ES2198408T3

ES2198408T3 - Genes para delta 12 desaturasas de acidos grasos microsomales y enzimas afines de plantas.

Info

Publication number: ES2198408T3
Application number: ES93924360T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Edward Lightner; John Joseph Okuley
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1992-11-17
Filing date: 1993-10-15
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: DE69333025T2; JP3818540B2; JPH08503364A; BR1101149KB1; EP0668919B1; JP2009171968A; DK0668919T3; JP2006238886A; WO1994011516A1; CA2149223A1; CA2149223C; JP4308829B2; DE69333025D1; AU5407594A; EP0668919A1

Abstract

SE DESCRIBE LA PREPARACION Y LA APLICACION DE FRAGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN LAS ENZIMAS DE ACIDO GRASO DESATURADAS. LA INVENCION PERMITE LA ALTERACION DE LA COMPOSICION LIPIDA DE LA PLANTA. LOS GENES QUIMERICOS QUE INCORPORAN TALES FRAGMENTOS DE ACIDOS NUCLEICOS CON SECUENCIAS REGULATORIAS APROPIADAS DEBEN SER USADAS PARA CREAR PLANTAS TRANSGENICAS CON NIVELES ALTERADOS DE ACIDOS GRASOS INSATURADOS.

Description

Genes para delta 12 desaturasas de ácidos grasos microsomales y enzimas afines de plantas.

Ámbito de la invención

La invención se refiere a la preparación y al uso de fragmentos de ácido nucleico que codifican enzimas ácido graso desaturasa para modificar la composición de lípidos de plantas. Genes quiméricos que incorporan tales fragmentos de ácido nucleico y adecuadas secuencias reguladoras pueden ser usados para crear plantas transgénicas con niveles alterados de ácidos grasos insaturados.

Antecedentes de la invención

Los lípidos vegetales tienen una variedad de usos industriales y nutricionales y son primordiales para la función membranosa y la adaptación climática de las plantas. Estos lípidos representan un vasto conjunto de estructuras químicas, y estas estructuras determinan las propiedades fisiológicas e industriales del lípido. Muchas de estas estructuras son directa o indirectamente el resultado de procesos metabólicos que alteran el grado de insaturación del lípido. Diferentes regímenes metabólicos en distintas plantas producen estos lípidos alterados, y habitualmente es necesaria una domesticación de especies vegetales exóticas o una modificación de especies adaptadas agronómicamente para producir económicamente grandes cantidades del lípido deseado.

Los lípidos vegetales encuentran su principal aplicación como aceites comestibles en forma de triacilgliceroles. La actuación específica y los específicos atributos en materia de salud de los aceites comestibles vienen determinados en gran medida por su composición de ácidos grasos. Los de la mayoría de los aceites vegetales sacados de variedades de plantas comerciales se componen primariamente de ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido linolénico (18:3). Los ácidos palmítico y esteárico son respectivamente ácidos grasos saturados de 16 y 18 carbonos de longitud. Los ácidos oleico, linoleico y linolénico son ácidos grasos insaturados de 18 carbonos que contienen uno, dos y tres enlaces dobles, respectivamente. Al ácido oleico se le denomina ácido graso monoinsaturado, mientras que a los ácidos linoleico y linolénico se les denomina ácidos grasos poliinsaturados. Se resumen a continuación (Tabla 1) las cantidades relativas de ácidos grasos saturados e insaturados en los aceites vegetales comestibles que son comúnmente usados:

TABLA 1 Porcentajes de Ácidos Grasos Saturados e Insaturados en los Aceites de Cultivos Oleaginosos Seleccionados

	Saturados	Monoinsaturados	Poliinsaturados
Canola	6%	58%	36%
Soja	15%	24%	61%
Maíz	13%	25%	62%
Cacahuete	18%	48%	34%
Alazor	9%	13%	78%
Girasol	9%	41%	51%
Algodón	30%	19%	51%

Muchos recientes trabajos de investigación han examinado el papel que los ácidos grasos saturados e insaturados desempeñan en la reducción del riesgo de enfermedad cardíaca coronaria. En el pasado se creía que los monoinsaturados, en contraste con los saturados y con los poliinsaturados, carecían de efecto en el colesterol en suero y en el riesgo de enfermedad cardíaca coronaria. Varios estudios clínicos recientes efectuados con seres humanos sugieren que las dietas ricas en grasa monoinsaturada y pobres en grasa saturada pueden reducir el colesterol ``malo'' (lipoproteína de baja densidad) manteniendo el colesterol ``bueno'' (lipoproteína de alta densidad) (Mattson et al., Journal of Lipid Research (1985) 26:194-202).

Un aceite vegetal pobre en saturados totales y rico en monoinsaturados proporcionaría importantes beneficios en materia de salud a los consumidores, así como beneficios económicos a los elaboradores de aceites. Como ejemplo, el aceite de canola es considerado un aceite muy saludable. Sin embargo, en uso, el alto nivel de ácidos grasos poliinsaturados en el aceite de canola hace que el aceite sea inestable, se oxide con facilidad y sea susceptible de desarrollar desagradables olores y sabores (Gailliard, 1980, Vol. 4, pp. 85-116 En: Stumpf, P. K., Ed., The Biochemistry of Plants, Academic Press, Nueva York). Los niveles de poliinsaturados pueden ser reducidos por hidrogenación, pero el gasto que supone este proceso y la concomitante producción de nutricionalmente cuestionables isómeros trans de los restantes ácidos grasos insaturados reducen la deseabilidad global del aceite hidrogenado (Mensink et al., New England J. Medicine (1990) N323: 439-445). Con los aceites de soja y de maíz existen problemas similares.

Para aplicaciones especializadas pueden ser deseables altos niveles de poliinsaturados. El linoleato y el linolenato son ácidos grasos esenciales en las dietas humanas, y un aceite comestible rico en estos ácidos grasos puede ser usado para suplementos nutricionales, por ejemplo en alimentos para bebés.

Con programas de procreación por mutación se ha logrado cierto éxito en cuanto a alterar los niveles de ácidos grasos poliinsaturados que se encuentran en los aceites comestibles de especies agronómicas. Son ejemplos de variedades cultivadas comercialmente el girasol rico en ácido oleico (85%) y el lino pobre en ácido linolénico (2%) (Knowles, (1980) pp. 35-38 En: Applewhite, T. H., Ed., World Conference of Biotechnology for the Fats and Oils Industry Proceedings, American Oil Chemists' Society). Un similar progreso comercial con las otras plantas que están indicadas en la Tabla 1 ha venido siendo elusivo en gran medida debido a la difícil naturaleza del procedimiento y a los efectos pleiotrópicos del régimen mutacional en la resistencia de las plantas al frío y al calor y en la capacidad de producción de las mismas.

La biosíntesis de los principales lípidos vegetales ha sido objeto de gran cantidad de trabajo de investigación (Browse et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. (1991) 42:467-506). Estos estudios ponen de manifiesto que, con la notable excepción de la estearoil desaturasa de proteína portadora de acilo soluble, los pasos de control de la producción de ácidos grasos insaturados son catalizados en gran medida por ácido graso desaturasas asociadas a la membrana. Las reacciones de desaturación tienen lugar en los plástidos y en el retículo endoplásmico usando una variedad de sustratos que incluyen galactolípidos, sulfolípidos y fosfolípidos. Los análisis genéticos y fisiológicos de mutantes nucleares de Arabidopsis thaliana defectivos en varias reacciones de desaturación de ácidos grasos indican que las de la mayor parte de estas reacciones son catalizadas por enzimas que son codificadas en loci genéticos singulares en la planta. Los análisis ponen además de manifiesto que los diferentes defectos en la desaturación de ácidos grasos pueden tener profundos y distintos efectos en la morfología ultraestructural, en la sensibilidad al frío y en la capacidad fotosintética de las plantas (Ohlrogge et al., Biochim. Biophys. Acta (1991) 1082:1-26). Sin embargo, la caracterización bioquímica de las reacciones de desaturasa ha sido escasa. La inestabilidad de las enzimas y la intratabilidad de su correcto análisis han limitado en gran medida a los investigadores a las investigaciones de las actividades enzimáticas en preparaciones de membranas en bruto. Estas investigaciones han demostrado, sin embargo, el papel de las actividades de delta-12 desaturasa y de delta-15 desaturasa en la producción de linoleato y linolenato a partir de 2-oleoil-fosfatidilcolina y 2-linoleoil-fosfatidilcolina, respectivamente (Wang et al., Plant Physiol. Biochem. (1988) 26:777-792). Por consiguiente, la modificación de las actividades de estas enzimas representa un atractivo objetivo a perseguir para alterar los niveles de insaturación de lípidos mediante ingeniería genética.

Han sido descritas secuencias de nucleótidos que codifican delta-9 estearoilcoenzima-A desaturasas microsomales de levadura, rata y ratón (Stukey et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:20144-20149; Thiede et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:13230-13235; Kaestner et al., J. Biol. Chem. (1989) 264:14755-1476). Han sido también descritas secuencias de nucleótidos que codifican delta-9 estearoil desaturasas de proteína portadora de acilo solubles de plantas superiores (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 88:2578-2582; Shanklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1991) 88:2510-2514). Ha sido también descrita [Cahoon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:11184-11188] una secuencia de nucleótidos de coriandro que codifica una ácido graso desaturasa soluble cuya secuencia de aminoácidos deducida es altamente idéntica a la de la estearoil desaturasa de proteína portadora de acilo y que es responsable de introducir el enlace doble en ácido graso petroselínico (18:1, 6c). Han sido descritos dos genes de ácido graso desaturasa de la cianobacteria Synechocystis PCC6803: uno codifica una ácido graso desaturasa, llamada des A, que cataliza la conversión de ácido oleico en la posición sn-1 de los galactolípidos en ácido linoleico [Wada et al., Nature (1990) 347:200-203], y otro codifica una delta-6 ácido graso desaturasa que cataliza la conversión de ácido linoleico en la posición sn-1 de los galactolípidos en ácido \gamma-linolénico (18:2, 6c,9c) [WO 9306712]. Han sido también descritas [WO 9311245; Arondel, V. et. al. (1992) Science 258:1353-1355)] secuencias de nucleótidos que codifican delta-15 ácido graso desaturasas microsomales y plastídicas fijadas a la membrana de plantas superiores. No hay informes sobre el aislamiento de genes de plantas superiores que codifiquen ácido graso desaturasas que no sean las delta-6 y delta-9 desaturasas solubles y las delta-15 desaturasas (microsomales y plastídicas) fijadas a la membrana. Mientras que hay una extensiva identidad de las secuencias de aminoácidos entre las desaturasas solubles y una importante identidad de las secuencias de aminoácidos entre las delta-15 desaturasas microsomales y plastídicas de plantas superiores, no hay una significativa homología entre las desaturasas solubles y las desaturasas fijadas a la membrana. Con los protocolos dependientes de la secuencia basados en las secuencias que codifican delta-15 desaturasas no se ha logrado clonar secuencias para delta-12 desaturasa microsomal. Por ejemplo, con secuencias de nucleótidos de delta-15 desaturasas microsomales o plastídicas como sondas de hibridación no se ha logrado aislar un clon de delta-12 desaturasa microsomal vegetal. Además, mientras que hemos usado un conjunto de oligómeros degenerados hecho según un tramo de 12 aminoácidos que es idéntico en todas las delta-15 desaturasas vegetales y está altamente conservado (10/12) en la desaturasa des A cianobacteriana como sonda de hibridación para aislar una secuencia de nucleótidos de planta superior que codifica delta-12 ácido graso desaturasa plastídica, con este método no se ha logrado aislar los cDNAs de delta-12 desaturasa microsomal. Además, no se ha logrado aislar la delta-12 desaturasa microsomal usando los productos de reacción en cadena de la polimerasa sacados de librería de DNA vegetal, de RNA vegetal o de cDNA vegetal usando cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa hechos según tramos de aminoácidos que están conservados entre las desaturasas des A y delta-15 desaturasas de plantas superiores. Así, no hay descripciones que permitan el aislamiento de delta-12 ácido graso desaturasas microsomales vegetales o de enzimas afines a las ácido graso desaturasas vegetales. Además, no se tiene conocimiento de un método para controlar el nivel de desaturación o hidroxilación de ácidos grasos delta-12 en plantas usando ácidos nucleicos que codifiquen delta-12 ácido graso desaturasas o hidroxilasas.

No ha sido tan bien estudiada la biosíntesis de los lípidos vegetales secundarios. Mientras que han sido descubiertos cientos de distintos ácidos grasos, muchos de ellos del reino vegetal, tan sólo las de una pequeñísima fracción de todas las plantas han sido estudiadas con respecto a su contenido de lípidos (Gunstone et al., Eds., (1986) The Lipids Handbook, Chapman and Hall Ltd., Cambridge). En consecuencia, se sabe poco acerca de la biosíntesis de estos ácidos grasos y derivados de ácidos grasos no habituales. Las características químicas interesantes halladas en tales ácidos grasos incluyen, por ejemplo, enlaces dobles alénicos y conjugados, enlaces acetilénicos, enlaces dobles trans, enlaces dobles múltiples y enlaces dobles singulares en un amplio número de posiciones y configuraciones a lo largo de la cadena del ácido graso. Análogamente, muchas de las modificaciones estructurales encontradas en los lípidos no habituales (como p. ej. hidroxilación, epoxidación, ciclización, etc.) son probablemente producidas por medio de adicional metabolismo a continuación de una activación química del ácido graso por desaturación, o bien suponen una reacción química que es mecanísticamente similar a la desaturación. Muchos de estos ácidos grasos y derivados que tienen tales características dentro de su estructura podrían resultar comercialmente útiles si pudiese inducirse a una especie agronómicamente viable a sintetizarlos por medio de la introducción de un gen que codifique la desaturasa apropiada. Son de particular interés los aceites vegetales ricos en ácido 12-hidroxioctadeca-9-enoico (ácido ricinoleico). El ácido ricinoleico y sus derivados son extensamente usados en la fabricación de lubricantes, polímeros, cosméticos, recubrimientos y productos farmacéuticos (véase, p. ej., Gunstone et al., Eds., (1986) The Lipids Handbook, Chapman and Hall Ltd., Cambridge). La única fuente comercial de ácido ricinoleico es el aceite de ricino, y el 100% del aceite de ricino que es usado por los EE.UU. está sacado de semillas cultivadas en otras partes del mundo, y principalmente en Brasil. El ácido ricinoleico en las semillas de ricino es sintetizado mediante la adición de un grupo hidroxilo en la posición delta-12 del ácido oleico (Galliard & Stumpf (1966) J. Biol. Chem. 241: 5806-5812). Esta reacción se parece a la reacción inicial en un posible mecanismo para la desaturación de oleato en la posición delta-12 para su conversión en linoleato puesto que la deshidratación de ácido 12-hidroxioctadeca-9-enoico, por medio de una actividad enzimática análoga a la hidroxidecanoildehidrasa de E. coli (Cronan et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4641-4646), redundaría en la formación de ácido linoleico. Se ha logrado demostrar que la reacción de hidroxilación es parte de un mecanismo general de desaturación catalizada por enzimas en eucariotas a base de sustituir un átomo de azufre en el sitio de carbono en la posición delta-9 del ácido esteárico. Al ser incubado con extractos celulares de levadura, el tioestearato fue convertido en un 9-sulfóxido (Buist et al. (1987) Tetrahedron Letters 28:857-860). Esta sulfoxidación era específica del azufre en la posición delta-9 y no tenía lugar en un mutante deficiente en delta-9 desaturasa de levadura (Buist & Marecak (1991) Tetrahedron Letters 32:891-894). El 9-sulfóxido es el análogo de azufre del 9-idroxioctadecaestearato, que es el intermedio propuesto de la desaturación de estearato.

La hidroxilación de ácido oleico para su conversión en ácido ricinoleico en las células de semilla de ricino, como la desaturación microsomal de oleato en las plantas, tiene lugar en la posición delta-12 del ácido graso en la posición sm-2 de fosfatidilcolina en microsomas (Bafor et al. (1991) Plant Physiol 280:507-514). Además, la delta-12 hidroxilación de oleato de ricino y la delta-12 desaturación microsomal de oleato vegetal son ambas inhibidas por queladores de hierro y requieren oxígeno molecular [Moreau & Stumpf (1981) Plant Physiology 67:672-676; Somerville, C. (1992) MSU-DOE Plant Research Laboratory Annual Report]. Estas similitudes bioquímicas en conjunción con la observación de que anticuerpos cultivados contra citocromo b_{5} inhiben completamente las actividades tanto de oleato delta-12 desaturación en microsomas de alazor como de oleato delta-12 hidroxilasa en microsomas de ricino [Somerville, C. (1992) MSU-DOE Plant Research Laboratory Annual Report] constituyen una considerable evidencia de que la hidroxilasa y la desaturasa son afines funcionalmente. Parece razonable suponer, por consiguiente, que la secuencia de nucleótidos que codifica una delta-12 desaturasa vegetal sería útil para clonar el gen de oleato hidroxilasa de ricino mediante protocolos dependientes de la secuencia. Esto puede hacerse, por ejemplo, a base de procesar una librería de DNA de ricino con oligómeros basados en regiones de aminoácidos conservadas entre delta-12 desaturasas o en regiones conservadas entre delta-12 desaturasas y otras desaturasas, o con oligómeros basados en aminoácidos conservados entre delta-12 desaturasas e hidroxilasas conocidas asociadas a la membrana. Sería más eficaz aislar el cDNA de oleato hidroxilasa de ricino a base de combinar los protocolos dependientes de la secuencia con un enfoque de librería ``diferencial''. Un ejemplo de una librería diferencial de este tipo estaría basado en distintas etapas del desarrollo de la semilla de ricino, puesto que el ácido ricinoleico no es sintetizado por semillas de ricino muy jóvenes (de menos de 12 días después de la plantación, lo que corresponde a semillas de la etapa I y de la etapa II en el programa de Greenwood & Bewley, Can. J. Bot. (1982) 60:1751-1760), en los 20 días siguientes a estas etapas tempranas el contenido relativo de ricinoleato aumenta pasando de ser de un 0% a ser de casi un 90% de los ácidos grasos seminales totales (James et al. Biochem. J. (1965) 95:448-452, Canvin. Can. J. Biochem. Physiol. (1963) 41:1879-1885). Así, sería posible hacer una librería ``diferencial'' de cDNA hecha a partir de mRNA que estuviese presente en una etapa en la que estuviese siendo sintetizado a alta velocidad ácido ricinoleico pero de la cual hubiese sido retirado el mRNA presente en las etapas anteriores. Para el mRNA de la etapa anterior, sería apropiada una etapa tal como la etapa II (10 días después de la plantación) en la que no se hace ácido ricinoleico pero en la que se hacen otros ácidos grasos insaturados. Es perfectamente conocida en la técnica la construcción de librerías que contienen solamente genes expresados diferencialmente (Sargent. Meth. Enzymol. (1987) 152:423-432). La reunión del ácido ricinoleico libre, por medio de ricinoleoil-CoA, en triacilglicerol es fácilmente catalizada por microsomas de semilla de canola y de alazor (Bafor et al., Biochem J. (1991) 280:507-514, Wiberg et al. 10^{th} International Symposium on the Metabolism, Structure & Function of Plant Lipids (1992), Jerba, Túnez), y el ácido ricinoleico es retirado de fosfatidilcolina por una lipasa que es común a todas las semillas oleaginosas investigadas. Así, sería de esperar que la expresión del gen de oleato hidroxilasa de semilla de ricino en cultivos de plantas oleaginosas, tales como semillas de canola y sojas, redundase en un aceite rico en triglicéridos que contenga ácido ricinoleico.

Breve exposición de la invención

Los solicitantes han descubierto unos medios para controlar la naturaleza y los niveles de ácidos grasos insaturados en las plantas. Son usados para crear genes quiméricos fragmentos de ácido nucleico de cDNAs o genes que codifican ácido graso desaturasas. Los genes quiméricos pueden ser usados para transformar varias plantas para modificar la composición de ácidos grasos de la planta o el aceite producido por la planta. Más específicamente, una realización de la invención es un fragmento de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima delta-12 desaturasa microsomal o delta-12 hidroxilasa, catalizando dicha enzima una reacción en las posiciones de carbono 6 y 7 numeradas desde la terminación metílica de una cadena acil graso de 18 carbonos, correspondiendo las posiciones 6 y 7 a las posiciones de carbono 12 y 13 numeradas desde el carbono carbonílico de una cadena acil graso de 18 carbonos, con una identidad de aminoácidos de un 50%, de un 60%, de un 90% o de un porcentaje mayor con respecto al polipéptido codificado por las secuencias de las ID SEC NÚMS.:1, 3, 5, 7, 9, 11 ó 15. En extremo específicamente, la invención se refiere a una secuencia génica para delta-12 ácido graso desaturasa microsomal vegetal o para una enzima delta-12 hidroxilasa. La planta en esta realización puede ser más específicamente soja, la especie de Brassica de semilla oleaginosa, Arabidopsis thaliana, ricino y maíz.

Otra realización de esta invención supone el uso de estos fragmentos de ácido nucleico en protocolos dependientes de la secuencia. Los ejemplos incluyen el uso de los fragmentos como sondas de hibridación para aislar secuencias de nucleótidos que codifican otras ácido graso desaturasas o enzimas afines a las ácido graso desaturasas. Una realización afín supone el uso de las secuencias descritas para la amplificación de fragmentos de RNA o de DNA que codifican otras ácido graso desaturasas o enzimas afines a las ácido graso desaturasas.

Otro aspecto de esta invención se refiere a genes quiméricos que son capaces de modificar la composición de ácidos grasos en la semilla de una planta transformada, comprendiendo el gen fragmentos de ácido nucleico afines como se define a las secuencias de las ID SEC NÚMS.:1, 3, 5, 7, 9 ó 15 o a la secuencia de la ID SEC Nº:11 que codifica una enzima delta-12 desaturasa microsomal o una enzima delta-12 hidroxilasa ligada operativamente en adecuada orientación a adecuadas secuencias reguladoras.

Otra realización adicional de la invención se refiere a un método para producir aceite seminal que contiene niveles alterados de ácidos grasos insaturados, comprendiendo dicho método los pasos de: (a) transformar una célula vegetal con un gen quimérico anteriormente descrito; (b) cultivar plantas sexualmente maduras a partir de las células vegetales transformadas del paso (a); (c) seleccionar las semillas de la progenie de las plantas sexualmente maduras del paso (b) para los deseados niveles de ácidos grasos insaturados; y (d) elaborar la semilla de la progenie del paso (c) para obtener aceite seminal que contiene niveles alterados de los ácidos grasos insaturados. Los aceites y las células vegetales preferidos se sacan de soja, colza, girasol, algodón, cacao, cacahuete, alazor, coco, lino, palma de aceite y maíz. Los métodos preferidos para transformar tales células vegetales incluirían el uso de plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, la electroporación y el bombardeo balístico a alta velocidad.

La invención puede ser también usada en un método de selección por polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción para obtener niveles alterados de ácidos oleicos en el aceite seminal de especies de plantas oleaginosas. Este método supone los pasos de: (a) hacer un cruce entre dos variedades de especies de plantas oleaginosas que difieran en el rasgo del ácido oleico; (b) hacer una transferencia Southern de DNA genómico digerido con enzima de restricción aislado de varias plantas de la progenie resultante del cruce; y (c) hibridar la transferencia Southern con los fragmentos de ácido nucleico radiomarcado que codifican las ácido graso desaturasas o las enzimas afines a las desaturasas.

La invención puede ser también usada en un método de mapeo por polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción que usa el cDNA aislado de delta-12 desaturasa microsomal o fragmentos genómicos afines aquí descritos.

La invención es también realizada en plantas que son capaces de producir niveles alterados de ácido graso desaturasa en virtud de contener los genes quiméricos aquí descritos. Además, la invención es realizada en aceite seminal obtenido de tales plantas.

Breve descripción de las descripciones de las secuencias

La invención podrá comprenderse más plenamente a la luz de la siguiente descripción detallada y de las Descripciones de Secuencias que forman parte de esta solicitud. Las Descripciones de Secuencias contienen los tres códigos de letras para los aminoácidos que están definidos en 37 C.F.R. 1.822.

La ID SEC Nº:1 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1372 pares de bases del cDNA de Arabidopsis thaliana que codifica delta-12 desaturasa microsomal. Los nucleótidos 93-95 y los nucleótidos 1242-1244 son respectivamente el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 93-1244). Los nucleótidos 1-92 y 1245-1372 son respectivamente los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'.

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La ID SEC Nº:2 es la secuencia de proteína de 383 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótido 93-1244 en la ID SEC Nº:1).

La ID SEC Nº:3 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1394 pares de bases del cDNA de Brassica napus que codifica delta-12 desaturasa microsomal en plásmido pCF2-165d. Los nucleótidos 99 a 101 y los nucleótidos 1248 a 1250 son respectivamente el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 99 a 1250). Los nucleótidos 1 a 98 y 1251 a 1394 son respectivamente los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'.

La ID SEC Nº:4 es la secuencia de proteína de 383 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótidos 99 a 1250) en la ID SEC Nº:3.

La ID SEC Nº:5 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1369 pares de bases de cDNA de soja (Glycine max) que codifica delta-12 desaturasa microsomal en plásmido pSF2-169K. Los nucleótidos 108 a 110 y los nucleótidos 1245 a 1247 son respectivamente el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 108 a 1247). Los nucleótidos 1 a 107 y 1248 a 1369 son respectivamente los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'.

La ID SEC Nº:6 es la secuencia de proteína de 381 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótidos 113 a 1258) en la ID SEC Nº:5.

La ID SEC Nº:7 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1790 pares de bases decDNA de maíz (Zea mays) que codifica delta-12 desaturasa microsomal en plásmido pFad2#1. Los nucleótidos 165 a 167 y los nucleótidos 1326 a 1328 son respectivamente el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 164 a 1328). Los nucleótidos 1 a 163 y 1329 a 1790 son respectivamente los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'.

La ID SEC Nº:8 es la secuencia de proteína de 387 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótidos 164 a 1328) en la ID SEC Nº:7.

La ID SEC Nº:9 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 673 pares de bases de cDNA incompleto de ricino (Ricinus communis) que codifica para de una delta-12 desaturasa microsomal en plásmido pRF2-1C. La secuencia codifica un marco de lectura abierto desde la base 1 hasta la base 673.

La ID SEC Nº:10 es la secuencia de proteína de 219 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótidos 1 a 657) en la ID SEC Nº:9.

La ID SEC Nº:11 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1369 pares de bases de cDNA de ricino (Ricinus communis) que codifica parte de una delta- 12 desaturasa microsomal o enzima afín a la desaturasa en plásmido pRF197C-42. Los nucleótidos 184 a 186 y los nucleótidos 1340 a 1342 son respectivamente el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 184 a 1347). Los nucleótidos 1 a 183 y 1348 a 1369 son respectivamente los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'.

La ID SEC Nº:12 es la secuencia de proteína de 387 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótidos 184 a 1342) en la ID SEC Nº:11.

La ID SEC Nº:13 es la secuencia de un conjunto de oligómeros de 26 nucleótidos degenerados 64 veces, llamados NS3, hechos según los aminoácidos conservados 101-109 de la ID SEC Nº:2, destinados a ser usados como cebadores sentido en la reacción en cadena de la polimerasa para aislar nuevas secuencias que codifican delta-12 desaturasas microsomales o enzimas tipo desaturasa.

La ID SEC Nº:14 es la secuencia de un conjunto de oligómeros de 26 nucleótidos degenerados 64 veces, llamados NS9, hechos según los aminoácidos conservados 313-321 de la ID SEC Nº:2 y que están destinados a ser usados como cebadores antisentido en la reacción en cadena de la polimerasa para aislar nuevas secuencias que codifican delta-12 desaturasas microsomales o enzimas tipo desaturasa.

La ID SEC Nº:15 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 2973 pares de bases de fragmento genómico de Arabidopsis thaliana que contiene el gen de delta-12 desaturasa microsomal contenido en el plásmido pAGF2-6. Sus nucleótidos 433 a 2938 corresponden respectivamente al comienzo y al final de la ID SEC Nº:1. Sus nucleótidos 521 a 1654 son el intrón de 1134 pares de bases.

