ES2198403T3 - Celulas madre mesenquimaticas humanas derivadas de medula y anticuerpos monoclonales especificos para dichas celulas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION ES RELATIVA A UN PROCESO PARA PRODUCIR ANTICUERPOS MONOCLONICOS LOS CUALES SON ESPECIFICOS PARA CELULAS DE MESENQUIMA DERIVADAS DE MEDULA (P.EJ. CELULAS DE CAÑA DE MESENQUIMA), ASI COMO LOS ANTICUERPOS MONOCLONICOS QUE SE PRODUCEN POR EL PROCESO DE LA INVENCION. ADICIONALMENTE, LA PRESENTE INVENCION SE DIRIGE A LINEAS DE CELULA HIBRIDA O HIBRIDOMAS QUE SINTETIZAN Y SEGREGAN ESTOS ANTICUERPOS MONOESPECIFICOS, Y AL USO DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONICOS PARA DIAGNOSTICO Y/O PROPOSITOS TERAPEUTICOS.

Description

Células madre mesenquimáticas humanas derivadas de médula y anticuerpos monoclonales específicos para dichas células.

Antecedentes de la invención

La presente invención se dirige a un procedimiento para producir anticuerpos monoclonales que son específicos para células mesenquimáticas humanas derivadas de médula (es decir, células madre mesenquimáticas), así como a los anticuerpos monoclonales que se producen mediante el procedimiento de la invención. Además, la presente invención se dirige a las líneas celulares híbridas o hibridomas que sintetizan y secretan estos anticuerpos monoespecíficos y al uso de los anticuerpos monoclonales con fines de diagnóstico y/o terapéutico.

Las células mesenquimáticas derivadas de médula son los blastos pluripotenciales formadores hallados en el tejido óseo que se cree que son capaces de diferenciarse en cualquier tipo de tejido conjuntivo específico (es decir, los tejidos corporales que sostienen los elementos especializados; en particular, los tejidos conjuntivos adiposo, areolar, óseo, cartilaginoso, elástico y fibroso) dependiendo de diversas influencias ambientales. Aunque estas células normalmente están presentes con muy baja frecuencia en la médula ósea, los inventores de las presentes invenciones han descubierto un procedimiento para aislar, purificar y replicar estas células en cultivo en gran cantidad, por ejemplo, in vitro. Este descubrimiento es el contenido de una solicitud de patente de EEUU co-pendiente.

La presente invención trata de la generación de anticuerpos monoclonales específicos de determinantes de la superficie celular de las células mesenquimáticas humanas derivadas de médula. Ya que no se conocen actualmente marcadores para las células mesenquimáticas derivadas de médula tales como actividad enzimática, moléculas de la matriz extracelular o una morfología característica, los anticuerpos monoclonales de la presente invención (que reconocen determinantes de la superficie celular de las células mesenquimáticas derivadas de médula, pero no de otras células tales cono las células hematopoyéticas) proporcionan sondas monoespecíficas efectivas que pueden utilizarse para la identificación, cuantificación y/o purificación de células mesenquimáticas humanas derivadas de médula de muestras de tejido tales como médula ósea.

Aunque se ha descrito previamente la producción de anticuerpos monoclonales mediante la fusión de células esplénicas de ratones inmunizados y de células de mieloma cultivadas en un cultivo continuo, por ejemplo, Kohler y col, en Nature, Vol.256, pág.495-497 (1975), Kohler y col. en European Journal of Immunology, Vol. 6, pág. 511-519 (1976), Galfre y col. en Nature, Vol. 266, pág. 550-552 (1977) y en el texto Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, R. Kennett, T. McKearn, K. Bechtol, Eds. Plenum Press, NY y Londres, (1980) y las técnicas para la selección química de los hibridomas que surgen de dicha fusión y el subsecuente aislamiento de los clones celulares secretores de un único anticuerpo para la producción de anticuerpos monoclonales, también se conocen, no se han producido nunca líneas celulares capaces de sintetizar y secretar anticuerpos monoclonales que no sólo se unen selectivamente a células mesenquimáticas derivadas de médula y no a células hematopoyéticas y otras estrechamente relacionadas, sino que además diferencian selectivamente entre células madre mesenquimáticas derivadas de médula y de periostio. La capacidad de estos anticuerpos para unirse selectivamente a tipos específicos de células madre mesenquimáticas hacen de ellos unas sondas excelentes para la identificación, cuantificación, aislamiento y/o purificación de las células madre mesenquimáticas en muestras de médula, etc. Goshima y col. (Clin. Orthopedics and Related Research, 1991, Vol.262. 298-311) describe una población heterogénea aislada de células madre mesenquimáticas de médula de rata.

Resumen de la invención

La presente invención trata de un anticuerpo monoclonal que reconoce una célula madre mesenquimática humana que puede diferenciarse en células de más de un tipo de tejido conjuntivo; en la que el anticuerpo es el mismo que el producido por la línea celular de hibridoma SH2, depositada en la ATCC bajo el número de acceso HB 10743 o la línea celular de hibridoma SH3, depositada en la ATCC bajo el número de acceso HB 10744 o la línea celular de hibridoma SH4, depositada bajo el número de acceso de la ATCC HB 10745. Los anticuerpos reconocen un antígeno sobre la superficie de las células mesenquimáticas derivadas de médula, pero no reconocen un antígeno sobre las células hematopoyéticas. Además, la presente invención se dirige también a los hibridomas que sintetizan y secretan estos anticuerpos monoclonales, así como al proceso de recuperación de las células madre mesenquimáticas humanas y una población homogénea de células madre mesenquimáticas humanas aisladas mediante dicho proceso.

Además, un aspecto adicional de la presente invención se dirige a diversos procedimientos para usar las células madre mesenquimáticas humanas, al anticuerpo monoclonal dirigido contra estas células madre mesenquimáticas humanas y a la composición terapéutica que comprenda dichas células madre mesenquimáticas humanas.

En un aspecto más, la presente invención se dirige a una población homogénea aislada de células madre mesenquimáticas humanas así como a una composición que comprenda dichas células madre mesenquimáticas humanas.

Descripción de las figuras

Lo que sigue es una breve descripción de las figuras que se presentan con el propósito de ilustrar la invención y no con el propósito de limitar la misma.

La Figura 1 es una fotomicrografía de contraste de fase de un cultivo en monocapa de células de tipo fibroblasto derivadas de médula (100x);

La Figura 2 es una serie de fotomicrografías (tinción de Mallory Heidehain) de secciones histológicas de una composición que contiene los fibroblastos humanos de médula cultivados y cerámica, tras dos semanas de incubación en un ratón ``desnudo''; la Figura 2A muestra la formación de hueso nuevo (B) revistiendo de los poros del esqueleto de cerámica (G) (40x); la Figura 2B indica que el tejido fibroso (F) estaba presente en la mayoría de los poros mientras que el lecho vascular (V) estaba presente sólo en algunos poros pero no en otros (100x del área del recuadro de la Figura 2A); la Figura 2C indica que los osteocitos (C) se veían claramente embebidos dentro de la matriz ósea. Los osteoblastos putativos (OB) recubrían la superficie interna de la nueva matriz ósea (400x del área del recuadro de la FIGURA 2B);

La Figura 3 es una serie de fotomicrografías (tinción de Mallory Heidehian) de una sección histológica de una composición que contiene fibroblastos humanos de médula cultivados en cerámica después de tres semanas de incubación en un ratón ``desnudo''; la Figura 3A indica que se observó el hueso (B) recubriendo un número mayor de poros del esqueleto de cerámica (G)que en la Figura 2 (2 semanas de incubación) (40x); la Figura 3B demuestra que el tejido fibroso (F) permanecía aún en los espacios internos de la mayoría de los poros. Además, el lecho vascular (V) estaba también presente en algunos poros (100X del área recuadrada en la Figura 3A);

La Figura 4 son dos fotomicrografías (tinción de Mallory Heidehian) de una sección histológica de fibroblastos humanos de médula cultivados en cerámica tras seis semanas de incubación en un ratón ``desnudo''; la Figura 4A indica que se observó el hueso (B) recubriendo la mayoría de los poros del esqueleto de cerámica (G) (40x); la FIGURA 4B indica que se observó el tejido fibroso (F) en los espacios internos de unos pocos poros, sin embargo, la médula (M) y el tejido vascular (V) habían sustituido al tejido fibroso en la mayoría de los poros (100x del área recuadrada en la Figura 4A).

La Figura 5 es una fotografía que indica los resultados positivos del ensayo ELISA de IgG del Ejemplo 2 (III) (A).

Las Figuras 6A-6H son fotomicrografías de una sección característica congelada de células humanas derivadas de médula ósea expandidas en cultivo sedimentadas mediante inmunofluorescencia indirecta (400x). Las Figuras 6A (fase) y 6B (fluorescencia), 6C (fase) y 6D (fluorescencia), y 6E (fase) y 6F (fluorescencia) representan el control SB1, y los anticuerpos SH2, SH3 y SH4 que demostraron ser positivos para la secreción de IgG y la especificidad hacia el sedimento congelado de células de médula en cultivo.

Las Figuras 7A-7H son fotomicrografías que demuestran los resultados positivos característicos del análisis por inmunofluorescencia indirecta de células vivas mesenquimáticas derivadas de médula en cultivo en micromasa (400x).

Las Figuras 7A (fase) y 7B (fluorescencia), 7C (fase) y 7D (fluorescencia), y 7E (fase) y 7F (fluorescencia), y 6G (fase) y 6H (fluorescencia) representan el control SB-1 y los anticuerpos SH2, SH3 y SH4 que demostraron ser positivos para la especifidad de células vivas mesenquimáticas derivadas de médula en cultivo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención trata del descubrimiento de que a través de un procedimiento bastante detallado, las células progenitoras de varios tipos de tejidos conjuntivos pueden aislarse y purificarse a partir de tejidos tales como médula ósea. El presente inventor se refiere a estas células como ``células mesenquimáticas derivadas de médula'' y/o ``células madre mesenquimáticas''. En lo que respecta a esto, se ha hallado que aunque estas células mesenquimáticas progenitoras normalmente están presentes en la médula ósea en cantidades muy pequeñas y que estas cantidades disminuyen enormemente con la edad (es decir, entre, aproximadamente, 1/10.000 células en un paciente relativamente joven hasta, aproximadamente, 1/1.000.000 en un paciente anciano), las células progenitoras o madre mesenquimáticas pueden aislarse del tejido y purificarse cuando se cultivan en un medio específico para que se adhieran selectivamente a los sustratos. Este descubrimiento, como se indicó anteriormente, es el propósito de la solicitud de patente de EEUU co-pendiente.

Además, se ha hallado también que las células mesenquimáticas derivadas de médula aisladas y purificadas pueden crecer en un estado no diferenciado a través de la expansión mitótica en un medio específico. Estas células pueden entonces recolectarse y activarse para diferenciarlas en hueso, cartílago y otros diversos tipos de tejido conjuntivo mediante varios factores que incluyen estímulos mecánicos, celulares y bioquímicos.

Por consiguiente, se ha determinado que las células mesenquimáticas derivadas de médula poseen el potencial para diferenciarse en células que producen una amplia variedad de tejidos conjuntivos, tales como osteoblastos y condrocitos y, posiblemente, tendón, ligamento y dermis, y que este potencial se retiene tras el aislamiento y durante varias expansiones de la población en cultivo. Por lo que, siendo capaces de aislar, purificar, multiplicar en gran medida y, posteriormente, activar las células mesenquimáticas derivadas de médula (o células madre mesenquimáticas) para diferenciarlas en los tipos de tejido conjuntivo específico deseados, tales como osteoblastos formadores de hueso, etc., existe in proceso altamente efectivo para el tratamiento de enfermedades esqueléticas y de otros tejidos conjuntivos. Estos hallazgos son el tema de una solicitud de patente de EEUU adicional co-pendiente, también, con la presente solicitud.

La presente invención se dirige hacia la producción de anticuerpos monoclonales in vitro específicos para las células mesenquimáticas derivadas de médula y expandidas en cultivo, aisladas y purificadas, y al uso de los anticuerpos monoclonales e hibridomas asociados (es decir, las células fusionadas mieloma- linfocitos que producen los anticuerpos monoclonales e hibridomas asociados) para propósitos terapéuticos y/o diagnósticos. Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse no sólo para identificar, enumerar, localizar y aislar las células madre mesenquimáticas a través de varios modos como la inmunonofluorescencia, sino para además distribuir diversos productos farmacéuticos, etc.

A. El aislamiento y la purificación de células mesenquimáticas derivadas de médula

La médula ósea es el tejido blando que ocupa las cavidades medulares de los huesos largos, algunos canales de Havers y los espacios entre el entramado de trabéculas o hueso esponjoso. La médula ósea es de dos tipos- roja, que se halla en los huesos de vida temprana y en localizaciones restringidas en la vida adulta (es decir, en el hueso esponjoso) y se ocupa de la producción de células rojas (es decir, hematopoyesis) y de la hemoglobina (por eso es de color rojo); y amarilla, que consiste en su mayor parte en células adiposas (por eso es de color amarillo) y tejido conjuntivo.

En conjunto, la médula ósea es un tejido complejo que comprende células rojas y células blancas, sus precursores y un grupo de células que consiste en fibroblastos, reticulocitos, adipocitos y células endoteliales que forman la red de tejido conjuntivo llamada ``estroma''. Las células del estroma regulan morfológicamente la diferenciación de las células hematopoyéticas a través de la interacción indirecta a través de proteínas de la superficie celular y de la secreción de factores de crecimiento que están implicados en la fundación y el soporte de la estructura ósea. Los estudios que usan modelos animales han sugerido que la médula ósea contiene células ``pre-estromales'' que tienen la capacidad de diferenciarse a cartílago, hueso y a otras células de tejidos conjuntivos. (Beresford, J.N.; Osteogenic Stem Cell and the Stromal System of Bone Marrow, Clin. Orthop., 240:270. 1989). Evidencias recientes indican que estas células, llamadas células madre pluripontentes o células madre mesenquimáticas, tienen la capacidad para generar varios tipos diferentes de líneas celulares (tales como osteocitos, condrocitos, adipocitos, etc.) tras la activación. No obstante, las células madre mesenquimáticas están presentes en el tejido no sólo en cantidades muy pequeñas con una amplia variedad de otras células (tales como eritrocitos, plaquetas, neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos, células adiposas, etc.) en una relación inversa con la edad, son capaces de diferenciarse en diversos tejidos conjuntivos dependiendo de la influencia de varios factores bioactivos.

Por consiguiente, los inventores han desarrollado un procedimiento para aislar y purificar las células mesenquimáticas derivadas de médula a partir del tejido antes de la diferenciación y expandir en cultivo las células mesenquimáticas derivadas de médula para producir una herramienta valiosa para las terapias esqueléticas. El objetivo de tal manipulación es aumentar enormemente el número de células potencialmente reparadoras y utilizar estas células redirigiendo o reforzando la capacidad regeneradora normal del cuerpo. Respecto a esto, las células mesenquimáticas derivadas de médula pueden ser recolectadas posteriormente en gran número y aplicarse a áreas de tejido conjuntivo dañado para intensificar o estimular el crecimiento in vivo para la regeneración y/o reparación, mejorar la adhesión del implante de las prótesis a través de la activación posterior y la diferenciación, intensificar la producción celular hematopoyética, etc.

