ES2207690T3

ES2207690T3 - Uso de nitroxidos y oxazolidinas para la proteccion contra la radiacion ionizante y el estres oxidativo.

Info

Publication number: ES2207690T3
Application number: ES97100145T
Authority: ES
Inventors: William G. Degraff; James B. Mitchell; Stephen Hahn; Amram Samuni
Original assignee: US SECRETARY UNITED STATES DEP; United States Department of Commerce
Current assignee: US SECRETARY UNITED STATES DEP; United States Department of Commerce
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 2004-06-01
Anticipated expiration: 2011-03-18
Also published as: CA2078287C; ATE157249T1; EP0520005A1; AU644865B2; EP0520005A4; JPH05501114A; CA2078287A1; WO1991013619A1; DE69127437T2; EP0787492B1; DE69133313T2; EP0520005B1; AU7542391A; US5462946A; DK0787492T3; DE69127437D1; DE69133313D1; JP2741427B2; EP0787492A1; ATE249829T1

Abstract

COMPUESTOS DE NITROXIDOS INDEPENDIENTES DE METAL Y OXAZOLIDINA CAPACES DE FORMAR OZAZOLIDINA-OXILES SON UTILES PARA PROTEGER A LOS PACIENTES DE LOS EFECTOS DE LA RADIACION IONIZANTE Y DEL DESGASTE OXIDATIVO.

Description

Uso de nitróxidos y oxazolidinas para la protección contra la radiación ionizante y el estrés oxidativo.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de nitróxido útiles para aliviar los efectos perjudiciales de especies tóxicas relacionadas con oxígeno en organismos vivos y a métodos para usar las mismas.

Descripción de la técnica afín

La utilización de oxígeno por los mamíferos implica tanto una ventaja como un inconveniente potencial. La ventaja es que todos los mamíferos requieren oxígeno para la vida. La desventaja potencial es que, durante el metabolismo del oxígeno, se produce una variedad de especies tóxicas relacionadas con oxígeno tales como el radical hidroxilo (\cdotOH), peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) y superóxido (O\tfrac{\bullet}{\leq}). Sin no se controlan, estas especies de radicales libres podrían dañar indudablemente las células. Sin embargo, las células han desarrollado sistemas de destoxificación y reparación elaborados para librarse ellas mismas de estos subproductos metabólicos potencialmente tóxicos y no deseables: la superóxido dismutasa (SOD) puede convertir el superóxido en H_{2}O_{2} y la catalasa (CAT) puede convertir el H_{2}O_{2} en H_{2}O.

Otro medio más para destoxificar H_{2}O_{2} (y organoperóxidos) es a través del enzima glutationa peroxidasa (GPX) que con la glutationa (GSH) también convierte H_{2}O_{2} en H_{2}O. La glutationa transferasa (GST), además de su capacidad para conjugarse y activar fármacos y xenobióticos, también posee actividad de peroxidasa y puede destoxificar H_{2}O_{2}. Estos sistemas representan las principales rutas de destoxificación para especies de radicales libres derivadas de oxígeno; sin embargo, existen indudablemente otros sistemas que pueden proporcionar protección, incluyendo sulfhidrilos proteínicos y otros enzimas relacionados con tiol que podrían estar implicados en mecanismos de reparación.

A pesar de la eficacia de estos sistemas enzimáticos, existe una pequeña "fuga" de especies tóxicas más allá de la red de defensa bioquímica. De particular importancia es el destino definitivo del H_{2}O_{2} si escapa a la destoxificación. El H_{2}O_{2}, por sí mismo un oxidante capaz de dañar moléculas biológicamente importantes, también puede sufrir reducción a través de complejos ferrosos para producir \cdotOH. Esta reacción (a menudo denominada química de Fenton) produce el \cdotOH altamente reactivo, que, en el orden de 10^{-9} segundos, puede: 1) substraer electrones de moléculas orgánicas; 2) romper enlaces químicos; 3) iniciar la peroxidación de lípidos; y 4) reaccionar con otro \cdotOH para producir H_{2}O_{2}. No se sabe si la exposición crónica a especies de radicales libres derivados de oxígeno de bajo nivel es perjudicial; sin embargo, se postula que el proceso de envejecimiento puede ser una manifestación de la incapacidad de los organismos para hacer frente al estrés oxidativo prolongado. Muchas modalidades usadas en el tratamiento del cáncer, incluyendo los rayos X y algunos fármacos quimioterapéuticos, ejercen su citotoxicidad a través de la producción de radicales libres relacionados con oxígeno, imponiendo de ese modo una carga añadida a los sistemas de destoxificación normales. Adicionalmente, los radicales libres y las especies tóxicas relacionadas con oxígeno se han relacionado con la lesión por isquemia/reperfusión, y durante mucho tiempo se ha creído que eran importantes en la toxicidad mediada por neutrófilos de patógenos extraños. Asimismo, el daño por radicales libres se ha relacionado con la carcinogénesis. El término "estrés oxidativo" ha surgido así para abarcar una amplia variedad de estreses, algunos de los cuales tienen implicaciones obvias para el cuidado de la salud.

Ha existido un interés considerable en idear sistemas adicionales, aparte de sistemas de destoxificación intracelulares inherentes, para proteger células, tejidos, animales y seres humanos de los efectos tóxicos de cualquier agente o proceso que implique estrés oxidativo. En los últimos pocos años, los estudios experimentales han indicado que enzimas tales como catalasa y superóxido dismutasa y agentes tales como alopurinol y compuestos quelantes de metales proporcionan protección contra el estrés oxidativo. Ninguno de estos sistemas se está aplicando actualmente a seres humanos.

