ES2198767T3 - Porfirinas sustituidas. - Google Patents
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Abstract
Compuesto de **fórmula** o de la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que cada R es, independientemente, un grupo alquilo C1- C8, y cada P es, independientemente, hidrógeno, NO2, un halógeno, un nitrilo, un grupo vinilo o un grupo formilo; en el que cada R es metilo y cada P es hidrógeno, dicho compuesto, está acomplejado con un metal seleccionado de entre el grupo constituido por hierro, cobre, cobalto, niquel o cinc.
Description
Porfirinas sustituidas.
La presente invención se refiere, en general, a
un procedimiento para modular procesos fisiológicos y patológicos
y, en particular, a un procedimiento de modulación de
concentraciones de oxidantes celulares y, por lo tanto, procesos en
los que participan tales oxidantes. La invención se refiere a
compuestos y composiciones adecuadas para su utilización en dichos
procedimientos.
Los oxidantes se producen como parte del
metabolismo normal de todas las células, pero también son un
componente importante de la patogénesis de muchos procesos
patológicos. Las especies de oxígeno reactivo, por ejemplo, son
elementos críticos de la patogénesis de las enfermedades del
pulmón, del sistema nervioso central y del músculo estriado. Los
radicales libres con oxígeno pueden desempeñar un papel en la
modulación de los efectos del óxido nítrico (NO.). En este
contexto, contribuyen a la patogénesis de los trastornos
vasculares, enfermedades inflamatorias y en el proceso de
envejecimiento.
Se necesita un balance crítico de enzimas
defensoras contra los oxidantes para mantener normales la función
celular y de los órganos. Las superóxido dismutasas (SOD) son una
familia de metaloenzimas que catalizan la transformación intra y
extracelular del O_{2}\cdot en H_{2}O_{2} más O_{2} y
representan la primera línea de defensa contra los efectos
perjudiciales de los radicales superóxido. Los mamíferos producen
tres SOD distintos. Uno es un enzima dímero que contiene cobre y
cinc (CuZn SOD) que se encuentra en el citosol de todas las
células. Un segundo es un enzima tetrámero que contiene manganeso
SOD (Mn SOD) que se encuentra dentro de la mitocondria y el tercero
es un enzima tetrámero, glucosilado que contiene cobre y cinc
(EC-SOD) que se encuentra en los fluidos
extracelulares y está unido a la matriz extracelular. Se sabe que
existen otros enzimas importantes dentro de las células, incluyendo
la catalasa y la glutation peroxidasa. Aunque los fluidos
extracelulares y la matriz extracelular contienen únicamente
pequeñas cantidades de estos enzimas, se sabe también que están
presentes otros conocidos antioxidantes extracelulares, incluyendo
los secuestrantes de radicales y los inhibidores de peroxidación de
los lípidos, tales como ácido ascórbico, ácido úrico y
\alpha-tocoferol (Halliwell et al., Arch.
Biochem. Biophys. 280:1 (1990)).
El documento WO 96/40223 da a conocer un
procedimiento para modular las concentraciones de antioxidantes
intra o extracelulares tales como los radicales de superóxido,
peróxido de hidrógeno y peroxinitrito utilizando antioxidantes de
bajo peso molecular, por ejemplo, miméticos de SOD, catalasa o
peroxidasa. En particular, el documento WO 96/40223 da a conocer
secuestrantes de oxidantes que comprenden grupos macrocíclicos que
contienen nitrógeno.
La presente invención se refiere generalmente a
compuestos de porfirina de bajo peso molecular adecuados para su
utilización en la modulación de los procesos intra o extracelulares
en los que participan radicales superóxido, u otros oxidantes tales
como peróxido de hidrógeno o peroxinitrilo. Los compuestos y
procedimientos según la invención encuentran una aplicación en los
procesos fisiológicos y patológicos en los que desempeña un papel
la tensión oxidativa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de modulación de las concentraciones intra o
extracelulares de oxidantes tales como los radicales superóxido,
peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, peróxidos de lípidos,
radicales hidroxilo y radicales tiilo. Más particularmente, la
invención se refiere a un procedimiento de modulación de procesos
normales o patológicos que implica radicales superóxido, peróxido
de hidrógeno, óxido nítrico o peroxinitrito, utilizando
antioxidantes de bajo peso molecular, y porfirinas sustituidas con
metina (a saber, meso) adecuadas para su utilización en dicho
procedimiento. Es de esperar que también las porfirinas sustituidas
presenten actividad como agentes antibacterianos y antivíricos y
como ionóforos y quimioterapéuticos. Los objetivos y ventajas de la
presente invención se pondrán de manifiesto a partir de la
siguiente descripción.
Figura 1. Mecanismo.
Figura 2. Porfirinas basadas en
meso-tetrakis-N-alquil-piridinio de
manganeso.
Figura 3. Actividad de SOD in vivo (E.
Coli) de 1, 2, 3* y 4* (20 \muM) en medio mínimo (mezcla de
atropoisómeros, JI=cepa con insuficiente SOD, AB=cepa madre).
Figura 4. Estructuras de
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+} (x=1 a
4).
Figura 5. Espectro ^{1}H-RMN
(anillo de porfirina) de
H_{2}Cl_{2a}T-2-PyP en
CDCl_{3} (\delta=7,24 ppm). Los cuatro protones en posición
alfa de los cuatro nitrógenos de piridilo se consideran como
referencia de integración.
Figura 6. Diagrama de energía libre de activación
(\DeltaG^{#}) para la reacción de dismutación de O_{2}^{-}
catalizada por
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+} en función
del cambio de energía libre del estado fundamental
(\DeltaG^{o}) para redox de
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+}.
\DeltaG^{#} y \DeltaG^{o} se calcularon a partir de los
valores k_{cat} y E^{o}_{1/2} descritos en la
Tabla 4 (F, R, h y k_{B} son constantes de Faraday, gas molar,
Planck y Boltzmann, respectivamente).
Los números 0 a 4 corresponden a x en
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+}.
Datos correspondientes para una zona activa de
Cu,Zn-SOD (Ellerby et al., J. Am.Chem. Soc.
118:6556 (1996)).
Figura 7. Se ilustran las estructuras químicas de
las tres clases de antioxidantes. A) Se representa la clase
meso-porfirina en la que: R_{1} es ácido benzoico
(tetrakis-(4-ácido benzoico) porfirina (TBAP)) o un grupo
N-metilo en posición 2 ó 4 del piridil
(tetrakis-(N-metil
piridinio-2(4)-il) porfirina
(TM-2-PyP,
TM-4-PyP)); R_{2} es un hidrógeno
(H) o un bromo (Br, OBTM-4-PyP) y en
el que la porfirina está ligada a un metal de manganeso (Mn),
cobalto (Co), hierro (Fe) o cinc (Zn). B) La clase análogo de
vitamina E está representada por trolox. C) La clase flavonoide
está representada por rutina.
Figura 8. Transcurso del tiempo de la oxidación
de los homogeinizados de cerebro de rata mediada por
hierro/ascor-bato. Se incubaron homogeneizados de
cerebro de rata para varios periodos con FeCl_{2} 0,25 \muM y
ascorbato 1 \muM y se midió la peroxidación de lípidos como
especies reactivas con ácido tio/barbitúrico (TBARS)
espectrofotométricamente a 535 nm (n =3).
Figura 9. Comparación de la capacidad de trolox
(\blacksquare), rutina (\blacktriangle), CuZnSOD bovina
(\bullet), MnOBTM-4-PyP
(\blacktriangledown) y MnTM-2-PyP
(\Diamondblack) para inhibir la oxidación de los homogeinizados
de cerebro de rata mediada por hierro/ascorbato. Se incubaron
homogeneizados de cerebro de rata durante 30 minutos con FeCl_{2}
0,25 \muM y ascorbato 1 \muM y se midió la peroxidación de
lípidos como especies reactivas con ácido tiobarbitúrico. La
cantidad de TBARS formado en 30 minutos se expresó como
peroxidación de lípidos al 100% (n=3-6). Las curvas
sigmoideas de respuesta a la dosis procedían del ajuste de los datos
con un programa de regresión no lineal.
Figura 10. Comparación de la capacidad de los
análogos de TBAP mangánico (\blacktriangle), de cobalto
(\bullet), de hierro (\blacktriangledown) y de cinc
(\blacksquare) para inhibir la oxidación de los homogeinizados de
cerebro de rata mediada por hierro/ascorbato. Se incubaron
homogeneizados de cerebro de rata durante 30 minutos con FeCl_{2}
0,25 \muM y ascorbato 1 \muM y se midió la peroxidación de
lípidos como especies reactivas con ácido tiobarbitúrico. La
cantidad de TBARS formado en 30 minutos se expresó como
peroxidación de lípidos al 100% (n=3-6). Las curvas
sigmoideas de respuesta a la dosis procedían del ajuste de los
datos con un programa de regresión no lineal.
Figura 11. Comparación de la capacidad de los
análogos de TM-4-PyP (cuadrados) y
TM-2-PyP (triángulos) mangánico
(negros), y cinc (blancos) para inhibir la oxidación de los
homogeinizados de cerebro de rata mediada por hierro/ascorbato. Se
incubaron homogeneizados de cerebro de rata durante 30 minutos con
FeCl_{2} 0,25 \muM y ascorbato 1 \muM y se midió la
peroxidación de lípidos como especies reactivas con ácido
tiobarbitúrico. La cantidad de TBARS formado en 30 minutos se
expresó como peroxidación de lípidos al 100%
(n=3-6). Las curvas sigmoideas de respuesta a la
dosis procedían del ajuste de los datos con un programa de
regresión no lineal.
La presente invención se refiere a los
procedimientos de protección contra los efectos perjudiciales de
los oxidantes, particularmente, de los radicales superóxido,
peróxido de hidrógeno y peroxinitrito y a procedimientos para evitar
y tratar las enfermedades y los trastornos que implican o proceden
del estrés oxidante. La invención también se refiere a
procedimientos de modulación de procesos biológicos que implican
oxidantes, incluyendo radicales superóxido, peróxido de hidrógeno,
óxido nítrico y peroxinitrito. La invención se refiere también a
compuestos y composiciones, incluyendo antioxidantes de bajo peso
molecular (p. ej.: miméticos de secuestrantes de especies de oxígeno
reactivo, incluyendo miméticos de SOD, catalasas y peroxidasas) y
formulaciones de los mismos, adecuadas para su utilización en
dichos procedimientos.
Los miméticos de secuestrantes de especies de
oxígeno reactivo apropiados para su utilización en los presentes
procedimientos incluyen porfinas sustituidas con metina (a saber,
meso) o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. La
invención incluye a las porfinas unidas tanto por metal como sin
metal. En al caso de las porfinas unidas por el metal, se prefieren
derivados mangánicos de porfinas (meso) sustituidas con
metina, sin embargo, se pueden también utilizar otros metales
aparte del manganeso, tales como el hierro (II ó III), cobre (I ó
II), cobalto (II ó III) o níquel (I ó II). Se reconocerá que el
metal seleccionado puede presentar varios estados de valencia, por
ejemplo, se puede utilizar manganeso II, III ó V. Se puede utilizar
también cinc (II) aún cuando no experimente cambio de valencia y
por lo tanto no secuestre directamente al superóxido. La selección
del metal puede afectar selectivamente la especie de oxígeno que es
secuestrada. Las porfinas unidas al hierro, por ejemplo, se pueden
utilizar para secuestrar NO- mientras que las porfinas unidas al
manganeso no se pueden utilizar. Estas porfinas unidas al metal
secuestran peroxinitrito; las porfinas unidas a hierro, níquel y
cobalto tienden a presentar la mayor reactividad con
peroxinitrito.
\newpage
Los miméticos preferidos de la invención tienen
la Fórmula I ó II:
o la sal farmacéuticamente aceptable de los
mismos,
en la que R es alquilo
C_{1}-C_{8}, preferentemente, alquilo
C_{1}-C_{4}, más preferentemente, metilo, etilo
o isopropilo, con mayor preferencia metilo. Este mimético puede
estar presente también sin metal o unido a un metal distinto del
Mn. Todos los atropoisómeros de los anteriores están comprendidos
dentro del alcance de la invención, presentes en forma aislada o
como mezcla de dos por lo menos. Los atropoisómeros en los que,por
lo menos 3, preferentemente 4, o los grupos R están por encima del
plano del anillo de porfirina son particularmente ventajosos.
Uno o más de los anillos pirrólicos de la
porfirina de Fórmula I ó II se pueden sustituir en cualquiera o
todos los carbonos beta, es decir, 2, 3, 7, 8, 12, 13, 17 ó 18.
