ES2285710T3 - Induccion dirigida por linaje de la diferenciacion de celulas madre mesenquimatosas humanas. - Google Patents

Induccion dirigida por linaje de la diferenciacion de celulas madre mesenquimatosas humanas. Download PDF

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Abstract

Método para efectuar la inducción dirigida por linaje de células madre mesenquimatosas humanas cultivadas y aisladas que comprende poner en contacto ex vivo las células madre mesenquimatosas con un factor bioactivo eficaz para inducir la diferenciación in vitro de las mismas en un linaje mesenquimatoso condrogénico.

Description

Inducción dirigida por linaje de la diferenciación de células madre mesenquimatosas humanas.
La presente invención proporciona métodos para dirigir las células madre mesenquimatosas cultivadas in vitro para diferenciarse en rutas de linaje celular específicas antes de, o al tiempo de, su implantación para el tratamiento terapéutico de estados patológicos en seres humanos y otras especies.
Las células madre mesenquimatosas (MSC, "mesenchymal stem cells") son las células de tipo embrionarias o blásticas pluripotentes formadoras encontradas en la médula ósea, sangre, dermis, y periostio que pueden diferenciarse en tipos específicos de tejidos conjuntivos o mesenquimatosos incluyendo los tejidos adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular, y conjuntivo fibroso. La ruta de diferenciación específica que presentan estas células depende de diversas influencias a partir de influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas, y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos huésped. Aunque normalmente estas células están presentes a muy bajas frecuencias en la médula ósea, se informa sobre un procedimiento para aislar, purificar, y extender de manera mitótica la población de estas células en cultivo tisular en Caplan et al. patentes estadounidenses números 5.197.985 y 5.226.914.
En organismos prenatales, la diferenciación de las MSC en células de tejido conjuntivo especializadas está bien establecida; por ejemplo las células mesenquimatosas de protuberancia embriónica de miembros humanas, de ratón o de pollo se diferencian en cartílago, hueso y otros tejidos conjuntivos (1-5). Además, se ha demostrado también que una línea celular clónica de la bóveda craneal de feto de rata se diferencia en músculo, grasa, cartílago y hueso (6). La existencia de las MSC en organismos postnatales no se ha estudiado ampliamente con el objetivo de mostrar la diferenciación de las células postembrionarias en varios fenotipos mesodérmicos. Los pocos estudios que se han realizado implican la formación de hueso y cartílago por las células de la médula ósea tras su recubrimiento en cámaras de difusión y trasplante in vivo (7, 8). Recientemente, se ha demostrado que las células derivadas de la médula ósea de conejos jóvenes (800-1.000 g) forman células adipocíticas y osteogénicas in vivo (9) y se demostró que las células del estroma de la médula ósea clonadas de ratones postnatales forman adipocitos y células osteogénicas (10). De igual manera, las células del periostio de pollo se han aislado, extendido en cultivo y en condiciones de alta densidad in vitro han demostrado que se diferencian en cartílago y hueso (11). Se ha demostrado que las células mesenquimatosas derivadas de la médula ósea de rata tienen la capacidad para diferenciarse en osteoblastos y condrocitos cuando se implantan in vivo (12, 6). Nunca se ha observado que las células de diversas fuentes medulares de organismos postnatales muestren propiedades miogénicas, siendo la apariencia multinuclear la característica más fácilmente reconocible en cultivo.
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para llevar a cabo la inducción dirigida por linaje de las células madre mesenquimatosas humanas extendidas en cultivo, aisladas que comprende poner en contacto las células madre mesenquimatosas ex vivo con un factor bioactivo o combinación de factores eficaces para inducir la diferenciación in vitro del mismo en un linaje mesenquimatoso condrogénico. Las células se ponen en contacto ex vivo con uno o más factores bioactivos en este aspecto, proporcionando así un método libre de cualquier riesgo que puede estar asociado con la administración in vivo de cualquier factor bioactivo.
En otro aspecto, el método de la invención proporciona además administrar a un individuo que lo necesita, células madre mesenquimatosas humanas extendidas en cultivo aisladas y un factor bioactivo eficaz para inducir la diferenciación de tales células en un linaje mesenquimatoso condrogénico. Preferiblemente, las células madre mesenquimatosas y el factor bioactivo se administran juntos o alternativamente pueden administrarse por separado. Particularmente, este aspecto del método comprende administrar un factor bioactivo a un individuo al que se ha administrado, se está administrando o se administrará una preparación que comprende células madre mesenquimatosas humanas autólogas aisladas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para inducir la producción in vivo de citocinas humanas en un individuo que las necesita, que comprende administrar al individuo células madre mesenquimatosas humanas extendidas en cultivo aisladas y un factor bioactivo eficaz para inducir que tales células se diferencien en un descendiente de linaje mesenquimatoso que produce citocina en tal individuo. Preferiblemente, las células madre mesenquimatosas y el factor bioactivo se administran juntos o alternativamente pueden administrarse por separado.
En ejemplos preferidos específicos de estos aspectos, el factor bioactivo es una proteína morfogenética ósea y las MSC humanas se dirigen al linaje condrogénico.
La figura 1 ilustra esquemáticamente el proceso mesengénico por el que las células madre mesenquimatosas se diferencian en diversas rutas de linaje.
La figura 2 ilustra esquemáticamente la ruta de diferenciación osteogénica.
La figura 3 demuestra gráficamente el aumento en la actividad de la fosfatasa alcalina como una función del tiempo en cultivos, en los estudios iniciales notificados en el ejemplo de referencia 1.
La figura 4 muestra resultados de los estudios posteriores notificados en el ejemplo de referencia 1.
La figura 5 ilustra esquemáticamente la ruta de diferenciación condrogénica.
La figura 6 muestra el grado de expresión de citocina de células madre mesenquimatosas humanas, con y sin estimulación por interleucina-1, basándose en los experimentos en el ejemplo de referencia 4.
Las figuras 7A y 7B.
(A) Micrografía de contraste de fase del cultivo vivo de MSC que muestra las células multinucleadas derivadas tras la exposición a 5-aza-CR. Esta micrografía muestra un cultivo 2 semanas después del tratamiento con 5-aza-CR 10 \muM. Pueden observarse muchos núcleos (flechas) en la célula, pero no pueden discernirse las estriaciones.
(B) Micrografía de contraste de fase del cultivo vivo de células de músculo fetal de rata normal preparadas a partir de las extremidades posteriores de fetos de rata de 17 días de edad. Como con miotubos derivados de MSC de la médula ósea, no son aparentes las estriaciones discernibles. Barra de escala 50 \mum.
La figura 8: tinción inmunofluorescente para miosina específica de músculo en miotubos derivados de las MSC de la médula ósea de rata tras la exposición a 5-aza-CR. Los anticuerpos frente a miosina no visualizan estriaciones cruzadas, pero los anticuerpos iluminan claramente fibras longitudinales. Barra de escala 30 \mum.
Las figuras 9A-9D: Miotubos derivados de las MSC de la médula ósea de rata 2 semanas [(A) y (B)] y 5 semanas [(C) y (D)] tras la exposición a 5-aza-CR. Micrografía de contraste de fase [(A) y (C)] y tinción inmunofluorescente para miosina [(B) y (D)]. (A) y (B), (C) y (D) son los mismos campos visuales. Se tiñen miotubos 2 semanas tras la exposición a 5-aza-CR con anticuerpo anti-miosina, pero no los de 5 semanas tras la exposición. Barra de escala 50 \muM.
Las figuras 10A-10B: Micrografía de las MSC tratadas con 5-aza-CR que contienen gotas en su citoplasma; se tiñó este cultivo con negro Sudán. (A) se observaron agrupaciones de adipocitos (flechas); barra de escala 200 \muM. (B) Se tiñeron las gotas de marrón a negro (flechas), lo que sugiere que estas gotas son lípidos; barra de escala 100
\muM.
La figura 11: Micrografía de contraste de fase del cultivo vivo de células miogénicas derivadas de las MSC de la médula ósea de rata tras la exposición a 5-aza-CR. Tras la exposición a 5-aza-CR, se cultivaron estas células con bFGF 4ng/ml durante 10 días. Pueden observarse miotubos grandes; barra de escala 300 \mum.
Las figuras 12A-12D ilustran gráficamente la expresión de G-CSF, GM-CSF, M-CSF y SCF, respectivamente, observada en los experimentos notificados en el ejemplo de referencia 6.
Las figuras 13A-13C ilustran gráficamente la expresión de LIF, IL-6 y IL-11, observadas respectivamente en los experimentos notificados en el ejemplo de referencia 6.
La figura 14 ilustra gráficamente la inducción por IL-1\alpha dependiente de dosis de la expresión de GM-CSF observada en los experimentos notificados en el ejemplo de referencia 6.
Esta invención tiene múltiples usos y ventajas. La primera radica en la capacidad para dirigir y acelerar la diferenciación de MSC antes de implantarse de nuevo en huéspedes autólogos. Por ejemplo, las MSC que se dirigen in vitro para convertirse en células osteogénicas sintetizarán la matriz ósea en un sitio de implante más rápida y uniformemente que las MSC que deben reclutarse en primer lugar en el linaje y después progresar a través de las etapas claves de diferenciación. Un tratamiento ex vivo de este tipo también proporciona aplicación uniforme y controlada de factores bioactivos a las MSC purificadas, conduciendo al compromiso y diferenciación uniforme del linaje. No puede asegurarse o controlarse tan fácilmente la disponibilidad in vivo de los factores bioactivos endógenos. Una etapa de pretratamiento tal como se describe en el presente documento salva esto. Además, pretratando las MSC antes de su implantación se evitan efectos secundarios potencialmente dañinos asociados con la administración sistémica o local de factores bioactivos exógenos. Otro uso de esta técnica radica en la capacidad para dirigir la regeneración tisular basándose en la etapa de diferenciación en la que las células están en el momento de implantación. Es decir, con respecto a hueso y cartílago, el estado de las células en la implantación puede controlar el tipo de tejido final formado. Los condrocitos hipertróficos mineralizarán su matriz y finalmente allanarán el camino para la invasión vascular, que finalmente dará como resultado la formación ósea nueva. Claramente, las MSC implantadas con el fin de restaurar el cartílago hialino normal no deben evolucionar a lo largo del linaje entero. Sin embargo, los implantes que se diseñan para reparar defectos de superficie articulares y el hueso subcondral subyacente pueden beneficiarse de un sistema de dos componentes en el que las células en la zona del futuro hueso están dirigidas ex vivo para convertirse en condrocitos hipertróficos, mientras que las células en la zona de la futura superficie de articulación están dirigidas sólo para convertirse en condroblastos. En la zona de la reconstitución del estroma, el control ex vivo de la diferenciación puede optimizar poblaciones de células MSC para la elaboración de citocinas específicas de fase requeridas para las necesidades del individuo. De manera similar puede dirigirse la morfogénesis muscular para crear fibras de contracción nerviosa rápida o lenta, dependiendo de la indicación.
