ES2198579T3

ES2198579T3 - Hidrogeles hidrolizables para liberacion controlada.

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Publication number: ES2198579T3
Application number: ES97929571T
Authority: ES
Inventors: Wilhelmus Everhardus Hennink; Wendelmoed Nelletha Eleonora Van Dijk-Wolthuis
Original assignee: Rijksuniversiteit Utrecht
Current assignee: Universiteit Utrecht
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: EP0910412B1; US6497903B1; AU3360197A; PT910412E; ATE238068T1; DE69721265T2; JP4625548B2; US7060296B2; DE69721265D1; US20020131952A1; DK0910412T3; EP0910412A1; WO1998000170A1; JP2000515853A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN HIDROGEL BIODEGRADABLE QUE COMPRENDE ENLACES QUE SON HIDROLIZABLES BAJO CONDICIONES FISIOLOGICAS. MAS PARTICULARMENTE, EL HIDROGEL CONSTA DE DOS REDES DE POLIMEROS DE INTERPENETRACION INTERCONECTADAS ENTRE SI A TRAVES DE SEPARADORES HIDROLIZABLES. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UN HIDROGEL, EN EL QUE LAS MACROMOLECULAS, POR EJEMPLO LOS POLIMEROS, QUE CONTIENEN ENLACES QUE SEAN HIDROLIZABLES BAJO CONDICIONES FISIOLOGICAS, SE RETICULAN EN UNA SOLUCION ACUOSA.

Description

Hidrogeles hidrolizables para liberación controlada.

La presente invención se relaciona con hidrogeles que tienen un buen comportamiento de liberación controlada y con procedimientos para preparar dichos hidrogeles.

Los rápidos avances en el campo de la biología molecular y la biotecnología han hecho posible producir un gran número de productos farmacéuticamente interesantes en grandes cantidades. Por ejemplo, se pueden usar adecuadamente péptidos y proteínas farmacéuticamente activos como fármacos en el tratamiento de enfermedades mortales, por ejemplo del cáncer, y de varios tipos de enfermedades víricas, bacterianas y parasitarias; en el tratamiento de, por ejemplo, la diabetes; en vacunas, por ejemplo para fines profilácticos, y para fines anticonceptivos. Especialmente las actividades biológicas especializadas de estos tipos de fármacos proporcionan ventajas tremendas sobre otros tipos de productos farmacéuticos.

Para ilustrar los rápidos avances, se ha descrito (véase, por ejemplo, oeterboek y Verheggen, Pharm. Weekblad, 130 (1995), 670-675) que, en los Estados Unidos de América, aproximadamente 275 productos biotecnológicos están en estudios de fase IV, mientras que más de 500 productos están en investigación.

Son ejemplos de proteínas (recombinantes) consideradas como muy interesantes desde un punto de vista farmacológico las citokinas, tales como las interleukinas, los interferones, el factor de necrosis tumoral (``TNF''), la insulina, las proteínas para uso en vacunas y las hormonas del crecimiento.

Debido a su naturaleza, las proteínas y los productos proteicos, incluidos los péptidos, a cuyo grupo de productos se hará referencia como fármacos proteicos a partir de ahora, no pueden ser administrados por vía oral. Estos productos tienden a degradarse rápidamente en el tracto gastrointestinal, en particular debido al ambiente ácido y a la presencia de enzimas proteolíticas en el mismo.

Más aún, en gran medida, los fármacos proteicos no son capaces de pasar las barreras endoteliales y epiteliales debido a su tamaño y, en general, a su carácter polar.

Por estas razones, los fármacos proteicos han de ser llevados al istema parenteralmente, por ejemplo por inyección. El perfil farmacológico de estos productos es, sin embargo, tal que la inyección el producto per se requiere una administración frecuente, ya que es un hecho sabido que el material proteico se elimina de la circulación sanguínea en minutos.

En otras palabras, como los fármacos proteicos son química y/o físicamente inestables y tienen, en general, una corta vida medida en el organismo humano o animal, se requieren múltiples inyecciones diarias o infusiones continuas para que el fármaco proteico tenga un efecto terapéutico deseado. Será evidente que esto es un inconveniente para pacientes que necesitan estos fármacos proteicos. Más aún, este tipo de aplicación requiere con frecuencia hospitalización y tiene inconvenientes logísticos.

Además, parece ser que, al menos para ciertas clases de proteínas farmacéuticas, tales como citokinas, las cuales son actualmente empleadas en, por ejemplo, tratamientos para el cáncer, la eficacia terapéutica tiene una fuerte dependencia de una administración efectiva, por ejemplo intra- o peritumoral. En tales casos, los fármacos proteicos deben ser dirigidos a los sitios en los que se necesita su actividad durante un prolongado período de tiempo.

Por ello, se necesitan sistemas de administración que sean capaces de liberación controlada. En la técnica, se han propuesto sistemas de administración consistentes en redes poliméricas en las que se cargan las proteínas y de las que se liberan gradualmente.

Con más detalle, actualmente, se pueden distinguir dos tipos mayores de sistemas de administración poliméricos: polímeros biodegradables e hidrogeles no biodegradables.

Los polímeros biodegradables, por ejemplo el ácido poliláctico (``PLA'') y los copolímeros de PLA con ácido glicólico (``PLGA'') son frecuentemente usados como sistemas de administración para proteínas.