Dichos sustituyentes, denominados P, pueden ser un grupo que cede
electrones, por ejemplo, cada P puede independientemente, ser un
grupo NO_{2}, un halógeno (p. ej.: Cl, Br o F), un nitrilo, un
grupo vinilo o un grupo formilo. Por ejemplo, pueden ser 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7 u 8 sustituyentes de halógeno (p. ej.: Br) (cuando existen
menos de 8 sustituyentes de halógeno, los P restantes son
ventajosamente hidrógeno). Tales sustituyentes alteran el potencial
redox de la porfirina y de este modo aumentan su capacidad para
secuestrar los radicales con oxígeno. Cada P puede ser también,
independientemente, hidrógeno. Cuando P es formilo, se prefiere que
no existan más de 2 (en carbonos no adyacentes), más preferentemente
1, siendo hidrógeno los restantes P. ej.: Cuando P es NO_{2}, es
preferible que no sea más de 4 (en carbonos no adyacentes), más
preferentemente 1 ó 2, siendo hidrógeno los restantes P.
Los miméticos aceptables para su utilización en
los presentes procedimientos se pueden seleccionar analizando la
actividad y la estabilidad de SOD, catalasa y/o peroxidasa. Los
miméticos pueden ser también identificados por su capacidad para
inhibir la peroxidación de los lípidos y midiendo la formación de la
especie reactiva del ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Ohkawa et
al., Anal. Biochem. 95:351 (1979) y Yue et al., J.
Pharmacol. Exp.Ther. 263:92 (1992)). La inactivación selectiva,
reversible y sensible a SOD, de la aconitasa por los conocidos
generadores de O^{-}_{2} se puede utilizar como un marcador de
generación intracelular de O^{-}_{2}. Por lo tanto, se pueden
seleccionar miméticos adecuados analizando su capacidad para
proteger la actividad de la aconitasa.
La actividad de SOD se puede controlar en
presencia y ausencia de EDTA utilizando el procedimiento de McCord
y Fridovich (J. Biol. Chem. 244:6049 (1969)). La eficacia de
un mimético se puede determinar también midiendo el efecto del
mimético sobre el cultivo aerobio de una cepa de E. Coli
completa de SOD frente a una cepa madre que carece de mutaciones
específicas. Específicamente, E. Coli madre (AB1157) y E.
Coli completa de SOD (JI132) se pueden cultivar en medio M9 que
contienen 0,2% aprox. de aminoácidos y 0,2% de glucosa a pH 7,0 y
37ºC; el cultivo se puede controlar en función de la turbidez
seguida a 700 nm. Este análisis se puede hacer más selectivo para
los miméticos de SOD omitiendo del medio los aminoácidos que
contienen cadena ramificada, aromáticos y azufre (medio mínimo de
glucosa (M9), más 5 aminoácidos esenciales) (véase Ejemplo V).
La eficacia de los miméticos activos se puede
también evaluar determinando su capacidad para proteger las células
del mamífero frente a la toxicidad provocada por metilviologen
(paraquat). Particularmente, células L2 cultivadas de rata, tal como
se describe más adelante y sembradas en placas de 24 pocillos se
pueden preincubar en varias concentraciones de mimético de SOD y a
continuación incubar con una concentración de metilviologen
mostrado anteriormente para producir un LC_{75} en las células L2
de referencia. La eficacia del mimético se puede correlacionar con
una disminución de la liberación de LDH provocada por el
metilviologen (St. Clair et al., FEBS Lett. 293:199
(1991)).
La eficacia de los miméticos de SOD se puede
probar in vivo en modelos de ratón y/o rata utilizando tanto
administración de aerosol como inyección parenteral. Por ejemplo,
se pueden colocar al azar ratones Balb/c en 4 grupos de 8 ratones
cada uno para formar un modelo estándar de contingencia
2\times2. Los animales se pueden tratar con paraquat (40 mg/kg,
ip) o con solución salina y ser tratados con mimético de SOD o
control por vehículo. La lesión pulmonar se puede evaluar 48 horas
después del tratamiento con paraquat por análisis de los parámetros
(LDH, proteína y % de PMN) de daño al fluido de lavado
broncoalveolar (BALF) tal como se describió anteriormente (Hampson
et al., Tox. Appl. Pharm. 98:206 (1989); Day et al., J.
Pharm. Methods 24:1 (1990)). Los pulmones de 2 ratones de cada
grupo se pueden fijar por instilación con paraformaldehído al 4% y
procesar su histopatología al microscopio óptico.
La actividad de la catalasa se puede controlar
midiendo la absorbancia a 240 nm en presencia de peróxido de
hidrógeno (véase Beers y Sizer, J. Biol. Chem. 195:133
(1952)) o midiendo la evolución del oxígeno con un electrodo de
oxígeno Clark (Del Río, et al., Anal. Biochem. 80:409
(1977)). La actividad de la peroxidasa se puede medir
espectrofotométricamente como describieron anteriormente Putter y
Becker: Peroxidases. En: Methods of Enzymatic
Analysis, H.U. Bergmeyer (ed.), Verlag Chemie, Weinheim, págs.
286-292 (1983). La actividad de la aconitasa se
puede medir según describieron Gardner y Fridovich (J. Biol.
Chem. 266:19328 (1991)). La capacidad de los miméticos para
inhibir la peroxidación de los lípidos se evalúa tal como describe
Ohkawa et al., Anal. Biochem. 95:351 (1979)) y Yue et
al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 263:92 (1992)).
Se puede probar la toxicidad de los miméticos
activos en cultivos celulares de mamífero midiendo la liberación de
lactato deshidrogenasa (LDH). Particularmente, las células L2 de
rata (una célula semejante al tipo II del pulmón, (Kaighn y
Douglas, J. Cell Biol. 59:160a (1973)) se pueden cultivar en
medio F-12 de Ham con complemento de suero de
ternero fetal al 10% a pH 7,4 y 37ºC; las células se pueden sembrar
a densidades iguales en placas de cultivo de 24 pocillos y
cultivarse a aproximadamente una confluencia del 90% se pueden
añadir miméticos de SOD a las células en dosis log (p. ej.: dosis
micromolares en medio esencial mínimo (MEM) e incubarse durante 24
horas. La toxicidad se puede evaluar por morfología y midiendo la
liberación del marcador de lesión citosólica, LDH (p. ej.: en un
lector de placa termocinético), según describió Vassault (en:
Methods of Enzymatic Analysis, H.U. Bergmeyer (ed.) págs.
118-26 (1983); la oxidación de NADH se mide a 340
nm).
La síntesis de miméticos adecuados para su
utilización en el presente procedimiento se puede efectuar
utilizando protocolos reconocidos en la materia (véase también
Ejemplos I, II, III y IV y Sastry et al., Anal. Chem. 41:857
(1969), Pasternack et al., Biochem. 22:2406 (1983); Richards
et al., Inorg. Chem. 35:1940 (1996) y la solicitud U.S. nº
08/663.028, particularmente los detalles de ésta relacionados con
la síntesis). La separación de los atropoisómeros se puede efectuar
utilizando diversas técnicas.
Una forma de realización específica de la
presente invención se refiere a un procedimiento para regular las
concentraciones de NO\cdot, dirigiendo las porfinas descritas
anteriormente a posiciones estratégicas. NO\cdot es una señal
intracelular y, como tal, NO\cdot debe atravesar la matriz
extracelular para ejercer sus efectos. NO\cdot, sin embargo es muy
sensible a la inactivación mediada por O_{2}^{-} presente en los
espacios extracelulares. Las porfirinas sustituidas por metina
(meso) de la invención pueden aumentar la biodisponibilidad
de NO\cdot evitando su degradación por O_{2}^{-}.
En una forma de realización adicional, los
miméticos de la invención se utilizan como secuestrantes
catalíticos de una especie de oxígeno para proteger contra las
lesiones de isquemia por revascularización asociadas al infarto de
miocardio, apoplejía, traumatismo cerebral agudo, revascularización
del órgano después del trasplante, isquemia intestinal, choque
hemorrágico, infarto pulmonar, oclusión quirúrgica de la
circulación sanguínea y lesión leve del tejido. Los miméticos se
pueden utilizar además para proteger contra la lesión ocular debida
a los rayos solares (y en la piel) además de glaucoma y
degeneración macular en el ojo. Los miméticos también se pueden
utilizar para proteger contra cataratas y/o tratarlas. Los
miméticos también se pueden utilizar para proteger contra cataratas
y/o tratar enfermedades inflamatorias de la piel (p. ej.:
psoriasis). Las enfermedades óseas también son tratables mediante
el tratamiento con miméticos. Además, se puede esperar que los
trastornos del tejido conectivo asociados a defectos en la síntesis
o degradación del colágeno sean susceptibles al tratamiento con los
presentes miméticos, tal como serían las insuficiencias
generalizadas del envejecimiento.
En otra forma de realización todavía, los
miméticos de la invención se pueden utilizar como secuestrantes
catalíticos de especies reactivas de oxígeno para aumentar la
viabilidad de almacenamiento muy limitada de los corazones,
riñones, piel y otros órganos y tejidos trasplantados. La invención
también proporciona procedimientos para inhibir el daño debido a la
autoxidación de las sustancias producidas en la formación de
O_{2}^{-} incluyendo los productos alimenticios, farmacéuticos,
banco de sangre, etc. Para llevar a cabo este fin, los miméticos de
la invención se añaden a productos alimenticios, farmacéuticos,
banco de sangre y similares, en cantidad suficiente para inhibir o
impedir el daño por oxidación y por lo tanto inhibir o impedir la
degradación asociada a las reacciones de autooxidación. (para otras
utilizaciones de los miméticos de la invención, véase la patente
USP nº 5.227.405). La cantidad de mimético a utilizar en un
tratamiento determinado o que está asociada a una sustancia
determinada puede ser determinada por un experto en la materia.
En otra forma de realización todavía, los
miméticos de la invención se pueden utilizar para secuestrar el
peróxido de hidrógeno y proteger de este modo contra la formación
de radicales hidroxilo muy reactivos por interferencia con la
química de Fenton (Aruoma y Halliwell, Biochem. J. 241:273
(1987); Mello Filho et al, Biochem. J. 218:273 (1984); Rush
y Bielski, J. Phys. Chem. 89:5062 (1985)). Los miméticos de
la invención se pueden utilizar también para secuestrar
peroxinitrito, tal como se demostró indirectamente por inhibición de
la oxidación de dihidrorrodamina 123 a rodamina 123 y directamente
acelerando la degradación mediante análisis en flujo
interrumpido.
Ejemplos adicionales de enfermedades/trastornos
específicos apropiados para el tratamiento utilizando los miméticos
de la presente invención incluyen enfermedades del sistema nervioso
central (incluyendo la demencia por SIDA, apoplejía, esclerosis
lateral amiótrofa (ALS), la enfermedad de Parkinson y la enfermedad
de Huntington) y las enfermedades de la musculatura (incluyendo las
enfermedades del diafragma (p. ej.: fatiga respiratoria en el
enfisema, bronquitis y fibrosis quística), fatiga cardíaca e
insuficiencia cardíaca congestiva, síndromes de debilidad muscular
asociadas a miopatías, ALS y esclerosis múltiple). Muchos trastornos
neurológicos (incluyendo la apoplejía, la enfermedad de Huntington,
la enfermedad de Parkinson, ALS, la enfermedad de Alzheimer y la
demencia por SIDA) están asociadas a la sobreestimulación del
subtipo principal del receptor de glutamato, el subtipo NMDA (o
N-metil-D-aspartato).
En la estimulación del receptor de NMDA, las excesivas
concentraciones de calcio neuronal contribuyen a una serie de casos
de membrana y citoplásmicos que conducen a la producción de
radicales libres con oxígeno y óxido nítrico (NO\cdot). Se ha
demostrado que las interacciones entre radicales libres con oxígeno
y NO\cdot contribuyen a la muerte de la célula neuronal. Se han
desarrollado y utilizado modelos de cultivo corticales neuronales de
toxicidad de NMDA bien probados como base para el desarrollo del
fármaco. En estos mismos sistemas, los miméticos de la presente
invención inhiben la lesión provocada por NMDA. La formación de
radicales O^{-}_{2} es una etapa obligada en los casos
intracelulares que culmina en la muerte excitotóxica de las
neuronas corticales y demuestra además que los miméticos de la
invención se pueden utilizar para secuestrar radicales
O^{-}_{2} y sirven, por lo tanto, como protectores frente a la
lesión excitotóxica.
La presente invención se refiere asimismo a
procedimiento para el tratamiento del SIDA. Se utiliza el promotor
B de NfKappa mediante el virus VIH para replicación. Este promotor
es sensible al redox, por consiguiente, un antioxidante puede
regular este proceso. Esto se ha demostrado anteriormente para dos
metaloporfirinas distintas a las de la presente invención (Song
et al., Antiviral Chem. And Chemother. 8:85 (1997)). La
invención también se refiere a procedimientos para tratar artritis,
hipertensión generalizada, aterosclerosis, edema, choque séptico,
hipertensión pulmonar, incluyendo la hipertensión pulmonar
primaria, impotencia, MED, infertilidad, endometriosis,
contracciones uterinas prematuras, infecciones microbianas, gota y
en el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo I y tipo II. Los
miméticos de la invención se pueden utilizar para mejorar los
efectos tóxicos asociados a la endotoxina, por ejemplo, manteniendo
el tono vascular e impidiendo el daño al sistema multiorgánico.