La aplicación de los nitróxidos de la presente invención es nueva a este respecto, y proporciona varias ventajas únicas. Aunque el grupo de compuestos químicos llamados marcadores de espín de nitróxido estables ha tenido un uso biofísico extendido, nunca se han usado como antioxidantes. Exhiben baja reactividad con el propio oxígeno. Al ser de bajo peso molecular, descargados y solubles en solución acuosa, cruzan fácilmente al medio intracelular. Encimas tales como catalasa y superóxido dismutasa no lo hacen. Por lo tanto, los nitróxidos deben ser superiores a la catalasa y la superóxido dismutasa ya que pueden ejercer protección dentro de la célula. Son activos dentro del intervalo de pH biológico de aproximadamente 5 a 8. Los nitróxidos no son proteínas; por lo tanto, la posibilidad de estimulación antigénica es remota. Los miméticos de superóxido dismutasa de bajo peso molecular previos han sido todos dependientes de metales. Los agentes actuales no contienen metales y por lo tanto se evitan problemas con las constantes de disociación y reacciones perjudiciales inducidas por metales. Estos compuestos son aparentemente atóxicos a concentraciones eficaces. La lipofilia de los nitróxidos puede controlarse mediante la adición de diversos substituyentes orgánicos. Estos substituyentes orgánicos facilitan la orientación de las moléculas a órganos u orgánulos específicos donde se generan especies tóxicas derivadas de oxígeno, a regiones que son particularmente susceptibles al daño oxidativo, o al cerebro, si se desea. Los protectores de la radiación previos han sido dependientes del grupo sulfhidrilo. Los agentes actuales no tienen un grupo sulfhidrilo. Finalmente, el uso previo de estos tipos de compuestos como agentes de contraste de resonancia magnética no se refiere a su presente aplicación como antioxidantes.

Sumario de la invención

De acuerdo con esto, un objetivo de la presente invención es vencer los problemas asociados con el uso de agentes destoxificantes enzimáticos impermeables tales como superóxido dismutasa y catalasa, para proteger tejidos vivos de los efectos perjudiciales de productos tóxicos generados durante el metabolismo del oxígeno. Esto se efectúa proporcionando métodos para usar los compuestos de nitróxido como antioxidantes de bajo peso molecular independientes de metales, como:

1): Protectores frente a la radiación ionizante para proteger la piel y para proteger contra mucositis, los efectos de la radiación del cuerpo entero y la pérdida de cabello inducida por radiación. La administración en estas situaciones puede efectuarse a través de aplicación tópica como una pomada, una loción o una crema, intravenosamente u oralmente mediante una píldora o gragea.

2): Protectores contra exposiciones a oxígeno incrementadas a fin de evitar, por ejemplo, el síndrome de la dificultad respiratoria del adulto (ARDS) pulmonar.

3): Protectores contra la degeneración lenticular inducida por oxígeno y la enfermedad de la membrana hialina en niños, y contra cataratas inducidas por estrés oxidativo. Los compuestos también pueden usarse para proteger contra el estrés oxidativo en pacientes que sufren terapia con oxígeno o tratamiento con oxígeno hiperbárico. La administración bajo estas circunstancias puede efectuarse a través de diversas rutas que incluyen, por ejemplo, el uso de gotas oculares, la inhalación de aerosoles o la inyección intravenosa.

4): Protectores frente a la lesión por reperfusión eficaces para tratar fenómenos cardiovasculares tales como infarto de miocardio y apoplejías, pancreatitis o ulceración intestinal; para proteger a pacientes que reciben trasplantes de órganos en soluciones de conservación de órganos.

5): Protectores para usar en medios de cultivo de células de animales o plantas para prevenir la citotoxicidad debida a la oxidación excesiva, para usar en medios diseñados para cultivar microorganismos aerobios, para usar la estabilización de compuestos químicos lábiles que sufren degradación espontánea generando radicales libres, para usar en la neutralización de radicales libres que catalizan el alargamiento de cadenas durante la formación de polímeros, terminando de ese modo el alargamiento del polímero, y para usar como un estabilizante para alimentos o aditivos alimentarios tales como colores y sabores, especialmente en alimentos conservados a través de tratamiento por radiación.

6): Antioxidantes biológicos para proteger a seres humanos y animales contra agentes tales como el herbicida paraquat. En esta circunstancia, la composición farmacéutica puede administrarse, por ejemplo, a través de la inhalación como un aerosol a un sujeto expuesto a paraquat. Además, las plantas pueden protegerse contra tales agentes mediante, por ejemplo, pulverización antes o después de la exposición a tales compuestos.

7): Protectores contra los efectos citotóxicos de agentes quimioterapéuticos.

8): Protectores contra agentes mutagénicos y carcinogénicos. La administración en esta situación o en 6, previamente, puede efectuarse a través de ingestión oral o parenteralmente.

9): Agentes antiinflamatorios eficaces contra estados artríticos. Para este propósito, las composiciones pueden administrarse parenteralmente, intraarticularmente o a través de ingestión oral.

10): Retardadores del envejecimiento. La administración para este propósito puede efectuarse oralmente tal como a través de un suplemento en tabletas de la dieta o parenteralmente.

11): Agentes orales intravenosos que inducen la reducción de peso.

Estos y otros objetivos se logran proporcionando una composición biológicamente compatible, que comprende: una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula

1

en la que R_{1} es -CH_{3}; R_{2} es -C_{2}H_{5}, -C_{3}H_{7}, -C_{4}H_{9}, -C_{5}H_{11}, -C_{6}H_{13}, -CH_{2}-CH(CH_{3})_{2}, -CHCH_{3}C_{2}H_{5} o -(CH_{2})_{7}-CH_{3}, o en la que R_{1} y R_{2} juntos forman espirociclopentano, espirociclohexano, espirocicloheptano, espirociclooctano, 5-colestano o norbornano; R_{3} es -O\cdot o -OH, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo que tiene actividad antioxidante; y un portador biológicamente aceptable.