Aislamiento y purificación de células madre mesenquimatosas humanas
Las células madre mesenquimatosas humanas aisladas y purificadas tal como se describe en el presente documento pueden derivarse de, por ejemplo, la médula ósea, sangre, dermis o periostio. Cuando se obtienen a partir de la médula ósea esta puede ser médula de una variedad de fuentes diferentes, incluyendo tapones de piezas de hueso trabecular de cabeza femoral, obtenidos de pacientes con enfermedad degenerativa de las articulaciones durante cirugía de sustitución de cadera o rodilla, o a partir de la médula aspirada obtenida de donantes normales y pacientes oncológicos que han recogido médula para futuros trasplantes de médula ósea. La médula recogida se prepara entonces para el cultivo celular. El proceso de aislamiento implica el uso de un medio especialmente preparado que contiene agentes que permiten no sólo el crecimiento de células madre mesenquimatosas sin diferenciación, sino también la adherencia directa sólo de las células madre mesenquimatosas a la superficie de plástico o vidrio del recipiente de cultivo. Creando un medio que permite la unión selectiva de las células madre mesenquimatosas deseadas que estaban presentes en las muestras de tejido mesenquimatosos en cantidades muy pequeñas, entonces fue posible separar las células madre mesenquimatosas de las otras células (es decir, glóbulos rojos y blancos, otras células mesenquimatosas diferenciadas, etc.) presentes en el tejido mesenquimatoso de origen.
La médula ósea es el tejido blando que ocupa las cavidades medulares de huesos largos, algunos canales harvesianos, y espacios entre trabéculas del hueso trabecular o esponjoso. La médula ósea es de dos tipos: roja, que se encuentra en todos los huesos en la vida temprana y en localizaciones restringidas en la vida adulta (es decir, en el hueso esponjoso) y está relacionada con la producción de células sanguíneas (es decir, hematopoyesis) y hemoglobina (por tanto, el color rojo); y amarilla, que consiste en su mayor parte en células grasas (por tanto, el color amarillo) y tejido conjuntivo.
Como un total, la médula ósea es un tejido complejo comprendido por células hematopoyéticas, incluyendo las células madre hematopoyéticas, y los glóbulos rojos y blancos y sus precursores; y un grupo de células incluyendo las células madre mesenquimatosas, fibroblastos, reticulocitos, adipocitos, y células endoteliales que contribuyen a la red del tejido conjuntivo denominado "estroma". Las células del estroma regulan la diferenciación de las células hematopoyéticas mediante interacción directa por medio de proteínas de superficie celular y la secreción de factores de crecimiento y están implicadas en la fundación y soporte de la estructura ósea. Los estudios que usan modelos animales han sugerido que la médula ósea contiene células "pre-estromales" que tienen la capacidad para diferenciarse en cartílago, hueso y otras células del tejido conjuntivo. (Beresford, J.N.: Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow, Clin. Orthop., 240:270, 1989). Pruebas recientes indican que estas células, denominadas células madre mesenquimatosas o células madre estromales pluripotentes, tienen la capacidad para generarse en diferentes tipos de líneas celulares (es decir, osteocitos, condrocitos, adipocitos, etc.) en la activación, dependiendo de la influencia de una variedad de factores bioactivos. Sin embargo, las células madre mesenquimatosas están presentes en el tejido en cantidades muy pequeñas con una amplia variedad de otras células (es decir, eritrocitos, plaquetas, neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos, basófilos, adipocitos, etc.).
Como resultado, se ha desarrollado un procedimiento para aislar y purificar células madre mesenquimatosas humanas a partir de tejido antes de la diferenciación y después extender el cultivo de las células madre mesenquimatosas para producir una herramienta valiosa para el tratamiento musculoesquelético. El objetivo de tal manipulación es aumentar enormemente el número de células madre mesenquimatosas y utilizar estas células para redirigir y/o reforzar la capacidad reparadora normal del cuerpo. Las células madre mesenquimatosas se extienden hasta números elevados y se aplican a zonas de daño de tejido conjuntivo para potenciar o estimular el crecimiento in vivo para regenerar y/o reparar, para mejorar la adhesión del implante a diversos dispositivos protésicos mediante activación y diferenciación posterior, o aumentar la producción de células hematopoyéticas, etc.
Con estas líneas, se contemplan diversos procedimientos para transferir, inmovilizar, y activar las células madre mesenquimatosas purificadas, extendidas en cultivo, en el sitio de reparación, implantación, etc., incluyendo inyectar las células en el sitio de un defecto esquelético, incubar las células con una prótesis e implantar la prótesis, etc. Por tanto, aislando, purificando y extendiendo enormemente el número de células antes de la diferenciación y después controlando de manera activa el proceso de diferenciación en virtud de su posicionamiento en el sitio de daño tisular o pretratando in vitro antes de su trasplante, las células madre mesenquimatosas extendidas en cultivo pueden utilizarse para diversos fines terapéuticos tales como para paliar trastornos celulares, moleculares y genéticos en un amplio número de enfermedades óseas metabólicas, displasias esqueléticas, defectos de cartílago, lesiones en ligamento y tendón y otros trastornos del tejido conjuntivo y musculoesquelético.
Se han preparado varios medios que son particularmente adecuados para la unión selectiva deseada y se denominan en el presente documento como "medios completos" cuando se complementan con suero tal como se describe más adelante. Un medio de este tipo es una versión aumentada del medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa (DMEM-LG), que se conoce bien y está disponible fácilmente en el comercio.
La formulación comercial se complementa con 3700 mg/l de bicarbonato de sodio y 10 ml/l de 100x antibiótico-antimicótico que contiene 10.000 unidades de penicilina (base), 10.000 \mug de estreptomicina (base) y 25 \mug de anfotericina B/ml utilizando penicilina G (sal de sodio), sulfato de estreptomicina, y anfotericina B como FUNGIZONE® en solución salina al 0,85%.
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El medio descrito anteriormente se prepara y almacena en botellas de 100 ml para 90 ml o de 500 ml para 450 ml a 4ºC hasta que estén listas para usarse. Para su uso, se añaden a las botellas de medio 10 ml o 50 ml de suero bovino fetal (de lotes seleccionados) para dar un volumen final de suero al 10%. Se calienta el medio hasta 37ºC antes de usarlo.
Con respecto a esto, también se encontró que el medio BGJ_{b} (Gibco, Grand Island, NY) con lotes sometidos a prueba y seleccionados de suero bovino fetal al 10% (J.R. Scientific, Woodland, CA, u otros suministradores) era muy adecuado para su uso en la invención. Este medio, que también era un "medio completo", contenía factores que también estimularon el crecimiento de las células madre mesenquimatosas sin diferenciación y permitieron la unión selectiva mediante sitios de unión a proteína específicos, etc. sólo de las células madre mesenquimatosas a las superficies plásticas de las placas Petri.
Además, se encontró que el medio F-12 Nutrient Mixture (Ham) (Gibco, Grand Island, NY) presentaba las propiedades deseadas para la separación selectiva de células madre mesenquimatosas.
Tal como se indicó anteriormente, el medio completo puede utilizarse en una variedad de procedimientos de aislamiento diferentes dependiendo del tipo específico de procedimientos de cultivo inicial usados con el fin de preparar la médula ósea cultivada para la separación de cultivo celular. Con respecto a esto, cuando se utilizaron tapones de médula ósea trabecular, se añadió la médula al medio completo y se agitaron con vórtex para formar una dispersión que se centrifugó después para separar las células de la médula de las piezas óseas, etc. Se disociaron entonces las células de médula (que consistían predominantemente en glóbulos rojos y blancos, y una cantidad muy pequeña de células madre mesenquimatosas, etc.) en células sencillas haciendo pasar secuencialmente el medio completo que contenía las células de médula a través de jeringas acopladas con una serie de agujas de calibre 16, 18, y 20. Se cree que la ventaja producida mediante la utilización del procedimiento de separación mecánica, al contrario que cualquier procedimiento de separación enzimática, fue que el procedimiento mecánico produjo poco cambio celular mientras que un procedimiento enzimático podría provocar daño celular particularmente a los sitios de unión a proteína necesarios para adherencia de cultivo y separación selectiva, y/o a los sitios proteicos necesarios para la producción de anticuerpos monoclonales específicos para dichas células madre mesenquimatosas. Entonces, la suspensión de células sencillas (que estaba formada por aproximadamente 50-100 x 10^{6} células nucleadas) se sembró en placa posteriormente en placas de 100 mm con el fin de separar selectivamente y/o aislar las células madre mesenquimatosas de las células restantes encontradas en la suspensión.
Cuando se utilizó médula aspirada como fuente de las células madre mesenquimatosas humanas, se añadieron las células madre de la médula (que contenía poco o nada de astillas óseas pero una buena cantidad de sangre) al medio completo y se fraccionaron con gradientes de Percoll (Sigma, St. Louis, MO) descritos más particularmente a continuación en el ejemplo de referencia 1. Los gradientes de Percoll separaron un gran porcentaje de los glóbulos rojos y las células hematopoyéticas mononucleadas de la fracción plaquetaria de baja densidad que contenía las células madre mesenquimatosas derivadas de la médula. Con respecto a esto, la fracción plaquetaria, que contenía aproximadamente de 30-50 x 10^{6} células estaba formada por una cantidad indeterminada de plaquetas, 30-50 x 10^{6} células nucleadas, y sólo aproximadamente 50-500 células madre mesenquimatosas dependiendo de la edad del donante de médula. Entonces, la fracción plaquetaria de baja densidad se sembró en placa en la placa Petri para la separación selectiva basándose en la adherencia celular.
Con respecto a esto, las células de medula obtenidas o bien del hueso trabecular o bien del aspirado ilíaco (es decir, los cultivos primarios) se hicieron crecer en medio completo y se dejaron que se adhiriesen a la superficie de las placas Petri durante de uno a siete días según las condiciones expuestas en el ejemplo de referencia 1 a continuación. Dado que se observó la unión celular mínima después del tercer día, se eligió 3 días como el periodo de tiempo habitual en el que las células no adherentes se eliminaron de los cultivos sustituyendo el medio completo original con medio completo nuevo. Se realizaron cambios de medio posteriores cada cuatro días hasta que las placas de cultivo se volvieron confluentes que normalmente requiere de 14-21 días. Esto representó un aumento de 10^{3}-10^{4} veces en el número de células madre mesenquimatosas humanas no diferenciadas.
Se separaron entonces las células de las placas de cultivo utilizando un agente liberador tal como tripsina con EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) (tripsina al 0,25%, EDTA (1X) 1 mM, Gibco, Grand Island, NY). El agente liberador se inactivó entonces y las células madre mesenquimatosas no diferenciadas cultivadas, separadas se lavaron con medio completo para su uso posterior.
La capacidad de estas células no diferenciadas para introducirse en rutas de linaje discretas se denomina como el proceso mesengénico, y se representa esquemáticamente en la figura 1. En el proceso mesengénico, se reclutan las MSC para introducirse en rutas de linaje de múltiples etapas específicas que producen finalmente tejidos funcionalmente diferenciados tales como hueso, cartílago, tendón, músculo, dermis, estroma de la médula ósea, y otros tejidos conjuntivos mesenquimatosos. Por ejemplo, en la figura 2 se presenta un esquema detallado de la ruta de diferenciación de células que forman hueso. Este mapa de linaje implica la existencia de elementos controladores individuales que reclutan las MSC en el linaje osteogénico, promueven la replicación de pre-osteoblasto, y dirigen la diferenciación paso a paso todo el camino hacia el osteocito de fase terminal. Se ha notificado que el trabajo sustancial soporta el punto de vista de que cada etapa de esta ruta compleja está controlada por diferentes factores
bioactivos.