Las inflamaciones, particularmente las
inflamaciones pulmonares, son tratables utilizando la presente
invención (observénse particularmente los trastornos inflamatorios
del asma, ARDS incluyendo la toxicidad por oxígeno, neumonía
(especialmente la neumonía relacionada con el SIDA), fibrosis
quística, sinusitis crónica y enfermedades autoinmunitarias (tal
como la artritis reumatoidea)). EC-SOD se localiza
en los espacios intersticiales que rodean las vías respiratorias y
las células vasculares del músculo liso. EC-SOD y
O_{2}^{-} median el equilibrio
antiinflamatorio-proinflamatorio en el septum
alveolar. El NO\cdot liberado por las células alveolares del
septum actúa para suprimir la inflamación a menos que reaccione con
O_{2}^{-} para formar ONOO^{-}. Al secuestrar el
O_{2}^{-}, EC-SOD desequilibra el equilibrio en
el septum alveolar frente a la inflamación. Se formarán cantidades
significativas de ONOO^{-} únicamente cuando
EC-SOD sea insuficiente o cuando exista una
liberación de O_{2}^{-} muy aumentada. Se pueden utilizar los
miméticos descritos en la presente memoria para proteger contra la
destrucción provocada por la hiperoxia.
La invención se refiere además a procedimientos
para tratar trastornos de la memoria. Se cree que el óxido nítrico
es un neurotransmisor implicado en la potenciación de la memoria a
largo plazo. Utiizando un modelo de ratón expulsado de
EC-SOD (Carlsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92:6264 (1995)), se puede demostrar que el deterioro del
aprendizaje se correlaciona con el secuestro del superóxido
reducido en los espacios extracelulares del cerebro. El secuestro
reducido produce mayores concentraciones de O_{2}^{-}
extracelular. Se cree que el O_{2}^{-} reacciona con el óxido
nítrico impidiendo o inhibiendo de este modo la neurotransmisión
medicada con óxido nítrico y, por lo tanto, la potenciación de la
memoria a largo plazo. Los miméticos de la invención se pueden
utilizar para tratar demencias y trastornos de la memoria y del
aprendizaje.
La disponibilidad de los miméticos de la
invención hace también posibles los estudios de los procesos
mediados por O_{2}^{-}, peróxido de hidrógeno, óxido nítrico y
peroxinitrito.
Los miméticos descritos anteriormente se pueden
formular en composiciones farmacéuticas adecuadas para su
utilización en los presentes procedimientos. Dichas composiciones
incluyen el agente activo (mimético), junto con un vehículo,
excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición
puede estar presente en forma de dosificación unitaria, por
ejemplo, comprimidos, cápsulas o supositorios. La composición
también puede estar en forma de solución estéril adecuada para la
inyección o nebulización. Las composiciones también pueden estar en
forma de solución estéril adecuada para la utilización oftálmica.
La invención también incluye composiciones formuladas para
administración tópica, presentando dichas composiciones la forma de,
por ejemplo, una loción, crema, gel o pomada. La concentración de
agente activo que se ha de incluir en la composición se puede
seleccionar basándose en la naturaleza del agente, del régimen de
dosificación y el resultado pretendido.
La dosis de la composición de la invención que se
ha de administrar se puede determinar sin experimentación indebida
y dependerá de varios factores incluyendo la naturaleza del agente
activo, la vía de administración, el paciente, y los resultados
pretendidos que se han de conseguir. Una dosis adecuada de mimético
a administrar, por ejemplo, por vía intravascular o tópica, se puede
esperar que esté comprendida en el intervalo entre aproximadamente
0,01 y 100 mg/kg/día, preferentemente entre 0,1 y 10 mg/kg/día.
Para una administración con aerosol, se espera que las dosis estén
comprendidas entre 0,01 y 1,0 mg/kg/día. Las dosis adecuadas de
miméticos variarán, por ejemplo, con el mimético y con el resultado
pretendido. Los resultados de Faulkner et al., (J. Biol.
Chem. 269:23471 (1994)) indican que la actividad in vivo
de los miméticos por la oxidorreductasa es tal que una dosis
farmacéuticamente eficaz ha de ser lo bastante baja para evitar los
problemas de toxicidad. Las dosis que se pueden utilizar incluyen
las comprendidas en el intervalo de 1 a 50 mg/kg.
Determinados aspectos de la presente invención se
describirán con mayor detalle en los siguientes Ejemplos no
limitativos.
En los Ejemplos I a V siguientes se utilizaron
los siguientes productos químicos. Las sales de cloruro de los
ligandos orto y meta sin metal
(H_{2}TM-2-PvPCl_{5} y
H_{2}TM-3-PyPCl_{5}) se
adquirieron en MidCentury Chemicals y las sales de toxilato de los
ligandos para sin metal
H_{2}TM-4-PyP(CH_{5}PhSO_{3})_{5})
se adquirieron en Porphyrin Products. Se comprobó la pureza en
función de su análisis elemental y de las propiedades espectrales,
es decir, de las absortividades molares y de la correspondiente
longitud de onda de las bandas de Soret. Las propiedades de la banda
de Soret de los ligandos sin metal fueron
\varepsilon_{413,3nm}=2,16 \times 10^{5}M^{-1} cm^{-1}
(H_{2}TM-2-PyPCl_{4}),
\varepsilon_{416,6nm}=3,18 \times 10^{5}M^{-1} cm^{-1}
(H_{2}TM-3-PyPCl_{4}),
\varepsilon_{422,0nm}=2,35 \times 10^{5}M^{-1} cm^{-1}
(H_{2}TM-4-PyPCl_{4}). El
ligando no metilado sin metal en orto
(H_{2}T-2-PyP) se adquirió en
MidCentury Chemicals y se comprobó la pureza en función de su
análisis elemental (véase más adelante). Yodoetano,
1-yodobutano, cloruro de manganeso anhidro
(MnCl_{2}), MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, cloruro de tetrabutil
amonio (TBA) y hexafluorfosfato de amonio (PF_{6}NH_{4}) se
adquirieron en Aldrich.
Se sintetizaron las porfirinas sin metal
meso-tetrakis-(N-metilpiridinio-2-il)porfirina
(H_{2}T-2-PyP) y
meso-tetrakis-(N-metilpiridinio-3-il)porfirina(H_{2}T-3-PyP)
vía condensación de Rothmund con la utilización de un procedimiento
de Adler modificado (Kalyanasundaram, Inorg. Chem. 23:2453
(1984); Torrens et al., J. Am. Chem. Soc. 94:4160 (1972)).
En 100 ml de solución de ácido propiónico a reflujo se inyectaron
lentamente cantidades equimoleculares de pirrol recién destilado y
piridina-2 o
piridina-3-carboxialdehído y se dejó
la solución a reflujo durante 45 min aproximadamente, después de lo
cual se destiló el ácido propiónico. Se neutralizaron los residuos
negros con NaOH, se lavaron con metanol, se disolvieron en
CH_{2}Cl_{2} (diclorometano) y se cromatografiaron en una
columna de alúmina Woelm neutra preparada con acetona. Después de
la elución de una fracción azul pálido, se eluyó H_{2}TPyP
utilizando CH_{2}Cl_{2} que contenía 5 a 10% de piridina. Se
recogieron cristales púrpura oscuro brillantes procedentes del
eluyente rojo oscuro después de agitación de los solventes en el
rotoevaporador. La metilación de los H_{2}TPyP se realizó
utilizando el exceso del p-toluensulfonato de
metilo en cloroformo a reflujo (Kalyanasundaram, Inorg. Chem.
23:2453 (1984); (Hambright et al., Inorg. Chem. 15:2314
(1976)). Ambas porfirinas alquiladas precipitaron espontáneamente
en las soluciones calientes de cloroformo y se lavaron con éter y
se secaron con aire.
La metalación se realizó en agua a temperatura
ambiente. La proporción de porfirina a metal fue de 1:5 en el caso
de los isómeros meta y orto y 1:14 en el caso del
isómero para. Se añadió MnCl_{2}x 4H_{2}O (Aldrich) a
las porfirinas sin metal acuosas, a continuación se llevó el pH de
la solución a \simpH=10,2. La metalación se completó en una hora
en los casos de los tres isómeros. Para la preparación de los
compuestos orto y meta
MnTM-2-PyP^{5+} y
MnTM-3-PyP^{5+} se disolvieron 300
mg del ligando sin metal,
H_{2}TM-2-PyP^{4+} o
H_{2}TM-3-PyP^{4+}, en 100 ml de
agua, se llevó el pH a 10,2 con varias gotas de NaOH 1 M, seguido de
adición de 340 mg de MnCl_{2}. La metalación se siguió
espectralmente mediante la desaparición de la banda de Soret de
H_{2}TM-2-PyP^{4+} o
H_{2}TM-3-PyP^{4+} a 413,3 nm ó
416,6 nm, respectivamente, y la aparición de las bandas de Soret de
complejos de manganeso a 454,1 nm y 459,8 nm, respectivamente.
El exceso de metal se eliminó como sigue para los
tres isómeros (orto, meta y para) de MnTMPyP^{5+}.
El
\breakMnTMPyP^{5+} se precipitó como sal PF_{6}^{-} añadiendo un exceso de 50 veces de NH_{4}PF_{6}. Se lavó el precipitado con 2-propanol:dietiléter =1:1 y se secó al vacío a temperatura ambiente. Se disolvió a continuación en acetona la sal PF_{6}^{-} anhidra de MnTMPyP^{5-} (370 mg en 100 ml de acetona) y se añadió 1 g de cloruro de tetrabutilamonio. Se lavó el precipitado con acetona y se secó toda la noche al vacío a temperatura ambiente. Se repitió el procedimiento para obtener un compuesto puro. Se realizo el análisis elemental de todos los isómeros metalados. Se analizaron los compuestos desde un punto de vista espectral y se obtuvieron los siguientes datos: las propiedades de las bandas de Soret fueron: \varepsilon_{454,1nm}=12,3 \times 10^{4} cm^{-1} M^{-1} (MnTM-2-PyPCl_{5}), \varepsilon_{459,8nm}=13,3 \times 10^{4} cm^{-1} M^{-1} (MnTM-3-PyPCl_{5}), \varepsilon_{462,2nm}=13,9 \times 10^{4} cm^{-1} M^{-1} (MnTM-4-PyPCl_{5}).
La metalación también se realizó en metanol.
Además, cuando se realizó en agua, la proporción metal:ligando
varió de 1:5, a 1:14 a 1:100. En todas las condiciones, se
obtuvieron las absortividades molares dadas. Los cálculos se
basaron en ligandos sin metal que se analizaron antes de la
metalación. Las absortividades molares de los ligandos sin metal,
además de sus análisis elementales, estuvieron de acuerdo con la
bibliografía.
En la Tabla 1 se presenta el análisis elemental
de MnTM2-PyPCl_{5} y
MnTM-3-PyPCl_{5}
| C* | H* | N* | |
| MnTM2-PyPCl_{5}\cdot6H_{2}O | 52,99 (52,90) | 4,85 (4,64) | 11,22 (11,21) |
| MnTM-3-PyPCl_{5}\cdot3H_{2}O | 55,41 (54,87) | 4,97 (4,40) | 11,10 (11,69) |
| *Obtenido (calc.). |
Se disolvieron 50 mg de
H_{2}T-2-PyP en 30 ml de
dimetilformamida anhidra (DMF) y se agitó y calentó la solución a
100ºC. Se añadieron 20 mg de MnCl_{2} anhidro (20 eq) y se agitó
a solución durante 3 días. Se comprobó la terminación de la
metalación por espectroscopía UV. En la metalación, la temperatura
disminuyó a 60ºC, se añadió 0,65 ml (100 eq) de yodoetano y se agitó
la solución durante 7 días (Perree-Fauvet et
al., Tetrahedron 52:13569 (1996)). Se evaporó la DMF, se
añadieron 10 ml de acetona y se precipitó el producto añadiendo 20
ml de una solución de TBA en acetona (0,45 M); de hecho, al
contrario que la sal de yodo, la sal del cloruro precipita en
acetona. Se purificó el producto utilizando el procedimiento de la
"doble precipitación", tal como se describió anteriormente. Se
secó el producto toda la noche al vacío, sobre P_{2}O_{5}, a
70ºC, dando 125 mg (95%) de un sólido púrpura oscuro. UV
(H_{2}O), \varepsilon_{454,0nm}=1,41 \times 10^{5} M^{-1}
cm^{-1}. Análisis elemental calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{44}Cl_{5}\cdot5H_{2}O:C (54,64), H
(5,16), N (10,62); obtenido: C (54,55), H (5,36), N (10,88).
Se utilizó el mismo procedimiento descrito
anteriormente. Se añadió 0,92 ml (100 eq) de
1-yodobutano y se agitó la mezcla a 100ºC durante 7
días. El secado de la sal del cloruro produjo 70 mg (50%) de un
producto viscoso púrpura oscuro. Se realizó por lo tanto el
análisis elemental en la sal hexafluorfosfato (no viscosa). La sal
de cloro es soluble en agua (no se observaron micelas). UV
(H_{2}O) de la sal cloruro, \varepsilon_{454,0nm}=1,21 \times
10^{5} M^{-1} cm^{-1}. Análisis elemental calculado para
MnC_{56}H_{60}N_{8}P_{5}F_{30}\cdotH_{2}O:C (40,94), H
(3,80), N (6,82); obtenido: C (41,15), H (4,35), N (6,52).