La ID SEC Nº:16 es la secuencia de un conjunto de oligómeros de 25 nucleótidos degenerados 256 veces, llamados RB5a, hechos según los aminoácidos conservados 318-326 de la ID SEC Nº:2 y destinados a ser usados como cebadores antisentido en la reacción en cadena de la polimerasa para aislar nuevas secuencias que codifican delta-12 desaturasas microsomales o enzimas tipo desaturasa.

La ID SEC Nº:17 es la secuencia de un conjunto de oligómeros de 25 nucleótidos degenerados 128 veces, llamados RB5b, hechos según los aminoácidos conservados 318-326 de la ID SEC Nº:2 y destinados a ser usados como cebadores antisentido en la reacción en cadena de la polimerasa para aislar nuevas secuencias que codifican delta-12 desaturasas microsomales o enzimas tipo desaturasa.

Descripción detallada de la invención

Los solicitantes han aislado fragmentos de ácido nucleico que codifican ácido graso desaturasas vegetales que son enzimas delta-12 desaturasas microsomales o delta-12 hidroxilasa y que son útiles para modificar la composición de ácidos grasos en especies oleaginosas por transformación genética.

Así, la transferencia de los fragmentos de ácido nucleico de la invención o de una parte de los mismos que codifica una enzima funcional junto con adecuadas secuencias reguladoras que dirigen la transcripción de su mRNA (mRNA = RNA mensajero) a una célula viviente redundará en la producción o sobreproducción de ácido graso desaturasas vegetales y redundará en incrementados niveles de ácidos grasos insaturados en los lípidos celulares, incluyendo los triacilgliceroles.

La transferencia de los fragmentos de ácido nucleico de la invención o de una parte de los mismos junto con adecuadas secuencias reguladoras que dirigen la transcripción de su RNA antisentido a plantas redundará en la inhibición de la expresión de la ácido graso desaturasa endógena que es considerablemente homóloga con el fragmento de ácido nucleico transferido y redundará en niveles reducidos de ácidos grasos insaturados en los lípidos celulares, incluyendo los triacilgliceroles.

La transferencia de los fragmentos de ácido nucleico de la invención o de una parte de los mismos junto con adecuadas secuencias reguladoras que dirigen la transcripción de su mRNA a plantas puede redundar en inhibición por cosupresión de la expresión del gen de ácido graso desaturasa endógena que es considerablemente homólogo con el fragmento de ácido nucleico transferido y puede redundar en niveles reducidos de ácidos grasos insaturados en los lípidos celulares, incluyendo los triacilgliceroles.

Los fragmentos de ácido nucleico de la invención pueden ser también usados como marcadores del polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP) en programas de mapeo genético y de selección de plantas.

Los fragmentos de ácido nucleico de la invención o los oligómeros sacados de los mismos pueden ser también usados para aislar otros genes de ácido graso desaturasa afines usando DNA, RNA o una librería de secuencias de nucleótidos clonados de la misma especie o de especies distintas mediante protocolos dependientes de la secuencia perfectamente conocidos que incluyen, por ejemplo, métodos de hibridación y amplificación de ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

Definiciones

En el contexto de esta descripción serán utilizadas las de una serie de expresiones. Los ácidos grasos son especificados mediante el número de átomos de carbono y el número y la posición del enlace doble: los números antes y después de los dos puntos se refieren a la longitud de la cadena y al número de enlaces dobles, respectivamente. El número a continuación de la designación del ácido graso indica la posición del enlace doble desde la terminación carboxílica del ácido graso, indicando el afijo ``c'' la configuración cis del enlace doble. Por ejemplo: ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1,9c), ácido petroselínico (18:1,6c), ácido linoleico (18:2,9c,12c), ácido \gamma-linolénico (18:3,6c,9c,12c) y ácido \alpha-linolénico (18:3,9c,12c,15c). A no ser que se especifique otra cosa, las expresiones 18:1, 18:2 y 18:3 se refieren a los ácidos grasos oleico, linoleico y linolénico. La expresión ``ácido ricinoleico'' se refiere a un ácido graso de 18 carbonos con un enlace doble cis-9 y un grupo 12-hidroxilo. La expresión ``ácido graso desaturasa'' usada en la presente se refiere a una enzima que cataliza la rotura de un enlace carbono-hidrógeno y la introducción de un enlace doble carbono-carbono en una molécula de ácido graso. El ácido graso puede estar libre o esterificado con otra molécula incluyendo, aunque sin carácter limitativo, proteína portadora de acilo, coenzima A, esteroles y la mitad glicerol de glicerolípidos. La expresión ``glicerolípido desaturasas'' utilizada en la presente se refiere a las de un subconjunto de las ácido graso desaturasas que actúan en las mitades de acilo graso esterificadas con una cadena principal de glicerol. La expresión ``delta-12 desaturasa'' se refiere a una ácido graso desaturasa que cataliza la formación de un enlace doble entre las posiciones de carbono 6 y 7 (numeradas a partir de la terminación metílica) (es decir, aquéllas que corresponden a las posiciones de carbono 12 y 13 (numeradas a partir del carbono carbonílico) de una cadena acilo graso de 18 carbonos). La expresión ``delta-15 desaturasa'' se refiere a una ácido graso desaturasa que cataliza la formación de un enlace doble entre las posiciones de carbono 3 y 4 (numeradas a partir de la terminación metílica) (es decir, aquéllas que corresponden a las posiciones de carbono 15 y 16 (numeradas a partir del carbono carbonílico) de una cadena acil graso de 18 carbonos). Los ejemplos de ácido graso desaturasas incluyen, aunque sin carácter limitativo, las delta-12 y delta-15 desaturasas microsomales que actúan en sustratos lipídicos de fosfatidilcolina; las delta-12 y delta-15 desaturasas cloroplásticas o plastídicas que actúan en fosfatidilglicerol y galactolípidos; y otras desaturasas que actúan en sustratos de ácido graso tales como fosfolípidos, galactolípidos y sulfolípidos. La expresión ``desaturasa microsomal'' se refiere a la ubicación citoplásmica de la enzima, mientras que las expresiones ``desaturasa cloroplástica'' y ``desaturasa plastídica'' se refieren a la ubicación plastídica de la enzima. Estas ácido graso desaturasas pueden encontrarse en los de una variedad de organismos entre los que se incluyen, aunque sin carácter limitativo, plantas superiores, diatomeas y varios microorganismos eucarióticos y procarióticos tales como hongos y algas y bacterias fotosintéticas. La expresión ``ácido graso desaturasas homólogas'' se refiere a ácido graso desaturasas que catalizan la misma desaturación en el mismo sustrato lipídico. Así, las delta-15 desaturasas microsomales, aunque sean de distintas especies vegetales, son ácido graso desaturasas homólogas. La expresión ``ácido graso desaturasas heterólogas'' se refiere a ácido graso desaturasas que catalizan desaturaciones en distintas posiciones y/o en distintos sustratos lipídicos. Así por ejemplo, las delta-12 y delta-15 desaturasas microsomales, que actúan en lípidos de fosfatidilcolina, son ácido graso desaturasas heterólogas, aunque sean de la misma planta. Análogamente, la delta-15 desaturasa microsomal, que actúa en lípidos de fosfatidilcolina, y la delta-15 desaturasa cloroplástica, que actúa en galactolípidos, son ácido graso desaturasas heterólogas, aunque sean de la misma planta. Hay que señalar que estas ácido graso desaturasas nunca han sido aisladas y caracterizadas como proteínas. En consecuencia, las expresiones tales como ``delta-12 desaturasa'' y ``delta-15 desaturasa'' son utilizadas por comodidad para describir las proteínas codificadas por fragmentos de ácido nucleico que han sido aislados sobre la base de los efectos fenotípicos ocasionados por su disrupción. Dichas expresiones no implican mecanismo catalítico alguno. Por ejemplo, la expresión ``delta-12 desaturasa'' se refiere a la enzima que cataliza la formación de un enlace doble entre los carbonos 12 y 13 de un ácido graso de 18 carbonos independientemente de si ``cuenta'' los carbonos a partir de la terminación metílica, de la terminación carboxílica o del primer enlace doble. La expresión ``enzima afín a las ácido graso desaturasas'' se refiere a enzimas cuyo producto catalítico puede no ser un enlace doble carbono-carbono pero cuyo mecanismo de acción es similar al de la una ácido graso desaturasa (es decir, la catálisis del desplazamiento de un enlace carbono-hidrógeno de una cadena de ácido graso para formar un intermedio o producto final hidroxiacílico graso). Los ejemplos incluyen la delta-12 hidroxilasa, que significa una delta-12 ácido graso hidroxilasa o la oleato hidroxilasa que es responsable de la síntesis de ácido ricinoleico a partir de ácido oleico.

La expresión ``ácido nucleico'' se refiere a una gran molécula que puede ser de una sola hebra o de doble hebra y se compone de monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, un fosfato y una purina o una pirimidina. Un ``fragmento de ácido nucleico'' es una fracción de una determinada molécula de ácido nucleico. En las plantas superiores, el ácido desoxirribonucleico (DNA) es el material genético, mientras que el ácido ribonucleico (RNA) interviene en la transferencia de la información del DNA a proteínas. Un ``genoma'' es todo el conjunto de material genético contenido en cada célula de un organismo. La expresión ``secuencia de nucleótidos'' se refiere a la secuencia de los polímeros de DNA o de RNA, que pueden ser de una sola hebra o de doble hebra, conteniendo opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas que son susceptibles de ser incorporadas a los polímeros de DNA o RNA. La expresión ``oligómero'' se refiere a cortas secuencias de nucleótidos que son habitualmente de hasta 100 bases. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión ``homóloga a'' se refiere a la afinidad entre la secuencia de nucleótidos de dos moléculas de ácido nucleico o entre las secuencias de aminoácidos de dos moléculas de proteína. Las evaluaciones de tal homología son obtenidas mediante hibridación de DNA-DNA o DNA-RNA bajo condiciones de rigor como comprenden perfectamente los expertos en la materia (Hames and Higgins, Eds. (1985) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, U.K.); o bien mediante la comparación de la similitud de secuencias entre dos ácidos nucleicos o proteínas, tal como mediante el método de Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453). En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión ``considerablemente homólogas'' se refiere a secuencias de nucleótidos que tienen una identidad global de más de un 90% a nivel de los nucleótidos con la región codificante de la secuencia reivindicada, tal como los genes y pseudogenes correspondientes a las regiones codificantes. Los fragmentos de ácido nucleico aquí descritos incluyen moléculas que comprenden posibles variaciones, tanto sintéticas como naturales, tales como, aunque sin carácter limitativo, (a) aquéllas que suponen cambios de bases que no ocasionan un cambio en un aminoácido codificado, o (b) que suponen cambios de bases que alteran un aminoácido pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de DNA, (c) aquéllas que se derivan de eliminaciones, reorganizaciones, amplificaciones o mutagénesis aleatoria o controlada del fragmento de ácido nucleico, y (d) incluso ocasionales errores de secuenciación de nucleótidos.

El vocablo ``gen'' se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las secuencias reguladoras que preceden (no codificantes del lado 5') y siguen (no codificantes de lado 3') a la región codificante. La expresión ``gen de ácido graso desaturasa'' se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína con actividad de ácido graso desaturasa. La expresión ``gen nativo'' se refiere a un gen aislado con sus propias secuencias reguladoras tal como se encuentra en la naturaleza. La expresión ``gen quimérico'' se refiere a un gen que comprende secuencias reguladoras y codificantes heterogéneas que no se encuentran en la naturaleza. La expresión ``gen endógeno'' se refiere al gen nativo que se encuentra normalmente en su ubicación natural en el genoma y no está aislado. La expresión ``gen foráneo'' se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo huésped pero que es introducido mediante transferencia genética. El vocablo ``pseudogen'' se refiere a una secuencia nucleotídica genómica que no codifica una enzima funcional.

La expresión ``secuencia codificante'' se refiere a una secuencia de DNA que codifica para una proteína específica y excluye las secuencias no codificantes. Dicha secuencia codificante puede constituir una ``secuencia codificante ininterrumpida'', es decir una secuencia que carezca de intrones, o bien puede incluir uno o varios intrones limitados por apropiadas uniones de corte y empalme. Un ``intrón'' es una secuencia de nucleótidos que es transcrita en el transcrito primario pero es retirada por corte y nueva ligación del RNA dentro de la célula para crear el mRNA maduro que puede ser traducido a una proteína.

Las expresiones ``codón de iniciación'' y ``codón de terminación'' se refieren a un conjunto de tres nucleótidos adyacentes en una secuencia codificante que especifica la iniciación y la terminación de cadena, respectivamente, de la síntesis de proteína (traducción del mRNA). La expresión ``marco de lectura abierto'' se refiere a la secuencia codificante ininterrumpida por intrones entre los codones de iniciación y terminación que codifica una secuencia de aminoácidos.

La expresión ``transcrito de RNA'' se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por RNA polimerasa de una secuencia de DNA. Cuando el transcrito de RNA es una copia complementaria perfecta de la secuencia de DNA, a dicho transcrito se le llama el transcrito primario, o bien dicho transcrito puede ser una secuencia de RNA obtenida del procesamiento posttranscripcional del transcrito primario, y a dicho transcrito se le denomina el RNA maduro. La expresión ``RNA mensajero (mRNA)'' se refiere al RNA que carece de intrones y puede ser traducido a proteína por la célula. La expresión ``cDNA'' se refiere a un DNA de doble hebra que es complementario del mRNA y está sacado del mismo. La expresión ``RNA sentido'' se refiere a transcrito de RNA que incluye el mRNA. La expresión ``RNA antisentido'' se refiere a un transcrito de RNA que es complementario de la totalidad o de una parte de un mRNA o transcrito primario objetivo y que bloquea la expresión de un gen objetivo interfiriendo en el procesamiento, el transporte y/o la traducción de su mRNA o transcrito primario. La complementariedad de un RNA antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito génico específico, es decir en la secuencia no codificante de lado 5', en la secuencia no codificante de lado 3', en los intrones o en la secuencia codificante. Además, en el sentido en el que la expresión es utilizada en la presente, el RNA antisentido puede contener regiones de secuencias ribozímicas que incrementen la eficacia de un RNA antisentido para bloquear la expresión génica. El vocablo ``ribozima'' se refiere a un RNA catalítico e incluye endorribonucleasas específicas de secuencia.

En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión ``adecuadas secuencias reguladoras'' se refiere a secuencias de nucleótidos en genes nativos o quiméricos que están situados en el lado de cabeza (lado 5'), dentro y/o en el lado de cola (lado 3') con respecto a los fragmentos de ácido nucleico de la invención y que controlan la expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la invención. En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo ``expresión'' se refiere a la transcripción y acumulación estable del (mRNA) sentido o del RNA antisentido sacado del fragmento de ácido nucleico o de los fragmentos de ácido nucleico de la invención que, en conjunción con el aparato proteínico de la célula, redunda en niveles alterados de la ácido graso desaturasa o de las ácido graso desaturasas. La expresión o sobreexpresión del gen supone la transcripción del gen y la traducción del mRNA a proteínas ácido graso desaturasa precursoras o maduras. La expresión ``inhibición antisentido'' se refiere a la producción de transcritos de RNA antisentido que son capaces de impedir la expresión de la proteína objetivo. El vocablo ``sobreexpresión'' se refiere a la producción de un producto génico en organismos transgénicos que sobrepasa los niveles de producción en los organismos normales o no transformados. El vocablo ``cosupresión'' se refiere a la expresión de un gen foráneo que tiene considerable homología con un gen endógeno redundando en la supresión de la expresión tanto del gen foráneo como del gen endógeno. La expresión ``niveles alterados'' se refiere a la producción de un producto génico o de productos génicos en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las de los organismos normales o no transformados.

El vocablo ``promotor'' se refiere a una secuencia de DNA en un gen, habitualmente en el lado de cabeza (lado 5') con respecto a su secuencia codificante, que controla la expresión de la secuencia codificante proporcionando el reconocimiento para RNA polimerasa y otros factores necesarios para la correcta transcripción. En constructos de DNA artificiales pueden usarse también promotores para transcribir RNA antisentido. Los promotores pueden también contener secuencias de DNA que intervienen en la fijación de factores proteína que controlan el rendimiento de la iniciación de la transcripción en respuesta a las condiciones fisiológicas o de desarrollo. El promotor puede también contener elementos potenciadores. Un ``potenciador'' es una secuencia de DNA que puede estimular la actividad de un promotor. Dicha secuencia puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel y/o la especificidad tisular de un promotor. La expresión ``promotores constitutivos'' se refiere a aquéllos que dirigen la expresión génica en todos los tejidos y en todo momento. En el sentido en el que las expresiones son utilizadas en la presente, son ``promotores específicos del tejido'' o ``promotores específicos del desarrollo'' aquéllos que dirigen la expresión génica casi exclusivamente en tejidos específicos, tales como las hojas o las semillas, o en específicas etapas del desarrollo en un tejido, tal como en la embriogénesis inicial o final, respectivamente.

La expresión ``secuencias no codificantes del lado 3''' se refiere a la parte de la secuencia de DNA de un gen que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar procesamiento de mRNA o expresión génica. La señal de poliadenilación está habitualmente caracterizada por efectuar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de mRNA.

En el sentido en el que se le utiliza en la presente, el vocablo ``transformación'' se refiere a la transferencia de un gen foráneo al genoma de un organismo huésped y su herencia genéticamente estable. La expresión ``polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción'' (RFLP) se refiere a los tamaños de los fragmentos de restricción que tienen distintos dimensionados debido a las secuencias de nucleótidos alteradas en o en torno a formas variantes de genes. La expresión ``selección molecular'' se refiere al uso de técnicas de diagnosis basadas en el DNA, tales como las técnicas del RFLP, de los RAPDs (RAPDs = DNAs polimórficos amplificados aleatoriamente) y de la PCR en la selección. El vocablo ``fértil'' se refiere a plantas que son capaces de propagarse sexualmente.

El vocablo ``plantas'' se refiere a organismos fotosintéticos, tanto eucarióticos como procarióticos, mientras que la expresión ``plantas superiores'' se refiere a plantas eucarióticas. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión ``especies oleaginosas'' se refiere a especies vegetales que producen y almacenan triacilglicerol en órganos específicos, y principalmente en las semillas. Tales especies incluyen la soja (Glycine max), la colza y la canola (incluyendo Brassica napus, B. campestris), el girasol (Helianthus annus), el algodón (Gossypium hirsutum), el maíz (Zea mays), el cacao (Theobroma cacao), el alazor (Carthamus tinctorius), la palma de aceite (Elaeis guineensis), el cocotero (Cocos nucifera), el lino (Linum usitatissimum), el ricino (Ricinus communis) y el cacahuete (Arachis hypogaea). El grupo incluye también especies no agronómicas que son útiles para desarrollar apropiados vectores de expresión, tales como el tabaco, las especies de Brassica de rápido ciclaje y la Arabidopsis thaliana, y especies salvajes que pueden ser fuente de ácidos grasos singulares.

La expresión ``protocolos dependientes de la secuencia'' se refiere a técnicas que se basan en una secuencia de nucleótidos para su utilidad. Los ejemplos de protocolos dependientes de la secuencia incluyen, aunque sin carácter limitativo, los métodos de hibridación de ácido nucleico y de oligómeros y métodos de amplificación de DNA y RNA tales como los ejemplificados en varios usos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

A varias soluciones que son usadas en las manipulaciones experimentales se alude con sus nombres comunes tales como ``SSC'', ``SSPE'', ``solución de Denhardt'', etc. La composición de estas soluciones puede encontrarse haciendo referencia al Apéndice B de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Mutagénesis por T-DNA (T-DNA = DNA transferido) e identificación de un mutante de arabidopsis Defectivo en Delta-12 desaturación microsomal

En la mutagénesis por T-DNA (Feldmann et al., Science (1989) 243:1351-1354), la integración de T-DNA en el genoma puede interrumpir la expresión normal del gen en el sitio de la integración o cerca del sitio de la integración. Si el fenotipo mutante resultante puede ser detectado y si puede demostrarse que el mismo está estrechamente ligado genéticamente a la inserción de T-DNA, el locus mutante ``identificado'' y su sosía de tipo salvaje pueden ser fácilmente aislados por clonación molecular por un experto en la materia.

Semillas de Arabidopsis thaliana fueron transformadas por la cepa C58C1rif de Agrobacterium tumefaciens que aloja el plásmido Ti avirulento pGV3850::pAK1003 que tiene la región de T-DNA entre los bordes izquierdo y derecho del T-DNA sustituida por el gen de resistencia a la ampicilina y origen de región de replicación del plásmido pBR322, un gen de resistencia bacteriana a la canamicina y un gen de resistencia vegetal a la canamicina (Feldmann et al., Mol. Gen. Genetics (1987) 208:1-9). Plantas de las semillas tratadas fueron autofertilizadas y las semillas descendientes resultantes, germinadas en presencia de canamicina, fueron autofertilizadas para dar lugar a una población, designada con T3, que presentaba segregación con respecto a las inserciones de T-DNA. Semillas T3 de aproximadamente 1700 plantas T2 fueron germinadas y cultivadas en un entorno controlado. Fueron formadas agrupaciones con una hoja de cada una de diez plantas T3 de cada línea, y las mismas fueron analizadas para determinar la composición de ácidos grasos. Una línea, llamada 658, presentaba un incrementado nivel de ácido oleico (18:1). Los análisis de doce semillas T3 individuales de la línea 658 identificaron dos semillas que contenían más de un 36% de ácido oleico, mientras que las semillas restantes contenían un 12-22% de ácido oleico. El fenotipo mutante de nivel incrementado de ácido oleico en los tejidos foliares y seminales de la línea 658 y su segregación en semillas T3 individuales sugerían que la línea 658 aloja una mutación que afecta la desaturación de ácido oleico a ácido linoleico en los tejidos tanto foliares como seminales. Cuando aproximadamente 200 semillas T3 de la línea 658 fueron analizadas para determinar su capacidad para germinar en presencia de canamicina, fueron identificadas cuatro semillas sensibles a la canamicina, lo cual sugería múltiples, y posiblemente tres, insertos de T-DNA en la línea T2 original. Cuando semillas descendientes de 100 plantas T3 individuales fueron analizadas para determinar su composición de ácidos grasos y su capacidad para germinar sobre canamicina, fue identificada una planta, llamada 658-75, cuya progenie presentaba una segregación de 7 de tipo salvaje:2 mutantes para el ácido oleico incrementado y 28 sensibles:60 resistentes para la resistencia a la canamicina. Fueron cultivadas aproximadamente 400 semillas descendientes T4 de la línea derivativa 658-75, y sus hojas fueron analizadas para determinar la composición de ácidos grasos. Noventa y una de estas plantas de semillero fueron identificadas como homocigotos para el fenotipo mutante (de alto contenido de ácido oleico). Ochenta y tres de estas plantas homocigotos fueron analizadas para determinar la presencia de nopalina, que es otro marcador para T-DNA, y todas ellas resultaron positivas para la nopalina. Sobre la base de estos estudios genéticos se dedujo que la mutación en la delta-12 desaturación microsomal estaba ligada al T-DNA.

Aislamiento de DNA genómico de arabidopsis 658-75 que contiene el gen desorganizado que controla la delta-12 desaturación microsomal

A fin de aislar el gen que controla la delta-12 desaturación microsomal a partir de Arabidopsis de tipo salvaje, un fragmento de ``unión'' de T-DNA-DNA vegetal que contenía un borde de T-DNA integrado en el DNA de la planta huésped fue aislado a partir de las plantas mutantes homocigóticas de la línea 658-75 de Arabidopsis. Para esto, DNA genómico de la planta mutante fue aislado y digerido completamente por enzimas de restricción Bam HI o Sal I. En cada caso era de esperar que uno de los fragmentos resultantes contuviese el gen de origen de replicación y resistencia a la ampicilina de pBR322 así como el fragmento izquierdo de la unión de T-DNA-DNA vegetal. Tales fragmentos fueron rescatados como plásmidos a base de ligar los fragmentos de DNA genómico digerido a una concentración diluida para facilitar la autoligación y usando entonces los fragmentos ligados para transformar células de E. coli. Mientras que no fue obtenida una colonia resistencia a la ampicilina del rescate de plásmidos de DNA genómico vegetal digerido con Sal I, fue obtenida una sola colonia resistente a la ampicilina del rescate plasmídico de DNA genómico vegetal digerido con Bam HI. El plásmido obtenido de este transformante fue llamado p658-1. Los análisis de restricción del plásmido p658-1 con las enzimas de restricción Bam HI, Sal I y Eco RI sugerían marcadamente que el mismo contenía la prevista parte de 14,2 kb del T-DNA (que contenía secuencias de pBR322) y un putativo fragmento de DNA vegetal/borde izquierdo de T-DNA en un fragmento Eco RI-Bam HI de 1,6 kb. El fragmento Eco RI-Bam HI de 1,6 kb fue subclonado en pBluescript SK [Stratagene] mediante procedimientos de clonación estándar descritos en Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), y el plásmido resultante fue llamado pS1658.

Aislamiento de cDNA y gen de delta-12 desaturasa microsomal a partir de arabidopsis de tipo salvaje

El fragmento Eco RI-Bam HI de 1,6 kb, que contenía el putativo DNA vegetal flanqueando el T-DNA en el plásmido p658-1, fue aislado y usado como una sonda de hibridación radiomarcada para examinar una librería de cDNA hecha según poliA^{+} mRNA de las partes al descubierto de plantas Arabidopsis thaliana cuyo tamaño variaba yendo desde el de aquéllas que acababan de abrir sus hojas primarias hasta el de las plantas que habían echado vástagos y estaban floreciendo [Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:1731-1735]. Los insertos de cDNA en la librería fueron hechos en un sitio para Xho I flanqueado por sitios para Eco RI en vector lambda Yes [Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:1731-1735]. De las varias placas en las que resultó positiva la hibridación, cuatro fueron sometidas a purificación de placa. Los plásmidos fueron extirpados de los fagos purificados mediante recombinación específica de sitio usando el sistema de recombinación cre-lox en la cepa BNN132 de E. coli [Elledge et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:1731-1735]. Los cuatro plásmidos extirpados fueron digeridos por enzima de restricción Eco RI, y se comprobó que contenían insertos de cDNA cuyo tamaño estaba situado entre 1 kb y 1,5 kb. La determinación de la secuencia de nucleótidos parcial y el mapeo por enzimas de restricción de los cuatro cDNAs revelaron su identidad común.

Fueron determinadas las secuencias de nucleótidos parciales de dos cDNAs, llamados pSF2b y p92103, que contenían insertos de poco más o menos 1,2 kb y poco más o menos 1,4 kb, respectivamente. La secuencia compuesta sacada de estos plásmidos está ilustrada como la ID SEC Nº:1, y se prevé que la misma esté completamente contenida en el plásmido p92103. La IDE SEC Nº:1 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1372 pares de bases del cDNA de Arabidopsis que codifica delta-12 ácido graso desaturasa microsomal. Los nucleótidos 93-95 son el putativo codón de iniciación del marco de lectura abierto (nucleótidos 93-1244), (identificado por comparación de otras delta-12 desaturasas vegetales en esta solicitud). Los nucleótidos 1242-1244 son el codón de terminación. Los nucleótidos 1 a 92 y 1245-1372 son los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3', respectivamente. La secuencia proteica de 383 aminoácidos en la ID SEC Nº:2 es la deducida del marco de lectura abierto y tiene un peso molecular estimado de 44 kD.

El gen correspondiente a la ID SEC Nº:1 fue aislado sometiendo a selección a una librería de DNA genómico de Arabidopsis usando inserto de cDNA de pSF2b radiomarcado, purificando la placa en la que había resultado positiva la hibridación, y subclonando un fragmento de inserto de Hind III de 6 kb del DNA del fago en vector pBluescript. La secuencia de 2973 nucleótidos del gen está ilustrada en la ID SEC Nº:15. La comparación de las secuencias del gen (ID SEC Nº:15) y del cDNA (ID SEC Nº:1) reveló la presencia de un solo intrón de 1134 pares de bases en una posición situada entre las posiciones nucleotídicas 88 y 89 del cDNA, lo cual es 4 nucleótidos en el lado 5' con respecto al codón de iniciación.