A lo largo de estas líneas, se contemplan varios procedimientos por los inventores para transferir, inmovilizar y activar las células mesenquimáticas derivadas de médula purificadas expandidas en cultivo en el sitio de la reparación, implante, etc., que incluyen inyectar las células en el sitio del defecto esquelético, incubar las células con una prótesis e implantar la prótesis, etc. Por lo tanto, mediante el aislamiento, purificación y la gran expansión de varias células antes de la diferenciación y controlando después activamente el procedimiento de diferenciación, las células mesenquimáticas derivadas de médula sin diferenciar expandidas en cultivo pueden utilizarse para varios propósitos terapéuticos tales como para elucidar enfermedades celulares, moleculares y genéticas en una amplio número de enfermedades metabólicas óseas y displasias esqueléticas.

Como se indica a continuación más específicamente en el Ejemplo 1, las células mesenquimáticas derivadas de médula aisladas y purificadas en la presente invención derivan de médula ósea de varias fuentes diferentes, que incluyen el componente de las piezas del entramado óseo femoral obtenido de pacientes con una enfermedad articular degenerativa durante la cirugía de cadera o rodilla y del aspirado de médula obtenido de donantes normales y pacientes oncológicos de los que se ha recolectado médula para un futuro transplante de médula ósea. Aunque la recolección de médula se prepare para la separación en cultivo celular mediante varios procedimientos de aislamiento mecánico diferentes dependiendo de la fuente de la médula recolectada (tales como la presencia de pedacitos óseos, sangre periférica, etc.), la etapa crítica implicada en los procedimientos de aislamiento fue el uso de un medio preparado especialmente que contenía agentes que permitían no sólo que las células mesenquimáticas derivadas de médula crecieran sin diferenciarse, sino, además, la adherencia directa de las células mesenquimáticas derivadas de médula solamente a la superficie de plástico o cristal de la placa de cultivo. Mediante la producción de un medio que permite la adhesión selectiva de las células mesenquimáticas derivadas de médula deseadas que estaban presentes en las muestras de médula en muy pequeñas cantidades, fue posible separar las células madre mesenquimáticas de las otras células (tales como células rojas y células blancas, etc.) presentes en la médula ósea.

Respecto a esto, se halló que el medio que consistía en medio BGJ_{b} (Gibco, Grand Island, NY) con mucha cantidad probada y seleccionada de suero bovino fetal al 10% (J.R. Scientific, Woodland, CA, u otros proveedores), fue un medio muy adecuado para el uso en la presente invención. Este medio, que se denominó ``medio completo'' contenía factores que estimularon el crecimiento sin diferenciación de las células mesenquimáticas derivadas de médula y permitieron la adhesión selectiva a través de lugares específicos de unión a proteína, etc., de solamente las células mesenquimáticas derivadas de médula a la superficie de plástico de las placas Petri. Aunque, actualmente no se comprende bien el mecanismo específico que opera en el medio completo para producir la adhesión diferencial, continúa la investigación en esta área.

Los principales componentes del medio BGJ_{b} (modificación de Fitton-Jackson) usados para formular el medio completo se detallan a continuación:

Medio BGJ_{b} (Modificación de Fitton-Jackson)
Componente	Líquido 320-2591 1X (mg/L)
Sales inorgánicas:
NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O	90,00
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	200,00
KCl	400,00
KH_{2}PO_{4}	160,00
NaHCO_{3}	3500,00
NaCl	5300,00
Otros componentes:
Lactato cálcico	550,00
D-Glucosa	10000,00
Rojo Fenol	20,00
Acetato sódico	50,00
Aminoácidos:
L-Alanina	250,00
L-Arginina	175,00
L-Arginina HCl
L-ácido Aspártico	150,00
L-Cisteína HCl\cdotH_{2}O	101,00
L-Glutamina	200,00
Glicina	800,00
L-Histidina	150,00
L-Histidina HCl\cdotH_{2}O
L-Isoleucina	30,00
L-Leucina	50,00
L-Lisina	240,00
L-Lisina HCl	-
L-Metionina	50,00
L-Fenilalanina	50,00
L-Prolina	400,00
L-Serina	200,00
L-Treonina	75,00
L-Triptófano	40,00
L-Tirosina	40,00
DL-Valina	65,00
L-Valina	-

Tabla (continuación)

Medio BGJ_{b} (Modificación de Fitton-Jackson)
Componente	Líquido 320-2591 1X (mg/L)
Vitaminas:
fosfato de \alpha-tocoferol	1,00
(sal disódica)
Ácido ascórbico	50,00
Biotina	0,20
D-Ca Pantotenato	0,20
Cloruro de colina	50,00
Ácido Fólico	0,20
j-Inositol	0,20
Nicotinamida	20,00
Ácido para-aminobenzoico	2,00
Riboflavina	0,20
Tiamina HCl	4,00
Vitamina B_{12}	0,04

Además, se halló también que el medio de mezcla de nutrientes F-12 (Ham) (Gibco, Grand Island, NY) exhibió las propiedades deseadas para la separación selectiva de células mesenquimáticas derivadas de médula. Los componentes principales de la mezcla de nutrientes F-12 (Ham) son los siguientes:

Mezcla de Nutrientes F-12 (Ham)
Componente	Líquido 320-1765 1X (mg/L)	Polvo 430-1700(mg/L)
Sales inorgánicas:
CaCl_{2} (anhidro)	-	33,22
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O	44,00	-
CuSO_{4}\cdot5H_{2}O	0,00249	0,00249
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,834	0,834
KCl	223,60	223,60
KH_{2}PO_{4}	-	-
MgCl_{2} (anhidro)	-	57,22
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O	122,00	-
MgSO_{4} (anhidro)	-	-
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O	-	-
NaCl	7599,00	7599,00
NaHCO_{3}	1176,00	-
Na_{2}HPO_{4} (anhidro)	-	142,04
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O	268,00	-
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O	0,836	0,863

Tabla (continuación)

Mezcla de Nutrientes F-12 (Ham)
Componente	Líquido 320-1765 1X (mg/L)	Polvo 430-1700(mg/L)
Otros componentes:
D-Glucosa	1802,00	1802,00
Hipoxantina	4,10	-
Hipoxantina	-	4,77
(sal sódica)
Ácido linoléico	0,084	0,084
Ácido lipóico	0,21	0,21
Rojo Fenol	1,20	1,20
Putrescina 2HCl	0,161	0,161
Piruvato sódico	110,00	110,00
Timidina	0,73	0,73
Aminoácidos:
L-Alanina	8,90	8,90
L-Arginina HCl	211,00	211,00
L-Asparagina\cdotH_{2}O	15,01	15,01
L-ácido Aspártico	13,30	13,30
L-Cisteína	-	-
L-Cisteína HCl\cdotH_{2}O	35,12	35,12
L-ácido Glutámico	14,70	14,70
L-Glutamina	146,00	146,00
Glicina	7,50	7,50
L-Histidina HCl\cdotH_{2}O	20,96	20,96
L-Isoleucina	3,94	3,94
L-Leucina	13,10	13,10
L-Lysina HCl	36,50	36,50
L-Metionina	4,48	4,48
L-Fenilalanina	4,96	4,96
L-Prolina	34,50	34,50
L-Serina	10,50	10,50
L-Treonina	11,90	11,90
L-Triptófano	2,04	2,04
L-Tirosina	5,40	-
L-Tirosina	-	7,78
(sal disódica)
L-Valina	11,70	11,70

Como se indica arriba, el medio completo puede utilizarse en varios procedimientos de aislamiento diferentes dependiendo del tipo procedimiento de recolección inicial específico usado con el fin de preparar la médula ósea recolectada para la separación del cultivo celular. Respecto a esto, cuando el componente del entramado de la médula ósea se utilizó, la médula se añadió al medio completo y se agitó (en vórtex) para formar una dispersión que se centrifugó después para separar las células de la médula de los fragmentos óseos, etc. Las células de la médula (que consisten, predominantemente, en células rojas y blancas y en células madre mesenquimáticas en muy pequeña cantidad, etc.) se disociaron célula a célula haciéndolas pasar el medio completo que contenía las células de médula a través de una jeringa con agujas adaptadas de calibres 16, 18 y 20. Se cree que la ventaja que se produce por la utilización del procedimiento de separación mecánico frente a cualquier procedimiento de separación enzimática, fue que el procedimiento mecánico produjo pocos cambios celulares mientras que el procedimiento enzimático podría producir daños celulares, particularmente, a los sitios de unión a proteína necesarios para la adhesión en cultivo y la separación selectiva, y/o a que los sitios de unión a proteína se necesitan para la producción de anticuerpos monoclonales específicos para dichas células mesenquimáticas derivadas de médula. La suspensión de células separadas (que se hizo aproximadamente de 50-100 x 10^{6} células nucleadas) se repartió en placas de 100 mm posteriormente, con el propósito de separar selectivamente y/o aislar las células mesenquimáticas derivadas de médula del resto de las células que se hallaban en la suspensión.

Cuando se utilizó el aspirado de médula como fuente de células mesenquimáticas derivadas de médula, las células madre de médula (que contenían pocos pedacitos óseos, pero mucha sangre) se añadieron al medio completo y se fraccionaron con gradientes de Percoll (Sigma, St. Louis, MO) descritos en detalle más adelante en el Ejemplo 1. Los gradientes de Percoll separaron un gran porcentaje de células rojas y de células hematopoyéticas mononucleares de la fracción de baja densidad de plaquetas que contenía las células madre mesenquimáticas derivadas de médula. A este respecto, la fracción de plaquetas, que contenía aproximadamente 30-50 x 10^{6} células se preparó con una cantidad indeterminada de células plaquetarias, 30-50 x 10^{6} células nucleadas, y sólo, aproximadamente, 50-500 células mesenquimáticas derivadas de médula dependiendo de la edad del donante de médula. La fracción de baja densidad de plaquetas se repartió luego en placas Petri para la separación selectiva basada en la adherencia celular.

A este respecto, las células de médula obtenidas del hueso reticular o del aspirado ilíaco (es decir, los cultivos primarios) se crecieron en medio completo y se permitió que se adhiriesen a la superficie de las placas Petri de uno a siete días según las condiciones establecidas en el Ejemplo 1. Debido a que no se observó un aumento en la adhesión celular después del tercer día, se eligieron tres días como periodo de tiempo estándar en el cual las células no adherentes se retiraban de los cultivos sustituyendo el medio completo original por medio completo fresco. Los cambios de medio posteriores se realizaron cada cuatro días hasta que las placas de cultivo llegaban a la confluencia lo que normalmente requería 14-21 días. Esto representa un incremento de 10^{3}-10^{4} en las células madre mesenquimáticas sin diferenciar.

Las células se despegaron de la placa de cultivo utilizando un agente liberador como la Tripsina con EDTA (ácido etilen diaminatetraacético) (0,25% de tripsina, EDTA 1 mM (1x), Gibco, Grand Island, NY) o con un agente quelante como el EGTA (ácido N,N'-tetraacético etilenglicol-bis-(2-aminoetil éter)), Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La ventaja que se produjo usando el agente quelante frente a la tripsina fue que la tripsina, posiblemente, podría romper varias de las proteínas de unión de las células madre mesenquimáticas. Debido a que estas proteínas de unión contienen sitios de reconocimiento, se utilizó un agente quelante como el EGTA en vez de tripsina, como agente liberador, cuando se persiguió producir anticuerpos monoclonales. Luego, se inactivo el agente liberador y el cultivo de células madre sin diferenciar despegado se lavó con medio completo para usarlo posteriormente.

A este respecto, los potenciales linajes óseo y cartilaginoso (es decir, el potencial osteo-condrogénico) de las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas bajo la influencia de diversos factores bioactivos se determinó usando dos ensayos in vivo distintos en ratones ``desnudos''. Véase a continuación el Ejemplo1. Un ensayo implicó el implante subcutáneo de cerámicas porosas de fosfato cálcico cargadas con células mesenquimáticas derivadas de médula cultivadas; el otro implicó el implante peritoneal de cámaras de difusión inoculadas con células mesenquimáticas derivadas de médula cultivadas. La médula completa y las fracciones del aspirado separadas por gradiente de Percoll también se analizaron en estos ensayos in vivo. La evaluación histológica mostró la formación de hueso en las cerámicas implantadas con las células madre mesenquimáticas cultivadas derivadas de la cabeza femoral y de la cresta ilíaca. No se observó cartílago en ninguno de los injertos de cerámica. Por el contrario, las mismas células no consiguieron formar ni hueso, ni cartílago en las cámaras de difusión. Mientras que se ha observado actualmente que la médula completa forma hueso cuando se sitúa como un injerto compuesto con cerámica en localización subcutánea en un ratón ``desnudo'', la cantidad de hueso producido es sustancialmente menor que el que se ve cuando se usan las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo.

Estos resultados indican que bajo ciertas condiciones, las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo tienen la capacidad de diferenciarse en hueso cuando se incuban como un injerto en cerámicas porosas de fosfato cálcico. Aunque no se conocen bien los factores internos que influyen sobre las células madre mesenquimáticas para que se diferencien en células óseas en vez de en células de cartílago, parece que la accesibilidad directa de las células mesenquimáticas a los factores de crecimiento y a los nutrientes proporcionados por la vasculatura en las cerámicas de fosfato cálcico a diferencia de las cámaras de difusión, influyeron sobre la diferenciación de las células madre mesenquimáticas en hueso.

Por consiguiente, las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo pueden utilizarse bajo ciertas condiciones específicas y/o bajo la influencia de determinados factores, para diferenciarse y producir el fenotipo celular deseado que se necesita para la reparación del tejido conjuntivo o la regeneración y/o para el implante de varios dispositivos de prótesis. Por ejemplo, usando cubos de cerámica porosa rellenos con células madre mesenquimáticas humanas derivadas de médula expandidas en cultivo, se ha generado la formación ósea dentro de los poros de las cerámicas tras incubaciones subcutáneas en hospedadores inmunocompatibles. En un estudio reciente llevado a cabo loe el laboratorio del inventor, es decir, Ohgushi, H., Goldberg, V., y Caplan, A. Acta Scandia., 60:334-339, 1989, se usó médula de rata en un injerto compuesto de cerámica porosa para llenar un defecto segmental en el fémur de la rata. Se demostró que el hueso llenó los poros de la cerámica y afianzó el injerto cerámica-médula al hueso del hospedador.

B. La producción de anticuerpos monoclonales específicos de células mesenquimáticas derivadas de médula

La presente invención se dirige a la producción in vitro de anticuerpos monoclonales específicos de células mesenquimáticas derivadas de médula (células madre mesenquimáticas) que se aislaron, purificaron y se expandieron en cultivo como se indicó arriba, y al uso de los anticuerpos monoclonales y los hibridomas asociados (es decir, a las células fusionadas mieloma-linfocitos que producen los anticuerpos monoclonales) para propósitos diagnósticos y/o terapéuticos. Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse no sólo para la identificación, enumeración, localización y aislamiento de células madre mesenquimáticas a través de varias formas de diagnóstico tales como la inmunofluorescencia sino, además, para la distribución de diversos productos farmacéuticos y usos terapéuticos adicionales.