Se pueden incorporar proteínas en sistemas de administración farmacéuticos, por ejemplo microesferas, por una variedad de procedimientos. Tanto in vitro como in vivo, se observa normalmente un perfil de liberación bifásico: una explosión inicial seguido de una liberación más gradual. La explosión está causada por el material proteico presente en la superficie de las microesferas o en su proximidad y por el material proteico presente en los poros. La liberación gradual es atribuida a una combinación de difusión del material proteico a través de la matriz y de degradación de la matriz. Especialmente para proteínas de mayor tamaño, la difusión de estas matrices es insignificante, por lo que la liberación depende de la degradación del polímero. La degradación puede estar influenciada por la composición del (co)polímero. Una estrategia conocida para aumentar la velocidad de degradación del PLA es la copolimerización con ácido glicólico.

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Aunque los sistemas de administración basados en polímeros biodegradables son interesantes, es muy difícil controlar la liberación de la proteína incorporada. Esto dificulta la aplicabilidad de estos sistemas, especialmente para proteínas con una estrecha ventana terapéutica, tales como las citokinas y las hormonas. Más aún, se tienen que usar solventes orgánicos para la encapsulación de la proteína en estos sistemas poliméricos. La exposición de las proteínas a solventes orgánicos conduce generalmente a desnaturalización, que puede afectar a la actividad biológica de la proteína. Más aún, los muy estrictos requerimientos de las autoridades de registro con respecto a posibles trazas de substancias perjudiciales pueden prohibir el uso de tales formulaciones de fármacos terapéuticos en pacientes humanos.

También se utilizan con frecuencia hidrogeles como sistemas de administración para proteínas y péptidos. Los hidrogeles pueden ser obtenidos por entrecruzamiento de un polímero hidrosoluble, que da lugar a una red tridimensional que puede contener grandes cantidades de agua. Las proteínas pueden ser cargadas en el gel añadiendo la proteína al polímero antes de llevar a cabo la reacción de entrecruzamiento o empapando un hidrogel preformado en una solución de proteína. De este modo, no hay que usar solventes orgánicos (agresivos) para cargar los hidrogeles con moléculas de proteínas.

Contrariamente a los polímeros biodegradables, la liberación de proteínas desde los hidrogeles puede ser fácilmente controlada y manipulada variando las características del hidrogel, tales como el contenido acuoso y la densidad de entrecruzamiento del gel. Sin embargo, un inconveniente importante de los sistemas de administración de hidrogel actualmente usados es que no son biodegradables. Esto necesita la eliminación quirúrgica del gel del paciente después de la liberación de la proteína para prevenir las complicaciones de la inclusión del material de hidrogel vacío (con frecuencia se forma tejido dañado).

Se han utilizado hidrogeles biodegradables en la preparación de sistemas de administración para fármacos proteicos. Uno de estos sistemas consiste en dextranos entrecruzados, obtenidos por acoplamiento de metacrilato de glicidilo (``GMA'') con dextrano, seguido de polimerización por radicales de una solución acuosa de dextrano derivatizado con GMA (dex-GMA). En este sentido, se hace referencia a Van Dijk-Wolthuis y col., en Macromolecules, 28 (1995), 6317- 6322, y a De Smedt y col., en Macromolecules, 28 (1995), 5082-5088.

Se pueden encapsular proteínas en los hidrogeles añadiendo proteínas a una solución de dextrano derivatizado con GMA antes de la reacción de entrecruzamiento. Se vio que la liberación de las proteínas fuera de estos hidrogeles depende de, y puede ser controlada por, el grado de entrecruzamiento y el contenido acuoso del gel (Hennink y col., J. Contr. Rel., 39 (1996), 47-57).

Aunque se esperaba que los hidrogeles de dextrano entrecruzados descritos fueran biodegradables, estos hidrogeles son bastante estables en condiciones fisiológicas. Esto está más elaborado en el Ejemplo 5. Se ve, entre otras cosas, que el tiempo de disolución de los hidrogeles de dextrano obtenidos por polimerización de dextrano derivatizado con metacrilato de glicidilo (DS = 4) tenía un tiempo de disolución de aproximadamente 100 días. Los hidrogeles de dextrano donde los dextranos tienen un grado mayor de substitución no mostraron signo alguno de degradación durante 70 días, incluso en condiciones extremas.

El objeto de la presente invención es disponer de un sistema de administración de liberación lenta o controlada que no posea los inconvenientes anteriores y especialmente que no requiera del uso de solventes orgánicos, que no muestre los efectos de explosión indeseados e incontrolables y que no posea un comportamiento de liberación pobremente controlable. La presente invención intenta combinar las ventajas de ambos tipos de sistemas de administración conocidos, viz. un sistema, (bio)degradable en condiciones fisiológicas -química o enzimáticamente- con liberación controlada de fármacos proteicos.

La presente invención proporciona sistemas de administración seguros y fácilmente controlables basados en hidrogeles biodegradables particulares, que aumentan la aplicabilidad de fármacos proteicos para el tratamiento de diversas enfermedades. Los riesgos asociados a estos fármacos, tales como las explosiones en el perfil de liberación y la inconveniencia para el paciente, se reducen, mientras que la eficacia de los tratamientos con el fármaco usando los hidrogeles de la presente invención aumenta.

