ES2198774T3 - Utilizacion de citoquinas y nitrogenos para inhibir respuestas inmunes patologicas. - Google Patents

Abstract

Utilización de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), tratadas con IL-2 o TGF-Beta, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.

Description

Utilización de citoquinas y nitrógenos para inhibir respuestas inmunes patológicas.

Campo de la invención

El campo de la invención trata de la utilización de una composición que comprende la IL-2 o el TGF-\beta para el tratamiento de enfermedades auto-inmunes mediadas por anticuerpos.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades auto-inmunes están causadas por el fallo del sistema inmune para diferenciar lo propio de lo extraño. En estas enfermedades, el sistema inmune reacciona contra los propios tejidos y esta respuesta causa, en última instancia, inflamación y lesión tisular. Las enfermedades auto-inmunes se pueden clasificar en dos categorías básicas: enfermedades mediadas por anticuerpos como el lupus sistémico eritematoso (LSE), el pénfigo vulgar, la miastenia gravis, la anemia hemolítica, la trombocitopenia púrpura, la enfermedad de Greaves, la enfermedad de Sjogrens y la dermatomiositis; y las enfermedades mediadas por células como la enfermedad de Hashimoto, la polimiositis, la enfermedad inflamatoria de los intestinos, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus, la artritis reumatoide y la esclerodermia.

En muchas enfermedades auto-inmunes, la lesión tisular está causada por la producción de anticuerpos contra el tejido nativo. Estos anticuerpos se denominan auto-anticuerpos, ya que son producidos por un mamífero y tienen sitios de unión con los tejidos del propio mamífero. Algunas de estas enfermedades presentan unos aumentos y disminuciones característicos de la cantidad de auto-anticuerpos circulantes causantes de los diversos síntomas con el tiempo.

De los diferentes tipos de enfermedades auto-inmunes mediadas por anticuerpos, el LSE es una enfermedad que se ha estudiado con detalle y está bien documentada. El LSE es una enfermedad de auto-inmunidad generalizada caracterizada por la hiperactividad de células B con numerosos auto-anticuerpos contra los antígenos nucleares, citoplasmáticos y de superficie celular. Esta enfermedad auto-inmune tiene una patogénesis multifactorial con factores desencadenantes ambientales (revisado en Hahan, B.H., Dubois Lupus Erythematosus, 5ª Ed. (1997), pp. 69-76 (D.J. Wallace y col., eds., Williams y Wilkins, Baltimore)). Entre los numerosos defectos descritos en linfocitos, el defecto en el LSE es un fallo de las células T reguladoras para inhibir la función B (Horwitz, D.A., Dubois, Lupus Erythematosus, 5ª Ed. (1997), pp. 155-194 (D.J. Wallace y col., Williams y Wilkins, Baltimore)). Las células T reguladoras pueden regular negativamente la síntesis de anticuerpos mediante mecanismos líticos o mediados por citoquinas. El último mecanismo implica el factor de crecimiento transformante de tipo beta (TGF-\beta) y otras citoquinas inhibidoras (Wahl, S.M. (1994), J. Exp. Med. 180:1587-1590). Los linfocitos B circulantes que secretan espontáneamente Ig se hallan aumentados en pacientes con LSE activo (Klinman, D.M., y col., (1991) Arthritis Rheum 34:1404-1410). La producción sostenida de IgG y anticuerpos policlonales in vitro requiere linfocitos T auxiliares (Zhivakumar, S. y col., (1989) J. Immunolo. 143:103-112).

Las manifestaciones clínicas del LSE incluyen una erupción cutánea (especialmente en la cara en forma de "mariposa"), glomerulonefritis, pleuresía, pericarditis e implicación del sistema nervioso central. Muchos de los pacientes son mujeres y relativamente jóvenes (edad media al diagnóstico de 29 años).

El tratamiento del LSE depende de las manifestaciones clínicas. Algunos pacientes con síntomas clínicos ligeros responden a medidas simples como los agentes anti-inflamatorios no-esteroideos. Sin embargo, síntomas mucho más severos requieren esteroides con potente acción anti-inflamatoria e inmunosupresora como la prednisona. Otros fármacos potentes inmunosupresores que pueden utilizarse son la azatioprina y la ciclofosfamida. Los esteroides y otros fármacos inmunosupresores tienen efectos secundarios debido a la reducción global del sistema inmune de mamíferos. En la actualidad, no existe un tratamiento ideal para el LSE y por lo tanto la enfermedad no se puede curar.

Actualmente, la atención se ha focalizado en la identificación de genes que aumentan la susceptibilidad de la resistencia a LSE, en la identificación de determinantes antigénicos que desencadenan la enfermedad, en los mecanismos moleculares de la activación de células T que dan como resultado la supervivencia o apoptosis celular y en las citoquinas que determinan la función de las células T y las propiedades de las células B formadoras de auto-anticuerpos. Se han descrito muchos ejemplos de disregulación de células T en el LSE (revisado en Horwitz, D.A. y col., Dubois Lupus Erythematosus, 5ª Ed. (1997), pp. 83-96 (D.J. Wallace y col., eds. Williams y Wilkins, Baltimore). Aunque está bien establecido que la función principal de algunos linfocitos es regular negativamente las respuestas inmunes, el progreso para elucidar la identidad y los mecanismos necesarios para la generación de estas células ha sido lento.

Previamente, se consideró que la interleuquina-2 (IL-2) presentaba una función importante en la generación de células T supresoras no-específicas de antígenos. Los anticuerpos anti-IL-2 producidos en ratones coinciden con la inducción de la enfermedad injerto contra huésped producida en algunos casos de LSE (Via, C.S. y col. (1993) International Immunol. 5:565-572). El que la IL-2 sea directa o indirectamente importante para generar la supresión ha sido tema de controversia (Fast, L.D. (1992), J. Immunol. 149:1510-1515; Hirohata, S. y col. (1989), J. Immunol. 142:3104-3112; Baylor, CE (1992), Advances Exp. Med. Biol. 319:125-135. Recientemente, se ha demostrado que la IL-2 induce las células CD8+ a suprimir la replicación del VIH en las células T CD4+ mediante un mecanismo no-lítico. Este efecto está mediado por citoquinas, aunque todavía no se ha identificado la citoquina específica (Kinter, Al.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10985-10989; Barker, T.D. y col., (1996), J. Immunol. 156:4478-4483). La producción de células T de IL-2 está disminuida en el LSE (Horwitz, D.A. y col., (1997), Dubois Lupus Erytematosus, 5ª Ed. (1997), pp. 83- 96, D. J. Wallace y col., Eds. Williams and Wilkins, Baltimore).

Las células T CD8+ de los individuos LSE mantienen en lugar de suprimir la producción de IgG policlonal (Linker-Israeli, M. y col. (1990), Arthritis Rheum. 33:1216-1225). Las células T CD8+ de donantes sanos pueden estimularse para incrementar la producción de Ig (Takahashi, T. y col., (1991), Clin. Immunol. Immunopath. 58:352-365). Sin embargo, no se ha demostrado que la IL-2, como las células T CD4+, por ellas mismas, indujeran las células T CD8+ a desarrollar una actividad fuertemente supresora. Cuando se incluyeron las células NK ("natural killer" del inglés) en los cultivos, apareció una actividad fuertemente supresora (Gray y col., (1994) J. Exp. Med. 180:1937-1942). Se cree que la contribución de las células NK en el cultivo es producir el factor de crecimiento transformante de tipo beta (TGF-\beta) en su forma activa. Se descubrió entonces que concentraciones no-inmunosupresoras (2-10 pg/ml) de esta citoquina sirven como co-factores para la generación de efectos fuertemente supresores en la producción de IgG e IgM (Gray , J.D., y col. (1994) J.Exp. Med. 180:1937-1942). Además, se cree que las células NK son la principal fuente de TGF-\beta en los linfocitos no-estimulados (Gray J.D. y col., (1998) J. Immunol. 160:2248-2254).

TGF-\beta es una familia multifuncional de citoquinas de importancia en la reparación tisular, la inflamación y la inmunoregulación (Massague, J. (1980), Ann. Rev. Cell. Biol. 6:597). El TGF-\beta, a diferencia de otras muchas citoquinas, se libera de forma inactiva biológicamente y es incapaz de unirse a receptores específicos (Sporn, M.B., (1987) J. Cell Biol. 105:1039-1045). El complejo latente se corta extracelularmente para liberar la citoquina activa tal como se indicó anteriormente. La respuesta al TGF-\beta requiere la interacción de dos receptores de superficie (TGF\beta-R1) y TGF\beta-R2) descubiertos de forma ubicuitaria en las células mononucleares (Massague, J. (1992) Cell 69:1067-1070). En consecuencia, la conversión del TGF\beta latente al activo es la etapa crítica que determina los efectos biológicos de esta citoquina.

Se halló que los pacientes LSE presentaban una producción reducida de TGF\beta por las células NK. Los defectos en el TGF\beta constitutivo producido por las células Nk, así como el TGF\beta inducido se han documentado en un estudio de 38 pacientes LSE (Ohtsuk, K. y col., (1998), J. Immunol. 160:2539-2545). Curiosamente, ni la adición de IL-2 recombinante, ni del TNF-alfa, ni del antagonismo de IL-10 pudieron normalizar el defecto del TGF\beta en el LSE. La producción reducida de TGF\beta en el LSE no se correlaciona con la actividad de la enfermedad y en consecuencia puede ser un defecto primario.