Las células mesenquimáticas derivadas de médula utilizadas en la invención para la inmunización se aislaron y se purificaron según el procedimiento descrito arriba con la excepción de que después del primer pase de células que crecieron hasta la confluencia, las células se despegaron de la superficie de la placa Petri con EGTA 0,5 mM (ácido N,N'-tetraacético etilenglicol-bis-(2-aminoetil éter), Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en Solución Salina de Moscona (solución salina de Tyrode libre de Ca-Mg) durante una hora. A este respecto, debido a que el EGTA actúa como un agente liberador posiblemente quelando los iones Mg^{2+} y Ca^{2+}, las células mesenquimáticas derivadas de médula se empaparon inicialmente con el reactivo de Moscona (una solución salina que no contiene iones Mg^{2+} y Ca^{2+}) con el fin de eliminar el Mg^{2+} y Ca^{2+} presentes en el medio completo y luego se incubaron en EGTA durante una hora. Las células mesenquimáticas derivadas de médula se lavaron luego con Sales de Tyrode (Nº de catálogo T-2145, sin bicarbonato sódico, Sigma Chemical, St. Louis, MO), una solución salina equilibrada que proporciona determinados factores fisiológicos que se requieren para el mantenimiento de la integridad estructural de las células in vitro y se reconstituyeron en sales de Tyrode para inyectarlas en un ratón para la producción de anticuerpos.

Durante este procedimiento, antes de la inmunización (o estimulación), las células mesenquimáticas derivadas de médula se disociaron de una en una pasándolas a través de una aguja de calibre 20. Un ratón hembra (CBGF1/J Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) de aproximadamente 14 semanas al principio del procedimiento de inmunización, se inmunizó con las células mesenquimáticas derivadas de médula aisladas expandidas en cultivo mediante inyección peritoneal según el protocolo de inmunización específico descrito con más claridad más adelante en el Ejemplo 2. A este respecto, ya que al menos uno de los intentos previos falló en la producción de anticuerpos monoclonales específicos de células mesenquimáticas derivadas de médula durante la inmunización, se exploraron varios factores respecto al procedimiento óptimo de inmunización con el fin de producir hibridomas secretores de anticuerpos anti-células madre mesenquimáticas que incluyen (1) disociación celular (es decir, las células se disocian con EGTA y otros agentes en vez de con tripsina), (2) la concentración del antígeno inmunizante,(3) la fuente de las células mesenquimáticas derivadas de médula utilizada (es decir, se usaron células de varios donantes de médula distintos para maximizar la proporción de antígenos comunes sobre los antígenos específicos del donante), etc. El procedimiento que se descubrió que producía los resultados óptimos se describe en detalle en el Ejemplo 2.

Brevemente, sin embargo, se inyectaron intraperitonealmente en el ratón, aproximadamente, 2,0 x 10^{6} las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo. La inyección inicial fue seguida de cuatro inyecciones, una por semana aproximadamente, de células de médula obtenidas de múltiples donantes humanos preparadas de manera similar. Las células de médula de los donantes múltiples se utilizaron con el propósito de producir anticuerpos monoclonales específicos para epítopos comunes hallados en la superficie de las células mesenquimáticas derivadas de médula. Después del día 25, se extrajo sangre del ratón y el suero de la sangre se ensayó mediante inmunofluorescencia con el fin de comprobar que el régimen de inmunización había tenido éxito a la hora de producir una respuesta inmune en el ratón frente a las células mesenquimáticas derivadas de médula cultivadas.

Después de completar con éxito el procedimiento de cuatro semanas de inmunización, se sacrificó el ratón y las células esplénicas (en particular, las células plasmáticas secretoras de anticuerpos, es decir, linfocitos que producían los anticuerpos específicos para las células mesenquimáticas derivadas de médula) se fusionaron con células de mieloma SP 2/0 (células tumorales inmortales secretoras de anticuerpos obtenidas del Dr. Douglas Fambrough del Carnegie Institute en Baltimore, Maryland) según los procedimientos altamente específicos descritos más adelante. Las células de mieloma SP 2/0 utilizadas eran sensibles al medio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) en virtud de su ausencia de enzimas tales como la timidina quinasa (TK). Por consiguiente, las células de mieloma SP 2/0 murieron cuando se expusieron al medio selectivo HAT. Esto permitió que la selección de híbridos se llevase a cabo mediante el crecimiento de las células fusionadas y no fusionadas en el medio HAT. Más todavía, además de la sensibilidad de las células de mieloma SP 2/0 al medio HAT, estas células, además, no sintetizaron inmunoglobulinas. El beneficio de usar células de mieloma no secretoras de inmunoglobulinas para la fusión era que cualquier inmunoglobulina asociada con el crecimiento del hibridoma que surge de la fusión indicaría solamente la contribución de las células esplénicas.

El procedimiento utilizado para la fusión de células para producir los hibridomas se describe en detalle en el Ejemplo 2 más adelante. Generalmente, sin embargo, las células esplénicas se mezclaron primero con una tercera parte del número de células de mieloma y se centrifugaron. El sedimento de células se expuso a polietilén glicol (PEG 1500, Boehringer Mannheim, W. Germany) que facilitó la fusión celular. El PEG se diluyó a continuación y la mezcla de fusión se centrifugó y el sedimento se resuspendió en medio de crecimiento específico (es decir, el medio HAT que mata a las células de mieloma mientras que permite el crecimiento de los hibridomas) con células cebadoras (tales como macrófagos peritoneales de ratón que ayudaron al establecimiento de los hibridomas), se plaquearon en alícuotas y se incubó según la alimentación y los cambios previstos descritos en el Ejemplo 2. Después de aproximadamente de siete a diez días, aparecieron en los pocillos pequeños grupos o colonias de células de hibridoma (es decir, la progenie inmortalizada de la fusión celular entre las células tumorales y los linfocitos \beta hallados en el bazo del ratón). Debido a que la línea de mieloma utilizada (es decir, las células de mieloma SP 2/0) era un mutante que había perdido la capacidad para producir sus propios anticuerpos, los hibridomas resultantes secretaron solamente los anticuerpos de las células plasmáticas secretoras de anticuerpos (linfocitos \beta) obtenidas del ratón inmunizado.

Con el fin de identificar aquellas colonias del hibridoma que sintetizasen y secretasen anticuerpos que fuesen específicos para las células mesenquimáticas de médula expandidas en cultivo, se utilizaron varias técnicas preliminares de análisis (es decir, ensayo inmunoenzimático (ELISA), ensayo de inmunofluorescencia indirecta, etc.) para caracterizar los anticuerpos que secretaron los distintos hibridomas. Los controles positivos para todos los ensayos incluyeron sueros de ratones inmunizados a distintas diluciones obtenidos cuando se extirpó el bazo.

Específicamente, se realizaron una serie de ensayos con el fin de identificar los hibridomas que secretaban anticuerpos con isotipo IgG. Debido a que este isotipo fue el principal anticuerpo secretado y fue además el más fácil de purificar y usar, se prefirió sobre los isotipos IgM e IgA que pueden ser también específicos para el epítopo deseado. Como se indica más adelante en el Ejemplo 2, de los 764 pocillos que mostraron el crecimiento del hibridoma (de los 960 pocillos inicialmente plaqueados), 245 de estos pocillos resultaron positivos para la secreción de anticuerpos con isotipo IgG.

El sobrenadante del cultivo de las colonias que fueron positivas para la producción de anticuerpos IgG se analizó entonces en secciones congeladas de sedimentos de células mesenquimáticas derivadas de médula mediante inmunofluorescencia indirecta. Este ensayo se realizó con el fin de identificar anticuerpos que se unían sólo a epítopos de las células madre mesenquimáticas derivadas de médula. De los 245 pocillos que fueron positivos para la producción de anticuerpos IgG, sólo 171 de estos fueron positivos en cuanto a su unión a las células mesenquimáticas derivadas de médula.

Debido a que la etapa de análisis descrita arriba se dirigió a sedimentos de células mesenquimáticas derivadas de médula, falla en cuanto a la distinción de aquellos hibridomas que secretaron anticuerpos sólo específicos para la superficie de la célula en vez de para la región intracelular de la célula, los sobrenadantes de los hibridomas que fueron positivos respecto a la reactividad para IgG y secciones congeladas de sedimentos de sedimentos de células mesenquimáticas derivadas de médula, se incubaron entonces con células mesenquimáticas derivadas de médula en cultivo vivas en cultivos de micromasa (es decir, las células cultivadas fueron ``re-plaqueadas'' en pequeñas masas localizadas en el centro del tejido de las placas de cultivo donde las células permanecían viables y se replicaban) y la reactividad se midió mediante inmunofluorescencia indirecta. Debido a que las células que se estaban analizando eran células vivas, este ensayo identificó los anticuerpos que se unían a la superficie de la célula y dio resultados negativos para los anticuerpos que se unían sólo a epítopos intracelulares. Esto fue importante porque para usar anticuerpos monoclonales como marcadores de diferenciación útiles, se necesita que sean específicos para la superficie celular.

Como se indica más abajo, de los 171 pocillos que fueron positivos para la reactividad frente al sedimento de células mesenquimáticas derivadas de médula, sólo 15 de estos pocillos fueron positivos para la reactividad frente a células mesenquimáticas derivadas de médula cultivadas vivas.

Los hibridomas que fueron positivos para cada uno de los análisis preliminares anteriores (es decir, 15 de los 960 pocillos iniciales) se clonaron entonces mediante dilución límite para asegurar que el análisis posterior se realizó sobre hibridomas que se originaron de un único clon. A este respecto, ya que múltiples líneas celulares pueden estar presentes en los pocillos ``parentales'' originales (es decir, en el pocillo original de fusión, las células del hibridoma pueden descender de varios productos de fusión y/o la pérdida gradual de cromosomas durante los días iniciales tras la fusión puede haber generado también una heterogeneidad adicional) se requirió el clonaje de las células para obtener una línea celular de hibridoma monoclonal. Mientras que más adelante, en el Ejemplo 2, se describe detalladamente el procedimiento utilizado para el clonaje, éste básicamente implica las etapas de ``re-plaqueo'' de las células presentes en los pocillos ``parentales'' originales a una densidad de menos de una célula por pocillo. Como consecuencia del establecimiento de cultivos de una sola célula, cualquier colonia que creció en los pocillos fue la progenie de únicamente las células originales ``re-plaquetas''. Con el fin de asegurar la monoclonalidad, se realizaron múltiples clonajes hasta que 100% de los subclones fueron positivos durante dos generaciones.

Las líneas celulares o clones se propagaron en cultivos tisulares o in vivo en hospedadores singénicos o inmunocompatibles donde continuaron sintetizando y secretando anticuerpos frente a las células mesenquimáticas derivadas de médula purificadas. Estos anticuerpos se recuperaron de las células tejido tisular o del fluido ascítico mediante técnicas convencionales tales como precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc.

Los hibridomas clonados se analizaron posteriormente frente a series de tejidos derivados o no de mesénquima con el fin de identificar el grado de especificidad de los anticuerpos monoclonales frente a las células mesenquimáticas derivadas de médula. Específicamente, con el fin de determinar que los anticuerpos monoclonales no fuesen específicos (es decir, no reaccionasen) con las células del linaje hematopoyético en la médula (y, por tanto, pudieran utilizarse para diferenciar tejido mesenquimático de las células hematopoyéticas), se analizó la médula completa y varias fracciones parciales de la médula frente al sobrenadante del cultivo del hibridoma mediante inmunofluorescencia indirecta. Los resultados se describen más adelante en la Tabla 4 (véase Ejemplo 2).

Además, con el fin de determinar si los anticuerpos monoclonales reaccionaron frente a los epítopos comunes de las células mesenquimáticas derivadas de médula y de los tejidos mesenquimáticos diferenciados, secciones congeladas de diversos tejidos mesenquimáticos que se obtuvieron mediante cirugía o autopsia se analizaron frente al sobrenadante del cultivo del hibridoma mediante inmunofluorescencia indirecta. Las reactividades positivas y negativas se anotaron y de detallan en la Tabla 4.

Además, con el fin de identificar los hibridomas que secretaban anticuerpos que sólo eran específicos para las células madre mesenquimáticas y/o su linaje de descendientes (es decir, anticuerpos que no reaccionaron con células derivadas de tejido no derivado de mesenquima), los sobrenadantes del cultivo del hibridoma se incubaron con secciones de tejido no derivado de mesénquima y la reactividad de los anticuerpos se analizó mediante inmunofluorescencia indirecta. Los resultados también se detallan en la Tabla 5 más adelante.

Un análisis de los datos indicó que tres de los hibridomas producidos, identificados y clonados por la presente invención (es decir, SH2, SH3 y SH4) fueron útiles para el análisis de células mesenquimáticas derivadas de médula. Estos tres hibridomas secretaron anticuerpos que reaccionaron con epítopos de la superficie de 99-100% de las células en los ensayos de las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo. Por el contrario, cada uno de los tres hibridomas secretó anticuerpos que reaccionaron frente a menos de 1% de las células en los ensayos de médula completa. La capacidad de estos anticuerpos para unirse selectivamente a las células mesenquimáticas derivadas de médula y no a las células hematopoyéticas hacen de ellos sondas excelentes para cuantificar el número de células madre mesenquimáticas en muestras de médula y para purificar las células madre mesenquimáticas de la médula.

Además, los tres hibridomas mostraron, en su mayor parte, reacción cruzada negativa cuando se analizaron frente a una diversidad tejidos derivados y no derivados de mesénquima, aunque se observó algo de reactividad cruzada con cada uno. Es de particular interés la reacción cruzada de SH3 y SH4 frente a los determinantes de superficie de las células en cultivo derivadas de periostio. A este respecto, los inventores previamente demostraron que el periostio fue otra fuente de células mesenquimáticas y que la reactividad cruzada de los anticuerpos anteriores frente a epítopos de la superficie celular en células de periostio sugirió una relación estructural entre las células mesenquimáticas derivadas de médula y las células mesenquimáticas derivadas de periostio. El anticuerpo SH2, sin embargo, no reaccionó frente a las células mesenquimáticas derivadas de periostio incluso aunque se unió a células mesenquimáticas derivadas de médula. Esta selectividad hace que el anticuerpo SH2 sea útil para diferenciar entre células madre mesenquimáticas derivadas de médula y derivadas de periostio. La selectividad del anticuerpo SH2 junto con la reactividad cruzada de SH3 y SH4 sugiere que las células madre mesenquimáticas derivadas de médula y de periostio están relacionadas pero no son idénticas.

Los depósitos de los cultivos de las líneas celulares identificadas como SH2, SH3 y SH4 están depositados en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 y se les ha asignado los números de acceso de la ATCC HB 1073, HB 1074 y HB 1075, respectivamente. Los depósitos están con el propósito de posibilitar la descripción solamente y no con intención de limitar el concepto de la presente invención a los materiales particulares depositados.

Los resultados indicaron que los anticuerpos monoclonales generados reconocieron determinantes de la superficie celular sobre las células mesenquimáticas derivadas de médula pero no ciertos otros en células estrechamente relacionadas tales como las células hematopoyéticas, etc. Ya que no hay marcadores específicos para las células mesenquimáticas derivadas de médula, los anticuerpos monoclonales generados ahora proporcionan sondas efectivas monoespecíficas que pueden utilizarse para identificar, cuantificar y purificar células mesenquimáticas derivadas de médula.