Más en detalle, la presente invención se relaciona con un hidrogel biodegradable que tiene enlaces que son hidrolizables en condiciones fisiológicas. Los hidrogeles de la presente invención contienen espaciadores hidrolíticamente lábiles, cuyos espaciadores se rompen en los organismos humano o animal. Como se ha indicado antes grosso modo, un hidrogel se define como una red tridimensional hinchada con agua de macromoléculas hidrofílicas entrecruzadas. Más concretamente, los hidrogeles de la invención consisten en dos redes interpenetrantes interconectadas entre sí a través de espaciadores hidrolizables. Los hidrogeles contienen, en general, desde un 20 hasta más de un 99% en peso de agua.

Además, la invención se relaciona con un método para la preparación de un hidrogel, donde se entrecruzan en una solución acuosa macromoléculas, por ejemplo polímeros, que contienen enlaces que son hidrolizables en condiciones fisiológicas.

Según la presente invención, se puede usar todo tipo de hidrogeles biodegradables, siempre que se introduzcan espaciadores hidrolíticamente lábiles en estas estructuras. Cuando se lleva al sistema de un organismo animal o humano, la estructura del hidrogel más o menos se destruye gradualmente. Los productos de degradación no necesitan ser eliminados después de la terapia, sino que pueden ser simplemente metabolizados y/o excretados por el organismo.

Preferiblemente, los hidrogeles se basan en polímeros solubles en agua que contienen al menos un número de grupos laterales que tienen la capacidad de formarligantes con otros polímeros, por ejemplo dextrano o dextranos derivatizados, mientras que también se pueden usar almidones y derivados de almidón, derivados de celulosa tales como hidroxietil- e hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, proteínas, poliaminoácidos, alcohol polivinílico, poliacrilatos, polimetacrilatos, polietilenglicoles que contienen un número de unidades monoméricas capaces de formar cadenas laterales, etc., así como sus copolímeros.

Los hidrogeles de la invención se basan adecuadamente en un polímero entrecruzado con unidades de metacrilato. Otras unidades entrecruzantes son unidades de acrilato, éteres vinílicos y ésteres vinílicos, así como otras unidades conocidas para este fin por la persona experta en la técnica.

En general, se hace que los polímeros hinchables con agua usados en la presente invención sean hidrolizables introduciendo al menos una unidad hidrolíticamente lábil en los espaciadores entre las cadenas principales de polímeros hidrosolubles y la segunda cadena polimérica formada por las unidades entrecruzables, según se ha descrito en el párrafo anterior. Es también posible usar cadenas poliméricas que tienen unidades monoméricas hidrolíticamente lábiles en la cadena principal. Sin embargo, no quedan dentro del alcance de la invención hidrogeles que sólo contienen cadenas poliméricas que están interconectadas cabeza-a-cola sólo por grupos espaciadores hidrolizables. Contrariamente a los hidrogeles según la invención, en los hidrogeles basados en polímeros hinchables que están sólo substituidos con espaciadores lábiles cabeza-a-cola, el grado de entrecruzamiento está directamente relacionado con el contenido acuoso del gel. El sistema polimérico del hidrogel de invención hace posible controlar la liberación del compuesto ajustando el contenido acuoso y/o el grado de entrecruzamiento independientemente.

En una realización preferida, los hidrogeles de la presente invención contienen, como unidades hidrolíticamente lábiles, enlaces éster de lactato y/o carbonato hidrolizables. Estos enlaces pueden ser llevados al hidrogel introduciendo, por ejemplo, residuos de ácido (poli)glicólico y/o ácido (poli)láctico entre la cadena principal del polímero y los grupos entrecruzables de dicho polímero. Mediante el término ácido (poli)glicólico, se entiende ácido glicólico, así como dímeros y oligómeros del mismo. Mediante el término ácido (poli)láctico, se entiende ácido láctico, así como dímeros y oligómeros del mismo. Otras posibilidades para unidades hidrolíticamente lábiles se basan en unidades que introducen ésteres carboxílicos, uretanos, anhídridos, (hemi)acetales, amidas y enlaces peptídicos.

En la realización más preferida de la presente invención, se introducen espaciadores de ácido (poli)glicólico y/o ácido (poli)láctico entre grupos metacrilato polimerizables y dextrano. Cuando se introduce un hidrogel formado de este material en un ambiente fisiológico, el hidrogel se hace biodegradable, dando lugar a dextrano, metacrilato de polihidroxietilo (``PHEMA''), ácido láctico y/o ácido glicólico como productos de degradación. Estos productos de degradación son todos biocompatibles. Se observa que el ácido láctico y el ácido glicólico son compuestos endógenos. El dextrano es un polímero no tóxico que se ha utilizado durante muchos años como expansor del plasma y es aclarado por los riñones dependiendo de su peso molecular. El PHEMA es también un polímero biocompatible conocido probablemente aclarado a través de los riñones.

Los hidrogeles de la presente invención pueden ser adecuadamente preparados sintetizando primeramente espaciadores que contengan al menos un grupo entrecruzable y al menos un grupo hidrolíticamente lábil, acoplando dichos espaciadores con un polímero hidrosoluble y entrecruzando los polímeros obtenidos, preferiblemente en presencia del compuesto que ha de ser liberado.