La actividad de superóxido dismutasa de los
miméticos de la invención depende de un número de factores,
incluyendo los factores termodinámicos (p. ej.: el potencial redox
centrado en el metal (véase la Fig. 1)) y factores cinéticos (p.
ej.: facilitacion electrostática). En un análisis enzimático in
vitro de la actividad de SOD (véase McCord y Fridovich (J.
Biol. Chem. 244:6049 (1969)), el compuesto orto "3"
demuestra ser más de un orden de magnitud más activo que el
compuesto para "1" (véase la Fig. 2 (obsérvese también
la Tabla 2 en la que "2" es el compuesto meta y "4"
y "5" son compuestos orto que llevan 4 grupos etilo o 4
grupos butilo, respectivamente)).
La actividad in vivo de los miméticos de
la invención se puede probar en una cepa de E.coli
suprimidos los genes que codifican tanto MnSOD como FeSOD. En este
análisis, se determina la eficacia de un mimético midiendo el
efecto del mimético en el crecimiento aerobio de una capa de E.
coli completa de SOD frente a la cepa madre. Específicamente,
E. Coli madre (AB1157) y E. Coli completa de SOD
(JI132) se cultivan en medio M9 que contiene 0,2% aprox. de
aminoácidos y 0,2% de glucosa a pH 7,0 y 37ºC; el cultivo se
controla en función de la turbidez seguida a 700 nm. Este análisis
se hace más selectivo para los miméticos de SOD omitiendo del medio
los aminoácidos cadena ramificada, que contienen aromáticos y
azufre (medio mínimo de glucosa (M9), más 5 aminoácidos
esenciales). Tal como se muestra en la Fig. 3 el aumento de
actividad por el "efecto orto" se confirmó porque, en
estas condiciones de cultivo, las células completas con SOD
cultivadas en presencia del compuesto "1" no presentan un
aumento de A_{700}, mientras que dichas células cultivadas en
presencia de los compuestos "3" y "4" (además del
"2") sí.
El "efecto orto" también disminuye la
toxicidad. Es bien conocido que las porfirinas, y particularmente
las porfirinas catiónicas, interactúan con ADN y pueden actuar como
escindidores de ADN. Este hecho puede ser una consecuencia de la
utilización de las metaloporfirinas como fármacos antitumorales. Los
presentes miméticos impiden la interacción. Además del aumento de
actividad, la interacción con el ADN de los compuestos meta
"2" y orto "3", disminuyó en gran medida. Esto se
demuestra claramente mediante las mediciones de la actividad de SOD
in vitro en presencia de ADN (véase Tabla 2) y por la
disminución de toxicidad in vivo (E. coli) (véase Fig.
3).
Para maximizar la disminución de la toxicidad
debida a la interacción con el ADN, se han preparado dos derivados
del compuesto orto que llevan cuatro grupos etilo o cuatro
grupos butilo ("4" y "5" respectivamente). El derivado de
etilo "4" fue significativamente menos tóxico que el derivado
de metilo "3" (véase Tabla 2 y Fig. 3). Sin embargo, en
comparación con el derivado etilado "4", el derivado butilado
no muestra una disminución adicional en la toxicidad (véase Tabla
2). Estos datos indican que los grupos orto etilo son suficientes
para inhibir la unión de la porfirina al ADN.
| \Delta_{SB}(nm) | \varepsilon (10^{3}) | E_{1/2}(V) | K_{cat}(M^{-} s^{-1}) | ADN-IC_{50} | |
| 1 | 462,2 | 139 | +0,060 | 3,8 10^{6} | 7,0 10^{-6} |
| 2 | 459,8 | 133 | +0,042 | 4,1 10^{6} | 2,2 10^{-5} |
| 3* | 454,0 | 123 | 4,5 10^{7} | 3,3 10^{-5} | |
| 4* | 454,0 | 141 | 4,5 10^{7} | 6,7 10^{-5} | |
| 5* | 454,0 | 120 | 3,0 10^{7} | 6,7 10^{-5} | |
| Tabla. Parámetros de UV, potencial redox (frente a NHE), actividad como SOD y parámetros de interacción | |||||
| de ADN de 1, 2, 3 y sus atropoisómeros, 4 y 5 (*mezcla de atropoisómeros, \Delta_{SB}=longitud de onda de banda | |||||
| de Soret, \varepsilon=absortividad molecular de la banda de Soret, E_{1/2}=potencial redox centrado en un metal con un | |||||
| electrón, k_{cat}=velocidad constante para la reacción de dismutación del superóxido, ADN-IC_{50}=concentración | |||||
| de ADN para inhibición del 50% de para la reacción de dismutación del superóxido). |
Materiales.
5,19,15,20-Tetrakis-(2-piridil)-porfirina
(H_{2}T-2-PyP) se adquirió en
Mid-Century Chemicals (Posen, IL) (Torrens et
al., J. Am. Chem. Soc. 94:4160 (1972)).
N-clorosuccinimida (NCS), p-toluensulfonato
de etilo (ETS), cloruro de tetrabutilamonio (98%) (TBAC),
hexafluorfosfato de amonio (NH_{4}PF_{6}), cloruro de
manganeso, L-ascorbato de sodio (99%), citocromo
c, xantina, ácido etilendinitrilotetraacético (EDTA),
N,N-dimetilformamida (98,8%, anhidra) y
2-propanol(99,5%)fueron de
Sigma-Aldrich. Etanol absoluto, acetona, etil éter
(anhidro), cloroformo y diclorometano (calidad HPLC) fueron de
Mallinckrodt y se utilizaron sin purificación adicional. La xantina
oxidasa fue suministrada por R.D. Wiley (Waud et al., Arch.
Biochem. Biophys. 19:695 (1975)). Las placas
(Baker-flex silica gel IB) de cromatografía en capa
fina (TLC) fueron de J.T. Baker (Phillipsburg, NJ). Wakogel
C-300 fue de Wako Pure Industry Chemicals, Inc
(Richmond, VA).
Instrumentación. Se registraron espectros
de resonancia magnética nuclear de protones
(^{1}H-RMN) en un espectrómetro Varian Inova 400.
Se registraron espectros ultravisible/visible (UV/VIS) en un
espectrofotómetro Shimadzu modelo UV-260. La
desorción/ionización por láser asistida en la
matriz-tiempo de
recorrido-(MALDI-TOFMS) y la espectrometría de masas
por electroatomización/ionización (ESMS) se realizaron en
espectrómetros de triple cuadrupolo Bruker Proflex III^{TM} y
Fisons Instruments VG Bio-Q, respectivamente.
H_{2}Cl_{1}T-2-PyP.
Se calentaron a reflujo 50 mg (8,1 \times 10^{-5} moles) de
H_{2}T-2-PyP en cloroformo con 43
mg (3,22 \times 10^{-4} moles) de NCS (Ochsenbein et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:348 (1994). La reacción se
siguió por TLC de sílice en fase normal utilizando una mezcla
EtOH/CH_{2}Cl_{2} (5:95) como eluyente. Después de 6 horas de
reacción se lavó una vez la solución con agua destilada. Se evaporó
el cloroformo y se cromatografiaron los productos de la reacción en
100 g de Wakogel C-300 en una columna de 2,5
\times 50 cm utilizando el mismo eluyente. Se purificó de nuevo la
fracción correspondiente a
H_{2}Cl_{1}T-2-PyP utilizando el
mismo sistema, dando 16 mg de un sólido negro púrpura (30%). TLC:
R_{f}=0,47. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 419,6 (5,44), 515,2 (4,21), 590,0 (3,72), 645,8
(3,25). MALDI-TOFMS: m/z=654 (M+H^{+}).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}):
\Delta_{ppm}-2,91 (2H, NH);
7,66-7,74 (m, 4H); 7,99-8,21 (m,
8H); 7,68 (s, 1H); 8,74 (d, 1H, J 6Hz); 8,76 (d, 1H,
J 6Hz); 8,76 (d, 1H, J 6Hz); 8,88 (d, 1H, J
6Hz); 8,90 (d, 1H, J 6Hz); 8,94 (d, 1H, J6Hz);
9,04-9,14 (m, 4H).
H_{2}Cl_{2a}T-2-PyP.
El mismo procedimiento que el descrito anteriormente conduce a
5,3 mg de un sólido negro púrpura (10%). TLC: R_{f}=0,50.
UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{nm} (log\varepsilon) 421,4 (5,38),
517,8 (4,21), 591,4 (3,78), 647,6 (3,51).
MALDI-TOFMS: m/z=688 (M+H^{+}).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \Delta_{ppm} - 2,98 (2H,
NH); 7,66-7,74 (m, 4H); 8,00-8,20
(m, 8H); 8,70 (s, 2H); 8,82 (d, 2H, J 6Hz); 8,91 (d, 2H,
J 6Hz); 9,06-9,14 (m, 4H).
H_{2}Cl_{2b+2c}T-2-PyP.
El mismo procedimiento que el descrito anteriormente conduce a 11
mg de un sólido negro púrpura (20%). TLC: R_{f}=0,53.
UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{nm} (log\varepsilon) 421,4 (5,42),
516,8 (4,25), 593,2 (3,74), 646,2 (3,31).
MALDI-TOFMS: m/z=688 (M+H^{+}).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \Delta_{ppm} - 3,04 (2H,
NH); - 2,84 (1H, NH); - 2,87 (1H, NH); 7,66-7,74
(m, 8H); 7,98-8,20 (m, 16H); 8,59 (s, 1H); 8,61 (s,
1H); 8,73 (d, 2H, J < 2Hz); 8,78 (d, 2H, J 6Hz);
8,87 (d, 2H, J 6Hz); 8,93 (d, 2H, J < 2Hz);
9,02-9,14 (m, 8H).
H_{2}Cl_{3}T-2-PyP.
El mismo procedimiento utilizando 65 mg (4,87 \times 10^{-4}
moles) de NCS, conduce a 8,4 mg de un sólido negro púrpura (14%).
TLC: R_{f}=0,55. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 422,8 (5,37), 519,4 (4,21), 593,8 (3,71), 651,4
(3,37). MALDI-TOFMS: m/z=723 (M+H^{+}).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \Delta_{ppm} -3,08 (1H,
NH); -3,15 (1H, NH); 7,66-7,74 (m, 4H);
8,00-8,18 (m, 8H); 8,56 (s, 1H); 8,72 (d, 1H,
J 6Hz); 8,76 (d, 1H, J 6Hz); 8,82 (d, 1H, J
6Hz); 8,88 (d, 1H, J 6Hz); 9,04-9,14 (m,
4H).
H_{2}Cl_{4}T-2-PyP.
El mismo procedimiento utilizando 65 mg (4,87 \times 10^{-4}
moles) de NCS, conduce a 7,3 mg de un sólido negro púrpura (12%).
TLC: R_{f}=0,58. UV/VIS (CHCl_{3}): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 423,4 (5,33), 520,0 (4,19), 595,6 (3,66), 651,0
(3,33). MALDI-TOFMS: m/z=758 (M+H^{+}).
^{1}H-RMN (CDCl_{3}): \delta_{ppm} -3,14 (2H,
NH); 7,66-7,74 (m, 4H); 7,98-8,16
(m, 8H); 8,74 (d, 4H, J < 2Hz);
9,06-9,12 (m, 4H).
MnTE-2-PyP^{5+}.
Se disolvieron 100 mg (1,62 \times 10^{-4} moles) de
H_{2}T-2-PyP en 5 ml de DMF
(anhidra) caliente, se añadieron 5,5 ml (3,22 \times 10^{-2}
moles) de p-toluensulfonato de etilo (ETS) en
agitación a 90ºC y se dejó reaccionar durante 24 a 48 horas. La
ejecución de la tera-N-etilación se siguió mediante TLC en
sílice en fase normal utilizando una mezcla
KNO_{3sat}/H_{2}O/CH_{3}CN (1:1:8) como eluyente
(Batinic-Haberle et al., J. Biol. Chem.
273:24521 (1998)). Durante la ejecución de la reacción, se eliminó
al vacío la DMF y se añadieron a continuación 5 ml de acetona. A
esta solución, se añadió gota a gota una solución concentrada de
cloruro de tetrabutilamonio (TBAC) en acetona (\sim1g/10 ml de
acetona) en agitación hasta que se terminó la precipitación del
cloruro. El sólido púrpura resultante se disolvió en 10 ml de agua,
el pH de la solución se subió a 12 con NaOH y se añadió 640 mg de
MnCl_{2}\cdot4H_{2}O (3,23 \times 10^{-3} moles)
(Batinic-Haberle et al., J. Biol. Chem.
273:24521 (1998). A la terminación de la metalación, se redujo el
pH entre 4 y 7 para facilitar la autooxidación de Mn (II) a Mn
(III) y el exceso de metal se eliminó como sigue. Se filtró la
solución y se añadió una solución acuosa concentrada de
NH_{4}PF_{6} para precipitar la metaloporfirina como sal de
PF_{6}^{-} (Batinic-Haberle et al., Arch.