Más especialmente, los anticuerpos monoclonales producidos pueden marcarse con marcadores adecuados radiactivos, enzimáticos o fluorescentes mediante procedimientos convencionales y/o unirse a vehículos sólidos adecuados, que deberían ser obvios para los expertos en la técnica. A este respecto, el Ejemplo 3 más adelante demuestra la efectividad de los anticuerpos monoclonales generados para identificar y/o cuantificar la presencia de células mesenquimáticas derivadas de médula en muestras biológicas tales como la médula ósea con procedimientos inmunológicos convencionales. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden usarse en combinación con, o conjugados con, un inmunoquímico tal como el isotiocianato de fluoresceína, la peroxidasa, la fosfatasa alcalina u otros marcadores. Además, los anticuerpos monoclonales pueden unirse o anclados a determinados sustratos y utilizarse para capturar células mesenquimáticas derivadas de médula cuando las muestras de tejido tales como la médula ósea, se ponen en contacto con los anticuerpos monoclonales anclados. Las células unidas pueden luego separarse de la fase sólida mediante procedimientos conocidos dependiendo de, esencialmente, la naturaleza de la fase sólida y del anticuerpo. Las células sueltas pueden recuperarse y usarse para diversos propósitos terapéuticos tales como para la regeneración del hueso, etc., dependiendo de diversos factores externos e internos.

Por consiguiente, la presente invención contempla cualquier procedimiento que emplee anticuerpos monoclonales para separar células mesenquimáticas derivadas de médula de otras células tales como las células hematopoyéticas de la médula ósea. Por ejemplo, una forma de realización adicional de la presente invención se dirige a un procedimiento para producir una población de células mesenquimáticas derivadas de médula que comprende las etapas de suministro de una suspensión celular de tejido que contiene médula ósea; el contacto de la suspensión celular con los anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo sobre las células mesenquimáticas derivadas de médula pero no reconocen un epítopo sobre las células hematopoyéticas; y la separación y recuperación de la suspensión celular de las células unidas a los anticuerpos monoclonales.

Además, una forma de realización alternativa de la invención se dirige a un procedimiento para proporcionar una población de células mesenquimáticas derivadas de médula que comprende las etapas de suministro de una suspensión celular de tejido que contiene médula ósea; el contacto de la suspensión celular con una fase sólida unida a anticuerpos monoclonales que reconocen un epítopo sobre la superficie celular de las células mesenquimáticas derivadas de médula pero no reconocen un epítopo sobre las células hematopoyéticas; la separación de las células no unidas a la fase sólida unida a los anticuerpos monoclonales; y la recuperación de las células unidas a partir del líquido unido a los anticuerpos monoclonales.

Los siguientes ejemplos se incluyen con los propósitos de ilustrar más las etapas detalladas de la presente invención.

Ejemplo 1 El aislamiento, purificación y expansión del cultivo de células mesenquimáticas derivadas de médula Recogida de la médula

La médula de la cabeza femoral de las piezas de entramado óseo se obtuvo de pacientes con enfermedad degenerativa de las articulaciones durante la cirugía de sustitución de cadera o rodilla. Además, la médula se obtuvo también mediante aspirado ilíaco de donantes normales y pacientes oncológicos a los que se les recogió médula para un futuro transplante de médula ósea. Todos los pacientes oncológicos tuvieron malignidades no relacionadas con las células del estroma y las células del estroma expresaron un cariotipo normal.

Preparación del cultivo celular de médula A. De contenido de médula de hueso trabecular

El contenido de médula ósea de las trabéculas (0,5-1,5 ml) se transfirió a tubos estériles a los que se les añadió 25 ml de medio BGJ_{b} (GIBCO, Grand Island, NY) con 10% de suero bovino fetal lotes seleccionados (JR Scientific, Woodland, CA) (medio completo). Los tubos se agitaron en un vórtex para dispersar la médula y se centrifugaron a 1000 x rpm durante 5 minutos para sedimentar las células y los fragmentos óseos. El sobrenadante y la capa de grasa se eliminaron y la médula y el hueso se reconstituyeron en 5 ml de medio completo y se agitaron en vórtex para suspender las células de médula. Las células suspendidas se recogieron con una jeringa de 10 ml con una aguja de calibre 16 y se transfirieron a tubos separados. Los fragmentos óseos se reconstituyeron en 5 ml. El medio completo y las células de médula se recogieron como antes. El conjunto de células de médula se consideró completo cuando el sedimento de los fragmentos óseos trabeculares blanco-amarillento era todo lo que quedaba en el tubo inicial. Las células de médula se separaron en una suspensión de células separadas pasándolas a través de jeringas con agujas de calibre 18 y 20. Las células se centrifugaron a 1000 x rpm durante 5 minutos después de eliminar la capa de grasa y el sobrenadante. Las células se reconstituyeron en medio completo, se contaron con un hemocitómetro (las células rojas se lisaron antes del recuento con ácido acético al 4%) y se plaquearon en placas de 100 mm a 50-100 x 10^{6} células nucleadas/ placa.

B. De aspirado de médula ósea

El aspirado de médula (5-10 ml) se transfirió a tubos a los que se les añadió 20 ml de medio completo. Los tubos se centrifugaron a 1000 x rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. Se eliminó el sobrenadante y la capa de grasa y los sedimentos celulares se cargaron en gradientes de Percoll (Sigma, St. Louis, MO) al 70% y se centrifugaron a 460 x g durante 15 minutos. Los gradientes se separaron en tres fracciones con una pipeta: parte superior del gradiente 25% (células de baja densidad - fracción plaquetaria), densidad de la mezcla = 1,03 g/ml; mitad del gradiente 50% (células de alta densidad - células mononucleares), densidad de la mezcla = 1,10 g/ml; y parte inferior del gradiente 25% (células rojas sanguíneas), densidad de la mezcla = 1,44 g/ml. En experimentos preliminares cada uno de estos tres grupos se plaquearon por separado en medio completo en placas de 100 mm. Se observó que las células adherentes se localizaron en las células de baja densidad. Para producir cultivos de células adherentes para todos los experimentos posteriores solamente se plaquearon las células de baja densidad.

Cultivos y pases de células de estroma medular

Las células de médula bien del hueso trabecular de la cabeza femoral o del aspirado ilíaco se cultivaron en medio completo (es decir, BGL_{b} con 10% de suero bovino fetal) en una atmósfera humidificada a 37ºC con 95% de aire y 5% de CO_{2}. En experimentos preliminares se permitió que las células se adhiriesen durante 1, 3 ó 7 días antes del cambiar el medio inicial. No se observó un aumento en la adhesión después del día 1, por lo que se eligió el día uno como periodo de tiempo estándar en el cual las células no adherentes se eliminaban de los cultivos mediante la sustitución del medio original con 7 ml de medio fresco completo. Los siguientes cambios de medio se realizaron cada 4 días. Cuando las placas de cultivo llegaron a la confluencia, las células se despegaron con tripsina al 0,25% con EDTA 0,1 mM (GIBCO) durante 10-15 minutos a 37ºC. La acción de la tripsina se paró con ½ volumen de suero bovino fetal. Se contaron las células, se dividieron 1:3 y se replaquearon en 7 ml de medio completo. Las alícuotas de células se criopreservaron en suero bovino fetal al 90% con DMSO al 10% (medio de congelación).

Preparación de cultivos para incubaciones in vivo en cerámicas y cámaras de difusión

Las células cultivadas se despegaron de las placas como se describió para realizar subcultivos. Después de inactivar la tripsina, se lavaron las células dos veces con 10 ml de medio BGJ_{b} sin suero, se contaron y se ajustaron a una concentración adecuada con BGJ_{b} sin suero. La médula completa y las fracciones de Percoll se lavaron dos veces con 10 ml de BGJ_{b} sin suero y se ajustaron a la concentración apropiada con BGJ_{b} sin suero. Los cubos de cerámica porosa (3 mm^{3}) compuestos de 40% de hidroxiapatita + 40% de fosfato \beta-tricálcico (Zimmer Corporation, Warsaw, Indiana) se añadieron a la suspensión celular bajo condiciones de ligero vacío y se empaparon hasta 90 minutos antes de la implantación quirúrgica.

Las cámaras de difusión se construyeron de anillos de lucita y filtros Millipore como se describió en otro sitio (Ashton y col., 1980). Las células se prepararon como se describió anteriormente y se añadieron a las cámaras en 100-140 \mul de medio BGJ_{b} sin suero. Las cámaras se sellaron con una gota de cemento y se sumergieron en BGJ_{b} sin suero hasta 90 minutos antes de la implantación quirúrgica.

Implantación quirúrgica de cerámicas y de cámaras de difusión

Cerámicas: los ratones ``desnudos'' (National Institute of Health, cepa nu/nu) se anestesiaron con éter y se colocaron sobre su estómago. Se hicieron cuatro incisiones longitudinales (5 mm) a lo largo de la espalda. Los injertos de cerámica-médula se insertaron en las cavidades y se colocaron lo más lateralmente posible en éstas. Las incisiones se cerraron con Autoclips (Becton Dickinson and Company, Parsippany, NJ). Cada par de cavidades recibió una par diferente de injerto cerámica-médula para que las cuatro muestras diferentes (2 cubos de cerámica por muestra) se incubasen en cada ratón.

Cámaras de Difusión: los ratones ``desnudos'' se anestesiaron con éter y se colocaron sobre su espalda. Las incisiones se realizaron a través de la piel y el peritoneo, y las cámaras de difusión se insertaron en la cavidad peritoneal. El peritoneo se cerró con suturas y la piel con Autoclips. Sólo se insertó una cámara por ratón y contenía células cultivadas idénticas a las células cargadas en uno de los cuatro pares de injertos de cerámica-médula implantados en el mismo ratón.

Evaluación histológica

Los ratones ``desnudos'' se sacrificaron y los injertos de céramica-médula se recogieron después de 1-8 semanas tras la implantación (Tabla 1 y Tabla 3). La cerámica se fijó con formalina al 10% tamponada, y se desmineralizó durante 7 horas en el descalcificador óseo rápido RDO (Dupage Kinetics Laboratories, Inc., Plainfield, Illinois), se embebió en parafina, se realizaron secciones (5 \mum de grosor) y se tiñeron con Mallory Heidenhain o con azul de Toluidina.

Las cámaras de difusión se recogieron después de 3-10 semanas tras la implantación (Tabla 2 y Tabla 3). Las cámaras se fijaron en formalina al 10% tamponada, se embebieron en parafina, se realizaron y se tiñeron con Mallory Heidenhain o con azul de Toluidina.

TABLA 1 Incubación de los injertos compuestos de células de médula humana cultivadas y cerámica en un ratón ``desnudo''

Don.

Edad/

Lugar

Pase

Conc.

1

2

3

4

5

6

7

8

#

Sexo

#

1

50/M

FH

4

20X10^{6}

+

1

50/M

FH

5

2X10^{6}

-

+

+

1

50/M

FH

6

0,7X10^{6}

+

+

+

2

65/M

FH

1

5X10^{6}

++

+++

2

65/M

FH

2

4X10^{6}

+++

+++

+++

3

65/M

FH

P

6X10^{6}

-

+

+++

+++

+++

4

66/M

FH

1

10X10^{6}

+

+++

+++

5

64/M

FH

P

8X10^{6}

-

+

++

+++

+++

6

64/M

FH

1

4X10^{6}

+

+++

+++

TABLA 1 (continuación)

Don.

Edad/

Lugar

Pase

Conc.

1

2

3

4

5

6

7

8

#

Sexo

#

7

67/M

FH

P

7X10^{6}

-

+

++

+++

8

34/F

IC

1

4X10^{6}

-

+

9

42/M

IC

P

4X10^{6}

-

-

10

38/M

IC

P

4X10^{6}

-

++

11

45/M

IC

P

4X10^{6}

+

++

Pase #: es el número de subcultivos

Conc. Es la concentración de las células en células/ml

Lugar: es el lugar de donde se obtiene la médula

FH: cabeza femoral

IC: cresta ilíaca

P: cultivo primario

- = ninguno de los poros contenía hueso

+ = 0-30% de los poros contenían hueso

++ = 30-70% de los poros contenían hueso

+++ = más del 70% de los poros contenían hueso

TABLA 2 Incubación de cultivos células de médula humana en cámaras de difusión

Donante	Edad/Sexo	Lugar	Pase#	Células/Cámara
1	50/M	FH	4	4x10^{6}
2	65/M	FH	1	3x10^{6}
3	65/M	FH	P	4x10^{6}
4	66/M	FH	1	4x10^{6}
5	64/M	FH	P	4x10^{6}
P= cultivo primario
Pase# = número de subcultivo
Lugar: es el lugar de donde se obtiene la médula
FH: cabeza femoral
IC: cresta ilíaca
- = ninguno de los poros contenía hueso
+ = 0-30% de los poros contenían hueso
++ = 30-70% de los poros contenían hueso
+++ = más del 70% de los poros contenían hueso

Resultados Cultivos in vitro

Las células mesenquimáticas adherentes derivadas de médula del hueso trabecular de la cabeza femoral o de aspirado ilíaco tienen una morfología similar, además son todas fibroblásticas, con pocas células adipocíticas, poligonales o redondeadas (Figura 1). La tinción histoquímica para la fosfatasa alcalina dio reactividad positiva variable sin diferencias perceptibles entre las células derivas médula de trabécula ósea o de aspirado de médula. Las células adherentes de ambas procedencias no produjeron matriz extracelular que se tiñe metacromáticamente con el azul de Toluidina o es positiva para von Kossa; una tinción positiva habría indicado la posibilidad de que en estos cultivos se estaba produciendo cartílago o hueso.

Incubación in vivo de las células de médula cultivadas con cerámica

Los bloques de cerámica de fosfato cálcico se empaparon en medio de cultivo que contenía varias concentraciones de células mesenquimáticas derivadas de médula bien de hueso trabecular de la cabeza femoral o de aspirado ilíaco. Los donantes de médula incluyeron a hombre y mujeres de edades comprendidas entre 34 y 67 años (Tabla 1). Se ensayaron células de cultivos primarios y del primero al sexto pase con concentraciones de carga celular del intervalo 0,7 x 10^{6} a 20 x 10^{6} células/ml. Los bloques de cerámica cargados con células mesenquimáticas derivadas de médula cargadas se implantaron de forma quirúrgica subcutáneamente en ratones desnudos y se incubaron de 1 a 8 semanas. Tras recogerse, las cerámicas se fijaron, desmineralizaron y la presencia de hueso y cartílago se determinó mediante evaluación histológica. La tabla 1 resume los datos.

Se observó hueso, pero no cartílago en los poros de cada injerto de cerámica y células mesenquimáticas derivadas de médula de hueso trabecular de la cabeza femoral. El hueso más temprano se observó a las 2 semanas en menos del 30% de los poros de cada cerámica (Figura 2). A las tres semanas, el número de poros que contenían hueso varió de menos del 30% a más del 70% (Figura 3). A las seis semanas, la mayoría de las cerámicas contenían hueso en más del 70% de los poros (Figura 4). No se pudo establecer una correlación obvia entre la edad de los donantes y la cantidad formación ósea. Por el contrario, el número de pase parecía tener alguna influencia sobre la cantidad formación ósea, con cultivos primarios y células en pases tempranos (1º y 2º pase) dando una mayor formación ósea que las células en pases tardíos (4º-6º pase). La formación ósea parece comenzar con la diferenciación de osteoblastos y la deposición del hueso sobre las superficies de los poros de cerámica y parece progresar hacia el centro de los poros mientras que las células que revisten la superficie de la nueva matriz ósea secretan osteoides sobre la parte superior de la matriz previamente depositada. El mantenimiento de los injertos de cerámica y células mesenquimáticas derivadas de médula durante periodos de 6-8 semanas dio como resultado la remodelación ósea y la identificación de elementos medulares en los espacios internos de cada poro (Figura 2C).