Compuestos que pueden ser útiles en la presente invención también incluyen cualquier compuesto que tenga un grupo >N-O\cdot o >N-OH o una sal del mismo. Estos compuestos pueden representarse ampliamente por la fórmula:

2

en la que R_{3} es como se define previamente y R_{4} y R_{5} se combinan junto con el nitrógeno para formar un grupo heterocíclico. Los átomos en el grupo heterocíclico (distintos al átomo de N mostrado en la fórmula) pueden ser todos átomos de C o pueden ser átomos de C así como uno o más átomos de N, O y/o S. El grupo heterocíclico tiene preferiblemente 5 ó 6 átomos totales. El grupo heterocíclico puede ser preferiblemente un pirrol, un imidazol, un oxazol, un tiazol, un pirazol, una 3-pirrolina, una pirrolidina, una piridina, una pirimidina o una purina, o derivados de los mismos, por ejemplo.

Compuestos adicionales que pueden ser útiles en la presente invención también incluyen aquellos en los que R_{4} y R_{5} comprenden ellos mismos un grupo cíclico o heterocíclico substituido o no substituido.

Otros compuestos adicionales que pueden ser útiles en la presente invención también incluyen compuestos de oxazolidina capaces de formar un oxazolidin-1-oxilo.

Otros compuestos más que pueden ser útiles en la presente invención incluyen también nitróxidos independientes de metales.

La presente invención también se dirige a métodos para tratar los efectos perjudiciales de productos metabólicos dañinos derivados de oxígeno, según se lista previamente.

Sales fisiológicamente aceptables incluyen sales de adición de ácidos formadas con ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos tales como sales de sulfato de creatina, fosfatos, citratos, fumaratos y maleatos. Se ha observado que los compuestos de la invención exhiben poca o ninguna citotoxicidad in vitro a concentraciones de 1-5 mM durante 5 horas.

Los compuestos de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de los efectos tóxicos del estrés oxidativo en una variedad de materiales, células y mamíferos incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de laboratorio tales como hámsteres, ratones, ratas, monos, etc. Se contempla que los compuestos de la invención se formularán como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad antioxidante eficaz de los compuestos de fórmula (I) y portadores farmacéuticamente aceptables. Una cantidad antioxidante eficaz de la composición farmacéutica se administrará al sujeto o el organismo, el ser humano, el animal o la planta de una manera que evite las manifestaciones del estrés oxidativo. La cantidad del compuesto (I) y el portador farmacéuticamente aceptable específico variarán dependiendo del paciente y su estado, el modo de administración y el tipo de estado de estrés oxidativo que se trate.

En un aspecto particular, la composición farmacéutica comprende un compuesto de fórmula (I) en forma de dosificación unitaria eficaz. Según se usa aquí, el término "dosificación unitaria eficaz" o "dosis unitaria eficaz" se indica para significar una cantidad antioxidante predeterminada suficiente para ser eficaz contra el estrés oxidativo in vitro o in vivo. Portadores farmacéuticamente aceptables son materiales útiles para el propósito de administrar el medicamento, que son preferiblemente atóxicos y pueden ser materiales sólidos, líquidos o gaseosos que por lo demás son inertes y médicamente aceptables, y son compatibles con los ingredientes activos. Las composiciones farmacéuticas pueden contener otros ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos y otros agentes tales como conservantes.

Estas composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de una solución, una emulsión, una suspensión, una pomada, una crema, un aerosol, un gránulo, un polvo, gotas, una pulverización, una tableta, una cápsula, un saquito, una gragea, una ampolla, un pesario o un supositorio. Pueden administrarse parenteralmente, intramuscularmente o subcutáneamente, intravenosamente, intraarticularmente, transdérmicamente, oralmente, bucalmente, como un supositorio o pesario, tópicamente, como una pulverización de aerosol, o gotas.

Las composiciones pueden contener el compuesto en una cantidad de 0,1%-99% en peso de la composición total, preferiblemente de 1 a 90% en peso de la composición total. Para la inyección intravenosa, la dosis puede ser de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 mg/kg/día. Si se aplica tópicamente como un líquido, una pomada o una crema, el compuesto puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg/ml de la composición. Para inhalación, deben administrarse de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal del compuesto al día. Para la administración oral, el compuesto debe administrarse en una cantidad de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 mg/kg/día.

La invención también proporciona un método para tratar los efectos del estrés oxidativo debido a la producción de especies dañinas derivadas de oxígeno, que comprende administrar una cantidad antioxidante eficaz del compuesto mencionado previamente a un organismo, un material, un mamífero o un ser humano susceptible al estrés oxidativo. Tal estrés incluye el debido a agentes oxidantes, exposición incrementada a oxígeno, degeneración o enfermedad inducida por oxígeno, lesión por reperfusión, radiación ionizante, agentes carcinogénicos, quimioterapéuticos o mutagénicos, envejecimiento o artritis. La lesión por reperfusión puede incluir infarto de miocardio, apoplejías, pancreatitis y ulceración intestinal, mientras que el estrés oxidativo debido a la exposición incrementada a oxígeno incluye síndrome de dificultad respiratoria del adulto pulmonar. Otros estreses oxidativos susceptibles al tratamiento con los compuestos de la presente invención incluyen degeneración lenticular inducida por oxígeno, cataratas o enfermedad de la membrana hialina en niños, o estrés oxidativo que se produce durante la terapia con oxígeno o el tratamiento con oxígeno hiperbárico.