El inserto del fragmento del borde genómico de Eco RI-Bam HI de 1,6 kb en pS1658 fue también parcialmente secuenciado desde los extremos de Bam HI y Eco RI. La comparación de las secuencias de nucleótidos del gen (ID SEC Nº:15), del cDNA (ID SEC Nº:1), del fragmento del borde y de la secuencia publicada del extremo izquierdo de T-DNA (Yadav et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6322-6326) reveló que a) la secuencia de los primeros 451 nucleótidos del fragmento del borde desde el extremo de Bam HI es colineal con la de los nucleótidos 539 (sitio para Bam HI) a 89 del cDNA, b) desde el extremo de Eco RI el fragmento del borde es colineal entre los nucleótidos 1 y 61 con el del extremo izquierdo de T-DNA (exceptuando una eliminación de 9 nucleótidos contiguos en la posición 42 en el fragmento del borde) y es colineal entre los nucleótidos 57 y 104 con el de los nucleótidos 41-88 del cDNA, y c) las divergencias de secuencia entre el fragmento del borde y el cDNA son debidas a la presencia del intrón en el fragmento del borde. Estos resultados ponen de manifiesto que el T-DNA desorganizó el gen de delta-12 desaturasa microsomal en la región transcrita entre el promotor y la región codificante y en el lado 5' con respecto al intrón en la secuencia no traducida.

Un DNA de fago que contenía gen de delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis fue usado como marcador de RFLP en una transferencia Southern que contenía DNA genómico de diversa progenie de Arabidopsis thaliana (fondo de ecotipo Wassileskija y de ecotipo Landesberg de la línea marcadora W100) digerido con Hind III. Esto mapeó el gen de delta-12 desaturasa microsomal a 13,6 cM en ubicación proximal con respecto al locus c3838, a 9,2 cM en ubicación distal con respecto al locus 1At228 y a 4,9 cM en ubicación proximal con respecto al locus Fad D en el cromosoma 3 [Koorneef, M. et al., (1993) en Genetic Maps, Ed. O'Brien, S. J.; Yadav et al. (1993) Plant Physiology 103:467-476]. Esta posición corresponde de cerca al locus anteriormente sugerido para la delta-12 desaturación microsomal (Fad 2) [Hugly, S. et al., (1991) Heredity 82:4321].

Los marcos de lectura abiertos en la ID SEC Nº:1 y en las secuencias que codifican delta-15 desaturasa microsomal de Arabidopsis [WO 9311245], delta-15 desaturasa plastídica de Arabidopsis [WO 9311245] y desaturasa cianobacteriana des A, [Wada et al., Nature (1990) 347:200-203; Genbank ID:CSDESA; Nº de Accesión al GenBank: X53508] así como sus secuencias de aminoácidos deducidas fueron comparados mediante el método de Needleman et al. [J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453] usando unos valores de ponderación de laguna y de ponderación del tamaño de laguna de 5,0 y 0,3, respectivamente, para las secuencias de nucleótidos, y de 3,0 y 0,1, respectivamente, para las secuencias proteicas. Las identidades globales están resumidas en la Tabla 2.

TABLA 2 Identidad porcentual entre distintas ácido graso desaturasas a nivel de los nucleótidos y a nivel de los aminoácidos

	a3	ad	des A
a2	nucleótido	48 (8 lagunas)	46 (6 lagunas)	43 (10 lagunas)
	aminoácido	39 (9 lagunas)	34 (8 lagunas)	24 (10 lagunas)
a3	nucleótido	-	65 (1 lagunas)	43 (9 lagunas)
	aminoácido	-	65 (2 lagunas)	26 (11 lagunas)
ad	nucleótido	-	-	43 (9 lagunas)
	aminoácido	-	-	26 (11 lagunas)

a2, a3, ad y des A se refieren, respectivamente, a la ID SEC Nº:1/2, delta-15 desaturasa microsomal de Arabidopsis, delta-15 desaturasa plastídica de Arabidopsis y desaturasa cianobacteriana, des A}. Las identidades porcentuales en cada comparación están indicadas tanto a nivel de los nucleótidos como a nivel de los aminoácidos, y los números de lagunas impuestas por las comparaciones están indicados entre paréntesis a continuación de las identidades porcentuales. Como era de esperar sobre la base de los intentos sin éxito de usar secuencias de nucleótidos de ácido graso delta-15 como sondas de hibridación para aislar secuencias de nucleótidos que codifiquen delta-12 ácido graso desaturasa microsomal, la homología global a nivel de los nucleótidos entre la delta-12 ácido graso desaturasa (ID SEC Nº:1) y las secuencias de nucleótidos que codifican las otras tres desaturasas es escasa (estando situada entre un 43% y un 48%). También a nivel de los aminoácidos la delta-12 ácido graso desaturasa microsomal (ID SEC Nº:2) es poco afín a la des A cianobacteriana (con una identidad de menos de un 24%) y a las delta-15 desaturasas vegetales (con una identidad de menos de un 39%).

Mientras que la afinidad global entre la secuencia de aminoácidos deducida de dicha invención y las ácido graso desaturasas publicadas es limitada, se observan identidades más significativas en tramos más cortos de las secuencias de aminoácidos en las anteriores comparaciones. Estos resultados confirmaron que el T-DNA en la línea 658-75 había interrumpido la expresión normal de un gen de ácido graso desaturasa. Sobre la base del fenotipo de ácidos grasos de la línea mutante homocigótica 658-75, los Solicitantes llegaron a la conclusión de que la secuencia de la ID SEC Nº:1 codificaba la delta-12 desaturasa. Además, los Solicitantes dedujeron que se trataba de la delta-12 desaturasa microsomal y no de la delta-12 desaturasa cloroplástica, puesto que: a) el fenotipo mutante era marcadamente expresado en la semilla pero poco expresado o no expresado en absoluto en la hoja de la línea 658-75, y b) el polipéptido de delta-12 desaturasa, por comparación con los polipéptidos de delta-15 desaturasa microsomal y plastídica [WO 911245], no tenía una prolongación N-terminal de un péptido de tránsito prevista para una desaturasa plastídica codificada nuclearmente.

El plásmido p92103 fue depositado el 16 de octubre de 1992 en la Colección Americana de Tipos de Cultivo de Rockville, Maryland, al amparo de las disposiciones del Tratado de Budapest, y tiene el número de accesión ATCC 69095.

Expresión de delta-12 ácido graso desaturasa microsomal en mutante Fad2-1 de arabidopsis para complementar su mutación en delta-12 ácido graso desaturación

Para confirmar la identidad de la ID SEC Nº:1 (cDNA de delta-12 ácido graso desaturasa microsomal de Arabidopsis), un gen quimérico que constaba de la ID SEC Nº:1 fue transformado en una mutante de Arabidopsis afectada en delta-12 ácido graso desaturación microsomal. Para esto, el fragmento Eco RI de aprox. 1,4 kb que contenía el cDNA (ID SEC. Nº:1) fue aislado de plásmido p92103 y subclonado en vector pGA748 [An et al. (1988) Binary Vectors. En: Plant Molecular Biology Manual. Eds. Gelvin, S. B. et al. Kluwer Academic Press] que fue previamente linealizado con enzima de restricción Eco RI. En uno de los plásmidos binarios resultantes, llamado pGA-Fad2, el cDNA fue puesto en la orientación sentido detrás del promotor CaMV 35S del vector para proporcionar expresión constitutiva.

El vector binario pGA-Fad2 fue transformado por el método de congelación y descongelación [Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187] en la cepa R1000 de Agrobacterium tumefaciens, que lleva el plásmido Ri pRiA4b de Agrobacterium rhizogenes [Moore et al., (1979) Plasmid 2:617-626], redundando en las transformantes R1000/pGA-Fad2.

Las cepas R1000 y R1000/pGA-Fad2 de Agrobacterium fueron usadas para transformar la mutante fad2-1 de Arabidopsis [Miquel, M. & Browse, J. (1992) Journal of Biological Chemistry 267:1502-1509], y la cepa R1000 fue usada para transformar Arabidopsis de tipo salvaje. Los vástagos jóvenes de las plantas fueron esterilizados y cortados de forma tal que estaba presente un solo nodo en cada explante. Los explantes fueron inoculados con Agrobacterias e incubados a 25ºC en la oscuridad sobre medio orgánico mínimo MS (= medio orgánico mínimo de Murashige y Skoog) exento de drogas con 30 g/l de sucrosa (Gibco). Después de cuatro días, los explantes fueron transferidos a medio MS sin usar que contenía 500 mg/l de cefotaxima y 250 mg/ml de carbenicilina para la contraselección de Agrobacterium. Después de 5 días, raíces pilosas sacadas de la transformación con R1000/pGA-Fad2 fueron extirpadas y transferidas al mismo medio, que contenía 50 mg/ml de canamicina. Fueron preparados ésteres metílicos de ácido graso a partir de 5-10 mm de las raíces en esencia como describen Browse et al., (Anal. Biochem. (1986) 152:141-145), exceptuando que fue usado como reactivo de metilación H_{2}SO_{4} al 2,5% en metanol y las muestras fueron calentadas por espacio de 1,5 h a 80ºC para efectuar la metanólisis de los triglicéridos seminales. Los resultados están indicados en la Tabla 3. Las muestras de raíces 41 a 46, 48 a 51, 58 y 59 están sacadas de la transformación de plantas fad2-1 con R1000/pGA Fad2; las muestras de raíces 52, 53 y 57 fueron sacadas de la transformación de plantas fad2-1 con R1000 y sirven de controles; y la muestra de raíz 60 es sacada de la transformación de Arabidopsis de tipo salvaje con R1000 y sirve también de control.

TABLA 3 Composición de ácidos grasos en raíces pilosas de arabidopsis fad2-1 transgénica transformadas con agrobacterium R1000/pGA-fad2

Muestra	16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	18:3
41	24.4	1.8	1.7	5.0	29.4	33.8
42	25.6	3.7	1.3	20.0	22.0	27.5
43	23.6	-	1.6	7.2	27.6	36.1
44	24.4	1.3	4.6	16.0	18.1	33.6
45	20.7	-	8.1	44.-7	11.8	14.8
46	20.1	-	1.8	7.5	33.7	36.0
48	26.1	2.9	2.1	9.5	17.6	33.4
49	30.8	1.0	2.4	8.7	18.7	31.1
50	19.8	1.9	3.3	27.7	21.8	24.4
51	20.9	1.1	5.0	13.7	25.0	32.1
58	23.5	0.3	1.4	3.6	22.1	45.9
59	22.6	0.6	1.4	2.8	29.9	40.4
52, cont.	12.3	-	2.6	64.2	4.6	16.4
53, cont.	20.3	9.1	2.2	55.2	1.7	9.2
57, cont.	10.4	2.4	0.7	65.9	3.8	12.7
60, WT	23.0	1.7	0.8	6.0	35.0	31.8

Estos resultados ponen de manifiesto que la expresión de delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis en una Arabidopsis mutante carente de delta-12 desaturación puede redundar en una complementación parcial a completa de la mutante. La disminución de los niveles de ácido oleico en las raíces transgénicas va acompañada por incrementos de los niveles tanto de 18:2 como de 18:3. Así, es también de esperar que la sobreexpresión de este gen en otros cultivos oleaginosos, y especialmente en canola, que es una pariente cercana de la Arabidopsis y tiene de manera natural altos niveles de 18:1 en las semillas, redunde en niveles más altos de 18:2, lo cual en conjunción con la sobreexpresión de la delta-15 ácido graso desaturasa microsomal redundará en niveles muy altos de 18:3.

Uso del cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de arabidopsis como sonda de hibridación para aislar cDNAs de delta-12 desaturasa microsomal a partir de otras especies de plantas

La evidencia de la conservación de las secuencias de delta-12 desaturasa entre las especies fue obtenida usando el inserto de cDNA de Arabidopsis de pSF2b como sonda de hibridación para clonar secuencias afines de Brassica napus y soja. Además, delta-12 ácido graso desaturasas microsomales de maíz y de grano de ricino fueron aisladas mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores hechos según las regiones conservadas de las delta-12 desaturasas microsomales.

Clonación de un cDNA de semilla de brassica napus que codifica delta-12 ácido graso desaturasa microsomal seminal

Con la finalidad de clonar el cDNA seminal de Brassica napus que codifica una delta-12 ácido graso desaturasa, el inserto de cDNA de pSF2b fue aislado mediante digestión de pSF2b con EcoR I seguida por purificación del inserto de 1,2 kb mediante electroforesis sobre gel. El fragmento de 1,2 kb fue radiomarcado y usado como sonda de hibridación para procesar una librería de cDNA de fago lambda hecha con poli A^{+} mRNA de semillas de Brassica napus en desarrollo 20-21 días después de la polinización. Aproximadamente 600.000 placas fueron sometidas a selección en condiciones de hibridación poco rigurosas (Tris 50mM pH 7,6, 6X SSC, 5X Denhardt, SDS al 0,5%, 100 ug de DNA de timo de ternero desnaturalizado y 50ºC) y con lavados (dos lavados con 2X SSC, SDS al 0,5% a temperatura ambiente por espacio de 15 minutos cada uno, y a continuación dos veces con 0,2X SSC, SDS al 0,5% a temperatura ambiente por espacio de 15 minutos cada vez, y a continuación dos veces con 0,2X SSC, SDS al 0,5% a 50ºC por espacio de 15 minutos cada vez). Diez fagos con fuerte hibridación fueron purificados en placas, y el tamaño de los insertos de cDNA fue determinado mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del inserto usando fago como molde y oligómeros T3/T7 como cebadores. Dos de estos fagos, que eran el 165D y el 165F, tenían insertos amplificados por reacción en cadena de la polimerasa de 1,6 kb y de 1,2 kb respectivamente, y estos fagos fueron también usados para sacar los fagomidos como se ha descrito anteriormente. El fagomido sacado del fago 165D, llamado pCF2-165D, contenía un inserto de 1,5 kb que estaba completamente secuenciado en una hebra. La ID SEC Nº:3 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1394 pares de bases del cDNA de Brassica napus que codifica delta-12 desaturasa en plásmido pCF2-165d. Los nucleótidos 99 a 101 y los nucleótidos 1248 a 1250 son, respectivamente, el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 99 a 1250). Los nucleótidos 1 a 98 y 1251 a 1394 son, respectivamente, los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'. La secuencia proteica de 383 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto en la ID SEC Nº:3 está ilustrada en la ID SEC Nº:4. Mientras que la otra hebra puede ser fácilmente secuenciada para confirmación, las comparaciones de las ID SEC Núms.:1 y 3 y de las ID SEC Núms.:2 y 4, incluso admitiendo posibles errores de secuenciación, pusieron de manifiesto una homología global de aproximadamente un 84% tanto a nivel de los nucleótidos como a nivel de los aminoácidos, lo cual confirmó que el pCF2-165D es un cDNA seminal de Brassica napus que codificaba delta-12 desaturasa. El plásmido pCF2-165D ha sido depositado el 16 de octubre de 1992 en la Colección Americana de Tipos de Cultivo de Rockville, Maryland, al amparo de las disposiciones del Tratado de Budapest, y tiene el número de accesión ATCC 69094.

Clonación de un cDNA de soja (glicine max) que codifica delta-12 ácido graso desaturasa microsomal seminal

Una librería de cDNA fue hecha según poli A^{+} mRNA aislado a partir de semillas de soja en desarrollo, y fue sometida a selección como se ha descrito anteriormente. Fue añadida sonda radiomarcada preparada a partir de pSF2b como se ha descrito anteriormente, y se dejó que tuviese lugar la hibridación por espacio de 18 h a 50ºC. Las sondas fueron lavadas como se ha descrito anteriormente. La autorradiografía de los filtros indicó que había 14 placas en las que se había producido una fuerte hibridación, y numerosas placas en las que se había producido una débil hibridación. Seis de las 14 placas en las que se había producido una fuerte hibridación fueron sometidas a purificación de placas como se ha descrito anteriormente, y el tamaño del inserto de cDNA fue determinado mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del inserto usando fago como molde y oligómeros T3/T7 como cebadores. Uno de estos fagos, el 169K, tenía un tamaño de inserto de 1,5 kb, y este fago fue también usado para sacar el fagomido como se ha descrito anteriormente. El fagomido sacado del fago 169K, llamado pSF2-169K, contenía un inserto de 1,5 kb que estaba completamente secuenciado en ambas hebras. La ID SEC Nº:5 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1473 pares de bases de cDNA de soja (Glycine max) que codifica delta-12 desaturasa en plásmido pSF2-169K. Los nucleótidos 108 a 110 y los nucleótidos 1245 a 1247 son, respectivamente, el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 108 a 1247). Los nucleótidos 1 a 107 y 1248 a 1462 son, respectivamente, los nucleótidos no traducidos del lado 5' y del lado 3'. La secuencia proteica de 380 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto en la ID SEC Nº:5 está ilustrada en la ID SEC Nº:6. Las comparaciones de las ID SEC Núms.:1 y 5 y de las ID SEC Núms.:2 y 6, incluso admitiendo posibles errores de secuenciación, pusieron de manifiesto una homología global de aproximadamente un 65% a nivel de los nucleótidos y de aproximadamente un 70% a nivel de los aminoácidos, lo cual confirmó que el pSF2-169K es un cDNA seminal de soja que codificaba delta-12 desaturasa. Una adicional descripción de este clon puede ser obtenida mediante una comparación de la ID SEC Nº:1, la ID SEC Nº:3 y la ID SEC Nº:5 y analizando el fenotipo de plantas transgénicas producidas usando genes quiméricos que incorporan el inserto de pSF2-169K, en orientación sentido o antisentido, con adecuadas secuencias reguladoras. El plásmido pSF2-169K fue depositado el 16 de octubre de 1992 en la Colección Americana de Tipos de Cultivo de Rockville, Maryland, al amparo de las disposiciones del Tratado de Budapest, y tiene el número de accesión ATCC 69092.

Clonación de un cDNA de maíz (zea mays) que codifica delta-12 ácido graso desaturasa microsomal seminal

cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de maíz fue aislado utilizando un procedimiento en el que se hizo uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Para esto se hizo una librería de cDNA según poli A^{+} RNA de embriones de maíz en desarrollo en vector Lambda Zap II. Esta librería fue usada como molde para la reacción en cadena de la polimerasa usando conjuntos de oligómeros degenerados NS3 (ID SEC Nº:13) y RB5A/B (ID SEC Núms.:16 y 17) como cebadores sentido y antisentido, respectivamente. NS3 y RB5A/B corresponden a los tramos de aminoácidos 101-109 y 318-326, respectivamente, de la ID SEC Nº:2 que están conservados en las de la mayoría de las delta-12 desaturasas microsomales (como por ejemplo, las ID SEC Núms.:2, 4, 6, 8). La reacción en cadena de la polimerasa fue llevada a cabo usando un conjunto de materiales y utensilios para la realización de la reacción en cadena de la polimerasa (Perkin-Elmer) efectuando 40 ciclos de 94ºC por espacio de 1', 45ºC por espacio de 1 min. y 55ºC por espacio de 2 min. Los análisis de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa sobre un gel de agarosa pusieron de manifiesto la presencia de un producto del tamaño previsto (720 pares de bases) que estaba ausente en las reacciones de control que contenían solamente los cebadores sentido o antisentido. El fragmento fue sometido a purificación en gel y fue entonces usado como sonda para someter a selección a la librería de cDNA de maíz a 60ºC como se ha descrito anteriormente. Fue sometida a purificación una placa en la que había resultado positiva la hibridación, y la determinación de secuencia parcial de su cDNA puso de manifiesto que se trataba de una secuencia de nucleótidos que codificaba delta-12 desaturasa microsomal pero truncada en el extremo 3'. El inserto de cDNA que codificaba la desaturasa parcial fue aislado en gel y usado para sondar de nuevo la libraría de cDNA de maíz. Fueron recuperadas y caracterizadas varias placas positivas. El análisis de la secuencia de DNA reveló que todos estos clones parecen representar la misma secuencia con la distinta longitud de los extremos 5' ó 3'. El clon que contenía el inserto más largo, llamado pFad2#1, fue secuenciado completamente. La longitud total del cDNA es de 1790 pares de bases (ID SEC Nº:7) y comprende un marco de lectura abierto desde el nucleótido 165 hasta el par de bases 1328 que codificaba un polipéptido de 388 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido (ID SEC Nº:8) compartía unas identidades globales de un 71%, un 40% y un 38% con la delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis, la delta-15 desaturasa microsomal de Arabidopsis y la delta-15 desaturasa plastídica de Arabidopsis, respectivamente. Además, a esta secuencia le faltaba una prolongación de aminoácidos N-terminal que indicaría que se trata de una enzima plastídica. Sobre la base de estas consideraciones, se llega a la conclusión de que este polipéptido codifica una delta-12 desaturasa microsomal.

Aislamiento de cDNAs que codifican delta-12 ácido graso desaturasas microsomales y enzimas afines a las desaturasas a partir de semilla de grano de ricino

MRNA polisomal fue aislado a partir de granos de ricino de las capas I-II (5-10 días después de la plantación) y también a partir de granos de ricino de las etapas IV-V (20-25 días después de la plantación). Fueron usados diez ng de cada mRNA para las distintas reacciones en cadena de la polimerasa de transcripción inversa, utilizando el conjunto de materiales y utensilios para la realización de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa de Perkin-Elmer. La reacción de la transcriptasa inversa fue cebada con hexámeros aleatorios, y la reacción en cadena de la polimerasa lo fue con cebadores de delta-12 desaturasa degenerados NS3 y NS9 (ID SEC Núms.:13 y 14). La temperatura de ampliación-hibridación de la reacción en cadena de la polimerasa fue de 50ºC. Un fragmento de DNA de aproximadamente 700 pares de bases fue amplificado a partir de mRNA tanto de las etapas I-II como de las etapas 4-5. El fragmento de DNA amplificado de una de las reacciones fue purificado con gel y clonado en un vector pGEM-T usando el conjunto de materiales y utensilios de Promega para la clonación mediante la reacción en cadena de la polimerasa con pGEM-T para crear el plásmido pRF2-1C. El inserto de 700 pares de bases en pRF2-1C fue secuenciado como se ha descrito anteriormente, y la secuencia de DNA resultante está ilustrada en la ID SEC Nº:9. La secuencia de DNA en la ID SEC Nº:9 contiene un marco de lectura abierto que codifica 219 aminoácidos (ID SEC Nº:10), cuya secuencia tiene una identidad de un 81% (una similitud de un 90%) con los aminoácidos 135 a 353 de la delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis, descrita en la ID SEC Nº:2. El inserto de cDNA en pRF2-1C es por consiguiente un fragmento de 676 pares de bases de un cDNA de plena longitud que codifica una delta-12 desaturasa microsomal seminal de grano de ricino. El cDNA de delta-12 desaturasa microsomal seminal de grano de ricino de plena longitud puede ser aislado a base de someter a selección a una librería de cDNA de grano de ricino a 60ºC, con el inserto marcado de pRF2-1C como se ha descrito en el ejemplo anterior. El inserto en pRF2-1C puede ser también usado para someter a selección librerías de grano de ricino a temperaturas más bajas para aislar secuencias afines a las delta-12 desaturasas, tales como la delta-12 hidroxilasa.

Una librería de cDNA hecha según poli A^{+} mRNA aislado de granos de ricino en desarrollo (etapas IV-V, 20-25 días después de la plantación) fue sometida a selección como se ha descrito anteriormente. Fueron añadidas sondas radiomarcadas preparadas a partir de pSF2b o de pRF2-1C, como se ha descrito anteriormente, y se dejó que tuviese lugar la hibridación por espacio de 18 h a 50ºC. Los filtros fueron lavados como se ha descrito anteriormente. La autorradiografía de los filtros indicó que había numerosas placas en las que se había producido hibridación, en las cuales se apreciaba una fuerte hibridación o una débil hibridación. Tres de las placas en las que se había producido fuerte hibridación (190A-41, 190A-42 y 190A-44) y tres de las placas en las que se había producido débil hibridación (190B-41, 190b-43 y 197c-42) fueron sometidas a purificación de placas utilizando los métodos que han sido descritos anteriormente. El tamaño del inserto de cDNA de los fagos purificados fue determinado mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del inserto usando fago como molde y oligómeros lambda-gt11 (Amplímeros lambda-gt11 de Clontech) como cebadores. Los insertos amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa de los fagos amplificados fueron subclonados en pBluescript (Pharmacia) que había sido cortado con Eco RI y rellenado con Klenow (Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Approach, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los plásmidos resultantes fueron llamados pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44, pRF190b-41, pRF190b-43 y pRF197c-42. Todos los insertos eran de aproximadamente 1,1 kb, con la excepción del pRF197c-42, que era de aproximadamente 1,5 kb. Los insertos en los plásmidos fueron secuenciados como se ha descrito anteriormente. El inserto en pRF190b-43 no contenía marco de lectura abierto alguno, y no fue identificado. Los insertos en pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44 y pRF190b-41 eran idénticos. El inserto en pRF197c-42 contenía todos los nucleótidos de los insertos en pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44 y pRF199b-41 más una parte adicional de aproximadamente 400 pares de bases. Se dedujo por consiguiente que el inserto en pRF197c-42 era una versión más larga de los insertos en pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44 y pRF190b-41 y que todos estaban derivados del mismo mRNA de plena longitud. La secuencia de cDNA completa del inserto en el plásmido pRF197c-42 está ilustrada en la ID SEC Nº:11. La secuencia de aminoácidos deducida de la ID SEC Nº:11, ilustrada en la ID SEC Nº:12, es idéntica en un 78,5% (similitud del 90%) a la delta-12 desaturasa microsomal de ricino anteriormente descrita (ID SEC Nº:10) e idéntica en un 66% (similitud de un 80%) a la secuencia de aminoácidos de delta-12 desaturasa de Arabidopsis en la ID SEC Nº:2. Estas similitudes confirman que pRF197c-42 es un cDNA seminal de grano de ricino que codifica una delta-12 desaturasa microsomal o una enzima afín a la delta-12 desaturasa microsomal, tal como una delta-12 hidroxilasa. Fueron hechos cebadores de reacción en cadena de la polimerasa específicos para pRF2-1C y pRF197c-42. Para pRF2-1c el cebador de lado de cabeza era las bases 180 a 197 de la secuencia de cDNA en la ID SEC Nº:9. Para pRF197c-42 el cebador del lado de cabeza era las bases 717 a 743 de la secuencia de cDNA en la ID SEC Nº:11. Se hizo un cebador común del lado de cola correspondiente al exacto complemento de los nucleótidos 463 a 478 de la secuencia descrita en la ID SEC Nº:9. Utilizando reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa con hexámeros aleatorios y los cebadores anteriormente mencionados se observó que el cDNA contenido en pRF2-1C es expresado en semillas de grano de ricino tanto de las etapas I-II como de las etapas IV-V, mientras que el cDNA contenido en plásmido pRF197c-42 es expresado tan sólo en semillas de grano de ricino de las etapas IV-V, es decir que es expresado solamente en tejido que sintetiza activamente ácido ricinoleico. Así, es posible que este cDNA codifique una delta-12 hidroxilasa.

Hay suficiente secuencia de aminoácidos deducida de las dos secuencias de ricino descritas en las ID SEC Núms:10 y 12 para comparar la región altamente conservada correspondiente a los aminoácidos 311 a 353 de la ID SEC Nº:2. Cuando las secuencias de las ID SEC Núms.:2, 4, 6, 8 y 10 son alineadas por el método de Hein anteriormente descrito, la secuencia consenso corresponde exactamente a los aminoácidos 311 a 353 de la ID SEC Nº:2. Todas las delta-12 desaturasas microsomales seminales anteriormente descritas tienen un alto grado de identidad con el consenso dentro de esta región, y concretamente Arabidopsis (identidad de un 100%), soja (identidad de un 90%), maíz (identidad de un 95%), canola (identidad de un 93%) y una (pRF2-1c) de las secuencias de grano de ricino (identidad de un 100%). La otra delta-12 desaturasa seminal de grano de ricino o secuencia afín a la desaturasa (pRF197c-42), sin embargo, tiene menor identidad con el consenso, y concretamente un 81% para la secuencia de aminoácidos deducida del inserto en pRF197c-42 (descrita en la ID SEC Nº:12). Así, mientras que sigue siendo posible que el inserto en pRF197c-42 codifique una delta-12 desaturasa microsomal, esta observación respalda la hipótesis de que el mismo codifica una secuencia afín a la desaturasa, y concretamente la delta-12 hidroxilasa.