Biochem. Biophy. 343:225 (1997); Richards et al., Inorg.
Chem. 35:1940 (1996)). Se lavó intensamente el precipitado con
una mezcla de 2-propano/etil éter (1:1), se secó al
vacío a temperatura ambiente. Se lavó a continuación en acetona el
sólido resultante y se añadió una solución concentrada de TBAC para
aislar la metaloporfirina en forma de su sal cloruro. Se lavó el
precipitado intensamente con acetona y se secó al vacío a
temperatura ambiente dando 150 mg de un sólido negro rojizo (95%).
TLC: R_{f}=0,18. UV/VIS (H_{2}O): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 364,0 (4,64), 453,8 (5,14), 558,6 (4,05). ESMS:
m/z=157,4 (M^{5+}/5). Análisis calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{44}Cl_{5}\cdot5H_{2}O: C. 54,64; H.
5,16; N. 10,62; obtenido: C. 54,55; H. 5,40; N. 10,39. (Véase Fig. 4
para las estructuras del compuesto).
MnCl_{1}TE-2-PyP^{5+}.
El mismo procedimiento que el descrito anteriormente partiendo de
10 mg (1,53 \times 10^{-5} moles) de
H_{2}Cl_{1}T-2-PyP y 0,5 ml
(2,94 \times 10^{-3} moles) de ETS en 1 ml de DMF. TLC:
R_{f}=0,20. UV/VIS (H_{2}O): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 365,6 (4,63), 455,6 (5,13), 560,6 (4,02). ESMS:
m/z=164,3 (M^{5+}/5). Análisis calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{43}Cl_{6}\cdot5H_{2}O: C. 52,91; H.
4,90; N. 10,28. Obtenido: C. 52,59; H. 5,28; N. 10,14.
MnCl_{2a}TE-2-PyP^{5+}.
El mismo procedimiento partiendo de 5 mg (7,28 \times 10^{-6}
moles) de H_{2}Cl_{2a}T-2-PyP y
0,25 ml (147 \times 10^{-3} moles) de ETS conduce a 7,5 mg de
un sólido negro rojizo (95%). TLC: R_{f}=0,21. UV/VIS
(H_{2}O): \lambda_{nm} (log\varepsilon) 365,8 (4,58), 456,4
(5,05), 562,2 (4,00). ESMS: m/z=171,1 (M^{5+}/5). Análisis
calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{42}Cl_{7}\cdot
\break6H_{2}O: C. 50,48; H. 4,77; N. 9,81. Obtenido: C. 50,08, H. 4,60; N. 10,01.
MnCl_{2b+2c}TE-2-PyP^{5+}.
El mismo procedimiento partiendo de 5 mg (7,28 \times 10^{-6}
moles) de
H_{2}Cl_{2b+2c}T-2-PyP, conduce
a 7,5 mg de un sólido negro rojizo (95%). TLC: R_{f}=0,22.
UV/VIS (H_{2}O): \lambda_{nm} (log\varepsilon) 365,2 (4,63),
457,4 (5,08), 462,2 (4,06). ESMS: m/z=171,1 (M^{5+}/5).
Análisis calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{42}Cl_{7}\cdot5H_{2}O: C. 51,29; H.
4,66; N. 9,97. Obtenido: C. 51,31; H. 5,19; N. 9,68.
MnCl_{3}Th-2-PyP^{5+}.
El mismo procedimiento partiendo de 5 mg (6,93 \times 10^{-6}
moles) de H_{2}Cl_{3}T-2-PyP,
conduce a 7,5 mg de un sólido marrón negruzco (95%). TLC:
R_{f}=0,23. UV/VIS (H_{2}O): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 364,8 (4,58), 458,0 (4,98), 466,4 (4,00). ESMS:
m/z=178,1 (M^{5+}/5). Análisis calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{41}Cl_{8}\cdot6H_{2}O: C. 49,00; H.
4,54; N. 9,52. Obtenido: C. 48,40; H. 4,26; N. 9,59.
MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+}.
El mismo procedimiento partiendo de 5 mg (6,61 \times 10^{-6}
moles) de H_{2}Cl_{4}T-2-PyP,
conduce a 7,5 mg de un sólido marrón negruzco (95%). TLC:
R_{f}=0,24. UV/VIS (H_{2}O): \lambda_{nm}
(log\varepsilon) 365,8 (4,52), 459,2 (4,90), 567,0 (3,96). ESMS:
m/z=184,9 (M^{5+}/5). Análisis calculado para
MnC_{48}N_{8}H_{40}Cl_{9}\cdot5H_{2}O: C. 48,33; H.
4,22; N. 9,39. Obtenido: C. 48,38; H. 4,45; N. 9,53.
Electroquímica. Se realizó la
caracterización electroquímica, tal como se describió
anteriormente, en un analizador voltamétrico modelo 600 (CH
instrument) utilizando un electrodo de carbono vítreo (electrodo de
referencia Ag/AgCl y auxiliar de Pt), en porfirina 0,5 mM, pH 7,8
(tampón de fosfato 0,05 M), NaCl 0,1 M. Se estandarizaron los
potenciales frente al par ferricianuro de potasio/ferrocianuro de
potasio (Batinic-Haberle et al., Arch. Biochem.
Biophys. 343:225 (1997); Kolthof et al., J. Phys. Chem.
39:945 (1974)).
Actividad de dismutación del superóxido.
Se midieron las actividades de tipo SOD utilizando el sistema
xantina/xantina oxidasa como fuente de O_{2}^{-} y
ferrifitocromo c como secuestrante indicador (McCord et
al. (J. Biol. Chem. 244:6049 (1969)). Se produjo
O_{2}^{-} a la velocidad de 1,2 \muM por minuto y se continuó
la reducción de ferricitocromo c a 550 nm. Los análisis se
realizaron en presencia de EDTA 0,1 mM en tampón de fosfato 0,05 M
(pH 7,8). Las constantes de velocidad para la reacción de los
compuestos se basaron en la competencia con citocromo c 10
\muM, k_{cyt}=2,6 \times 10^{5} M^{-1}s^{-1}
(Butler et al., J. Biol. Chem. 257:10747 (1982)). Todas las
mediciones se hicieron a 25ºC. La concentración de citocromo
c fue por lo menos 10^{3} veces mayor que las
concentraciones de los mímicos de SOD y las velocidades fueron
lineales durante por lo menos dos minutos, durante los cuales los
compuestos interceptaron \sim100 equivalentes de O_{2}^{-},
confirmando de este modo la naturaleza catalítica de la dismutación
de O_{2}^{-} en presencia de los mímicos.
A pesar del conocimiento creciente sobre la
purificación de las porfilinas solubles en agua, la separación de
las porfilinas halogenadas sin cargar seguida de
N-alquilación y metalación todavía parece más fácil para la
preparación con éxito de
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+} (Esquema
A) (Richards et al., Inorg. Chem. 35:1940 (1996); Kaufman
et al., Inorg. Chem. 34:5073 (1995)):
Esquema
A
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ NCS/CHCl _{3} \+ \+ 1) ETS/DMF\+\cr
H _{2} T-2-PyP \+ ------------->
\+ H _{2} Cl _{x} T-2-PyP \+
---------------> \+
MnCl _{x} T-2-EPyP ^{5+} \cr \+ \+
\+ 2)
MnCl _{2} /H _{2} O\+\cr}
Síntesis de derivados
\beta-clorados de
H_{2}T-2-PyP. Se realizó la
\beta-cloración de
H_{2}T-2-PyP según se describe en
la bibliografía para los análogos de H_{2}TPP, utilizando
N-clorosuccinimida (NCS) en cloroformo en condiciones de
reflujo (Ochsenbein et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
33:348 (1994)). El número de equivalentes de NCS utilizados puede
ser 4 ó 6, dependiendo del grado de sustitución deseado (Tabla 3).
La reacción se puede seguir por TLC (gel de sílice) utilizando una
mezcla de etanol/diclorometano (5:95) como eluyente (Tabla 3 y
Esquema B).
| H_{2}Cl_{x}T-2-PyP (x=1 a 4): R_{t}, datos de banda de Soret y rendimientos con | ||||
| 4 y 6 equivalentes de NCS | ||||
| Porfirina | R_{f}^{a} | \lambda_{nm} (\varepsilon/10^{5} M^{-1} | Rendimiento (%)^{c} | |
| cm^{-1})^{b} | 4 eq | 6 eq | ||
| H_{2}T-2-PyP | 0,43 | 418,4 | ||
| \beta-Cl_{1} | 0,47 | 419,6 (2,74) | 30 | - |
| \beta-Cl_{2a} | 0,50 | 421,4 (2,39) | 10 | 5 |
| \beta-Cl_{2b-2c} | 0,53 | 421,4 (2,62) | 20 | 10 |
| \beta-Cl_{3} | 0,55 | 422,8 (2,33) | 10 | 15 |
| \beta-Cl_{4} | 0,58 | 423,6 (2,13) | 7 | 12 |
| ^{a}TLC en sílice con EtOH/CH_{2}Cl_{2} (5:95) como eluyente. | ||||
| ^{b}en CHCl_{3} (los errores estimados para \epsilon están comprendidos dentro del 10%). | ||||
| ^{c}en CHCl_{3} a reflujo durante 6 horas (c \sim2 \muM). |
Esquema
B
Cada compuesto se purificó por cromatografía en
gel de sílice (Wakogel C-300) utilizando el mismo
eluyente. Se identificaron las estructuras de los principales
isómeros por espectrometría de masas y espectroscopías UV/VIS y
^{1}H-RMN (Tabla 3 y Esquema B). El cambio
batocrómico de la banda de Soret para el cloro en
H_{2}T-2-PyP fue solamente de 1,3
nm comparado con 3,5 nm descrito anteriormente para los derivados
de H_{2}TPP (Tabla 3) (Hoffmann et al., Bull. Soc. Chem.
Fr. 129:85 (1992); Chorghade et al., Synthesis 1320
(1996); Wijesekera et al., Bull. Chem. Fr. 133:765 (1996)).
Únicamente uno de los tres regioisómeros diclorados (derivado
\beta-Cl_{2a}) se purificó por cromatografía
sobre gel de sílice. Sus otros dos regioisómeros (derivados
\beta-Cl_{2b} y
\beta-Cl_{2c}) presentaron el mismo
R_{f}. Al principio los resultados demostraron que la
purificación de H_{2}Br_{x}
T-4-PyP (x=1 a 4) es más difícil. De
hecho, utilizando el mismo sistema de TLC, ambos derivados de
\beta-Br_{1} y \beta-Br_{2a}
tienen el mismo R_{f} y no se observó ninguna diferencia de
R_{f} entre los derivados de
\beta-Br_{2b},
\beta-Br_{2c}, \beta-Br_{3}
y \beta-Br_{4}, mostrando claramente que, en
este caso, R_{f} depende del número de pirroles
sustituidos y no sutituidos en el número de protones \beta
sustituidos.
Identificación por ^{1}H-RMN
de derivados \beta-clorados de
H_{2}T-2-PyP. La
^{1}H-RMN permitió la identificación de los
productos de la reacción de sustitución (Tabla 4 y Fig. 5). Tal
como se describe en la bibliografía para los análogos de H_{2}
TPP, el principal regioisómero de
H_{2}Cl_{4}T-2-PyP tiene cloros
en las posiciones 7, 8, 17 y 18. De hecho, su espectro de
^{1}H-RMN presenta un singlete aparente (doblete
con J menor de 2Hz), correspondiente a 4
\beta-protones químicamente equivalentes
emparejados con los dos protones pirrólicos que han perdido su
deslocalización (Crossley et al., J. Chem. Soc., Chem. Common
. 1564 (1991). No obstante, se identificó otra fracción polar
inferior (R_{f}=0,60) según su espectro de masas,
como mezcla de otros tetraclororegioisómeros (espectro
^{1}H-RMN inapreciable), que representa
aproximadamente el 50% en peso de ambas fracciones
\beta-Cl_{4} y que demuestra que la
\beta-sustitución es sólo parcialmente
regioselectiva. Según el espectro ^{1}H-RMN de la
correspondiente fracción H_{2}Cl_{3}
T-2-PyP^{5+}, no se ponen de
manifiesto otros regioisómeros. El espectro presenta un singlete
correspondiente al protón \beta del pirrol monosustituido y
cuatro dobletes correspondientes a los cuatro protones \beta de
los dos pirroles no sustituidos. Además, la asimetría de este
compuesto conduce a una diferenciación de los dos protones de NH.
