ES2198421T3 - Derivados de la camptotecina unidos a polimeros. - Google Patents

Derivados de la camptotecina unidos a polimeros.

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ES2198421T3 ES94928387T ES94928387T ES2198421T3 ES 2198421 T3 ES2198421 T3 ES 2198421T3 ES 94928387 T ES94928387 T ES 94928387T ES 94928387 T ES94928387 T ES 94928387T ES 2198421 T3 ES2198421 T3 ES 2198421T3
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Abstract

UN CONJUGADO POLIMERICO QUE CONSISTE ESENCIALMENTE DE: (I) DE 60 A 99 MOL % DE UNIDADES DE N-(2-HIDROXIPROPILO)METACRILOLAMIDA REPRESENTADAS EN LA FORMULA (1); (II) DE 1 A 40 MOL % DE UNIDADES DE 20-0-(N-METACRILOILGLICILAMINOACILO)CAMPTOTECINA REPRESENTADAS EN LA FORMULA (2), DONDE [A] ES UN GRUPO SE SEPARACION QUE TIENE GRUPOS RESPECTIVOS DE TERMINAL AMINO Y CARBONILOS LOS CUALES ESTAN SEPARADOS POR AL MENOS 3 ATOMOS Y O-CPT REPRESENTA UN RESIDUO DE UNA CAPTOTECINA, EL GRUPO HIDROXI C-20 DE LA CAMPTOTECINA, ESTANDO LIGADO A UN GRUPO DE TERMINAL CARBONILO DEL GRUPO SE SEPARACION; Y (III) DE 0 A 10 MOL % DE UNIDADES DE NMETACRILOILGLICINA O N-(2.HIDROXIPROPIL)METACRILOILGLICINAMIDA REPRESENTADAS EN LA FORMULA (3) DONDE Z REPRESENTA HIDROXI O UN RESIDUO DE LA FORMULA NH-CH2-CH(OH)-CH3.

Description

Derivados de la camptotecina unidos a polímeros.
La presente invención se refiere a camptotecina unida a polímero soluble en agua y a derivados de camptotecina unida a polímero dotado de propiedades antitumorales, un proceso para su preparación y a composiciones farmacéuticas que los contienen.
La camptotecina es un alcaloide aislado de las hojas y cortezas de Camotheca acuminata; también se conocen otros análogos de camptotecina y se prepararon por semisíntesis a partir de camptotecina o por síntesis total: véase J. Amer. Chem,. Soc. 94(10), 3631 (1972); J. Chem. Soc. D. (7), 404 (1970); US-A-4. 981.969 (Jan. 1, 1991); US-A-5.049.668 (Sep. 17, 1991). La camptotecina tiene una estructura pentacíclica que consta de un sistema de anillo condensado que forma un anillo de quinolina (anillos A y B), un anillo de pirrolidina (anillo C), un anillo de piridona (anillo D) y un resto de \alpha-hidroxi-\delta-lactona (anillo Q). La camptotecina y varios de sus derivados de anillo A sustituidos muestran actividad antitumoral frente a una diversidad de líneas tumorales sólidas, incluyendo líneas de celulares resistentes a agentes quimioterapéuticos disponibles clínicamente (véase J.Clin. Pharmacol. 30. 770. 11990); Cancer Chemother. Pharmacol. 28, 192 (1991)).
La camptotecina, así como la mayor parte de sus derivados es prácticamente insoluble en vehículos adecuados para la administración parenteral debido a la débil basicidad del átomo de nitrógeno de la quinona. Con el fin de solubilizar las camptotecinas, se han propuesto diversos profármacos solubles en agua tales como derivados de 20-0-fosfato o 20-0-acilamino que pueden protonarse por ácidos minerales, permitiendo así la solubilidad en agua:
véase el documento US-A-4.943.579 (Jul. 24, 1990). Hay efectos secundarios tóxicos, incluyendo hematológicos y gastrointestinales, asociados con la administración de estos fármacos. Se han realizado numerosos intentos para mejorar el índice terapéutico de la cantidad de camptotecina modificando su estructura.
El documento US-A-4-4 943 579 (B. Rao Vishnuvajjala), 24 de julio de 1990 y Journal of Medicinal Chemistry, vol. 36, 17 de septiembre de 1993, Washington US, p. 2689-2700, Monroe E. Wall et al. ``Plant tumor agents. 1A, B Synthesis and structure activity of novel camptothecin analogs'', describen una sal soluble en agua de camptotecina que, cuando se introduce en la corriente sanguínea de los pacientes, se convierte fácilmente en el fármaco parental, es decir, camptotecina. Los documento Journal of Controlled Release, vol. 18, 1992, Amsterdam NL. p. 123-132, V. Subr et al. ``Polymers contining enzymatically degradable bonds, XII. Effect of spacer structure on teh rate of release of daunomycin and adriamycin from poly [N-(2-hidroxipropil)-metacrilamida] copolymer drug cariers in vitro and antitumour activity measured in vivo''; WO-A-93 13804 (Farmitalia Carlo Erba), 22 de julio de 1993 y WO-A-93 14142 (University of Utah), 22 de julio de 1993, describe conjugados poliméricos que contienen una molécula bioactiva tal como melfala, daunomicina, doxorrubicina y beomicina. El fármaco se une al espaciador a través de un enlace amídico -CO-NH-.