Finalmente, en un aspecto adicional de la invención, el compuesto de la presente invención puede usarse para prolongar la vida de almacenamiento de células, tejidos u órganos de seres humanos o animales poniendo en contacto estos materiales con una solución de almacenamiento que contiene una cantidad eficaz de tal compuesto, o para inducir la reducción de peso en seres humanos o animales.

El término "biológicamente compatible" se refiere a una composición que no provoca efectos adversos en un organismo al que se aplica. La composición está libre preferiblemente de substancias tóxicas u otras substancias que la harían inadecuada para el uso pretendido.

El término "parenteral" incluye una administración mediante inyección tal como intravenosa, intramuscular o subcutánea.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1D muestran espectros de EPR de CHD y TEMPO que demuestran el reparto de cada nitróxido (1 mM) en el espacio tanto intra- como extra-celular de células V79. La intensidad de señal de EPR de la concentración total de CHD (intra- y extra-celular) en 6,4 x 10^{7} células V79/ml (señales A y C) y en presencia de trioxalato-cromato (CrOx) 110 mM (señales B y D). Las ganancias para espectros individuales son como se citan en las figuras individuales.

La figura 2 muestra una curva de supervivencia para células V79 de hámster chino expuestas a HX/XO (hipoxantina/xantina oxidasa) en presencia de diversos aditivos, incluyendo los nitróxidos CHD y TEMPOL, que protegían completamente las células. Células V79 de hámster chino en medio completo a 37ºC se expusieron a 0,05 U/ml de XO más HX 0,5 mM durante diversos períodos de tiempo en presencia de diversos aditivos: (\newmoon), control, sin aditivos; (\blacksquare), 100 U/ml de catalasa; (\bigcirc), 100 U/ml de SOD; (\Box), DF (desferrioxamina) 500 \muM, se preincubaron durante 2 h con las células antes de la adición de XO; (\Delta), CHD 5 mM; (\blacktriangle) TEMPOL 5 mM.

La figura 3 muestra una curva de supervivencia para células expuestas a H_{2}O_{2} en presencia de diversos aditivos, incluyendo los nitróxidos CHD y TEMPOL, que protegían completamente las células. El efecto de diversos agentes sobre la supervivencia celular se midió mediante el ensayo clonogénico de células V79 de hámster chino expuestas en medio completo a 37ºC a diversas concentraciones de H_{2}O_{2} durante 1 h; (\newmoon), control, sin aditivos; (\blacksquare), 100 U/ml de catalasa; (O), 100 \mug/ml de SOD; (\Box), DF 500 \muM, se preincubó 2 h con las células antes de la adición de H_{2}O_{2}; (\Delta), CHD 5 mM; (\blacktriangle) TEMPOL 5 mM.

La figura 4 muestra el efecto del nitróxido sobre la acumulación y la descomposición de H_{2}O_{2} en un cultivo tisular de células expuestas a HX/HO. Células V70 de hámster chino se cultivaron en placas en medio completo y se incubaron a 37ºC con HX 5 mM + 0,04 U/ml de XO, se muestrearon en diversos puntos temporales y se ensayaron con respecto a H_{2}O_{2} usando un electrodo selectivo de peróxido de hidrógeno.

La figura 5 muestra la supervivencia de células V79 de hámster chino expuestas a H_{2}O_{2} 600 \muM \pm DF o CHD en medio completo a 37ºC durante 1 h bajo condiciones hipóxicas.

La figura 6 muestra la reacción entre CHD y DNA-Fe(II): CHD en tampón de MOPS 50 mM, pH 7,0, se mezcló anóxicamente a 22ºC con DNA-Fe(II). Todas las soluciones contenían siempre 0,1 mg/ml de DNA de salmón. La aparición de DNA-Fe(III) se controló espectrofotométricamente a 353 nm, mientras la pérdida de espín de CHD se controló siguiendo su señal de EPR. Para estudiar la dependencia con el tiempo de \DeltaDO_{353} nm (\bigcirc), se mezcló CHD 1 mM con Fe(II) 0,1 mM. Para seguir la pérdida de espín de CHD (\Box), se mezcló Fe(II) 1 mM con CHD 0,1 mM. Recuadro: dependencia con el tiempo de ln{señal de EPR} (\Box) y de ln{DO-DO_{t}} (\bigcirc).

Las figuras 7A-7D muestran la supervivencia clonogénica de células V79 de hámster chino tratadas con concentraciones variables de TEMPOL 10 minutos antes de la radiación.

La figura 8 muestra la protección proporcionada a animales enteros tratados con TEMPOL antes de la irradiación del cuerpo entero. A ratones C3H hembra de 6 semanas de edad se les administraron 275 mg/kg de TEMPOL intraperitonealmente 10 minutos antes de la irradiación con de 3 Gy a 13 Gy. A los controles se les dio solución salina.

La figura 9 muestra los pesos medios de ratones de control y tratados con TEMPOL.

Descripción de las modalidades preferidas Ejemplo 1 Síntesis y actividad similar a SOD de derivados de oxazolidina in vitro

La desferrioxamina (DF) era un obsequio de Ciba Geigy; la hipoxanina (HX) se adquirió de Calbiochem - Boehringer Co.; el 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO), el 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPOL), la 4-idroxipirazolo[3,4-d]pirimidina (alopurinol), el ácido p-toluenosulfónico, el 2-amino-2-metil-1-propanol, la 2-butanona y la ciclohexanona se adquirieron de Aldrich Chemical Co.; el trioxalato-cromato(III) (CrOx) se adquirió de Pfaltz and Bauer, Inc., y se recristalizó; la xantina oxidasa (EC 1.2.3.2 xantina: oxígeno oxidorreductasa) clase III de suero de leche, la superóxido dismutasa (SOD) y el ferricitocromo c de clase V se obtuvieron de Sigma. El H_{2}O_{2} se compró de Fisher Scientific Co. El XO se purificó adicionalmente en una columna Sephadex G25. Todos los otros productos químicos se prepararon y se usaron sin purificación adicional. Se usó agua destilada-desionizada en todos los experimentos.