Se ha desarrollado un diagrama de linaje similar para la diferenciación de condrocitos y se proporciona en la figura 5. De nuevo, la evolución de cada etapa de linaje está bajo el control de factores bioactivos únicos incluyendo, pero sin limitarse a, la familia de proteínas morfogenéticas óseas. Cada modulador del proceso de diferenciación, ya sea en hueso, cartílago, músculo o cualquier otro tejido mesenquimatoso, puede afectar la tasa de evolución de linaje y/o puede afectar específicamente las etapas individuales a lo largo de la ruta. Es decir, si una célula está comprometida de manera incipiente a un linaje específico, que esté en un estado biosintéticamente activo, o evolucione hasta un fenotipo de fase final dependerá de la variedad y momento de actuación de los factores bioactivos en el entorno
local.
Se determinaron los potenciales de linaje de cartílago y óseo (es decir potencial osteocondrogénico) de las células madre mesenquimatosas humanas nuevas y extendidas usando dos ensayos in vivo diferentes en ratones desnudos. Un ensayo implicaba la implantación subcutánea de cerámica porosa de fosfato de calcio cargada con células madre mesenquimatosas cultivadas; el otro implicaba la implantación peritoneal de cámaras de difusión inoculadas con células madre mesenquimatosas cultivadas. También se analizaron las fracciones de médula completa y de aspirado separado por gradiente de Percoll en estos ensayos in vivo. La evaluación histológica mostró la formación ósea y de cartílago en la cerámica implantada con las células madre mesenquimatosas cultivadas derivadas de la cabeza femoral y la cresta ilíaca. La cerámica cargada con células madre mesenquimatosas humanas a 5 x 10^{6} células/ml formaron hueso dentro de los poros, mientras que la cerámica cargada con células madre mesenquimatosas humanas a 10 x 10^{6} células/ml formaron cartílago dentro de los poros. Aunque ahora se ha demostrado que la médula completa forma hueso cuando se coloca como un injerto compuesto con cerámica en un sitio subcutáneo en ratones desnudos, la cantidad de hueso producida es sustancialmente inferior que la observada cuando se usan células madre mesenquimatosas derivadas de médula extendidas en cultivo.
Estos resultados indican que en ciertas condiciones, las células madre mesenquimatosas extendidas en cultivo tienen la capacidad para diferenciarse en hueso o cartílago cuando se incuban como un injerto en cerámica porosa de fosfato de calcio. Los factores ambientales que influyen sobre las células madre mesenquimatosas para diferenciarse en células óseas o de cartílago parece, en parte, ser la accesibilidad directa de las células madre mesenquimatosas para factores de crecimiento y de nutrición suministrados por la vasculatura en la cerámica porosa de fosfato de calcio; las células que están íntimamente asociadas con la vasculatura se diferencian en células óseas mientras que las células que se aíslan de la vasculatura se diferencian en células de cartílago. La exclusión de la vasculatura de los poros de cerámica cargada con células madre mesenquimatosas humanas concentradas evitó la diferenciación osteogénica y proporcionó condiciones permisivas para la condrogénesis.
Como resultado, las células madre mesenquimatosas aisladas y extendidas en cultivo pueden utilizarse en ciertas condiciones específicas y/o bajo la influencia de ciertos factores, para diferenciarse y producir el fenotipo celular necesario para la reparación o regeneración del tejido conjuntivo y/o para la implantación de diversos dispositivos de prótesis. Por ejemplo, usando cubos de cerámica porosa rellenados con células madre mesenquimatosas humanas extendidas en cultivo, se ha generado la formación de hueso dentro de los poros de la cerámica tras las incubaciones subcutáneas en huéspedes inmunocompatibles. En un estudio reciente (13), se usó la médula de rata en un injerto compuesto con cerámica porosa para rellenar un defecto segmental en el fémur de la rata. Se demostró que el hueso rellenó los poros de la cerámica y fijaba el injerto cerámica-médula al hueso huésped.
Los factores que estimulan la osteogénesis (es decir son osteoinductores) de las células madre mesenquimatosas humanas aisladas están presentes en varias clases de moléculas, incluyendo las siguientes: proteínas morfogénicas óseas, tales como BMP-2 (14) y BMP-3 (15); factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF); glucocorticoides, tales como dexametasona (16); y prostaglandinas, tales como prostaglandina E1 (22). Además, el ácido ascórbico y sus análogos, tales como ácido ascórbico 2-fosfato (17) y fosfatos de glicerol, tales como \beta-glicerofosfato (18), son factores complementarios eficaces para la diferenciación avanzada, aunque solos no inducen la diferenciación osteogénica.
Los factores que tienen actividad condroinductora sobre las MSC humanas también están presentes en diversas clases de moléculas, incluyendo las siguientes: compuestos dentro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-\beta(TGF-\beta), tales como (i) TGF-\beta1 (19), (ii) inhibina A (20), (iii) factor de la actividad estimuladora de la condrogénesis (CSA) (21) y (iv) proteínas morfogénicas óseas, tales como BMP-4 (22); moléculas de matriz extracelular de colágeno, incluyendo colágeno de tipo I, particularmente como un gel (23); y análogos de vitamina A, tales como ácido retinoico (24).
Los factores que tienen actividad inductora de la estromagénesis sobre las MSC humanas también están presentes en varias clases de moléculas, especialmente las interleucinas, tales como IL-1\alpha (25) y IL-2 (26).
Los factores que tienen actividad inductora de la miogénesis sobre las MSC humanas también están presentes en varias clases de moléculas, especialmente análogos de citidina, tales como 5-azacitidina y 5-aza-2'-desoxicitidina.
El efecto de estos factores modulantes sobre las MSC humanas se describe por primera vez en el presente documento. Esto no pretende ser un listado total de factores modulantes potencialmente útiles para inducir la diferenciación en un linaje particular, pero ilustra la variedad de compuestos que tienen actividad biológica útil con el fin de promover la evolución paso a paso de la diferenciación de células madre mesenquimatosas humanas aisladas.
Ejemplo de referencia 1
Diferenciación osteogénica inducida de las MSC in vitro
El objetivo de los experimentos descritos en este ejemplo era demostrar que las células madre mesenquimatosas (MSC) se dirigieron a lo largo de la ruta de linaje osteogénico in vitro proporcionando factores bioactivos apropiados en el medio de cultivo tisular. Este conjunto de experimentos ilustra sólo un ejemplo de cómo las MSC pueden dirigirse a lo largo del linaje osteogénico.
Estudio inicial
Se cultivaron y se aislaron MSC humanas a partir de la médula ósea tal como se describió anteriormente. Estas células se extendieron en cultivo en medio DMEM-LG que contenía suero bovino fetal al 10% preseleccionado (medio completo). Se sustituyó el medio completo nuevo cada 3-4 días hasta que los cultivos estuvieron cerca de la confluencia, tiempo en el que se liberaron las células de las placas con tripsina, y se volvieron a sembrar en placas nuevas a aproximadamente el 40% de confluencia (400.000 células por 100 mm de placa). Se dejó que estas MSC sembradas de nuevo en placa se unieran durante la noche, tras lo cual se sustituyó el medio completo por un medio compuesto por DMEM-LG, suero bovino fetal al 10%, y o bien dexametasona 100 nM sola, o bien dexametasona 100 nM con ácido ascórbico 2-fosfato 50 \muM, y \beta-glicerofosfato 10 mM (complemento osteogénico). Se sustituyó el complemento osteogénico cada 3 días. Se examinaron las células diariamente para detectar cambios morfológicos. Se analizaron entonces placas seleccionadas para detectar la actividad de la fosfatasa alcalina (FA) en la superficie celular, un marcador de células que se ha introducido en el linaje osteogénico. Son estas células las que fueron posteriormente responsables de sintetizar la matriz osteoide. Se usaron reactivos histoquímicos enzimáticos y bioquímicos habituales para demostrar la actividad de esta proteína de superficie celular. Se evaluaron especimenes adicionales para determinar la presencia de nódulos de matriz extracelular mineralizados que se correlacionan con la diferenciación continuada y la expresión de fenotipo de una población de osteoblastos maduros. Se consiguió la precipitación con nitrato de plata sobre cristales de fosfato de calcio dentro del nódulo óseo mediante la técnica de tinción Von Kossa habitual.
Los resultados indican que tras sólo tres días de exposición a dexametasona, las MSC en cultivo ya habían empezado a expresar la fosfatasa alcalina en su superficie. En el día seis de cultivo, aproximadamente el 80% de las células eran positivas en FA. La organización macroscópica de la placa de cultivo había cambiado desde espirales casi confluentes de células de tipo fibroblasto el día 1, hasta numerosas zonas de células poligonales que estaban apiladas unas encima de otras. El día 9, muchos nódulos pequeños de matriz extracelular birrefringente se asociaron con estos focos de células poligonales en capas. Estas zonas se tiñeron positivamente mediante el método de Von Kossun para detectar mineral. Los cultivos control alimentados sólo por medio completo nunca desarrollaron estos nódulos óseos mineralizados, y sólo pocas veces contenían células positivas en FA. Por el contrario, las MSC tratadas con complemento osteogénico adquirieron uniformemente actividad de la FA y sintetizaron nódulos de matriz extracelular mineralizados por toda la placa. Aunque no son ellos mismos osteoinductores, la presencia de ácido ascórbico 2-fosfato y \beta-glicerofosfato en el complemento osteogénico completo soporta además la maduración de la matriz extracelular y la deposición mineral, respectivamente. La figura 3 demuestra gráficamente el aumento de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina como una función del tiempo en cultivo. En el día 8 y en adelante, se observa sustancialmente más actividad
enzimática en las células expuestas a complementos osteogénicos (CO) que las cultivadas con medio de control.
Considerados de manera conjunta, estos estudios demuestran que las MSC pueden estimularse rápida y uniformemente para diferenciarse a lo largo del linaje osteogénico in vitro. Además, no sólo se reclutan las MSC en las etapas tempranas dentro del linaje, demostrado por la expresión de la FA, sino que las MSC evolucionan a través del linaje para convertirse en osteoblastos maduros que secretan y mineralizan una matriz extracelular de tipo óseo. Una prueba adicional para esto procede de la observación de que cuando se tratan las MSC de pollo con complemento osteogénico, evolucionan a través de las fases del linaje osteogénico representado en la figura 2 como se determina mediante la tinción de anticuerpo monoclonal frente a antígenos de superficie celular específicos de fase.