Los espaciadores preferidos dentro de la presente invención contienen un grupo metacrilato de hidroxietilo (``HEMA''), acoplado con una o más unidades de lactida y/o glicolida, según se ejemplifica en las etapas a y b del esquema 1. Más concretamente, los prepolímeros de ácido poliláctico terminados en HEMA pueden ser sintetizados por polimerización en solución de lactida en tolueno usando HEMA como iniciador y alcóxido de aluminio como catalizador, o por una polimerización en masa de lactida usando HEMA como iniciador y octoato estannoso como catalizador. Dependiendo de la razón HEMA/ácido láctico, se pueden sintetizar prepolímeros que difieren en el peso molecular del bloque de ácido láctico. Se pueden sintetizar de forma análoga copolímeros terminados en HEMA de ácido glicólico y de ácido glicólico-co-ácido láctico. Los prepolímeros pueden ser caracterizados por técnicas conocidas, por ejemplo RMN y espectroscopía de IR, calorimetría de barrido diferencial (``DSC'') y cromatografía de permeación por gel (``GPC''). Para acoplar los prepolímeros de ácido poliláctico y/o ácido glicólico terminados en HEMA con dextrano, se ha de activar el grupo hidroxilo terminal. Preferiblemente, la unión de HEMA al dextrano es efectuada mediante carbonildiimidazol (CDI) como agente acoplante. Sin embargo, también se pueden usar otros métodos de activación. Por ejemplo, la reacción de la función hidroxilo del prepolímero de HEMA-ácido láctico con anhídrido succínico, seguida de activación del grupo carboxílico formado usando métodos establecidos (por ejemplo, activación con diciclohexilcarbodiimida (DCC)). Este último método da derivados de dextrano en donde sólo están presentes enlaces éster hidrolíticamente inestables, que proporcionan diferentes características de degradación en comparación con los derivados de dextrano sintetizados con el método CDI, en donde están presentes tanto enlaces éster como enlaces carbonato.

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Los prepolímeros activados de ácido poliláctico y/o glicólico acabados en HEMA son a continuación acoplados con dextrano en un solvente aprótico adecuado (tal como DMSO) en presencia de un catalizador, por ejemplo, N,N- dimetilaminopiridina (DMAP). El grado de substitución (es decir, el número de moles de prepolímero que contiene grupos metacrilato por 100 moles de unidades de glucosa del dextrano) puede ser adaptado mediante la razón del prepolímero que contiene HEMA al dextrano en la mezcla de reacción.

Se preparan hidrogeles a partir de estos polímeros substituidos, por ejemplo, por una polimerización de radicales de una solución acuosa de dextrano funcionalizado con HEMA-prepolímero usando un sistema iniciador conocido de una amina terciaria y un persulfato (véanse, por ejemplo, los artículos antes citados de Van Dijk-Wolthuis y col., en Macromolecules, 28, y Hennink y col., en J. Contr. Rel., 39. Es también posible usar polimerización por irradiación gamma, con la ventaja de que no se ha de extraer ningún residuo de iniciador y/o catalizador del hidrogel.

El sistema de hidrogel de la presente invención puede ser fácilmente adaptado con respecto a la cinética de liberación de fármacos proteicos, lo que amplía tremendamente la aplicabilidad de los fármacos proteicos. Esto es especialmente importante en el caso de modificadores de la respuesta biológica con una estrecha ventana terapéutica, que son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades en las que está implicado el sistema inmune.

Un grado creciente de substitución (``DS''; cantidad de espaciador hidrolizable que contiene ramas entrecruzables por 100 residuos de polímero hidrosoluble principales; determinable por ^{1}H-RMN) da una red más entrecruzada. Esto da lugar a una menor velocidad de hinchamiento y a un mayor tiempo de disolución del gel.

Los hidrogeles de la presente invención pueden ser preparados de tal forma que se puedan obtener tiempos de disolución de menos de 1 día a aproximadamente 3 meses y más. Esto puede ser, por ejemplo, efectuado variando el contenido de agua inicial en la solución polimérica acuosa que ha de ser entrecruzada y el DS. Los geles con un alto contenido inicial de agua, tales como contenidos acuosos mayores del 85% en peso, predominantemente contienen entrecruzamientos intramoleculares, mientras que contenidos acuosos iniciales menores dan más entrecruzamiento intermolecular. Los geles con menos entrecruzamientos intermoleculares se disuelven más rápido al mismo DS.

Se pueden cargar fármacos en los hidrogeles equilibrando en una solución que contiene fármaco (véase, por ejemplo, Kim y col., en Pharm. Res., 9(3) (1992), 283-290) o incorporando el fármaco durante la preparación del hidrogel (véase, por ejemplo, Heller y col., en Biomaterials, 4 (1983), 262- 266).

La carga por equilibración, sin embargo, conduce normalmente a un contenido bastante bajo de fármaco en el sistema de administración. Éste es especialmente el caso cuando el fármaco es un compuesto macromolecular. A menos que el tamaño de poro del hidrogel sea bastante grande, las macromoléculas sólo se adherirán a la superficie externa, lo que puede dar lugar a una liberación en explosión.

Por lo tanto, preferiblemente, el fármaco es cargado durante la polimerización o el entrecruzamiento.

Como las suspensiones de microesferas son fáciles de preparar y son fácilmente utilizadas para inyección, los hidrogeles serán generalmente aplicados como microesferas de tamaños variables. Las microesferas pueden ser preparadas disolviendo dextrano derivatizado con HEMA en agua, después de lo cual se añade esta solución a una fase oleosa (por ejemplo, aceite de silicona), dando una emulsión de agua-en-aceite. Después de la adición de un sistema iniciador adecuado, los grupos metacrilato se polimerizan, dando microesferas estables.