La presente invención proporciona conjugados poliméricos de camptotecinas que son solubles en agua y poseen actividad antitumoral in vivo y disminuyen la toxicidad. Más particularmente, la invención proporciona un conjugado polimérico que se menciona en este documento como A y que consta de:
(i) de un 60 a un 99% en moles de unidades de N-(2-hidroxipropil)metacriloilamida representado por la fórmula 1:
1
(ii) de un 1 a un 40% en moles de unidades 20-0-(N-metacriloilglicel-aminoacil) camptotecina representado por la fórmula 2:
2
en la que (A) es un grupo espaciador que tiene grupos amino y carboxilo terminales respectivos que se separan por al menos tres átomos y O-CPT representa un resto de una camptotecina de fórmula 6 como se define más adelante, estando unido el grupo C-20 de la camptotecina al grupo carbonilo terminal del grupo espaciador [A]; y
(iii) de un 0 a un 10% en moles de unidades N-metacriloilglicina o N-(2-hidroxi-propil) metacriloilglicinamida representado por la fórmula 3
3
en la que Z representa hidroxi o un resto de fórmula -NH-CH_{2}-CH(OH)-CH_{3}.
La invención también proporciona un procedimiento para preparar un conjugado polimérico como se ha definido anteriormente, procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado de 20-0-acilamida-camptotecina de fórmula 7:
H[A]-O-CPT 7
en la que [A] y O-CPT son como se ha definido anteriormente, con un polímero que consta esencialmente de:
(i) de un 60 a un 99% en moles de unidades de N-(2-hidroxipropil)metacriloilamida representada por la fórmula 1:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \hskip1mm |\cr  \+ CH _{2} \cr  \+
 \hskip1mm |\cr 
CH _{3} --- \hskip-2mm  \+
C---CO---NH---CH _{2} ---CHOH---CH _{3}    \hskip2cm  1\cr 
\+
 \hskip1mm |\cr}
y
(iv) de 40 a 1% en moles de unidades de N-metiacriloilglicina representada por la fórmula 4:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \hskip1mm |\cr  \+ CH _{2} \cr  \+
 \hskip1mm |\cr 
CH _{3} --- \hskip-2mm  \+
C---CO---Gly---R _{2}   \hskip4.5cm  4\cr  \+
 \hskip1mm |\cr}
en la que R_{2} es (a) el resto de un éster activo o (b) hidroxi; y opcionalmente desplazando los grupos restantes de éster activo con 1-amino-2-propanol.
El conjugado polimérico A contiene las unidades de N-(2-hidroxipropil)metacrilailamida representadas por la fórmula 1 en una proporción de un 60% en moles o mayor, por ejemplo al menos de un 80% en moles o al menos de un 85% en moles. Estas unidades deben estar presentes en una cantidad del 91 al 98% en moles. El conjugado también contiene de un 1 a un 40% en moles de las unidades de 20-0-(N-metacriloilglicil-aminoacil)camptotecina representada por la fórmula 1, por ejemplo, de un 1 a un 20% en moles de tales unidades. El conjugado puede contener de un 1 a un 8% en moles, por ejemplo, de un 2 a un 6% en moles, de estas unidades.
El grupo espaciador [A] puede tener de tres a doce, por ejemplo, de seis a nueve átomos de longitud. Típicamente, el grupo es susceptible a hidrólisis intracelular. Preferiblemente es resistente a la hidrólisis extracelular. El grupo espaciador puede ser un espaciador peptídico por ejemplo de una longitud de 1 a 4 o de 2 a 4 restos de aminoácidos. De esta forma el espaciador puede ser un dipéptido, tripéptido o tetrapéptido.
Preferiblemente el grupo espaciador (A) se selecciona entre Ala-Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Try-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly y Phe-Leu-Gly-Phe.
Como alternativa, el grupo espaciador (A) es un grupo de fórmula -HN-Y-CO- en la que Y es alquilo C_{3}-C_{6} lineal o ramificado tal como -(CH_{2})_{n}- donde n es 3, 4, 5 ó 6.
Como alternativa, el espaciador (A) es un grupo de fórmula Ala-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Gly-NH-Y-CO-, Val-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Ala-NH-Y-CO-, Leu-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO, Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO- o Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO- donde Y tiene el mismo significado proporcionado anteriormente.
Un resto de una camptotecina se denomina O-CPT.
La camptotecina puede ser camptotecina o un análogo del mismo o un análogo del anillo A. Tal análogo del anillo A es dicha camptotecina sustituida sobre el anillo A. La camptotecina está en la forma natural S.
Los restos de camptotecina O-CPT se representan por la fórmula 6:
6
en la que R_{1} representa hidrógeno, 9-, 10-, 11- ó 12-hidroxi, 9- ó 10-nitro, 9- ó 10-amino ó 10, 11-metilenodioxi. Preferiblemente, las unidades de fórmula 2 están presentes en una cantidad del 1 al 10% en moles tal como del 0,5 a 5% en moles. También preferiblemente, el contenido de camptotecina es del 1 al 10% (p/p) más preferiblemente del 4 al 8% (p/p), con respecto al conjugado polimérico.