Estudio posterior
Usando técnicas publicadas, se purificaron las MSC de 3 pacientes diferentes (edades 26-47), se extendieron en cultivo (27), y se sembraron durante la noche en placas de cultivo de 48 pocillos al 20% de confluencia en DMEM-LG con FBS al 10% de lotes seleccionados. Medios básicos para la comparación fueron DMEM-LG, BGJ_{b}, \alphaMEM, y DMEM/F-12 (1:1). Se hicieron crecer los cultivos por triplicado para cada ensayo en FBS al 10% en ausencia o presencia de "complementos osteogénicos" (CO) (dexametasona 100 nM, ácido ascórbico 2-fosfato 50 \muM, y \beta-glicerofosfato 10 mM (28). Se cambiaron los medios cada 3 días. Se sometió a ensayo cada conjunto de cultivos para determinar el número de células mediante el ensayo de cristal violeta, la fosfatasa alcalina de superficie celular (FA) mediante histoquímica y la formación de nódulos mineralizados mediante la tinción Von Kossa. Se calculó la actividad de la enzima FA incubando cultivos vivos con p-nitrofenilfosfato 5 mM en Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 9,0 y cuantificando la reacción colorimétrica explorando las muestras a 405 nm en un lector de placas ELISA. Se expresó la actividad enzimática de la FA como nanomoles de producto/minuto/10^{3} células. Se determinó el porcentaje de células positivas en FA en cada pocillo a partir de los cultivos teñidos, y se contó el número de nódulos mineralizados por pocillo. Se realizaron los ensayos cada 4 días durante el periodo de cultivo de 16 días. Se realizó la prueba de la t de dos muestras apareadas sobre muestras seleccionadas. Los datos en la figura 4 representan un paciente, aunque se obtuvieron resultados similares para todos los especimenes.
Las MSC unidas uniformemente a las placas, asumieron su morfología fusiforme característica, y proliferaron para alcanzar la confluencia en un plazo de 8 días. Durante este periodo, y particularmente más allá, las células tratadas con CO desarrollaron una morfología cuboidal a medida que aumentaba su densidad, formando múltiples capas. Para aclarar, en la figura 4 sólo se representan gráficamente los aspectos seleccionados de los parámetros descritos anteriormente. Todos los especimenes que se hicieron crecer en BGJb + CO murieron en un plazo de 3 días, mientras que los cultivos BGJb sobrevivieron durante la duración del protocolo. Por esta razón, se omitieron todos los datos de BGJb de las gráficas. Lo más destacado del estudio demuestra una proliferación sustancialmente superior en \alphaMEM comparado con DMEM/F-12 o DMEM sólo (es decir, p<0,01 y p<0,05 en el día 16). La adición de CO a cultivos \alphaMEM inhibió la proliferación en los días 8 y 12 (p<0,04 y p<0,03), pero no en el día 16 (p>0,05). \alphaMEM + CO también estimula que una proporción significativa de células exprese FA sobre su superficie cuando se compara con las MSC mantenidas en DMEM (p<0,02 en el día 8, p<0,01 en el día 16). Sin embargo, no se observa diferencia significativa en el porcentaje de células FA entre \alphaMEM con y sin CO (p>0,2 en el día 8, p>0,05 en el día 16). De manera notable, \alphaMEM + CO induce mayor actividad de la FA que cualquier otro medio a lo largo del periodo de cultivo, incluyendo \alphaMEM o DMEM (es decir, p<0,004 y p<0,002 en el día 16). Sin embargo, no hubo diferencia en la actividad de la FA entre \alphaMEM y DMEM + CO a lo largo del periodo de estudio (es decir, p>0,2 en el día 16). De todos los medios sometidos a prueba, el mayor número de nódulos mineralizados en el día 16 es en DMEM + CO (p<0,02 comparado con DMEM).
Estas investigaciones demuestran que las MSC humanas extendidas en cultivo, purificadas pueden inducirse en el linaje osteogénico in vitro, estableciendo así un modelo para la diferenciación de osteoblastos humano. Pronto en el periodo de cultivo (día 8) sólo \alphaMEM + CO indujo reclutamiento osteoblástico sustancial de las MSC (>50%), tal como se observa mediante la tinción de superficie celular de la FA. En el día 16, sin embargo, todos los cultivos excepto DMEM contenían el >60% de células teñidas con la FA. En todos los medios estudiados, la adición de CO da mayor actividad de la FA más allá de los 4 días. Aunque un gran porcentaje de células en la mayoría de los medios estaban teñidas con la FA en el día 16, las diferencias sustanciales en el ensayo de actividad de la FA es probable que reflejen la cantidad de enzima sobre la superficie celular, y por tanto, el grado de evolución en el linaje osteoblástico. En el mejor de los casos, los CO pueden regular por incremento la expresión de este marcador de superficie de células osteoblásticas. De manera interesante, a pesar de la actividad de la FA inferior, las células en DMEM + CO generaron más nódulos mineralizados que en \alphaMEM + CO. Esta observación puede sugerir que dentro del periodo de cultivo de 16 días, DMEM + CO soporta más diferenciación osteogénica de las MSC que \alphaMEM + CO. Es posible que, teniendo más tiempo, \alphaMEM + CO acogería incluso más focos mineralizados que DMEM + CO. Las diferencias en los medios que favorecen el mantenimiento del fenotipo de MSC (DMEM) demostradas por inmunotinción específica de MSC, o reclutamiento máximo e inducción en el linaje osteogénico (\alphaMEM + CO), observadas por el porcentaje de células positivas en FA y actividad de la FA, son intrínsecamente interesantes y garantizan la examinación adicional. El uso de diversos anticuerpos monoclonales y policlonales frente a componentes de matriz y celulares específicos durante este fenómeno inductor está actualmente en marcha, y proporcionará mejor comprensión en la naturaleza molecular del proceso de diferenciación in vitro.
Ejemplo de referencia 2
La generación de anticuerpos monoclonales frente a células osteogénicas humanas revela la formación de hueso embrionario in vivo y la diferenciación de células madre mesenquimatosas purificadas in vitro
Se ha establecido bien que las células progenitoras mesenquimatosas derivadas de la médula ósea pueden diferenciarse en osteoblastos. Además, estas células madre mesenquimatosas (MSC) también dan lugar a cartílago, tendón, ligamento, músculo, y otros tejidos. Sin embargo, se ha restringido el conocimiento de las etapas implicadas en el compromiso y la diferenciación de las MSC a lo largo de estos diversos linajes, en parte, por la falta de sondas específicas para células en las diversas fases dentro de las rutas osteogénicas u otras de diferenciación. Dado que los anticuerpos monoclonales son sondas útiles para estudiar la diferenciación, se inmunizaron ratones con preparaciones de células vivas intactas de las MSC derivadas de la médula ósea humana inducidas en el linaje osteogénico in vitro. Se detectaron colonias de hibridomas frente a las MSC purificadas, las MSC que experimentaron diferenciación osteogénica, y secciones congeladas de extremidades humanas embrionarias en las que los huesos largos se están desarrollando alrededor del rudimento de cartílago. Este protocolo de detección favorece la selección de anticuerpos que reaccionan con las MSC que experimentan diferenciación in vitro y las células osteogénicas humanas in vivo. Usando este enfoque, se han generado anticuerpos monoclonales frente a antígenos de superficie específicos de fase sobre células osteogénicas derivadas de las MSC de la médula humana.
Usando técnicas publicadas, se purificaron las MSC de 5 pacientes diferentes (edades 28-46), se extendieron en cultivo (29), y se hicieron crecer en DMEM-LG con FBS al 10% y "complementos osteogénicos" (dexametasona 100 nM, ácido ascórbico 2-fosfato 50 \muM, y \beta-glicerofosfato 10 mM (28). En los días 3 y 6 de cultivo, pronto durante la expresión de la fosfatasa alcalina, y antes de la formación de nódulos mineralizados (30), se liberaron las células de las placas con EGTA 5 mM. Se combinaron aproximadamente 4 millones de células de 3 y 6 días para cada una de las cinco inmunizaciones semanales en ratones Balbc/J. Usando técnicas habituales, se produjeron hibridomas monoclonales, y se detectaron los sobrenadantes de cultivo mediante un ELISA semicuantitativo frente a las MSC purificadas, y las MSC cultivadas durante 3 ó 6 días con complementos osteogénicos. En resumen, se sembraron en placa las MSC en placas de cultivo de 96 pocillos, se expusieron a complementos osteogénicos, y después se hicieron reaccionar con sobrenadantes de cultivo seguido por IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano. Se aclaró el anticuerpo secundario, y se añadió el sustrato o-fenilendiamina a las placas. Se evaluó la unión del anticuerpo monoclonal de ratón primario mediante la reacción colorimétrica cuantificada mediante exploración de los pocillos a 490 nm en un lector de placas ELISA. Se seleccionaron las colonias de interés basándose en la unión diferencial para controlar las MSC y células osteogénicas derivadas de las MSC. Se detectaron adicionalmente las colonias seleccionadas mediante inmunofluorescencia sobre las secciones congeladas no fijadas de extremidades embrionarias humanas. Se clonaron las colonias de hibridoma de interés y se realizaron análisis inmunocitoquímicos adicionales en una variedad de tejidos normales y derivados experimentalmente a partir de fuentes de ser humano, de rata, de conejo, de pollo y bovina.
Se detectaron casi 10.000 colonias de hibridoma mediante el protocolo ELISA modificado descrito anteriormente. Basándose en la unión diferencial a las MSC purificadas, o a las MSC cultivadas durante 3 y 6 días con complementos osteogénicos, se seleccionaron 224 colonias para la detección inmunofluorescente frente a extremidades embrionarias humanas de 55-60 días. La mayoría de esas 224 colonias o bien reaccionaron con múltiples tipos de tejidos presentes en la extremidad que se está desarrollando o bien no se detectaron en el hueso en desarrollo. Hasta aquí, se han identificado 9 colonias que demuestran la inmunorreactividad específica en células del linaje osteogénico. Los patrones de reactividad varían; algunos sobrenadantes de hibridoma reaccionan con una gran población de células dentro del collar osteogénico y periostio que contiene el osteoprogenitor, mientras que otros reaccionan sólo con aquellas células que parecen estar activamente implicadas en la síntesis de matriz. Parece que dos colonias de hibridoma reaccionan con las células osteogénicas así como con condrocitos hipertróficos. Los resultados se resumen en la tabla 1.
TABLA 1
1
La tabla 1 muestra la inmunorreactividad de colonias de hibridoma seleccionadas frente a las MSC sin tratar, o las MSC cultivadas con complementos osteogénicos (CO) durante 3 ó 6 días. Los números indican la cantidad relativa de anticuerpo unido en el ensayo ELISA descrito anteriormente.
Estas investigaciones indican la presencia de marcadores de la diferenciación de superficie celular específica de fase de linaje osteogénico humano similar a los detallados para células osteogénicas aviares (31). La tinción de células osteogénicas en las extremidades en desarrollo soporta la opinión de que las MSC cultivadas con complementos osteogénicos se convierten en osteoblastos "auténticos" en cultivo. Se confirma así la diferenciación osteogénica in vitro mediante sondas moleculares que se extienden más allá de los criterios tradicionales de expresión de la FA y la formación de nódulos mineralizados. La correlación de las observaciones in vitro detalladas con los análisis in vivo de la expresión antigénica será útil en estudios adicionales de osteogénesis. La caracterización de los elementos de cultivo tisular específicos, es decir, los factores bioactivos, que promueven la evolución de las células a través de las etapas del linaje osteogénico será crucial. La identificación de la superficie de células osteogénicas, y/o de los antígenos de matriz extracelular debe proporcionar una mejor comprensión en la fisiología de células óseas. Estos y otros anticuerpos monoclonales actualmente investigados resultarán útiles en estudios futuros de diferenciación de MSC.
