una mutación genética que causa un defecto en el receptor de las LDL en todas las células del cuerpo. Este receptor es responsable de evacuar y eliminar a la circulación, el colesterol ``malo'' (LDL), y cuando éste es deficiente los ratones llegan a ser hiperlipidémicos y desarrollan ateroesclerosis cuando se les alimenta con una dieta rica en grasa durante 3-5 semanas.

Se usaron tres grupos de ratones (15 ratones LDL-RD en cada grupo). La alimentación se realizó con un dispositivo especial (cánula) diseñada para ser introducida en el esófago y asegurar que las sustancias alimenticias alcanzan la mayoría el estómago.

Grupo 1

Los ratones se alimentaron con 5 dosis de 1 mg de LDL Ox humana disuelta en PBS, cada día. Al final de la última dosis, los ratones se pusieron en una dieta rica en grasa y se sacrificaron después de 3 ó 5 semanas a dieta.

Grupo 2

Los ratones se alimentaron con 5 dosis de 1 mg de una proteína control (ovalbúmina) en PBS y luego se alimentaron con una dieta especial durante 3 ó 5 semanas.

Grupo 3

Los ratones no se alimentaron antes de iniciar la dieta.

Los ratones se evaluaron, tras sacrificio para ver la aparición de lesiones ateroescleróticas, para ver el valor de colesterol en suero y los niveles de anticuerpo de las LDL ox.

Resultados

Todos los ratones tuvieron un peso similar antes de, y a la terminación del estudio. Se encontró que los ratones alimentados con LDL Ox desarrollaban menos ateroesclerosis (30% menos).

Se mostró en los estudios presentes el efecto beneficioso de la tolerancia oral con LDL Ox en la inducción de la ateroesclerosis en los ratones. Hay muchos estudios en los que los resultados apuntan a la efectividad de la tolerancia oral en varias enfermedades autoinmunes, como colágeno en artritis adyuvante (análoga a la artritis reumatoide), en diabetis mellitus, en uveitis, en EAE (análogo a la esclerosis múltiple). En los estudios mencionados anteriormente se realizaron pruebas humanas. Recientemente se notó un efecto remarcable cuando los pacientes con artritis reumatoide se les daba colágeno II vía oral (tolerancia oral). El efecto comparable entre los estudios de ratones y humanos en varias enfermedades autoinmunes apuntan a éxitos extrapolados en humanos. Debe destacarse que este tratamiento no tiene efectos secundarios.

Ejemplo 2 Supresión de ateroesclerosis inducida por una dieta rica en grasa en ratones deficientes en receptores LDL alimentados con LDL Ox humana

Se alimentaron los ratones LDL-RD (n=15) con 5 dosis (cada día) de LDL Ox humana en tres concentraciones diferentes (1mg/dosis, 100 \mug/dosis y 1mg/dosis. Ratones LDL-RD adicionales (n=15 por grupo) se alimentaron con antígeno control (ovalbúmina a dosis similares).

Un día después de la última alimentación, todos los ratones se cambiaron a una dieta rica en grasas ``paigen'' durante 5 semanas.

Al final del experimento, se evaluó el suero de todos los ratones para la presencia de LDL anti-Ox, anti-HSP65 y anticuerpos antifosfolipídicos y se realizó un perfil lipídico (colesterol total, LDL, VLDL, HDL y triglicéridos).

Los corazones de todos los ratones se extrajeron al final del estudio y se congelaron a -70ºC hasta su uso (ver materiales y métodos) se realizaron estudios inmunohistoquímicos en las secciones del criostato usando anticuerpos monoclonales para los macrófagos CD3, CD4, CD8, células de la musculatura lisa y marcadores de activación de linfocitos.

Un protocolo similar de alimentación se llevó a cabo usando LPC como derivado activo de LDL ox.

Ejemplo 3 Supresión de ateroesclerosis inducida por Mycobacterium tuberculosis (MT) por alimentación con HSP-65

Los inventores presentes observaron que una vez inmunizados los ratones LDL-RD, con MT desarrollaban aterosclerosis temprana acentuada.