Los injertos de cerámicas y de células mesenquimáticas derivadas de médula del aspirado ilíaco produjeron hueso en tres de las cuatro muestras analizadas (Tabla 1). No se observó cartílago en ninguno de los injertos. La formación ósea en los tres injertos positivos fue menor que la observada en los injertos de cerámica con células cultivadas de médula ósea de hueso trabecular de la cabeza femoral. Menos del 30% de los poros contenían hueso a las 3 semanas y 30-70% de los poros contenían hueso a las 6 semanas. El resto de los poros contenía tejido fibroso y vasculatura, de origen procedente del hospedador con toda probabilidad.

Incubación in vivo de células cultivadas en cámaras de difusión

El potencial osteo-condrogénico de las células mesenquimáticas derivadas de médula se ensayó también cargando células en cámaras de difusión e implantándolas quirúrgicamente en ratones ``desnudos'' intraperitonealmente. Las células que se obtuvieron de los mismos cultivos usados en los ensayos con las cerámicas (Tabla 2) y las cámaras de difusión se implantaron en el peritoneo de los mismos ratones ``desnudos'' que recibieron los injertos subcutáneos de cerámica-células mesenquimáticas derivadas de médula. Después de incubarse durante 3-10 semanas, se recogieron las cámaras y se determinó la presencia de la formación ósea y cartilaginosa mediante evaluación histológica. En contraste con la presencia de hueso en los injertos de cerámica y células cultivadas del hueso trabecular, no se observó hueso ni cartílago en ninguna de las cámaras de difusión que contenían células mesenquimáticas derivadas de médula de hueso trabecular incluso después de 10 semanas de incubación (Tabla 2). El cultivo de células mesenquimáticas derivadas de médula del aspirado ilíaco tampoco produjo hueso ni cartílago en las cámaras de difusión. En su lugar se observó un tejido fibroso disperso hipocelular en la mayoría de las cámaras.

Discusión

En este ejemplo, las células mesenquimáticas derivadas de médula mostraron la un potencial osteogénico reproducible tras su expansión mitótica en cultivo cuando se ensayaron en cerámicas de fosfato cálcico porosas en ratones ``desnudos''. La osteogénesis no se observó cuando las mismas células se incubaron en cámaras de difusión en los mismos ratones ``desnudos''. En conjunto, estos datos muestran que la médula humana contiene células que pueden seleccionarse y expandirse en cultivo, que tienen el potencial para diferenciarse en hueso cuando se incuban in vivo como un injerto en cerámicas de fosfato cálcico porosas.

La ausencia de la formación ósea en las cámaras de difusión sugiere que el ensayo con las cerámicas puede ser un ensayo más sensible para la diferenciación en hueso de las células de médula. Bab y col, (Bab, I, Passi-Even,L., Gazit, D., Sekeles, E., Ashton, B.A., Peylan-Ramu, N., Ziv, I., y Ulmansky, M; Osteogenesis in vivo difussion chamber cultures of human marrow cells, Bone and Mineral 4; 373, 1998) observaron hueso en cuatro de las ocho cámaras de difusión implantadas con médula humana de dos donantes infantiles, aunque, estos autores no observaron hueso cuando se incubaba médula completa de donantes adultos en cámaras de difusión en ratones ``desnudos''. Además, Davies (Davies, J.E., Human bone marrow cells synthesize collagen, in diffusion chambers, implanted into normal rat, Cell. Biol. Int. Rep. 11,2: 125, 1987)no observó formación ósea en las cámaras de difusión inoculadas con médula fresca de hembras de cinco años, ni tampoco Ashton y col. observaron formación ósea (Ashton, B.A., Cave, F.A., Williamson, M., Sykes, B.C., Couch, M., y Poser, J.W.; Characterization of cells with high alkaline phosphates activity derived from human bone and marrow; preliminar assesment of their osteogenicity, Bone, 5: 313-319, 1985) en las cámaras de difusión inoculadas con fibroblastos cultivados de piezas compuestas de hueso y médula de niños y adultos jóvenes.

En el presente ejemplo, la formación ósea no se observó en las cámaras de difusión inoculadas con células mesenquimáticas derivadas de médula de diversos donantes adultos. Sin embargo, la formación ósea se observó en injertos de cerámica rellenos con células mesenquimáticas derivadas de médula de las mismas preparaciones de donantes adultos (34-67 años) que no pudieron generar hueso en las cámaras de difusión. No están claros los factores que aparentemente hacen de la cerámica un vehículo más sensible para la diferenciación ósea de las células mesenquimáticas derivadas de médula, pero pueden implicar la accesibilidad directa de las células mesenquimáticas derivadas de médula a los factores de crecimiento y nutritivos provistos por la vasculatura o por la interacción directa con células vasculares que está limitada debido a la geometría de las cámaras de difusión (Jaroma, H.J., y Rotsila, V.A., Effect of diffusion chamber pore size on differentiation and proliferation of periosteal cells, Clin. Orthop., 236, 258, 1988)(Villanueva, J.E., and Nimni, M.E., Promotion of calvarial cell osteogenesis by endotelial cells in diffusion chambers, J. Cell. Biol., 109, 4, parte 2:42a (resumen).

La cuestión del origen del hueso formado en los poros de cerámica es importante ya que el donante de células mesenquimáticas derivadas de médula no está físicamente separado de las células del hospedador como sucede en el caso de las cámaras de difusión. Datos recientes de Goshima y col, (Jun Goshima, Víctor M. Goldberg y Arnold I. Caplan, ``The Origin of Bone Formed in Composite Grafts of Porous Calcium Phosphate Ceramic and Marrow Cells'' (1989) enviado) indica que la formación ósea en los injertos de cerámica es un fenómeno bifásico en la que la formación inicial ósea tiene el origen en el donante. Cuando este hueso derivado del donante ha llenado parcialmente los poros de las cerámicas, las células derivadas del hospedador comienzan a remodelar el hueso del donante, por lo que comienza la segunda fase de la formación ósea derivada del hospedador. Eventualmente, se forma una cavidad medular en el centro, como un capullo de hueso derivado del hospedador que ha sido depositado en las superficies internas parcialmente remodeladas del hueso original del donante. Para confirmar el origen del hueso formado con médula ósea, los presentes inventores están ensayando actualmente injertos de cerámica con anticuerpos monoclonales específicos de especie dirigidos contra osteocitos humanos. Los datos preliminares muestran la reactividad de los anticuerpos frente a los osteocitos dentro de los injertos, lo que sugiere que el hueso formado en las cerámicas porosas es origen humano y no de ratón.

Las células mesenquimáticas derivadas de médula originadas de hueso trabecular de la cabeza femoral parece ser más osteogénico que el de las células mesenquimáticas derivadas de médula del aspirado ilíaco; 9 de las 9 muestras de médula de hueso trabecular produjeron hueso en las cerámicas, mientras que 3 de las 4 muestras de aspirado de células mesenquimáticas derivadas de médula produjeron hueso en las cerámicas. Además, el hueso estaba presente en menos poros de cerámicas injertadas con aspirado de células mesenquimáticas derivadas de médula que en injertos de células mesenquimáticas derivadas de médula de hueso trabecular de la cabeza femoral. Las razones de estas diferencias no están claras, pero pueden estar asociadas con la proximidad de las células de estroma de médula recogidas de la superficie ósea en el tejido original. Ashton y col., (Ashton, B.A., Eaglesom, C.C., Bab, I., y Owen, M.E., Distribution of fibroblastic colony-forming cells in rabbit bone marrow and assay of their osteogenic potential by an in vivo diffusion chamber method, Calcif. Tissue Int., 36;83, 1984) mostraron que las células de estroma de médula de conejo cultivadas diferían en su potencial para formar colonias in vitro y en su potencial osteogénico en cámaras de difusión dependiendo de su proximidad original a la superficie endostial. Las células cercanas a la superficie endostial demostraron tener una eficiencia para formar colonias cuatro veces mayor comparadas con las células del centro. En el presente estudio, las células del hueso trabecular se recogieron mediante una agitación con vórtex vigorosa para separar el hueso trabecular de las células de médula. Esto posiblemente produce una población enriquecida de células de médula derivadas de cerca de la superficie endostial, comparada con el aspirado de médula donde la separación vigorosa de las células de médula del hueso trabecular no es posible. Los inventores observaron un número inicial consecuentemente más elevado de células adherentes de la médula del hueso trabecular en comparación con el aspirado medular, que es similar a las observaciones de Ashton y col. (Ashton, B.A., Eaglesom, C.C., Bab, I., y Owen, M.E. Distribution of fibroblastic colony forming cells in rabbit bone marrow and assay of their osteogenic potential by an in vivo diffusion chamber method. Calcif. Tissue Int., 36: 83, 1984).

En el caso de los donantes de médula adultos, no se observó cartílago en este estudio o en el estudio de Bab y col. (Bab, I, Passi-Even,L., Gazit, D., Sekeles, E., Ashton, B.A., Peylan-Ramu, N., Ziv, I.,y Ulmansky, M; Osteogenesis in vivo difussion chamber cultures of human marrow cells, Bone and Mineral 4; 373, 1998). Puede ser que exista una determinación dependiente de la edad de las células derivadas de médula para el linaje osteogénico sobre el linaje condrogénico. O si no, las condiciones de cultivo del presente estudio pueden ser selectivas para las células osteoprogenitoras sobre las células madre mesenquimáticas o pueden conducir a las células madre mesenquimáticas hacia el linaje osteogénico previamente al análisis in vivo en las cerámicas. Los estudios presentes están dirigiéndose hacia estas posibilidades.

La realización más importante de los estudios detallados en el ejemplo anterior es que la técnica de los injertos de cerámicas proporciona un ensayo sensible para la identificación del potencial osteogénico de las células mesenquimáticas derivadas de médula. Y es importante, que tales células osteogénicas pueden obtenerse de donantes humanos en un amplio intervalo de edades. Estas observaciones indican que la expansión ex vivo de las células que poseen un potencial osteogénico pueden usarse para circunstancias clínicas que requieran el incremento de la osteogénesis.

Ejemplo 2 Producción de hibridomas clonados de células mesenquimáticas derivadas de médula I. Inmunización

Una hembra de ratón (CB6F/J Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) de aproximadamente 14 semanas de edad al principio del experimento, se inmunizó mediante inyecciones peritoneales con células mesenquimáticas derivadas de médula obtenidas de múltiples donantes (ver Tabla 3 a continuación). La inyección inicial fue seguida de cuatro inyecciones, una por semana. Las células de médula de los múltiples donantes se utilizaron con el propósito de producir anticuerpos monoclonales específicos para sitios de reconocimiento común en las células madre mesenquimáticas.

TABLA 3 Información de los donantes de médula usados para la inmunización del ratón

Prp. #	Datos	Fecha de	Tipo de	Diagnóstico
	obtenidos	nacimiento	Prep.	Clínico
H-20	12/16/88	04/09/37	``plug''	DJD
H-21	01/05/89	01/01/38	``plug''	DJD
H-23	01/12/89	02/23/09	``plug''	DJD
H-27	01/17/89	12/12/25	``plug''	DJD
H-31	01/19/89	Aprox. 1929	``plug''	DJD
``plug'': un poquito de hueso trabecular y médula que se recoge de las cabezas femorales
durante la cirugía de transplante de cadera.
DJD: enfermedad degenerativa de las articulaciones

El programa de inmunización

A. Día 0: la inyección inicial consistió en células del donante H-20 que se aislaron y purificaron según el procedimiento detallado anteriormente en el Ejemplo 1. Las células del cultivo primario se dejaron crecer hasta la confluencia y se replaquearon (1:3). Estos primeros pases de células se dejaron también crecer hasta la confluencia y luego se despegaron de la placa con EGTA 0,5 mM en Moscona durante una hora. Las células se lavaron dos veces con Tyrodes y se reconstituyeron en 500 \mul de Tyrodes para inyectarse en el ratón. Las células se disociaron de una en una pasándolas a través de una aguja de calibra 20 adaptada a una jeringa y posteriormente se inyectaron en la cavidad peritoneal del ratón. Se usaron 2,0 x 10^{6} células aproximadamente. Todas las inyecciones repetidas siguientes se prepararon de manera similar.

B. Día 7: células que derivaban de los donantes H-21 y H-23 y se recogieron después de la confluencia de los cultivos primarios. Se usó aproximadamente el mismo número de células de cada donante con un recuento celular total = 1,5 x 10^{6}.

C. Día 15: células que derivaban del donante H-27 tras el cultivo primario. Recuento de células total: 1,0 x 10^{6}.

D. Día 22: células que derivaban del donante H-31 en confluencia después del primer pase. Recuento total de células: 1,0 x 10^{6}.

E. Día 29: células que derivaban del donante H-31. Se recogieron las células en confluencia tras el primer pase y se criopreservaron en nitrógeno líquido. Inmediatamente antes de la inyección, las células se descongelaron y se prepararon e inyectaron como se describió para el día 0. Recuento total de células: 2,0 x 10^{6}.

El día 25 la sangre se extrajo de la vena de la cola del ratón y se preparó el suero mediante centrifugación de las células sanguíneas. El suero se incubó sobre una sección congelada de células de médula humana cultivadas sedimentadas mediante inmunofluorescencia indirecta. El suero reaccionó positivamente frente a las células en la sección congelada, indicando que el régimen de inmunización había tenido éxito en generar una respuesta inmune en el ratón frente a las células cultivadas.

II. Fusión

Después de completarse con éxito el procedimiento de inmunización de cuatro semanas, el ratón inmunizado se sacrificó y las células esplénicas se fundieron con las células de mieloma SP 2/0 obtenidas del Dr. Douglas Fambrough del Carnegie Institute en Baltimore, Maryland, según el procedimiento específico descrito más abajo. Aunque, con el fin de proporcionar medio condicionado para las células del hibridoma producidas durante el procedimiento de fusión, fue necesario preparar al menos un día antes de la fusión una ``capa cebadora'' que comprendía medio condicionado y macrófagos peritoneales. Los macrófagos peritoneales se añadieron con el fin de limpiar las placas de cultivo a través de su acción fagocítica. Los siguientes procedimientos se utilizaron para producir la capa cebadora y para preparar las células de mieloma SP 2/o para la fusión.

A. Preparación de las células cebadoras

Debido a que las células linfoides a menudo crecen poco o mueren mientras crecen en baja densidad (no se entienden muy bien las razones, pero pueden relacionarse con los requerimientos de ``factores de crecimiento'' o con los problemas de productos tóxicos secundarios del tejido vascular) fue necesaria la adición de una población celular de crecimiento lento o que no crezca (normalmente denominadas ``cebadoras''). Las células cebadoras utilizadas en el procedimiento actual se produjeron según el siguiente procedimiento.

1.