Ejemplo 3 Diferenciación condrogénica inducida de las MSC in vitro
El objetivo de la experimentación descrita en este ejemplo fue demostrar que las células madre mesenquimatosas (MSC) se dirigieron a lo largo de la ruta de linaje condrogénico in vitro proporcionando factores bioactivos apropiados en el medio de cultivo tisular. Este conjunto de experimentos representa sólo un ejemplo de cómo las MSC pueden dirigirse a lo largo del linaje condrogénico. Se cultivaron las MSC humanas y se aislaron a partir de la médula ósea tal como se describió anteriormente. Se extendieron en cultivo las células en medio DMEM-LG que contenía suero bovino fetal al 10% seleccionado previamente (medio completo). Se sustituyó el medio nuevo cada 3-4 días hasta que los cultivo estuvieron próximos a la confluencia, momento en el que se liberaron las células de las placas con tripsina, y se volvieron a sembrar en placas nuevas a aproximadamente el 50% de confluencia (500.000 células por placa de 10 mm). Se dejó que estas MSC sembradas de nuevo en placa se unieran durante la noche, tras lo cual se sustituyó el medio completo por DMEM-LG con suero bovino fetal al 10%, y 5 mg/ml de proteína morfogénica ósea parcialmente purificada (complemento condrogénico), suministrado por Dr. Marshall R. Urist. Se sustituyó este complemento condrogénico cada 3 días. Se examinaron las células diariamente para detectar cambios morfológicos. Entonces se analizaron inmunohistoquímicamente las placas seleccionadas para detectar CSPG-M, un marcador para células que se han introducido en el linaje condrogénico. Son estas células las que actuaron entonces para sintetizar la matriz de colágeno de tipo II de cartílago. Se usaron reactivos inmunohistoquímicos habituales para demostrar la presencia de esta proteína de matriz extracelular. Se evaluaron especimenes adicionales para determinar la presencia de nódulos teñidos con azul de toluidina que los correlacionó con la diferenciación continuada y la expresión del fenotipo de una población condrocítica madura. La tinción Von Kossa para determinar la presencia de nódulos mineralizados de condrocitos hipertróficos fue negativa.
Los resultados indicaron que tras sólo tres días de exposición al complemento condrogénico, las MSC en cultivo ya habían empezado a expresar CSPG-M en su matriz extracelular. La organización macroscópica de la placa de cultivo había cambiado desde espirales de células del tipo fibroblasto en el día 1, hasta numerosos focos de células redondas o poligonales de múltiples capas rodeados por una fina capa de células fibroblásticas que se parecen a un pericondrio. La matriz extracelular de estos nódulos era sumamente inmunorreactiva para el colágeno de tipo II. Los cultivos control alimentados sólo con medio completo nunca desarrollaron estos nódulos de cartílago. Considerados de manera conjunta, estos estudios demuestran que las MSC se han estimulado para diferenciarse a lo largo del linaje condrogénico in vitro. Además, no sólo se recluyeron las MSC en las etapas tempranas dentro del linaje, demostrado por la expresión de CSPG-M, sino que las MSC evolucionaron a lo largo del linaje para convertirse en condrocitos maduros que secretan la matriz extracelular rica en colágeno de tipo II. Hasta aquí, no se ha observado la diferenciación terminal de condrocitos derivados a partir de las MSC in vitro, demostrado por las células hipertróficas en una matriz calcificada. Este hallazgo refleja la necesidad de diseñar un complemento condrogénico específicamente propuesto para promover esta etapa de diferenciación terminal. De manera interesante, Pacifici y sus colaboradores (32) han ideado un medio que contiene ácido retinoico que estimula la diferenciación terminal de condrocitos de pollo in vitro.
El aditivo al medio completo que constituye el complemento condrogénico en el ejemplo anterior es sólo uno de los factores que se sabe que estimulan la proliferación o diferenciación de células condrogénicas in vitro.
Ejemplo de referencia 4
Diferenciación de células del estroma de médula inducida de las MSC in vitro
El propósito de la experimentación descrita en este ejemplo fue demostrar que las MSC derivadas de la médula humana se dirigieron a lo largo de la ruta de linaje del estroma in vitro proporcionando factores bioactivos apropiados en el medio de cultivo. Se aislaron las MSC derivadas de la médula humana a partir de la médula ósea y se extendieron en cultivo tal como se describió anteriormente. Con el fin de demostrar la capacidad de las MSC humanas para inducirse a lo largo del linaje de células del estroma de médula, se midió la expresión de citocina específica como un marcador de diferenciación. Se hicieron crecer las MSC en condiciones que favorecen la proliferación de MSC sin diferenciación usando medio que consistía en DMEM-LG que contenía suero bovino fetal al 10% seleccionado previamente (medio completo), o condiciones que favorecen la expresión y la diferenciación en el fenotipo del estroma de médula usando medio que comprende medio completo más 10 U/ml de interleucina-1\alpha (IL-1\alpha) (Complemento Estromagénico (CE)). Se analizaron los medios de cultivo condicionados a partir de estas poblaciones de cultivo tisular para determinar la presencia de citocinas usando bioensayos ELISA de tipo sándwich comerciales(R&D Systems).
Las citocinas que se sometieron a ensayo son aquellas que se sabe que se secretan por las células del estroma y que influyen la hematopoyesis. Éstas incluyen interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de célula madre (SCF), factor inhibidor de leucemia (LIF) y factor de crecimiento transformante-beta-2 (TGF-\beta2). En cada caso, se sembraron en placa las MSC de segundo pase en placas de cultivo de 35 mm a una densidad de aproximadamente el 30% de confluencia (30.000 células por placa de 35 mm). Tras permitir durante la noche la unión de las células, se eliminaron los medios de cultivo, y se sustituyeron o bien por medio completo o bien por medio completo más complemento estromagénico. La figura 6 ilustra la expresión de citocina de las MSC humanas en condiciones de las dos siembras en placa. En ausencia de IL-1\alpha, las MSC expresaron G-CSF, GM-CSF, LIF y SCF a niveles muy bajos, pero expresaron IL-6 con mucha abundancia. En comparación, tras 3 días de estimulación con IL-1-\alpha, se detectaron niveles de citocinas drásticamente superiores para todas las especies anteriores. Las MSC no expresaron ni IL-3 ni TGF-\beta2 en ninguna de las dos condiciones de cultivo. Estos datos muestran que IL-I-\alpha potencia la expresión de MSC de un perfil de citocina que se ha documentado para soportar la diferenciación de las células madre hematopoyécticas y que es característica de células del estroma de médula diferenciadas.
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Ejemplo de referencia 5
Diferenciación miogénica inducida de las MSC in vitro
El propósito del estudio descrito en este ejemplo fue demostrar que 5-azacitidina induce que las células madre mesenquimatosas (MSC) se diferencien a lo largo del linaje miogénico.
El compuesto, 5-azacitidina (5-aza-CR; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), un análogo de citidina, produce hipometilación de algunas citosinas en el ADN que pueden estar implicadas en la activación de genes específicos de fenotipo. Se ha demostrado que las líneas celulares embrionarias de ratón, C3H/1OT1/2 C18 y Swiss 3T3, tras exposición a 5-aza-CR, se convierten en 3 linajes de células mesodérmicas diferentes, mioblasto, adipocito y condrocito (33-34). En parte, parece que el mecanismo por el que 5-aza-CR activa genes miogénicos implica MyoD1 (35-36). Teniendo lo anterior en mente, se expusieron MSC derivadas de médula ósea de rata a 5-aza-CR y se ha centrado el análisis en su conversión a fenotipos miogénicos.
Se recogieron los fémures y las tibias de ratas Fisher macho (Charles River, Indianapolis, IN) con un peso corporal promedio de 100 g y se eliminaron los tejidos blandos adherentes. Varios aislados de células de la médula fueron de ratas de 250 g. Se realizó una disección meticulosa de los huesos largos para eliminar el tejido blando para asegurar que los precursores miogénicos no se habían transportado a la preparación de médula. En este sentido, nunca se observaron células miogénicas en cultivos de MSC no tratados. Se seccionaron ambos extremos de los huesos de la diáfisis con tijeras para huesos. Se expulsaron los tapones de médula ósea hidroestáticamente desde los huesos mediante inserción de agujas de calibre 18 unidas a jeringas de 10 ml rellenas con medio completo que consistía en DMEM que contenía lotes seleccionadas de suero de ternero fetal al 10% (FCS; IR Scientific Inc., Woodland, CA), suero de caballo al 5% (HS; Hazleton Biologics Inc., Lenexa, KS), y antibióticos (Gibco Laboratories; penicilina G, 100 U/ml; estreptomicina, 100 \mug/ml; anfotericina B, 0,25 \mug/ml). Se insertaron las agujas en los extremos distales de los fémures y los extremos proximales de las tibias y se expulsaron los tapones de médula desde los extremos opuestos. Se desagregaron los tapones de médula mediante paso secuencial a través de agujas de calibre 18, calibre 20, y calibre 22 y se centrifugaron y resuspendieron dos veces en medio completo estas células dispersadas. Una vez se contaron las células en un hemocitómetro, se introdujeron 5 x 10^{7} células en 7-10 ml de medio completo en placas Petri de 100 mm. Tres días después, se cambió el medio y se desecharon las células no adherentes. Se sustituyó completamente el medio cada 3 días. Aproximadamente 10 días después de la siembra, las placas se volvieron casi confluentes, y se liberaron las células adherentes de las placas con tripsina al 0,25% en EDTA de sodio 1 mM (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), se fraccionaron 1:3, y se sembraron en placas nuevas. Tras haber realizado un pase de estas células, se volvieron casi confluentes, se recogieron y se usaron para los experimentos descritos más adelante. Estas células se denominan MSC derivadas de médula de rata. En total, se usaron 8 preparaciones de MSC derivadas de médula de rata separadas en este estudio. Se cultivaron rutinariamente las células en medio completo a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%.
Se sembraron las MSC con dos pases en placas de 35 mm en tres densidades celulares, 500, 5.000 y 50.000 células/placa. Empezando 24 h después de la siembra, se trataron estos cultivos durante 24 h con medio miogénico que consistía en medio completo que contenía diversas concentraciones de 5-aza-CR. Una vez lavados los cultivos dos veces con solución salina equilibrada de Tyrode (Sigma Chemical Co.), se cambió el medio a medio completo sin 5-aza-CR añadido y posteriormente se cambió dos veces a la semana hasta que se terminó el experimento, 40 días después del tratamiento. Tal como se describe en detalle en los resultados, se sometieron a prueba diversas condiciones de cultivo para intentar optimizar los efectos de 5-aza-CR, especialmente para optimizar la miogénesis.
Se sembraron las MSC de médula ósea de rata con dos pases en placas de 35 mm a 5.000 células/placa y se trataron con cuatro concentraciones (0,1 \muM, 0,3 \muM, 1 \muM y 10 \muM) de 5-aza-'-desoxicitidina (5-aza-dCR; Sigma Chemical Co.) de la misma manera que se describió anteriormente para 5-aza-CR. La morfología de los cultivos se observó a diversos tiempos durante el tratamiento.