La administración sistémica de un tratamiento a un paciente LSE con TGF\beta, IL-2 o una combinación de ambos puede provocar graves efectos secundarios. Estas citoquinas ejercen numerosos efectos sobre los diferentes tejidos corporales y no son muy seguras para suministrar a un paciente por vía sistémica. En consecuencia, es un objetivo de la presente invención proporcionar procedimientos y equipos para el tratamiento de células de mamífero que sean responsables para el control de la regulación de auto-anticuerpos para incrementar la población de células que regulen negativamente la producción de auto-anticuerpos.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la primera invención proporciona la utilización de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) tratadas con IL-2 o TGF-\beta en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de una composición inhibidora que comprende la IL-2 o el TGF-B en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno auto-inmune. Las utilizaciones comprenden la eliminación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del paciente y el tratamiento de las células con una composición inhibidora durante un tiempo suficiente para suprimir la producción de Ig, o estimular, o inducir las células para que ejerzan una regulación negativa de la producción de Ig. Las células pueden así ser reintroducidas al paciente, resultando en una mejora de los síntomas auto-inmunes. La composición inhibidora comprende preferentemente una combinación de IL-2 y de TGF-\beta.

Descripcion resumida de las figuras

La Figura 1 muestra que la incubación de PBMC de pacientes LSE con IL-2 y TGF-\beta disminuye espontáneamente la producción de inmunoglobulinas. Los PBMC se cultivaron (2x10^{5}/célula) en medio AIM-V libre de suero con o sin IL-2 (10 U/ml) y TGF-\beta (10 pg/ml). Al cabo de 3 días, los pocillos se lavaron tres veces y se añadió medio fresco AIM-V. Se recogieron los sobrenadantes de los pocillos después de 7 días y se determinó el contenido de IgG mediante un ELISA.

La Figura 2 muestra que la IL-2 y el TGF-\beta reducen espontáneamente la producción de IgG. Los valores representan la media \pm SEM de IgG (\mug/ml) producida por los PBMC de 12 pacientes LSE cultivados tal como se indica en la leyenda de la figura 1, excepto que las células se incubaron únicamente con IL-2 (10 U/ml) o con TGF-\beta (10 pg/ml).

Las Figuras 3A y 3B muestran que el anti-TGF-B puede invertir los efectos de la IL-2. Los PBMC de pacientes LSE se cultivaron durante 3 días en presencia (histogramas rellenos) o ausencia (histogramas de puntos) de IL-2

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(10 U/ml). En dichos cultivos se incluyó el medio, el anti-TGF\beta (10 \mug/ml) o la IgG1 de ratón (10 \mug/ml) como control. Después de 3 días, los pocillos se lavaron y se añadió medio fresco AIM-V. Se recogieron los sobrenadantes después de siete días más y se analizaron para conocer su contenido en IgG (Figura 3A) o anti-NP (Figura 3B) mediante ELISA.

Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran los efectos reguladores de las células T CD8+ en la producción de anticuerpos. (A) Sinergismo entre las células NK y las células CD8+ en la supresión de la producción de IgG en un individuo sano. Las células CD4+ y las células B se estimularon con anti-CD2 y se examinaron los efectos sobre las células CD8+ y NK. La combinación de células NK y CD8+ inhibió de forma importante la producción de IgG inducida por el anti-CD2, tal como se indicó anteriormente (Gray, J:D. y col. (1998), J. Immunol 160:2248-2254; Gray, J.D. y col., (1994), J.Exp. Med. 180:1937-1942). (B) Las células NK y las CD8+ incrementan la síntesis de IgG en el LSE. Las células CD4+ de un paciente con LSE activo y las células B en reposo de un individuo sano se estimularon con anti-CD2. El incremento de la producción de IgG por las células CD8+ LSE fue muy marcado por la adición de células NK. (C) Normalización de la función de las células T CD8+ producida por citoquinas en el LSE. Paralelamente, al estudio mostrado en la Fig. 4B, las células T CD4+ de este paciente se estimularon con anti-CD2 en presencia o ausencia de células T CD8+. Según la indicación, se añadió IL-2 (10 U/ml) y/o TGF-\beta (2 pg/ml). Estas citoquinas eliminaron los efectos auxiliares de estas células CD8+ y las incapacitaron para inhibir la producción de IgG en un 75%.

Las Figuras 5A y 5B muestran la producción linfocitaria de TGF-\beta1 por células no-estimuladas y estimuladas con anti-CD-2. Se añadieron los PBL de donantes sanos y de pacientes LSE y AR a placas de microtitulación a 1x10^{5}células/pocillo. Algunos pocillos recibieron mAbs anti-CD2 (1:40) y T11 (1:80). Al cabo de 2 días a 37ºC, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para estimar el TGF-B1 activo y total. Los valores de p significativos se hallan indicados.

Descripción detallada

La presente invención facilita un procedimiento de tratamiento de las enfermedades auto-inmunes mediadas por anticuerpos, como el lupus sistémicos eritematoso (LSE), mediante eliminación de las células de un paciente y su tratamiento con una composición que regula negativamente la hiperactividad de las células B, e inhibe así la producción de anticuerpos Ig, incluyendo los auto-anticuerpos, para mejorar los síntomas de la enfermedad auto-inmune. Esta estrategia se diferencia de casi todo el resto de modalidades de tratamiento actualmente en uso, que son tratamientos anti-inflamatorios o inmunosupresores. Los corticoides comúnmente utilizados suprimen la producción de citoquinas y bloquean los eventos terminales que causan la lesión tisular, pero generalmente no alteran la respuesta auto-inmune citada. Los fármacos citotóxicos, o los experimentales biológicos diseñados genéticamente como los anticuerpos monoclonales pueden también disminuir poblaciones linfocíticas específicas, o interferir con su función. Estos fármacos son generalmente de un éxito moderado y presentan graves efectos secundarios. Algunas citoquinas se han suministrado sistémicamente a pacientes, pero estos agentes también presentan acciones amplias asociadas con efectos secundarios graves.

En cambio, la estrategia de la presente invención es producir una remisión al restaurar una función celular reguladora normal y, en consecuencia, "reajustar" el sistema inmune. Otra ventaja potencial significativa de esta estrategia es una baja probabilidad de efectos secundarios graves. Ya que únicamente serán devueltos a los pacientes cantidades mínimas de las composiciones inhibidoras como las citoquinas, lo que representaría una toxicidad mínima.

En pacientes con LSE, los linfocitos B circulantes que secretan esponténeamente IgG secretoras se hallan incrementados (Blaese, R. M., y col. (1980), Am. J. Med. 69:345-350; Klinman, D.M. y col. (1991) Arthritis Rheum. 34:14004-1410). La producción sostenida de IgG y anticuerpos policlonales in vitro requiere la presencia de células T auxiliares (Shivakumar, S. y col. (1989), J. Immunol 143:103-112). Estudios previos de la regulación de células T sobre la producción espontánea de IgG muestran que mientras las células T CD8+ inhiben la producción de anticuerpos en individuos sanos, en el LSE estas células apoyan la función de célula B (Linker-Israeli, M. y col., (1990), Arthritis Rheum. 33:1216-1225).

Según ello, la presente invención posibilita los procedimientos de tratamiento de las enfermedades auto-inmunes mediadas por anticuerpos, comprendiendo dicho tratamiento la extracción de las células mononucleolares de sangre periférica (PBMC) del paciente con la enfermedad auto-inmune y el tratamiento de las células con una composición inhibidora.

El tratamiento de las células mediante una composición inhibidora conduce a la supresión directa de la producción de IgG en las células tratadas, lo que puede conducir a la mejora de los síntomas auto-inmunes. Alternativa o adicionalmente, el tratamiento de las células induce que las células reguladoras regulen negativamente la producción de Ig en otras células. Las Ig en este contexto abarcan todas las formas de Ig, incluyendo las IgM, IgG, IgE, etc. El resultado neto es una disminución de la cantidad de Ig en el sistema.

En consecuencia, la presente invención restaura la capacidad de las células T de sangre periférica de los pacientes con enfermedades auto-inmunes para regular negativamente la producción de anticuerpos, mediante el tratamiento de estas células con una composición inhibidora ex vivo.

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El término "enfermedades auto-inmunes mediadas por anticuerpos" hace referencia a una enfermedad en la que los individuos desarrollan anticuerpos contra constituyentes de sus propias células o tejidos. Las enfermedades auto-inmunes mediadas por anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, el lupus sistémico eritematoso (LSE), el pénfigo común, la miastenia gravis, la anemia hemolítica, la trombocitopenia púrpura, la enfermedad de Grave, la dermatomiositis y la enfermedad de Sjogren. La enfermedad auto-inmune modelo es el LSE.

El término "tratamiento" de una enfermedad auto-inmune hace referencia a que por lo menos se mejora un síntoma de la enfermedad auto-inmuen mediante la utilización médica ya citada. Esto puede evaluarse de muy diferentes maneras, incluyendo tanto los factores objetivos como los subjetivos en relación con el paciente, por ejemplo, se pueden evaluar las manifestaciones inmunológicas de la enfermedad; por ejemplo, el nivel espontáneo de anticuerpos Ig y la producción de auto-anticuerpos, en particular la producción de IgG en el caso del LSE se reduce. Se pueden cuantificar los niveles totales de anticuerpos Ig, o de auto-anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, los anticuerpos anti-DNA de cadena doble (dsDNA), los anticuerpos anti-nucleoproteínas, anti-Sm, anti-Rho y anti-La. Se pueden alterar los síntomas físicos, como la desaparición o la reducción de una erupción en el LSE. Se pueden analizar las funciones renales para determinar sus alteraciones y se puede evaluar la lesión tisular relacionada con la inflamación mediante análisis de laboratorio. Los niveles disminuidos de los complejos inmunes circulantes y de los niveles del complemento del suero son una evidencia más de la mejoría. En el caso del LSE, se puede observar una disminución de la anemia. La capacidad para disminuir la cantidad de fármacos requeridos por un paciente, como los inmunosupresores, puede también ser una indicación del éxito del tratamiento. Otras evaluaciones del éxito del tratamiento serán evidentes para los expertos en la materia de la enfermedad auto-inmune en particular.