Se filtró una solución de sacarosa 0,34 M (11-64 g/100 ml) para esterilizarla y se almacenó en alícuotas de 15 ml a 4ºC.

2.

Se sacrificó un ratón por dislocación cervical y se sumergió completamente en EtOH 70%. Después de unos minutos en Et OH, se sacó el ratón y se tumbó en posición supina sobre un ``bastidor'' de análisis de tubos de poliestireno.

3.

Se hizo un corte en la línea media en la piel abdominal. Mediante una disección directa, la piel se separó del peritoneo asegurándose no pinchar la delgada membrana.

4.

Se inyectaron 5 ml de sacarosa en el perioneo usando una aguja de calibre 20.

5.

La aguja se retiró y el abdomen se masajeó bien con el fin de liberar a los macrófagos. Se insertó una aguja de calibre 23 en el abdomen y, lentamente, se recuperaron los 5 ml de sacarosa.

6.

Las etapas 4 y 5 se repitieron dos veces y se juntaron los macrófagos.

7.

Se centrifugaron las células a 1000 rpm (200 g) durante 5 minutos en una Sorvall GLC-4 con un rotor H1000 (r=18,6 cm). El sedimento de células se resuspendió en 15 ml de D-MEM (Modificación de Dulbecco del Medio de Eagle, Gibco, Grand Island, NY,#430-2100)/ FBS 10% (suero bovino fetal, Gibco, # 430-2100) y se centrifugó.

8.

El sedimento se llevó a 2 ml de medio y se contaron las células. La media dio entre 3 y 6 millones de células.

9.

Las células se resuspendieron en medio Super HAT a una concentración de 1 x 10^{5} células/ml. A este respecto, el medio Super HAT consistió en 400 ml de D-MEM, 120 ml de FBS, 60 ml de NCTC-109-Suplemento de crecimiento de hibridoma (M.A., Bioproducts #12-923ª), 12 ml de HAT 50 X o de H+T (Boehringer Mannheim #644579 o #623091, respectivamente), 6 ml de la Solución I (D-MEM suplementado para proporcionar un pH adecuado y una intensificación del crecimiento de los hibridomas, que contiene 0,2 U/ml de Insulina, Piruvato Na 0,5 mM y ácido oxalacético 1,0 mM), 6 ml de L-Glutamina (Gibco #320-5030),0,6 ml de Gentamicina (M.A. Bioproducts #17-5182).

10.

Posteriormente se añadió 0,1 ml de la suspensión a cada pocillo de diez placas de cultivos de 96 pocillos. Se usaron diez placas por fusión.

11.

Los pocillos se guardaron a 37ºC en un incubador húmedo con 5% de dióxido de carbono, 95% de aire.

B. Preparación de las células de mieloma sp 2/0

Las células de mieloma obtenidas del Dr. Fambrough se evaluaron con el fin de asegurar que crecieran en cultivo durante no menos de 2 meses antes del procedimiento de fusión. Las células se pasaron en D-MEM (Modificación de Dulbecco del Medio de Eagle)/FBS 10%/8-Azaguanina (Gibco, GrandIsland, NY) con el fin de seleccionar células sensibles a HAT. Los pases de las células de hibridoma y de mieloma se llevaron a cabo mediante diluciones seriadas de una alícuota en 12 pocillos de una placa de 48 pocillos.

Dos semanas antes de la fusión, el medio se ajustó hasta FBS 20%. Una semana antes de la fusión se iniciaron varias botellas de cultivo grandes (75 cm^{2}, 20 ml de medio) de SP 2/0s. En ese momento dos filas de una placa de 24 pocillos se sembraron con SP 2/0s a baja densidad. Un día más tarde, el medio se cambió en una de las filas con el mismo medio Super HAT que se iba a usar para la fusión. (Antes de usar cualquier medio, se analizó la esterilidad y el crecimiento bacteriano en una muestra de cada botella). En 24 horas, la mayoría de las células alimentadas con HAT estaban muertas, y a las 72 horas, todas las células alimentadas con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) estaban muertas. Las células alimentadas con el medio de cultivo de SP 2/0 permanecían sanas.

Dos días antes de la fusión, las células SP 2/=s se dividieron en tres botellas nuevas a distintas diluciones (es decir, 1:20, 1:10, 1:8; 1:4). Estas células se analizaron cuidadosamente distintas diluciones y sólo las células que estaban en la fase logarítmica de crecimiento se seleccionaron para la fusión. No hubo células muertas o moribundas en la población seleccionada. Una botella que contiene una buena densidad de células en fase logarítmica contuvo un total de uno a diez millones de células.

C. El procedimiento de fusión Materiales - por bazo

Tijeras de disección, fórceps grandes, fórceps de disección #5 todo en EtOH 70%.

Portaobjetos esmerilados de vidrio en EtOH 70%

Un vidrio de reloj grande (estéril) con base de corcho

Varias placas Petri de 100 mm

Diez placas de cultivo de 96 pocillos con células cebadoras (preparadas como se indicó arriba)

Células de mieloma SP 2/0 (preparadas como se indicó arriba)

Baño a 37ºC

1ml de PEG 1500 a 37ºC (2 g de polietilén glicol) en HEPES 75 mM (ácido N-2-hidroxietilpiperazín-N'-2-etano sulfónico)

10 ml de D-MEM/FBS 10%/antibiótico 2X

100 ml de D-MEM (libre de suero) en hielo

25 ml de D-MEM (libre de suero) a 37ºC

Dos tubos de centrífuga de plástico de 50 ml (estériles)

Un hemocitómetro

Super HAT a 37ºC

Ácido acético 4%

Medio de congelación de células a 37ºC

Procedimiento

1.

Se sacaron dos portaobjetos esmerilados del EtOH y se colocaron en una placa Petri estéril bajo una tapa para que se secaran al aire.

2.

Se sacrificó el ratón por dislocación cervical y se sumergió en EtOH 70%. Después de unos minutos el ratón se colocó en el vidrio de reloj grande con su lado izquierdo hacia arriba.

3.

Se preparó una placa Petri estéril de 100 mm con 5 ml de D-MEM/FBS 10%/antibiótico 2x para depositar ahí el bazo.

4.

Se abrió la piel y la pared abdominal del cuadrante izquierdo superior del ratón.

5.

Se extirpó el bazo y se colocó en la placa Petri. Usando los fórceps de disección, se retiró todo el tejido blanco fibroso conjuntivo que fue posible. El bazo limpio se colocó en otra placa Petri con D-MEM/ FBS 10%/antibiótico 2x.

6.

Cualquier resto de EtOH de los portaobjetos de vidrio se secó al llamearlos. Los portaobjetos se usaron para cortar el bazo en tres piezas. Cada una de estas piezas se sepultó entre los extremos esmerilados de los portaobjetos para liberar las células esplénicas. La suspensión celular se aspiró entonces con una pipeta, y las piezas grandes de tejido conjuntivo se quedaron en la punta de la pipeta. Estas entonces se descartaron y la suspensión celular que quedaba se transfirió a tubos de centrífuga estériles de 50 ml.

7.

Otros 5 ml de D-MEM/FBS 10%/antibiótico 2x se añadió a la placa de Petri y se usó para recoger las células residuales. La solución se pipeteó como antes, las células se depositaron en un tubo de centrífuga de 50 ml, y se colocaron sobre hielo.

8.

Las células de mieloma SP 2/0 se recogieron mediante centrifugación en un tubo estéril de 50 ml. Al mismo tiempo, las células esplénicas se sedimentaban a 1000 rpm durante 5 minutos.

9.

Ambos grupos de células se lavaron tres veces con 5 ml de D-MEM libre de suero enfriado en hielo (es decir, el hielo interfiere en la fusión de estos dos tipos celulares).

10.

Ambos grupos de células se resuspendieron en 5 ml de D-MEM libre de suero enfriado en hielo mediante suaves golpecitos y pipeteos. Estas dos suspensiones celulares se mantuvieron en frío en hielo.

11.

Se hizo un recuento entonces de las células esplénicas usando el hemocitómetro. Se tomaron alícuotas de 30\mul y se añadió 30 \mul de ácido acético al 4%. El ácido lisó las células rojas sanguíneas e hizo más sencillo el recuento de los esplenocitos. La muestra se aplicó al hemocitómetro y se contaron las células en 25 cuadrados grandes. Este número, X, cuando se dividió entre 50 dio la concentración de células en millones por ml. Hubo, aproximadamente, 100 millones de células esplénicas totales. Solamente diez millones de las células esplénicas se usaron en la fusión. El resto, se congelaron. Estas células luego se descongelaron, se lavaron dos veces con D-MEM libre de suero y se usaron para otras fusiones. Por este motivo, las células se congelaron en alícuotas de diez a veinte millones de células por vial.

12.

El procedimiento de fusión se realizó usando un cociente 3:1 de células esplénicas sobre SP 2/0s (es decir, las SP 2/0s se contaron y aproximadamente 3 millones de las células se usaron, lo que dio cerca de 700-800 pocillos con crecimiento de los 960 sembrados inicialmente). La suspensión de células SP 2/0 se añadió entonces a las células esplénicas y la mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 1000 rpm. Se eliminó todo el sobrenadante dejándose así lo más seco posible el sedimento. El sedimento se disgregó mediante golpecitos rápidos. Fue importante deshacer este sedimento para que el PEG entrase en contacto con tantas como fuese posible.

13.

El tubo se colocó entonces en un baño a 37ºC, 1 ml de la solución de PEG (el promotor de la fusión) se añadió goteando directamente sobre el sedimento durante un periodo de un minuto completo. El tubo se rotó mientras se añadió el PEG. Para suspender las células, el tubo se agitó suavemente. Luego, la mezcla se dejó reposar en el baño durante aproximadamente un minuto.

14.

Mientras el tubo rotaba se añadió 1 ml de D-MEM libre de suero a 37ºC durante un periodo de un minuto.

15.

Luego se añadieron 20 ml de D-MEM libre de suero a 37ºC durante un periodo de cuatro minutos.

16.

La mezcla se centrifugó a 1000 rpm durante cinco minutos. El sobrenadante se eliminó inmediatamente y el sedimento se resuspendió en 100 ml de medio Super HAT. Se depositaron 0,1 ml en cada pocillo de las diez placas que contenían los macrófagos.

Programa de alimentación

Los cultivos se alimentaron después de la fusión mediante la sustitución de una parte del medio de cultivo por medio fresco. Por lo tanto, el alimento diluyó gradualmente cualquier anticuerpo hecho por las células esplénicas normales (no fusionadas) secretoras de anticuerpos mientras que también se eliminaban los productos de desecho y se reponían los nutrientes.

1.

Tras 3 días se retiraron 0,1 ml de medio de cada pocillo con cuidado de no alterar la monocapa de células y se sustituyeron por Super HAT fresco.

2.

El medio se cargó otra vez a los 5 días. La mayoría de las células (es decir, las células esplénicas y de mieloma, no fusionadas) estaban muertas o moribundas en esta etapa. Después de una semana en medio Super HAT se asumió que todas las células parentales de mieloma o esplénicas estaban muertas y que cualquiera de las células que crecían era híbrida. Los macrófagos aclararon mucho los restos celulares presentes en el medio. Si el medio se volvía amarillo y no se observaban colonias de células creciendo, el medio se cargaba de nuevo a los 7 días. Si el medio se volvía amarillo y se observaban colonias de células creciendo, se analizaba la presencia de anticuerpos en el medio.

3.

Entre los días 7 y 10 tras la fusión, se veían claramente bellas colonias de células de hibridoma. Se observó que crecían en la periferia de cada pocillo. De los 960 pocillos plaqueados, 764 pocillos exhibieron hibridomas.

4.

El sobrenadante del cultivo (50 \mul) se retiró para su análisis cuando estaba cubierto 1/4 ó 1/3 del pocillo con las células que crecían.

III. Análisis preliminares antes del clonaje

Existían dos procedimientos generales de análisis que se usaron para caracterizar los anticuerpos secretados por los diversos hibridomas: el ensayo inmunoenzimático (o ensayo ELISA) y el ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Lo que viene a continuación es un resumen de cómo se usaron estos ensayos para analizar las colonias de hibridoma presentes en los 764 pocillos para identificar aquellos hibridomas que produjeron anticuerpos con la especificidad para las células madre mesenquimáticas de médula cultivadas.

A. ELISA de IgG: cuando las colonias se volvían visibles por primera vez, se analizó el sobrenadante del cultivo en un ELISA de IgG de cabra anti-ratón. Debido a que este isotipo es el anticuerpo que más se secreta y además es el más sencillo de purificar y usar, se prefirió y se analizó en vez de los isotipos IgM e IgA que podían tener también especificidad frente al epítopo deseado.

Protocolo detallado para Realizar un Ensayo ELISA de IgG de cabra anti-ratón Preparación de las placas de ELISA con IgG de cabra anti-ratón

1.

Se diluyeron 500 \mul de IgG de cabra anti-ratón (Organon Teknila, Catálogo # 06110081) en 100 ml de PBS de Dulbecco (D-PBS) (GIBCO) y se añadieron 50 \mul a cada pocillo de placas de microvaloración de 96 pocillos (GIBCO).

2.

Se dejó incubar el anticuerpo durante una hora a temperatura ambiente.

3.

Las placas se lavaron a continuación dos veces con D-PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino (BSA) y luego se incubaron con D-PBS que contenía 1% de BSA durante una hora para bloquear las sitios inespecíficos de unión a proteínas.

4.

Las placas se lavaron una vez con D-PBS que contenía 0,1% de BSA y se sellaron en bolsas de plástico y se almacenaron a 4ºC hasta su uso.

Realización del Ensayo ELISA

1.

Se añadieron alícuotas de 50 \mul de sobrenadante de cultivo con los anticuerpos a los pocillos de las placas de ELISA y se dejaron incubando en una cámara húmeda durante una hora a temperatura ambiente.

2.

Las placas se lavaron cuatro veces con Tampón Salino Tris (TBS) que contenía 0,1% de BSA.

3.

Se diluyó 1:100-1:250 el anticuerpo de cabra específico para la IgG, IgM e IgA de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Organon Teknika, Catálogo # 86110231) en TBS con 0,1% de BSA y se añadieron 50 \mul a cada pocillo durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

4.

Las placas se lavaron cuatro veces con TBS con 0,1% de BSA.

5.

Se disolvieron 0,093 g del sustrato de la fosfatasa (Sigma) en 10 ml del tampón del sustrato que estaba compuesto por glicina 50mM y MgCl_{2} 1mM a un pH de 10,5. Se añadieron 50 \mul a cada pocillo y se dejó incubar a 37ºC durante 1 hora. Un color amarillo intenso en los pocillos se interpretó como reactividad positiva del anticuerpo.

6.

Los controles positivos y negativos consistieron en análisis idénticos del suero del ratón inmunizado y del medio de cultivo, respectivamente.

Los resultados de los ensayos indicaron que de los 764 pocillos que exhibieron crecimiento del hibridoma, sólo 245 de estos pocillos fueron positivos para la secreción de anticuerpos con el isotipo IgG. Esto se demuestra en la fotografía de los resultados del ensayo ELISA expuestos en la Figura 5.

B. Las secciones congeladas de células sedimentadas mediante inmunofluoresecencia indirecta - los sobrenadantes del cultivo de células que fueron positivas para la IgG se analizaron frente a secciones congeladas de células mesenquimáticas sedimentadas derivadas de médula mediante inmunofluorescencia indirecta. Este ensayo se diseñó para identificar anticuerpos que se unieron a epítopos sobre las células mesenquimáticas derivadas de médula cultivadas.