Se examinaron los cultivos vivos cada día con un microscopio de contraste de fase (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japón), y finalmente se fijaron algunos de los cultivos para determinar la histología o inmunohistoquímica. Se identificaron morfológicamente en primer lugar células de músculo en contraste de fase mediante la determinación de la presencia de miotubos multinucleados, y posteriormente de manera inmunohistoquímica mediante la determinación de presencia de la proteína específica del músculo esquelético, miosina. Se estimuló la contracción de las posibles células de músculo mediante una gota de acetilcolina 1 mM (Sigma Chemical Co.) en solución de Tyrode. Para la inmunohistoquímica, se fijaron las células cultivadas con metanol a -20ºC (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ) durante 10 min y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón frente a miosina esquelética de contracción rápida de rata (Sigma Chemical Co.; líquido ascítico, dilución 1/400) en PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4) que contenía BSA (albúmina de suero bovino; Sigma Chemical Co.) al 0,1%. Se conjugó con biotina el segundo anticuerpo IgG de oveja anti-ratón (Organon Teknika Corp., West Chester, PA; dilución 1/50) seguido por tratamiento con avidina conjugada con rojo Texas (Organon Teknika Corp.; dilución 1/4.000). Todas las incubaciones se realizaron durante 30 min a temperatura ambiente, cada una precedida por bloqueo durante 5 min con PBS que contenía BSA al 1%, seguido por dos lavados de 5 min en PBS. Se montaron las células en el dispositivo Fluoromount-G (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) y se observaron con un microscopio Olympus (BH-2) equipado para detectar fluorescencia y se fotografiaron con película Kodak TMAX 400.
Se sembraron las MSC de médula ósea de rata con dos pases en placas de 96 pocillos a dilución limitante de una célula/pocillo; se sembraron en placa las células en medio que consistía en medio completo al 50% y medio condicionado al 50%, que se obtuvo a partir de células de médula ósea de rata cerca de confluencia cultivadas en medio completo durante 2 días. Se detectaron 50 colonias, de un total de 384 pocillos; éstas se subcultivaron, se mantuvieron y finalmente sobrevivieron 4. Se trataron estos 4 clones con 5-aza-CR tal como se mencionó anteriormente y se puntuaron para determinar morfologías miogénicas o adipocíticas.
En primer lugar, se expusieron células de médula ósea de rata con un pase a 5-aza-CR 10 \muM durante 24 h y se sembraron en placas de 96 pocillos a dilución limitante de una célula/pocillo como anteriormente. Se determinó el número de clones que mostraban morfologías de células multinucleadas adipocíticas (positivas para negro Sudán) o miogénicas.
Para comparar la capacidad de conversión de las MSC de médula ósea para diversos fenotipos mesodérmicos con la de fibroblastos puros, se expusieron fibroblastos de cerebro de rata a, o bien 5-aza-CR, o bien 5-aza-CdR. Se recogió la corteza cerebral completa de cerebros de tres ratas Fisher macho del interior de los cráneos y se cortó en trozos pequeños con un escalpelo afilado. Se transfirieron estos trozos a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml, se centrifugaron a 500 xg durante 10 min, se resuspendieron en 10 ml de solución salina equilibrada con Tyrode, y se homogeneizaron con un homogeneizador Dounce de ajuste holgado. Se incubó el homogeneizado con colagenasa al 0,1% (CLS2, 247 U/mg; Worthington Biochemical Co., Freehold, NJ) a 37ºC durante 3 h, tiempo durante el que se agitó con vórtex durante 30 s cada 30 min. Tras el tratamiento, se pasaron las células liberadas a través de un filtro Nitex de 110 \mum, se centrifugaron, se resuspendieron en 10 ml de DMEM-LG bajo en glucosa (Gibco Laboratories) que contenía FCS al 10% y se cultivaron en tres placas de cultivo de 100 mm a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Se cambió el medio dos veces a la semana y se cultivaron las células hasta que las placas alcanzaron
confluencia.
Se sembraron fibroblastos de cerebro de rata con tres pases en placas de 35 mm a una densidad de 50.000 células/placa y se trataron con 5-aza-CR 1 \muM, 3 \muM o 10 \muM o 5-aza-CdR 0,1 \muM, 0,3 \muM o 1 \muM de la misma forma que las MSC de médula de rata. Tras 24 h, se cambió el medio a DMEM-LG que contenía FCS al 10%, HS al 5% e hidrocortisona 50 nM sin 5-aza-CR o 5-aza-CdR añadido y posteriormente se cambió dos veces a la semana hasta que se terminó el experimento.
Se compararon células miogénicas derivadas de MSC de médula ósea de rata con células miogénicas de rata fetal normales, dado que existe una base de datos sustancial para las últimas. Se disociaron células del músculo de los músculos las extremidades posteriores de fetos de rata Fisher de 17 días de edad con tripsina al 0,2% (Sigma Chemical Co.) en solución de Tyrode libre de calcio y magnesio durante 35 min a 37ºC con agitación ocasional. Tras realizar pases a través de un filtro Nirtex de 110 \mum, se redujo la concentración de fibroblastos incubando las suspensiones celulares durante 30 min en placas de plástico Falcon, lo que da como resultado una unión preferente de los fibroblastos. Una suspensión de 5 x 10^{5} células individuales que no se unió a la placa sin recubrir se sembró en una placa de cultivo de plástico 35 mm recubierta con colágeno (1,5 ml de gelatina al 0,14%, J.T. Baker Chemical Co., Phillipsberg, NJ) que contenía 2 ml de 79% de DMEM, 10% de FCS, 10% de HS y 1% de aminoácidos no esenciales (Gibco Laboratories). Las células se hicieron crecer a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2}
al 5%.
Se expusieron los cultivos de MSC derivadas de médula ósea de rata (5.000 células/placa de 35 mm) a diversas concentraciones de 5-aza-CR (0, 1, 3, 10, 20, y 50 \muM) 24 h después de sembrar las células en placas de cultivo. Se eliminó el medio que contenía 5-aza-CR tras el periodo de exposición de 24 h y se sustituyó con medio que carecía de 5-aza-CR. Siete días después de esta exposición, se observaron células multinucleadas largas en algunas de las placas tratadas con más de 5-aza-CR 3 \muM (figura 7A); las células en estos cultivos tenían aproximadamente el 80% de confluencia. El número de tales células multinucleadas aumentó como colonias aisladas o agrupaciones y alcanzó un máximo (9 colonias en 10 de placas de 35 mm) 2 semanas después del tratamiento inicial. El número de tales células disminuyó (6 colonias en 10 de placas de 35 mm) en 5 semanas después del tratamiento; 7 desaparecieron probablemente debido probablemente a su contracción y separación de las placas y aparecieron 4 nuevas colonias durante este periodo de tiempo; una parte sustancial de las células multinucleadas permaneció durante hasta 40 días tras la exposición inicial, que fue el periodo de observación más largo. La morfología de las células multinucleadas, observada mediante microscopía de contraste de fase de cultivos vivos (figura 7A), fue similar a la del músculo de rata en cultivo. No se observaron estriaciones discernibles, como se observan rutinariamente en las células miogénicas de pollo embrionario en cultivo, aunque los miotubos derivados de células miogénicas obtenidas a partir de extremidades de rata fetal normales tampoco mostraron estriaciones (figura 7B). Por tanto, ni los miotubos derivados de las MSC ni los obtenidos a partir de embriones de rata normales muestran estriaciones en las condiciones empleadas en estos estudios. Se observaron ondas de contracciones espontáneas o espasmos de algunas de estas células multinucleadas cuando se observaban los cultivos vivos. La contracción de estas células también puede estimularse colocando una gota de una disolución de acetilcolina sobre estas células, lo que es una indicación adicional de que estas células son miogénicas.
Para confirmar adicionalmente la identidad de estas células multinucleadas, se presentó un anticuerpo frente a miosina específica de músculo esquelético a una preparación fija de estos cultivos. La figura 8 muestra un miotubo teñido positivamente con el anticuerpo anti-miosina; de nuevo, no pudieron observarse las estriaciones cruzadas. También se tiñeron miotubos de 2 semanas y 5 semanas tras el tratamiento de 5-aza-CR con anticuerpo anti-miosina. Los miotubos 2 semanas después del tratamiento se tiñeron de manera intensamente positiva (figuras 9A y 9B), aunque los de 5 semanas tras el tratamiento se tiñeron débilmente (figuras 9C y 9D).
El efecto de 5-aza-CR parecía ser dependiente de la concentración presentada a las MSC. No se encontraron miotubos en placas tratadas con 5-aza-CR 0 o 1 \muM, pero se observaron miotubos en las tratadas con 5-aza-CR 3-50 \muM con incidencia comparable (tabla 2).
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TABLA 2
2
Se sembraron en placas los cultivos secundarios de células de médula ósea de rata a 5.000 células por placa de 35 mm, se trataron con la concentración indicada de 5-aza-CR, y se observaron 14 días después del tratamiento. Los números para la incidencia de miotubos y adipocitos indican el número total de agrupaciones discernibles por fenotipo observadas y el número total de placas de cultivo examinadas.
Para medir el índice se supervivencia (IS*) en presencia de 5-aza-CR, se sembraron MSC a 200 células/placa de 35 mm y se trataron con 5-aza-CR 24 h después de la siembra. Tras 14 días, se contaron las colonias que contenían más de 10 células, y se multiplicó este número por el 100% y se dividieron por 200 para generar el porcen-
taje.
Cuando se trataron las células con concentraciones superiores de 5-aza-CR, disminuyó el número de células sobre la placa, pareciendo que 10 \muM era la concentración más eficaz en relación al número máximo de células miogénicas y supervivencia celular (eficacia de siembra en placa de la tabla 2). Por tanto, todos los experimentos posteriores se realizaron con 5-aza-CR 10 mM.
Para examinar el efecto de 5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza-dCR), un análogo de desoxi de 5-aza-CR, se trataron MSC de médula ósea de rata con 5-aza-dCR 0,3 \muM, 1 \mum, y 10 \muM de la misma manera que 5-aza-CR. De las concentraciones sometidas a prueba, 5-aza-CdR 0,3 \muM dio la mayor incidencia de conversión miogénica, y la incidencia observada fue mucho mayor que para las células expuestas a 5-aza-CR 10 \muM (tabla 3).
TABLA 3
3
Se sembraron en placas los cultivos secundarios de células de médula ósea de rata a 5.000 células por placa de 35 mm, se trataron con la concentración indicada de 5-aza-dCR o 5-aza-CR, y se observaron 14 días después del tratamiento. Los números para la incidencia de miotubos indican el número total de agrupaciones discernibles por fenotipo observadas y el número total de placas de cultivo examinadas.
Para medir el índice de supervivencia en presencia de 5-aza-CdR o 5-aza-CR, se sembraron MSC a 200 células/placa de 35 mm y se trataron con 5-aza-dCR o 5-aza-CR 24 h después de sembrarlas en placas. Después de 14 días, se contaron las colonias que contenían más de 10 células, y se multiplicó este número por el 100% y se dividió por 200 para generar el porcentaje.
Para eliminar la posibilidad de contaminación por mioblastos derivados de músculo circundante en el momento de la recogida de la médula ósea, se clonaron MSC de médula ósea de rata de segundo pase tal como se describe en el presente documento. Se obtuvieron cuatro clones de morfologías indistinguibles de este procedimiento y se expusieron a 5-aza-CR durante 24 h; para enfatizar, ninguna célula en estos clones mostró características de tipo muscular o inmunotinción positiva para miosina específica de músculo antes de la exposición a 5-aza-CR. De 4 clones expuestos a 5-aza-CR, un clon mostró morfología distintiva de miotubos y adipocitos, lo que se interpreta como que indica que las células no musculares se convirtieron en o fueron influenciadas para convertirse en mioblastos o adipocitos.