Según los rendimientos y los espectros ^{1}H-RMN
de H_{2}Cl_{2a}T-2-PyP (Fig. 5)
y H_{2}Cl_{2b+2c}T-2-PyP, no se
observó ningún regioisómero \beta-Cl_{2}
predominante. Por último, el espectro de
H_{2}Cl_{1}T-2-PyP muestra un
singlete y seis dobletes, pero únicamente una señal de NH,
sugiriendo que en este caso la asimetría es demasiado débil para la
diferenciación de los dos protones de NH.
| H_{2}Cl_{x}T-2-PyP (x=1 a 4): datos de ^{1}H-RMN (anillo de porfirina) en CDCl_{3} | ||
| \delta_{ppm} (mult., Hz)^{a} | ||
| H_{2}Cl_{1}T-2-PyP | NH | -2,91 (2H) |
| CH | 7,68 (s, 1H) | |
| 8,74 (d, 1H, 5,5) | ||
| 8,76 (d, 1H, 5,5) | ||
| 8,76 (d, 1H, 6,0) | ||
| 8,88 (d, 1H, 6,0) | ||
| 8,90 (d, 1H, 6,0) | ||
| 8,94 (d, 1H, 6,0) | ||
| H_{2}Cl_{2a}T-2-PyP | NH | -2,98 (2H) |
| CH | 8,70 (s, 2H) | |
| 8,82 (d, 2H, 6,0) | ||
| 8,91 (d, 2H, 6,0) | ||
| H_{2}Cl_{2b}T-2-PyP | NH | -3,04 (2H) |
| CH | 8,59 (s, 2H) | |
| 8,78 (d, 2H, 6,0) | ||
| 8,87 (d, 2H, 6,0) | ||
| H_{2}Cl_{2c}T-2-PyP^{b} | NH | -2,84 (1H) |
| -2,87 (1H) | ||
| CH | 8,61 (s, 2H) | |
| 8,73 (d, 2H, <2,0) | ||
| 8,93 (d, 2H, <2,0) | ||
| H_{2}Cl_{3}T-2-PyP | NH | -3,08 (1H) |
| -3,15 (1H) |
| H_{2}Cl_{x}T-2-PyP (x=1 a 4): datos de ^{1}H-RMN (anillo de porfirina) en CDCl_{3} | ||
| \delta_{ppm} (mult., Hz)^{a} | ||
| CH | 8,56 (s, 1H) | |
| 8,72 (d, 1H, 6,5) | ||
| 8,76 (d, 1H, 6,5) | ||
| 8,82 (d, 1H, 6,5) | ||
| 8,88 (d, 1H, 6,5) | ||
| H_{2}Cl_{4}T-2-PyP | NH | -3,14 (2H) |
| CH | 8,74 (d, 4H, <2,0) | |
| ^{a}cambios químicos expresados en ppm en relación con TMS por ajuste de CDCl_{3} | ||
| =7,24 ppm. | ||
| ^{b}un espectro para la mezcla de los dos regioisómeros (\simrelación 1:1). |
N-etilación y metalación. La
N-etilación de H_{2}T-2-PyP
se realizó eficazmente utilizando p-toluensulfonato de
etilo, sulfato de dietilo o yodoetano como reactivos, pero la
elevada toxicidad del sulfato de dietilo y la baja reactividad
del yodoetano hace que el p-toluensulfonato de etilo (ETS)
sea la mejor elección (Chen et al., J. Electroanal. Chem.
280:189 (1990); Kalyamasundaram, Inorg. Chem. 23:2453
(1984); Hambright et al., Inorg. Chem. 15:1314 (1976); Alder
et al., Chem. Brit. 14:324 (1978);
Perree-Fauvet et al., 52:13569 (1996)).
Algunos autores prefieren realizar la N-alquilación después
de la metalación para proteger los nitrógenos del pirrol
(Perree-Fauvet et al., Tetrahedron 52:13569
(1996)). Sin embargo, con el tratamiento directo de los presentes
ligandos libres, no se observó ninguna N-etilación de los
nitrógenos del pirrol (la metalación posterior en solución acuosa
fue completa). La ejecución de la etilación además de la metalación
se puede seguir mediante TLC (sílice normal) utilizando un eluyente
muy polar, una mezcla de una solución acuosa saturada de nitrato de
potasio con acetonitrilo (Batinic-Haberle et al.,
J. Biol. Chem. 273:24521 (1998)). Los rendimientos de esta
etapa (N-etilación y metalación) fueron casi del 100%
(aproximadamente 5% de pérdida durante el proceso de purificación).
Ya que la N-etilación (o la N-metilación) limita la
rotación libre de los anillos de piridinio, cada compuesto es, de
hecho, una mezcla de cuatro atropoisómeros y se puede considerar una
purificación posterior de cada atropoisómero (Kaufmann et al.,
Inorg. Chem. 34:5073 (1995)). Todas las porfirinas de manganeso
preparadas tienen metal en el estado 3+ como se demostró por el
cambio hipsocrómico de 20 nm de la banda de Soret (junto con la
pérdida de desdoblamiento) en el momento de la reducción del centro
del metal por el ácido ascórbico.
Electroquímica. El comportamiento redox
centrado en el metal de todos los productos de metaloporfirina fue
reversible. Los potenciales de onda media (E^{0}_{1/2}) se
calcularon como la media de los picos catódicos y anódicos y se dan
en mV frente a NHE (Tabla 5). El cambio medio por cloro es de +55 mV
(Tabla 5), que está de acuerdo con los valores descritos
anteriormente para los derivados de H_{2}TPP (entre +50 y +70 mV)
(Sen et al., Chem. Soc. Faraday Trans. 93:4281 (1997); Autret
et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans. 2793 (1996); Hariprasad
et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans. 3429 (1996); Tagliatesta
et al., Inorg. Chem. 35:5570 (1996); Ghosh, J. Am. Chem.
Soc. 117:4691 (1995); Takeuchi et al., J. Am. Chem. Soc.
116:9730 (1994); Binstead et al., Inorg. Chem. 30:1259
(1991); Giraudeau et al., J. Am.Chem. Soc. 101:3857 (1979)).
Este cambio parece ser mayor (\sim+65 mV) entre 0 y 1, entre 2 y
3 cloros (Tabla 5). Los valores de E^{0}_{1/2} de
\beta-Cl_{2a} y la mezcla
\beta-Cl_{2b+2c} no fueron significativamente
diferentes. El estado redox del manganeso de
MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+}
(E^{0}_{1/2}=+448 mV) y MnOBTMPyP^{4+}
(E^{0}_{1/2}=+480 mV) es 3+ y 2+, respectivamente. Esta
diferencia se puede explicar por su diferencia desde el punto de
vista del potencial redox (\sim30 mV) pero también por
consideraciones estructurales, por ejemplo, un aumento de
distorsión del anillo de porfirina en el caso de MnOBTMPyP^{4+}.
Batinic-Haberle et al., Arch. Biochem.
Biophys. 343:225 (1997); (Ochsenbein et al., Angew. Chew.
Int. Ed. Engl. 33:348 (1994).
| MnCl_{x}TE-2-PyP^{5-} (x=1 a 4): datos de la banda Soret, potenciales redox y actividades de SOD | ||||
| Mn-porfirina | \lambda_{nm} (\varepsilon/10^{4} M^{-1} | E'_{1/2}(\Delta)^{b} | IC_{50}/10^{-9} M^{c} | k_{cat}/10^{7} M^{-1}s^{-1} |
| cm^{-1})^{a} | ||||
| MnTE-2-PyP^{5-} | 453,8 (14,0) | +228 (71) | 45 | 5,7 |
| \beta-Cl_{1} | 455,6 (12,5) | +293 (65) | 25 | 10 |
| \beta-Cl_{2a} | 456,4 (10,6) | +342 (70) | 20 | 13 |
| \beta-Cl_{2b-2c} | 457,4 (11,2) | +344 (65) | 20 | 13 |
| \beta-Cl_{3} | 458,0 (9,5) | +408 (67) | 10 | 26 |
| \beta-Cl_{4} | 459,2 (8,0) | +448 (79) | 6,5 | 40 |
| MnTM-4-PyP^{5-} | +060 | 0,4 | ||
| MnTM-2-PyP^{5-} | +220 | 6,0 | ||
| MnOBTMPyP^{4-} | +480 | 22 | ||
| Cu.ZnSOD | +260 | 200 | ||
| ^{a}en H_{2}O (los errores estimados para \varepsilon están comprendidos dentro del 10%). | ||||
| ^{b}mV frente a NHE, con errores estimados de 5 mV (\Delta=separación pico a pico) y en las siguientes | ||||
| condiciones: porfirina 0,5 mM, NaCl 0,1 M, tampón de fosfato 0,05 M (pH 7,8). | ||||
| ^{c}concentración que produce inhibición del 50% de la reducción del citocromo c por O_{2}^{-} | ||||
| (los errores estimados están dentro del 10%). |
Actividades de dismutación del superóxido.
Se midieron las actividades de tipo SOD tal como se describió
anteriormente, basadas en la competencia con citocromo c
(McCord et al. (J. Biol. Chem. 244:6049 (1969)). Las
actividades de tipo SOD de
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5-} se
describen en la Tabla 5, IC_{50} (M) que representa la
concentración de una unidad de actividad (o la concentración que
produce el 50% de inhibición de la reducción de citocromo c
por O_{2}^{-}) y k_{cat} (M^{-1}s^{-1}) que
representa la constante de velocidad para la reacción de
dismutación del superóxido. La actividad de tipo SOD por mol de
MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+} es
aproximadamente 2, 7 y 100 veces mayor que la de MnOBTMPyP^{4+}
MnTM-2-PyP^{5+} y
MnTM-4-PyP^{5+}, respectivamente
(Faulkner et al., J. Biol. Chem. 269:23471 (1994);
Batinic-Haberle et al., Arch. Biochem.
Biophys. 343:225 (1997); Batinic-Haberle et
al., J. Biol. Chem. 273:24521 (1998)). La actividad de tipo SOD
de MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+}
representa el 20% de la actividad de la enzima Cu,
Zn-SOD en base molar (40% por zona activa
considerando que la enzima presenta dos zonas activas)
(Klug-Roth et al., J. Am. Chem. Soc. 95:2786
(1973)).
Prueba de estabilidad. Cada grado de
clonación adicional aumenta el potencial redox que se espera que se
siga por el aumento de los valores de pKa de los nitrógenos del
pirrol, tal como se encuentra en la serie de porfirinas
meso-fenil y meso-piridil sustituida además de en las
\beta-sustituidas (Worthington et al., Inorg.
Nucl. Chem. Lett. 16:441 (1980); Kadish et al., Inorg.
Chem. 15:980 (1976)). El pKa, como medida de la estabilidad del
protón con el ligando, es a su vez también una medida de la
estabilidad del ligando con el metal. Por lo tanto, es de esperar
que el compuesto de tetracloro tenga una estabilidad disminuida
comparada con la menor de los análogos clorados. Se probó la
estabilidad de
MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+} midiendo
su actividad de tipo SOD en presencia de EDTA en exceso. En
presencia de un exceso de 10^{2} veces de EDTA,
MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+}
(c= 5 \times 10^{-6}M) mantiene su actividad durante
dieciséis horas (a 25ºC). Se observó una pérdida de actividad
(\sim25%) después de cuarenta horas, indicando de este modo la
formación de algún complejo manganeso-EDTA
(K=10^{14,05}). Estos resultados confirman una estabilidad
relativamente buena de
MnCl_{4}TE-2-PyP^{5+} cuando se
compara con MnOBTMPyP^{4+} (K=10^{8,08})
(Batinic-Haberle et al., Arch. Biochem.
Biophys. 343:225 (1997)).
Relación entre las propiedades redox y las
actividades de tipo SOD. La enzima Cu, Zn-SOD
es un dímero de dos subunidades idénticas y por lo tanto presenta
dos zonas activas, que presentan un potencial redox próximo al medio
punto de las dos mitades de los valores de reacción, además de las
mismas constantes de velocidad para cada media reacción (Esquema C
y Tabla 5) (Ellerby et al., J. Am. Chem. Soc. 118:6556
(1996); Klug-Roth et al., J. Am. Chem. Soc.
95:2786 (1973)):
\newpage
Esquema
C
Por otra parte, los estudios previos de
dismutación de O_{2}^{-} catalizados por
MnTM-4-PyP^{5+} (E^{0}_{1/2}=+
60 mV), utilizando radiolisis pulsante y técnicas de flujo
interrumpido, demostraron que la velocidad de reducción del metal
por O_{2}^{-} es 10^{2} a 10^{3} veces inferior a la
velocidad de reoxidación del metal (Faraggi, Oxygen Radicals in
Chemistry and Biology, Bors et al. (Eds): Walter de
Gruyter and Co.; Berlín, Alemania 1984, página 419; Lee et al.,
J. Am. Chem. Soc. 120:6053 (1998)). Mientras que un pico de
actividad de tipo SOD en algún punto entre +200 y +450 mV era de
esperar en primer lugar, la representación de k_{cat}
frente a E^{0}_{1/2} para
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+} presenta
un aumento exponencial de la actividad de tipo SOD, lo que sugiere
intensamente que el factor limitante es todavía la reducción del
metal. Esta hipótesis, sin embargo, debe ser confirmada midiendo
las velocidades de cada media reacción catalizada por cada compuesto
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+}. La
relación entre la energía libre de activación (\DeltaG^{#})
para la dismutación del superóxido y el cambio de energía libre
(\DeltaG^{0}) para el redox de
MnCl_{x}TE-2-PyP^{5+} es lineal
(pendiente \sim+0,2), mostrando claramente el predominio de los
factores cinéticos sobre los termodinámicos en la zona teórica
potencial de redox óptimo (Fig. 6). Según este comportamiento, la
actividad del enzima Cu,Zn-SOD
(k_{cat}=10^{9} M^{-1}s^{-1} por zona activa) se
puede alcanzar a aproximadamente E^{0}_{1/2}=+ 570 mV
(Fig. 3). Sin embargo, debido tanto a los factores estéricos
(distorsión del anillo de porfirina) como a los termodinámicos, que
introducen un grado mayor de \beta-cloración es de
esperar que estabilicen el manganeso en el estado redox 2+, y por
lo tanto, como en el caso de MnOBTMPyP^{4+}, limitando la
velocidad de la reoxidación del metal además de provocar la
disociación de Mn(II) (Batinic-Haberle et
al., Arch. Biochem. Biophys. 343:225 (1997); Ochsenbein et
al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:348 (1994)).