Un enfoque adicional para clonar una delta-12 hidroxilasa seminal de grano de ricino es la selección de una población diferencial de cDNAs. Una librería de cDNA construida con lambda-Zap (Stratagene) y hecha según mRNA polisomal aislado a partir de endosperma de grano de ricino en desarrollo (etapas IV-V, 20-25 días después de la plantación) fue sometida a selección con cDNA marcado con ^{32}P hecho a partir de mRNA polisomal aislado a partir de endosperma de grano de ricino en desarrollo (etapas I-II, 5-10 días después de la plantación) y con cDNA marcado con ^{32}P hecho a partir de mRNA polisomal aislado a partir de endosperma de grano de ricino en desarrollo (etapas IV-V, 20-25 días después de la plantación). La librería fue sometida a selección a razón de una densidad de 2000 placas por placa de cultivo de 137 mm de forma tal que fueron aisladas las placas individuales. Fueron sometidas a selección aproximadamente 60.000 placas, y fueron reunidas las placas que se hibridaron con cDNA final (etapas IV/V) pero no con cDNA inicial (etapas I/II), que correspondían a aproximadamente 1 de cada 200 placas.

La librería de cDNAs expresados diferencialmente puede ser sometida a selección con el cDNA de delta-12 desaturasa de ricino anteriormente descrito y/o con oligonucleótidos degenerados basados en secuencias de aminoácidos conservadas entre delta-12 desaturasas para aislar cDNAs de ricino afines, incluyendo el cDNA que codifica la enzima delta-12 oleato hidroxilasa. Estas regiones de conservación de aminoácidos pueden incluir, aunque sin carácter limitativo, los aminoácidos 101 a 109, 137 a 145 y 318 a 327 de la secuencia de aminoácidos descrita en la ID SEC Nº:2 o cualquiera de las secuencias descritas en la siguiente Tabla 7. Son ejemplos de tales oligómeros las ID SEC Núms.:13, 14, 16 y 17. El inserto en plásmido pCF2-197c puede ser cortado con Eco RI para retirar secuencias de vector, purificado por electroforesis en gel y marcado como se ha descrito anteriormente. Los oligómeros degenerados basados en las secuencias de aminoácidos conservadas anteriormente mencionadas pueden ser marcados con ^{32}P como se ha descrito anteriormente. Los cDNAs clonados a partir de la librería diferencial de endosperma en desarrollo que no se hibridan con sonda de mRNA inicial pero que se hibridan con sonda de mRNA final y se hibridan con cDNA de delta-12 desaturasa de ricino o con un oligómero basado en secuencias de delta-12 desaturasa es probable que sean la delta-12 hidroxilasa de ricino. El vector pBluescript que contiene el cDNA de hidroxilasa putativo puede ser extirpado, y los insertos pueden ser secuenciados directamente como se ha descrito anteriormente.

Clones tales como pRF2-1C y pRF197c-42 y otros clones de la selección diferencial que, sobre la base de su secuencia de DNA, son menos afines a las delta-12 desaturasas microsomales seminales de grano de ricino y no son ninguna de las ácido graso desaturasas conocidas anteriormente descritas o descritas en la WO 9311245 pueden ser expresados, por ejemplo, en embriones de soja o en otro adecuado tejido vegetal o en un microorganismo tal como la levadura que no contenga normalmente ácido ricinoleico, usando adecuados vectores de expresión y protocolos de transformación. La presencia de nuevo ácido ricinoleico en el tejido transformado o en los tejidos transformados que expresan el cDNA de ricino confirmaría la identidad del cDNA de ricino como DNA que codifica para una oleato hidroxilasa.

Comparaciones de secuencias entre delta-12 desaturasas microsomales seminales

Las identidades globales porcentuales entre las regiones codificantes de las secuencias de nucleótidos de plena longitud que codifican delta-12 desaturasas microsomales fue determinada mediante su alineación por el método de Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453) usando unos valores de ponderación de laguna y de ponderación de longitud de laguna de 5,0 y 0,3 (Tabla 4). Aquí, a2, c2, s2, z2 y des A se refieren respectivamente a las secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 ácido graso desaturasas microsomales de Arabidopsis (ID SEC Nº:1), Brassica napus (ID SEC Nº:3), soja (ID SEC Nº:5), maíz (ID SEC Nº:7) y des A cianobacteriana, mientras que r2 se refiere a la delta-12 desaturasa microsomal o enzima afín a la desaturasa de grano de ricino (ID SEC Nº:12).

TABLA 4

Identidad porcentual entre las regiones codificantes de secuencias
de nucleótidos que codifican distintas
delta-12 ácido graso desaturasas microsomales
	c2	s2	z2	des A
a2	84	66	64	43
c2	-	65	62	42
s2	-	-	62	42

Se muestra en la Tabla 5 la afinidad global entre las secuencias de aminoácidos deducidas de delta-12 desaturasas microsomales o enzimas afines a las desaturasas de la invención (es decir, las secuencias de las ID SEC Núms.:2, 4, 6, 8 y 12) determinada mediante su alineación por el método de Needleman et al. (J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453) usando unos valores de ponderación de laguna y de ponderación de la longitud de laguna de 3,0 y 0,1, respectivamente. Aquí, a2, c2, s2, z2 y des A se refieren respectivamente a delta-12 ácido graso desaturasas microsomales de Arabidopsis (ID SEC Nº:2), Brassica napus (ID SEC Nº:4), soja (ID SEC Nº:6), maíz (ID SEC Nº:8) y des A cianobacteriana, mientras que r2 se refiere a la desaturasa microsomal o enzima afín de la desaturasa de grano de ricino (ID SEC Nº:12). La afinidad entre las enzimas está indicada como identidad global/similitud global porcentual.

TABLA 5

Afinidad entre distintas delta-12 ácido graso desaturasas microsomales
	c2	s2	r2	z2	des A
a2	84/89	70/85	66/80	71/83	24/50
c2	-	67/80	63/76	69/79	24/51
s2	-	-	67/83	66/82	23/49
r2	-	-	-	61/78	24/51
z2	-	-	-	-	25/49

El alto grado de identidad global (de un 60% o más) a nivel de los aminoácidos entre las enzimas de Brassica napus, soja, ricino y maíz con la delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis y su carencia de una prolongación N-terminal de un péptido de tránsito según se prevé para una desaturasa cloroplástica codificada nuclearmente conduce a los Solicitantes a deducir que las secuencias de las ID SEC Núms.:4, 6, 8, 10 y 12 codifican las delta-12 desaturasas microsomales o enzimas afines a las desaturasas. La adicional confirmación de esta identidad se desprenderá de la función biológica, es decir que será obtenida a base de analizar el fenotipo de plantas transgénicas o de otros organismos transgénicos producidos usando genes quiméricos que incorporen las secuencias anteriormente mencionadas en orientación sentido o antisentido, con adecuadas secuencias reguladoras. Así, pueden aislarse cDNAs y genes para ácido grasa desaturasas homólogas de la misma especie de plantas superiores o de distintas especies de plantas superiores, y especialmente de las especies oleaginosas. Además, sobre la base de estas comparaciones, los Solicitantes prevén que todas las delta-12 desaturasas microsomales de plantas superiores de todas las plantas superiores presenten una identidad global de un 60% o más, y esperan ser capaces de aislar fácilmente secuencias de ácido graso desaturasa homólogas usando las ID SEC Núms.1, 3, 5, 7, 9 y 11 y mediante protocolos dependientes de la secuencia.

En la Tabla 6 está ilustrada la identidad porcentual global a nivel de los aminoácidos, usando el método de alineación anteriormente mencionado, en entre desaturasas de plantas seleccionadas.

TABLA 6

Identidad porcentual entre ácido graso desaturasas de plantas
seleccionadas a nivel de los aminoácidos
	a2	aD	c3	cD	S3
a2	38	33	38	35	34
a3	-	65	93	66	67
aD	-	-	66	87	65
c3	-	-	-	67	67
cD	-	-	-	-	65

En la Tabla 6, a2, a3, ad, c3, cD y S3 se refieren respectivamente a la ID SEC Nº:2, a delta-15 desaturasa microsomal de Arabidopsis, a delta-15 desaturasa plastídica de Arabidopsis, a delta-15 desaturasa microsomal de canola, a delta-15 desaturasa plastídica de canola y a delta-15 desaturasa microsomal de soja. Sobre la base de estas comparaciones, las delta-15 desaturasas, tanto del tipo microsomal como del tipo plastídico, tienen unas identidades globales de un 65% o más a nivel de los aminoácidos, incluso cuando son de la misma especie de plantas. Sobre la base de lo expuesto anteriormente, los Solicitantes esperan que las delta-12 desaturasas microsomales de todas las plantas superiores presenten similares niveles de identidad (es decir, una identidad de un 60% o más a nivel de los aminoácidos) y que las secuencias de las ID SEC Núms.:1, 3, 5, 7 y 9 puedan ser también usadas como sonda de hibridación para aislar secuencias de delta-12 desaturasa homólogas, y posiblemente para secuencias para enzimas afines a las ácido graso desaturasas, tales como oleato hidroxilasa, que tengan una homología de aminoácidos global de un 50% o más.

Similares alineaciones de secuencias proteicas de delta-12 ácido graso desaturasas microsomales vegetales [ID SEC Núms.:2, 4, 6 y 8] y de delta-15 desaturasas vegetales [delta-15 desaturasas microsomales y plastídicas de Arabidopsis y Brassica napus, WO 9311245] permiten la identificación de secuencias de aminoácidos conservadas entre las distintas desaturasas (Tabla 7).

TABLA 7 Secuencias de aminoácidos conservadas entre delta-12 desaturasas microsomales vegetales y delta-15 desaturasas plastídicas y microsomales

	Posiciones AA	Secuencia	Secuencia
Región	conservadas en la ID	Consenso AA Conservada	Consenso AA Conservada	Secuencia Consenso AA
	SEC Nº:2	en \Delta^{12} Desaturasas	en \Delta^{15} Desaturasas
A	39-44	AIPPHC	AIPKHC	AIP(P/K)HC
B	86-90	WP(L/I)YW	WPLYW	WP(LI)YW
C	104-109	AHECGH	GHDCGH	(A/G)H(D/E)CGH
D	130-134	LLVPY	ILVPY	(L/I)LVPY
E	137-142	WKYSHR	WRISHR	W(K/R)(Y/I)SHR
F	140-145	SHRRHH	SHRTHH	SHR(R/T)HH
G	269-274	ITYLQ	VTYLH	(I/V)TYL(Q/H)
H	279-282	LPHY	LPWY	LP(H/W)Y
I	289-294	WL(R/K)GAL	YLRGGL	(W/Y)L(R/K)G(A/G)L
J	296-302	TVDRDYG	TLDRDYG	T(V/L)DRDYG

TABLA 7 (continuación)

	Posiciones AA	Secuencia	Secuencia
Región	conservadas en la ID	Consenso AA Conservada	Consenso AA Conservada	Secuencia Consenso AA
	SEC Nº:2	en \Delta^{12} Desaturasas	en \Delta^{15} Desaturasas
K	314-321	THVAHHLF	THVIHHLF	THV(A/I)HHLF
L	318-327	HHLFSTMPHY	HHLFPQIPHY	HHFL(S/P)
				(T/Q)(I/M)PHY

La Tabla 7 muestra doce regiones de secuencias de aminoácidos conservadas, llamadas A-L (columna 1), cuyas posiciones en la ID SEC Nº:2 están indicadas en la columna 2. Las secuencias consenso para estas regiones en las delta-12 ácido graso desaturasas vegetales y en las delta-15 ácido graso desaturasas vegetales están indicadas en las columnas 3 y 4, respectivamente; los aminoácidos están indicados mediante abreviaturas estándar, los aminoácidos subrayados están conservados entre las delta-12 y las delta-15 desaturasas, y los aminoácidos entre paréntesis representan sustituciones encontradas en esa posición. Las secuencias consenso de estas regiones están indicadas en la columna 5. Estos cortos aminoácidos conservados y sus posiciones relativas confirman adicionalmente que los cDNAs aislados codifican una ácido graso desaturasa.

Aislamiento de secuencias de nucleótidos que codifican enzimas afines a las desaturasas y ácido graso desaturasas homólogas y heterólogas

Fragmentos de la presente invención pueden ser usados para aislar cDNAs y genes de ácido graso desaturasas homólogas y heterólogas de la misma especie como los fragmentos de la invención o de especies distintas. El aislamiento de genes homólogos usando protocolos dependientes de la secuencia es perfectamente conocida en la técnica, y los Solicitantes han demostrado que la secuencia de cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis puede ser usada para aislar cDNA para ácido graso desaturasas afines de Brassica napus, soja, maíz y grano de ricino.

Lo que es más importante es que pueden usarse los fragmentos que contienen las secuencias de las ID SEC Núms.:1, 3, 5, 7 y 9 o sus menores regiones más conservadas para aislar nuevas ácido graso desaturasas y enzimas afines a las ácido graso desaturasas.

En una realización particular de la presente invención, regiones de los fragmentos de ácido nucleico de la invención que están conservados entre distintas desaturasas pueden ser usadas por un experto en la materia para diseñar una mezcla de oligómeros degenerados destinados a ser usados en protocolos dependientes de la secuencia destinados a aislar fragmentos de ácido nucleico que codifican cDNAs o genes de ácido graso desaturasas homólogas o heterólogas. Por ejemplo, en la reacción en cadena de la polimerasa (Innis et al., Eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego) dos pedazos cortos del presente fragmento de la invención pueden ser usados para amplificar un fragmento más largo de DNA de ácido graso desaturasa a partir de DNA o de RNA. La reacción en cadena de la polimerasa puede ser también llevada a cabo en una librería de secuencias nucleotídicas clonadas, estando un cebador basado en el fragmento de la invención y estando el otro cebador basado en la secuencia de cola de poli A^{+} o en una secuencia vectorial. Estos oligómeros pueden ser secuencias singulares o secuencias degeneradas sacadas de los fragmentos de ácido nucleico de la invención. El pedazo más largo de DNA de ácido graso desaturasa homóloga generado mediante este método podría ser entonces usado como sonda para aislar genes o cDNAs de ácido graso desaturasas afines de Arabidopsis o de otras especies, y podría ser posteriormente identificado mediante selección diferencial con secuencias de desaturasas conocidas y por determinación de las secuencias de nucleótidos. El diseño de oligómeros, incluyendo oligómeros largos, usando desoxiinosina y ``guessmers'' para hibridación o para la reacción en cadena de la polimerasa, es conocido para un experto en la materia y está descrito en Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tramos cortos de secuencias de aminoácidos que están conservadas entre delta-12 desaturasa cianobacteriana (Wada et al., Nature (1990) 347:200-203) y delta-15 desaturasas vegetales [WO 9311245] fueron usados previamente para hacer oligonucleótidos que eran degenerados y/o usaban desoxiinosina/s. Con un conjunto de estos oligómeros hechos según un tramo de 12 aminoácidos conservado entre delta-12 desaturasa cianobacteriana y delta-15 desaturasas de plantas superiores se logró clonar los cDNAs de delta-12 desaturasa plastídica; y estas desaturasas vegetales tienen una identidad de más de un 50% con la delta-12 desaturasa cianobacteriana. Algunos de estos oligonucleótidos fueron también usados como cebadores para hacer productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando poli A^{+} RNA de plantas. Sin embargo, ninguno de los oligonucleótidos y de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa logró buenos resultados como sonda de hibridación radiomarcada para aislar secuencias de nucleótidos que codifiquen delta-12 ácido graso desaturasas microsomales. Así, como era de esperar, ninguno de los tramos de cuatro o más aminoácidos conservados entre delta-12 desaturasas de Arabidopsis y delta-15 desaturasas de Arabidopsis es idéntico en la desaturasa cianobacteriana, igual como ninguno de los tramos de cuatro o más aminoácidos conservados entre la delta-15 desaturasa de Arabidopsis y la desaturasa cianobacteriana es idéntico en la ID SEC Nº:2. Los tramos de aminoácidos conservados entre la presente invención y delta-15 desaturasas permiten ahora que el diseño de oligómeros sea usado para aislar secuencias que codifican otras desaturasas y enzimas afines a las desaturasas. Por ejemplo, los tramos conservados de aminoácidos entre la delta-12 desaturasa y la delta-15 desaturasa, ilustrados en la Tabla 7, son útiles para diseñar largos oligómeros para hibridación así como oligómeros más cortos destinados a ser usados como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa. A este respecto serían particularmente útiles las secuencias conservadas entre la delta-12 desaturasa y la delta-15 desaturasa (indicadas en la Tabla 7). Las secuencias consenso tomarán también en consideración las sustituciones conservadoras que son conocidas para un experto en la materia, tales como las de Lys/Arg, Glu/Asp, Ile/Val/Leu/Met, Ala/Gly, Gln/Asn y Ser/Thr. Secuencias de aminoácidos tan cortas como las de una longitud de cuatro aminoácidos pueden ser usadas con éxito en la reacción en cadena de la polimerasa [Nunberg et al. (1989) Journal of Virology 63:3240-3249]. Secuencias de aminoácidos conservadas entre delta-12 desaturasas (ID SEC Núms.:2, 4, 6, 8 y 10) pueden ser también usadas en protocolos dependientes de la secuencia para aislar ácido graso desaturasas y enzimas que sean afines a las ácido graso desaturasas y de las que sea de esperar que sean más afines a las delta-12 desaturasas, tal como es el caso de la oleato hidroxilasa de grano de ricino. Son particularmente útiles las secuencias conservadas de la columna 3 (Tabla 7), puesto que las mismas están también bien conservadas con las delta-15 desaturasas (columna 4, Tabla 7).

El determinar las secuencias de aminoácidos conservadas de diversas desaturasas permitirá también identificar más y mejores secuencias consenso que ayudarán adicionalmente al aislamiento de nuevas ácido graso desaturasas, incluyendo las de fuentes no vegetales, tales como las de hongos, algas (incluyendo las desaturasas que intervienen en las desaturaciones de los ácidos grasos n-3 de cadena larga) e incluso cianobacterias, así como otras desaturasas asociadas a la membrana de otros organismos.

La función de los diversos fragmentos de nucleótidos que codifican ácido graso desaturasas o enzimas afines a las desaturasas y que pueden ser aislados usando la presente invención puede ser identificada transformando plantas con las secuencias aisladas, ligadas en orientación sentido o antisentido a las adecuadas secuencias reguladoras requeridas para la expresión en la planta, y observando el fenotipo de ácidos grasos de las plantas transgénicas resultantes. Las plantas objetivo preferidas para la transformación son iguales a la fuente de los fragmentos de nucleótidos aislados cuando el objetivo perseguido es el de lograr la inhibición del correspondiente gen endógeno por cosupresión o inhibición antisentido. Son plantas objetivo preferidas para ser usadas en la expresión o sobreexpresión de los fragmentos de ácido nucleico aislados plantas de tipo salvaje o plantas con conocidas mutaciones en reacciones de desaturación, tal como las mutantes fadA, fadB, fadC, fadD, fad2 y fad3 de Arabidopsis; lino mutante deficiente en delta-15 desaturación; o girasol mutante deficiente en delta-12 desaturación. Como alternativa, la función de los fragmentos de ácido nucleico aislados puede ser determinada de manera similar por medio de la transformación de otros organismos, tales como levadura o cianobacterias, con genes quiméricos que contengan el fragmento de ácido nucleico y adecuadas secuencias reguladoras, seguida por un análisis de la composición de ácidos grasos y/o de la actividad enzimática.

Sobreexpresión de las enzimas ácido graso desaturasas en especies transgénicas

El fragmento de ácido nucleico o los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención que codifica o codifican ácido graso desaturasa funcional o ácido graso desaturasas funcionales, con adecuadas secuencias reguladoras, puede ser usado o pueden ser usados para sobreexpresar la enzima o las enzimas en organismos transgénicos. Un ejemplo de tal expresión o sobreexpresión queda demostrado por la transformación de la mutante de Arabidopsis que carece de oleato desaturación. Tales constructos de DNA recombinante pueden incluir el gen de ácido graso desaturasa nativo o un gen de ácido graso desaturasa quimérico aislado a partir de la misma especie como el organismo huésped o a partir de una especie distinta. Para la sobreexpresión de ácido graso desaturasa(s) es preferible que el gen introducido sea de una especie distinta, para reducir la probabilidad de cosupresión. Por ejemplo, la sobreexpresión de delta-12 desaturasa en soja, colza u otras especies oleaginosas para producir niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados puede lograrse a base de expresar RNA a partir del cDNA de plena longitud que se encuentra en p92103, pCF2-165D y pSF2-169K. Las líneas transgénicas que sobreexpresan la delta-12 desaturasa, al ser cruzadas con líneas que sobreexpresan delta-15 desaturasas, redundarán en niveles ultraaltos de 18:3. Análogamente, los fragmentos de ácido nucleico aislados que codifican ácido graso desaturasas a partir de Arabidopsis, colza y soja pueden ser también usados por un experto en la materia para obtener otros cDNAs de plena longitud considerablemente homólogos, si los mismos no han sido ya obtenidos, así como los correspondientes genes como fragmentos de la invención. Éstos pueden ser a su vez usados para sobreexpresar las correspondientes desaturasas en plantas. Un experto en la materia puede también aislar la secuencia codificante o las secuencias codificantes a partir del fragmento o de los fragmentos de la invención a base de usar y/o crear sitios para endonucleasas de restricción, como se describe en Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Una aplicación particularmente útil de las invenciones que se reivindican es la de restituir el rendimiento agronómico de mutantes vegetales que contengan niveles ultraaltos de oleato en el aceite seminal. En Arabidopsis, la reducción de linoleato en fosfatidilcolina debido a una mutación en delta-12 desaturasa microsomal afectaba la supervivencia a bajas temperaturas [Miquel, M. et al. (1993) Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 90:6208-6212]. Además, hay evidencia de que el mal rendimiento agronómico de las canolas que contienen niveles ultraaltos (> 80%) de oleato en la semilla es debido a mutaciones en los genes de delta-12 desaturasa microsomal que reducen el nivel de linoleato en fosfatidilcolina de las raíces y las hojas. Esto significa que las mutaciones no son específicas de la semilla. Así, la expresión específica de las raíces y/o de las hojas (es decir, sin expresión en las semillas) de la actividad de delta-12 desaturasa microsomal en mutantes de semillas oleaginosas con niveles ultraaltos de oleato en el aceite seminal redundará en plantas mutantes agronómicamente mejoradas con niveles ultraaltos de oleato en el aceite seminal.

Inhibición de genes objetivo de las plantas mediante el uso de RNA antisentido

El RNA antisentido ha sido usado para inhibir genes objetivo de plantas de manera específica del tejido (véase van der Krol et al., Biotechniques (1988) 6:958-976). Ha sido demostrada inhibición antisentido usando la secuencia de cDNA completa (Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1988) 85:8805-8809) así como una secuencia de cDNA parcial (Cannon et al., Plant Molec. Biol. (1990) 15:39-47). Hay también evidencia de que las secuencias no codificantes del lado 3' (Ch'ng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1989) 86:10006-10010) y fragmentos de secuencia codificante del lado 5' que contienen tan pocos como 41 pares de bases de un cDNA de 1,87 kb (Cannon et al., Plant Molec. Biol. (1990) 15:39-47) pueden desempeñar importantes papeles en la inhibición antisentido.

El uso de la inhibición antisentido de las ácido graso desaturasas puede requerir el aislamiento de la secuencia transcrita para uno o varios genes objetivo de ácido graso desaturasa que son expresados en el tejido objetivo de la planta objetivo. Los genes que son más altamente expresados son los mejores objetivos para la inhibición antisentido. Estos genes pueden ser identificados a base de determinar sus niveles de transcripción mediante técnicas tales como el análisis cuantitativo de los niveles de mRNA o la transcripción en vaciado nuclear, que son técnicas conocidas para un experto en la materia.

Todo el cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de soja fue clonado en la orientación antisentido con respecto a b-conglicinina de soja, KTi3 o promotor de faseolina de grano, y el gen quimérico fue transformado en embriones somáticos de soja de los que se había comprobado anteriormente que sirven de buen sistema modelo para embriones cigóticos de soja y son predictivos de la composición seminal (Tabla 11). Los embriones somáticos transformados presentaban inhibición de la biosíntesis de linoleato. Análogamente, todo el cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de Brassica napus fue clonado en la orientación antisentido con respecto a un promotor de napina de colza, y el gen quimérico fue transformado en B. napus. Las semillas de B. napus transformadas presentaban inhibición de la biosíntesis de linoleato. Así, la inhibición antisentido de delta-12 desaturasa en especies oleaginosas entre las que se incluye el maíz, el Brassica napus y la soja que redunda en niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados puede lograrse a base de expresar RNA antisentido a partir del cDNA entero o parcial que codifica delta-12 desaturasa microsomal.

Inhibición de genes objetivo de plantas por cosupresión

El fenómeno de cosupresión ha sido también usado para inhibir genes objetivo de plantas de manera específica del tejido. Es conocida la cosupresión de un gen endógeno usando toda la secuencia de cDNA (Napoli et al., The Plant Cell (1990) 2:279-289; van der Krol et al., The Plant Cell (1990) 2:291-299) así como una secuencia de cDNA parcial (730 pares de bases de un cDNA de 1770 pares de bases) (Smith et al., Mol. Gen. Genetics (1990) 224:477-481).

Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención que codifican ácido graso desaturasas, o partes de los mismos, con adecuadas secuencias reguladoras, pueden ser usados para reducir el nivel de ácido graso desaturasas, alterando con ello la composición de ácidos grasos, en plantas transgénicas que contengan un gen endógeno que sea considerablemente homólogo al fragmento de ácido nucleico introducido. Los procedimientos experimentales que son necesarios para esto son similares a los descritos anteriormente para la sobreexpresión de los fragmentos de ácido nucleico para ácido graso desaturasa, exceptuando que puede también usarse una secuencia de cDNA parcial. Por ejemplo, la cosupresión de delta-12 desaturasa en Brassica napus y soja que redunda en niveles alterados de ácidos grasos poliinsaturados puede lograrse a base de expresar en la orientación sentido todo el o una parte del cDNA de delta-12 desaturasa seminal que se encuentra en pCF2-165D y pSF2-165K, respectivamente. Genes endógenos pueden ser también inhibidos por regiones no codificantes de una copia introducida del gen [Por ejemplo, Brusslan, J. A. et al. (1993) Plant Cell 5:667-677; Matzke, M. A. et al., Plant Molecular Biology 16:821-830]. Hemos demostrado que puede ser aislado un gen de Arabidopsis (ID SEC Nº:15) correspondiente al cDNA (ID SEC Nº:1). Un experto en la materia puede aislar fácilmente DNA genómico que contenga o flanquee los genes y usar las regiones codificantes o no codificantes en tales métodos de inhibición de transgenes.

El análisis de la composición de ácidos grasos de las raíces y semillas de mutantes de Arabidopsis deficientes en delta-12 desaturación microsomal pone de manifiesto que los mismos presentan niveles reducidos de 18:2 así como niveles reducidos de 16:0 (siendo la reducción del nivel tan importante como de un 40% en las semillas mutantes en comparación con las semillas de tipo salvaje) [Miquel and Browse (1990) en Plant Lipid Biochemistry, Structure, and Utilization, páginas 456-458, Ed. Quinn, P. J. and Harwood, J. L., Portland Press]. La reducción del nivel de 16:0 es también observada en mutantes de B. napus con contenido ultraalto de oleato. Así, puede ser de esperar que el nivel ultraalto de 18:1 en las plantas transgénicas debido a la cosupresión o inhibición antisentido usando las secuencias que se reivindican reducirá también el nivel de 16:0.

Selección de huéspedes, promotores y potenciadores

Los de una clase preferida de huéspedes heterólogos para la expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la invención son huéspedes eucarióticos, y particularmente las células de plantas superiores. Son particularmente preferidas entre las plantas superiores las especies oleaginosas tales como la soja (Glycine max), la colza (incluyendo Brassica napus, B. ampestris), el girasol (Helianthus annus), el algodón (Gossypiun hirsutum), el maíz (Zea mays), el cacao (Theobroma cacao), el alazor (Carthamus tinctorius), la palma de aceite (Elaeis guineensis), el cocotero (Cocos nucifera), el lino (Linum usitatissimum) y el cacahuete (Arachis hypogaea).