Se expusieron MSC derivadas de médula ósea de rata con un primer pase a 5-aza-CR 10 \muM durante 24 h y se clonaron. Se detectaron 136 colonias de un total de 768 pocillos. De estas 136 colonias, 7 (el 5%) mostraron un fenotipo miogénico, 27 (el 20%) mostraron un fenotipo adipocítico, y las otras colonias carecían de morfologías obviamente relacionadas a fenotipos discernibles.
Para probar el efecto de 5-aza-CR y 5-aza-dCR sobre preparaciones distintas de MSC, se expusieron fibroblastos cerebrales a los mismos reactivos. Se sembraron fibroblastos cerebrales de ratón en placas de 35 mm a una densidad de 50.000 células/placa y se trataron con 5-aza-CR 1 \muM, 3 \muM o 10 \muM o 5-aza-dCR 0,1 \muM, 0,3 \muM o 1 \muM de la misma manera que para MSC de rata. Cada grupo tenía 9 placas y se inspeccionaron las células hasta 14 días tras la exposición. El día 7, todas las placas alcanzaron confluencia, salvo para el grupo tratado con 5-aza-CR 10 \muM. No pudieron encontrarse adipocitos ni miotubos en ninguna de las placas durante el periodo de observación.
Se recogieron MSC de la médula ósea de ratas donantes jóvenes (4 semanas de edad, 100 g) y adultas (3 meses de edad, 250 g) y se realizaron pases, y se comparó el número de colonias de fenotipo miogénico tras la exposición a 5-aza-CR (tabla 4).
TABLA 4
4
Se sembraron cultivos secundaros de MSC de médula ósea de rata a 5.000 células por placa de 35 mm, se trataron con 5-aza-CR \muM y 24 h se cambiaron a DMEM con diferentes niveles de FCS, HS, o HC 50 \muM, y se observaron 14 días tras terminarse la exposición a 5-aza-CR. Los números para la incidencia de miotubos indican el número total de placas de cultivo examinadas.
Las MSC de ratas donantes jóvenes tenían más colonias miogénicas que las procedentes de ratas adultas. Los cultivos de segundo pase de MSC de donantes jóvenes expuestas a 5-aza-CR produjeron más colonias miogénicas comparadas con las MSC de donantes mayores sometidas a prueba en los cultivos de los pases primero al
cuarto.
Se sometió a prueba una variedad de condiciones de cultivo para intentar optimizar la expresión del fenotipo miogénico de MSC cultivadas expuestas a 5-aza-CR. Se cultivaron las células expuestas en medio que contenía diversas concentraciones de FCS, HS, factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGFb) e hidrocortisona. La tabla 4 muestra que el medio que contenía FCS al 10%, HS al 5% e hidrocortisona parecía ser el óptimo para la expresión de MSC de propiedades miogénicas. El medio que contenía FGFb parecía aumentar la expresión del fenotipo miogénico (tabla 5), aunque esto puede estar relacionado con un aumento en el número de mioblastos debido a la división de mioblastos como oposición a la conversión aumentada de células progenitoras.
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TABLA 5
5
6
Se cultivaron las células en DMEM con FCS al 10%, HS al 5% y HC 50 \muM, con o sin FGFb. Los números para la incidencia de miotubos indican el número total de colonias o agrupaciones discernibles fenotípicamente observadas y el número total de placas de cultivo examinadas. Se obtuvieron MSC de ratas jóvenes (100 g) o adultas
(250 g).
Además, se sembraron en placas MSC derivadas de médula ósea a 500 células/placa, 5.000 células/placa, y 50.000 células/placa y luego se expusieron a 5-aza-CR. A 500 células/placa, se observaron en primer lugar células miogénicas a los 20 días tras el tratamiento, convirtiéndose las células en confluentes 25 días tras el tratamiento; se observaron 2 agrupaciones de células miogénicas en 5 placas 29 días tras el tratamiento. A 5.000 células/placa, se observaron en primer lugar células miogénicas a los 7 días, convirtiéndose las células en confluentes 10 días tras el tratamiento; se observaron 3 agrupaciones en 4 placas 14 días tras el tratamiento. A 50.000 células/placa, se observaron células miogénicas a los 6 días, convirtiéndose las células en confluentes a los 7 días tras el tratamiento; se observaron 10 agrupaciones en 5 placas 14 días tras el tratamiento.
Las observaciones presentadas aquí indican que las MSC de médula ósea de rata tienen capacidad para diferenciarse en el linaje miogénico in vitro tras una breve exposición a 5-aza-CR. Las células miogénicas observadas mostraban la morfología multinucleada característica de miotubos, se contraían espontáneamente, se contraían cuando se exponían a acetilcolina, y se tenían positivamente con un anticuerpo monoclonal frente a miosina específica de músculo esquelético, aunque estos miotubos nunca mostraron estriaciones aparentes. Sin embargo, los mioblastos de rata normales recogidos de músculo de rata fetal no formaron, en este caso, miotubos estriados de manera obvia en cultivo. Se ha intentado excluir la posibilidad de contaminación mediante células miogénicas comprometidas eliminando meticulosamente el tejido blando unido de los huesos en el momento de la recogida de la médula ósea. Y lo que es más importante, nunca se observaron miotubos en ningún cultivo de MSC de médula ósea de rata en cientos de preparaciones, excepto para las expuestas a concentraciones suficientes de 5-aza-CR. Además, se convirtió un clon de MSC de médula ósea de rata en fenotipos tanto miogénico como adipocítico tras el tratamiento con 5-aza-CR, lo que se interpreta como que significa que las células progenitoras no musculares se convirtieron en estos dos fenotipos. Dado que no se ha observado músculo esquelético en médula ósea, se cree que 5-aza-CR convierte estas MSC derivadas de médula en células miogénicas.
Ejemplo de referencia 6
Expresión de citocina por células madre mesenquimatosas derivadas de médula humana in vitro: Efectos de IL-1\alpha y dexametasona
El objetivo del presente estudio era establecer adicionalmente las características fenotípicas de MSC cultivadas mediante la identificación de un perfil de expresión de citocina. Se usaron ELISA comerciales para identificar y medir los niveles de expresión de citocinas que se sabe son importantes en la regulación de la división, diferenciación o expresión celular de una variedad de fenotipos mesenquimatosos. Se identificó la expresión de citocina de MSC en condiciones de cultivo que ya se ha notificado previamente que permite a las MSC extenderse mitóticamente sin diferenciación (medio de extensión de cultivo constitutivo). Además, se sometió a ensayo la expresión de citocina mediante MSC en medio de cultivo complementado con dexametasona o IL-1\alpha. Se ha notificado que la dexametasona induce la diferenciación de osteoprogenitores en osteoblastos. Por el contrario, se ha notificado que IL-1\alpha, que se secreta en el microambiente medular por una variedad de células durante la respuesta inflamatoria, aumenta la capacidad del estroma de médula ósea para soportar la hematopoyesis y por tanto puede desempeñar un papel en el control de la diferenciación y/o expresión de fibroblastos de estroma de médula ósea.
Los datos de estos análisis muestran que las MSC cultivadas expresan un perfil de citocina único. Además, dexametasona e IL-1\alpha alteran el perfil de expresión de citocina de MSC de diferentes maneras. Estos datos se suman al entendimiento del perfil fenotípico único de las MSC, y también identifican macromoléculas cuya expresión está regulada por desarrollo dado que las MSC se diferencian o modulan su fenotipo hacia el linaje osteogénico o fenotipo de estroma medular.
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Materiales y métodos Aislamiento y extensión en cultivo de MSC
Se obtuvo médula ósea de seis donantes humanos, 3 masculinos y 3 femeninos de diversas edades (tabla 6).
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TABLA 6
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Cada donante estaba en remisión de cáncer y estaba experimentando cultivo de médula para futuros trasplantes de médula ósea autóloga. Se obtuvieron aproximadamente 10 ml de médula ósea no fraccionada del cultivo y se usaron en los ensayos en este estudio. Se purificaron las MSC y se cultivaron mediante una modificación de métodos previamente notificados. En resumen, se transfirieron los aspirados de médula ósea desde sus jeringas a tubos cónicos de 50 ml que contenían 25 ml de medio completo que consistía en medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal (FBS) de lotes seleccionados, hasta un volumen final del 10%. Se centrifugaron los tubos en una centrífuga de mesa Beckman a 1200 rpm en un rotor de cubo giratorio GS-6 durante 5 min para sedimentar las células. Se aspiraron la capa de grasa que se forma en la parte superior de las muestras y los sobrenadantes usando una pipeta serológica y se descartaron. Se resuspendieron los sedimentos celulares hasta un volumen de 5 ml con medio completo y se transfirieron entonces a la parte superior de los gradientes formados previamente de Percoll al 70%. Se cargaron las muestras en un rotor de ángulo fijo Sorvall GS-34 y se centrifugaron en una centrífuga Sorvall de alta velocidad a 460 x g durante 15 min. Se recogió la fracción de baja densidad de aproximadamente 15 ml (densidad acumulada = 1,03 g/ml) de cada gradiente y se transfirió a tubos cónicos de 50 ml a los que se añadieron 30 ml de medio completo. Se centrifugaron los tubos a 1200 rpm para sedimentar las células. Se descartaron los sobrenadantes y se resuspendieron las células en 20 ml de medio completo y se contaron con un hemocitómetro después de lisar glóbulos rojos con ácido acético al 4%. Se ajustaron las células a un concentrado de 5 x 10^{7} células por 7 ml y se sembraron en placas de cultivo de 100 mm a 7 ml por
placa.
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Cultivo y pase de MSC derivadas de médula
Se cultivaron MSC derivadas de médula en medio completo a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía el 95% de aire y el 5% de CO_{2}, con cambios de medio cada 3-4 días. Cuando las placas de cultivo primario se volvieron casi confluentes, se desunieron las células con tripsina al 0,25% que contenía EDTA 1 mM (GIBCO) durante 5 min a 37ºC. Se detuvo la actividad enzimática de la tripsina añadiendo 1/2 volumen de FBS. Se contaron las células, se fraccionaron 1:3 y volvieron a sembrarse en placas en 7 ml de medio completo. Se dejó que estas células de primer pase se dividieran durante 4-6 días hasta que se volvieron casi confluentes. Se tripsinizaron las células de primer pase casi confluentes y volvieron a sembrarse en placas en los formatos de ensayo tal como se describe a continua-
ción.