Los fármacos son liberados de los hidrogeles biodegradables de la presente invención durante la hidrólisis del hidrogel, aunque tiene lugar, al menos en algún grado, la difusión de proteínas desde el hidrogel. Ciertamente, el comportamiento de hidrólisis del hidrogel y el tiempo durante el cual se liberan los compuestos presentes en el sistema de hidrogel pueden ser ajustados entre sí de forma tal que la liberación pueda tener lugar a cualquier nivel entre liberación de primer orden (no hay degradación del hidrogel) y de orden cero (degradación totalmente controlada) (véase, en este sentido, el Ejemplo 6 que se dará más adelante). Esto proporciona una evidente ventaja sobre sistemas de hidrogel que no son hidrolizables en condiciones fisiológicas, sino que son más bien estables, tales como el conocido sistema de hidrogel de dextrano-GMA, o sobre sistemas en los que los polímeros del hidrogel se alargan en una única dimensión.

Los fármacos proteicos se liberan de los hidrogeles más bien estables siguiendo una cinética de primer orden -liberación de proteína proporcional a la raíz cuadrada del tiempo, que es común para los sistemas de administración monolíticos. Los hidrogeles de la presente invención, sin embargo, muestran un comportamiento de liberación más de orden cero -liberación de proteína proporcional al tiempo. Cuando el hidrogel se degrada durante el proceso de liberación, el coeficiente de difusión del fármaco proteico presente en el hidrogel aumenta. Esto da lugar a una liberación más constante en el tiempo.

El sistema de hidrogel de la presente invención ofrece, como se ha dicho, la posibilidad de adecuar los perfiles de liberación de fármacos proteicos encapsulados. Más concretamente, se puede ajustar la velocidad de degradación del hidrogel variando el contenido acuoso del hidrogel, el grado de substitución, el número y la longitud de los grupos hidrolizables de los espaciadores y la elección de espaciadores hidrolizables.

Se ha visto que los espaciadores basados en ácido glicólico tienen una sensibilidad hidrolítica mayor que los espaciadores basados en ácido láctico. Si hay presencia de espaciadores basados en ácido glicólico, se observa una velocidad de degradación acelerada del hidrogel en comparación con los espaciadores basados en ácido láctico.

En los ejemplos que se darán a continuación, se elabora el efecto del contenido acuoso del hidrogel y el grado de substitución de los polímeros de hidrogel.

Además, la velocidad de liberación depende del tamaño de las partículas de hidrogel. Este tamaño puede ser ajustado variando la velocidad de agitación, la viscosidad de la fase externa, etc. durante la preparación de las microesferas.

La velocidad de liberación no depende de la longitud de los polímeros hidrosolubles, al menos no en gran medida. Esto contrasta con los sistemas de hidrogel en los que los grupos hidrolizables están presentes en las cadenas principales del polímero solamente (polímeros alargados en una dimensión).

Como se ha indicado anteriormente, el compuesto liberable puede ser un fármaco proteico. Sin embargo, es también posible encapsular nanopartículas que contienen fármaco, por ejemplo liposomas, iscoms, partículas de ácido poliláctico, partículas de policaprolactona y sistemas de administración de genes conocidos para el experto en la técnica. La encapsulación de estas nanopartículas tiene la ventaja de evitar que se produzca una liberación demasiado rápida del compuesto encapsulado, o, dicho en otras palabras, se pueden evitar los efectos de explosión de un modo más seguro.

Un ejemplo de un sistema de hidrogel cargado de la presente invención es un hidrogel que contiene la citokina interleukina-2 (IL-2). La IL-2 es un fármaco proteico que puede ser, por ejemplo, utilizado en el tratamiento de tipos particulares de cáncer.

Para que la IL-2 sea terapéuticamente efectiva en el tratamiento del cáncer, se requiere la presencia prolongada de IL-2 en el sitio del crecimiento tumoral. Se puede conseguir esto administrando altas dosis de IL-2 por vía intravenosa a travésde frecuentes inyecciones en bolo (véase, por ejemplo, Rosenberg y col., JAMA, 271 (1994), 907-913), por infusión continua prolongada (véase, por ejemplo, West y col., N. Engl. J. Med., 316 (1987), 898-905) o por administración frecuente de bajas dosis de IL-2 intra- o peritumoralmente (véase, por ejemplo, Den Otter y col., Anticancer Res., 13 (1993), 2453-2455).

Un inconveniente mayor de la vía intravenosa es que, para obtener niveles suficientemente altos de IL-2 en el sitio del crecimiento tumoral, hay que administrar intravenosamente dosis tan altas de IL-2 que resulta gravemente tóxica. Por el contrario, la aproximación intra- o peritumoral, desarrollada por Den Otter y col., ha demostrado dar muy buenos resultados y ser virtualmente no tóxica en diversos tumores trasplantados y espontáneos.

Un serio problema para la aplicación de esta forma de terapia en pacientes humanos de cáncer, sin embargo, es que la IL-2 tiene que ser inyectada intra- o peritumoralmente 5 a 10 veces en 1 a 2 semanas. Para muchos tipos de cáncer, esto representa una carga inaceptable para el paciente, como en los casos de carcinoma pulmonar, de cáncer de vejiga y de cáncer gástrico. En los primeros intentos de trasladar el muy efectivo tratamiento local con IL-2 a bajas dosis a la clínica humana del cáncer, hubo que enfrentarse ya con estos problemas logísticos de la administración de IL-2. El sistema de administración de liberación lenta de la presente invención hace posible el uso de inmunoterapias locales con IL-2.