La invención también proporciona un derivado de 20-0-acilamino-camptotecina de fórmula 7 como se ha definido anteriormente. La presente invención también proporciona un proceso para preparar un derivado de 20-0-acilamina-camptotecina de fórmula 7, procedimiento que comprende condensar una camptotecina con un derivado de aminoacilo N-protegido de fórmula 8 :
R_{3}-[A]-P 
\hskip0.5cm
8
en la que [A] es como se ha definido anteriormente y R_{3} representa un grupo protector de amino, tal como t-boc, CBZ, FMOC, trifenilsilil, difenilmetileno o trifenilmetilo, y P es un resto de un éster activado, tal como p-nitrofenoxi, pentfluorfenoxi o N-hidroxisuccinimido, en presencia de un agente de activación tal como 4-dimetilaminopiridina, para dar un compuesto N-protegido-2-O(acilamino) representado por la fórmula 9:
R_{3}-[A]-[O-CPT]
en la que R_{3}, [A] y [O-CPT] son como se han definido anteriormente; y retirando el grupo N-protector del compuesto resultante.
La preparación de los compuestos de fórmula 8 sigue procedimientos sintéticos convencionales que son bien conocidos a partir de la bibliografía. Los derivados de aminoacilo N-protegidos de fórmula 8 incluyen N-tritil-L-fenilalanil-L-leucil-glicil p-nitrofenil éster (8a) o N-tritil-glicil-L-leucil-glicil p-nitrofeniléster (8b), ó 6-N-tritil-hexa-noil p-nitrofenil éster (8c). Algunos derivados de fórmula 8 y su preparación se describen también en nuestra solicitud de patente internacional pendiente junto con la presente Nº PCT/EP94/01100.
De esta forma, por ejemplo, una camptotecina puede dejarse reaccionar con un exceso molar, por ejemplo un exceso molar de hasta cinco veces o más, especialmente 2 equivalentes molares, de un derivado de aminoácido N-protegido de fórmula 5 en un disolvente anhidro tal como dimetilformamida anhidra o dimetilsulfóxido en presencia de un agente de activación tal como 4-dimetilaminopiridina. De esta manera, el aminoácido protegido se introduce en la posición C-20 de la molécula de camptotecina. La reacción típicamente se realiza durante un período comprendido entre 8 y 24 horas. La reacción típicamente se realiza a una temperatura de 15 a 40ºC. Debería apreciarse que, siguiendo tales condiciones de reacción, la 9-aminocamptotecina reacciona regio-específicamente en la posición C-20-hidroxi debido a la débil basicidad del grupo 9-amino.
El grupo protector de amino R_{3} se retira por un agente de desprotección apropiado para dar el derivado de 20-O-acilamino-camptotecina de fórmula 7. Por lo tanto, la desprotección puede conseguirse por tratamiento con un ácido débil tal como tratamiento con ácido acético o por reducción. Por lo tanto, puede emplearse hidrogenolisis.
La condensación del derivado de 20-O-acetamido-camptotecina de fórmula 7 con el polímero que consta esencialmente de un 60 a un 99% en moles de unidades de la N-(2-hidroxipropil)-metacriloilamida de fórmula 1 y de un 40 a un 1% en moles de unidades de N-metacriloilamida de fórmula 4, y el posterior desplazamiento opcional de los grupos éster activos restantes, se realiza en condiciones capaces de conservar la naturaleza de la unión entre las camptotecinas y los espaciadores [A], así como la del conjugado.
Los polímeros que constan esencialmente de un 60 a un 99% en moles de unidades de N-(2-hidroxipropil)-metacriloilamida de fórmula 1 y de un 40 a un 1% en moles de unidades de N-metacriloilglicina de fórmula 4, se preparan por copolimerización de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida con N-metacriloil-glicina o con derivados de N-metacriloilglicina o del éster activo de N-metacriloilglicina, como se describe en Makromol. Chem. 178, 2159 (1977). R_{2} puede representar un grupo feniloxi que está sustituido sobre el anillo fenilo con uno o más grupos eliminadores de electrones. Los ejemplos de grupos eliminadores de electrones adecuados incluyen nitro (-NO_{2}) y halógeno. R_{2} preferiblemente es el grupo saliente:
7
En la que L es un grupo eliminador de electrones, por ejemplo -NO_{2} o un halógeno tal como fluoro, cloro, y m es un número entero de 1 a 5 típicamente de 1 a 3, preferiblemente 1 ó 2, preferiblemente R_{2} es un grupo p-nitrofenoxi o un grupo 2,4-diclorofenoxi.
Preferiblemente la reacción entre un polímero en el que R_{2} representa (a) el resto de un éster activo y un compuesto de fórmula 7 para preparar el conjugado polimérico de la invención se realiza en un disolvente orgánico polar anhidro tal como dimetilformamida o dimetilsulfóxido. La reacción típicamente puede realizarse durante un período de tiempo comprendido entre 8 y 24 horas. La reacción típicamente se realiza a una temperatura entre 15 y 30ºC, preferiblemente a temperatura ambiente durante 15 horas; después puede realizarse la aminolisis del éster activo restante en presencia de 1-amino-2-propanol a temperatura ambiente, de 0,5 a 1 hora. El conjugado se precipita adecuadamente con acetona, se disuelve en etanol y se reprecipita con acetona.
En otro método, con el fin de preparar un conjugado polimérico de la invención, la reacción entre un polímero en el que R_{2} representa el grupo hidroxi (b) y un compuesto de fórmula 7 se realiza en un disolvente polar anhidro tal como dimetilformamida o dimetilsulfóxido en presencia de un agente de condensación tal como 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1, 2-dihidroquinolina. La reacción puede realizarse típicamente de 8 a 24 horas. La reacción típicamente se realiza a una temperatura comprendida entre 15 y 30ºC, preferiblemente a temperatura ambiente durante 15 horas. Después, el conjugado puede precipitarse con acetona, disolverse en etanol y después precipitarse con acetona.