La expresión en las plantas usará secuencias reguladoras que son funcionales en tales plantas. Ha sido perfectamente establecida la expresión de genes foráneos en plantas (De Blaere et al., Meth. Enzymol. (1987) 153:277-291). La fuente del promotor elegido para activar la expresión de los fragmentos de la invención no es decisiva siempre que tenga suficiente actividad transcripcional para lograr la invención a base de incrementar o reducir respectivamente el nivel de mRNA traducible para las ácido graso desaturasas en el tejido huésped deseado. Los promotores preferidos incluyen (a) fuertes promotores vegetales constitutivos tales como los que dirigen los transcritos 19S y 35S en virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., Nature (1985) 313:810-812; Hull et al., Virology (1987) 86:482-493), (b) promotores específicos del tejido o del desarrollo, y (c) otros sistemas promotores transcripcionales desarrollados en plantas, tales como los que usan secuencias promotoras de RNA polimerasa de bacteriófago T7 para expresar genes foráneos. Son ejemplos de promotores específicos del tejido el promotor fotoinducible de la pequeña subunidad de ribulosa 1,5-bis-fosfato carboxilasa (si la expresión se desea en tejidos fotosintéticos), el promotor de la proteína ceína de maíz (Matzke et al., EMBO J. (1984) 3:1525-1532) y el promotor de la proteína de fijación a/b de la clorofila (Lampa et al., Nature (1986) 316:750-752).

Son promotores particularmente preferidos aquéllos que permiten la expresión específica de la semilla. Esto puede ser especialmente útil puesto que las semillas son la fuente primaria de aceites vegetales y también puesto que la expresión específica de la semilla evitará todo potencial efecto perjudicial en tejidos no seminales. Los ejemplos de promotores específicos de la semilla incluyen, aunque sin carácter limitativo, los promotores de proteínas de almacenamiento seminal, que pueden representar hasta un 90% de la proteína seminal total en muchas plantas. Las proteínas de almacenamiento seminal son estrictamente reguladas, siendo expresadas casi exclusivamente en las semillas de manera altamente específica del tejido y de manera altamente específica de las etapas (Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. (1984) 35:191-221; Goldberg et al., Cell (1989) 56:149-160). Además, distintas proteínas de almacenamiento seminal pueden ser expresadas en distintas etapas del desarrollo de las semillas.

Ha sido estudiada en gran detalle la expresión de los genes específicos de las semillas (véanse los estudios de Goldberg et al., Cell (1989) 56:149-160 y Higgins et al., Ann. Rev. Plant Physiol. (1984) 35:191-221). Hay actualmente numerosos ejemplos de expresión específica de la semilla de genes para proteínas de almacenamiento seminal en plantas dicotiledóneas transgénicas. Éstos incluyen genes de plantas dicotiledóneas para b-faseolina seminal (Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1985) 82:3320-3324; Hoffman et al., Plant Mol. Biol. (1988) 11:717-729), lectina seminal (Voelker et al., EMBO J. (1987) 6:3571-3577), lectina de soja (Okamuro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1986) 83:8240-8244), inhibidor de tripsina de Kunitz de soja (Perez-Grau et al., Plant Cell (1989) 1:095-1109), b-conglicinina de soja (Beachy et al., EMBO J. (1985) 4:3047-3053), vicilina de guisante (Higgins et al., Plant Mol. Biol. (1988) 11:683-695), convicilina de guisante (Newbigin et al., Planta (1990) 180:461-470), legumina de guisante (Shirsat et al., Mol. Gen. Genetics (1989) 215:326-331) y napina de colza (Radke et al., Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694), así como genes de plantas monocotiledóneas tales como los que son para ceína de 15 kD de maíz (Hoffman et al., EMBO J. (1987) 6:3213-3221), oleosina de 18 kD de maíz (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 888:6181-6185), b-hordeína de cebada (Marris et al., Plant Mol. Biol. (1988) 10:359-366) y glutenina de trigo (Colot et al., EMBO J. (1987) 6:3559-3564). Además, los promotores de genes específicos de la semilla que están operativamente ligados a secuencias codificantes heterólogas en constructos de genes quiméricos mantienen también su patrón de expresión temporal y espacial en las plantas transgénicas. Tales ejemplos incluyen el uso de promotor del gen de proteína de almacenamiento seminal 2S de Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de encefalina en semillas de Arabidopsis y B. napus (Vandekerckhove et al., Bio/Technology (1989) 7:929-932), promotores de b-faseolina seminal y de lectina seminal para expresar luciferasa (Riggs et al., Plant Sci. (1989) 63:47-57) y promotores de glutenina de trigo para expresar cloramfenicol acetiltransferasa (Colot et al., EMBO J. (1987) 6:3559-3564).

Serán particularmente aplicables en la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención los promotores heterólogos de varios genes de proteínas de almacenamiento seminal de soja tales como aquéllos que son para el inhibidor de tripsina de Kunitz (Jofuku et al., Plant Cell (1989) 1:1079-1093), glicinina (Nielson et al., Plant Cell (1989) 1:313-328) y b-conglicinina (Harada et al., Plant Cell (1989) 1:415-425). Los promotores de genes para subunidades a y b de proteína de almacenamiento de b-conglicinina de soja serán particularmente útiles para expresar el mRNA o el RNA antisentido en los cotiledones en las etapas intermedias a finales del desarrollo de las semillas (Beachy et al., EMBO J. (1985) 4:3047-3053) en las plantas transgénicas. Esto es debido al hecho de que hay un muy escaso efecto de la posición en su expresión en semillas transgénicas, y los dos promotores presentan distinta regulación temporal. El promotor para el gen de la subunidad a es expresado unos pocos días antes de que sea expresado el promotor para el gen de la subunidad b. Esto es importante para transformar colza, en la que la biosíntesis de aceite comienza aproximadamente una semana antes de la síntesis de proteínas de almacenamiento seminal (Murphy et al., J. Plant Physiol. (1989) 135:63-69).

Serán también particularmente útiles los promotores de genes que son expresados durante la embriogénesis inicial y la biosíntesis de aceite inicial. Las secuencias reguladoras nativas, incluyendo los promotores nativos, de los genes de ácido graso desaturasa que expresan los fragmentos de ácido nucleico de la invención pueden ser usadas a continuación de su aislamiento por parte de los expertos en la materia. Serán también útiles promotores heterólogos de otros genes que intervienen en la biosíntesis de aceite seminal, tales como los que son para malato sintasa e isocitrato liasa de B. napus (Comai et al., Plant Cell (1989) 1:293-300), delta-9 desaturasa de alazor (Thompson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 88:2578-2582) y ricino (Shanklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 88:2510-2514), proteína portadora de acilo (ACP) de Arabidopsis (Post-Beittenmiller et al., Nucl. Acids Res. (1989) 17:1777), B. napus (Safford et al., Eur. J. Biochem. (1988) 174:287-295) y B. campestris (Rose et al., Nucl. Acids Res. (1987) 15:7197), b-cetoacil-ACP sintetasa de cebada (Siggaard-Andersen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 88:4114-4118), y oleosina de Zea mays (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1991) 88:6181-6185), soja (Nº de registro de entrada en el Genbank: X60773) y B. napus (Lee et al., Plant Physiol. (1991) 96:1395-1397). Si la secuencia de los genes correspondientes no está publicada o si su región promotora no está identificada, un experto en la materia puede usar la secuencia publicada para aislar el gen correspondiente y un fragmento del mismo que contenga el promotor. Están también publicadas las secuencias proteicas parciales para las relativamente abundantes enoil-ACP reductasa y acetil-CoA carboxilasa (Slabas et al., Biochim. Biophys. Acta (1987) 877:271-280; Cottingham et al., Biochim. Biophys. Acta (1988) 954:201-207), y un experto en la materia puede usar estas secuencias para aislar los correspondientes genes seminales con sus promotores. Análogamente, los fragmentos de la presente invención que codifican ácido graso desaturasas pueden ser usados para obtener regiones promotoras de los correspondientes genes destinados a ser usados para expresar genes quiméricos.

El alcanzar el correcto nivel de expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la invención puede requerir el uso de distintos genes quiméricos utilizando distintos promotores. Tales genes quiméricos pueden ser transferidos a las plantas huésped ya sea juntamente en un solo vector de expresión o bien secuencialmente usando más de un vector.

Se contempla que la introducción de potenciadores o de elementos tipo potenciador en las regiones promotoras de los fragmentos de ácido nucleico nativos o quiméricos de la invención redundará en una expresión incrementada para lograr la invención. Esto incluiría potenciadores virales tales como el que se encuentra en el promotor 35S (Odell et al., Plant Mol. Biol. (1988) 10:263-272), potenciadores de los genes de opina (Fromm et al., Plant Cell (1989) 1:977-984), o potenciadores de cualquier otra fuente que redunden en una transcripción incrementada al ser colocados en un promotor ligado operativamente al fragmento de ácido nucleico de la invención.

Es de particular importancia el elemento de secuencia de DNA aislado del gen para la subunidad a de b-conglicinina que puede conferir a un promotor constitutivo una potenciación específica de la semilla con un factor de 40 (Chen et al., Dev. Genet. (1989) 10:112-122). Un experto en la materia puede aislar fácilmente este elemento e insertarlo dentro de la región promotora de cualquier gen a fin de obtener una incrementada expresión específica de la semilla con el promotor en plantas transgénicas. La inserción de un elemento de este tipo en cualquier gen específico de la semilla que sea expresado en distintos puntos en el tiempo en comparación con el gen de b-conglicinina redundará en una expresión en las plantas transgénicas por espacio de un más prolongado período de tiempo durante el desarrollo de las semillas.

La invención puede ser también llevada a cabo mediante los de una variedad de otros métodos para alcanzar la finalidad perseguida. En una forma, la invención se basa en modificar plantas para producir niveles incrementados de ácido graso desaturasas en virtud de introducir más de una copia del gen foráneo que contiene los fragmentos de ácido nucleico de la invención. En algunos casos, el deseado nivel de ácidos grasos poliinsaturados puede requerir la introducción de genes foráneos para más de una clase de ácido graso desaturasa.

Pueden ser usadas para llevar a cabo la invención cualquier región no codificante del lado 3' que sea capaz de proporcionar una señal de poliadenilación y otras secuencias reguladoras que puedan ser necesarias para la correcta expresión de los fragmentos de ácido nucleico de la invención. Esto incluiría los extremos 3' de la ácido graso desaturasa nativa o de las ácido graso desaturasas nativas, genes virales tales como los de los transcritos del virus del mosaico de la coliflor 35S o 19S, de los genes de la síntesis de opina, ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa, o proteína de fijación a/b de la clorofila. Hay numerosos ejemplos en la técnica que describen la utilidad de distintas regiones no codificantes del lado 3'.

Métodos de transformación

Están a disposición de los expertos en la materia varios métodos para transformar células de plantas superiores según la presente invención (véanse las publicaciones de la EPO 0 295 959 A2 y 0 318 341 A1). Tales métodos incluyen los basados en vectores de transformación utilizando los plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium spp. Se prefiere particularmente usar el tipo binario de estos vectores. Los vectores derivados de los Ti transforman una amplia variedad de plantas superiores, incluyendo plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas (Sukhapinda et al., Plant Mol. Biol. (1987) 8:209-216; Potrykus, Mol. Gen. Genet. (1985) 199:183). Están a disposición de los expertos en la materia otros métodos de transformación, tales como la incorporación directa de constructos de DNA foráneo (véase la publicación 0 295 959 A2 de la EPO), las técnicas de electroporación (Fromm et al., Nature (1986) (Londres) 319:791) o el bombardeo balístico a alta velocidad con partículas metálicas recubiertas con los constructos de ácido nucleico (Kline et al., Nature (1987) (Londres) 327:70). Una vez transformadas, las células pueden ser regeneradas por los expertos en la materia.

Son particularmente relevantes los métodos recientemente descritos para transformar genes foráneos en plantas de cultivo comercialmente importantes tales como la colza (De Block et al., Plant Physiol. (1989) 91:694-701), el girasol (Everett et al., Bio/Technology (1987) 5:1201) y la soja (Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1989) 86:7500-7504).

Aplicación a la selección molecular

El inserto de 1,6 kb obtenido del plásmido pSF2-169K fue usado como sonda radiomarcada en una transferencia Southern que contenía DNA genómico de soja (Glycine max (la variedad Bonus obtenida por selección) y Glycine soja (PI81762)) digerido con una de varias enzimas de restricción. En las digestiones efectuadas con las enzimas de restricción Hind III y Eco RI fueron identificados distintos patrones de hibridación (polimorfismos). Estos polimorfismos fueron usados para mapear dos loci de pSF2-169 en relación con otros loci en el genoma de la soja en esencia como han descrito Helentjaris et al., (Theor. Appl. Genet. (1986) 72:761-769). Uno quedó mapeado en el grupo de ligación 11 entre los loci 4404,00 y 1503,00 (a 4,5 cM y a 7,1 cM de 4404,00 y 1503,00, respectivamente), y el otro quedó mapeado en el grupo de ligación 19 entre los loci 4010,00 y 5302,00 (a 1,9 cM y a 2,7 cM de 4010,00 y 5302,00, respectivamente) [Rafalski, A and Tingey, S. (1993) en Genetic Maps, Ed. O'Brien, S. J.]. El uso de marcadores de polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP) en la selección de plantas ha sido bien documentado en la técnica (Tanksley et al., Bio/Technology (1989) 7:257-264). Así, los fragmentos de ácido nucleico de la invención pueden ser usados como marcadores de RFLP para los rasgos ligados a la expresión de ácido graso desaturasas. Estos rasgos incluirán los niveles alterados de ácidos grasos insaturados. El fragmento de ácido nucleico de la invención puede ser también usado para aislar el gen de ácido graso desaturasa a partir de plantas variantes (incluyendo las mutantes) con niveles alterados de ácidos grasos insaturados. La secuenciación de estos genes revelará las diferencias nucleotídicas con respecto al gen normal que ocasionan la variación. Oligonucleótidos cortos diseñados en torno a estas diferencias pueden ser también usados en selección molecular como sondas de hibridación o bien en diagnosis basada en el DNA para seguir la variación en ácidos grasos. Oligonucleótidos basados en diferencias que están ligadas a la variación pueden ser usados como marcadores moleculares en la selección para estos rasgos variantes con respecto al aceite.

Ejemplos

Se define a continuación más ampliamente la presente invención en los Ejemplos siguientes, en los cuales todas las partes y todos los porcentajes son en peso y los grados son Celsius, a no ser que se indique otra cosa. Debe entenderse que estos Ejemplos, si bien indican realizaciones preferidas de la invención, se dan tan sólo con carácter ilustrativo.

Ejemplo 1 Aislamiento de dna genómico que flanquea el sitio del T-DNA de inserción en la línea mutante 658 de arabidopsis thaliana Identificación de una mutante de T-DNA de arabidopsis tThaliana con alto contenido de ácido oleico

Una población de transformantes de Arabidopsis thaliana (raza geográfica Wassilewskija) que contenían el T-DNA modificado de Agrobacterium tumefaciens fue generada por transformación seminal como describen Feldmann et al., (Mol. Gen. Genetics (1987) 208:1-9). En esta población las transformantes contienen secuencias de DNA que codifican el vector bacteriano pBR322, nopalina sintasa, neomicina fosfotransferasa (NPTII, confiere resistencia a la canamicina) y b-lactamasa (confiere resistencia a la ampicilina) dentro de las secuencias de borde del T-DNA. La integración del T-DNA en distintas zonas de los cromosomas de las transformantes individuales puede ocasionar una disrupción de la función genética de la planta en el o cerca del sitio de inserción, y los fenotipos asociados a esta pérdida de función genética pueden ser analizados a base de someter a selección a la población para la determinación del fenotipo.

Fue generada semilla T3 a partir de la semilla de tipo salvaje tratada con Agrobacterium tufemaciens mediante dos ciclos de autofertilización como describen Feldmann et al., (Science (1989) 243:1351-1354). Estos descendientes presentaban segregación con respecto a la inserción del T-DNA, y por consiguiente con respecto a toda mutación resultante de la inserción. Fueron combinadas aproximadamente 10-12 hojas de cada una de 1700 líneas, y el contenido de ácidos grasos de cada una de las 1700 muestras combinadas fue determinado por cromatografía de gases de los ésteres metílicos de acilo graso esencialmente como describen Browse et al., (Anal. Biochem. (1986) 152:141-145) exceptuando que como reactivo de metilación fue usado H_{2}SO_{4} al 2,5% en metanol. Una línea llamada ``658'' produjo una muestra que presentaba un perfil de ácidos grasos alterado en comparación con los de las líneas 657 y 659 muestreadas al mismo tiempo (Tabla 8).

TABLA 8

Éster Metílico de Ácido Graso	Combinación Hojas 657	Combinación Hojas 659	Combinación Hojas 658
16:0	14.4	14.1	13.6
16:1	4.4	4.6	4.5
16:2	2.9	2.2	2.7
16:3	13.9	13.3	13.9

TABLA 8 (continuación)

Éster Metílico de Ácido Graso	Combinación Hojas 657	Combinación Hojas 659	Combinación Hojas 658
18:0	1.0	1.1	0.9
18:1	2.6	2.5	4.9
18:2	14.0	13.6	12.8
18:3	42.9	46.1	44.4

El análisis de la composición de ácidos grasos de 12 semillas T3 individuales de la línea 658 indicó que la combinación 658 se componía de semillas que se segregaban en tres clases que eran las clases ``rica'', ``mediana'' y ``pobre'' con aproximadamente un 37% (12 semillas), un 21% (7 semillas) y un 14% (3 semillas) de ácido oleico, respectivamente (Tabla 9).

TABLA 9

	Clase ``rica''	Clase ``mediana''	Clase ``pobre''
16:0	8.9	8.7	9.3
16:1c	2.0	1.6	2.6
18:0	4.5	4.3	4.4
18:1	37.0	20.7	14.4
18:2	8.0	24.9	27.7
18:3	10.6	14.3	13.6
20:1	25.5	21.6	20.4

Así, el fenotipo mutante rico en ácido oleico se segrega en una proporción aproximadamente mendeliana. Para determinar el número de insertos de TDNA que se segregan independientemente en la línea 658, fueron analizadas 200 semillas T3 para determinar su capacidad para germinar y crecer en presencia de canamicina [Feldman et al. (1989) Science 243:1351-1354]. En este experimento fueron identificadas solamente 4 plantas individuales sensibles a la canamicina. La proporción de segregación (aproximadamente 50:1) indicaba que la línea 658 alojaba tres insertos de T-DNA. En este experimento y en otros dos experimentos fueron identificadas en total 56 plantas sensibles a la canamicina; 53 de estas plantas fueron analizadas para determinar su composición de ácidos grasos, y al menos siete de éstas presentaron unos niveles de ácido oleico que eran más altos que los que habrían sido de esperar para plantas de semillero de tipo salvaje cultivadas bajo estas condiciones.

A fin de analizar con mayor rigor si la mutación que redunda en un alto contenido de ácido oleico es el resultado de la inserción de T-DNA, los Solicitantes identificaron una línea derivativa que presentaba segregación para el fenotipo de ácido graso mutante así como para un único locus de resistencia a la canamicina. Para esto, fueron cultivadas individualmente hasta la madurez poco más o menos 100 plantas T3, y fueron recolectadas las semillas. Una muestra de semilla de cada planta T3 fue analizada para determinar su capacidad para germinar y crecer en presencia de canamicina. Además fueron determinadas las composiciones de ácidos grasos de diez semillas individuales adicionales de cada línea. Fue identificada una planta T3 llamada 658-75 cuyas semillas de progenie se segregaban en la proporción de 28 sensibles a la canamicina a 60 resistentes a la canamicina y de 7 con bajo contenido de ácido oleico o con contenido intermedio de ácido oleico a 2 ricas en ácido oleico.

Fueron cultivadas en total aproximadamente 400 semillas de progenie T4 de la línea derivativa 658-75, y fue analizada la composición de ácidos grasos de las hojas. Las de un total de 91 plantas fueron identificadas como homocigotos para el rasgo del alto contenido de ácido oleico (18:2/18:1 menos de 0,5). Las plantas restantes (18:2/18:1 más de 1,2) no pudieron ser definitivamente asignadas a las clases de tipo salvaje y heterocigótica sobre la base de la composición de ácidos grasos de las hojas, y por consiguiente no pudieron ser usadas para analizar la vinculación entre el marcador de canamicina y la mutación de ácidos grasos. Ochenta y tres de las 91 mutantes ricas en ácido oleico que eran aparentemente homocigotos fueron analizadas para determinar la presencia de nopalina, que es otro marcador de T-DNA, en extractos foliares (Errampalli et al. The Plant Cell (1991)3:149-157), y las 83 plantas dieron resultado positivo con respecto a la presencia de nopalina. Esta fuerte vinculación del fenotipo de ácidos grasos de las mutantes y de un marcador de T-DNA proporciona la evidencia de que el rasgo del alto contenido de ácido oleico en la mutante 658 es el resultado de la inserción del T-DNA.

Rescate y análisis de plásmido

Un microgramo y medio de DNA genómico de las plantas mutantes homocigotos de la línea 658-75, preparado a partir de tejido foliar como se ha descrito [Rogers, S. O. and A. J. Bendich (1985) Plant Molecular Biology 5:69-76], fue digerido con 20 unidades de enzima de restricción Bam HI o Sal I (Bethesda Research Laboratory) en un volumen de reacción de 50 \mul según las especificaciones del fabricante. Después de la digestión, el DNA fue extraído con fenol saturado con tampón (Bethesda Research Laboratory), siendo a continuación efectuada precipitación en etanol. De medio a un microgramo de DNA genómico digerido con Bam HI o Sal I fue puesto de nuevo en suspensión en 200 ul o 400 ul de tampón de ligación que contenía Tris-Cl 50mM, pH 8,0, MgCl_{2} 10mM, ditiotreitol 10mM, ATP (ATP = adenosina-5'-trifosfato) 1mM y 4 unidades de T4 DNA ligasa (Bethesda Research Laboratory). La concentración de DNA diluida de aproximadamente 2,5 ug/ml en la reacción de ligación fue elegida para facilitar la circularización, en oposición a la unión intermolecular. La mezcla de reacción fue incubada por espacio de 16 h a 16ºC. Células DH10B competentes (Bethesda Research Laboratory) fueron transfectadas con 10 ng de DNA ligado por cada 100 \mul de células competentes según las especificaciones del fabricante. Las transformantes de las digestiones con Sal I o Bam HI fueron seleccionadas en placas de cultivo LB (LB = Luria-Bertani) (10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de Bacto-levadura, 5 g de NaCl, 15 g de agar por litro, pH 7,4) que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Tras incubación durante la noche a 37ºC, las placas de cultivo fueron examinadas para determinar las colonias resistentes a la ampicilina.

Una sola transformante resistente a la ampicilina derivada de DNA vegetal digerido con Bam HI fue usada para iniciar un cultivo en 35 ml de medio de Luria-Bertani (10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl por litro) que contenía 25 mg/l de ampicilina. El cultivo fue incubado con sacudimiento durante la noche a 37ºC, y las células fueron entonces recolectadas por centrifugación a 1000g por espacio de 10 min. DNA de plásmido, llamado p658-1, fue aislado de las células por el método de la lisis alcalina de Birmbiom et al. [Nucleic Acid Research (1979) 7:1513-1523] como se describe en Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). El DNA del plásmido p658-1 fue digerido por enzimas de restricción Bam HI, Eco RI y Sal I (Bethesda Research Laboratory) y fue sometido a electroforesis a través de gel de agarosa al 1% en tampón 1xTBE (tris-borato 0,089M, EDTA 0,002M) (EDTA = ácido etilendiaminotetraacético). El patrón de restricción indicaba la presencia en este plásmido del esperado fragmento de T-DNA de 14,2 kb y de un putativo fragmento de borde de T-DNA/DNA vegetal de 1,6 kb.

Ejemplo 2 Clonación de cdna delta-12 desaturasa microsomal de arabidopsis thaliana usando dna genómico flanqueando el sitio de T-DNA de inserción en la línea mutante 658-75 de arabidopsis thaliana como sonda de hibridación

Doscientos nanogramos del fragmento Eco RI-Bam HI de 1,6 kb del plásmido p658- 1, a continuación de la digestión del plásmido con Eco RI y Bam HI y de la purificación por electroforesis en agarosa, fueron radiomarcados con alpha[32P]dCTP usando un conjunto de materiales y utensilios llamado Random Priming Labeling Kit (Bethesda Research Laboratory) bajo las condiciones recomendadas por el fabricante.

El DNA radiomarcado fue usado como sonda para someter a selección a una librería de cDNA de Arabidopsis hecha a partir de RNA aislado a partir de las partes al descubierto de varias etapas de crecimiento (Elledge et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., 88:1731-1735) en esencia como se describe en Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Para esto, aproximadamente 17.000 unidades formadoras de placa fueron cultivadas en siete placas de cultivo de Petri de 90 mm que contenían una lámina de células de E. coli LE392 sobre medio de agar NZY (5 g de NaCl, 2 g de MgSO4-7 H_{2}O, 5 g de extracto de levadura, 10 g de hidrolizado ácido de caseína, 13 g de agar por litro). Filtros de réplica de las placas de fago fueron preparados adsorbiendo las placas sobre filtros de nitrocelulosa (BA85, Schleicher and Schuell) e impregnando a continuación sucesivamente por espacio de cinco minutos en cada caso en NaOH 0,5M/NaCl 1M, Tris 0,5M (pH 7,4)/NaCl 1,5M y 2xSSPE (NaCl 0,36M, NaH2PO4 20mM (pH 7,4), EDTA 20mM (pH 7,4)). Los filtros fueron entonces secados al aire y estufados por espacio de 2 h a 80ºC. Tras el estufado, los filtros fueron mojados en 2X SSPE, y fueron entonces incubados a 42ºC en tampón de prehibridación (Formamida al 50%, 5X SSPE, SDS al 1%, 5X Reactivo de Denhardt, y 100 ug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado) por espacio de 2 h. Los filtros fueron retirados del tampón de prehibridación y fueron entonces transferidos a tampón de hibridación (Formamida al 50%, 5X SSPE, SDS al 1%, 1X Reactivo de Denhdardt y 100 ug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado) que contenía la sonda radiomarcada desnaturalizada (véase lo expuesto anteriormente), y fueron incubados por espacio de 40 h a 42ºC. Los filtros fueron lavados tres veces en 2X SSPE/SDS al 0,2% a 42ºC (15 min. cada vez) y dos veces en 0,2X SSPE/SDS al 0,2% a 55ºC (30 min. cada vez), siendo efectuada a continuación autorradiografía sobre película Kodak XAR-5 con una pantalla intensificadora a -80ºC, durante la noche. Quince placas fueron identificadas como de hibridación positiva sobre filtros de réplica. Cinco de éstas fueron sometidas a purificación de placas en esencia como se describe en Sambrook et al., (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los clones de cDNA lambda YES-R fueron convertidos en plásmido propagando el fago en las células BNN--132 de E. coli, lo cual expresa la proteína Cre que extirpa el inserto de cDNA como un plásmido de doble hebra por recombinación específica de sitio in vivo mediada por cre en un sitio 'lox' presente en el fago. Clones plasmídicos resistentes a la ampicilina que contenían insertos de cDNA fueron cultivados en cultivo en líquido, y fue preparado DNA plasmídico usando el método de la lisis alcalina como se ha descrito anteriormente. Los tamaños de los plásmidos resultantes fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa. Los geles de agarosa fueron tratados con NaOH 0,5M/NaCl 1M, y Tris 0,5M (pH 7,4), NaCl 1,5M por espacio de 15 minutos en cada caso, y el gel fue entonces secado completamente en un secador de gel a 65ºC. El gel fue hidratado en 2X SSPE y fue incubado durante la noche, a 42ºC, en tampón de hibridación que contenía la sonda radiomarcada desnaturalizada, siendo a continuación efectuado lavado como se ha descrito anteriormente. Tras la autorradiografía, se comprobó que los insertos de cuatro de los clones de cDNA purificados se habían hibridado con la sonda. DNA plasmídico de los clones hibridados fue purificado mediante equilibrado en un gradiente de CaCl/bromuro de etidio (véase lo expuesto anteriormente). Los cuatro clones de cDNA fueron secuenciados usando DNA polimerasa Sequenase T7 (US Biochemical Corp.) y siguiendo las instrucciones del fabricante, comenzando con cebadores homólogos a las secuencias vectoriales que flanquean el inserto de cDNA. Tras haber comparado las secuencias parciales de los insertos obtenidos a partir de los cuatro clones, quedó de manifiesto que los mismos contenían cada uno secuencias en común. Fue secuenciado un clon de cDNA, el p92103, que contenía un inserto de cDNA de aproximadamente 1,4 kb. los tres clones más largos fueron subclonados en el vector plasmídico pBluescript (Stratagene). Uno de estos clones, llamado pSF2b, que contenía inserto de cDNA de aproximadamente 1,2 kb, fue también secuenciado serialmente con cebadores diseñados a partir de las nuevas secuencias adquiridas a medida que progresaba el experimento de secuenciación. La secuencia compuesta derivada de pSF2b y p92103 está ilustrada en la ID SEC Nº:1.