El término "paciente" significa un sujeto mamífero a tratar, preferentemente pacientes humanos. En algunos casos, las utilizaciones de la invención hallan una utilización con animales de experimentación, en la aplicación veterinaria y en el desarrollo de modelos animales de la enfermedad, incluyendo, pero sin limitarse a, roedores incluyendo ratones, ratas y hámsteres y los primates.

Las utilizaciones médicas proporcionan los medios para extraer las células sanguíneas de un paciente. En general, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se obtienen del paciente mediante técnicas estándares. El término "células mononucleares de sangre periférica" o "PBMCs" hace referencia a los linfocitos (incluyendo las células T, las células B, las células NK, etc.) y los monocitos. Como se indica más adelante de forma más completa, parece ser que el efecto principal de la composición inhibidora es permitir que las células T CD8+ supriman la producción de IgG. Según ello, la población de PBMC comprendería las células T CD8+. Preferentemente, se extraen únicamente las células PBMC, dejando o retornando prácticamente todas los eritrocitos y leucocitos polimorfonucleados al paciente. Esto se realiza tal como se conoce en la materia, por ejemplo, utilizando técnicas de leucoforesis. En general, se realiza una etapa de leucoforesis de 5 a 7 litros, que extrae esencialmente las PBMCs del paciente, devolviendo los componentes sanguíneos restantes. La toma de muestra celular se realiza preferentemente en presencia de un anticoagulante como la heparina, bien conocida en la materia.

En general, la muestra que comprende las PBMCs se puede pretratar de muy diversas maneras. Las células, una vez recogidas, se pueden además concentrar, si no se ha realizado simultáneamente con la recogida de muestras, o se puede realizar posteriormente con la purificación. Las células se pueden lavar, contar y resuspender en un tampón.

Las PBMCs se concentran generalmente para el tratamiento, utilizando técnicas estándares en la materia. En una realización preferida, la etapa de leucoforesis proporciona una muestra concentrada de PBMCs, en un leukopak estéril que puede contener reactivos y/o dosis de la composición inhibidora, tal como se describe más adelante con mayor detalle. En general, se realiza una etapa adicional de concentración/purificación, como la conocida centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque.

En una realización preferida, las PBMCs se lavan para eliminar las proteínas séricas y los componentes sanguíneos solubles, como los auto-anticuerpos, los inhibidores, etc., utilizando técnicas bien conocidas en la materia. En general, esto implica la adición de medios o tampones fisiológicos, seguido de una centrifugación. Este lavado se repetirá tantas veces como sea necesario. Las PBMCs se pueden resuspender en medio fisiológico, preferentemente en medio AIM-V libre de suero (Life Technologies)(ya que el suero contiene cantidades significativas de inhibidores), aunque también se pueden utilizar los tampones como la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), o la solución fisiológica salina tamponada.

A continuación, las células se cuentan y se recogen generalmente de 1x10^{9} a 2x10^{9} glóbulos blancos de la etapa de leucoforesis de 5-7 litros. Estas células se resuspenden en 200 ml de tampón o medio.

En una realización preferida, las PBMCs se pueden enriquecer en uno o más tipos celulares. Por ejemplo, las PBMCs se pueden enriqueces en células T CD8+ o T CD4+. Esto se realiza tal como se conoce en la materia, como se describe en Gray y col. (1998) J. Immunol. 160:2248, incorporado aquí mediante referencias. En general, esto se realiza utilizando columnas inmunoabsorbentes disponibles comercialmente, o utilizando procedimientos de investigación (las PBMCs ser añaden a un columna de lana de nylon y se eluyen, las células no adherentes se tratan con los anticuerpos contra CD4, CD16, CD11b y CD74 y se prosigue con el tratamiento con bolas inmunomagnéticas, obteniéndose una población enriquecida en células T CD8+).

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Una vez que las células han sufrido cualquier pretratamiento necesario, se tratan con una composición inhibidora. El término "tratado" significa que las células se incuban con la composición inhibidora durante un periodo de tiempo suficiente para desarrollar la capacidad de inhibir la producción de Ig y de auto-anticuerpos, en particular cuando se devuelve al paciente. La incubación se realizará generalmente a temperatura fisiológica. Tal como se indicó anteriormente, esto puede ser el resultado de la supresión directa de la producción de Ig por las células tratadas, o de la inducción de células reguladoras para regular negativamente la producción de Ig en los órganos linfoides de los pacientes.

El término "composición inhibidora" o "composición inhibidora de la producción de Ig" o "composición inhibidora humoral" hace referencia a una composición que puede causar la inhibición de la producción espontánea de Ig y auto-anticuerpos. Estas composiciones son las citoquinas. Las composiciones inhibidoras adecuadas incluyen la IL-2, el TGF-\beta y los activadores de CD2, incluyendo los anticuerpos anti-CD2 y el ligando CD2, el LFA-3, así como las mezclas o combinaciones de éstos. Una composición inhibidora preferida es una mezcla de IL-2 y TGF-\beta.

La concentración de la composición inhibidora variará según la identidad de la composición. En una realización preferida, se utiliza el TGF-\beta como la composición inhibidora. El término "factor de crecimiento transformante -\beta" o "TGF-\beta" hace referencia a cualquier miembro de la familia de los TGF-\betas, incluyendo las tres isoformas de

\hbox{TGF- \beta 1}

, TGF-\beta2 y TGF-\beta3; ver Massague, J. (1980). J. Ann. Rev. Cell. Biol. 6:597. Lymphocytes and Monocytes produce the \beta1 isoform of this cytokine (Kehrl, J. H. y col., (1991), Int. J. Cell Cloning 9:438-450). El TGF-\beta puede ser cualquier forma de TGF-\beta que sea activa en las células de mamífero a tratar. En los humanos, se prefiere actualmente el

\hbox{TGF- \beta }

recombinante. Un TGF-\beta humano preferido puede obtenerse de Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA. En general, la concentración de TGF-\beta utilizada varía desde 2 pg a aproximadamente 2 ng por ml de suspensión celular, preferentemente de 10 pg a aproximadamente 500 pg y todavía más preferentemente de 50 pg a 150 pg e idealmente de 100 pg.

En otra realización preferida, se utiliza la IL-2 como composición inhibidora. La IL-2 puede ser cualquier forma de IL-2 que sea activa en las células de mamífero a tratar. En humanos, se prefiere actualmente la IL-2 recombinante. Esta IL-2 recombinante puede obtenerse de Cetus, Emeryville, CA. En general, la concentración de IL-2 que se utiliza se halla en un intervalo de 1 Unidad/ml de suspensión celular a aproximadamente 100 U/ml, preferentemente de

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5 U/ml a aproximadamente 25 U/ml y más preferentemente de 10 U/ml. En una realización preferida, la IL-2 no se utiliza sola.

En una realización preferida, un activador de CD2 como los anticuerpos anti-CD2 o el ligando de CD2, LFA-3, se utilizan además en la composición inhibidora. El CD2 es una glicoproteína de superficie celular que se expresa en los linfocitos T. El término "activador de CD2" hace referencia a un compuesto que iniciará la vía de señalización de CD2. Un activador de CD2 preferido comprende los anticuerpos anti-CD2 (OKT11, American Type Culture Collection, Rockville MD). En general, la concentración utilizada del activador de CD2 será suficiente para inducir la producción de TGF-\beta. La concentración de los anticuerpos anti-CD2 utilizada se halla en un intervalo de aproximadamente

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1 ng/ml a 10 \mug/ml y preferentemente de 10 ng/ml a 100 ng/ml aproximadamente.

Además de utilizar una composición inhibidora, en algunas realizaciones es deseable utilizar un mitógeno para activar las células; dado que muchas de las células en fase de reposo no contienen grandes cantidades de receptores de citoquinas. La utilización de un mitógeno como la Concanavalina A puede permitir la estimulación de las células para producir los receptores de citoquinas, que a su vez harán que la utilización de la invención sea más eficaz. Cuando se utiliza un mitógeno como la ConA, se utiliza generalmente tal como se conoce en la materia, a concentraciones en un intervalo de 1 \mug/ml a aproximadamente 10 \mug/ml. Además, puede ser deseable lavar las células con componentes que eliminen la ConA, como la \alpha-metil-manósido, tal como se conoce en la materia.

La composición inhibidora se incuba con las células durante un período de tiempo suficiente para causar un efecto. En una realización preferida, el tratamiento de las células con la composición inhibidora se prosigue inmediatamente con la devolución de las células al paciente. Según ello, en una realización preferida, las células se incuban con la composición inhibidora durante 12 a 120 horas, preferentemente 24 a aproximadamente 72 horas y más preferentemente 48 horas.

En una realización, las células se tratan durante un período de tiempo, se lavan para eliminar la composición inhibidora y luego pueden reincubarse. Antes de la introducción en el paciente, las células se lavan preferentemente, tal como se indicó anteriormente, para eliminar la composición inhibidora. Además, también se pueden realizar incubaciones para el análisis o la evaluación, que pueden variar desde una pocas horas a varios días. Si se desea realizar la evaluación de la producción de Ig antes de la re-introducción de las células a un paciente, las células se incubarán durante varios días para permitir que tenga lugar la producción de Ig (o la falta de lo mismo).

Una vez que se han tratado las células, se pueden evaluar o analizar antes de su autotransplantación en el paciente. Por ejemplo, se puede extraer una muestra para realizar: análisis de esterilidad; tinción de Gram., estudios microbiólogicos; estudios de LAL; estudios de micoplasmas; citometría de flujo para identificar los tipos celulares; estudios funcionales, etc. De manera similar, estos y otros estudios se pueden realizar antes y después del tratamiento.