Para la aplicación in vivo, las suspensiones de hidrogel (microesferas) contendrán normalmente hasta 10^{5} U.I. de IL-2 en 0,5 ml, que se liberarán a lo largo de un período de 5 días (es decir, 2x10^{4} U.I. de IL-2 liberadas diariamente). La cantidad de proteína liberada puede ser determinada con métodos sensibles de detección cuantitativa (ensayos de HPLC y ELISA). Para investigar si la IL-2 liberada es aún biológicamente activa y en qué medida (es decir, cuál es el efecto de estos procedimientos químicos sobre la actividad específica de la IL-2), se pueden realizar ensayos de proliferación usando la línea celular CTLL dependiente de IL-2.

La presente invención será ahora explicada con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Para obtener un hidrogel de dextrano, se introdujo primeramente un grupo metacrilato polimerizable en dextrano. Para todas las reacciones descritas a continuación, se usó dextrano de Fluka (T40, M_{n} = 15.000, M_{p} = 32.500 g/mol). Se sintetizaron cuatro derivados diferentes de dextrano (Ejemplos 1-4) en los que se acopló el éster de metacrilato mediante un espaciador con el dextrano. El espaciador contiene diferentes enlaces hidrolizables (éster carbonato y/o carboxílico). El comportamiento de degradación de los geles preparados con estos derivados fue comparado con geles de dextrano derivados de metacrilato de glicidilo (``dex-GMA''). En este compuesto de referencia, el éster metacrilato está directamente acoplado con un grupo hidroxilo del dextrano. Este gel de referencia se degrada con extremada lentitud.

Ejemplo 1 Síntesis de dex-HEMA

Se sintetizó dextrano derivatizado con metacrilato de hidroxietilo (dex-HEMA) acoplando HEMA activado con carbonildiimidazol (CDI) (HEMA-CI) con dextrano.

Se disolvió CDI (1,62 g, 10 mmol) en aproximadamente 10 ml de tetrahidrofurano (THF) anhidro. Se añadió esta solución a una solución de HEMA (1,30 g, 10 mmol) en 5 ml de THF anhidro. Se agitó la mezcla de reacción durante 16 horas a temperatura ambiente. Tras la evaporación del solvente, se obtuvo un líquido ligeramente amarillo (rendimiento, 2,93 g). Se disolvió el producto bruto en acetato de etilo, se extrajo con agua para eliminar el imidazol y el HEMA no reaccionado y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. Después de la filtración, se evaporó el solvente y se obtuvo metacrilato de hidroxietilo casi puro activado con CDI (HEMA-CI). Se confirmó la estructura de este producto por RMN y espectroscopía de IR.

Se añadieron cantidades variables de HEMA-CI (0,73 g, 1,49 ó 2,19 g; 96% puro) a una solución de dextrano (10 g, 62 mmol de unidades de glucosa) y N,N-dimetilaminopiridina (DMAP; 2 g, 16,4 mmol) en sulfóxido de dimetilo (``DMSO'', 90 ml) anhidro. Se agitaron estas mezclas de reacción durante 4 días a temperatura ambiente, después de lo cual se finalizó la reacción por adición de aproximadamente 2 ml de HCl concentrado. Se dializó la mezcla de reacción frente a agua durante 3 días a 4ºC. Se aisló dex-HEMA por liofilización, obteniéndose un material blanco plumoso (rendimiento >90%). Se determinó el grado de substitución del HEMA por espectroscopía de RMN y era de 4, 9 y 13, respectivamente.

Ejemplo 2 Síntesis de dex-SA-HEMA

Se sintetizó dextrano derivatizado con el hemiéster de ácido succínico (``SA'') y HEMA (dex-SA-HEMA) como sigue.

Se disolvieron SA (2,00 g, 20 mmol), HEMA (2,6 g, 20 mmol), trietilamina (TEA, 0,28 ml, 2 mmol) e hidroquinona (inhibidor, \pm10 mg) en aproximadamente 30 ml de THF anhidro. Se agitó la mezcla de reacción durante 2 días a 45ºC, después de lo cual se evaporó el solvente. Se obtuvo un líquido amarillo (rendimiento 4,88 g). Se confirmó la estructura de HEMA-SA por RMN y espectroscopía de IR.

Se disolvieron HEMA-SA (0,99 g (94% puro), 4 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (DCC, 0,83 g, 4 mmol) en aproximadamente 20 ml de DMSO anhidro. Después de 15 minutos, se formó un precipitado (diciclohexilurea, DCU) y se añadió la mezcla a una solución de dextrano (2,57 g, 16 mmol de unidades de glucosa) y TEA (0,56 ml, 4 mmol) en DMSO anhidro (20 ml). Se agitó la mezcla resultante durante 3 días a temperatura ambiente, después de lo cual se añadieron 3 gotas de HCl concentrado para finalizar la reacción. A continuación, se filtró la mezcla de reacción para eliminar la DCU y se dializó durante 3 días a 4ºC. Después de la liofilización, se obtuvo un producto plumoso (rendimiento 2,78 g). Se estableció el grado de substitución por espectroscopía de RMN y éste ascendía a 3.