Por ejemplo, el polímero en el que R_{2} representa (a) el resto de un éster activo, proporcionado a una concentración del 15% (peso/volumen) en dimetilsulfóxido anhidro, se trata con un derivado de 20-O-aminoacil camptotecina de fórmula 7, 3% (p/v), a temperatura ambiente durante 15 horas. Después, se añade 1-amino-2 propanol, 0,1% (p/v) y la mezcla de reacción se mantiene a temperatura ambiente durante 1 hora. El conjugado puede precipitarse con acetona, después disolverse con etanol absoluto a una concentración del 10% (p/v) y precipitarse de nuevo con acetona para dar el conjugado de camptotecina neutro de acuerdo con la invención.
En otro ejemplo, el polímero en el que R_{2} representa (b) hidroxi, proporcionado a una concentración del 15% (peso/volumen) en dimetilsulfóxido anhidro, se trata con un derivado de 20-O-aminoacil camptotecina de fórmula 7, 3% (p/v), en presencia de 2-etoxi-1-etoxi-1-etoxicarbonil-1, 2-dihidroquinolina, 1, 3% (p/v), a temperatura ambiente durante 15 horas. Después se añade acetona para provocar la precipitación, el precipitado se disuelve con etanol absoluto a una concentración del 10% (p/v) y se produce de nuevo precipitación provocada por la adición de acetona, para dar un conjugado polimérico de acuerdo con la invención.
El contenido del fármaco activo, tal como camptotecina o sus análogos de anillo A, en los conjugados poliméricos de la invención se determinan por HPLC o por análisis de espectrometría de absorbancia.
Los conjugados poliméricos de camptotecina y sus análogos de anillo A descritos en la presente invención están dotados de una solubilidad en agua mejorada y una disminución de la toxicidad. Los conjugados muestran una solubilidad en agua, biocompatibilidad y liberación de camptotecinas en el plasma o después de la internalización en células por escisión enzimática.
Actividad biológica
Se ensayó el copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, 20-O-[N-metacriloilglicil-L-fenilalanila-L-leucilglicil]camptotecina y N-(2-hidroxipropil)metacriloilglicinamida (A2) en ratones desnudos en los que se había trasplantado HT29/carcinoma de colon (Tabla 1) y en ratones que llevaban un retículo de sarcoma murino M5076 en las primeras fases y avanzado (tabla 2 y 3) en comparación con la camptotecina libre (CPT).
Cuando se comparó con la camptotecina, se observó una actividad sorprendentemente mayor en todos los experimentos para el derivado de camptotecina A2 unido a polímero. Debe destacarse que se encontraron ratones curados en el experimento sobre HT29/carcinoma de colon.
La actividad antitumoral se ensayó con el mismo programa de tratamiento para A2 y CPT.
Debe indicarse que se descubrió que la camptotecina A2 unida a polímero era muy soluble en agua y se disolvió en solución salina y se administró i.v., mientras que la CPT se disolvió en una mezcla de agua y tween 80.
Preparación del fármaco y administración
El compuesto A2 se disolvió en agua destilada inmediatamente antes del uso y la concentración se comprobó espectrofotométricamente a 370 nM (E1% 57,18).
La camptotecina (CPT) se disolvió en agua estéril con tween al 10%.
El tratamiento se administró i.v. en un volumen de 10 ml/kg de peso corporal y los ratones de control se trataron con agua estéril.
Tumores
Se trasplantó carcinoma de colon HT29 s.c. en ratones Swiss/nu/atímicos usando 15-20 mg de tejido tumoral.
Se mantuvo un retículo de sarcoma murino M5076 por pasos i.m. en serie y se trasplantó s.c. (5 x 10^{5} células/ratón) en ratones C57B1/6 compatibles.
Todos los animales procedían de Charles River Calco, Como, Italia. Se usaron diez ratones/grupo en el caso de los ratones convencionales y ocho en el caso de los ratones atímicos.
Los ratones convencionales pesaban de 20 a 22 g y se mantuvieron en condiciones de laboratorio convencionales.
La colonia de ratones se ensayó rutinariamente con respecto a la ausencia de anticuerpos contra un panel de patógenos incluyendo la hepatitis de ratón, el virus Sendai y Mycoplasma Pulmonis.
Evaluación de la actividad antitumoral y la toxicidad
El crecimiento tumoral se evaluó midiendo por medio con un calibre y el peso del tumor se estimó de acuerdo con Gerant et al. (véase: Cancer Chem. Rep., Part 3, 3 (2) ed. 3, p. 1-103, 1972). La actividad antitumoral se expresa como un porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (% T/I) usando la siguiente fórmula:
100 -- \frac{(peso \; tumoral \; medio \; de \; ratones \; tratados)}{(peso \; tumoral \; medio \; de \; ratones \; de \; control)} x 100
El aumento medio del tiempo de supervivencia (T/C%) se calculó usando la siguiente fórmula:
\frac{(tiempo \; de \; supervivencia \; media \; de \; ratones \; tratados)}{(tiempo \; de \; supervivencia \; media \; de \; ratones \; de \; control)} x 100
Los ratones curados son ratones sin tumores al final del experimento.
La toxicidad se evaluó basándose en la reducción del peso corporal y los hallazgos de autopsia generales, principalmente en términos de la reducción del tamaño del bazo y del hígado.