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En una realización preferida, se puede evaluar la cantidad o la calidad, es decir, tipo de producción de Ig. Así, por ejemplo, se pueden evaluar los niveles totales de Ig, o los niveles de tipos específicos de Igs, por ejemplo, IgG, IgM, etc.; IgG, auto-anticuerpos anti-DNA, anticuerpos anti-nucleoproteínas (NP), etc.

En una realización preferida, los niveles de Ig, en particular IgG, se analizan utilizando técnicas bien conocidas en la materia, incluyendo ensayos ELISA, tal como se describe en Abo y col., (1987), Clin. Exp. Immunol. 67:544 y Linker-Israeli y col., (1990), Atrhritis Rheum. 33:1216, incorporados ambos en las referencias. Estas técnicas también se pueden utilizar para detectar los niveles de anticuerpos específicos, como los auto-anticuerpos.

En una realización preferida, el tratamiento da como resultado una disminución significativa de la cantidad de IgG y de los auto-anticuerpos producidos, preferentemente con una disminución por lo menos del 10%, más preferentemente de por lo menos del 25% e idealmente del 50%. En muchas realizaciones, se pueden observar disminuciones del 75% o superior.

En una realización preferida, antes del transplante, también se puede analizar la cantidad de TGF-\beta total o activo. Tal como se indica aquí, el TGF-\beta se produce como un precursor latente que se activa post-traduccionalmente.

Después del tratamiento, las células se transplantan o se reintroducen de nuevo en el paciente. Ello se realiza generalmente, tal como se conoce en la materia, y comprende la inyección o la introducción de las células tratadas en el paciente, mediante administración intravenosa, como se apreciará por los expertos en la materia. Por ejemplo, las células pueden colocarse en una bolsa de infusión e inyectrse con jeringas estériles u otros mecanismos de transferencia estériles. Las células se pueden infundir inmediatamente mediante administración i.v. durante un período de tiempo, como por ejemplo 15 min, mediante una línea de flujo i.v. libre en el paciente. En algunas realizaciones, se pueden añadir también reactivos adicionales como tampones o sales.

Después de reintroducir las células en el paciente, se puede evaluar el efecto del tratamiento, si se desea, tal como se indicó anteriormente. Así, se pueden evaluar las manifestaciones inmunológicas de la enfermedad; por ejemplo, se pueden analizar los títulos de Ig totales o de inmunoglobulinas específicas, realizar pruebas de funciones renales, evaluar la lesión tisular, etc.

El tratamiento se puede repetir tantas veces como sea necesario. Por ejemplo, el tratamiento puede realizarse una vez a la semana durante de varias semanas, o muchas veces a la semana durante un determinado período de tiempo, por ejemplo 3-5 veces durante un período de dos semanas. En general, la mejora de los síntomas de la enfermedad auto-inmune persiste durante cierto tiempo, preferentemente durante por lo menos unos meses. Con el tiempo, el paciente puede experimentar una recaída, sufriendo de nuevo los síntomas, por lo que en esas circunstancias se pueden repetir los tratamientos.

Los siguientes ejemplos sirven para describir más completamente la manera de utilizar la invención anteriormente descrita, así como para exponer los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se sobreentiende que estos ejemplos se presentan con propósito ilustrativo.

Ejemplos Ejemplo 1 Tratamiento de las PBMCs con una mezcla de IL-2 y TGF-\beta

El ejemplo 1 muestra que el tratamiento relativamente breve de las PBMCs de pacientes LSE con IL-2 y TGF-\beta puede dar como resultado la inhibición marcada de la producción espontánea de IgG y auto-anticuerpos policlonales. Como se describe más adelante, las PBMC de 12 pacientes con LSE activo se expusieron a IL-2 con o sin TGF-\beta durante 3 días y luego se lavaron y cultivaron siete días más. La disminución media en la secreción de IgG fue del 79%. Este efecto fuertemente inhibidor se observó en los casos con la mayor hiperactividad de células B. En 4 casos, se observó producción espontánea de anticuerpos anti-nucleoproteínas (NP) y el tratamiento con citoquinas de las PBMC disminuyó la producción de auto-anticuerpos del 50% al 96%. La IL-2 inhibió la producción de Ig mediante mecanismos dependientes o independientes de TGF-\beta en pacientes aislados. En un estudio sobre la producción de IgG estimulada por anti-CD2 en un paciente con LSE activo, se observó que tanto la IL-2 como el TGF-\beta pueden invertir los efectos incrementadores de las células T CD8+ sobre la producción de IgG e inducir en su lugar una actividad supresora.

Procedimientos Individuos del estudio de la síntesis espontánea de Ig

Se eligieron 12 individuos con un diagnóstico de LSE que cumplían con el criterio ARA para la clasificación de LSE (Arnett, F.C. y col., (1998), Athritis Rheum 31:315-324). Estos pacientes fueron todas mujeres, 8 hispanas, 2 afro-americanas y 2 asiáticas. La edad de cada paciente y la duración de la enfermedad se muestra en la Tabla 1. Se hospitalizaron cinco pacientes y 7 fueron pacientes externos. También se han indicado los pacientes que recibieron corticosteroides o antimalariales. Ocho pacientes no se trataron. La actividad de la enfermedad se valoró según los índices SLAM (Liang, M.H. y col. (1989), Atrhritis Rheum 32:1107-1118) y SLEDAI (Bombardier, C. y col., (1992), Arthritis Rheum. 35:630-640) con valores medios de 16,5 y 13,4, respectivamente.

TABLA 1

Perfil de los pacientes LSE
Caso	Sexo	Edad	Etnia	Duración	Medicación	SLAM	SLEDAI	IgG (\mug/ml)
1	F	18	A	3 años	Nil	13	9	13,7
2	F	37	H	6 meses	Nil	23	13	13,0
3	F	29	H	1 año	Nil	15	6	2,6
4	F	32	AA	4 años	Pred 5 mg	9	6	2,5
					Ohclor 400 mg
5	F	57	A	5 meses	Nil	24	19	2,2
6	F	55	H	5 meses	Nil	23	22	1,5
7	F	27	H	3 años	Pred 5 mg	13	17	1,0
					Ohclor 400 mg
8	F	21	HH	2 años	Nil	18	13	1,0
9	F	36	A	15 años	Pred 5 mg	14	8	0,8
					Ohclor 400 mg
					Aza 25 mg
10	F	41	H	4 años	Nil	15	16	0,5
11	F	20	H	6 años	Pred 25 mg	11	16	0,4
12	F	25		1 año	Nil	21	16	0,4

Reactivos

El TGF-\beta recombinante y el anticuerpo monoclonal anti-TGF-\beta (1D11.16) y una IgG1 murina fueron proporcionados por el Dr. Bruece Prat (Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA). La IL-10 recombinante y el anticuerpo monoclonal anti-IL10 (JES3-19F1) y la IgG2a de rata control fueron proporcionados por el Dr. Satwant Narula (Schering Plough Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ). La proteína de mieloma IgG1 murina control se obtuvo de Calbiochem, San Diego, CA. La IL-2 humana recombinante se obtuvo de Chiron, Emmervylle, CA. Los hibridomas secretores de anticuerpos anti-CD2, OKT11, se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, el MD y GT2 fueron proporcionados generosamente por A. Bernard, Niza, Francia). Otros anticuerpos incluyeron: anti-CD4 (OKT4, ATCC), anti-CD8 (OKT8, ATCC; CD8, Dako, Carpenteria, CA), anti-CD11b (OKM1, ATC), anti-CD16(3G8) proporcionados por J. Unkeless, New York, NY); el anti-CD20 (Leu 16, Becton Dickinson, San Jose, CA) y el anti-CD47 (L243, ATCC).

Aislamiento de las células mononucleares sanguíneas

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se prepararon a partir de sangre venosa heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad (Pharmacia, Piscataway, NJ). Luego se lavaron con PBS y EDTA 5 mM (Life Technologies, Grand Island, NY) para eliminar las plaquetas, ricas en TGF-\beta.

Procedimientos de cultivos celulares

Los procedimientos del cultivo celular se han descrito previamente (Wahl, S.M. (1994), J.Exp. Med. 180:1587-1590; Gray, J.D. y col., (1998), J Immunol 160:2248-2254). En resumen, se cultivaron 2x10^{5} células PBMC en medio AIM-V sin suero (Life Technologies) en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano, con o sin las citoquinas indicadas. Al cabo de tres días de cultivo, las PBMC se lavaron tres veces y luego se añadión medio fresco sin suero. Después de 7 días más a 37ºC, se recogieron los sobrenadantes y se valoró su contenido en IgG y auto-anticuerpos reactivos con nucleoproteína de timo de ternera (NP) mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima en fase sólida (ELISA), tal como se describió anteriormente (Linker-Israeli, M. y col. (1990), Arthritis Rheum 33:1216-1255). Las lecturas de densidad óptica (OD) se transformaron en unidades/ml (U/ml) a partir de una curva estándar utilizando estándares positivos y negativos. Se utilizaron como controles los sobrenadantes del cultivo de PBMC de los pacientes LSE (con títulos elevados de anticuerpos anti-NP) y los de individuos normales.

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron utilizando un programa de Prism, Graph Pad (San Diego, CA). Se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) después de la transformación logarítmica de los resultados y del test de Mann-Whitney no paramétrico.