El CHD, 2-espirociclohexanodoxilo(2-espirociclohexano-5, 5-dimetil-3-oxazolidinoxilo), y el OXANO, 2-etil-2,5,5-trimetil-3-oxazolidin-1-oxilo así como otros nitróxidos se sintetizaron según se describe por Keana y otros (J. Am. Chem. Soc., 89, 3055-3056, 1967). Para la síntesis general de las aminas cíclicas, la cetona de partida apropiada se hacía reaccionar con 2-amino-2-metil-1-propanol en benceno en presencia de cantidades catalíticas de ácido p-toluenosulfónico. A medida que se formaba la estructura cíclica, el agua se eliminaba. El volumen de agua recogido en un aparato de Dean Stark se comprobó y se usó para calibrar el avance de la reacción. Las aminas así producidas se purificaron a través de destilación fraccionada bajo presión reducida, caracterizada por ^{1}H NMR a 220 MHz, IR, UV, espectroscopía de masas EI o CI y subsiguientemente se oxidó hasta los nitróxidos correspondientes usando ácido m-cloroperbenzoico. Los nitróxidos se purificaron mediante cromatografía de desarrollo rápido en sílice (Still y otros, J. Org. Chem. 43, 2923-2925, 1978). Las relaciones de agua/octanol se determinaron poniendo una cantidad de nitróxido en agua+octanol con un embudo separador. La mezcla se removió a fondo y se dejó separar durante 15 minutos, después de lo cual se tomaron partes alícuotas de ambas fracciones y la relación de distribución de nitróxido se determinó usando espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR), comparando las intensidades de señal obtenidas bajo N_{2}.

Para comprobar si los derivados de oxazolidinoxilo distintos a OXANO manifiestan actividad similar a SOD, se sintetizaron varios nitróxidos que tenían diferentes substituyentes de anillo. La tabla 1A muestra nitróxidos sintetizados representativos con características físicas adjuntas.

TABLA 1A.

3

La exposición de estos nitróxidos cíclicos de 5 miembros a un flujo de O_{2} formado por HX/XO daba como resultado una disminución en su señal de EPR, como se encontraba previamente para OXANO (Samuni y otros, Free Rad. Biol. Med., 6, 141-148, 1989). Para experimentos de EPR, muestras (0,05-0,1 ml) de soluciones de productos químicos y suspensiones celulares se extrajeron mediante una jeringa a un capilar de teflón permeable a los gases de 0,8 mm de diámetro interno, 0,5 mm de grosor de la pared (Zeus Industrial Products, Inc. Raritan, NJ). Cada capilar se dobló dos veces, se insertó en un tubo de cuarzo estrecho que estaba abierto en ambos extremos (diámetro interno 2,5 mm) y a continuación se puso horizontalmente en la cavidad de EPR. Durante los experimentos, gases de las composiciones deseadas se inyectaron alrededor de la mezcla sin tener que perturbar el alineamiento del tubo dentro de la cavidad de EPR. Se registraron espectros de EPR en un espectrómetro de banda X Varian E4 (o E9), con el campo fijado a 3357G, frecuencia de modulación de 100 KHz, amplitud de modulación de 1G y potencia de microondas no saturante. El espectrómetro de EPR se interconectó a un PC IBM a través de un conversor de análogico a digital y un hardware de traducción de datos (DT2801) y los espectros se digitalizaron usando software de adquisición comercial, que permitía la substracción de las señales del fondo. Para estudiar la cinética de la pérdida de espín, los espectros se sobremodularon deliberadamente, y el campo magnético se mantuvo constante mientras se seguía la intensidad de la señal de EPR. Después de terminar la reacción de HX/XO mediante alopurinol, la pérdida de espín del nitróxido se invirtió añadiendo ferricianuro 0,5 mM, indicando que O\tfrac{\bullet}{\leq} reduce el nitróxido hasta su hidroxilamina respectiva (Samuni y otros, Free Rad. Biol. Med., 6, 141-148, 1989). Por otra parte, no era detectable efecto de O\tfrac{\bullet}{\leq} sobre la señal de EPR de nitróxidos de anillo de 6 miembros tales como TEMPO y TEMPOL (véase la Tabla 1B).

TABLA 1B

4

El fallo del superóxido para afectar a TEMPO y TEMPOL sugería aparentemente que los nitróxidos cíclicos de 6 miembros carecían de actividad similar a SOD. Como una comprobación adicional, se estudió la reacción de representantes de nitróxidos cíclicos tanto de 5 como de 6 miembros con O\tfrac{\bullet}{\leq}. El ensayo de reducción de ferricitocromo c inhibible por SOD (Fridovich, Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, 213-215, 1985) se usó para determinar constantes de velocidad de la reacción con O\tfrac{\bullet}{\leq}. Se generaron radicales superóxido a 25ºC en tampón de fosfato aireado (50 mM) que contenía DTPA 50 \muM, HX 5 mM y ferricitocromo c 10-50 \muM (con o sin 65 U/ml de catalasa). La reacción se inició añadiendo 0,01 U/ml de XO y la velocidad de reducción de ferricitocromo c, en ausencia (V) y en presencia (v) de diversos nitróxidos, se siguió espectrofotométricamente a 550 nm. Las cubetas tanto de referencia como de muestra contenían todos los reaccionantes, conteniendo la cubeta de referencia 100 unidades/ml de SOD, eliminando de ese modo reacciones espúreas de la interferencia con la determinación de las constantes de velocidad. Los datos se analizaron representando V/v como una función de [nitróxido] y se calculó k_{1}, conociendo k_{CitC+superóxido}, de acuerdo con. (V/v)-1 = k_{1}x[nitróxido]/K_{CitC+superóxido}x[Cit-c^{III}].