Se analizaron los isómeros orto,
meta y para de manganeso (III)
5,10,15,20-tetrakis(N-metilpiridil)porfirina,
MnTM-2-PyP^{5+},
MnTM-3-PyP^{5+}y
MnTM-4-PyP^{5+}, respectivamente,
desde el punto de vista de su actividad de peróxido dismutasa (SOD)
in vitro e in vivo. Se analizó también el impacto de
su interacción con el ADN y el ARN en la actividad de SOD in
vivo e in vitro. Las diferencias en su comportamiento son
debidas a los factores estéricos y electrostáticos combinados. Las
actividades catalíticas in vitro están íntimamente
relacionadas con sus potenciales redox. Los potenciales de onda
media (E_{1/2}) son +0,220 mV, +0,052 mV y +0,060 V frente al
electrodo normal de nitrógeno (NHE), mientras que las
velocidades de dismutación (k_{cat}) son 6,0\times10^{7}
M^{-1}s^{-1}, 4,1\times10^{6} M^{-1}s^{-1} y 3,8
\times 10^{6} M^{-1}s^{-1} para los isómeros orto,
meta y para, respectivamente.
Sin embargo, la actividad in vitro no es
un factor pronóstico suficiente de la eficacia in vivo. Los
isómeros orto y meta, aunque de actividades de SOD
in vitro significativamente diferentes, presentan una
eficacia de SOD in vivo bastante próxima debido a sus
interacciones igualmente débiles con el ADN. En cambio, debido a un
mayor grado de interacción con el ADN, el isómero para
inhibió el crecimiento de Escherichia coli insuficiente en
SOD. Para detalles, véase (Batinic-Haberle et
al., J. Biol. Chem. 273(38):24521-8 (18
septiembre 1998).
Ácido L-ascórbico,
n-butanol, hidroxitolueno butilado, cloruro de
cobalto, cloruro de hierro(II), ácido fosfórico (85%),
hidróxido de sodio, fosfato de potasio, cloruro de tetrabutilamonio
y 1,1,3,3-tetrametoxipropano se adquirieron en
Sigma (St. Louis, MO). Acetona, ácido clorhídrico concentrado,
4,6-dihidroxi-2-mercaptopirimidina
(ácido tiobarbitúrico), NH_{4}PF_{6}, cloruro de cinc,
5,10,15,20-tetrakis (ácido
4-benzoico) porfirina (H_{2}TBAP)(Conocido
también como
5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina(H_{2}TCPP)),
5,10,15,20-tetrakis
(N-metilpiridinio-4-il)
porfirina (H_{2}TM-4-PyP) y Trolox
se adquirieron en Aldrich (Milwaukee, WI).
5,10,15,20-tetrakis (ácido
4-benzoico) porfirina férrica (FeTBAP) se adquirió
en Porphyrin Products (Logan, UT).
5,10,15,20-tetrakis
(N-metilpiridinio-2-il)
porfirina (H_{2}TM-2-PyP) se
adquirió en MidCentury Chemicals (Posen, IL).
(+)-Rutin se adquirió en Calbiochem (La Jolla, CA).
El cloruro de manganeso se adquirió en Fisher (Fair Lawn, NJ) y
etanol USP se adquirió en AAPER Alcohol and Chemical Co.
(Shelbville, KY). Todas las soluciones se prepararon en agua de
Milli-Q Plus (Millipore, Bedford, MA).
\newpage
Se prepararon las metaloporfirinas MnTBAP, CoTBAP
y ZnTBAP utilizando procedimientos descritos anteriormente (Day
et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 275:1227 (1995)).
MnTM-4-PyP,
CoTM-4-PyP y
ZnTM-4-PyP se sintetizaron mediante
el siguiente procedimiento. Se mezcló un exceso 1,5 molar de cloruro
de manganeso, cobalto o cinc con
H_{2}TM-4-PyP que se disolvió en
agua desionizada. Se calentó la mezcla de reacción a 80ºC y se
consiguió el enlace del metal espectrofotométricamente
(UV-2401PC, Shimadzu, Columbia, MD). El exceso de
metal se eliminó pasando la mezcla a través de una columna
conteniendo Bio-Gel P-2 (BioRad,
Richmond, CA) que retuvo selectivamente
MnTM-4-PyP.
MnTM-4-PyP se eluyó con HCl 0,01 N
después de un prolongado lavado de la columna con agua. Se
caracterizaron MnTM-4-PyP,
CoTM-4-PyP y
ZnTM-4-PyP desde el punto de vista
de las bandas de Soret indicadas. La banda de Soret para
MnTM-4-PyP está a 463 nm con un
coeficiente de extinción de (\varepsilon)=1,3 \times 10^{5}
M^{-1}s^{-1}, la banda de Soret para
ZnTM-4-PyP está a 437 nm con un
coeficiente de extinción de (\varepsilon)=2,0 \times 10^{5}
M^{-1}s^{-1} (Pasternack et al., Inorg. Chem. 12:2606
(1973)) y la banda de Soret para
CoTM-4-PyP está a 434 nm con un
coeficiente de extinción de (\varepsilon)=2,15 \times 10^{5}
M^{-1}s^{-1} (Pasternack et al., Biochemistry 22:2406
(1983)). Se sintetizó
\beta-octabromo-meso-tetrakis-(N-metilpiridinio-4-il)
porfirina de manganeso
(MnOBTM-4-PyP) tal como se describió
anteriormente (Batinic-Haberle et al., Arch.
Biochem. Biophys. 343:225 (1997)) y presenta una banda de Soret
a 490 nm con un coeficiente de extinción de (\varepsilon)=8,56
\times 10^{4} M^{-1}s^{-1}. Se metaló
H_{2}TM-2-PyP con porfirina 1:20
en proporción de manganeso en agua (pH>11) a temperatura
ambiente. Al terminar la metalación, precipitó
MnTM-2-PyP por adición de una
solución acuosa concentrada de NH_{4}PF_{6}. El precipitado se
lavó con 2-propanol:dietil éter (1:1) y se secó al
vacío a temperatura ambiente. Se disolvió la sal PF_{6}^{-} de
MnTM-2-PyP en acetona y se secó al
vacío a temperatura ambiente. Se observó la banda de Soret para
MnTM-2-PyP a 453 nm con un
coeficiente de extinción de (\varepsilon)=1,29 \times 10^{5}
M^{-1}s^{-1}.
Se homogeneizaron cerebros congelados de rata
adulta Sprague-Dawley (Pel-Freez,
Rogers, AR) con un politrón (Turrax T25, Alemania) en 5 volúmenes de
fosfato de potasio 50 mimético enfriado en hielo a pH 7,4. Se
determinó la concentración de proteína homogeneizada en un análisis
de proteínas Coomassie Plus (Pierce, Rockford, IL) utilizando
albúmina de suero bovino como patrón. Se ajustó el volumen de
homogeneizado con tampón para dar una concentración de proteína
final de 10 mg/ml y se congeló en alícuotas a -80ºC.
Se incubaron homogeneizados de cerebro de rata (2
mg de proteína) con concentraciones variables de antioxidante a
37ºC durante 15 minutos. La oxidación del homogeneizado de cerebro
de rata se inició mediante la adición de
\hbox{0,1 ml}
de solución madre aerobia recién preparada conteniendo cloruro de
hierro (II) (0,25 mimético) y ascorbato (1 mimético) tal como se
describió anteriormente (Braughler et al., J. Biol. Chem.
262:10438 (1987)). Se colocaron las muestras (1 ml de volumen
final) en un baño de agua en agitación a 37ºC durante 30 minutos.
Se interrumpieron las reacciones por adición de 0,1 ml de solución
madre de hidroxitolueno butilado (60 mM) en etanol.
Se utilizó la concentración de la especie
reactiva de ácido barbitúrico (TBARS) en homogeneizados de cerebro
de rata como índice de peroxidación de lípidos (Bernhem et al.,
J. Biol. Chem. 174:257 (1948); Witz et al., J. Free Rad.
Biol. Med. 2:33 (1986); Kikugawa et al., Anal. Biochem.
202:249 (1992); Jentzsch et al., J. Free Rad. Biol. Med.
20P251 (1996)). Se obtuvieron patrones de malondialdehído añadiendo
8,2 \mul de 1,1,3,3-tetrametoxipropano en 10 ml de
HCl 0,01 M y mezclando durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Esta solución madre se diluyó a continuación en agua para dar
patrones que oscilan entre 0,25 y 25 \muM. Se acidificaron
muestras o patrones (200 \mul) con 200 \mul de ácido fosfórico
0,2 M en tubos cerrados de microcentrífuga de 1,5 ml. La reacción
coloreada se inició mediante la adición de 25 \mul de solución de
ácido tiobarbitúrico 0,11 M y las muestras se colocaron en una
placa calefactora a 90ºC durante 45 minutos. Se extrajeron los
TBARS con 0,5 ml de n-butanol agitando las muestras
durante 3 minutos y enfriando en hielo durante 1 minuto. Se
centrifugaron a continuación las muestras a 12.000 \times g
durante 3 minutos, en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se
colocaron alícuotas de 150 \mul de la fase de
n-butanol y se leyeron a 535 nm en un lector de
placa Thermomax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 25ºC. Las
absorbancias de la muestra se transformaron en equivalencias de MDA
(\muM) por extrapolación en una curva patrón de MDA. Ninguno de
los antioxidantes en las concentraciones empleadas en estos
estudios afectó a la reacción de los patrones de MDA con ácido
tiobarbitúrico y se utilizaron las reacciones sin TBA como blancos
de sustracción.
Los datos se presentaron como sus medias \pm
SE. Se determinó la concentración inhibidora de antioxidantes que
reducen el grado de peroxidación de lípidos en el 50% (IC_{50}) y
los intervalos de confianza del 95% respectivos (CI) mediante
ajuste de una curva sigmoidea con pendiente variable a los datos
(GraphPad Prizm, San Diego, CA).
\newpage
El objetivo de estos estudios fue investigar si
las metaloporfirinas pueden inhibir la peroxidación de lípidos y
comparar sus potencias con las de los antioxidantes caracterzados
anteriormente, que incluyen los antioxidantes enzimáticos (SOD y
catalasa) y los antioxidantes no enzimáticos (análogo de vitamina E
soluble en agua, trolox y flavonoide polifenólico vegetal) (Figura
7). Se determinó el trascurso de la peroxidación de lípidos en
homogeneizados de cerebro de rata utilizando hierro y ascorbato
como iniciadores de la oxidación de lípidos y la formación de
especies reactivas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) como índice de la
peroxidación de lípidos. Un aumento lineal en la formación de TBARS
tuvo lugar entre los 15 a los 90 minutos de incubación a 37ºC
(Figura 8). Sobre la base de estos resultados, se seleccionó un
periodo de incubación de 30 minutos para probar la capacidad de las
metaloporfirinas y otros oxidantes para inhibir la peroxidación de
los lípidos (Figura 9). De los agentes probados, se observó que las
porfirinas de manganeso que presentan las mayores actividades de
SOD, MnOBTM-4-PyP y
MnTM-2-PyP, eran los inhibidores de
peroxidación de lípidos más potentes con IC_{50} calculados de
1,3 y 1,0 \muM respectivamente (Tabla 6). CuZnSOD bovino fue
moderadamente activo con un IC_{50} calculado de 15 \muM,
mientras que trolox y rutin fueron mucho menos potentes con
IC_{50} calculados de 204 y 112 \muM, respectivamente. En este
sistema, la catalasa (hasta concentraciones de 1 mg/ml) no inhibió
la peroxidación iniciada con hierro/ascorbato.
| Antioxidantes | SOD | Potencial redox | Peroxidación de lípidos^{c} | |
| (U/mg)^{a} | (E_{1/2}, V)^{b} | IC_{50}[\muM] | Cl 95% [\muM] | |
| CuZnSOD | 5.100 | +0,35 | 15 | 13-17 |
| Trolox | - - - | - - - | 204 | 135-308 |
| Rutin | - - - | - - - | 113 | 99-129 |
| MnTM-2-PyP | 8.500 | +0,22 | 1,0 | 0,4-2,2 |
| MnOBTM-4-PyP | 18.460 | +0,48 | 1,3 | 0,8-2,2 |
| MnTM-4-PyP | 547 | +0,06 | 16 | 12-22 |
| MnTBAP | 179 | -0,19 | 29 | 23-37 |
| CoTM-4-PyP | 113 | +0,42 | 17 | 14-22 |
| CoTBAP | 24 | +0,20 | 21 | 13-33 |
| FeTBAP | 24 | +0,01 | 212 | 144-311 |
| ZnTM-4-PyP | vestigios | - - - | 241 | 159-364 |
| ZnTM-2-PyP | vestigios | - - - | 591 | 423-827 |
| ZnTBAP | vestigios | - - - | 843 | 428-1660 |
| ^{a} Unidad de actividad de SOD definida como la cantidad de compuesto que inhibe a la mitad la | ||||
| reducción de citocromo c o la fotorreducción de NBT. | ||||
| ^{b} Potenciales redox centrados en el metal frente a NHE (Mn^{+3}/Mn^{+2}; Co^{+3}/Co^{+2}; Fe^{3+}/Fe^{2+}). Si no se | ||||
| especifica de otra manera, E_{1/2} se obtuvieron a pH 7,8. | ||||
| ^{c} La cantidad de sustancias reactivas de ácido tiobarbitúrico producidas en el homogeneizado de cerebro | ||||
| de rata durante 30 minutos de incubación de hierro y ascorbato. |
Un amplio intervalo de metales puede estar unido
covalentemente mediante porfirinas y esto confiere diferentes
potenciales redox y actividades de SOD (Tabla 6). Se probó la
capacidad de diferentes quelatos metálicos para influir en una
capacidad de porfirina para inhibir la peroxidación de los lípidos.