Síntesis de IgG inducida por anti-CD2

Los efectos de las células T CD8+ cultivadas con o sin células NK sobre las células T CD4+ estimuladas por anti-CD2 y las células B se examinaron en un paciente con LSE y en un control normal. Las células CD4+ y CD8+ se prepararon a partir de linfocitos no-adherentes al nylon mediante selección negativa con bolas inmunomagnéticas, tal como se describió anteriormente (Gray, J.D. y col., (1998), J. Immunol 160:2248-2254). Para obtener células CD4+, las células no-adherentes al nylon se tiñeron con anticuerpos contra CD8, CD16, CD11b y CD74. Los mismos anticuerpos se utilizaron para obtener células CD8+, excepto que se sustituyó el CD4 por el CD8. La pureza de las células CD4+ fue del 95% y del 89% para CD8+. Para obtener células NK, se añadieron las PBMC a una columna de lana de nylon y se eluyeron, las células no-adherentes se aglutinaron inmediatamente formando una roseta con los eritrocitos de oveja tratados con AET. La fracción no aglutinada se tiñó con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4 (anti-HLA-DR) y se eliminaron las células reactivas utilizando bolas inmunomagnéticas (Dynal). Esta población resultante contenía el 98% de linfocitos CD56+ y <0,5% de CD3+ y <0,5% de CD20+. Dado que las células LSE secretan espontáneamente grandes cantidades de IgG y que se necesita una gran cantidad de sangre para preparar un número suficiente de células B para estos estudios, se sustituyeron las células B de un individuo donante sano por las células B de un paciente en este estudio. Para obtener las células B, las células adherentes a la lana de nylon se aglutinaron inmediatamente con SRBC para eliminar las células T y se trataron con éster de metil L-leucina 5 mM para eliminar completamente los monocitos y las células NK funcionales. La población resultante fue >92% CD20+ y <0,5% CD3+.

Resultados

En 12 pacientes estudiados, las IgG espontáneas se hallaron en un intervalo de 0,4 a 13,7 \mug/ml (Fig.1). La exposición de PBMC a IL-2+TGF-\beta durante 72 horas disminuyó la síntesis de IgG en 8 de los 12 casos estudiados en por lo menos el 50% (media de disminución del 79%, p=0,008, Mann Whitney). Las disminuciones más dramáticas se observaron en los casos con mayor hiperactividad de células B. La correlación entre la cantidad de IgG secretada y el porcentaje de inhibición por Il-2 y TGF-\beta fue de r=0,647, p=0,02.

Se compararon los efectos de la Il-2 y el TGF-\beta solos con los resultados de la combinación de IL-2 y TGF-\beta. La Fig. 2 muestra que estas citoquinas también inhibían la producción de IL-2. Sin embargo, después de la transformación logarítmica para lograr una distribución normal de los resultados y aplicar la corrección de Bonnferoni para comparaciones múltiples, los análisis de varianza mostraron que sólo la combinación de IL-2 y TGF-\beta daban como resultado una inhibición significativa (p=0,05).

En el LSE, la producción de IL-10 está aumentada (Llorente, L. y col., (1993), Eur. Cytokine Network 4:421-427), pudiendo inhibir dicha citoquina la producción de Il-2 y de TGF-\beta. En 9 casos también se valoró el efecto del anti-Il10, pero sólo se observó una modesta reducción de la síntesis de IgG en algunos individuos y esta diferencia no fue estadísticamente significativa. De igual modo, la producción del TNF-\alpha también disminuyó en un subgrupo de pacientes con LSE (Jacob, C.O. y col., (1990), Proc. Natl. Acad Sci 87:1233-1237). Aunque esta citoquina también incrementa la producción del TGF-\beta activo (Ohtsuka, K. y col., (198), J. Immunol 160:2539-2545), la adición de

\hbox{TNF- \alpha }

a los cultivos presentó efectos mínimos (resultados no mostrados). También se examinaron los PBMC LSE para su producción espontánea de auto-anticuerpos anti-NP y se hallaron títulos significativos en 4 casos. En todos los casos, la exposición de PBMC a la IL-2 o a la IL-2 y TGF-\beta inhibieron la producción de anti-NP por lo menos en un 50%. El propio TGF- \beta fue ineficaz (Tabla 2). En estos casos, los efectos de la IL-2 sola fueron equivalentes a la combinación de IL-2 y TGF-\beta. TABLA 2

Efecto del tratamiento de PBMC con IL-2 y TGF-\beta en la producción espontánea de auto-anticuerpos en el LSE
		Anticuerpos anti-nucleoproteínas (U/ml)
Tratamiento con citoquinas	Caso A:	Caso B:	Caso C:	Caso D:
Nil	308 (100)*	312(100)	25(100)	73(100)
TGF-\beta (10 pg/ml)	282(92)	298(96)	26(104)	ND
IL-2 \textamp TGF-\beta	29(10)	14(4,5)	12(48)	35(48)
IL-2	23(7,5)	10(3)	11(44)	ND
* Porcentaje de niveles basales.

Las PBMC de pacientes LSE se expusieron a IL-2 (10 u/ml) y TGF-\beta (10 pg/ml) durante 72 horas. Las células se lavaron durante 7 días adicionales. Se cuantificaron los anti-NP liberados en los sobrenadantes mediante un ELISA.

Con anterioridad se había publicado que la IL-2 incrementa la producción del TGF-\beta activo biológicamente

\break

(Ohtsuka, K. y col., (1998), J Immunol 160:2539-2545). Es, por tanto, posible que por lo menos algunos de los efectos de la IL-2 sobre la síntesis espontánea de Ig estuviera mediado por el TGF-\beta. Esta posibilidad se investigó determinando si los efectos de la IL-2 podían ser invertidos por el anticuerpo neutralizante anti-TGF-\beta. En el ejemplo mostrado en la Fig. 3A, la adición de anti-TGF-\beta no afectó la síntesis espontánea de IgG. El antagonismo del

\hbox{TGF- \beta ,}

sin embargo, no eliminó los efectos inhibidores de la IL-2 sobre la síntesis de IgG. Las PBMC de este paciente (Caso C en la Tabla 2) también produjeron espontáneamente anticuerpos anti-NP. Aquí también el anti-TGF-\beta eliminó los efectos inhibidores de la IL-2 en la producción de anti-NP (Fig. 3B). En este individuo, por tanto, los efectos inhibidores de la IL-2 en la síntesis espontánea de IgG y autoanticuerpos estuvo mediada por el TGF-\beta. Este efecto de anti-TGF-\beta se documentó en 4 de 8 casos estudiados. Así, los efectos inhibidores de IL-2 podían ser dependientes o independientes del TGF-\beta. Ejemplos de cada efecto se muestran en la Tabla 3. TABLA 3

Efecto de la IL-2 y el TGF-\beta en la síntesis espontánea de IgG en el LSE
Citoquinas añadidas	Paciente A: inhibición de IgG	Paciente B: inhibición de IgG
	dependiente de TGF-\beta (\mug/ml)	independiente de TGF-\beta (\mug/ml)
Medio sólo	2,5 (100)	2,6(100)
TGF-\beta (10 pg/ml)	1,4(56)	2,5(96)
IL-2 \textamp TGF-\beta	0,4(16)	0,5(19)
IL-2 \textamp anti-TGF-\beta	11,6(464)	0,5(19)
IL-2 \textamp IgG	3,6(144)	0,6(23)
* Porcentaje del nivel basal de síntesis de IgG

Tuvimos la oportunidad de repetir el estudio en pacientes LSE 28 días después de iniciar la terapia con esteroides (Tabla 4). Antes del tratamiento, la síntesis espontánea de IgG fue superior a 2 \mug/ml de IgG. La exposición de las PBMC a IL-2 inhibió fuertemente la producción de IgG y el TGF-\beta tuvo un efecto moderado. Después de la terapia con corticosteroides, la producción espontánea de IgG disminuyó un 75%. Como antes, la exposición de PBMC a

\break

IL-2 \pm TGF-\beta disminuyó la producción al 50%. Sin embargo, esta inhibición fue invertida por el anti-TGF-\beta. De nuevo, este efecto de la IL-2 podía explicarse por la regulación positiva del TGF-\beta activo endógeno. TABLA 4

Efecto de la terapia corticosteroidea en la síntesis espontánea de IgG en el LSE
Citoquinas añadidas	Antes del tratamiento, Día 0	Después del tratatamiento, Día 28
Nil	2,2	0,6
TGF-\beta (10 pg/ml)	1,2	0,4
IL-2 (10 U/ml)	0,4	0,3
IL-2 \textamp TGF-\beta	0,7	0,3
IL-2 \textamp anti-TGF-\beta	ND	0,8
IL-2 \textamp IgG	ND	0,6
* Porcentaje del nivel basal de la síntesis de IgG

De acuerdo con nuestros estudios previos en individuos sanos, en donde la IL-2 y el TGF-\beta pueden inducir las células T CD+ a regular negativamente la producción de Ig, se intentó aislar y tratar las células T CD8+ de pacientes LSE en este estudio. Estos experimentos se realizaron sin éxito debido a la gran variabilidad de síntesis espontánea de Ig y a la gran cantidad de sangre que se necesitaba de pacientes con LSE activa para los procesos de separación. Sin embargo, fue posible obtener bastante sangre de un paciente con LSE activo para investigar el efecto de IL-2 y TGF-\beta en la modulación de células T CD8+ sobre la síntesis de IgG inducida por anti-CD2. Recientemente, se ha publicado que a deiferencia del anti-CD3, una combinación mitogénica de anticuerpos monoclonales anti-CD2 no induce la producción de IgG en los PBL (Gray, J.D. y col. (1989), J Immunol 160:2248-2254). Esto es debido a que el anti-CD2 estimulaba las células NK a producir TGF-\beta, que a su vez inducía las células T CD8+ a regular negativamente la producción de Ig (Gray, J.D., (1998), J Immunol 160:2248-2254). En este paciente, tal como se publicó anteriormente (Gray, J.D. y col. (1994), J Exp. Med 180:1937-1942), las células T CD8+ incrementaron la síntesis de IgG y este incremento fue fuertemente potenciado por la combinación de células NK y células T CD8+ (Fig. 4A). En cambio, la IL-2 y el TGF-\beta eliminaron los efectos auxiliares de las células T CD8+ de LSE e incapacitaron estas células para suprimir la producción de IgG. Este efecto inhibidor de la IL-2 y el TGF-\beta fue dependiente de la presencia de células T CD8+ (Fig. 4B). Así, se obtuvieron evidencias de que los efectos de IL-2 y del TGF-\beta podían estar mediados por las células T CD8+.