Los ratones LDL-RD (n=15) se alimentaron con 5 dosis (cada día) de HSP65 recombinante en tres concentraciones diferentes (100 mg/dosis, 10 \mug/dosis y 1\mug/dosis). Ratones LDL-RD adicionales (n=15 por grupo) se alimentaron con antígeno control (ovalbúmina a dosis similares).

Un día después de la última alimentación, todos los ratones fueron sometidos a una inmunización con una suspensión matada por calor de MT (10 mg/ml, 100 \mug/ratón) emulsionada en adyuvante de Freund incompleto. Los ratones se sacrificaron 12 semanas después de la inmunización con MT.

Al final del experimento, el suero de todos los ratones se evaluó para ver la presencia de anticuerpos anti-HSP65, y se realizó un perfil lipídico (colesterol total, LDL, VLDL, HDL y triglicéridos).

Se evaluaron las respuestas proliferativas de las células del nódulo linfático drenadas de HSP65 a partir de ratones tolerados HSP65 y de ratones alimentados control.

Los niveles de citocinas (IL-4, IFN-\gamma, IL-10 y TGF-\beta) se evaluaron en el sobrenadante recogido del medio en que los linfocitos se indujeron con HSP65 in-vitro.

Los corazones de todos los ratones se extrajeron y congelaron a -70º C. Para determinar la amplitud de la ateroesclerosis se realizaron secciones de criostato (5 \mum por sección). Las secciones relevantes (del área del seno aórtico) se tiñeron con aceite rojo O y la amplitud de la ateroesclerosis se determinó por contaje del área, mediante una cuadrícula.

Se realizaron estudios inmunohistoquímicos en las secciones de criostato usando anticuerpos monoclonales para CD3, CD4, CD8, macrófagos, células de la musculatura lisa y marcadores de activación linfocitaria.

Ejemplo 4 Supresión de ateroesclerosis por alimentación con \beta2GPI humana

El procedimiento es similar al empleado para LDL Ox y HSP-65 y se basó en la observación que la inmunización con \beta2GPI induce aterogénesis temprana.

Valoración de la amplitud de la ateroesclerosis

La cuantificación de las lesiones de la banda grasa de la ateroesclerosis se realizó por calculo del tamaño de la lesión en el seno aórtico (con unas pocas modificaciones). Brevemente, se extrajeron el corazón y la sección superior de la aorta de los animales y se limpió la grasa periférica cuidadosamente. La sección superior se puso en medio OCT y se congeló. Se cogieron todas las otras secciones (10\muM grosor) a través del seno aórtico (400\mum) para el análisis. La porción distal del seno aórtico se reconoció por las tres cúspides de la válvula que son la unión de la aorta al corazón. Se evaluaron las lesiones para ver las lesiones de la banda de grasa tras tinción con aceite rojo O. Las áreas lesionadas por secciones se contaron usando una cuadrícula por un observador desconocido con el espécimen ensayado.

El contenido de ateroesclerosis se evaluó a nivel del seno de la aórtico. Se realizó el procesamiento y tinción del tejido. El área de lesión se cuantificó por el método modificado de Rubin EM, Kraus RM, Sprangler EA & al. (Inhibition of early atherogenesis in transgenic mice by human apoliprotein Al. Nature 1991; 353: 265-267).

Inmunohistoquímica de las lesiones ateroescleróticas

mAbs: Los anticuerpos monoclonales de rata H129,19 (L3T4)-anti-ratón CD4^{+} y S3-6,7 (Ly-2)-anti-ratón CD8a se obtuvieron de PharMingen (San Diego, CA, USA); los macrófagos MCA 497 (F4/80)-anti-ratón se obtuvieron de Serotec (Oxford, UK).

Se realizó la tinción inmunohistoquímica para CD4, CD8 y macrófagos en secciones congeladas de grosor de 5 \mum del seno aórtico. Se fijaron las secciones durante 4 minutos en metanol a -20ºC seguido por 10 minutos de incubación con etanol a -20ºC. Se bloquearon las secciones con suero de cabra no inmune durante 15 minutos a temperatura ambiente seguido por incubación con reactivo bloqueante CAS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguidamente, se añadieron los CD4/CD8 anti-ratón monoclonal de rata durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados, se añadieron los anticuerpos IgG anti-rata de conejo biotinilados de afinidad purificada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavados, las secciones se incubaron con 0,3% de H_{2}O_{2} seguido de aclarados adicionales e incubación con estreptavidina-peroxidasa conjugada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de los lavados, las secciones se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbonasol (AEC) sutrato (Dako) durante 15 minutos. Las secciones son contrateñidas con hematoxilina. Las secciones del bazo se usaron como control positivo. La tinción en ausencia de un primer o segundo anticuerpo se usó como control negativo.