Ejemplo 3 Síntesis de dex-lactato-HEMA

Se sintetizó dextrano derivatizado con HEMA-oligolactida como sigue según se ilustra en el esquema 1. Se pueden distinguir tres etapas.

a. acoplamiento de lactato a HEMA, obteniéndose HEMA-lactato;

b. activación del HEMA-lactato usando CDI, obteniéndose HEMA-lactato-CI;

c. acoplamiento del HEMA-lactato-CI a dextrano.

Se calentó una mezcla de L-lactida (4,32 g, 30 mmol) y HEMA (3,90 g, 30 mmol) a 110ºC. A continuación, se añadió una cantidad catalítica de octoato estannoso (SnOct_{2}, 121,5 mg, 0,3 mmol) disuelto en aproximadamente 0,5 ml de tolueno. Se agitó la mezcla resultante durante 1 hora. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, se disolvió la mezcla en THF (20 ml). Se dejó caer esta solución en agua (180 ml) y se aisló el precipitado formado por centrifugación. Se recogió la pella en acetato de etilo (40 ml), se centrifugó para eliminar el material sólido, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. Se evaporó el solvente, obteniéndose un aceite viscoso (3,74 g, 45%). Se caracterizó el producto (HEMA-lactato) por espectroscopía de RMN e IR.

Se añadió HEMA-lactato (3,74 g, 10,8 mmol) a una solución de CDI (1,76 g, 10,8 mmol) en THF y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. Se evaporó el solvente a presión reducida, obteniéndose un aceite viscoso. Se usó el producto que contenía HEMA-lactato-CI e imidazol como compuestos mayores (análisis de RMN) sin mayor purificación.

A una solución de dextrano (10 g, 62 mmol de unidades de glucosa) y DMAP (2,0 g, 10,6 mmol), se añadió una cantidad variable de HEMA-lactato-CI (1,61, 3,23 ó 4,84 g, respectivamente, 80% puro). Se agitó esta mezcla durante 4 días a temperatura ambiente, tras de lo cual se finalizó la reacción por adición de aproximadamente 2 ml de HCl concentrado. Se dializaron las soluciones frente a agua durante 2 días. Después de la liofilización, se obtuvieron productos blancos plumosos (rendimiento de alrededor del 85%). El grado de substitución (determinado por espectroscopía de RMN) ascendía a 3, 6 y 10 para los tres productos, respectivamente.

Usando procedimientos similares, se puede variar la longitud del espaciador de lactato cambiando la razón molar de HEMA y lactida en la primera reacción.

Ejemplo 4 Síntesis de dex-glicolida-HEMA

Se sintetizó dex-glicolida-HEMA según el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 3 substituyendo la lactida por glicolida.

Ejemplo de referencia 1

Dex-GMA

Se sintetizó Dex-GMA según describen Van Dijk-Wolthuis y col., Macromolecules, 28 (1995), 6317-6322. Una reinvestigación del derivado de dextrano obtenido reveló que el grupo éster metacrílico está directamente acoplado a uno de los grupos hidroxílicos del dextrano, lo que significa que el espaciador glicerilo no está presente.

Ejemplo 5: Preparación de hidrogeles de dextrano

Se obtuvieron hidrogeles por polimerización de radicales libres de soluciones acuosas de dextrano metacrilado (preparado según los Ejemplos 1-4 y el Ejemplo de referencia 1). Se disolvió dextrano metacrilado (100 mg) en 760 \mul de tampón PBS (fosfato 10 mM, 0,9% NaCl, 0,02% NaN_{3}, pH 7,2). Se añadieron a esta solución 90 \mul de peroxidisulfato de potasio (``KPS'', 50 mg/ml) en el mismo tampón por gramo de solución y se mezcló bien. A continuación, se añadió N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (``TEMED'', 50 \mul, 20% (v/v) en agua, pH ajustado a 7) y se transfirió rápidamente la solución resultante a un tubo Eppendorf y se polimerizó durante 1 hora a temperatura ambiente, obteniéndose un material hidrogel con un contenido inicial de agua de aproximadamente el 90% (p/p) después de la polimerización.

Se retiraron los geles de los tubos, se pesaron con exactitud y se incubaron en PBS a 37ºC. Periódicamente, se determinó el peso de los geles y se usó éste para calcular el grado de hinchamiento (=W_{t}/W_{0}, en donde W_{t} es el peso del gel en el tiempo t y W_{0} es el peso inicial del gel). Se define el tiempo de degradación (disolución) del hidrogel como el tiempo en el cual la razón de hinchamiento = 0 (o W_{t} = 0).

La Figura 1 muestra el comportamiento de hinchamiento de tres hidrogeles de dextrano diferentes (contenido de agua inicial 90%). El dex-GMA (DS = 4) alcanzó un hinchamiento en el equilibrio en 3 días; a continuación, el peso de los geles permaneció constante, lo que indica que no se produjo ninguna hidrólisis significativa de los ésteres de metacrilato. Dex-HEMA y dex-lactato-HEMA mostraron un hinchamiento progresivo en el tiempo hasta que estos geles se disolvieron por completo. Esto demuestra que, en estos sistemas de hidrogel, se había producido hidrólisis de los ésteres de carbonato (dex-(lactato)-HEMA) y/o de los ésteres de lactato (dex-lactato-HEMA).