Estos estudios demostraron que una exposición corta de PBMC a IL-2 y TGF-\beta puede disminuir en gran manera la producción espontánea posterior de IgG y autoanticuerpos policlonales en el LSE, especialmente en pacientes con enfermedad severa e hiperactividad de células B marcadas. Este estudio confirma las publicaciones anteriores, al indicar que la IL-2 puede inhibir la producción de anticuerpos (Hirohata, S. y col. (1989), J Immunol 142:3104-3112 y Fast, L.D. (1992), J Immunol 149:1510-1515) y muestra que las concentraciones picomolares del TGF-\beta pueden contribuir a esta regulación negativa. En el grupo de 12 pacientes estudiados, el efecto inhibidor de la IL-2 y del

\hbox{TGF- \beta }

sobre la síntesis de IgG policlonal fue mayor que el efecto de la IL-2 sola. Sin embargo, los efectos inhibiodores de la IL-2 fueron heterogéneos. En 4 de 8 casos estudiados, la inhibición fue dependiente del TGF-\beta, dado que un anti-TGF-\beta neutralizante eliminó el efecto. En los caos restantes, los efectos reguladores negativos de la IL-2 fueron independientes del TGF-\beta. De modo similar, se ha documentado la inhibición dependiente e independiente del TGF-\beta de la producción espontánea de autoanticuerpos anti-NP. También se investigaron los efectos de antagonización de la IL10 y de la adición del TNF-\alpha por haberse descrito con anterioridad anomalías en la producción de estas citoquinas en el LSE (Llorente L. y col., (1993), Eur. Cytokine Network 4:421-427; Jacob, C.O. y col., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87:1223-1237). Estos procedimientos, sin embargo, tuvieron mínimos efectos sobre la síntesis espontánea de Ig si los linfocitos se habían activado previamente.

Otros autores han publicado que el grado de hiperactividad de las células B en el LSE se correlaciona con la actividad de la enfermedad (Blaese, R.M. y col. (1980), Am. J. Med. 69:345-350; Klinman, D.M. y col., (1991), Arthritis Rheum 34:1404-1410). Hecho que no se produjo en el presente estudio, debido probablemente a la terapia de fármacos concurrente. En general, los pacientes con síntesis espontánea de Ig marcada no estaban en tratamiento, en cambio los pacientes con menos actividad de células B estaban actualmente recibiendo prednisona. Presentamos un caso en donde la síntesis espontánea de IgG disminuyó de forma marcada después de iniciarse la terapia con corticosteroides. Estas células B del paciente también secretaban anticuerpos anti-NP antes del tratamiento, pero después de la terapia con esteroides la producción de este auto-anticuerpo fue indetectable (resultados no mostrados).

El TGF-\beta consiste de una familia multifuncional de citoquinas importante en la reparación tisular, inflamación e inmunoregulación (Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641). El TGF-\beta se diferencia de muchas otras citoquinas en que se secreta como una molécula precursora inerte y se convierte en su forma biológica activa extracelularmente (Massague, J (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641; Flaumenhaft, R. y col. (1993), Adv. Pharmacol 24:51-76). Las células reguladoras T en diversos modelos auto-inmunes experimentales como la encefalitis auto-inmune experimental (Weiner, H.L. y col., (1994), Annu Rev Immunol 12:809-837) y la colitis (Neurath, MF y col. (1996), J. Exp Med 183:2605-2516) producen esta citoquina. El TGF-\beta es inmunosupresor a concentraciones nanomolares y puede inhibir la proliferación de células T y B, la actividad citotóxica de células NK y la generación de citotoxicidad de células T (Letterio, JJ y col., (1998), Ann Rev Immunol 16:137-162). Por el contrario, se ha publicado que el

\hbox{TGF- \beta }

promueve el crecimiento de células CD4+ y de CD8+ (Kehrl, J.H. y col. (1986), J Exp Med 163:1037-1050; Lee, H M y col. (1993), J Immunol 151:668-677) y puede promover la diferenciación de células B (Van Vlasselaer, P. y col. (1992), J Immunol 148:2062-2067).

En nuestros estudios previos con linfocitos de individuos sanos para generar células T reguladoras, las concentraciones picomolares del TGF-\beta utilizadas fueron menores que las requeridas para la inhibición de la función de células T o B (Gray, J. D. y col., (1998), J Immunol 160:2248-2254; Gray, J.D. y col (1994), J. Exp. Med 180:1937-1942). Las concentraciones similares se utilizaron en los estudios presentes con pacientes LSE y el propio TGF-\beta tuvo efectos inhibidores modestos en la síntesis de Ig. Como antes, una combinación de IL-2 y TGF-\beta produjo la inhibición más potente. En nuestros estudios previos, este efecto fue mediado por células T CD8+.

La IL-2 tiene efectos bien establecidos sobre la inducción de la actividad de células supresoras T (Hirohata, S. y col., (1989), J. Immunol 142:3104-3112; Fast, L.D. J Immunol 149:1510-1515), pero todavía no está claro si estos efectos son directos o indirectos. En el ratón, la deleción del gen de IL-2 da como resultado una linfoproliferación masiva y la enfermedad auto-inmune (Sadlack, B. y col., (1995), Eur. J. Immunol 25:3053-3059). En el LSE, se describió una correlación negativa entre los niveles de IL-2 y la hiperactividad de células B (Huang, Y.P. y col. (1988), J Immunol 141:827-833). Anteriormente, se había intentado inhibir la producción espontánea de Ig en el LSE con IL-2, pero, sin embargo, los resultados fueron extremadamente variables. Mientras en algunos casos se observó una fuerte inhibición, en otros la IL-2 incrementó de forma importante la producción de Ig. Por lo que se cree que el tiempo y el entorno de citoquinas explican la inhibición más consistente observada en este estudio. Aquí la IL-2 y el TGF-\beta estuvieron presentes únicamente durante las 72 horas iniciales del cultivo, en lugar de todo el periodo de cultivo. El incremento de la síntesis de Ig en el último caso podría explicarse por los efectos positivos de la IL-2 sobre la diferenciación de células B (Coffman, R.L. y col. (1988) Immunol Rev 102:5-28). La IL-2 puede regular negativamente la producción de anticuerpos mediante varios mecanismos. Además del circuito del TGF-\beta descrito en el informe, puede tener lugar una inhibición inducida por IL-2 mediante regulación positiva del IFN-\gamma (Noble, A. y col. (1998), J Immunol 160:566-571), o mediante mecanismos citolíticos (Stohl, W. y col., (1998), J Immunol 160:5231-5238; Esser, M.T. y col. (1997), J Immunol 158:5612-5618). Anteriormente, se habían investigado los efectos reguladores de las células NK sobre la síntesis de anticuerpos y se había publicado que mientras el efecto directo de las células NK es regular positivamente la síntesis de IgG (Kinter, A. y col. (1995), Proc Natl Acad Sci USA 92:10985-10989), estos linfocitos presentaban el efecto opuesto cuando se cultivaban con células T CD8+ en individuos sanos (Gray, J.D. y col., (1994), J Exp Med 180:1937-1942). En los pacientes LSE, sin embargo, la combinación de células T CD8+ y de células NK incrementaron la producción de IgG (linker-Israeli, M. y col. (1990), Arthritis Rheum 33:1216-1225). Esto se observó de nuevo en el presente informe. Mientras que en individuos normales, la adición de células NK a células T CD8+ inhibía fuertemente la síntesis de IgG estimulada por anti-CD2, en el LSE se observó lo contrario. A partir de los estudios con individuos sanos, se demostró que el TGF-\beta derivado de las células NK inducía las células T CD8+ co-estimuladas a regular negativamente la producción de IgG e IgM (Gray,JD y col., (1998), J Immunol 160:2248-2254). En este estudio, la IL-2 y el TGF-\beta indujeron una actividad supresora moderada de las células T CD8+. Lo que indica que, seguramente en el LSE, por lo menos una de las vías por las que la IL-2 y el TGF-\beta inhiben la actividad de células B se realiza mediante la generación de células T reguladoras. Además, otras poblaciones de linfocitos tratados con éstas u otras citoquinas pueden también regular negativamente la actividad de las células B en el LSE.

Ejemplo 2 Correlación de la producción de TGF-\beta con la actividad y gravedad de la enfermedad

Una vez demostrado que disminuye la producción de las formas totales y activas del TGF-\beta por los linfocitos, nos preguntamos si estos defectos se correlacionaban con la actividad y/o gravedad de la enfermedad. La producción del TGF-\beta1 por los linfocitos sanguíneos de 17 pacientes LSE estudiados prospectivamente se comparó con la de 10 pacientes con artritis reumatoide (AR) y 23 controles emparejados sanos. En la AR, los niveles del TGF-\beta1 activo fueron inferiores a los controles, pero no disminuyeron en la misma magnitud hallada en el LSE. Los niveles del TGF-\beta1 constitutivo y del activo estimulado por anti-CD2 detectados en cantidades picomolares se redujeron de forma importante en 6 pacientes no tratados y hospitalizados con LSE de reciente aparición, muy activo y severo, y se redujo de forma similar en 11 pacientes en tratamiento y con la enfermedad menos activa. En consecuencia, la producción disminuida de TGF-\beta1 activo no se correlacionó con la actividad de la enfermedad. En cambio, la producción disminuida de TGF-\beta1 total se correlacionó inversamente con la actividad de la enfermedad. Así, parece ser que aunque la secreción mermada del precursor del TGF-\beta1 latente por los linfocitos puede ser una consecuencia de la actividad de la enfermedad, la capacidad para convertir la molécula precursora en su forma activa puede ser un defecto celular intrínseco. La exposición insuficiente de las células T a cantidades picomolares de TGF-\beta1 en el momento de su activación puede ser el resultado de un defecto en la regulación negativa de la síntesis de Ig.