Ejemplo 3 Clonación de cDNAs de ácido graso desaturasa vegetal usando el clon de cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de arabidopsis taliana como sonda de hibridación

Fue obtenido de plásmido pSF2b un fragmento de aproximadamente 1,2 kb que contenía la secuencia codificante de delta-12 desaturasa de Arabidopsis de la ID SEC Nº:1. Este plásmido fue digerido con EcoR I, y el fragmento de cDNA de delta-12 desaturasa de 1,2 kb fue purificado a partir de la secuencia vectorial por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento fue radiomarcado con ^{32}P como se ha descrito anteriormente.

Clonación de un cDNA seminal de brassica napus que codifica delta-12 ácido graso desaturasa microsomal

La sonda radiomarcada fue usada para someter a selección a una librería de cDNA seminal de Brassica napus. A fin de construir la librería, fueron recolectadas 20-21 días después de la polinización y puestas en nitrógeno líquido semillas de Brassica napus, y el RNA polisomal fue aislado siguiendo el procedimiento de Kamalay et al., (Cell (1980) 19:935-946). La fracción de mRNA poliadenilado fue obtenida por cromatografía de afinidad sobre oligo-dT celulosa (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1972) 69:1408-1411). Cuatro microgramos de este mRNA fueron usados para construir una librería de cDNA seminal en fago lambda (vector Uni-ZAP^{MF}) (MF = marca de fábrica) usando el protocolo descrito en el conjunto de materiales y utensilios para la síntesis de ZAP-cDNA^{MF} (Catálogo de Stratagene de 1991, artículo Nº200400). Aproximadamente 600.000 clones fueron sometidos a selección para determinar las placas en las que había resultado positiva la hibridación usando el fragmento EcoR I radiomarcado de pSF2b como sonda en esencia como se describe en Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), exceptuando que fueron usadas unas condiciones de hibridación poco rigurosas (Tris 50mM, pH 7,6, 6X SSC, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 \mug de DNA de timo de ternero desnaturalizado y 50ºC), y los lavados posthibridación fueron efectuados dos veces con 2X SSC, SDS al 0,5% a temperatura ambiente por espacio de 15 min., a continuación dos veces con 0,2X SSC, SDS al 0,5% a temperatura ambiente por espacio de 15 min., y a continuación dos veces con 0,2X SSC, SDS al 0,5% a 50ºC por espacio de 15 min. Fueron tomadas y cultivadas diez placas positivas que presentaban fuerte hibridación, y fue repetido el procedimiento de selección. De la selección secundaria fueron aisladas nueve placas con fago puro. Los clones plasmídicos que contenían los insertos de cDNA fueron obtenidos utilizando un fago colaborador según el protocolo de excisión in vivo proporcionado por Stratagene. El DNA de doble hebra fue preparado utilizando el método de lisis alcalina anteriormente descrito, y los plásmidos resultantes fueron analizados según tamaño por electroforesis en geles de agarosa. El mayor de los nueve clones, llamado pCF2-165D, contenía un inserto de aproximadamente 1,5 kb que fue secuenciado como se ha descrito anteriormente. La secuencia de 1394 bases del inserto de cDNA de pCF2-165D está ilustrada en la ID SEC Nº:3. Están contenidas en el inserto pero no ilustradas en la ID SEC Nº:3 aproximadamente 40 bases del extremo 5' de la región no traducida del lado 5' y una cola de poli A de aproximadamente 38 bases en el extremo 3' final del inserto.

Clonación de un cDNA de semilla de soja que codifica delta-12 ácido graso desaturasa microsomal

Se hizo una librería de cDNA de la manera siguiente: Embriones de soja (cada uno con un peso de aproximadamente 50 mg recién cogido) fueron retirados de las vainas y congelados en nitrógeno líquido. Los embriones congelados fueron molidos hasta haber sido convertidos en un polvo fino en presencia de nitrógeno líquido, y fueron entonces sometidos a extracción mediante homogeneización en Polytron y fraccionados para lograr un enriquecimiento en RNA total por el método de Chirgwin et al. (Biochemistry (1979) 18:5294-5299). La fracción de ácido nucleico fue enriquecida para poli A^{+}Rna pasando el RNA total por una columna de oligo-dT celulosa y eluyendo el poli A^{+}RNA con sal como describen Goodman et al. (Meth. Enzymol. (1979) 68:75-90). El cDNA fue sintetizado a partir del poli A^{+}RNA purificado usando el Sistema de Síntesis de cDNA (Bethesda Research Laboratory) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA de doble hebra resultante fue metilado mediante EcO RI DNA metilasa (Promega) antes de rellenar sus extremos con T4 DNA polimerasa (Bethesda Research Laboratory) y de la ligación por extremos romos a ligadores Eco RI fosforilados usando T4 DNA ligasa (Pharmacia). El DNA de doble hebra fue digerido con enzima Eco RI, separado de los ligadores sobrantes mediante paso por una columna de filtración en gel (Sepharose CL-4B), y ligado a vector lambda ZAP (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. El DNA ligado fue empaquetado en fago usando el extracto de empaquetamiento Gigapack (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. La librería de cDNA resultante fue amplificada según las instrucciones de Stratagene y almacenada a -80ºC.

Siguiendo las instrucciones del Manual del Conjunto de Materiales y Utensilios para la Clonación de Lambda ZAP (Stratagene), la librería de cDNA fago fue usada para infectar células BB4 de E. coli, y aproximadamente 600.000 unidades formadoras de placa fueron cultivadas en placas de cultivo de Petri de 150 mm de diámetro. Fueron hechas transferencias duplicadas de las placas de cultivo sobre filtros de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell). Los filtros fueron prehibridados en 25 ml de tampón de hibridación que constaba de 6X SSPE, 5X solución de Denhardt, SDS al 0,5%, sulfato de dextrano al 5% y 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (Sigma Chemical Co.) a 50ºC por espacio de 2 h. Fue añadida la sonda radiomarcada preparada a partir de pSF2b como se ha descrito anteriormente, y se la dejó hibridarse por espacio de 18 h a 50ºC. Los filtros fueron lavados exactamente como se ha descrito anteriormente. La autorradiografía de los filtros indicaba que había 14 placas que presentaban fuerte hibridación. Las 14 placas fueron sometidas a un segundo ciclo de selección igual como antes. Fueron observadas numerosas placas que presentaban fuerte hibridación en 6 de los 14 filtros, y una, bien aislada de otro fago, fue tomada de cada una de las seis placas de cultivo para adicional análisis.

Siguiendo las instrucciones del Manual de Instrucciones del Conjunto de Materiales y Utensilios para la Clonación de Lambda ZAP (Stratagene), secuencias del vector pBluescript, que incluían los insertos de cDNA, de los fagos purificados fueron extirpadas en presencia de un fago colaborador, y los fagomidos resultantes fueron usados para infectar células XL-1 Blu de E. coli. El DNA de los plásmidos fue hecho mediante el sistema ``Magic Miniprep'' de Promega según las instrucciones del fabricante. El análisis de restricción indicó que los plásmidos contenían insertos cuyo tamaño iba desde 1 kb hasta 2,5 kb. El DNA de doble hebra desnaturalizado con álcali de uno de éstos, llamado pSF2-169K, contenía un inserto de 1,6 kb, y fue secuenciado como se ha descrito anteriormente. La secuencia de nucleótidos del inserto de cDNA en plásmido pSF2-169K está ilustrada en la ID SEC Nº:5.

cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de maíz fue aislado utilizando una técnica que hacía uso de la reacción en cadena de la polimerasa. Para esto se hizo una librería de cDNA según poli A^{+} RNA a partir de embriones de maíz en desarrollo en vector Lambda ZAP II (Stratagene). 5-10 ul de esta librería fueron usados como molde para la reacción en cadena de la polimerasa usando 100 pmoles de cada uno de dos conjuntos de oligómeros NS3 degenerados (ID SEC Nº:13) y cantidades equimolares de RB5a/b (es decir, cantidades equimolares de las secuencias de las ID SEC Núms:16/17) como cebadores sentido y antisentido, respectivamente. NS3 y RB5a/b corresponden a tramos de aminoácidos 101-109 y 318-326, respectivamente, de la secuencia de la ID SEC Nº:2 que están conservados en las de la mayoría de las delta-12 desaturasas microsomales (ID SEC Núms.:2, 4, 6, 8). La reacción en cadena de la polimerasa fue llevada a cabo usando el conjunto de materiales y utensilios para la reacción en cadena de la polimerasa (Perkin-Elmer) y efectuando 40 ciclos a 94ºC por espacio de 1 min., a 45ºC por espacio de 1 min. y a 55ºC por espacio de 2 min. Los análisis de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa sobre un gel de agarosa pusieron de manifiesto la presencia de un producto que tenía el tamaño esperado (720 pares de bases) y que estaba ausente en las reacciones de control que contenían solamente los cebadores sentido o antisentido. El fragmento del producto de la reacción en cadena de la polimerasa fue purificado en gel y fue entonces usado como sonda para someter a selección a la misma librería de cDNA de maíz a 60ºC como se ha descrito anteriormente. Una placa en la que había resultado positiva la hibridación fue purificada, y la determinación de secuencia parcial de su cDNA puso de manifiesto que se trataba de una secuencia de nucleótidos que codificaba delta-12 desaturasa microsomal pero estaba truncada en el extremo 3'. El inserto de cDNA que codificaba la desaturasa parcial fue aislado en gel y fue usado para sondear de nuevo la librería de cDNA de maíz. Fueron recuperadas y caracterizadas varias placas positivas. El análisis de secuencia de DNA reveló que todos estos clones parecen representar la misma secuencia con la distinta longitud de los extremos 5' o 3'. El clon que contenía el inserto de mayor longitud, llamado pFad2#1, fue secuenciado completamente. La ID SEC Nº:7 ilustra la secuencia de nucleótidos de 5' a 3' de 1790 pares de bases de cDNA de maíz (Zea mays) que codifica delta-12 desaturasa microsomal en plásmido pFad2#1. Los nucleótidos 165 a 167 y los nucleótidos 1326 a 1328 son, respectivamente, el codón de iniciación putativo y el codón de terminación del marco de lectura abierto (nucleótidos 164 a 1328). La secuencia de la ID SEC Nº:8 es la secuencia proteica de 387 aminoácidos deducida del marco de lectura abierto (nucleótidos 164 a 1328) en la ID SEC Nº:7. La secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido compartía unas identidades globales de un 71%, un 40% y un 38% con delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis, delta-15 desaturasa microsomal de Arabidopsis y delta-15 desaturasa plastídica de Arabidopsis, respectivamente. Esta secuencia carecía además de una prolongación de aminoácidos N-terminal que indicaría que se trata de una enzima plastídica. Sobre la base de estas consideraciones, se llega a la conclusión de que esta secuencia codifica una delta-12 desaturasa microsomal.

Clonación de un cDNA que codifica una delta-12 desaturasa microsomal y de cDNAs que codifican enzimas afines a delta-12 desaturasa microsomal a partir de semilla de ricino

cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de ricino fue aislado utilizando una técnica que hacía uso de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. mRNA polisomal fue aislado a partir de granos de ricino de las etapas I-II (5-10 días después de la plantación) y también a partir de granos de ricino de las etapas IV-V (20-25 días después de la plantación). Diez ng de cada mRNA fueron usados para distintas reacciones en cadena de la polimerasa de transcripción inversa utilizando el conjunto de materiales y utensilios de Perkin-Elmer para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa con la concentración de reactivos recomendada por el protocolo del conjunto de materiales y utensilios. La reacción de la transcriptasa inversa fue cebada con hexámeros aleatorios, y la reacción en cadena de la polimerasa fue cebada con 100 pmoles de cada uno de los cebadores de delta-12 desaturasa degenerada NS3 y NS 9 (ID SEC Núms.:13 y 14, respectivamente). La mezcla de la reacción de la transcriptasa inversa fue incubada a 25ºC por espacio de 10 min., a 42ºC por espacio de 15 min., a 99ºC por espacio de 5 min. y a 5ºC por espacio de 5 min. La mezcla de la reacción en cadena de la polimerasa fue incubada a 95ºC por espacio de 2 min. siendo a continuación efectuados 35 ciclos a 95ºC por espacio de 1 min./a 50ºC por espacio de 1 min. Una incubación final a 60ºC por espacio de 7 min. completó la reacción. Un fragmento de DNA de 720 pares de bases fue amplificado a partir de mRNA tanto de las etapas I-II como de las etapas IV-V. El fragmento de DNA amplificado de una de las reacciones fue purificado en gel y clonado en un vector pGEM-T usando el conjunto de materiales y utensilios de Promega para la clonación por reacción en cadena de la polimerasa en pGEM-T para crear el plásmido pRF2-1C. El inserto de 720 pares de bases en pRF2-1C fue secuenciado como se ha descrito anteriormente, y la secuencia de DNA resultante está ilustrada en la ID SEC Nº:9. La secuencia de DNA en la ID SEC Nº:9 contiene un marco de lectura abierto que codifica 219 aminoácidos (ID SEC Nº:10), que tiene una identidad de un 81% (una similitud de un 90%) con los aminoácidos 135 a 353 de la delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis que está descrita en la ID SEC Nº:2. El inserto de cDNA en pRF2-1C es por consiguiente un fragmento de 673 pares de bases de un cDNA de plena longitud que codifica una delta-12 desaturasa microsomal seminal de grano de ricino. El cDNA de delta-12 desaturasa microsomal seminal de grano de ricino de plena longitud puede ser aislado sometiendo a selección a una librería de cDNA de grano de ricino, a 60ºC, con el inserto marcado de pRF2-1C como se ha descrito en el ejemplo anterior. El inserto en pRF2-1C puede ser también usado para someter a selección a librerías de grano de ricino a temperaturas más bajas para aislar secuencias afines a las delta-12 desaturasas, tales como la delta-12 hidroxilasa.

Una librería de cDNA hecha según poli A^{+} mRNA aislado a partir de granos de ricino en desarrollo (etapas IV-V, 20-25 días después de la plantación) fue sometida a selección como se ha descrito anteriormente. Fueron añadidas sondas radiomarcadas preparadas a partir de pSF2b o pRF2-1C, como se ha descrito anteriormente, y se las dejó hibridarse por espacio de 18 h a 50ºC. Los filtros fueron lavados como se ha descrito anteriormente. La autorradiografía de los filtros indicaba que había numerosas placas en las que se había producido hibridación, las cuales presentaban una fuerte hibridación o una débil hibridación. Tres de las placas que presentaban fuerte hibridación (190A-41, 190A-42 y 190A-44) y tres de las placas que presentaban débil hibridación (190B-41, 190b-43 y 197c-42) fueron sometidas a purificación de placas utilizando los métodos anteriormente descritos. Los tamaños de los insertos de cDNA de los fagos purificados fueron determinados mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del inserto usando fago como molde y oligómeros lambda-gt11 (Amplímeros lambda-gt11 de Clontech) como cebadores. Los insertos amplificados por reacción en cadena de la polimerasa de los fagos amplificados fueron subclonados en pBluescript (Pharmacia) que había sido cortado con Eco RI y rellenado con Klenow (Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Approach, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los plásmidos resultantes fueron llamados pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44, pRF190b-41, pRF190b-43 y pRF197c-42. Todos los insertos eran de aproximadamente 1,1 kb, con la excepción del pRF197c-42, que era de aproximadamente 1,5 kb. Los insertos en los plásmidos fueron secuenciados como se ha descrito anteriormente. El inserto en pRF190b-43 no contenía marco de lectura abierto alguno, y no fue identificado. Los insertos en pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44 y pRF190b-41 eran idénticos. El inserto en pRF197c-42 contenía todos los nucleótidos de los insertos en pRF190a-41, pRF190a-42, pRF190a-44 y pRF199b-41 más un fragmento adicional de aproximadamente 400 pares de bases. Se dedujo, por consiguiente, que el inserto en pRF197c-42 era una versión más larga de los insertos en pRF190a-41, pRF190a- 42, pRF190a-44 y pRF190b-41, y que todos ellos se derivaban del mismo mRNA de plena longitud. La secuencia de cDNA completa del inserto en el plásmido pRF197c-42 está ilustrada en la ID SEC Nº:11. La secuencia de aminoácidos deducida de la ID SEC Nº:11, ilustrada en la ID SEC Nº:12, es idéntica en un 78,5% (con una similitud de un 90%) a la delta-12 desaturasa microsomal de ricino anteriormente descrita (ID SEC Nº:10) y es idéntica en un 66% (con una similitud de un 80%) a la secuencia de aminoácidos de delta-12 desaturasa de Arabidopsis en la ID SEC Nº:2. Estas similitudes confirman que pRF197c-42 es un cDNA de semilla de ricino que codifica una delta-12 desaturasa microsomal o una enzima afín a delta-12 desaturasa microsomal, tal como una delta-12 hidroxilasa. Se hicieron cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa específicos para pRF2-1C y pRF197c-42. Para pRF2-1c el cebador del lado de cabeza era las bases 180 a 197 de la secuencia de cDNA en la ID SEC Nº:9. Para pRF197c-42 el cebador del lado de cabeza era las bases 717 a 743 de la secuencia de cDNA en la ID SEC Nº:11. Se hizo un cebador común del lado de cola correspondiente al exacto complemento de los nucleótidos 463 a 478 de la secuencia descrita en la ID SEC Nº:9. Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa con hexámeros aleatorios y los cebadores anteriormente indicados y las temperaturas de incubación anteriormente descritas, se observó que el mRNA que daba lugar al cDNA contenido en pRF2-1C está presente en semillas de ricino tanto de las etapas I-II como de las etapas IV-V, mientras que el mRNA que dio lugar al cDNA contenido en el plásmido pRF197c-42 está presente tan sólo en semillas de ricino de las etapas IV-V, es decir que es expresado tan sólo en tejido que sintetiza activamente ácido ricinoleico. Así, es posible que este cDNA codifique una delta-12 hidroxilasa.

Clones tales como pRF2-1C y pRF197c-42 y otros clones de la selección diferencial que, sobre la base de su secuencia de DNA, son menos afines a las delta-12 desaturasas microsomales seminales de grano de ricino y no son ninguna de las ácido graso desaturasas conocidas anteriormente descritas o descritas en la WO 9311245 pueden ser expresados, por ejemplo, en embriones de soja o en otro adecuado tejido vegetal, o bien en un microorganismo, tal como levadura, que no contenga normalmente ácido ricinoleico, utilizando adecuados vectores de expresión y protocolos de transformación. La presencia de nuevo ácido ricinoleico en el tejido transformado o en los tejidos transformados que expresa o que expresan el cDNA de ricino confirmaría la identidad del cDNA de ricino como DNA que codifica para una oleato hidroxilasa.

Ejemplo 4 Uso del clon genómico de delta-12 desaturasa de arabidopsis thaliana como marcador del polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP) para mapear el locus de delta-12 desaturasa en arabidopsis

El gen que codifica delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis fue usado para mapear el locus genético que codifica la delta-12 desaturasa microsomal de Arabidopsis thaliana. El inserto de cDNA de pSF2b que codifica DNA de delta- 12 desaturasa microsomal de Arabidopsis fue radiomarcado y usado para someter a selección a una librería de DNA genómico de Arabidopsis. Fue aislado DNA de varios fagos puros que presentaban fuerte hibridación. El análisis por transferencia Shouthern del DNA de distintos fagos usando inserto de cDNA de pSF2b radiomarcado como sonda identificó un fragmento del inserto de Hind III de 6 kb como un fragmento que contenía la región codificante del gen. Este fragmento fue subclonado en vector pBluescript redundando en plásmido pAGF2-6, y fue usado para determinación de secuencia parcial. Esta secuencia (ID SEC Nº:15) confirmó que se trata del gen de delta-12 desaturasa microsomal. DNA de dos fagos fue aislado y marcado con ^{32}P usando una conjunto de materiales y utensilios para cebado aleatorio de Pharmacia bajo las condiciones recomendadas por el fabricante. El DNA radiactivo fue usado para sondar una transferencia Southern que contenía DNA genómico de Arabidopsis thaliana (ecotipo Wassileskija y fondo de ecotipo Landesberg de la línea marcadora W100) digerido con una de varias endonucleasas de restricción. A continuación de la hibridación y de los lavados bajo condiciones estándar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press), fueron obtenidos los autorradiogramas. Un distinto patrón de hibridación (polimorfismo) fue identificado en los DNAs genómicos digeridos con Hind III usando uno de los DNAs de fago. Este polimorfismo fue localizado en un fragmento de Hind III de 7 kb en el DNA de fago que reveló el polimorfismo. El fragmento de 7 kb fue subclonado en vector pBluescript, redundando en plásmido pAGF2-7. El plásmido pAGF2-7 fue sometido a restricción con enzima Hind III y fue usado como sonda radiomarcada para mapear el polimorfismo en esencia como describen Helentjaris et al., (Theor. Appl. Genet. (1986) 72:761-769). El fragmento de DNA radiomarcado fue aplicado como se ha descrito anteriormente a transferencias Southern de DNA genómico digerido con Hind III aislado a partir de 117 descendientes endogámicos recombinantes (derivados de líneas descendientes de una sola semilla hasta la generación F_{6}) resultantes de un cruce entre la línea marcadora W100 de Arabidopsis thaliana y el ecotipo Wassileskija (Burr et al., Genetics (1988) 118:519-526). Se interpretó que las bandas en los autorradiogramas eran el resultado de la herencia del DNA paterno (ecotipo Wassileskija) o del DNA materno (línea marcadora W100), o de ambos (un heterocigoto). Los datos de segregación resultantes fueron sometidos a análisis genético utilizando el programa de ordenador Mapmaker (Lander et al., Genomics (1987) 1:174-181). En conjunción con los datos de segregación anteriormente obtenidos para 63 marcadores anónimos del polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción y para 9 marcadores morfológicos en Arabidopsis thaliana (Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1988) 85:6856-6860; Nam et al., Plant Cell (1989) 1:699-705), fue determinada la posición de un solo locus genético correspondiente al gen de delta-12 desaturasa microsomal. Así, se determinó que la ubicación del gen de delta-12 desaturasa microsomal era la ubicada a 13,6 cM del locus c3838 en ubicación proximal con respecto al mismo, a 9,2 cM del locus 1At228 en ubicación distal con respecto al mismo, y a 4,9 cM del locus FadD en ubicación proximal con respecto al mismo en el cromosoma 3 [Koorneef, M. et. Al. (1993) in Genetic Maps, Ed. O'Brien, S. J.; Yadav et al. (1993) Plant Physiology 103:467-476].

Ejemplo 5 Uso de secuencia de cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de soja como marcador del polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP)

El inserto de 1,6 kb obtenido del plásmido pSF2-169K como se ha descrito anteriormente fue radiomarcado con ^{32}P usando un conjunto de materiales y utensilios de cebado aleatorio de la Bethesda Research Laboratories bajo las condiciones recomendadas por el fabricante. La sonda radiactiva resultante fue usada para sondar una transferencia Southern (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) que contenía DNA genómico de soja (Glycine max (variedad Bonus obtenida por selección) y Glycine soja (PI81762)) digerido con una de varias enzimas de restricción. Tras la hibridación y los lavados bajo condiciones poco rigurosas (Tris 50mM, pH 7,5, 6X SSPE, sulfato de dextrano al 10%, SDS al 1% a 56ºC para la hibridación y los lavados iniciales, cambiando a 2X SSPE y SDS al 0,1% para el lavado final), fueron obtenidos autorradiogramas, y fueron identificados distintos patrones de hibridación (polimorfismos) en digestiones efectuadas con las enzimas de restricción Hind III y Eco RI. Estos polimorfismos fueron usados para mapear dos loci de pSF2-169K en relación con otros loci en el genoma de soja en esencia como describen Helentjaris et al., (Theor. Appl. Genet. (1986) 72:761-769). Se determinó que las posiciones del mapa de los polimorfismos estaban en el grupo de ligación 11 entre los loci 4404,00 y 1503,00 (a 4,5 cM y a 7,1 cM de 4404,00 y 1503,00, respectivamente) y en el grupo de ligación 19 entre los loci 4010,00 y 5302,00 (a 1,9 cM y a 2,7 cM de 4010,00 y de 5302,00, respectivamente) [Rafalski, A. and Tingey, S. (1993) in Genetic Maps, Ed. O'Brien, S. J.].

Ejemplo 6 Expresión de delta-12 desaturasa microsomal en sojas Construcción de vectores para la transformación de glycine max para una reducida expresión de delta-12 desaturasas microsomales en semillas de soja en desarrollo

Fueron construidos plásmidos que contenían la secuencia de cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de G. max. antisentido bajo el control del promotor del Inhibidor 3 de Tripsina de Kunitz (KTi3) de soja (Jofuku and Goldberg, Plant Cell (1989) 1:1079-1093), del promotor de proteína de almacenamiento seminal 7S de Phaseolus vulgaris (faseolina) (Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1985) 82:3320-3324; Hoffman et al., Plant Mol. Biol. (1988) 11:717-729) y del promotor de beta-conglicinina de soja (Beachy et al., EMBO J. (1985) 4:3047-3053). La construcción de vectores que expresaban el cDNA antisentido de delta-12 desaturasa de soja bajo el control de estos promotores fue facilitada por el uso de los plásmidos siguientes: pML70, pCW108 y pCW109A.

El vector pML70 contiene el promotor KTi3 y la región no traducida del lado 3' KTi3, y fue sacado del vector pTZ18R que está disponible comercialmente (Farmacia) por medio de los plásmidos intermedios pML51, pML55, pML64 y pML65. Un fragmento Bst BI/Eco RI de 2,4 kb del gen KTi3 de soja completo (Jofuku and Goldberg (1989) Plant Cell 1:1079-1093), que contiene todos los 2039 nucleótidos de la región no traducida del lado 5' y 390 bases de la secuencia codificante del gen KTi3 terminando en el sitio para Eco RI correspondiente a las bases 755 a 761 de la secuencia descrita en Jofuku et al (1989) Plant Cell 1:427-435, fue ligado en los sitios para Acc I/Eco RI de pTZ18R para crear el plásmido pML51. El plásmido pML51 fue cortado con Nco I, rellenado usando Klenow, y religado, para destruir un sitio para Nco I en el centro de la región no traducida del lado 5' del inserto KTi3, redundando en el plásmido PML55. El plásmido pML55 fue digerido parcialmente con Xmn I/Eco RI para liberar un fragmento de 0,42 kb, correspondiente a las bases 732 a 755 de la secuencia anteriormente citada, que fue descartado. Un ligador Xmn I/Eco RI sintético que contenía un sitio para Nco I fue construido a base de hacer un dímero de oligonucleótidos sintéticos complementarios que constaban de la secuencia codificante para un sitio para Xmn I (5'-TCTTCC-3') y un sitio para Nco I (5'-CCATGGG-3') seguida directamente por parte de un sitio para Eco RI (5'-GAAGG-3'). Los sitios para Xmn I y Nco I/Eco RI fueron ligados por una corta secuencia intermedia (5'-ATAGCCCCCAA-3'). Este ligador sintético fue ligado en los sitios para Xmn I/Eco RI del fragmento de 4,94 kb para crear el plásmido pML64. La región no traducida del lado 3' del gen KTi3 fue amplificada a partir de la secuencia descrita en Jofuku et al (Ibid.) mediante protocolos de reacción en cadena de la polimerasa estándar (conjunto de materiales y utensilios GeneAmp de Perkin Elmer Cetus para la reacción en cadena de la polimerasa) usando los cebadores ML51 y ML52. El cebador ML51 contenía los 20 nucleótidos correspondientes a las bases 1072 a 1091 de la secuencia anteriormente citada con la adición de nucleótidos correspondientes a los sitios para Eco RV (5-'GATATC-3'), Nco I (5'-CCATGG-3'), Xba I (5'-TCTAGA-3'), Sma I (5'-CCCGGG-3') y Kpn I (5'-GGTACC-3') en el extremo 5' del cebador. El cebador ML52 contenía el exacto complemento de los nucleótidos correspondientes a las bases 1242 a 1259 de la secuencia anteriormente citada con la adición de nucleótidos correspondientes a los sitios para Sma I (5'- CCCGGG-3'), Eco RI (5'-GAATTC-3'), Bam HI (5'-GGATCC-3') y Sal I (5'-GTCGAC-3') en el extremo 5' del cebador. El extremo 3' amplificado mediante reacción en cadena de la polimerasa del gen KTi3 fue ligado en los sitios para Nco I/Eco RI de pML64 para crear el plásmido pML65. Fue construido un ligador sintético de múltiples sitios de clonación a base de hacer un dímero de oligonucleótidos sintéticos complementarios que constaba de la secuencia codificante para los sitios para Pst I (5'-CTGCA-3'), Sal I (5'-GTCGAC-3'), Bam HI (5'-GGATCC-3') y Pst I (5'-CTGCA-3'). El ligador fue ligado en el sitio para Pst I (directamente en el lado 5' con respecto a la región promotora KTi3) de pML65 para crear el plásmido pML70.