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ELISA cuantitativo
Se midieron los niveles de expresión de citocina por las MSC usando ELISA cuantitativo. Se compraron kits de ELISA (R&D Systems, Minneapolis MN) con especificidades de anticuerpo para las siguientes citocinas; interleucina-3 (IL-3), interleucina-6 (IL-6), interleucina-11 (IL-11), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), actividad estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de células madre (SCF), factor inhibidor de leucemia (LIF) y factor de crecimiento transformante beta-2 (TGF-\beta-2). Las MSC casi confluentes de primer pase volvieron a sembrarse en placas de 35 mm a 50.000 células por placa y se dejaron que se uniesen durante la noche. Se cambiaron entonces las condiciones de cultivo a una de tres condiciones de prueba: medio completo nuevo; medio completo con complemento osteogénico; y medio completo con complemento del estroma. Se dejaron incubar los cultivos en los medios de prueba durante 24 ó 48 horas momento en el que se recogieron los sobrenadantes, se congelaron de manera ultrarrápida en hielo seco-etanol y se almacenaron a -70ºC en un congelador Revco hasta que todas las muestras estuvieran preparadas para analizarse juntas. Se realizaron los ensayos aplicando 100 \mul de sobrenadante de cultivo en los pocillos de la placa ELISA seguido del procesamiento de las placas según las instrucciones del fabricante. Se generaron curvas patrón usando citocinas habituales suministradas con los kits y se diluyeron hasta las concentraciones apropiadas. En algunos casos (particularmente para el ensayo de IL-6), tuvieron que diluirse los sobrenadantes sustancialmente para generar medidas de absorbancia suficientemente bajas que pudieran cuantificarse de manera precisa a partir de las curvas
patrón.
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Cuantificación de número de células Resultados Condición de medio de extensión en cultivo constitutivo
Los niveles detectables de seis de las nueve citocinas sometidas a ensayo estuvieron presentes tras 24 horas de exposición a condiciones de extensión en cultivo constitutivo. Véanse las figuras 12A-12D y 13A-13C y véanse las tablas 7-10 a continuación).
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TABLA 7
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9 
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TABLA 8
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TABLA 9
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TABLA 10
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Las citocinas expresadas en cuanto a pg/10.000 células en 24 ó 48 horas, de menor a mayor fueron: G-CSF, SCF, LIF, M-CSF, IL-11 e IL-6. No se detectaron tres citocinas en los sobrenadantes en condiciones de extensión en cultivo constitutivo: GM-CSF, IL-3 y TGF-\beta2. Se observaron grandes diferencias en la expresión de citocina promedio de cada citocina en comparación con los niveles promedio de expresión de otras citocinas. En los extremos, el nivel detectable promedio de expresión de G-CSF (10 pg/10.000 células/24 horas) fue aproximadamente 700 veces inferior al nivel promedio de expresión de IL-6 (7421 pg/10.000 células/24 horas).
Condiciones de cultivo con complemento osteogénico
La adición de complementos osteogénicos al medio completo dio como resultado cambios no detectables en G-CSF, M-CSF y SCF con respecto al control (figuras 12A-12D y 13A-13B; tablas 7-10). Por el contrario, el medio CO reguló por disminución significativamente la expresión de LIF (p<0,01), IL-6 (p<0,001) e IL-11 (p<0,005) con respecto a la expresión de estas citocinas en condiciones de medio de extensión en cultivo constitutivo a las 24 horas. Estos niveles permanecieron estadísticamente inferiores a los niveles de citocina en medio de extensión en cultivo constitutivo a las 48 horas (figuras 12A-12D y 13A-13C; tablas 7-10). La cantidad de inhibición mediada por medio CO varió para las tres citocinas; en el momento de las 24 horas el nivel promedio de expresión de citocina en medio CO con respecto a las condiciones del medio de extensión en cultivo constitutivo fue tal como sigue; expresión de LIF el 55% \pm 54%, IL-6 el 16% \pm 9% e IL-11 el 1% \pm 3%. La gran desviación estándar en el cambio en porcentaje de LIF fue debida principalmente a las mediciones de un donante (donante nº 4) en el que el nivel de expresión de LIF era realmente superior en condiciones de medio CO con respecto a condiciones de extensión en cultivo constitutivo (tabla 7). Para un donante dado, la inhibición en porcentaje de una citocina con respecto al nivel absoluto promedio de inhibición de esa citocina, fue independiente de la inhibición en porcentaje de las otras dos citocinas, con respecto a sus niveles absolutos promedio de inhibición (tablas 7-10). Además, para cada una de las citocinas, la inhibición en porcentaje para una citocina dada entre los seis individuos en la población, fue independiente de los niveles iniciales de expresión en condiciones de extensión en cultivo constitutivo (figuras 12A-12D y 13A-13C; tablas
7-10).
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Condiciones de cultivo con complemento del estroma
El medio CE aumentó la expresión de varias citocinas por las MSC en una forma dependiente de la concentración. La figura 14 muestra la respuesta a las 24 horas de las MSC de segundo pase frente a concentraciones crecientes de IL-1\alpha en cuanto a la expresión de GM-CSF. Existe un aumento casi lineal en el nivel de secreción de GM-CSF por las MSC, con niveles crecientes de IL-1\alpha en el medio de cultivo entre 0,1-10,0 U/ml. Aumentos logarítmicos adicionales en IL-1\alpha con respecto al medio de cultivo dan como resultado poco aumento adicional en la expresión de GM-CSF. Se usaron estos datos para identificar la concentración de IL-1\alpha para complementar con respecto a los medios de cultivo en los experimentos descritos a continuación. Para todos los ensayos posteriores, se añadieron 10 U/ml de IL-1\alpha a los medios de cultivo.
El medio de cultivo complementado con 10 U/ml de IL-1\alpha indujo regulación por incremento estadísticamente significativa en la expresión de G-CSF (P<0,05), M-CSF (p<0,02), LIF (p<0,02), IL-6 (p<0,01-) e IL-11 (p<0,06) con respecto a las células cultivadas en medio de extensión en cultivo constitutivo. Además, IL-1\alpha indujo la expresión de GM-CSF que no pudo detectarse en el medio de extensión en cultivo constitutivo. Por el contrario, IL-1\alpha no tuvo efecto estadísticamente significativo sobre la expresión de SCF con respecto al nivel de expresión en condiciones de medio de extensión en cultivo constitutivo. El incremento en veces de la repuesta frente a IL-1\alpha varió dependiendo de la citocina. Se estimuló IL-6 (incremento de 25,1 +/- 13,4 veces) hasta el mayor grado, seguido de LIF (9,2 \pm 6,9 veces), M-CSF (5,2 \pm 1,7 veces) e IL-11 (4,9 \pm 3,3 veces). No se calculó el incremento en veces promedio para G-CSF y GM-CSF, dado que estas citocinas no se detectaron en algunos o ningún cultivo de extensión en cultivo consti-
tutivo.
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Discusión
Los análisis continuados de las MSC en este estudio estaban dirigidos a identificar características fenotípicas adicionales, y determinar cómo este fenotipo se altera cuando se exponen las MSC a moléculas reguladoras que provocan la diferenciación o modulación fenotípica. En este estudio, se usaron ensayos ELISA para caracterizar la expresión de citocina de las MSC en condiciones de extensión en cultivo constitutivo, y en presencia de CO o
CE.
Las MSC expresan un perfil único de citocinas que incluye G-CSF, M-CSF, SCF, LIF, IL-6 e IL-11 en condiciones de extensión en cultivo constitutivo. No expresan GM-CSF, IL-3 ni TGF-\beta2 en estas condiciones. El CO regula por disminución la expresión de LIF, IL-6 e IL-11, aunque no afecta a la expresión de las otras citocinas expresadas en condiciones de cultivo constitutivo. No se observó que el CO regulase por incremento la expresión de ninguna de las citocinas sometidas a ensayo en este estudio. Por el contrario, el CE regula por incremento la expresión de G-CSF, M-CSF, LIF, IL-6 e IL-11, e induce la expresión de GM-CSF que no se detectó en condiciones de extensión en cultivo constitutivo. El CE no tuvo efecto sobre la expresión de SCF, y no se observó que regulase por disminución ninguna de las citocinas sometidas a ensayo en este estudio. A través de estos datos, se ha generado un perfil de expresión de citocina único que puede ayudar a distinguir las MSC de otros fenotipos mesenquimatosos. La identidad del perfil de citocina debe proporcionar claves para determinar el papel que desempeñan estas células en el microambiente de médula ósea que proporciona la información inductiva y reguladora que soporta la hematopoyesis. Además, las alteraciones en este perfil de citocina en respuesta a CO y CE, identifican citocinas específicas cuyos niveles de expresión cambian a medida que se diferencian las MSC o modulan su fenotipo en respuesta a moléculas regu-
ladoras.
La IL-1\alpha, que se libera en el microambiente medular por una variedad de tipos de células durante las respuestas inflamatorias, induce que las MSC regulen por incremento la expresión de citocinas que soportan la diferenciación granulocítica (G-CSF y GM-CSF), monocítica/osteoclástica (GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-6) y megacariocítica (IL- 11). Se ha demostrado que IL-1\alpha protege la médula ósea de la radio y hemoablación. La regulación por incremento inducida por IL-1\alpha de la expresión de citocina por las MSC probablemente desempeña un papel en los mecanismos de los efectos protectores de IL-1\alpha.
La dexametasona, que induce a las MSC a diferenciarse en osteoblastos, atenúa la expresión de las citocinas de apoyo monocíticas/osteoclásticas (LIF, IL-6) y megacariocíticas (IL-11), y no tiene ningún efecto sobre la expresión de citocinas que soportan a progenitores graulocíticos (G-CSF, GM-CSF). Las tres citocinas inhibidas por dexametasona son de interés porque cada una media su señal a través de un receptor que usa gp130 en su ruta de señaliza-
ción.
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Claims (19)

1. Método para efectuar la inducción dirigida por linaje de células madre mesenquimatosas humanas cultivadas y aisladas que comprende poner en contacto ex vivo las células madre mesenquimatosas con un factor bioactivo eficaz para inducir la diferenciación in vitro de las mismas en un linaje mesenquimatoso condrogénico.
2. Método según la reivindicación 1, en el que las células se ponen en contacto con el factor bioactivo en un recipiente poroso rígido.
3. Método según la reivindicación 2, en el que el recipiente poroso rígido es un cubo cerámico.
4. Método según la reivindicación 1, en el que las células se ponen en contacto con el factor bioactivo en un recipiente de cultivo.
5. Método según la reivindicación 4, en el que el recipiente de cultivo está formado por un material seleccionado del grupo que consiste en vidrio y plástico.
6. Método según la reivindicación 1, en el que las células se ponen en contacto con el factor bioactivo en un líquido inyectable.
7. Método según la reivindicación 6, en el que el líquido es adecuado para inyección intramuscular, intravenosa o intraarticular.
8. Método según la reivindicación 1, que comprende inducción condrogénica y el factor bioactivo es un factor condroinductor.
9. Método según la reivindicación 8, en el que el factor condroinductor es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-\beta.
10. Método según la reivindicación 9, en el que el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-\beta es una proteína morfogénica ósea.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la proteína morfogénica ósea es BMP-4.
12. Método según la reivindicación 9, en el que el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-\beta es TGF-\beta1.
13. Método según la reivindicación 9, en el que el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-\beta es inhibina A.
14. Método según la reivindicación 9, en el que el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante-\beta es el factor de actividad estimulante de la condrogénesis.
15. Método según la reivindicación 8, en el que el factor condroinductor es un componente de la matriz extracelular de colágeno.
16. Método según la reivindicación 15, en el que el componente de la matriz extracelular de colágeno es colá-
geno I.
17. Método según la reivindicación 16, en el que el colágeno I está en forma de un gel.
18. Método según la reivindicación 8, en el que el factor condroinductor es un análogo de la vitamina A.
19. Método según la reivindicación 18, en el que el análogo de la vitamina A es ácido retinoico.
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