Así, la producción disminuida de TGF-\beta1 activo por los linfocitos en el LSE puede contribuir a la hiperactividad de las células B, característica de esta enfermedad.

Procedimientos Individuos del estudio

Se estudiaron 17 individuos con un diagnóstico de LSE que cumplían con los criterios del American College of Rheumatology para la clasificación de LSE (Tan, E.M. y col., (1982), Arthritis Rheum 25:1271-1277), 10 individuos con AR que cumplían con los criterios revisados de la ACR de 1987 para la clasificación de RA (Arnett, F.C. y col., (1988), Arthritis Rheum 31:315-324) y 23 individuos sanos. El grupo de LSE consistió de 15 mujeres y 2 hombres (15 hispanos, 1 afro-americano, 1 asiático). La media de edad fue de 34,5 años (intervalo de 20-75 años). Seis pacientes se hospitalizaron y 11 siguieron un control externo. Todos los pacientes hospitalizados no habían sido tratados antes de la admisión y fueron estudiados antes de recibir la primera dosis de corticosteroides. Los pacientes externos recibieron menos de 20 mg de prednisona sin que ninguno recibiera fármacos citotóxicos. La actividad de la enfermedad se valoró con los índices SLAM (Liang, M.H. y col., (1989), Arthritis Rheum 32:1107-1118) y SLEDAI (Bombardier, C. y col., 1992), Arthritis Rheum 35:630-640) con valores medios de 6,6 y 7,6, respectivamente. El grupo AR consistió de 9 mujeres y 1 hombre (9 hispanos, 1 asiático). La media de edad fue de 50,9 años (intervalo de edad de 39-67 años). Todos los pacientes siguieron un régimen de clínica externa y tenían una enfermedad ligera a moderadamente activa. La media de duración de la enfermedad fue de 9,5 años. Un paciente recibió miocrisina, 3 pacientes recibieron prednisona (1,1, y 20 mg), 3 pacientes recibieron metotrexato y un paciente recibió sulfasalazina. Los donantes sanos sirvieron como controles, emparejándose lo más estrechamente posible según la edad, sexo y grupo étnico.

TABLA 5

Características clínicas de los dos grupos de pacientes LSE
Resultados clínicos	Hospitalizados (n=6)	Externos (n=11)	Valor p
Edad	26,8	38,6	1,037
Sexo (H/M) Grupo étnico	6/0	9/2
(H/AA/A)	5/0/1	10/10
Duración de la enfermedad	0,71	8,25	0,051
(años)

TABLA 5 (continuación)

Características clínicas de los dos grupos de pacientes LSE
Resultados clínicos	Hospitalizados (n=6)	Externos (n=11)	Valor p
Actividad de la enfermedad
SLAM	13,3	2,9	0,014
SLEDAI	15,7	4,1	0,006
Dosis de prednisona	41,2	7,8	0,008
(mg/día)	83%	9%	0,028
Enfermedad renal activa	67%	9%	0,064
Anemia hemolítica	466,7	33,0	0,064
Anti-DNA (título)	47,5	98,6	0,008
C3	13,7	18,6	0,127
C4

Reactivos

Los anticuerpos utilizados fueron los sobrenadantes de hibridomas secretores de anti-CD2 (OKT11, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD y GT2 proporcionados por el Dr. Alain Bernard, Niza, Francia). Un anticuerpo monoclonal que reconoce las isoformas de TGF-\beta 1, 2 y 3 (1D11), un anticuerpo contra las isoformas de TGF-\beta 2 y 3 (3C7) y el rTGF-B2 fueron proporcionados por el Dr. Bruce Pratt (Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA).

Aislamiento de linfocitos de sangre periférica

Se prepararon células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de sangre venosa heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) según los procedimientos descritos anteriormente (Ohtsuka, K. y col., (1998), J Immunol 160:2539-2545). Las células mononucleares se lavaron con PBS y EDTA 5 mM (Life Technologies, Grand Island, NY) para eliminar las plaquetas, que son una fuente rica en TGF-\beta. Los linfocitos de sangre periférica se separaron de los PBMC mediante centrifugación con gradiente de densidad continua de Percoll (Pharmacia). El porcentaje de monocitos que permaneció en la fracción de densidad elevada enriquecida en linfocitos fue algo superior en el LSE (8,5% versus 4,3%).

Procedimientos del cultivo de células

Los procedimientos para los cultivos de células se han descrito con anterioridad (Ohtsuka, K. y col., (1998),

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J Immunol 160:2539-2545). En resumen, se añadieron 1x10^{5} linfocitos a la placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Rocky Mountain Scientific, Salt Lake City UT). Los cultivos se llevaron a cabo en medio

\hbox{AIM-V}

sin suero (Life Technologies), ya que el suero contiene cantidades significativas de TGF-\beta latente. El anti-CD2 se utilizó a las concentraciones óptimas para inducir la producción de TGF-\gamma (GT2 1:40 y T11 1:80) en los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas. Estudios previos ya habían demostrado que el anti-CD2 estimula fuertemente los PBL para producir TGF-\beta (Gray, JD y col., (1998), J Immunol 160:2248-2254). Ensayo del TGF-\beta

Las células epiteliales de pulmón de visón (MLEC), que habían sido transfectadas con una construcción de expresión que contenía un promotor (PAl-1) del inhibidor del activador del plasminógeno fusionado con el gen marcador de la luciferasa, fueron proporcionadas por el Dr. D. B. Rifkin, New York, NY. Se incubaron MLEC a 2x10^{4}/pocillo con 200 \mul de sobrenadantes durante 18 h a 37ºC. Para valorar la actividad luciferasa, se lisaron las células MLEC mediante un reactivo de lisis celular (Analytical Luminescence, Ann Arbor, MI). Los lisados celulares se hicieron reaccionar luego con el tampón de ensayo y la solución de luciferasa (ambos de Analytical Luminiscence), inmediatamente antes de cuantificarse en un luminómetro (Lumat, Berthold Analytical Instruments Inc., Nashua, NH). Para cuantificar la actividad del TGF-\beta total, se calentaron muestras a 80ºC durante 3 minutos para liberar la citoquina activa del complejo latente. Se cuantificó la actividad del TGF-\beta sin calentar los sobrenadantes. En todos los ensayos, concentraciones varias de rTGF-\beta se incluyeron para generar una curva estándar. La variabilidad de los cultivos replicados fue inferior al 10 por ciento (Ohtsuka,K. y col. (1998), J Immunol 160:2539-2545).

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Análisis estadístico

La significación de los resultados se analizó utilizando el test de Mann-Whitney y la correlación de rango de Sperman con el programa GBSTAT (Professional Statistics and Graphics Computer Program, Dynamic Microsystems Inc., Silver Spring, MD).

Se cuantificó el TGF-\beta1 constitutivo y estimulado producido por los PBL de pacientes con LSE o AR y se compararon estos valores con los valores de controles normales. La citoquina detectada en los sobrenadantes de los cultivos se neutralizó mediante mABs que reconocían las isoformas 1, 2 y 3, pero no las isoformas 2 y 3, resultado que confirmó la producción de TGF-\beta1. En comparación con los controles normales, la producción constitutiva de TGF-\beta1 activa disminuyó significativamente en el LSE (14 \pm 5 versus 56 \pm 21 pg/ml, p = 0,02, Fig. 5). También disminuyó el TGF-\beta1 activo estimulado por el anti-CD2 (87 \pm 22 versus 399 \pm 103 pg/ml, p = 0,003). En la AR, el valor medio para el TGF-\beta1 constitutivo fue similar al del LSE (19 \pm 5 pg/ml) y después de la estimulación por anti-CD2 fue intermedio entre el valor normal y el del LSE (197 \pm 54 pg/ml).

El TGF-\beta1 total constitutivo producido por los linfocitos también disminuyó en el LSE en comparación con el grupo normal (268 \pm 82 versus 631 \pm 185 pg/ml, p = 0,05). El valor en la AR fue intermedia entre el normal y el de LSE (435 \pm 161 pg/ml). Después de la adición de anti-CD2, el TGF-\beta1 total aumentó en el LSE algo más que en los controles normales, aunque las diferencias no fueron significativas estadísticamente. Los valores en el grupo de AR fueron de nuevo intermedios entre el grupo normal y el de LSE.

Para buscar una posible relación entre los niveles disminuidos de TGF-\beta1 y la actividad de la enfermedad, se compararon los pacientes de LSE hospitalizados con los de régimen externo. Las características clínicas de estos dos grupos se resumen en la Tabla 5. Aquellos que se hospitalizaron eran más jóvenes; 5 de 6 presentaron síntomas durante menos de 3 meses; tuvieron una enfermedad marcadamente activa; y la mayoría presentó LSE severo con nefritis y/o anemia hemolítica. El grupo de pacientes externos, por el contrario, tenía una enfermedad crónica que se volvió menos activa tras el tratamiento. A pesar de esta diferencia marcada en la heterogeneidad, duración, actividad y severidad de la enfermedad, tanto la producción constitutiva como la estimulada del TGF-\beta1 activo disminuyeron significativamente en ambos grupos en comparación con los controles normales (Tabla 6).