Protocolo detallado de la unión de anticuerpos a células sedimentadas de médula humana cultivada mediante el ensayo de inmunofluorescencia indirecta Preparación de secciones congeladas de células mesenquimáticas derivadas de médula humana expandida en cultivo

1.

Se añadieron 4 ml de Tripsina al 0,25% con EDTA 1mM (GIBCO) a cultivos en confluencia de células mesenquimáticas derivadas de médula humana en placas de cultivo de 100 mm y se dejaron incubando a 37ºC durante 5 minutos.

2.

La actividad enzimática de la tripsina se paró añadiendo 2 ml de suero de ternera. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 100x g y se desecharon los sobrenadantes. Las células sedimentadas se lavaron dos veces con PBS.

3.

Después del segundo lavado se eliminó el sobrenadante y el sedimento de células se dispersó en un pequeño cubito que contenía el compuesto OCT Tissue Tek (Miles Inc.) y se congeló en nitrógeno líquido. Los bloques congelados de células se almacenaron en bolsas de plástico a 0ºC hasta que se realizaron las secciones.

4.

Se hicieron secciones a partir de los bloques de tejido de 6 micrómetros/ sección y se colocaron sobre portaobjetos cubiertos con gelatina. Los portaobjetos se almacenaron en cajas de portaobjetos hasta que se necesitaron.

Tinción por inmunofluorescencia indirecta

1.

Los portaobjetos se retiraron del refrigerador y se atemperaron a temperatura ambiente antes de usarse.

2.

Las secciones se cubrieron con 50-100 \mul de sobrenadante de cultivo con anticuerpos y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora en una cámara húmeda. Los portaobjetos se lavaron cuatro veces con PBS-BSA 0,1%.

3.

Las secciones se cubrieron entonces con 50 \mul de anticuerpo de cabra anti-ratón IgG conjugado con FITC (Organon Teknika, Catálogo # 1211-0231) que se había diluído de 1:100 a 1:200 en PBS-BSA 0,1% y se dejaron incubando durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

4.

Los portaobjetos se lavaron cuatro veces con PBS-BSA 0,1% y se cubrieron con una gota del medio de montaje para inmunofluorescencia PPD, y se observaron en un microscopio de epi-fluorescencia Olympus BH-2.

5.

Los portaobjetos control negativo consistieron en un análisis idéntico de las células con medio de cultivo que no contenía anticuerpos.

Los resultados del análisis identificaron aquellos anticuerpos que se unían a epítopos sobre las células mesenquimáticas derivadas de médula cultivadas. Véase las figuras 6A-6H que son fotomicrografías de secciones congeladas típicas de células mesenquimáticas derivadas de médula sedimentadas expandidas en cultivo. Además, una observación mayor del patrón de tinción dio una indicación acerca de la localización celular del antígeno; intracelular, en la superficie celular, o ambos. Interesaron sólo los anticuerpos que reaccionaron con la superficie celular, sin embargo ya que la interpretación del patrón de inmunofluorescencia para la superficie celular no era 100% seguro, todos los anticuerpos que reaccionaron con cualquier parte de las células de médula cultivadas se guardaron, y aquellos anticuerpos que dieron respuestas negativas no se analizaron más. De los 245 pocillos que fueron positivos para la secreción de IgG, 171 de estos pocillos fueron positivos para las secciones congeladas de sedimentos de células de médula cultivadas.

C. Inmunofluorescencia indirecta en células vivas en cultivos de micromasa: las células mesenquimáticas derivadas de médula humana se replaquearon en pequeñas masas en el centro de una placa de cultivo de tejido. Este tipo de cultivo se denomina micromasa. Las células normalmente permanecieron viables, se expandieron y se replicaron en estas masas. Los sobrenadantes del hibridoma que mostraron reactividad positiva en los análisis de las partes A y B anteriores, se incubaron con las células en estos cultivos de micromasa y se midió la reactividad mediante inmunofluorescencia indirecta según el protocolo expuesto anteriormente. Debido a que las células que estaban analizándose en este ensayo eran células vivas, este ensayo identificó anticuerpos que se unieron sólo a la superficie celular y dio resultados negativos para los anticuerpos que se unían a epítopos intracelulares.

Protocolo detallado de la unión de anticuerpos a células vivas de médula expandidas en cultivo en micromasa Preparación de los cultivos de micromasa

1.

Las células de cultivos en confluencia de células mesenquimáticas derivadas de médula se despegaron con tripsina al 0,25% que contenía EDTA 1mM como se describió anteriormente. Tras parar la actividad de la tripsina con suero de ternera, las células se sedimentaron mediante centrifugación y se retiró el sobrenadante.

2.

Las células se lavaron una vez con 5-10 ml de medio completo BGJ_{b} y luego se resuspendieron en medio completo a una concentración de 500.000 células por ml. Se transfirieron 50 \mul de la suspensión celular al centro de una placa de cultivo de tejido de 35 mm (Falcon) y se incubaron durante toda la noche a 37ºC.

Tinción por inmunofluorescencia indirecta

1.

Las placas de 35 mm se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron alícuotas de 100 \mul de sobrenadante de cultivo con anticuerpos a cada placa y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora en una cámara húmeda.

2.

Las placas se lavaron tres veces con PBS-BSA 0,1 %, y luego se añadieron 100 \mul del anticuerpo de cabra específico para la IgG anti-ratón conjugado con FITC a cada placa tras haberse diluido de 1:100 a 1:200 en PBS-BSA 0,1%. Las placas incubaron durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

3.

Las placas se lavaron tres veces con PBS-BSA 0,1% y se cubrieron tras aplicar una gota del medio de montaje para inmunofluorescencia PPD La tinción inmunofluorescente se observó en un microscopio de epi-fluorescencia Olympus BH-2.

Utilizando el protocolo descrito arriba, de los 171 pocillos que fueron positivos para la secreción de IgG y específicos para los sedimentos congelados de células de médula cultivadas, sólo 15 de estos pocillos fueron positivos en cuanto a su especificidad hacia células mesenquimáticas vivas derivadas de médula cultivada. Véase las fotomicrografías expuestas en las Figuras 7A-7H que demuestran los resultados característicos de un análisis mediante inmunofluorescencia indirecta de células mesenquimáticas vivas derivadas de médula cultivada en micromasa.

IV. Clonaje mediante dilución límite de las colonias seleccionadas

Los hibridomas que fueron positivos para cada uno de los tres análisis preliminares (es decir, 15 pocillos) se clonaron mediante el siguiente procedimiento con el fin de asegurar que las etapas de análisis siguientes se realizaban sobre hibridomas originados a partir de un único clon. Debido a que múltiples líneas celulares están normalmente presentes en el pocillo ``parental'' original, se requirió el clonaje de las células para obtener una línea celular de hibridoma monoclonal. Mediante el replaqueo de las células a una densidad de menos de una célula por pocillo, cualquiera de las colonias que crecieran en un pocillo deberían ser la progenie de esa célula. Cuando todos los pocillos con crecimiento contenían el anticuerpo de interés durante dos clonajes seriados, la línea celular se consideró monoclonal. Además, el clonaje mediante dilución límite se realizó también con el fin de reducir el riesgo de un crecimiento excesivo de las células no productoras.

Preparación de la capa de células cebadoras y del medio condicionado

1.

En esta etapa, se usaron esplenocitos de ratón en lugar de macrófagos. Aunque los esplenocitos fueron más fáciles de recoger, añadieron restos celulares a los pocillos mientras que los macrófagos, en realidad, aclararon los restos celulares.

2.

Se sacrificó un ratón y se le extirpó el bazo como se describió anteriormente.

3.

Las células se despegaron como se describió previamente, se contaron y se añadió Super HAT a 37ºC para que la concentración fuese 1 millón por ml.

4.

Cuando se usaron placas de 96 pocillos para plaquear, se añadieron 0,1 ml de esta suspensión a cada pocillo. Cuando se usaron placas de 24 pocillos para plaquear, se añadieron 0,5 ml de esta suspensión a cada pocillo.

5.

Alternativamente, esta suspensión celular se dejó crecer también en botellas de cultivo grandes (20 ml) hasta tres días. Durante esos tres días, las suspensión se usó para crear capas cebadoras. Si las células no se usaban en esos tres días, el medio se recogía pasando la suspensión a través de un filtro estéril de 0,22 \mum. Este medio, que podía almacenarse a 4ºC durante varias semanas, fue un aditivo útil para los cultivos que crecían poco. No obstante, este medio no se usó en lugar de las capas cebadoras.

Clonaje

1.

En todos los casos anteriores, las células se plaquearon en pocillos que ya contenían una capa cebadora (véase arriba).

2.

Las células y el medio se transfirieron de los pocillos parentales seleccionados de una placa de 96 pocillos a un pocillo en una placa de 24 pocillos.

3.

Se añadieron 200 \mul del medio de nuevo a los pocillos parentales para que las células residuales parentales pudiesen continuar creciendo. Los pocillos parentales sirvieron como ``copias de seguridad'' en caso de error.

4.

El crecimiento de las células se monitorizó en las placas de 24 pocillos. Generalmente, las colonias que crecían tardaron de 3 a 7 días en cubrir la mitad del pocillo. En aquellos casos que mostraron un crecimiento lento, se añadió el medio condicionado adicional.

5.

Cuando las células crecían adecuadamente, se analizó de nuevo en el medio la presencia de anticuerpos. Fue necesaria esta etapa ya que no tenía sentido el clonaje de estas células si habían parado de secretar anticuerpos.

6.

Si el anticuerpo de interés estaba presente, se recogió una pequeña alícuota (50 \mul) de células del borde de la colonia. Aquí es donde, normalmente, se hallan las células que crecen más activamente.

7.

Se añadieron 10 \mul de esta alícuota a 30 \mul de colorante azul de Tripano al 0,5%. Se contaron las células viables, las células muertas aparecían azules. Fue importante tener en cuenta la dilución con Tripano cuando se determinó la concentración final de células.

8.

La alícuota que quedó de 30 \mul se manipuló para que se cogieran 100 células con seguridad.

9.

Estas 100 células se añadieron a 20 ml de Super HAT, la suspensión se mezcló y se plaquearon uniformemente en placas de 96 pocillos. Esto dio como resultado dos placas de células con 0,5 células por pocillo.

10.

Las colonias se desarrollaron en cerca de la mitad de los pocillos en 5-10 días. Se analizaron los anticuerpos en las colonias de crecimiento rápido. Cuando se hallaron colonias positivas, cuatro de las colonias se transfirieron a nuevos pocillos en una placa de 24 pocillos.

11.

Se añadieron 200 \mul del medio de nuevo a la placa de 96 pocillos y la nueva placa de 24 pocillos se trato exactamente como la placa original de 24 pocillos anterior. Esto proporcionó otra fuente de ``copia de seguridad'' de las células por si el clonaje (o cualquier otra cosa) fallase. Se congelaron aproximadamente 3 millones de células por vial.

12.

Aproximadamente, 2 semanas después de la fusión, las células se cambiaron de Super HAT a medio Super H+T.

13.

El clonaje se continuó usando las técnicas anteriores hasta que el 100% de los clones fueron positivos durante dos generaciones.

14.

Las células sucesivamente más ``clonales'' se congelaron también como medida de precaución.

15.

Una vez que se cumplió la monoclonalidad de la línea celular, el medio de cultivo se cambió por Hybridoma 20%. Este medio, que permite la intensificación del crecimiento celular, consistió en 78 ml de D-MEM, 20 ml de FBS, 1 ml de Glutamina (Gibco #320-5030), 1 ml de Solución I (véase arriba), o,1 ml de Gentamicina (M.A. Bioproducts #17-5187).

V. Recogida de los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas

Los anticuerpos monoclonales que secretaron los hibridomas clonados se recogieron mediante bien el cultivo de los hibridomas clonados (individualmente) en el medio Hybridoma 20% y se recogió el anticuerpo del medio, o se cultivaron los hibridomas clonados intraperitonealmente en ratones y se recogió el líquido ascítico maligno que contenía el anticuerpo o suero del ratón. A este respecto, mediante el uso del siguiente procedimiento, las células del hibridoma crecieron en la cavidad peritoneal del ratón que producía un fluído ascítico rico en anticuerpos monoclonales.

1.

El ratón receptor se ``cebó'' de 5 a 10 días antes de la inoculación de células tumorales mediante la inyección intraperitoneal a cada ratón de 0,5 ml de Pristane (2,6,10,14, Tetrametilpentadecano; Sigma. Catálogo #T-7640). Los ratones que se usaron para que crecieran las células tumorales fueron de la misma cepa, como la de los usados para generar inicialmente las líneas celulares de hibridoma. Los ratones usados tenían aproximadamente de 8 a 12 semanas. Una línea tumoral se dejó crecer en 6 ratones a la vez.

2.

En el cultivo, la línea celular monoclonal establecida se dejó crecer en fase logarítmica. Aproximadamente se recogieron 30 millones de células.

3.

Las células se centrifugaron a 1000 rpm durante cinco minutos y luego se separaron del sobrenadante del cultivo.

4.

Debido a que el suero interfiere con la producción tumoral y contamina el fluido ascítico, las células se lavaron en medio libre de suero y se centrifugaron de nuevo.

5.

Las células se resuspendieron en medio libre de suero (es decir, DMEM-HG, Gibco, Grand Island, NY) de tal forma que la densidad celular fuese 10 millones por ml.

6.

Usando una aguja de calibre 23, se inyectaron 0,5 ml (5 millones de células) de la suspensión en el peritoneo de cada ratón receptor.

7.

Aproximadamente, una semana después parecía que el ratón tenía ``inflada'' la cavidad abdominal. Una vez que aparecía haber aumentado de tamaño hasta alcanzar aproximadamente el tamaño de una ciruela, se dieron golpecitos en el fluido ascítico presente en la cavidad peritoneal.

8.

Mientras se daban golpecitos se anestesió ligeramente a los ratones usando Metafane (Metoxifluorano; Pitman-Moore, Inc., Catalog #NDC 11716-5943-4). Usando una aguja de calibre 22, se perforó la piel abdominal para que la aguja estuviera muy superficialmente dentro del peritoneo. Luego se vació el fluido ascítico de la aguja en un recipiente. Moviendo el ratón y/o la aguja fue posible obtener los 5 ml completos de fluido. Este fluido produjo anticuerpos en el intervalo de 0,5 a 5 mg/ml.

9.

Los animales se llevaron de vuelta a sus jaulas para que se recuperasen y ``masajearles'' de nuevo.

10.

En los animales que no se recuperaron de la anestesia en cualquier etapa del experimento, se obtuvo el fluido ascítico residual mediante la apertura quirúrgica del abdomen y la recuperación del fluido. A este respecto, hay que destacar que no se recogió el fluido de los ratones que llevaban muertos más de una hora.

11.

Una vez que se había recogido el fluido, se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células rojas sanguíneas y otras células no deseadas.

12.

Se añadió azida sódica de tal forma que la concentración final fuera 0,02%. Este fluido ascítico se almacenó entonces en pequeñas alícuotas a -70ºC. La estabilidad de cada anticuerpo al congelado y descongelado se analizó antes de que la preparación completa del fluido ascítico se congelase.