El fragmento Sma I/Kpn I de 1,46 kb de pSF2-169K (cDNA de delta-12 desaturasa de soja anteriormente descrito) fue ligado en los correspondientes sitios en pML70, redundando en el plásmido pBS10. El fragmento de cDNA de desaturasa estaba en orientación inversa (antisentido) con respecto al promotor KTi3 en pBS10. El plásmido pBS10 fue digerido con Bam HI, y fue aislado por electroforesis en gel de agarosa un fragmento de 3,47 kb, que representaba la unidad transcripcional de promotor KTi3/cDNA antisentido de desaturasa/extremo 3' de KTi3. El vector pML18 consta del promotor (35S) del virus del mosaico de la coliflor no específico de tejido y constitutivo (Odell et al., Nature (1985) 313:810-812; Hull et al., Virology (1987) 86:482-493) que activa la expresión del gen de neomicina fosfotransferasa descrito en (Beck et al. (1982) Gene 19:327-336) seguido por el extremo 3' del gen de nopalina sintasa que incluye los nucleótidos 848 a 1550, descrito por (Depicker et al. (1982) J. Appl. Genet. 1:561-574). Esta unidad transcripcional fue insertada en el vector de clonación comercial pGEM9Z (Gibco-BRL) y está flanqueada en el extremo 5' del promotor 35S por los sitios de restricción para Sal I, Xba I, Bam HI y Sma I en ese orden. Un adicional sitio para Sal I está presente en el extremo 3' de la secuencia NOS 3', y los sitios para Xab I, Bam HI y Sal I son únicos. La unidad transcripcional de 3,47 kb liberada del pBS10 fue ligada en el sitio para Bam HI del vector pML18. Cuando los plásmidos resultantes fueron sometidos a doble digestión con Sma I y Kpn I, los plásmidos que contenían insertos en la orientación deseada produjeron 3 fragmentos de 5,74, 2,69 y 1,46 kb. un plásmido con la unidad transcripcional en la orientación correcta fue seleccionado y fue llamado PBS13.

El vector pCW108 contiene el promotor de faseolina seminal y la región no traducida del lado 3' y fue sacado del plásmido pUC18 (Gibco-BRL) que está disponible comercialmente por medio de los plásmidos AS3 y pCW104. El plásmido AS3 contiene 495 pares de bases del promotor de faseolina (proteína de almacenamiento seminal 7S) de judía (Phaseolus vulgaris) empezando con 5'-TGGTCTTTTGGT-3' seguida por todos los 1175 pares de bases de la región no traducida del lado 3' del mismo gen (véanse las descripciones de secuencias en Doyle et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238 y Slightom et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 80:1897-1901). Puede encontrarse adicional descripción de secuencias en la WO 9113993) clonado en el sitio para Hind III de pUC18. Los adicionales sitios de clonación de la región de clonación múltiple de pUC18 (Eco RI, Sph I, Pst y Sal I) fueron retirados mediante digestión con Eco RI y Sal I, rellenando los extremos con Klenow y religando para producir el plásmido pCW104. Fue creado un nuevo sitio de clonación múltiple entre los 495 pares de bases de la faseolina del lado 5' y los 1175 pares de bases de la faseolina del lado 3' a base de insertar un dímero de oligonucleótidos sintéticos complementarios que constaba de la secuencia codificante para un sitio para Nco I (5'-CCATGG-3') seguida por tres bases de relleno (5'-TAG-3'), la secuencia codificante para un sitio para Sma I (5'-CCCGGG-3'), las tres últimas bases de un sitio para Kpn I (5'-TAC-3'), una citosina y la secuencia codificante para un sitio para Xba I (5'-TCTAGA-3') para crear el plásmido pCW108. Este plásmido contiene sitios únicos para Nco I, Sma I, Kpn I y Xba I directamente detrás del promotor de faseolina. El fragmento Eco RV/Sma I de 1,4 kb de pSF2-169K fue ligado en el sitio para Sma I del fagomido pBC SK+ (Stratagene) que está disponible comercialmente. Un fagomido con el cDNA en la orientación deseada fue seleccionado mediante digestión con Pfl MI/Xho I para producir fragmentos de aproximadamente 1 kb y 4 kb, y fue llamado pMI-SF2. El fragmento Xmn I/Xba I de 1,4 kb de pMI-SF2 fue insertado en los sitios para Sma I/Xba I de pCW108 para producir el plásmido pBS11, que tiene el cDNA de delta-12 desaturasa de soja en la orientación inversa (3'-5') detrás del promotor de faseolina. El plásmido pBS11 fue digerido con Bam HI, y un fragmento de 3,07 kb que representa la unidad transcripcional de promotor de faseolina/cDNA antisentido de desaturasa/extremo 3' de faseolina fue aislado por electroforesis en gel de agarosa y ligado en el sitio para Hind III de PML18 (anteriormente descrito). Cuando los plásmidos resultantes fueron digeridos con Xba I, los plásmidos que contenían los insertos en la orientación deseada produjeron 2 fragmentos de 8,01 y 1,18 kb. Un plásmido con la unidad transcripcional en la orientación correcta fue seleccionado y fue llamado pBS14.

El vector pCW109A contiene la secuencia promotora de b-conglicinina de soja y la región no traducida del lado 3' de faseolina y es una versión modificada del vector pCW109 que fue sacado del plásmido pUC18 (Gibco-BRL) que está disponible comercialmente. El vector pCW109 fue hecho a base de insertar en el sitio para Hind III del vector de clonación pUC18 una región no codificante del lado 5' de 555 pares de bases (que contenía la región promotora) del gen de b-conglicinina seguida por la secuencia de clonación múltiple que contiene los sitios para endonucleasas de restricción para Nco I, Sma I, Kpn I y Xba I. como se ha descrito para pCW108 anteriormente, y entonces 1174 pares de bases de la región no traducida del lado 3' de faseolina de judía común en el sitio para Hind III (anteriormente descrito). La región promotora de b-conglicinina usada es un alelo del gen de b-conglicinina publicado (Doyle et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:9228-9238) debido a las diferencias en 27 posiciones nucleotídicas. Adicional descripción de la secuencia de este gen puede encontrarse en Slightom (WO 9113993). Para facilitar el uso en construcciones antisentido, el sitio para Nco I y el sitio de inicio de la traducción potencial en el plásmido pCW109 fueron destruidos por digestión con NcoI, digestión con exonucleasa de judía de urd y con religación del sitio romo para obtener el plásmido modificado pCW109A. El plásmido pCW109A fue digerido con Hind III, y el fragmento resultante de 1,84 kb, que contenía la región no traducida del lado 3' de b-conglicinina/cDNA antisentido de delta-12 desaturasa/faseolina, fue aislado sobre gel. El plásmido pML18 (anteriormente descrito) fue digerido con Xba I, rellenado usando Klenow y religado, a fin de retirar el sitio para Xba I. El plásmido resultante fue llamado PBS16. El fragmento de 1,84 kb del plásmido pCW109A (descrito anteriormente) fue ligado en el sitio para Hind III de pBS16. Un plásmido que contenía el inserto en la orientación deseada produjo un fragmento de 3,53 kb y 4,41 kb al ser digerido con Kpn I, y este plásmido fue llamado pCST2. El fragmento Xmn I/Xba I de pML1-SF2 (descrito anteriormente) fue ligado en los sitios para Sma I/Xba I de pCST2 para producir el vector pST11.

Transformación de cultivos de embriones de soja somáticos y regeneración de sojas

Cultivos en suspensión embriogénica de soja fueron mantenidos en 35 ml de medios líquidos (SB55 o SBP6) sobre un sacudidor rotativo a 150 rpm y a 28ºC con luces fluorescentes y de incandescencia mixtas en un programa de 16:8 h durante el día/durante la noche. Los cultivos fueron subcultivados cada cuatro semanas inoculando aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de medio líquido.

Los cultivos en suspensión embriogénica de soja fueron transformados con pCS3FdST1R por el método de bombardeo con cañón de bombardeo con partículas (véase Kline et al. (1987) Nature (Londres) 327:70). Fue usado para estas transformaciones un aparato DuPont Biolistic PDS1000/HE (modificación para helio).

A 50 ml de una suspensión de 60 mg/ml de partículas de oro de 1 mm le fueron añadidos (en orden) 5 ul de DNA (1 ug/ul), 20 ul de espermidina (0,1M) y 50 ul de CaCl_{2} (2,5M). La preparación de partículas fue agitada por espacio de 3 min. y fue centrifugada en una microcentrífuga por espacio de 10 seg., y fue retirado el supernatante. Las partículas recubiertas con DNA fueron entonces lavadas una vez en 400 ul de etanol al 70% y fueron puestas nuevamente en suspensión en 40 ul de etanol anhidro. La suspensión de DNA y partículas fue sonicada tres veces por espacio de 1 seg. cada vez. Cinco ul de las partículas de oro recubiertas con DNA fueron entonces cargados sobre cada disco macroportador.

Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de cuatro semanas fueron puestos en una cápsula de Petri vacía de 60x15 mm, y el líquido residual fue retirado del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación fueron normalmente bombardeadas aproximadamente 5-10 placas de tejido. La presión de rotura de membrana fue ajustada a 100 psi (psi = libras/pulgada^{2}), y la cámara fue evacuada hasta haber quedado establecido en la misma un vacío de 28 pulgadas de columna de mercurio. El tejido fue colocado a una distancia de aproximadamente 3,5 pulgadas de la pantalla de retención, y fue bombardeado tres veces. A continuación del bombardeo, el tejido fue puesto de nuevo en líquido y cultivado como se ha descrito anteriormente.

A los once días del bombardeo, el medio líquido fue sustituido por SB55 sin usar, que contenía 50 mg/ml de higromicina. El medio selectivo fue renovado semanalmente. A las siete semanas del bombardeo, se observó que de agrupaciones embriogénicas necróticas no transformadas crecía tejido verde transformado. El tejido verde aislado fue retirado e inoculado al interior de matraces individuales para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénica transformados propagados clonalmente. Así, cada nueva línea fue tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones pueden ser entonces mantenidas como suspensiones de embriones agrupados en una etapa de desarrollo inmaduro mediante subcultivo, o bien pueden ser regeneradas para ser transformadas en plantas íntegras mediante maduración y germinación de los embriones somáticos individuales.

Las agrupaciones embriogénicas transformadas fueron retiradas del cultivo en líquido y fueron puestas sobre un medio de agar sólido (SB103) que no contenía hormonas ni antibióticos. Los embriones fueron cultivados por espacio de ocho semanas a 26ºC con luces fluorescentes y de incandescencia mixtas en un programa de 16:8 h durante el día/durante la noche. Durante este período, embriones individuales fueron retirados de las agrupaciones y fueron analizados en varias etapas del desarrollo embrionario. Después de ocho semanas, los embriones somáticos llegaron a ser adecuados para la germinación. Para la germinación, embriones de ocho semanas fueron retirados del medio de maduración y fueron secados en cápsulas de Petri vacías por espacio de 1 a 5 días. Los embriones secados fueron entonces plantados en medio SB71-1, donde se les dejó germinar bajo las mismas condiciones de iluminación y germinación anteriormente descritas. Los embriones germinados fueron transferidos a terreno estéril y fueron cultivados hasta la madurez para la recolección de las semillas.

TABLA 10

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ \+ Solución concentrada de Vitamina B5\cr  Medios: \+ \+ 10 g
m-inositol\cr  de SB55 y SBP6 (g/l): \+ \+ 100 mg
ácido nicotinico\cr  \+ \+ 100 mg piridoxina HCl\cr  Sulfato  de MS
100X S.c. \+ \+ 1 g tiamina\cr  MgSO _{4}\cdot 7H _{2} O 37.0 \+ \+
SB55 (por Litro)\cr  MnSO _{4}\cdot H _{2} O 1.69 \+ \+ 10 ml de
cada s.c. MS\cr  ZnSO _{4}\cdot 7H _{2} O 0.86 \+ \+ 1 ml de s.c. de
vitamina B5\cr  CuSO _{4}\cdot 5H _{2} O 0.0025 \+ \+ 0.8 g
NH _{4} NO _{3} \cr  Halogenuros de MS 100X S.c. \+ \+ 3.033 g
KNO _{3} \cr  CaC1 _{2}  \cdot 2H _{2} O 44.0 \+ \+ 1 mL
2,4-D (lOmg/mL stock)\cr  KI 0.083 \+ \+ 60 g
sucrosa\cr  CoC1 _{2}\cdot 6H _{2} O 0.00125 \+ \+ 0.667 g
asparaguina\cr  KH _{2} PO _{4}  17.0 \+ \+ pH 5.7\cr 
H _{3} BO _{3}\cdot 0.62 \+ \+ For SBP6- sustituto 0.5 mL\cr 
Na _{2} MoO _{4}\cdot 2H _{2} O 0.025 \+ \+ 2,4-D\cr
 MS FeEDTA 100X Stock \+ \+ SB103 (por litro)\cr  Na _{2} EDTA 3.724
\+ \+ Sales de MS\cr  FeSO _{4}\cdot 7H _{2} O 2.784 \+ \+ 6% de
maltosa\cr  \+ \+ 750 mg MgCl _{2} \cr  \+ \+ 0.2% Gelrite\cr  \+ \+
pH 5.7\cr  \+ \+ SB71-1 (por litro)\cr  \+ \+ sales
de B5\cr  \+ \+ lml s.c de vitamina B5\cr  \+ \+ 3% sucrosa\cr  \+
\+ 750mg MgCl _{2} \cr  \+ \+ 0.2% gelrite\cr  \+ \+ pH
5.7\cr}

Análisis de embriones y semillas de glycine max transgénica que contienen una delta-15 desaturasa antisentido: demostración de que el fenotipo de embriones somáticos de soja transgénica es predictivo del fenotipo de semillas derivadas de plantas regeneradas a partir de esos embriones

Mientras se encuentran en el estado embrionario globular en cultivo en líquido como se ha descrito anteriormente, los embriones somáticos de soja contienen muy pequeñas cantidades del triacilglicerol o de las proteínas de almacenamiento que son típicas de los embriones cigóticos de soja en maduración. En esta etapa del desarrollo, la relación de triacilglicérido total a lípido polar total (fosfolípidos y glicolípido) es de aproximadamente 1:4, como es típico de los embriones cigóticos de soja en la etapa de desarrollo a partir de la cual fue iniciado el cultivo de embriones somáticos. Asimismo en la etapa globular, están prácticamente ausentes los mRNAs para las proteínas seminales prominentes (subunidad alfa' de beta-conglicinina, Inhibidor 3 de Tripsina de Kunitz y Lectina de Semilla de Soja). Al haber sido efectuada la transferencia a medios exentos de hormonas para permitir la diferenciación al estado de embrión somático en maduración como se ha descrito anteriormente, el triacilglicerol deviene la clase de lípido más abundante. Asimismo, los mRNAs para la subunidad alfa' de beta-conglicinina, el Inhibidor 3 de Tripsina de Kunitz y la Lectina de Semilla de Soja devienen mensajes muy abundantes en la población de mRNA total. A estos respectos, el sistema del embrión somático de soja se comporta de manera muy similar a como se comportan los embriones cigóticos de soja en maduración in vivo, y es por consiguiente un sistema que constituye un buen y rápido modelo para analizar los efectos fenotípicos de modificar la expresión de genes en la ruta de la biosíntesis de ácidos grasos. Además, el sistema modelo es predictivo de la composición de ácidos grasos de las semillas de las plantas derivadas de embriones transgénicos. Los embriones globulares en cultivo en líquido transformados con un vector que contenía una delta-15 desaturasa microsomal de soja, en una orientación inversa y bajo el control del promotor (pCS3FdST 1R) de conglicinina de soja, dieron lugar a embriones maduros con un reducido contenido de 18:3 (WO 9311245). Los de una serie de embriones de la línea A2872 (tejido de control transformado con pCST) y de las líneas 299/1/3, 299/15/1, 303/7/1, 306/3/1, 306/4/3, 306/4/5 (línea 2872 transformada con plásmido pCS3FdST1R) fueron analizados para determinar el contenido de ácidos grasos. El análisis de ácidos grasos fue efectuado como se describe en la WO 9311245 usando embriones individuales como fuente de tejido. Embriones somáticos maduros de cada una de estas líneas fueron también regenerados siendo convertidos en sojas mediante transferencia a medio de regeneración como se ha descrito anteriormente. Las de una serie de semillas tomadas de plantas regeneradas a partir de estas líneas embrionarias fueron analizadas para determinar su contenido de ácidos grasos. La composición relativa de ácidos grasos de los embriones tomados de tejido transformado con pCS3FdST1R fue comparada con la composición relativa de ácidos grasos de semillas tomadas de plantas derivadas de embriones transformados con pCS3FdST1R. También las composiciones relativas de ácidos grasos de embriones y semillas transformados con pCS3FdST1R fueron comparadas con tejido de control, transformado con pCST. En todos los casos en los que se observó un reducido contenido de 18:3 en una línea embrionaria transgénica, en comparación con el control, fue también observado un reducido contenido de 18:3 en las semillas segregantes de plantas derivadas de esa línea, al ser comparadas con la semilla de control (Tabla 11).

TABLA 11 Delta-15 desaturasa antisentido: contenido relativo de 18:3 de los embriones y semillas de control (A2172) y de las líneas de soja transgénica (299-, 303-, 06-)

Línea de Soja	Embrión	Embrión	Semilla	Semilla
	% de promedio de 18:3	% más bajo de 18:3	% de promedio de 18:3	% más bajo de 18:3
A2872	12.1 (2.6)	8.5	8.9 (0.8)	8.0
(control)
299/1/3	5.6 (1.2)	4.5	4.3 (1.6)	2.5
299/15/1	8.9 (2.2)	5.2	2.5 (1.8)	1.4
303/7/1	7.3 (1.1)	5.9	4.9 (1.9)	2.8
306/3/1	7.0 (1.9)	5.3	2.4 (1.7)	1.3
306/4/3	8.5 (1.9)	6.4	4.5 (2.2)	2.7
306/4/5	7.6 (1.6)	5.6	4.6 (1.6)	2.7
*Las semillas que experimentaron segregación con fenotipo de tipo salvaje y sin una copia del transgén no
están incluidas en estos promedios. El número entre paréntesis es la desviación característica, n=10.

Por consiguiente, los Solicitantes llegan a la conclusión de que un fenotipo alterado de ácidos grasos poliinsaturados observado en una línea embrionaria somática madura transgénica es predictivo de una composición alterada de ácidos grasos de las semillas de las plantas derivadas de esa línea.

Análisis de embriones de glycine max transgénica que contienen un constructo de delta-12 desaturasa microsomal antisentido

Los vectores pBS13, pBS14 y pST11 contienen el cDNA de delta-12 desaturasa microsomal de soja, en la orientación antisentido, bajo el control del Inhibidor 3 de Tripsina de Kunitz (Kti3) de soja, faseolina de Phaseolus, y promotores de beta-conglicinina de soja como se ha descrito anteriormente. Los embriones globulares de cultivo en líquido transformados con vectores pBS13, pBS14 y pST11 dieron lugar a líneas embrionarias maduras como se ha descrito anteriormente. El análisis de ácidos grasos fue llevado a cabo como se describe en la WO 9311245 usando embriones maduros individuales como fuente de tejido. Los de una serie de embriones de la línea A2872 (tejido de control transformado con pCST) y de la línea A2872 transformada con vectores pBS13, pBS14 y pST11 fueron analizados para determinar el contenido de ácidos grasos. Las de aproximadamente un 30% de las líneas transformadas presentaban un incrementado contenido de 18:1 al ser comparadas con las líneas de control transformadas con pCST como se ha descrito anteriormente, demostrando que en estas líneas había sido inhibida la delta-12 desaturasa. Las restantes líneas transformadas presentaban composiciones relativas de ácidos grasos similares a las de la línea de control. El contenido relativo de 18:1 de las líneas que presentaban un incrementado contenido de 18:1 era tan alto como de un 50%, en comparación con un máximo de un 12,5% en las líneas embrionarias de control. El contenido de promedio de 18:1 de las líneas embrionarias que presentaban un incrementado contenido de 18:1 era de aproximadamente un 35% (Tabla 11). En todas las líneas que presentaban un incrementado contenido de 18:1 había una disminución proporcional del contenido relativo de 18:2 (Tabla 12). Las proporciones relativas de los otros ácidos grasos principales (16:0, 18:0 y 18:3) eran similares a las del control.

TABLA 12 Resumen del experimento en el cual embriones de soja fueron transformados con plásmidos que contenían un cDNA de delta-12 desaturasa microsomal antisentido de soja

		Nº de líneas
	Nº de líneas vectoriales	con alto contenido	con el más alto contenido	(%) de promedio
		de 18:1	de 18:1	de 18:1
pCST	- - -	- - -	12.5	10.5
(control)
pBS13	11	4	53.5	35.9
pBS14	11	2	48.7	32.6
pST11	11	3	50.1	35.9

En la Tabla 12 el contenido de promedio de 18:1 de los organismos transgénicos es el promedio de todos los embriones transformados con un determinado vector cuyo contenido relativo de 18:1 es mayor que dos desviaciones características con respecto al más alto valor del control (12,5). El promedio del control es el promedio de diez embriones A2872 (desviación característica = 1,2). Los datos de la Tabla 12 están sacados de la siguiente Tabla 13.

TABLA 13 Contenidos relativos de ácidos grasos de líneas embrionarias transformadas con plásmidos que contienen un cDNA de delta-12 desaturasa antisentido de soja

Línea embrionaria	Contenido porcentual relativo de ácidos grasos
A2872 (control)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	11.7	3.2	11.7	52.7	16.1
2	16.4	4.0	10.8	47.1	19.3
3	17.1	3.4	8.3	48.3	20.6
4	15.3	2.7	9.4	51.1	19.0
5	15.2	3.6	10.8	51.0	17.5
6	18.6	3.9	10.9	45.8	18.1

TABLA 13 (continuación)

Línea embrionaria	Contenido porcentual relativo de ácidos grasos
A2872 (control)
7	4.6	3.4	12.5	52.3	16.4
8	14.2	3.5	11.2	53.9	16.7
9	15.2	3.2	9.8	49.5	16.1
10	19.0	3.8	9.6	47.4	19.0

G335/4/197 (pBS13)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	12.2	3.3	42.0	23.0	17.4
2	12.4	2.7	22.4	39.0	21.9
3	12.0	3.2	42.0	23.2	18.4

G335/4/221 (pBS13)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	12.2	2.7	30.4	36.0	17.9
2	11.5	2.4	14.3	53.4-	17.6
3	13.0	2.6	15.2	47.4	19.9
4	12.0	2.6	27.4	37.9	19.1
5	11.7	2.7	25.1	42.3	15.6
6	11.7	3.4	21.6	44.3	17.8
7	12.0	2.5	11.3	53.6	20.0
8	12.0	2.5	20.8	44.1	19.5
9	11.7	2.6	25.3	39.6	18.3

G335/8/174 (pBS13)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	14.1	2.1	30.3	32.1	20.3
2	14.7	2.5	5.9	40.6	34.8
3	14.3	2.4	7.3	45.2	29.8

TABLA 13 (continuación)

Línea embrionaria	Contenido porcentual relativo de ácidos grasos
G335/8/202 (pBS13)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	11.7	1.5	30.1	32.4	23.3
2	11.4	2.3	48.5	20.6	16.1
3	12.9	2.3	46.6	17.1	19.5
4	12.7	2.6	32.0	31.1	20.5
5	12.9	1.9	41.7	23.5	18.9
6	12.3	2.6	40.1	25.6	17.9
7	11.3	2.4	53.5	16.6	14.5
8	11.4	2.5	15.5	21.7	17.8
9	10.2	2.0	45.4	23.2	18.5
10	12.8	2.2	43.2	23.5	16.9

G335/6/42 (pBS14)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	13.7	2.4	38.6	28.2	15.6
2	12.6	2.3	37.6	28.8	17.2
3	11.7	3.0	48.7	21.1	14.6

G335/6/104 (pBS14)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	13.8	2.5	30.5	35.4	16.0
2	12.3	2.3	14.6	53.2	16.4
3	12.7	2.6	27.1	36.6	20.0
4	12.6	2.2	32.1	34.9	17.4
5	12.7	2.6	23.2	41.2	19.3
6	12.6	2.2	11.7	52.5	20.1
7	13.3	2.1	23.3	41.2	18.4

TABLA 13 (continuación)

Línea embrionaria	Contenido porcentual relativo de ácidos grasos
G335/1/25 (pST11)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	13.7	2.8	50.7	17.5	12.1
2	14.5	3.0	41.8	23.5	15.0
3	13.9	2.9	49.1	16.8	13.6
4	12.3	2.8	47.5	19.3	14.8

G335/2/7/1 (pST11)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	15.5	4.3	21.8	38.0	17.5
2	17.8	4.1	22.0	39.5	14.0
3	15.2	3.0	20.5	42.2	16.5

G335/2/118 (pST11)
#	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
1	14.1	2.7	44.7	22.6	14.0
2	15.8	2.8	37.7	26.9	14.8
3	17.3	3.4	23.3	37.9	16.0

N.B. Todos los otros embriones transformados (24 líneas) tenían unos perfiles de ácidos grasos similares a los del control.

Una de estas líneas embrionarias, la G335/1/25, tenía un contenido de promedio de 18:2 de menos de un 20% y un contenido de promedio de 18:1 de más de un 45% (y que llegaba a ser tan alto como el de un 53,5%). Sobre la base de los datos de la tabla, los Solicitantes esperan que las semillas derivadas de plantas regeneradas a partir de tales líneas tendrán un incremento equivalente o mayor del contenido de 18:1 y una disminución equivalente o mayor del contenido de 18:2.

Ejemplo Expresión de delta-12 desaturasa microsomal en canola Construcción de vectores para la transformación de brassica napus para una expresión reducida de delta-12 desaturasas microsomales en semillas de canola en desarrollo

Una cola de poli A prolongada fue retirada de la secuencia de delta-12 desaturasa de canolacontenida en plásmido PCF2-165D, y adicionales sitios de restricción para la clonación fueron introducidos como se indica a continuación. Fue sintetizado un cebador de la reacción en cadena de la polimerasa correspondiente a las bases 354 a 371 de la ID SEC Nº:3. El segundo cebador de la reacción en cadena de la polimerasa fue sintetizado como el complemento para las bases 1253 a 1231 con 15 bases adicionales (GCAGATATCGCGGCC) añadidas al extremo 5'. Las bases adicionales codifican tanto un sitio para EcoRV como un sitio para NotI. El pCF2-165D fue usado como molde para amplificación por reacción en cadena de la polimerasa usando estos cebadores. El producto de 914 pares de bases de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa fue dirigido con EcoRV y PflMI para dar un producto de 812 pares de bases correspondiente a las bases 450 a 1253 de pCF2-165D con el sitio para NotI añadido.

El pCF2-165D fue digerido con PstI, y al saliente producido por la digestión con PstI se le hizo romo con fragmento de Klenow, y entonces se efectuó digestión con PflMI. El fragmento de 3,5 kb correspondiente a pBluescript junto con las 450 bases del lado 5' del cDNA de Fad2 de canola fue purificado en gel y ligado al fragmento de 812 pares de bases anteriormente descrito. El producto de la ligación fue amplificado mediante transformación de E. coli y aislamiento del DNA del plásmido. El sitio para EcoRI que quedaba en la unión de clonación entre pBluescript y el cDNA de Fad2 de canola fue destruido por digestión, enromado y religación. El plásmido recuperado fue llamado pM2CFd2.