TABLA 1 Actividad antitumoral del compuesto A2 en comparación con camptotecina (CPT) contra HT29/carcinoma de colon
Compuesto dosis ^{(1)} mg/kg Programa de tratamiento %de inhibición tumoral TOX^{(2)} ratones curados^{(3)}
A2 7,5 iv c4dx6 96 0/18 3/18
CPT 7,5 iv c4dx6 83 0/10 0/10
(1) expresado como equivalente de CPT
(2) número de muertes tóxicas/número total de ratones
(3) ratones sin tumores 90 días después del implante del tumor
TABLA 2 Actividad antitumoral del compuesto A2 en comparación con camptotecina (CPT) contra reticulosarcoma murino M5076 en sus primeras fases
Compuesto dosis^{(1)} mg/kg programa de tratamiento % de inhibición tumoral^{(3)} T/C% TOX^{(2)}
A2 7,5 iv 1, 6, 9 100 171 0/10
CPT 7,5 ip 1, 6, 9 100 165 0/10
(1) expresado como equivalente de CPT
(2) número de muertes tóxicas/número total de ratones
(3) el %de inhibición tumoral se estimó una semana después del último tratamiento.
TABLA 3 Actividad antitumoral del compuesto A2 en comparación con camptotecina (CPT) contra reticulosarcoma murino M5076 avanzado. Programa de tratamiento iv en los día 16, 20, 24, 28, 31, 35
Compuesto Dosis^{(1)} mg/kg % de inhibición tumoral^{(3)} T/C% TOX^{(2)}
A2 10,0 80 174 0/10
15,0 95 183 0/10
CPT 7,5 72 173 0/10
(1) expresado como equivalente de CPT
(2) número de muertes tóxicas/número total de ratones
(3) el % de inhibición tumoral se estimó en el día 34.
Toxicidad
La toxicidad del copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, 20-O-[N-metacriloilglicil-L-fenilalanila-L-leucilglicil]camptotecina y N-(2-hidroxipropil)metacriloilglicinamida (A2) se evaluó en ratones C57B1/F sanos, por tratamiento i.v. en comparación con camptotecina (CPT).
Los valores de DL_{10}^{(1)} y DL_{50}^{(2)} en ratones C57B1/F son los siguientes:
Compuesto DL_{10} mg/kg DL_{50} mg/kg
A2 129 151
CPT 16,9 43,4
(1) DL_{10}: un 10% de ratones muertos.
(2) DL_{50}: un 50% de ratones muertos.
La baja toxicidad del derivado de camptotecina A2 unido al polímero permite administrar dosis superiores del producto y alcanzar resultados equivalentes o mejores que los obtenidos con camptotecina.
Las camptotecinas unidas a polímero tienen actividad antitumoral. Inhiben la topoisómeras I. Son útiles en el tratamiento de la leucemia y de tumores de colon y rectales en particular.
Por lo tanto, un ser humano o un animal puede tratarse por un método que comprende administrar al mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado polimérico de la invención. De esta forma puede mejorar el estado del paciente humano o animal.
El intervalo de dosificación adoptado dependerá de la vía de administración y de la edad, peso y estado del paciente a tratar. Los conjugados poliméricos típicamente se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular, intravenosa o por infusión en embolada. Un intervalo de dosificación adecuado es de 1 a 1000 mg de camptotecina equivalente por m^{2} de área de superficie corporal, por ejemplo de 10 a 50 mg/m^{2}.
Los conjugados poliméricos pueden formularse en una composición farmacéutica junto con un vehículo diluyente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, los conjugados poliméricos se formula para administración parenteral, por ejemplo por disolución en agua para inyección o solución fisiológica salina.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitarla. A lo largo de toda la memoria descriptiva, los restos aminoacídicos se muestran en el código de tres letras de acuerdo con Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1994.
La estabilidad de los conjugados poliméricos en plasma murino o humano se evaluó de la siguiente manera: a 1 ml de plasma murino humano se le añadieron diversas concentraciones de un conjugado polimérico de la invención A y a los tiempos apropiados (24, 48, 72, 96 horas) se recogieron muestras de 100 \mul y se almacenaron a -70ºC hasta el procesamiento adicional.
Cada muestra se extrajo añadiendo 100 \mul de ácido fosfórico 0,25 M, 500 \mul de CH_{3}CN y 700 \mul de acetato de etilo y agitando vigorosamente durante 20 minutos a 4ºC. Después de ese momento, la muestra se centrifugó a 15.000 xg durante 10 minutos y se separó el sobrenadante. Al residuo se añadieron 300 \mul de CH_{3}CN y se centrifugó 500 \mul a 15000 xg durante 10 minutos. El sobranadante se separó. Las fases orgánicas se reunieron y se evaporaron usando una centrífuga de alto vacío. La muestra se recuperó añadiendo 500 \mul de MeOH/agua pH_{2} (70/30 en volumen) y se inyectó en un aparato de HPLC para determinar el contenido total de porcentaje de fármaco.