La Figura 2 muestra el comportamiento de hinchamiento de hidrogeles de dex-lactato-HEMA (contenido inicial de agua 92%) y con grado variable de substitución. Como puede verse, un DS creciente dio lugar a un tiempo de disolución creciente.

La Figura 3 muestra el comportamiento de hinchamiento de hidrogeles de dex-lactato-HEMA con un DS fijo (6) y un contenido de agua inicial variable. Parece que el tiempo de disolución aumenta al aumentar el contenido inicial de agua.

La Figura 4 muestra el comportamiento de hinchamiento de un hidrogel de dex-SA-HEMA (DS 3) y un contenido inicial de agua variable.

Las tablas siguientes dan una visión de los tiempos de disolución de diferentes hidrogeles de dextrano.

Tiempo de disolución (días) de geles de dex-lactato-HEMA
Contenido inicial de agua	DS 10	DS 6	DS 2,5
90%	8-13	4	1-2
80%	16	7-18	3-9
70%	22	10-19	6-10

Tiempo de disolución (días) de geles de dex-HEMA
Contenido inicial de agua	DS 8	DS 17	DS 20
92%	25	42	55
80%	53	100	ND
67%	70	>100	ND

Tiempo de disolución (días) de geles de dex-HEMA-SA
Contenido inicial de agua	DS 3
80%	15
74%	23-28
60%	44

El tiempo de disolución de los hidrogeles de dextrano (contenido inicial de agua 92%) obtenidos por polimerización de dextrano derivatizado con GMA (DS 4) era de aproximadamente 100 días (pH 7,2, 37ºC). Los geles obtenidos por polimerización de dextrano derivatizado con GMA (contenido inicial de agua 80%, DS 11) no mostraron signo alguno de degradación (mayor hinchamiento) durante 70 días, incluso en condiciones extremas (37ºC, pH 12 y pH 1).

Ejemplo 6 Liberación de proteínas por los hidrogeles de dextrano degradantes

Se ha estudiado extensamente la liberación por hidrogeles de dex-GMA no degradantes. Parecía ser que, cuando el diámetro de la proteína era menor que el tamaño de malla del hidrogel, la liberación de la proteína podía ser efectivamente descrita por la teoría del volumen libre. En este caso, la cantidad acumulativa de proteína liberada era proporcional a la raíz cuadrada del tiempo (W.E. Hennink, Controled release of proteins from dextran hydrogels, Journal of Controlled Release, 39 (1996), 47-55).

La Figura 5 muestra la liberación de una proteína modelo (IgG) por hidrogeles de dextrano degradantes (dex-lactato-HEMA, DS 2,5). La liberación de IgG por estos geles degradantes es de orden cero (liberación acumulativa proporcional al tiempo). Esto contrasta con la liberación de proteínas por los hidrogeles de dextrano no degradantes, donde se ha observado una liberación de primer orden.

Claims

1. Un sistema de liberación de fármaco basado en un hidrogel biodegradable que tiene una red de cadenas poliméricas, donde dichas cadenas poliméricas están interconectadas entre sí por espaciadores, donde los espaciadores tienen un motivo entrecruzante, y al menos una unión que es hidrolizable en condiciones fisiológicas, donde dicha al menos una unión hidrolizable en condiciones fisiológicas es seleccionada entre el grupo constituido por un o varios motivos lactato, uno o varios motivos glicolato, uno o varios motivos carbonato, uno o varios motivos succinato, uno o varios motivos éster de ácido carboxílico, uniones uretano, uniones anhídrido, uniones (hemi)acetato, uniones amida, uniones peptídicas y mezclas de dichos motivos y uniones; y un fármaco, donde el fármaco es liberado tras degradación de los espaciadores hidrolíticamente lábiles.

2. El sistema de liberación de fármacos de la reivindicación 1, donde dicho al menos un enlace que es hidrolizable en condiciones fisiológicas es seleccionado entre el grupo consistente en una o más unidades de lactida, una o más unidades de glicolida y mezclas de lactida y glicolida.

3. El sistema de liberación de fármacos de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2, donde las cadenas poliméricas se basan en dextrano o en un dextrano derivatizado.

4. El sistema de liberación de fármacos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la unidad entrecruzante es una unidad de metacrilato.

5.Un método de preparación de un hidrogel consistente en una red de cadenas poliméricas, donde dichas cadenas poliméricas están interconectadas entre sí a través de espaciadores formados por unidades entrecruzadas, donde los espaciadores contienen, entre una cadena polimérica y la unidad entrecruzada, enlaces que son hidrolizables en condiciones fisiológicas, cuyo método consiste en entrecruzar al menos dos unidades entrecruzables en un medio acuoso.

6. El método de la reivindicación 1, donde las cadenas poliméricas se basan en dextrano o en un dextrano derivatizado.

7. El método de la reivindicación 5 ó 6, donde dichos enlaces hidrolizables en condiciones fisiológicas son seleccionados entre el grupo consistente en una o más unidades de lactato, una o más unidades de glicolato, una o más unidades de carbonato, una o más unidades de succinato, una o más unidades de éster de ácido carboxílico, enlaces uretano, enlaces anhídrido, enlaces (hemi)acetal, enlaces amida, enlaces peptídicos y mezclas de dichas unidades y enlaces.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde el fármaco está presente durante la etapa de entrecruzamiento.