Experimentos de transferencia adoptiva

Linfocitos-T (cualquier célula CD4 o CD8) se aislará de los ratones con tolerancia o sin tolerancia en cada uno de los estudios y transferidos a los compañeros LDL-RD que se cambiaran a una dieta aterogénica durante 6 semanas. Al final de los experimentos los corazones se cogerán para la evaluación de ateroesclerosis e inmunohistoquímica.

Será evidente a aquellos experimentados en la materia que la invención no se limita a los ejemplos ilustrativos anteriores y la presente invención puede estar realizada en otras formas específicas sin salir de los atributos esenciales de la misma, y por lo tanto se desea que las realizaciones presentes y ejemplos sean considerados en todos los aspectos como ilustrativos y no restrictivos, se hace referencia a las reivindicaciones anexadas, más bien que a la descripción anterior, y todos los cambios que vengan con el significado y alcance de equivalencia de las reivindicaciones se entiende que están abarcados dentro de la misma.

Claims (26)

1.Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento de la ateroesclerosis por administración oral de la misma, comprendiendo un compuesto activo seleccionado del grupo consistente en lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 \beta2GPI, derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

2. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento del ataque de corazón por la administración oral de la misma, que comprende un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste en lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta2GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración.

3. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento de la angioplastia - restenosis por la administración oral de la misma, que comprende un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste de lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta2GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

4. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica para la prevención y/o tratamiento del derrame cerebral por la administración oral de la misma, que comprende un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste en lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta2GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral.

5. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad modificada.

6. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL Ox).

7. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es un derivado activo de la lipoproteína de baja densidad (LDL Ox).

8. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es una proteína de choque térmico 60/65 (HSP 60/65).

9. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es un derivado activo de HSP 60/65.

10. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1).

11. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es un derivado activo de \beta_{2}GP-1.

12. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto activo es un derivado activo de LDL cuyo derivado activo es lisofosfatidilcolina (LPC).

13. Una composición que induce tolerancia oral e inmunológica de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha LDL es malondialdehído LDL (MDA-LDL).

14. El uso de una composición que induce tolerancia oral e inmunológica administrable oralmente que comprende un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste de lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lippoproteína de baja densidad oxidada, proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de ateroesclerosis en un sujeto.

15. Uso de una composición que induce tolerancia oral e inmunológica administrable oralmente que comprende un compuesto activo seleccionado del grupo que consiste en lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezcla de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de los ataques de corazón en un sujeto.

16. El uso de una composición que induce tolerancia oral e inmunológica administrable oralmente que comprende un compuesto activo seleccionado de un grupo que consiste de una lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezclas de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de la angioplastia de restenosis en un sujeto.

17. El uso de una composición que induce tolerancia oral e inmunológica administrable oralmente que comprende un compuesto activo seleccionado de un grupo que consiste de una lipoproteína de baja densidad modificada, (LDL Ox) lipoproteína de baja densidad oxidada, proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65), beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1), derivados funcionales de los mismos y mezcla de los mismos, en combinación con un vehículo aceptable farmacéuticamente para la administración oral para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del derrame cerebral en un sujeto.

18. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad modificada.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho compuesto activo es una lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL Ox).

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es un derivado activo de lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL Ox).

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es la proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65).

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es un derivado activo de la proteína 60/65 de choque térmico (HSP 60/65).

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1).

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es un derivado activo de la beta_{2-}glicoproteína-1 (\beta_{2}GP-1).

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 donde dicho compuesto activo es un derivado activo de LDL cuyo derivado activo es lisofosfatidilcolina (LPC).

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicha LDL es malondialdehido LDL (MDA-LDL).