El pM2CFd2 fue digerido con EcoRV y SmaI para retirar el inserto de Fad2 como fragmento de extremos romos. El fragmento fue purificado en gel y clonado en el sitio para SmaI de pBC (Stratagene, La Jolla, CA). Un plásmido con el sitio para NotI introducido por reacción en cadena de la polimerasa orientada en el sentido de alejarse del existente sitio para NotI en pBC fue identificado mediante digestión con NotI y fraccionamiento en gel de los productos de digestión. El constructo resultante tenía entonces sitios para NotI en ambos extremos del fragmento de cDNA de Fad2 de canola, y fue llamado pM3CFd2.

Vectores para la transformación de las construcciones de delta-12 desaturasa citoplásmica antisentido bajo el control de los promotores de \beta-conglicinina, inhibidor III de tripsina de Kunitz, napina y faseolina en plantas usando Agrobacterium tumefaciens fueron producidos a base de construir un sistema de vector de plásmido Ti binario (Bevan, (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8720). Un vector de partida para el sistema, (pZS199), está basado en un vector que contiene: (1) el gen quimérico nopalina sintasa/neomicina fosfotransferasa como marcador seleccionable para células vegetales transformadas (Brevan et al. (1984) Nature 304: 184-186), (2) los bordes izquierdo y derecho del T-DNA del plásmido Ti (Brevan et al. (1984) Nucl. Acids. Res. 12:8711-8720), (3) el segmento a-complementador lacZ de E. coli (Vieria y Messing (1982) Gene 19:259-267) con sitios únicos para endonucleasas de restricción para Eco RI, Kpn I, Bam HI y Sal I, (4) el origen de replicación bacteriana del plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. (1984) Plasmid 11:206-220) y (5) el gen bacteriano de neomicina fosfotransferasa de Tn5 (Berg et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72:3628-3632) como marcador seleccionable para A. tumefaciens transformada. El promotor de nopalina sintasa en el marcador seleccionable vegetal fue sustituido por el promotor 35S (Odell et al. (1985) Nature, 313:810- 813) mediante una estrategia de digestión con endonucleasas de restricción y ligación estándar. El promotor 35S es necesario para una eficaz transformación de Brassica napus como se describe más adelante. Fue construido un segundo vector (pZS212) a base de invertir el orden de los sitios de restricción en la región de clonación en sitio único de pZS199.

Los casetes de expresión del promotor de napina de canola fueron construidos de la forma siguiente: Fueron sintetizados diez cebadores oligonucleotídicos sobre la base de la secuencia de nucleótidos del clon lambda de napina CGN1-2 publicado en la Solicitud de Patente Europea EP 255378. Las secuencias oligonucleotídicas eran las siguientes:

\bullet BR42 y BR43 correspondientes a las bases 1132 a 1156 (BR42) y al complemento de las bases 2248 a 2271 (BR43) de la secuencia ilustrada en la Figura 2 de la EP 255378.

\bullet BR45 y BR46 correspondientes a las bases 1150 a 1170 (BR46) y al complemento de las bases 2120 a 2155 (BR45) de la secuencia ilustrada en la Figura 2 de la EP 255378. Adicionalmente, la BR46 tenía bases correspondientes a un sitio para Sal I (5'-GTCGAC-3') y unas pocas bases adicionales (5'-TCAGGCCT-3') en su extremo 5', y la BR45 tenía basescorrespondientes a un sitio para Bgl II (5'-AGATCT-3') y dos bases adicionales (5'-CT-3') en el extremo 5' del cebador.

\bullet BR47 y BR48 correspondientes a las bases 2705 a 2723 (BR47) y a las bases 2643 a 2666 (BR48) de la secuencia ilustrada en la Figura 2 de la EP 255378. Adicionalmente, la BR47 tenía dos bases adicionales (5'-CT-3') en el extremo 5' del cebador seguidas por bases correspondientes a un sitio para Bgl II (5'-AGATCT-3') seguidas por unas pocas bases adicionales (5'-TCAGGCCT-3').

\bullet BR49 y BR50 correspondientes al complemento de las bases 3877 a 3897 (BR49) y al complemento de las bases 3985 a 3919 (BR50) de la secuencia ilustrada en la Figura 2 de la EP 255378. Adicionalmente, la BR49 tenía bases correspondientes a un sitio para Sal I (5'-GTCGAC-3') y unas pocas bases adicionales (5'-TCAGGCCT-3') en su extremo 5'.

\bullet BR57 y BR58 correspondientes a las bases 3875 a 3888 (BR57) y a las bases 2700 a 2714 (BR58) de la secuencia ilustrada en la Figura 2 de la EP 255378. Adicionalmente, el extremo 5' de BR57 tenía algunas bases extra (5'CCATGG-3') seguidas por bases correspondientes a un sitio para Sac I (5'-GAGCTC-3') seguidas por más bases adicionales (5'-GTCGACGAGG-3'). El extremo 5' de BR58 tenía bases adicionales (5'-GAGCTC-3') seguidas por bases correspondientes a un sitio para NcoI (5'-CCATGG-3') seguidas por bases adicionales (5'-AGATCTGGTACC-3').

\bullet BR61 y BR62 correspondientes a las bases 1846 a 1865 (BR61) y a las bases 2094 a 2114 (BR62) de la secuencia ilustrada en la Figura 2 de la EP 255378. Adicionalmente, el extremo 5' de BR62 tenía bases adicionales (5'-GACA-3') seguidas por bases correspondientes a un sitio para Bgl II (5'-AGATCT-3') seguidas por unas pocas bases adicionales (5'-GCGGCCGC-3').

DNA genómico de la variedad 'Hyola401' (Zeneca Seeds) de canola fue usado como molde para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de las regiones promotora de napina y de terminación de napina. El promotor fue primeramente amplificado usando cebadores BR42 y BR43, y reamplificado usando cebadores BR45 y BR46. El plásmido pIMC01 fue obtenido mediante digestión del producto de la reacción en cadena de la polimerasa que era un promotor de 1,0 kb con SalI/BglII y ligación en pBluescript SK^{+} (Stratagene) digerido con SalI/BamHI. La región de terminación de napina fue amplificada usando cebadores BR48 y BR50 y reamplificada usando cebadores BR47 y BR49. El plásmido pIMC06 fue obtenido mediante digestión del producto de la reacción en cadena de la polimerasa que es un terminador de 1,2 kb con SalI/BglII y ligación en SalI/BglII digerido con pSP72 (Promega). Usando pIMC06 como molde, la región terminadora fue reamplificada por reacción en cadena de la polimerasa usando cebador BR57 y cebador BR58. El plásmido pIMC101 que contenía tanto el terminador como el promotor de napina fue generado mediante digestión del producto de la reacción en cadena de la polimerasa con CacI/NcoI y ligación en pIMC01 digerido con SacI/NcoI. El plásmido pIMC101 contiene un casete de expresión de napina de 2,2 kb que incluye secuencias completas no traducidas del lado 5' y del lado 3' y un sitio para NcoI introducido en el ATG de iniciación de la traducción. El cebador BR61 y el cebador BR62 fueron usados para amplificar por reacción en cadena de la polimerasa un fragmento de \sim270 pares de bases desde el extremo 3' del promotor de napina. El plásmido pIMC401 fue obtenido mediante digestión del producto resultante de la reacción en cadena de la polimerasa con EcoRI/BglII y ligación en pIMC101 digerido con EcoRI/BglII. El plásmido pIMC401 contiene un casete de expresión de napina de 2,2 kb que carece de la secuencia no traducida del lado 5' de napina e incluye un sitio para NotI al comienzo de la transcripción.

Para construir el vector de expresión antisentido, pM3CFd2 fue digerido con NotI al igual como lo fue pIMC401. La delta-12 desaturasa que contenía el inserto del producto de digestión de pM3CFd2 fue aislada en gel y ligada al pIMC401 digerido con NotI y tratado con fosfatasa. Un aislado en el cual la delta-12 desaturasa estaba en orientación antisentido con respecto al promotor de napina fue seleccionado mediante digestión con XhoI para obtener el plásmido pNCFd2R. El pNCFd2R fue digerido con SalI, tratado con fosfatasa y ligado a pZS212 que había sido abierto mediante el mismo tratamiento. Un plásmido con la deseada orientación de la unidad de transcripción antisentido de napina:delta-12 desaturasa introducida en relación con el marcador seleccionable fue elegido mediante digestión con PvuI, y al vector binario resultante le fue dado el nombre de pZNCFd2R.

El plásmido pML70 (descrito en el anterior Ejemplo 6) fue digerido con NcoI, fue enromado y fue entonces digerido con KpnI. El plásmido pM2CFd fue digerido con KpnI y SmaI, y el fragmento aislado fue ligado al pML70 abierto para obtener el casete de expresión antisentido pMKCFd2R. La secuencia de promotor:delta-12 desaturasa:terminador fue retirada del pMKCFd2R mediante digestión con BamHI y ligada a pZS199 que había sido digerido con BamHI y tratado con fosfatasa. La deseada orientación en relación con el marcador seleccionable fue determinada mediante digestión con XhoI y PflMI para obtener el vector de expresión pZKCFd2R.

El vector de expresión que contenía el promotor de \beta-conglicinina fue construido mediante digestión de pM2CFd2 con SmaI y EcoRV y ligación a pML109A cortado con SmaI. Una aislado con la orientación antisentido fue identificado mediante digestión con XhoI y PflmI, y la unidad de transcripción fue aislada mediante digestión con SalI y EcoRI. El fragmento SalI-EcoRI aislado fue ligado a pZS199 digerido con EcoRI-SalI para obtener pCCFd2R.

El vector de expresión que contiene el promotor de faseolina fue obtenido utilizando el mismo procedimiento con pCW108 como vector de iniciación que contiene el promotor y con pZS212 como parte binaria del vector para obtener pZPhCFd2R.

Transformación de brassica napus mediada por agrobacterium

Los vectores binarios pZNCFd2R, pZCCFd2R, pZPhCFd2R y pZNCFd2R fueron transferidos mediante un método de congelación y descongelación (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187) a la cepa LBA4404/pAL4404 de Agrobacterium (Hockema et al. (1983), Nature 303:179-180).

La variedad ``Westar'' obtenida por selección de Brassica napus fue transformada mediante cocultivo de pedazos de plantas de semillero con la cepa LBA4404 de Agrobacterium tufemaciens desarmada que llevaba el apropiado vector binario.

Las semillas de B. napus fueron esterilizadas mediante agitación en Chlorox al 10% y SDS al 0,1% por espacio de treinta minutos, y fueron a continuación enjuagadas a fondo con agua destilada estéril. Se hizo que las semillas germinasen en medio estéril que contenía CaCl_{2} 30mM y agar al 1,5%, y fueron cultivadas por espacio de seis días en la oscuridad a 24ºC.

Cultivos en líquido de Agrobacterium para transformación vegetal fueron cultivados durante la noche a 28ºC en medio A Mínimo que contenía 100 mg/l de canamicina. Las células bacterianas fueron pelletizadas por centrifugación y fueron puestas nuevamente en suspensión a una concentración de 10^{8} células/ml en medio líquido Orgánico Mínimo de Murashige y Skoog que contenía 100 \muM de acetosiringona.

Los hipocotilos de las B. napus de semillero fueron cortados en segmentos de 5 mm que fueron puestos inmediatamente en la suspensión bacteriana. Después de 30 min., los pedazos de hipocotilo fueron retirados de la suspensión bacteriana y puestos en medio de cultivo de callo BC-35 que contenía 100 \muM de acetosiringona. El tejido vegetal y las Agrobacterias fueron cocultivados por espacio de tres días a 24ºC en luz débil.

Se puso fin al cocultivo transfiriendo los pedazos de hipocotilo a medio de cultivo de callo BC-35 que contenía 200 mg/l de carbenicilina para matar las Agrobacterias y 25 mg/l de canamicina para efectuar la pertinente selección de cara al crecimiento de las células vegetales transformadas. Los pedazos de plantas de semillero fueron incubados en este medio por espacio de tres semanas a 28ºC bajo luz continua.

Después de cuatro semanas, los segmentos fueron transferidos a medio de regeneración BS-48 que contenía 200 mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de canamicina. El tejido vegetal fue subcultivado cada dos semanas en nuevo medio de regeneración selectiva y bajo las mismas condiciones de cultivo descritas para el medio de cultivo de callo. Los callos putativamente transformados crecieron rápidamente sobre el medio de regeneración, y al alcanzar los callos un diámetro de aproximadamente 2 mm los mismos fueron retirados de los pedazos de hipocotilo y fueron puestos sobre el mismo medio que carecía de canamicina.

Empezaron a aparecer vástagos a las varias semanas de haber sido efectuada la transferencia al medio de regeneración BS-48. En cuanto los vástagos formaron tallos discernibles, los mismos fueron extirpados de los callos, transferidos a un medio de alargamiento MSV-1A y llevados a un fotoperíodo de 16:8 h a 24ºC.

Una vez que los vástagos habían experimentado un alargamiento de varios entrenudos, los mismos fueron cortados sobre la superficie de agar, y los extremos cortados fueron sumergidos en Rootone. Los vástagos tratados fueron plantados directamente en medio de cultivo en maceta sin tierra Metro-Mix 350. Las macetas fueron cubiertas con bolsas de plástico que fueron retiradas cuando las plantas estaban en claro crecimiento, lo cual tuvo lugar a los diez días aproximadamente.

Las plantas fueron cultivadas bajo un fotoperíodo de 16:8 h, con una temperatura diurna de 23ºC y una temperatura nocturna de 17ºC. Cuando comenzó a alargarse el tallo primario en floración, el mismo fue cubierto con una bolsa de malla de retención del polen para impedir el cruce exogámico. La autopolinización fue facilitada sacudiendo las plantas varias veces cada día. Hasta la fecha han sido obtenidas cincuenta y una plantas de transformaciones usando tanto pZCCFd2R como pZPhCFd2R, 40 plantas han sido obtenidas de pZKCFd2R, y 26 plantas han sido obtenidas de pZNCFd2R.

Medio A mínimo para el cultivo bacteriano

Disolver en agua destilada:

10,5 gramos de fosfato potásico, dibásico

4,5 gramos de fosfato potásico, monobásico

1,0 gramo de sulfato amónico

0,5 gramos de citrato sódico, dihidrato

Llegar hasta 979 ml con agua destilada

Autoclavear

Añadir 20 ml de sucrosa al 10% esterilizada en filtro

Añadir 1 ml de MgSO_{4} 1M esterilizado en filtro

Medio BC-35 para el cultivo de callo de brassica

Por litro:

Medio Orgánico Mínimo de Murashige y Skoog (sales de MS, 100 mg/l de i-inositol, 0,4 mg/l de tiamina; GIBCO #510-3118)

30 gramos de sucrosa

18 gramos de manitol

0,5 mg/l de 2,4-D

0,3 mg/l de cinetina

0,6% de agarosa

pH 5,8

Medio BS-48 para la regeneración de brassica

Medio Orgánico Mínimo de Murashige y Skoog

Vitaminas B5 Gamborg (SIGMA #1019)

10 gramos de glucosa

250 mg de xilosa

600 mg de MES

0,4% de agarosa

pH 5,7

Esterilizar en filtro y añadir después de autoclavear:

2,0 mg/l de ceatina

0,1 mg/l de IAA

Medio MSV-1A para el alargamiento de vástagos de brassica

Medio Orgánico Mínimo de Murashige y Skoog

Vitaminas B5 Gamborg

10 gramos de sucrosa

0,6% de agarosa

pH 5,8

Análisis de semillas de brassica napus transgénica que contienen un constructo de delta-12 desaturasa microsomal antisentido

Cincuenta y una plantas fueron obtenidas de la transformación tanto con pZPhCFd2R como con pZCCFd2R, 40 fueron obtenidas de pZKCFd2R, y 26 fueron obtenidas de pZNCFd2R. Los niveles relativos de oleato (18:1), linoleato (18:2) y linolinato (18:3) varían durante el desarrollo, por lo que una fiable determinación del fenotipo de ácidos grasos seminales es idealmente obtenida a partir de semilla que ha experimentado una maduración y un secado normales. Relativamente pocas plantas transformadas han llegado a la madurez, si bien las muestras de semillas fueron tomadas de plantas que habían estado transferidas a macetas por espacio de al menos 80 días y tenían vainas que habían amarilleado y contenían semillas cuyos revestimientos tenían pigmentación negra. Las plantas fueron elegidas para el análisis inicial sobre la base del tipo de promotor, de la presencia y del número de copias del gen antisentido de delta-12 desaturasa insertado y de la fertilidad de la planta.

El análisis de ácidos grasos fue efectuado en semillas individuales de plantas transformadas y de control, o en 40 mg de semilla colectiva de plantas individuales como se ha descrito en el Ejemplo 6. El análisis Southern para la detección de la presencia de genes antisentido de delta-12 desaturasa de canola fue efectuado en DNA obtenido de las hojas de plantas transformadas. El DNA fue digerido ya sea para liberar el fragmento de promotor:delta-12 desaturasa del vector de transformación o bien para cortar fuera de la región codificante del gen antisentido de delta-12 desaturasa pero dentro de los bordes izquierdo y derecho del T-DNA del vector.

TABLA 14 Perfiles relativos de ácidos grasos de semillas de brassica napus transformadas con genes antisentido de delta-12 desaturasa microsomal y de control

				% de ácidos grasos totales
Nº de planta	promotor	Nº de copias	Edad*	16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
A		S
Westar	control	ninguna	82	4.6	1.2	64.6	20.9	6.6
151-22	faseolina	>8	82	4.4	1.0	76.6	10.0	6.2
158-8	napina	1	83	3.5	1.5	81.3	6.3	4.6
westar	control	ninguna	106	4.1	1.7	64.4	19.9	7.1
151-22	faseolina	>8	106	4.2	1.9	74.4	9.9	6.3
151-127	faseolina	0	106	4.1	2.3	68.4	16.9	5.2
151-268	faseolina	1	106	4.2	2.7	73.3	12.0	4.2
153-83	conglicinina	2	106	4.1	1.6	68.5	16.7	6.3
*Fecha del muestreo de las semillas en días después de haber sido la planta transferida a terreno

El esperado fenotipo de ácidos grasos para la supresión antisentido de la delta-12 desaturasa es el de un reducido contenido relativo de 18:2 con un correspondiente incremento del contenido relativo de 18:1. Las plantas de los números 151-22 y 158-8 presentan ambas una considerable disminución del contenido de 18:2 de la semilla colectiva en comparación con el control Westar a los 83 días de la plantación. La planta 151-22 presenta también esta diferencia en la madurez en comparación con el control Westar o con la planta 151-127, que fue transformada con el gen marcador seleccionable pero no con el gen antisentido de delta-12 desaturasa.

Puesto que el análisis de ácidos grasos fue efectuado en semillas de la transformante primaria, la semilla individual debería presentar segregación con respecto a la presencia de la copia o de las copias del transgén. Los fenotipos que presentan segregación sirven de control interno para el efecto del gen antisentido de delta-12 desaturasa. Están indicados en la siguiente Tabla 15 los fenotipos de ácidos grasos relativos para 10 semillas Westar individuales, 10 semillas 151-22 individuales y 12 semillas 158-8 individuales.

TABLA 15 Perfiles de ácidos grasos relativos para semillas individuales de brassica napus de control y transformada presentando segregación genética con respecto a delta-12 desaturasa

Control Westar
16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
4.65	1.05	63.45	21.31	7.29
4.65	1.37	65.41	20.72	6.18
3.86	1.31	62.19	22.50	8.18
4-.46	1.41	66.81	19.40	5.63
4.76	1.30	61.90	22.39	7.65
4.59	1.10	64.77	20.62	6.56
4.61	1.16	68.66	18.20	5.07

TABLA 15 (continuación)

Control Westar
4.71	1.26	67.28	19.32	5.18
4.67	0.98	61.96	22.93	7.61
4.73	1.33	63.85	21.65	6.23

151-22
16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
4.56	1.08	73.40	12.40	7.60
4.25	1.20	77.90	10.00	5.40
4.40	1.00	76.90	10.10	5.90
4.40	0.94	77.40	9.40	6.10
4.50	1.00	73.60	11.30	7.90
4.60	0.98	75.40	10.50	6.50
4.49	0.96	76.70	9.90	6.00
4.20	1.10	77.20	9.70	5.50
4.20	1.00	80.00	7.90	4.90
4.50	1.00	78.00	8.80	5.80

158-8
16:0	18:0	18:1	18:2	18:3
3.62	1.67	84.45	3.60	3.73
3.46	1.64	85.56	3.02	3.36
3.48	1.61	83.64	4.43	4.21
3.53	1.40	83.80	4.41	4.36
3.48	1.39	83.66	4.35	4.44
3.80	1.50	68.17	16.57	7.56
3.41	1.40	83.76	4.38	4.40
3.49	1.29	82.77	5.16	4.60
3.77	1.39	69.47	16.40	6.54
3.44	1.36	83.86	4.49	4.27
3.48	1.38	83.15	4.91	4.53
3.55	1.92	83.69	4.20	3.70

El control Westar presenta comparativamente poca variación de semilla a semilla en cuanto al contenido de 18:1 o 18:2. Además, la relación de 18:3/18:2 se mantiene muy constante entre semillas, siendo de aproximadamente 0,35. La planta Nº 158-8 debería presentar una proporción de segregación de 1:2:1 o 1:3, puesto que por análisis Southern contiene un solo transgén. La proporción 1:2:1 indicaría un efecto del número de copias semidominante, mientras que la proporción de 1:3 indicaría una dominancia completa. Dos segregantes 158-8 de tipo salvaje están claras en la Tabla 15, mientras que las semillas restantes pueden ser las mismas, o las dos semillas que tienen más de un 84% de 18:1 pueden representar las transgénicas homocigóticas. En cualquier caso, los fenotipos de ácidos grasos de las semillas son como es de esperar para la efectiva supresión de delta-12 desaturasa en esta generación. Los fenotipos de ácidos grasos de las semillas de la planta 151-22 presentan variación de su contenido de 18:1 y 18:2, siendo el contenido de 18:1 superior al promedio del control, y siendo el contenido de 18:2 inferior. La segregación es aparentemente muy compleja, como sería de esperar en el caso de una planta transgénica de copias múltiples.

1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES PARA ÁCIDO GRASO

: DELTA-12 DESATURASAS MICROSOMALES Y ENZIMAS AFINES DE PLANTAS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: 1007 MARKET STREET

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(C): CIUDAD: WILMINGTON

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(D): ESTADO: DELAWARE

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): ZIP: 19898

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(v): FORMA INFORMATIZADA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: MacIntosh

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: Sistema MacIntosh 6.0

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO INFORMÁTICO: Patentin Release # 1.0, Versión # 1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: BB-1043-A

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: U.S. 07/977, 339

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-NOV-1992

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Morrissey, Bruce W.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE COLEGIADO: 330,663

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE ACTA/REFERENCIA: BB-1043-A

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO:(302) 992-4927

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX:(302) 892-7949

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TELEX: 835420

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 1372 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: p92103

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 93..1244

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:

1

2

202

203

201

200

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 383 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido***(C) TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:

4

5

501

500

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 1394 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Brassica napus

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pCF2-165D

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 99..1250

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:

6

600

7

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 383 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:

9

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 1462 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Glycine max

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pSF2-165K

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 108..1247

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:

11

12

1200

13

1300

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 379 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:6:

14

15

1500

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 1790 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pFad2#1

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 165..1328

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:7:

16

1601

1600

17

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 387 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:8:

19

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 673 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Ricinus communis

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pRF2-1C

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..673

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:9:

21

2100

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 224 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:10:

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 1369 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Ricinus communis

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pRF197c-42

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 184..1347

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:11:

23

24

2400

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 387 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:12:

26

27

2700

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:misc feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN:1..23

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto = ``oligonucleótido sintético''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:13:

\vskip1.000000\baselineskip

TGGGTATGCC AYGANTGYGG NCA

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 22 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..22

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto = ``oligonucleótido sintético''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:14:

\vskip1.000000\baselineskip

AAARTGRTGG CACRTGNGTR TC

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 2973 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON: pAG2-6

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intron

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 521..1654

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: intron

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 521..1654

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:15:

28

29

2900

30

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..23

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto = ``oligonucleótido sintético''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:16:

\vskip1.000000\baselineskip

GGGCATGTNG ARAANARRTG RTG

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº:17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TAMAÑO: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): HÉLICE: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDN

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..23

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto = ``oligonucleótido sintético''

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:17:

\vskip1.000000\baselineskip

GGGCATGTRC TRAAMARRTG RTG

\hfill

23

Claims

1. Fragmento de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, de forma tal que (I) dicho polipéptido codificado tiene una identidad de aminoácidos de un 50% o más con respecto al polipéptido codificado por las secuencias de las ID SEC Núms.: 1, 3, 5, 7, 9, 11 o 15, y (II) dicho polipéptido codificado es una enzima que es una delta-12 hidroxilasa o una delta-12 desaturasa microsomal, catalizando dicha enzima una reacción en las posiciones de carbono 6 y 7 numeradas a partir del extremo metílico de una cadena acil graso de 18 carbonos, correspondiendo las posiciones 6 y 7 a las posiciones de carbono 12 y 13 numeradas a partir del carbono carbonílico de una cadena acil graso de 18 carbonos.

2. El fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que la identidad de aminoácidos es de un 60% o más con respecto al polipéptido codificado por las secuencias de las ID SEC Núms.: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ó 15.

3. El fragmento de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en el que la identidad de ácidos nucleicos es de un 90% o más con respecto a las secuencias de las ID SEC Núms.: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ó 15.

4. El fragmento de ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho fragmento es aislado a partir de una especie vegetal oleaginosa.

5. Fragmento de ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una delta-12 ácido graso hidroxilasa.

6. Gen quimérico capaz de ocasionar niveles alterados de ácido ricinoleico en una célula vegetal transformada, comprendiendo dicho gen quimérico un fragmento de ácido nucleico de la reivindicación 5, estando dicho fragmento ligado operativamente a adecuadas secuencias reguladoras.

7. Gen quimérico capaz de ocasionar niveles alterados de ácidos grasos en una célula vegetal transformada, comprendiendo dicho gen quimérico un fragmento de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, estando dicho fragmento ligado operativamente a adecuadas secuencias reguladoras.

8. Método para preparar una planta transgénica que tiene niveles alterados de ácidos grasos, comprendiendo dicho método el paso de transferir a dicha planta un fragmento de ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un gen quimérico de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7.

9. Célula vegetal transformada que tiene niveles alterados de ácidos grasos, estando dicha célula vegetal transformada con un fragmento de ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o con un gen quimérico de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7.

10. Aceite de Brassica napus que puede ser obtenido de las semillas de plantas Brassica Napus que contienen los genes quiméricos de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, siendo el contenido de ácido graso C18:1 de más de un 84%.

11. Método para producir aceite seminal que contiene niveles alterados de ácidos grasos insaturados, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) transformar una célula vegetal de una especie oleaginosa con un gen quimérico de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7;

(b) cultivar plantas fértiles a partir de las células vegetales transformadas del paso (a);

(c) seleccionar las semillas de la progenie de las plantas fértiles del paso (b) para los deseados niveles de ácidos grasos; y

(d) elaborar la semilla de la progenie del paso (c) para obtener aceite seminal que contiene niveles alterados de ácidos grasos.

12. Método para aislar fragmentos de ácido nucleico que codifican ácido graso desaturasas y enzimas afines como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo dicho método los pasos de:

(a) comparar las secuencias de las ID SEC Núms.: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 y otras secuencias de polipéptidos de ácido graso desaturasa;

(b) identificar las secuencias conservadas de 4 o más aminoácidos obtenidas en el paso (a);

(c) diseñar oligómeros degenerados sobre la base de las secuencias conservadas identificadas en el paso (b); y

(d) usar los oligómeros degenerados del paso (c) para aislar secuencias que codifican ácido graso desaturasas y enzimas afines a las desaturasas mediante protocolos dependientes de la secuencia.

13. Planta que contiene un fragmento de ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un gen quimérico según la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

14. Semilla de una planta como la reivindicada en la reivindicación 13.