TABLA 6

Comparación de la producción de TGF-\beta1 por los linfocitos de dos grupos de pacientes con LSE*
	LSE
	Normal (n=23)	Grupo 1 (n=6)	Grupo 2 (n=11)
TGF-\beta1 activo (pg/ml)
Constitutivo	56 \pm 21	21 \pm 14 \dag	10 \pm 4 \dag
CD2 estimulado	399 \pm 103	117 \pm 52 \dag	70 \pm 19 É
TGF-\beta1 total (pg/ml)
Constitutivo	631 \pm 185	132 \pm 44 \dag	365 \pm 120
CD2 estimulado	771 \pm 136	226 \pm 74 \dag	667 \pm 166
* Se cultivaron 1x10^{5} PBL /pocillo durante 48 horas y se analizaron los sobrenadantes para el TGF-\beta1.
Los pacientes LSE se dividieron en 2 grupos. Grupo 1: pacientes hospitalizados. Grupo 2: pacientes externos.
Los valores p indican la comparación entre el grupo LSE y los controles normales valorado según el test
de Mann-Whitney;
\dag p < 0,05
É p < 0,01

Si se compara la correlación entre los niveles de TGF-\beta1 activo y total con la actividad de la enfermedad, hubo una correlación negativa significativa entre la producción estimulada por anti-CD2 de TGF-\beta1 total y el SLEDAI (r=-0,55, p=0,03, pero sin el índice SLAM (-0,43, p=11). El índice SLEDAI se valoró según la implicación del sistema nervioso central y de enfermedad renal. Así, una capacidad disminuida de los linfocitos para secretar la forma precursora del TGF-\beta1 parece estar asociada con la enfermedad severa. Los niveles de TGF-\beta1 activo no se correlacionaron con la actividad de la enfermedad.

El principal hallazgo en este ejemplo fue que la producción reducida de TGF-\beta1 activo en LSE no se correlaciona con la actividad o gravedad de la enfermedad. Cantidades decrecientes de TGF-\beta1 activo constitutivo y estimulado se hallaron en ambos grupos de pacientes, con aparición reciente de la enfermedad y con la enfermedad establecida. Además, los valores no se correlacionaron con la actividad, según se cuantificó por los índices de SLAM y SLEDAI, o la gravedad valorada por la implicación de órganos vitales. Sin embargo, mientras que la producción del TGF-\beta1 total también disminuyó en el LSE, este defecto parece correlacionarse con la actividad de la enfermedad. El hecho de que la producción de TGF-\beta1 total se correlacionara más estrechamente con el índice de SLEDAI, valorado según la implicación de los principales sistemas orgánicos, también sugiere una relación con la gravedad de la enfermedad.

Este estudio también incluyó un grupo control de pacientes AR cuya actividad de la enfermedad fue comparable a la de los pacientes LSE con enfermedad establecida. Aunque, los valores de TGF-\beta1 en el grupo de AR fueron algo inferiores a los valores de los controles normales, con la excepción del TGF- \beta1 activo constitutivo, la magnitud del defecto no fue tan marcada como en el LSE y no fue estadísticamente significativa.

Previamente, ya documentamos que las células NK son la fuente de linfocitos principal para el TGF-\beta y la única población de linfocitos que produce constitutivamente esta citoquina en su forma activa (Gray, J.D. y col., (1998),

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J. Immunol 160:2248-2254). En consecuencia, fue interesante hallar que la producción constitutiva del TGF-B derivado de células NK estaba disminuida en el LSE. También se demostró que tanto la IL-2 como el TNF-\alpha podían incrementar la producción de TGF-\beta activo. La producción de ambas citoquinas está disminuida en el LSE (Gray, J.D. y col. (1994), J Exp Med 180:1937-1942). Sin embargo, en muchos pacientes, la IL-2 y el TNF-\alpha exógenos no pudieron restaurar la producción normal de TGF-\beta (Ejemplo 2). La producción de IL10 está incrementada en el LSE (Llorente, L. y col., (1993), Eur Cytokine Network 4:421)) y se han publicado correlaciones entre los niveles elevados y la actividad de la enfermedad (Housslau, FA y col. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara, E. y col. (1996), Arthritis Rheum 39:379). La IL10 puede inhibir la producción de IL-2, TNF-\alpha y TGF-\beta (Ejemplo 2 y Moore, K.W. y col. (1993), Ann Rev Immunol 11:165-190). Los hallazgos de que la producción del TGF-\beta activo disminuye tanto en pacientes con una enfermedad moderada como con una enfermedad activa, y el hecho de que podría únicamente invertir parcialmente el defecto de producción antagonizando con IL10 (Ejemplo 2), sugiere que la producción incrementada de IL10, por ella misma, no puede tenerse en cuenta en la producción disminuida del TGF-\beta1 activo por los linfocitos en el LSE. Algunos mecanismos están probablemente implicados. Seguramente, uno o más defectos en la conversión extracelular del precursor latente a la forma activa y madura pueden explicar esta anomalía.

Aunque las propiedades inhibidoras del TGF-\beta están bien documentadas en la proliferación de linfocitos y la función celular efectora (Letterio, J.J. y col. (1998), Ann Rev Immunol 16:137-162), también se han publicado propiedades estimuladoras (Lee, H.M. y col. (1991), J Immunol 151:668-677). El TGF-\beta modula la producción de citoquinas por las células T estimuladas, así como la regula positivamente su producción. En los ratones, el TGF-\beta1 activa selectivamente las células T CD8+ para que proliferen (Lee, H.M. y col. (1991), J Immunol 151:668-677) y aumenta la maduración de las células T "naives" a células T de memoria (Lee,H.M. y col. (1991), J Immunol 153:4367- 4377). En el hombre, el TGF-\beta1 es un potente inductor de células T efectoras (Cerwenka A y col. (1994) J Immunol 153:4367-4377). Mientras que se necesitan grandes cantidades (nanogramos/ml) para obtener efectos inmuno-supresores, hemos demostrado que únicamente se necesitan cantidades pequeñas (picogramos/ml) para co-estimular las células T CD8+ para regular negativamente la producción de anticuerpos (Gray, J.D. y col. (1998), J Immunol 160:2248-2254).

Estos estudios sugieren, en consecuencia, que mientras la secreción linfocítica defectuosa del precursor del

\hbox{TGF- \beta 1}

latente puede resultar como consecuencia de la actividad de la enfermedad, la producción del TGF-\beta1 activo disminuida en el LSE es más compleja y puede ser el resultado de diversos mecanismos distintos. Se propuso que la programación de células T "naives" para regular negativamente la producción de anticuerpos requiere la presencia de cantidades de pg/ml del TGF-\beta activo en el momento que es activado, hipótesis que se soporta por evidencias halladas en ciertas publicaciones (Gray, J.D. y col. (1998), J Immunol 160:2248-2254). En consecuencia, la ausencia de cantidades picomolares del TGF-\beta activo, en el entorno local en un momento crítico, podría posiblemente ser responsable de la ineficacia de la función reguladora de células T para controlar la actividad de linfocitos B en el LSE. Ejemplo 4 Tratamiento del LSE con mitógenos

En este ejemplo, la producción de IgG se regula negativamente tratando las células con una composición inhibidora que comprende un mitógeno como la ConA. Las células se prepararon tal como se indicó en los ejemplos anteriores y luego se incubaron con mitógenos para aumentar la población de células para regular negativamente la producción de anticuerpos. En este caso, las células se incubaron con concentraciones fisiológicas de Con A durante 4 a 72 horas, utilizando técnicas de incubación estándar. La concentración de ConA utilizada puede variar desde aproximadamente 0,01 a 10 microgramos/ml, siendo 1 \mug/ml la concentración actual preferida. La Con A está disponible por Sigma

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(St. Louis, MO).

Aunque no se sabe como trabajan los mitógenos, se cree que inducen la producción del TGF-\beta por los monocitos en la preparación de PBMCs y luego el TGF-\beta actúa sobre las células T para convertirlas en células supresoras de anticuerpos.

Si es necesario, las células se lavan y se transplantan a continuación al paciente.

Ejemplo 5 Tratamiento de las células con una mezcla de citoquinas y mitógenos.

En este ejemplo, la producción de IgG se regula negativamente tratando las células con una composición inhibidora que comprende una mezcla de citoquinas y mitógenos. Las células se preparan tal como se indicó en los ejemplos anteriores y luego se incuban con la mezcla para aumentar la población de células que regulan negativamente la producción de anticuerpos, como las concentraciones fisiológicas de ConA, IL-2 y TGF-\beta, o Con A e IL-2, durante 4 ó 72 horas utilizando técnicas de incubación estándar.

Después de que las células se han incubado con citoquinas y mitógeno, las células se lavan con HBBS para eliminar cualquier citoquina y mitógeno que hubiera en la solución. Las células se resuspenden a continuación en 200-500 ml de HBBS y se reintroducen en el mamífero.

Claims (15)

1. Utilización de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), tratadas con IL-2 o TGF-\beta, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.

2. Utilización de una composición inhibidora que comprende la IL-2 o el TGF-\beta en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el mencionado medicamento se prepara poniendo en contacto la composición inhibidora con las células mononucleares extraídas de la sangre de un paciente diagnosticado de una enfermedad auto-inmune, y en donde dicho medicamento se reintroduce en el mencionado paciente para suprimir la mencionada enfermedad auto-inmune.

4. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición inhibidora comprende la IL-2.

5. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición inhibidora comprende el TGF-\beta.

6. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición inhibidora comprende además un activador CD2.

7. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición inhibidora comprende el TGF-\beta y un activador CD2.

8. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición inhibidora comprende la IL-2 y el TGF-\beta.

9. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición inhibidora comprende la IL-2, el TGF-\beta y un activador CD2.

10. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, o 9, en donde el mencionado activador CD2 es un anticuerpo anti-CD2.

11. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, o 9, en donde el mencionado activador CD2 comprende anticuerpos anti-CD2.

12. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, o 9, en donde el mencionado activador CD2 es el ligando de CD2 LFA-3.

13. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las mencionadas células están enriquecidas en células T CD4+.

14. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las mencionadas células están enriquecidas en células T CD8+.

15. Utilización de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la mencionada enfermedad auto-inmune es el lupus sistémico eritematoso (LSE).