VI. Análisis de los hibridomas clonados

Los hibridomas clonados (15 pocillos) se analizaron frente a series de tejidos derivados o no de mesénquima para identificar el grado de especificidad de los anticuerpos monoclonales de las células mesenquimáticas derivadas de médula cultivada.

Los resultados del análisis de los tres hibridomas óptimos, es decir, SH2, SH3 y SH4 se evaluaron frente a un control para el ruido de fondo. Los resultados se exponen más abajo en la Tabla 4. Según esto, en la Tabla 4, (-) indica que no hay reactividad visible superior a la del control; (\pm) indica una reactividad menor que el 1% por encima del control y con propósito evaluador se consideró como (-); y, (+) que indica una reactividad sustancial por encima del control. El control negativo de cada experimento consistió en incubar las células o el tejido de interés con SB-1, un anticuerpo monoclonal frente a la fosfatasa alcalina de pollo que no reacciona con células humanas (sin anticuerpo), seguido de la incubación con un anticuerpo secundario marcado con FITC.

A. El primer nivel y el más importante nivel de especificidad fue que los anticuerpos monoclonales no reaccionasen con células del linaje hematopoyético en la médula. Para determinar esto, se analizó médula completa y varias fracciones parciales de la médula frente a sobrenadante de cultivo de hibridoma mediante inmunofluorescencia indirecta según el procedimiento expuesto anteriormente. Con el fluorocromo isotiocianato (FITC), se advirtieron las células positivas y el porcentaje de células positivas, sin embargo, todos los hibridomas se guardaron para analizarlos en el siguiente nivel.

Preparación de médula

La médula completa y las fracciones del Percoll de baja densidad se prepararon como se describió anteriormente en el Ejemplo 1 y se procesaron para realizar secciones por congelación como se describió anteriormente para las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo.

Tinción por inmunofluorescencia indirecta

Las secciones de médula ósea completa y las fracciones del Percoll de baja densidad se analizaron con los sobrenadantes de cultivo con anticuerpos de los hibridomas clonados usando el mismo procedimiento que el descrito anteriormente para analizar el cultivo de células mesenquimáticas expandidas en cultivo en secciones congeladas.

B. Análisis de los anticuerpos monoclonales frente a tejido derivado de mesénquima. Se obtuvieron distintos tejidos mesenquimáticos por cirugía o autopsia para determinar si los anticuerpos monoclonales reaccionaban frente a epítopos comunes a las células mesenquimáticas derivadas de médula y a los tejidos mesenquimáticos diferenciados. Se analizaron secciones congeladas de los tejidos frente al sobrenadante del cultivo de hibridoma y se analizaron mediante inmunofluorescencia según el procedimiento siguiente.

Protocolo detallado para el análisis de las secciones de tejido frente a los sobrenadantes de los hibridomas clonados mediante inmunofluorescencia indirecta Preparación de la sección de tejido

1.

Los siguientes tejidos se obtuvieron de biopsias quirúrgicas o de autopsias de pacientes humanos: piel, prepucio, intestino, corazón, músculo esquelético, pulmón, hígado, cerebro, tendón, ligamento, vesícula biliar, cartílago articular, fémur, cartílago de la costilla y periostio.

2.

Los siguientes tejidos de animales se obtuvieron también para su análisis: médula y hueso de pollo, hueso y médula de conejo, hueso de rata y cartílago y hueso bovino.

3.

Cada tejido se embebió en el medio de congelación OCT-Tissue Tek (Miles Inc.) y se congeló en bloques en nitrógeno líquido y se almacenó a 0º hasta usarse.

4.

Se hicieron secciones de bloques de tejido de 6 micrómetros y se colocaron sobre portaobjetos cubiertos de gelatina y se almacenaron a 0ºC hasta usarse.

Tinción por inmunofluorescendia indirecta

Las secciones de tejido se analizaron frente al sobrenadante del cultivo del hibridoma de hibridomas clonados usando el mismo procedimiento que el descrito anteriormente para el análisis de las secciones congeladas de células expandidas en cultivo.

Se observó reactividad positiva y negativa, y los patrones de reactividad descritos (Tabla 4). Todos los hibridomas clonados se guardaron para analizarse en el siguiente nivel.

C. Análisis de los anticuerpos monoclonales frente a tejidos no derivados de mesénquima. El objetivo principal del protocolo de análisis fue identificar hibridomas que secretaran anticuerpos que fueran específicos para células mesenquimáticas derivadas de médula y/o su linaje de descendientes. Un anticuerpo que reaccionó con un tejido no derivado de mesénquima no sería, por lo tanto, ni específico ni único. Muchos de los tejidos que no derivan de mesénquima se obtuvieron por autopsia y se prepararon secciones congeladas. El sobrenadante del cultivo de hibridoma se incubó con estas secciones y la reactividad del anticuerpo se analizó mediante inmunofluorescencia indirecta como se describió anteriormente. Se identificó la reactividad positiva y negativa así como el patrón de reactividad.

TABLA 4 Reactividad de los hibridomas óptimos y de los anticuerpos monoclonales asociados con diversos tipos celulares

Anticuerpos monoclonales
		SH2	SH3	SH4
A.	Análisis preliminares
1	ELISA-IgG	+	+	+
2	Sedimento de células en cultivo	+	+	+
3	Micromasa de células en cultivo	+	+	+
B.	Células de médula hematopoyéticas
1	Médula Completa Fresca	-	\pm^{a}	\pm^{a}
2	Fracción del Percoll de baja densidad	\pm^{a}	-	-
C.	Tejidos derivados de Mesénquima
1	Cabeza femoral (hueso) (HCl)	-	-	-
2	Médula y hueso de costilla (RDO)	\pm^{b}	-	-
3	Cartílago de costilla	-	+	-
4	Músculo esquelético	-	-	-
5	Células de periostio cultivadas	-	+	+
6	Células de periostio (micromasa)	-	+	+
7	Ligamento	\pm^{b}	\pm^{b}	-
8	Tendón	-	-	\pm^{b}
9	Cartílago Articular	-	+	+
10	Diáfisis Femoral	-	-	-
D.	Tejidos no derivados de Mesénquima
1	Prepucio	-	-	-
2	Piel del pecho	-	-	-
3	Intestino	\pm^{b}	-	-
4	Corazón	\pm^{b}	-	-
5	Pulmón	\pm^{b}	-	-
6	Hígado	\pm^{b}	\pm^{b}	-
7	Cerebro	-	-	-
8	Vesícula biliar	-	-	+
^{a} menos de 1% sobre el control
^{b} reactividad a la matriz del tejido no asociada con células

Los resultados anteriores claramente indican que tres hibridomas, es decir, SH2, SH3 y SH4 se han identificado y clonado. Estos hibridomas son útiles para el análisis de células mesenquimáticas derivadas de médula. Los tres hibridomas secretan anticuerpos que reaccionan con epítopos de la superficie celular en un 99-100% de las células en los ensayos de células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo. Por el contrario, cada uno de los tres hibridomas secretan anticuerpos que reaccionan menos del 1% con células de los ensayos de médula completa. La capacidad de estos anticuerpos para unirse selectivamente a células mesenquimáticas derivadas de médula y no a células hematopoyéticas hace de ellos unas sondas excelentes para la cuantificación del número de células mesenquimáticas derivadas de médula en las muestras de médula así como para la purificación de dichas células a partir de la médula.

Además, los tres hibridomas mostraron en su mayoría negatividad para la reactividad cruzada cuando se analizaron frente a una variedad de tejidos derivados o no de mesénquima, aunque se observó algo de reactividad cruzada en cada uno. Es de particular interés la reacción cruzada de SH3 y SH4 frente a los determinantes de superficie de las células en cultivo derivadas de periostio. Ya que los inventores habían demostrado previamente que el periostio era otra fuente de células mesenquimáticas, la reactividad cruzada de los anticuerpos anteriores frente a epítopos de la superficie celular en células de periostio sugirió una relación estructural entre las células mesenquimáticas derivadas de médula y las células mesenquimáticas derivadas de periostio. El anticuerpo SH2, sin embargo, no reaccionó frente a las células mesenquimáticas derivadas de periostio incluso aunque se unió a células mesenquimáticas derivadas de médula. Esta selectividad hace que el anticuerpo SH2 sea útil para diferenciar entre células madre mesenquimáticas derivadas de médula y derivadas de periostio. La selectividad del anticuerpo SH2 junto con la reactividad cruzada de SH3 y SH4 sugiere que las células madre mesenquimáticas derivadas de médula y de periostio están relacionadas pero no son idénticas.

Ejemplo 3

Los anticuerpos monoclonales producidos anteriores pueden utilizarse también para distinguir entre células mesenquimáticas derivadas de médula y células hematopoyéticas derivadas de médula. La capacidad para hacer tal distinción es útil para el desarrollo de reactivos de diagnóstico que cuantifiquen el número de células mesenquimáticas en las muestras de médula completa. Por consiguiente, los reactivos de diagnóstico que contengan los anticuerpos monoclonales pueden entonces usarse para identificar pacientes con un número anormalmente bajo de células mesenquimáticas. Un nivel bajo de células mesenquimáticas puede que resulte un indicador de una síntesis ósea anormalmente baja, lo que conduce a la osteoporosis.

Además, las técnicas de diagnóstico que se basan en el uso de anticuerpos monoclonales son también útiles para medir la concentración recogida de médula para un futuro transplante de médula ósea. Un bajo nivel de células mesenquimáticas indicaría una probabilidad reducida de éxito en el transplante de médula ósea porque el estroma de la médula no se desarrollara rápida y completamente sin células mesenquimáticas adecuadas para diferenciarse en células del estroma. Además, los ensayos que permiten distinguir entre células mesenquimáticas derivadas de médula y células hematopoyéticas derivadas de médula pueden usarse también para purificar células mesenquimáticas de la médula completa. Las células purificadas podrían entonces expandirse en cultivo de forma más eficiente y usarse para aumentar la reparación esquelética o para transplante de médula ósea.

Un procedimiento diseñado para demostrar la efectividad de los anticuerpos monoclonales, tales como el anticuerpo monoclonal mesénquimático SH2 producido anteriormente, para distinguir entre células mesenquimáticas derivadas de médula y células mesenquimáticas derivadas de periostio incluiría los siguientes procedimientos definidos en general:

(1)

Tinción por inmunofluorescencia indirecta de las células mesenquimáticas cultivadas y de las células de médula completa en suspensión o en solución.

(2)

Tinción por inmunofluorescencia indirecta de los criocortes de las células mesenquimáticas expandidas en cultivo y de los criocortes de células de médula ósea completa.

(3)

Cuantificación mediante citometría de flujo (o purificación) de las células mesenquimáticas expandidas en cultivo teñidas indirectamente por inmunofluorescencia mezcladas en una suspensión de células de médula completa.

Además, los anticuerpos monoclonales producidos anteriores pueden usarse también para distinguir entre células mesenquimáticas derivadas de médula y células mesenquimáticas derivadas de periostio. Tal distinción sería útil para el desarrollo de un ensayo diagnóstico para cuantificar el número de células mesenquimáticas derivadas de médula en situaciones donde ambos tipos celulares de células mesenquimáticas estuvieran presentes. Por ejemplo, este tipo de ensayo sería útil para determinar la contribución relativa de las células mesenquimáticas derivadas de médula o de las células mesenquimátivas derivadas de periostio al proceso de curación de diversos tipos de fracturas.

Un procedimiento diseñado para demostrar la efectividad de los anticuerpos monoclonales, tales como el anticuerpo monoclonal mesénquimático SH2 producido anteriormente, para distinguir entre células mesenquimáticas derivadas de médula y células hematopoyéticas derivadas de médula incluiría los siguientes procedimientos definidos en general:

(1)

Tinción por inmunofluorescencia indirecta de las células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo de una suspensión que contenga también células mesenquimáticas derivadas de periostio expandidas en cultivo usando el anticuerpo monoclonal SH2.

(2)

Tinción por inmunofluorescencia indirecta de los criocortes de la población mixta de cantidades conocidas de células mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo y de células mesenquimáticas derivadas de periostio expandidas en cultivo.

(3)

Tinción por inmunofluorescencia indirecta del cultivo de células vivas mesenquimáticas derivadas de médula expandidas en cultivo y de células vivas mesenquimáticas derivadas de periostio expandidas en cultivo en un cultivo (en forma de micromasa).

La invención se ha descrito en referencia a una forma de realización preferida. Obviamente, a otros se les ocurrirán modificaciones y alteraciones tras la lectura y entendimiento de la descripción detalla precedente. Se pretende que la invención se interprete incluyendo tales modificaciones y alteraciones en la medida en que estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (12)

1. Un anticuerpo monoclonal que reconoce una célula madre mesenquimática humana que puede diferenciarse en células de más de un tipo de tejido conjuntivo; en el que el anticuerpo es el mismo anticuerpo que se produce a partir de la línea celular de hibridoma SH2, depositada bajo el número de acceso de la ATCC HB 10743, o la línea celular de hibridoma SH3, depositada bajo el número de acceso de la ATCC HB 10744, o la línea celular de hibridoma SH4 depositada bajo el número de acceso de la ATCC HB 10745.

2. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que el hibridoma está depositado bajo el número de acceso de la ATCC HB 10743, HB 10744 o HB 10745.

3. Un procedimiento para recolectar células madre mesenquimáticas humanas a partir de una población celular que contiene células madre mesenquimáticas y otras células, que comprende:

el contacto de la población celular con un anticuerpo según la reivindicación 1 para unir las células madre mesenquimáticas a dicho anticuerpo.

4. Una población aislada homogénea de células madre mesenquimáticas que pueden diferenciarse en células de más de un tipo de tejido conjuntivo que tienen la propiedad de unirse al menos a uno de los anticuerpos monoclonales según la reivindicación 1.

5. Las células madre mesenquimáticas humanas de la reivindicación 4, en las que las células madre mesenquimáticas humanas se unen a cada uno de los anticuerpos según la reivindicación 1.

6. Uso de células madre mesenquimáticas humanas según la reivindicación 4 para producir una composición para el uso en el tratamiento de enfermedades del tejido conjuntivo.

7. Un procedimiento para determinar la presencia de células madre mesenquimáticas humanas en una mezcla de células que comprende:

el contacto de la mezcla de células con un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que une selectivamente las células madre mesenquimáticas humanas; y

la detección de la presencia de dicho anticuerpo.

8. El procedimiento según la reivindicación 7 en el que dichas células madre mesenquimáticas humanas están expandidas en cultivo.

9. Las células madre mesenquimáticas de las reivindicaciones 4 ó 5 en las que uno de dichos tejidos conjuntivos es el óseo.

10. Una composición que comprende las células madre mesenquimáticas humanas de las reivindicaciones 4 ó 5 y un medio de cultivo, en la que dicho medio de cultivo expanda dichas células madre mesenquimáticas.

11. Una composición terapéutica que comprende las células madre mesenquimáticas de las reivindicaciones 4 ó 5 y un vehículo farmacológicamente aceptable, en la que dichas células madre mesenquimáticas estén presentes en una cantidad efectiva para producir células de tejido conjuntivo.

12. La composición terapéutica según la reivindicación 11, en la que dicho tipo de tejido conjuntivo es óseo o cartilaginoso.