ES2198835T3 - Procedimiento para la aplicacion selectiva de reactivos sobre material biologico inmovilizado. - Google Patents

Procedimiento para la aplicacion selectiva de reactivos sobre material biologico inmovilizado.

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Abstract

El contacto dirigido de reactivos ppara materiales biológicos inmovilizados, útiles para ensayos de hibridización consiste en grabar la posición del material y utilizar el dispositivo ppara la adición de reactivo. Un procedimiento (I) ppara e contacto dirigido de al menos un reactivo con un material biológico que está inmovilizado sobre un vehículo, es nuevo y consiste en encontrar y grabar las posición de los materiales biológicos inmovilizados probados, colocar un dispositivo ppara el contacto del reactivo en esta posición y añadir el reactivo al material. Un procedimiento (I) ppara el contacto dirigido de al menos un reactivo con un material biológico que está inmovilizado sobre un vehículo, es nuevo y consiste en: 8ª) encontrar la posición del material biológico inmovilizado probado del reactivo y grabar esta posición; b) colocar un dispositivo ppara el contacto del reactivo en esta posición; y c) añadir el reactivo al materia, donde los materiales biológicos idénticos o diferentes soninmovilizados sobre una o más posiciones sobre el vehículo. La invención se refiere también a un kit de diagnóstico (II) ppara el análisis de materiales biológicos, que contienen pequeños coberturas locales ppara la hibridización por contacto, sobre las cuales se fija al menos un reactivo.