Sistema de HPLC
Columna: \muBondpak C10 (Waters) 3,9 x 300 mm
Caudal: 1,5 ml/min
Detector: Espectrofotómetro de fluorescencia 650-40 (Perkin Elmer);
emisión a 434 nm (ranura 5); excitación a 370 nm (ranura 5)
Inyección : 10 \mul
Fase móvil: 51,5 % de MeOH, 47,5% de agua y 1% de ácido fosfórico
Ejemplo 1 6-N-tritil-hexanoil p-nitrofenil éster (8c)
(C_{6}H_{5})_{3}C-NH(CH_{2})_{5}CO-OC_{6}H_{4}pNO_{2} 
\hskip5cm
8c
Se añadió ácido 6-aminocaproico (6,5 g, 50 mmol) suspendido en una mezcla de cloroformo seco (75 ml) y acetonitrilo seco (15 ml) con cloruro de trimetilsililo (6,3 ml, 50 mmol) y se mantuvo a reflujo durante dos horas con agitación vigorosa. Después, la mezcla se enfrió y se añadieron secuencialmente trietilamina (13,7 ml, 100 mmol) y se disolvió cloruro de tritilo (14 g, 50 mmol) en cloroformo seco (100 ml). La mezcla se dejo reposar durante una noche a temperatura ambiente, después se añadió metanol (10 ml) y la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El residuo se recogió con ácido cítrico acuoso frío al 5% (200 ml) y se extrajo con acetato de etilo (200 ml). La fase orgánica se separó y se extrajo con hidróxido sódico acuoso frío 1 N (200 ml). La fase acuosa se separó, se enfrió con hielo, se llevó hasta pH 5 con ácido acético y se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). El disolvente orgánico se retiró a presión reducida para producir, después de cristalización en acetato de etilo, ácido 6-N-tritil-hexanoico (16 g). Este material se disolvió en tetrahidrofurano anhidro (150 ml) y se trató con p-nitrofenol (5,6 g, 400 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (8,4 g, 40 mmol) a 0ºC durante una hora en agitación, después durante una noche a 8ºC. Después, la mezcla de reacción se filtró, se enfrió a 0ºC durante dos horas y se filtró otra vez. Finalmente, el disolvente orgánico se retiró a presión reducida y el residuo se cristalizó con éter etílico para producir el compuesto del título 8c (16,4 g). TLC sobre placas Kieselgel F_{245} (Merck), eluyendo con un sistema de éter etílico/n-hexano (1:1 en volumen) R_{f}=0,6; FD-MS: m/z [M+H]^{+} 495 H^{1}RMN (90 MHz, CDCl_{3}) \delta:
1,1-1,9 (m, 6H); 2-2,5 (m, 4H); 5,7-5,9 (m, 2H, NH, -COOH); 7,2-7,7 (m, 15H)
Ejemplo 2 20-O-(6-aminohexanoil)camptotecina (7c)
8
Se disolvió camptotecina (6a, R_{1}=H, 0,7 g, 2 mmol) en dimetilsulfóxido seco (100 ml) y se añadió con 6-N-tritil-hexanoil p-nitrofenil éster 8c, 2g, 4 mmol), preparado como se describe en el ejemplo 1, y 4-dimetilaminopiridina (0,24 g, 2 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 48 horas, después se eluyó con cloroformo (400 ml) y se lavó con agua (3 x 100 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta un pequeño volumen a presión reducida. El material bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida en una columna de ácido silícico eluyendo con cloroformo para producir 20-O-(6-N-tritil-hexanoil)camptotecina (0,6 g). La TLC sobre placas Kieselgel F_{245} (Merck), eluyendo con un sistema de cloroformo/metanol (95:5 en volumen) R_{f}=0,4. El derivado N-protegido se trató con ácido trifluoroacético al 95% (10 ml) a temperatura ambiente durante 50 minutos. Después de la retirada del ácido a presión reducida, el compuesto del título 7c se recogió en éter etílico. Rendimiento del 0,4 g. La TLC sobre placas de Kieselgel F_{245} (Merck), eluyendo con un sistema cloruro de metileno/metanol/ácido acético/agua (80:20:7:3) R_{f}=0,6. FD-MS: m/z [M+H]^{+} 462.
Ejemplo 3 20-O-(L-Fenilalanil-L-leucil-glicil)camptotecina (7b)
9
Se disolvieron N-tritil-L-fenilalanil-L-leucilglicina p-nitrofenil éster (8a, 1,4 g, 2 mmol) preparado como se describe previamente en la solicitud de Patente del Reino Unido Nº. 9309663,4, camptotecina 6a, R_{1}=H, 0,35 g, 1 mmol), 4-dimetilaminopridina (0,12 g, 1 mmol) con dimetilsulfóxido seco (50 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Después, la mezcla de reacción se diluyó con cloroformo (400 ml) y se lavó con agua (3 x 100 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró hasta un pequeño volumen a presión reducida. El material bruto se sometió a cromatografía ultrarrápida en una columna ácido silícico, eluyendo con una mezcla de cloroformo/metanol (99,5/0,5 en volumen). Se combinaron las fracciones que contenían el derivado N-protegido del compuesto del título, se concentraron a sequedad, se disolvieron con ácido acético acuoso al 75% (30 ml) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante una hora. La mezcla de reacción se trató con hidrógeno carbonato sódico hasta un pH 7 y se extrajo con cloroformo (400 ml). Después de la retirada del disolvente orgánico, el compuesto del título 7b se cristalización en éter etílico. Rendimiento del 0,16 g. TLC sobre placas Kieselgel F_{245} (Merck), eluyendo con un sistema de cloroformo/metanol (9:1 en volumen) R_{f}= 0,35
FD-MS: m/z [M+H]^{+} 667
^{1}H-RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta:
0,81 (d, J = 6,5 Hz, 3H, \delta-Leu); 0,82 (d, J = 6,6 Hz, 3H, \delta'-Leu); 0,98 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH_{3}-CH_{2}); 1,25 (m, 1H, \beta-Leu); 1,39 (m, 1H, -Leu); 1,56 (m, 1H, \beta'-Leu); 1,98 (dd, J = 6,4 Hz, J = 13,5 Hz, 1H, \beta-Phe); 2,1-2,4 (m, 2H, CH_{2}CH_{3}); 2,48 (d, J = 7,0 1H, NH-Phe); 2,77 (dd, J = 4,7 Hz, J = 13,5 Hz, 1H, \beta'-Phe); 3,41 (m, 1H, \alpha-Phe); 4,0-4,3 (m, 3H, \alpha-Gly + \alpha'-Gly + \alpha-Leu); 5,20-5,27 (dos-d, J = 19,9 Hz, 2H, 5-CH_{2}); 5,41-5,68 (dos-d, J = 17,3 Hz, 2H, 17-CH_{2}); 6,35 (t, J = 5,3 Hz, 1H, NH-Gly); 6,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H, NH-Leu); 6,8-7,3 (m, 21H, 4x(C_{6}H_{5}) + 14-H).