Se examinaron varios análogos metálicos diferentes de TBAP en el
modelo de peroxidación de lípidos iniciado con hierro/ascorbato
(Figura 10). Los análogos de TBAP tanto de manganeso como de cobalto
presentan una eficacia similar con un IC_{50} calculado de 29 y
21 \muM, respectivamente. El análogo de FeTBAP fue un orden de
magnitud menos potente con un IC_{50} calculado de 212 \muM.
El análogo de ZnTBAP fue mucho menos activo que los otros análogos
de metal con un IC_{50} calculado de 946 \muM. La diferencia de
potencia entre el cinc y los demás metales refleja la importancia
de la química redox de la estructura del anillo frente a la
centrada en el metal ya que el cinc no puede cambiar fácilmente su
valencia. Las potencias ordenadas de las metaloporfirinas probadas
sobre la base de los IC_{50} fueron las siguientes:
MnTM-2-PyP=MnOBTM-4-PyP
>
MnTM-4-PyP=CoTM-4-PyP
> CoTBAP=MnTBAP >
FeTBAP=ZnTM-4-PyP >
ZnTM-2-PyP > ZnTBAP.
Hace poco, se ha observado que varios análogos de
manganeso de N-metilpiridil porfirinas poseen
grandes diferencias en las actividades de SOD (Tabla 6).
MnTM-2-PyP y
MnTM-4-PyP difieren estructuralmente
con respecto a la posición del grupo N-metilpiridil
del anillo de porfirina (orto frente a para) así como
en la actividad de SOD por un factor de seis. La sustitución del
cinc en estos análogos de porfirina produce la pérdida de actividad
de SOD. Se comparó la capacidad de estos análogos de TMPyP para
inhibir la peroxidación de los lípidos (Figura 11). El movimiento
del grupo N-metilpiridil desde la posición
para a la orto en el anillo con manganeso produjo un
aumento de 15 veces en la potencia. Ya que
MnTM-2-PyP posee un potencial redox
más positivo que MnTM-4-PyP (+0,22
frente a +0,06, respectivamente), este dato sugiere que tanto el
potencial redox como la actividad de SOD relacionada puede
contribuir al aumento de potencia del análogo de
MnTM-2-PyP.
Se evaluó la capacidad de Mn
TE-2-PyP para atenuar la lesión
asociada a 60 minutos de isquemia global, seguido de 90 minutos de
revascularización, en un modelo de hígado de ratón aislado,
perfundido. Se inyectó una infusión en hígados estirpados con una
solución salina tamponada durante 15 minutos, después de los cuales
se introdujo la metaloporfirina en el perfundido y en el hígado
perfundido en un sistema recirculante durante 15 minutos
adicionales. Los hígados se hicieron entonces isquémicos en su
totalidad en las condiciones térmicas normales durante 60 minutos.
Después del periodo isquémico los hígados se perfundieron durante
90 minutos perfusión complementada con 10 \mum de Mn
TE-2-PyP. En este modelo los hígados
reperfusionados con isquemia presentan una liberación marcada de
enzimas hepatocelulares, aspartato transaminasa, alanina
transaminasa y lactato deshidrogenasa durante los primeros 2½
minutos de revascularización. Esto se continuó con una liberación
progresiva de enzimas hepatocelulares, lo que indica lesión
hepatocelular durante el periodo de perfusión de 90 minutos. La
administración de Mn TE-2-PyP fue
muy eficaz para atenuar la lesión del hígado, bloqueando
prácticamente toda la liberación aguda de enzima hepatocelular y
bloqueando toda la liberación progresiva de enzima hepatocelular
durante el periodo de perfusión de 90 minutos. Al final de los
experimentos se trató el hígado con la metaloporfirina. Se ha
demostrado un excelente cosumo de oxígeno y un modelo de perfusión
normal. Permanecen firmes y con una textura normal hasta el exámen
morfológico en bruto. Los hígados sin tratamiento con fármaco no
consumen normalmente oxígeno y se vuelven edematosos, blandos y
presentan un aspecto moteado con escasa perfusión.
Se anestesiaron ratas y se inyectaron en la vena
femoral y en la arteria carótida. Mientras se controlaba la presión
sanguínea en la arteria carótida se inyecto por vía intravenosa Mn
TE-2-PyP en dosis que oscilan de 0,1
a 3,0 mg/kg. La presión arterial media cayó desde
100-125 mm Hg a 50-60 mm Hg en cinco
a diez minutos. El efecto fue transitorio, transcurriendo hasta
30 minutos a dosis de 0,1 a 0,25 mg/kg. A dosis de 1 a 3 mg/kg se
prolongó el efecto, transcurriendo hasta dos horas. El efecto se
puede bloquear por administración de inhibidores de óxido nítrico
sintasa demostrando que el papel de Mn
TE-2-PyP está siendo modulado por
óxido nítrico. El secuestro del superóxido en las paredes
vasculares potenciaría los efectos del óxido nítrico que producen
hipotensión.
Se sensibilizaron ratones por inyección
intraperitoneal de ovoalbúmina dos veces, en 14 días distintos.
Catorce días después de la segunda inyección intraperitoneal se
hicieron pruebas con avoalbúmina atomizada con aerosol diariamente
durante tres días. Cuarenta y ocho horas después de la tercera
inhalación de ovoalbúmina se administró una exposición a metacolina
de 1 minuto y la hiperactividad de las vías respiratorias continuó
utilizando un pletismógrafo corporal Buxco. Aumentos significativos
en la resistencia de las vías respiratorias tal como los medidos
mediante el índice PENH tuvieron lugar a dosis de 20, 30 y 40 mg/ml
de metacolina. Todas las dosis de metacolina antes de las
instilaciones intratraqueales de 2 \mug de Mn
TM-2-PyP administradas diariamente
durante 4 días produjeron una reducción estadísticamente
significativa en la hiperreactividad de la vías respiratorias. Esta
dosis de Mn TM-2-PyP es equivalente
a 0,8 mg/kg de dosis sobre el conjunto del cuerpo.
Se trataron a continuación mandriles recién
nacidos de parto prematuro por cesárea con oxígeno al 100% o
solamente con PRN FlO_{2} para mantener la oxigenación arterial
adecuada. Para establecer el modelo, se estudiaron trece animales
tratados con oxígeno al 100% y doce animales de referencia con PRN,
El tratamiento con oxígeno al 100% produce lesión pulmonar extensa
manifestada por 9 ó 10 días de exposición y caracterizada por
alveolización retardada, inflamación pulmonar parenquimatosa y poca
oxigenación. Esto es característico de la enfermedad displasia
broncopulmonar humana y se cree que está mediada, por lo menos en
parte, por la tensión oxidativa del pulmón neonato en desarrollo. En
una primera prueba con Mn TE-2-PyP,
un mandril recién nacido que fue parido a los 140 días de gestación
se colocó en oxígeno al 100%. El animal recibió 0,5 mg/kg/24 h de
Mn TE-2-PyP cada día administrados
por vía intravenosa en una infusión continua durante un periodo de
estudio de 10 días completos. El animal presentó una mejora notable
del índice de oxigenación. No hubo pruebas de descompensación
clínica de los pulmones los días 9 y 10. La patología pulmonar
demostró la ausencia de inflamación y una disminución notable en la
lesión pulmonar observada en los animales anteriores tratados con
oxígeno al 100% en condiciones idénticas. Esto sugiere que Mn
TE-2-PyP se puede utilizar para
tratar la tensión oxidante en recién nacido prematuro.
Claims (25)
1. Compuesto de fórmula
o de la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en el
que
- cada R es, independientemente, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, y
- cada P es, independientemente, hidrógeno, NO_{2}, un halógeno, un nitrilo, un grupo vinilo o un grupo formilo;
en el que cada R es metilo y cada P es hidrógeno,
dicho compuesto, está acomplejado con un metal seleccionado de
entre el grupo constituido por hierro, cobre, cobalto, niquel o
cinc.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
cada R es, independientemente, un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}.
3.Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que cada R es,
independientemente, un grupo metilo, etilo o isopropilo.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que cada R es,
independientemente, un grupo metilo o etilo.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos una P es un
halógeno.
6. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
uno o dos P son grupos formilo y los P restantes son hidrógeno.
7. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
un P es un grupo formilo y los P restantes son hidrógeno.
8. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
uno o dos P son -NO_{2} y los P restantes son hidrógeno.
9. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho compuesto está acomplejado
con un metal seleccionado de entre el grupo constituido por
manganeso, hierro, cobre, cobalto, niquel o cinc.
10. Compuesto según la reivindicación 9, en el
que dicho compuesto está acomplejado con manganeso.
11. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que cada R es un grupo etilo,
cada P es un hidrógeno y dicho compuesto está acomplejado con
manganeso.
12. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que cada R es un grupo metilo o un grupo etilo, por lo menos una P
es Br y los P restantes son hidrógeno y dicho compuesto está
acomplejado con manganeso.
13. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto es una
mezcla de atropoisómeros \alpha\alpha\alpha\alpha,
\alpha\alpha\alpha\beta, \alpha\alpha\beta\beta y
\alpha\beta\alpha\beta.
14. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que cada compuesto es una mezcla de atropoisómeros
\alpha\alpha\alpha\beta y \alpha\alpha\alpha\alpha.
\newpage
15. Utilización de un compuesto de fórmula
o de la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en el
que
- cada R es, independientemente, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, y
- cada P es, independientemente, hidrógeno, NO_{2}, un halógeno, un nitrilo, un grupo vinilo o un grupo formilo; en la preparación de un medicamento para proteger células de la toxicidad provocada por el oxidante.
16. Utilización según la reivindicación 15, en la
que dicho compuesto está acomplejado con un metal seleccionado de
entre el grupo constituido por manganeso, hierro, cobre, cobalto,
niquel o cinc.
17. Utilización de un compuesto de fórmula
o de la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en el
que
- cada R es, independientemente, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, y
- cada P es, independientemente, hidrógeno, NO_{2}, un halógeno, un nitrilo, un grupo vinilo o un grupo formilo; en la preparación de un medicamento para tratar un estado patológico procedente de la toxicidad provocada por el oxidante.
18. Utilización según la reivindicación 17, en la
que dicho compuesto está acomplejado con un metal seleccionado de
entre el grupo constituido por manganeso, hierro, cobre, cobalto,
niquel o cinc.
19. Utilización de un compuesto de fórmula
o de la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en el
que
- cada R es, independientemente, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, y
- cada P es, independientemente, hidrógeno, NO_{2}, un halógeno, un nitrilo, un grupo vinilo o un grupo formilo; en la preparación de un medicamento para tratar un estado patológico procedente de la degradación de NO o de una forma biológicamente activa del mismo.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicho compuesto está acomplejado con un metal seleccionado
de entre el grupo constituido por manganeso, hierro, cobre,
cobalto, niquel o cinc.
21. Utilización de un compuesto de fórmula
o de la sal farmacéuticamente aceptable del
mismo,
en el
que
- cada R es, independientemente, un grupo alquilo C_{1}-C_{8}, y
\newpage
- cada P es, independientemente, hidrógeno, NO_{2}, un halógeno, un nitrilo, un grupo vinilo o un grupo formilo; en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad pulmonar inflamatoria.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicho compuesto está acomplejado con un metal seleccionado
de entre el grupo constituido por manganeso, hierro, cobre,
cobalto, niquel o cinc.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que dicho metal es manganeso.
24. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicha enfermedad pulmonar inflamatoria es un estado
hiperactivo de las vías respiratorias.
25. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicha enfermedad pulmonar inflamatoria es el asma.
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