A través de este ensayo, se ha observado que todos los nitróxidos listados más adelante funcionan como miméticos de superóxido dismutasa.

TABLA 2

5

Las constantes de velocidad de la reacción de nitróxidos sintéticos con O_{2} a baja intensidad iónica (HEPES 10 mM) y pH 7,0 variaba de 1,1x10^{3} a 1,3x10^{6} M^{-1}s^{-1}, en comparación con 2,3x10^{9} M^{-1}s^{-1} para k_{cat} de SOD natural.

Ninguno de los nitróxidos mostrados (en las dos últimas tablas) exhibía citotoxicidad determinada por el ensayo clonogénico en células V79 expuestas durante 1 h a 5 mM. Para estudios subsiguientes, se eligieron el nitróxido más lipófilo, CHD, y el más hidrófilo, TEMPOL.

Ejemplo 2 Localización intracelular de nitróxidos

Las figuras 1A y C ilustran la señal de EPR de CHD y TEMPOL 1 mM, respectivamente, suspendidos con 6,4x10^{7} células V79/ml. Esta señal de EPR representa la concentración total de CDH intra- y extra-celular. El trioxalato-cromato es un agente de ampliación paramagnético que queda excluido del espacio del volumen intracelular y hace que la señal de EPR de especies extracelulares se haga no detectable (Lai, Biophys. J., 52, 625-628, 1987). Cuando las células se añadían a CHD o TEMPOL en presencia de trioxalato-cromato 110 mM, se detectaba una señal intracelular mucho más pequeña y todavía observable según se muestra en la figura 1B y D. La ampliación de la línea observable y la pérdida de la estructura hiperfina de la señal intracelular indica que el CHD, aunque no el TEMPOL, ha disminuido la libertad de movimiento (anisotropía) dentro del ambiente intracelular y está situado principalmente en un compartimento membranoso como puede anticiparse basándose en la diferencia entre sus lipofilias.

Ejemplo 3 Protección de células contra el daño oxidativo

Células de hámster chino V79 se hicieron crecer en medio F12 complementado con suero de ternero fetal al 10%, penicilina y estreptomicina. La supervivencia se determinó en todos los estudios mediante el ensayo clonogénico. El intervalo de eficacia de cultivo en placas era entre 80-90%. Cultivos de reserva de células que crecen exponencialmente se tripsinizaron, se enjuagaron y se cultivaron en placa (5x10^{5} células/cápsula) en un número de cápsulas de Petri de 100 mm y se incubaron 16 h a 37ºC antes de los procedimientos experimentales. Las células se expusieron durante 1 h a 37ºC a hipoxantina (HX) 0,5 mM + 0,005 U/ml de xantina oxidasa (XO) durante espacios de tiempo variables, o a H_{2}O_{2} a diferentes concentraciones. Para determinar la posible modulación en la citotoxicidad, se añadieron catalasa, 100 U/ml; SOD, 100 \mug/ml; DF, 500 \muM; y 5 mM de cada uno de los nitróxidos de la Tabla 1 a cultivos en paralelo. Se preparó CHD en una solución de reserva en etanol y se diluyó en un medio tal que la concentración final fuera 5 mM. Esto daba como resultado una concentración final de 1% de etanol en el medio que era no citotóxico y no influía en la respuesta celular a HX/XO o H_{2}O_{2}. El TEMPOL es soluble en agua y se preparó directamente en medio de cultivo tisular. Ni la catalasa, ni la SOD, ni la DF, ni el CHD ni el TEMPOL eran citotóxicos solos en las concentraciones usadas. La DF se añadió 2 h antes de o durante el tratamiento mientras los otros agentes estaban presentes solo durante el tratamiento con HX/XO o H_{2}O_{2}. Después del tratamiento, las células se enjuagaron, se tripsinizaron, se contaron y se cultivaron en placa para la formación de colonias macroscópicas. Para cada determinación de la dosis, las células se cultivaron en placas por triplicado y los experimentos se repitieron un mínimo de dos veces. Las placas se incubaron 7 días, después de los cuales las colonias se fijaron con metanol/ácido acético, se tiñeron con violeta cristal y se contaron. Las colonias que contenían >50 células se almacenaron. Las barras de error representan D.E. de la media y se muestran cuando son más grandes que el símbolo.