Ejemplo 4 9-Amino-20-O-(L-fenilalinil-L-leucil-glicil)camptotecina (7c)
10
Se hicieron reaccionar N-tritil-L-fenilalanil-L-leucilglicina p-nitrofenil éster (8a, 1,14 g, 2 mmol), 9-amino-camptotecina (6b, R_{1}=NH_{2}, 0,363 g, 1 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (0,12 g, 1 mmol) en dimetilsulfóxido seco (20 ml) a temperatura ambiente como se describe en el ejemplo 3 para dar el compuesto del título 7c (0,31 g). TLC en placas de Kieselgel F_{245} (Merck), eluyendo con un sistema de cloroformo/metanol (9:1 en volumen) R_{f} = 0,2 FD-MS: m/z [M+H]^{+} 682; ^{1}H-RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta: 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 6H, \delta-Leu + \delta'-Leu); 1,00 (t, J = 7,6 Hz, 3H, CH_{2}CH_{3}), 1,25 (m, 1H, \beta-Leu); 1,41 (m, 1H, -Leu); 1,59 (m, 1H, \beta'-Leu); 1,99 (dd, J = 6,2 Hz, J = 13,5 Hz, 1H, \beta-Phe); 2,1-2,4 (m, 2H, CH_{2}CH_{3}); 2,47 (d, J = 6,5 Hz, 1H, NH-Phe); 2,79 (dd, J = 4,7 Hz, J = 13,5 Hz, 1H, \beta'-Phe); 3,43 (m, 1H, \alpha-Phe); 4,0-4,3 (m, 5H, 9-NH_{2} + \alpha-Leu +\alpha-Gly + \alpha'-Gly); 5,04-5,15 (dos-d, J = 19,9 Hz, 2H, CH_{2}); 5,39-5,66 (dos-d, J = 17,0 Hz, 2H, 17-CH_{2}); 6,44 (t, J = 5,3 Hz, 1H, NH-Gly); 6,81 (d, J = 7,6 Hz, 1H, NH-Leu); 6,85 (m, 3H, 10-H + 11-); 7,0-7,4 (m, 19H, 3x(C_{6}H_{5})+ 110 - + 14-H); 7,51 (m, 1H, 11-H).
Ejemplo 5 Copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, 20-O-[N-metacriloilglicil-(6-aminohexanoil)]camptotecina y N-(2-hidroxi-propil)metacriloilglicinamida
(A1:x=96, y=3, z=1)
12
El copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida y N-metacriloilglicina p-nitrofenil éster (0,15 g) preparado como se describe en Makromol. Chem., 178, 2159 (1977), que contenía 2,7 x 10^{3} equivalentes de p-nitrofenil éster se hizo reaccionar con 20-O-(6-aminohexanoil)camptotecina (7c, 18 mg), preparada como se describe en el ejemplo 2, en dimetilsulfóxido seco (1 ml) a temperatura ambiente durante 18 horas y después con 1-amino-2-propanol (2 \mul) durante una hora a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se trató con acetona (70 ml). El precipitado se recogió, se disolvió de nuevo con etanol anhidro (5 ml) y se precipitó de nuevo con acetona (50 ml) para dar el conjugado del título A1 (0,14 g) que contenía camptotecina al 5% (p/p). Después de la incubación del plasma, el conjugado A1 libera camptotecina al 10% después de 120 horas.
Ejemplo 6 Copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida, 20-O-[N-meta-criloilglicil-L-fenilalanil-L-leucilglicil]camptotecina y N-(2-hidroxipropil)metacriloilglicinamida
(A2:x=96, y=2,2, z=1,8)
13
El copolímero de -(2-hidroxipropil)metilacrilamida y N-metacriloilglicina p-nitrofenil éster (0,15 g que contenía 2,7 x 10^{3} equivalentes de p-nitrofeniléster) y 20-O-(Glicil-L-leucil-L-fenilalanil)camptotecina (7b, 20 mg), preparado como se describe en el ejemplo 3 se hizo reaccionar en dimetilsulfóxido seco (1 ml) y después con 1-amino-2-propanol como se describe en el ejemplo 6 para dar el conjugado del título A2 (0,14 g), que contenía camptotecina al 4,8% p/p. Después de la incubación del plasma, el conjugado A2 libera camptotecina al 100% después de 60 horas.