Description

Procedimiento para la aplicación selectiva de reactivos sobre material biológico inmovilizado.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la aplicación selectiva de por lo menos un reactivo sobre material biológico inmovilizado.
Los métodos modernos para la investigación de materiales biológicos inmovilizados como, por ejemplo, células o cromosomas emplean frecuentemente reactivos caros en los que se utiliza, por ejemplo, fluorocromo para el marcado. Constituyen ejemplos de tales métodos, entre otros, el procedimiento FISH (hibridación in situ con fluorescencia) o bien multicolor-FISH, en los que las células son hibridadas, por ejemplo, con sondas o mezclas de sondas de ácido nucleico marcadas por fluorescencia. Un ejemplo de aplicación de tales métodos FISH es el análisis en metafase. Solamente una pequeña parte de las sondas de ADN en él utilizadas puede aprovecharse para el análisis, ya que los cromosomas en metafase constituyen solamente un pequeño porcentaje del material hibridado o bien de la superficie hibridada. La mayor parte de las sondas de ADN es por tanto desaprovechada y sea eliminada por lavado y desechada.
Una salida a esta situación es la aplicación selectiva de reactivos sobre zonas de un soporte, como por ejemplo, un portaobjetos, sobre el que se inmoviliza el material biológico de interés, en caso del análisis en metafase, por tanto los cromosomas en metafase, mediante el goteo selectivo de volúmenes de líquido correspondientemente más pequeños. El caro material de partida de los reactivos, como por ejemplo sondas de ADN marcadas por fluorescencia, puede aprovecharse así al máximo.
DE 43 44 726 A1 divulga una disposición de secuencias de ácidos nucleicos, caracterizada porque todos los componentes de esta disposición de secuencias de ácidos nucleicos están separados unos de otros.
WO 97 26539 divulga un sistema para comprobar la presencia de una biomolécula diana en una muestra.
Por tanto, la presente invención se plantea como objetivo preparar un procedimiento para la aplicación selectiva de por lo menos un reactivo sobre material biológico inmovilizado que posibilite un aprovechamiento mejorado de los reactivos a aplicar.
Este objetivo es alcanzado por las formas de realización de la presente invención caracterizadas en las reivindicaciones.
Se prepara en especial un procedimiento para la aplicación selectiva de por lo menos un reactivo sobre material biológico, que se inmoviliza sobre un soporte, que comprende los pasos de:
(a)
detectar el material biológico inmovilizado a investigar con registro de su posición,
(b)
posicionar un dispositivo para aplicar al menos un reactivo en la posición registrada del material biológico inmovilizado, y
(c)
aplicar de por lo menos un reactivo sobre el material biológico inmovilizado,
en el que sobre el soporte se registra una o varias posiciones de los mismos o diferentes materiales biológicos inmovilizados.
El término "material biológico" puede contener cualquier material existente en la naturaleza, en especial células, componentes de células como cromosomas, en especial cromosomas en metafase. El material biológico, como por ejemplo células o cromosomas puede ser marcado con uno o varios marcadores específicos, por ejemplo marcadores de superficie como anticuerpos marcados o, por ejemplo, 23 sondas marcadas diferentes, diferenciables para el análisis de cromosomas. El término "soporte" puede contener cualquier objeto sobre el que se mantenga el material biológico, especialmente portaobjetos para un microscopio. El término "inmovilizado" significa que el material biológico se ancla y/o se fija sobre el soporte con ayuda de métodos conocidos en esta especialidad.
La detección de material biológico inmovilizado a investigar en el paso (a) del procedimiento según la invención puede llevarse a cabo utilizando un dispositivo de exploración o bien un dispositivo para la exploración selectiva como, por ejemplo, una óptica buscadora que puede contener, por ejemplo, un objetivo de microscopio. En una forma de realización preferida se sustituye en el paso (b) del procedimiento según la invención, la óptica buscadora por un dispositivo apropiado para la aplicación de por lo menos un reactivo. De acuerdo con una forma de realización preferida del procedimiento según la invención se puede registrar, por ejemplo, en conexión con un dispositivo de exploración y una unidad de tratamiento de imágenes, por ejemplo una cámara CCD, durante el paso (a) una o varias fotografías del material biológico inmovilizado encontrado. Se puede mostrar conjuntamente, con preferencia, las fotografías para preseleccionar material biológico inmovilizado apropiado. El registro de la posición del material biológico inmovilizado puede llevarse a cabo, por ejemplo, con ayuda de un dispositivo para explorar la posición, por ejemplo, de la mesa portaobjetos de un microscopio en conexión con un registro/tratamiento y almacenamiento, realizados con ayuda de un ordenador, de los datos de posición del material biológico inmovilizado sobre medios de almacenamiento preferentemente digitales, como disquetes, placas fijas, placas cambiables, medios de almacenamiento ópticos como discos compactos, etc.
Un dispositivo (preferentemente automatizado) para aplicar al menos un reactivo puede comprender, por ejemplo, una pipeta como una pipeta de microlitro.
En una forma de realización preferida de la presente invención, el procedimiento para la aplicación selectiva de reactivos sobre células inmovilizadas o componentes de células, comprende adicionalmente el paso de
(d)
posicionar un dispositivo para aplicar una cubierta local de pequeña extensión sobre la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado.
Una cubierta local de pequeña extensión puede contener, por ejemplo, un pequeño microcristal de cubierta.
De acuerdo con una forma de realización preferida del procedimiento de la presente invención, se realiza automáticamente la aplicación de por lo menos un reactivo y/o la aplicación de la cubierta local de pequeña extensión. En otra forma de realización preferida del procedimiento según la invención la cubierta local de pequeña extensión es revestida o humectada con reactivos.