Algunos estudios requerían la exposición a H_{2}O_{2} bajo condiciones hipóxicas. Para estos estudios, células dispersadas en 1,8 ml de medio se cultivaron en placas en matraces de vidrio especialmente diseñados (Russo y otros, Radiat. Res., 103, 232-239, 1985). Los matraces se cerraron herméticamente con tapones de caucho blando y agujas de calibre 19 se introdujeron para actuar como aberturas de entrada y salida para una mezcla de gas humidificada de 95% de nitrógeno/5% de CO_{2} (Matheson Gas Products). Cada matraz también se equipó con un recipiente con brazos laterales de vidrio esmerilado que cuando se giraba y se invertía podía aportar 0,2 ml de medio que contenía H_{2}O_{2} a una concentración que cuando se añadía a la monocapa celular daba como resultado una concentración final de H_{2}O_{2} de 600 \muM. Los matraces tapados se conectaron en serie y se montaron sobre una plataforma oscilante y se gasificaron a 37ºC durante 45 minutos. Este procedimiento de gasificación da como resultado un equilibrio entre la fase gaseosa y líquida (tanto en el medio sobre la monocapa celular y como en la solución en el brazo lateral) y daba concentraciones de oxígeno en la fase de gas efluente de <10 ppm según se mide mediante una sonda Thermox (Russo y otros, Radiat. Res., 103 232-239, 1985). Después de 45 minutos de gasificación, la solución de H_{2}O_{2} hipóxica se añadió al cultivo de monocapa celular. Las células se expusieron a H_{2}O_{2} bajo condiciones hipóxicas. Se mantuvo flujo de N_{2} gaseoso durante la exposición a H_{2}O_{2}. En matraces paralelos, se añadieron DF y CHD según se describe previamente y estaban presentes durante todo el procedimiento de gasificación. Después del tratamiento, la supervivencia celular se determinó como se describe previamente.

El peróxido de hidrógeno se ensayó usando un YSI Model 27 Industrial Analyzer (Yellow Springs Instruments) equipado con un electrodo selectivo para H_{2}O_{2}. Para el análisis de preparaciones celulares, las células, excepto durante el breve tiempo requerido para la retirada de partes alícuotas para el análisis, se mantuvieron en matraces de cultivo T25 mantenidos a 37ºC en medio completo (pH 7,2). Partes alícuotas de 25 \mul se muestrearon del sistema de reacción o preparación celular en puntos temporales variables y se inyectaron en el analizador. Se determinó [H_{2}O_{2}] después de calibrar el instrumento con concentraciones conocidas de H_{2}O_{2}. Las concentraciones de soluciones de H_{2}O_{2} estándar se calibraron usando un ensayo yodométrico (Hochanadel, J. Phys. Chem., 56, 587-594, 1952).

Para exponer las células a estrés oxidativo se incubaron con HX/XO. La figura 2 muestra una curva de supervivencia para células expuestas a HX/XO. La supervivencia celular no se alteró cuando estaba presente SOD durante la exposición a HX/XO. En contraste, CHD o TEMPOL 5 mM protegían completamente las células. Los otros nitróxidos, presentados en la Tabla I, producían una detección similar (datos no mostrados). La figura 2 también muestra que la catalasa o DF proporciona una protección completa del daño derivado de HX/XO. La protección completa mediante DF requería una preincubación de 2 h con DF antes de que las células se expusieran a HX/XO, mientras que la adición de DF simultáneamente con HX/XO sólo ofrecía una protección parcial (datos no mostrados).

Una interpretación de los datos mostrados en la figura 2 es que el H_{2}O_{2} es la principal especie citotóxica producida por el sistema HX/XO (Link & Riley, Biochem. J., 249, 391-399, 1988). Esta suposición se basa en el hecho de que la catalasa extracelular proporcionaba una protección completa de HX/XO (figura 2). Para probar si la protección celular mediante el mimético de SOD resultaba de destoxificar H_{2}O_{2}, las células se expusieron a H_{2}O_{2} según se muestra en la figura 3. Los resultados de estos experimentos eran idénticos a los mostrados en la figura 2, en la que la SOD no se protegía, pero la catalasa, la DF, el TEMPOL y el CHD proporcionaban una protección completa contra citotoxicidad por H_{2}O_{2}. En este punto se cuestionó si el CHD podía tener otras características aparte de actuar como un mimético de SOD, a saber, si el CHD afecta a la concentración de H_{2}O_{2}. La figura 4 muestra la concentración de H_{2}O_{2} en cultivo tisular expuesto a HX/XO. Con el tiempo, había un aumento seguido por una disminución lenta en H_{2}O_{2}. La presencia de CHD no alteraba significativamente el patrón de generación de H_{2}O_{2} mediante HX/XO. Así, la protección celular proporcionada por CHD a HX/XO y H_{2}O_{2} no podía atribuirse a una reacción directa de CHD con H_{2}O_{2}.

Incluso con la exposición directa de células a H_{2}O_{2}, existe la posibilidad de que pudiera producirse superóxido intracelularmente como resultado del tratamiento con H_{2}O_{2}. Si se producía superóxido intracelularmente, la protección con CHD de células de HX/XO y H_{2}O_{2} podría esperarse, dados los hallazgos de que el CHD puede penetrar en los espacios intracelulares según se muestra en la figura 1. Para probar si la citoprotección proporcionada por CHD era solamente resultado de su reacción con superóxido, la eficacia del CHD se examinó cuando se aplicaba H_{2}O_{2} a células incubadas en un ambiente hipóxico, condiciones en las que la probabilidad de formación de superóxido se limitaría significativamente. Como se observa en la figura 5, el CHD protege contra la citotoxicidad por H_{2}O_{2} incluso bajo condiciones hipóxicas.