Ejemplo 7 Copolímero de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida, 9-amino-20-O- [N-metacriloilglicil-L- fenilalanil-L-leucilglicil] camptotecina y N-(2-hidroxipropil)metacriloilglicinamida
(A3:x=96, y=3, z=1)
14
El conjugado del título se preparó por la reacción del copolímero N-(2-hidroxipropil)metacrilamida y N-metacriloilglicina p-nitrofeniléster (0,15 g, que contenía 2,7 x 10^{3} equivalentes de p-nitrofeniléster) y 9-amino-20-O-(Glicil-L-leucil-L-fenilalanil)camptotecina (7c, 20 mg), preparado como se describe en el ejemplo 4, en dimetilsulfóxido seco (1 ml) y después con 1-amino-2-propanol como se describe en el ejemplo 5. Rendimiento del 0,14 g, que contenía 9-amino-camptotecina al 6,3% p/p. Después de la incubación del plasma, el conjugado A3 libera camptotecina al 100% después de 50 horas.

Claims (9)

1. Un conjugado polimérico que consta de:
(i) de un 60 a un 99% en moles de unidades de N-(2-hidroxipropil)metacriloilamida representado por la fórmula 1:
15
(ii) de un 1 a un 40% en moles de unidades 20-0-(N-metacriloilglicel-aminoacil) camptotecina representado por la fórmula 2:
16
en la que (A) es un grupo espaciador que tiene grupos amino y carboxilo terminales respectivos que se separan por al menos tres átomos y O-CPT representa un resto de una camptotecina de fórmula 6:
17
en la que R_{1} representa hidrógeno, hidroxi, nitro o amino o un grupo metilenodioxi unido a dos átomos de carbono adyacentes sobre el anillo A, estando unido el grupo hidroxi C-20 de la camptotecina al grupo carbonilo terminal del grupo espaciador [A]; y
(iii) de un 0 a un 10% en moles de unidades N-metacriloilglicina o N-(2-hidroxi-propil) metacriloilglicinamida representado por la fórmula 3
18
en la que Z representa hidroxi o un resto de fórmula -NH-CH_{2}-CH(OH)-CH_{3}.
2. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el grupo espaciador [A] se selecciona entre Ala-Gly, Phe-Gly, Phe-Phe, Leu-Gly, Val-Ala, Phe-Ala, Leu-Phe, Leu-Ala, Phe-Leu-Gly, Phe-Phe-Leu, Leu-Leu-Gly, Phe-Try-Ala, Phe-Gly-Phe, Phe-Phe-Gly y Phe-Leu-Gly-Phe.
3. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el grupo espaciador [A] es un grupo de fórmula -HN-Y-CO- en la que Y es alquilo C_{3}-C_{6} lineal o ramificado tal como -(CH_{2})_{n}- o Ala-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Gly-NH-Y-CO-, Val-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Ala-NH-Y-CO-, Leu-Phe-NH-Y-CO-, Leu-Ala-NH-Y-CO-, Phe-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Leu-NH-Y-CO-, Leu-Leu-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Tyr-Ala-NH-Y-CO, Phe-Gly-Phe-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO-, Phe-Phe-Gly-NH-Y-CO- o Phe-Leu-Gly-Phe-NH-Y-CO- donde Y tiene el mismo significado proporcionado anteriormente.
4. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que están presentes de un 1 a un 10% en moles de dichas unidades de fórmula 2.
5. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el contenido de camptotecina es de un 1 a un 10% (p/p).
6. Un proceso para preparar un conjugado polimérico como s e define en la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar un derivado de O-acilamino de fórmula 7:
H[A]-O-CPT 7
en la que [A] y O-CPT son como se ha definido anteriormente, con un polímero que consta esencialmente de:
(i) de un 60 a un 99% en moles de unidades de N-(2-hidroxipropil)metacriloilamida representada por la fórmula 1:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \hskip1mm |\cr  \+ CH _{2} \cr  \+
 \hskip1mm |\cr 
CH _{3} --- \hskip-2mm  \+
C---CO---NH---CH _{2} ---CHOH---CH _{3}    \hskip2cm  1\cr 
\+
 \hskip1mm |\cr}
y
(iv) de 40 a 1% en moles de unidades de N-metiacriloilglicina representada por la fórmula 4:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \hskip1mm |\cr  \+ CH _{2} \cr  \+
 \hskip1mm |\cr 
CH _{3} --- \hskip-2mm  \+
C---CO---Gly---R _{2}   \hskip4.5cm  4\cr  \+
 \hskip1mm |\cr}
en la que R_{2} es (a) el resto de un éster activo o (b) hidroxi;
y opcionalmente desplazando los grupos restantes de éster activo con 1-amino-2-propanol.
7. Un derivado de 20-=-acilamino-camptotecina de fórmula 7: H[A]-O-CPT en el que O-CPT es como se define en la reivindicación 1 y A es como se ha definido en la reivindicación 2 ó 3.
8. Un proceso para preparar un derivado de 20-=-acilamino-camptotecina de fórmula 7 como se define en la reivindicación 7, proceso que comprende la condensación de una camptotecina con un derivado de aminoacilo protegido de fórmula 8:
R_{3}-[A]-P
donde [A] es como se define en la reivindicación 2 ó 3, R_{3} representa un grupo amino-protector y P es un resto de un éster activado, en presencia de un agente de activación, para dar un compuesto de 20-O-(acilamino) N-protegido representado pro la fórmula 9:
R_{3}-[A]-[O-CPT]
en la que R_{3} y [A] son como se han definido anteriormente y O-CPT es como se define en la reivindicación 1; y la eliminación del grupo N-protector del compuesto resultante.
9. Una composición farmacéutica que comprende un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable y, como ingrediente activo, un conjugado polimérico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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