La figura 5 también muestra que la DF proporciona una protección completa frente a la citotoxicidad por H_{2}O_{2} bajo condiciones hipóxicas. El patrón de protección con DF mostrado en las figuras 2, 3 y 5 sugiere que la citotoxicidad de HX/XO y H_{2}O_{2} puede implicar directamente la reducción intracelular de H_{2}O_{2} por ion ferroso para producir el \cdotOH altamente tóxico. También se cuestionó si la protección aeróbica e hipóxica por CHD a la exposición por H_{2}O_{2} era un resultado de que el CHD afectara directamente a electrones de iones ferrosos, evitando de ese modo la generación de \cdotOH. Debido a que el hierro celular está quelado, la posible reacción del nitróxido con hierro(II) quelado se examinó repitiendo el experimento en presencia de DNA. Para estudiar la posibilidad de oxidación inducida por nitróxido de metales de transición, el CHD se mezcló hipóxicamente con hierro(II) en presencia de 0,1 mg/ml de DNA de salmón. Por consiguiente, se formó DNA-Fe(III) y la señal de EPR del nitróxido desapareció. La cinética de reacción se investigó manteniendo CHD o Fe(II) en exceso mientras la absorbancia debida a DNA-Fe(III) y la pérdida de espín del nitróxido se controlaban respectivamente (figura 6). Tanto la disminución de la señal de EPR como la aparición de la DO_{353 nm} obedecían a cinética de pseudoprimer orden de la que se calculó la constante de velocidad de reacción de segundo orden como 44 M^{-1}s^{-1} o 33 M^{-1} s^{-1} usando los datos de EPR o absorción óptica, respectivamente. Cuando se mezclaba hipóxicamente TEMPOL con DNA-Fe(II), tuvo lugar una reacción similar que tenía una constante de velocidad de reacción de segundo orden de 40 M^{-1}s^{-1}. La pérdida de espín se invertía completamente añadiendo ferricianuro 2 mM, indicando así que DNA-Fe(II) reducía el nitróxido respectivo hasta su hidroxilamina.

Ejemplo 4 Protección in vitro e in vivo contra la reacción ionizante por nitróxido

Se trataron células V79 de hámster chino con concentraciones variables de TEMPOL 10 minutos antes de la irradiación. La supervivencia clonogénica comparada con células de control se muestra en la figura 7. La extensión de la protección para TEMPOL 100 mM era aproximadamente 2,5 veces.

La protección proporcionada en animales enteros por TEMPOL se evaluó en ratones C3H hembra de seis semanas de edad a los que se administraban 275 mg/kg de TEMPOL intraperitonealmente 10 minutos antes de dosis de radiación del cuerpo entero que variaban de 3 Gy a 13 Gy. A los controles se les dio solución salina. La supervivencia se registró 30 días después de la exposición a radiación. La LD_{50(30)} se refiere a la dosis de radiación a la que 50% de los ratones sobrevivían 30 días después de la exposición. Como puede observarse en la figura 8, los ratones tratados con TEMPOL tenían una LD_{50(30)} aproximadamente 25% superior, demostrando la protección de la radiación de cuerpo entero y atoxicidad.

Los resultados previos demuestran que TEMPOL proporciona radioprotección a un nivel tanto in vitro como

\hbox{ in vivo .}

Ejemplo 5 Pérdida de peso inducida por nitróxido en animales

Se dejó que ratones C3H hembra de seis semanas de edad (6 animales en cada grupo) bebieran un suministro ilimitado de agua sola (control) o 4-hidroxitempo (TEMPOL) disuelto en agua a una concentración de 10 mg por ml. La administración oral crónica (>3 semanas) no daba como resultado toxicidad aparente para los animales, sin una reducción del peso en comparación con los controles en 12,5% según se muestra en la figura 9. Así, el nitróxido administrado durante períodos prolongados parece provocar pérdida de peso en los animales.

Habiéndose descrito así la invención, será obvio que la misma puede variarse de muchos modos. Tales variaciones no deben considerarse un apartamiento del espíritu y el alcance de la invención, y todas estas modificaciones que serán obvias para un experto en la técnica pretenden incluirse dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

1. Uso de un nitróxido independiente de metales o un compuesto de oxazolidina capaz de formar un oxazolidinoxilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para proteger a un paciente de los efectos de la radiación ionizante.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el compuesto tiene la fórmula

R_{3}-NR_{4}R_{5}

donde R_{3} es -O\cdot o -OH; y NR_{4}R_{5} es un grupo heterocíclico o R_{4} y R_{5} por sí mismos comprenden un grupo cíclico o heterocíclico substituido o no substituido.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene la fórmula

6

en la que R_{1} es -CH_{3} y R_{2} es -C_{2}H_{5}, -C_{3}H_{7}, -C_{4}H_{9}, -C_{5}H_{11}, -C_{6}H_{13}, -CH_{2}-CH(CH_{3})_{2}, -CHCH_{3}C_{2}H_{5} o -(CH_{2})_{7}-CH_{3}, o en la que R_{1} y R_{2} juntos forman espirociclopentano, espirociclohexano, espirocicloheptano, espirociclooctano,

\hbox{5-colestano}

o norbornano; R_{3} es -O\cdot o -OH; o una sal fisiológicamente aceptable del mismo.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el compuesto es 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo.

5. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, preferiblemente en su forma oxidada, para la fabricación de un medicamento para tratar los efectos del estrés oxidativo, en donde el estrés oxidativo se debe a agentes oxidantes, terapias con oxígeno, tratamiento con oxígeno hiperbárico, agentes carcinogénicos, quimioterapéuticos o mutagénicos.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el compuesto es como se define en la reivindicación 3, en el que R_{3} es -O\cdot.

7. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 ó 4, preferiblemente en su forma oxidada, para la fabricación de un medicamento para tratar los efectos del estrés oxidativo, en donde el estrés oxidativo se debe a agentes oxidantes, terapia con oxígeno o tratamiento con oxígeno hiperbárico.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el compuesto es como se define en la reivindicación 2, en el que R_{3} es -O\cdot.

9. Un método para prolongar la vida de almacenamiento de células, tejidos u órganos humanos o animales, que comprende poner en contacto las células, los tejidos o los órganos con una solución de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.