De acuerdo con una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, entre la detección del material biológico inmovilizado a investigar, con registro de su posición, se puede intercalar en el paso (a) y el posicionamiento de un dispositivo para aplicar al menos un reactivo sobre la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado en el paso (b) al menos un paso intermedio para tratar, preferentemente lavar el material biológico inmovilizado.
De acuerdo con otra forma de realización preferida del procedimiento según la invención, es preferible realizar una valoración después del paso (c) o (d) por posicionamiento de un dispositivo de análisis que comprende, por ejemplo, un dispositivo de exploración o un dispositivo para la exploración selectiva que comprende, por ejemplo, un dispositivo para mediciones fotométricas y/o quimioluminométricas como fluorométricas sobre la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado.
De acuerdo con otra forma de realización preferida del procedimiento según la invención, el reactivo comprende un ácido nucleico, seleccionado entre ADN o ARN, o un polipéptido. El término "ácido nucleico" significa moléculas de ácido nucleico nativo, semisintético o modificado de desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos y/o nucleótidos modificados como aminonucleótidos o [a-S]-nucleótidos de trifosfato. Un polipéptido puede contener, por ejemplo, una proteína como un anticuerpo, que puede ser policlonal o monoclonal.
De acuerdo con otra forma de realización adicional del procedimiento según la invención, el reactivo está provisto de uno o varios marcados. El término "marcado" significa átomos o moléculas apropiados, directa o indirectamente comprobables, que están incorporados o ligados en la molécula del reactivo. Son marcados apropiados, por ejemplo, los que contienen en el nucleótido o en el polipéptido, por ejemplo, anticuerpos, colorantes fluorescentes copulados y/o biotina y/o digoxigenina y/o en isótopos radiactivos incorporados en nucleótidos o en polipéptidos, por ejemplo anticuerpos. En una forma de realización preferida, el compuesto de marcado es un colorante fluorescente con una selección de menores cantidades de sustancia de diferencia suficiente en el comportamiento de fluorescencia de los aspectos de emisión como, por ejemplo, cumarina y rodamina y/o de vida útil fluorescente, como por ejemplo, isotiocianato fluorescente y avidina marcada con quelato de europio y/o marcada con porfirina.
De acuerdo con otra forma de realización preferida del procedimiento según la invención el reactivo es capaz de hibridación o reacción antígeno/anticuerpo o reacción ligandos/proteína. El término "hibridación", especialmente "hibridación in situ" significa la deposición de una sonda ADN/ARN sintéticamente producida y provista de marcados biológicos, físicos o químicos para la detección, como molécula de reactivo en secuencias de ADN/ARN nativas, existentes en la naturaleza, lográndose la deposición por desnaturalización y renaturalización de los correspondientes ácidos nucleicos. Evidentemente, estas sondas de ADN/ARN contienen al menos una porción de secuencia capaz de hibridar en una secuencia de ADN/ARN de la molécula del material biológico inmovilizado como un cromosoma. Esta porción de secuencia presenta una zona de secuencia específica, existente individualmente, con preferencia de 100 a 1.000 pares de bases de largo de la molécula de reactivo, que se deposita en una zona complementaria de la molécula del material biológico inmovilizado a una temperatura apropiada, preferentemente 50ºC o menos, y a una concentración de sal apropiada que contiene con preferencia de 50 a 300 mmol/l de iones monovalentes y 0 a 10 mmol/ de iones divalentes, con formación de puentes de hidrógeno.
En el marco del presente procedimiento, para la investigación de material biológico inmovilizado según uno de los procedimientos anteriormente definidos, se puede utilizar un kit de diagnóstico que contiene cubiertas locales de pequeña extensión, que contienen preferentemente pequeños microcristales de cubierta, para la hibridación por contacto, sobre los que se fijan los reactivos.
En el caso del análisis en metafase se lleva a cabo el procedimiento según la invención utilizando un dispositivo para relocalizar de manera selectiva cromosomas en metafase apropiados, buscados anteriormente, de forma que se pueda utilizar con facilidad y rápidamente y por tanto de manera rutinaria. La posición de los cromosomas en metafase detectados manual o automáticamente puede almacenarse. A continuación se posiciona automáticamente los cromosomas en metafase hallados bajo una pipeta con la solución de sonda, para aplicar la solución de hibridación selectivamente en una pequeña cantidad. En un paso ulterior, los cromosomas en metafase encontrados pueden posicionarse bajo otra pipeta o dispositivo apropiado, para aplicar automáticamente un pequeño cristal de cubierta.
El consumo de material, por ejemplo en la hibridación de los cromosomas en metafase con sondas de ADN, puede reducirse con ayuda del procedimiento de la invención en un factor de 10 o más. Esto es muy importante en la citogenética tumoral, donde por un lado el número de metafases por portaobjetos es bajo, y por otro lado es de particular interés la posibilidad de una preselección de metafases - por ejemplo, conforme a una forma de realización de la presente invención mediante una presentación de las fotografías de las metafases encontradas automáticamente -, que presentan una calidad de cromosomas apropiada para la valoración, antes de aplicar las sondas de ADN.
El procedimiento según la invención es utilizable sobre células en metafase previamente marcadas con marcadores apropiados, que presentan determinadas propiedades y que están presentes con baja frecuencia en el preparado, como por ejemplo células tumorales en la detección de enfermedades residuales mínimas o células fetales en la sangre materna.

Claims (17)

1. Procedimiento para la aplicación selectiva de por lo menos un reactivo sobre material biológico, que se inmoviliza sobre un soporte, que comprende los pasos de:
(a)
detectar el material biológico inmovilizado a investigar con registro de su posición,
(b)
posicionar un dispositivo para aplicar el reactivo en la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado, y
(c)
aplicar el reactivo sobre el material biológico inmovilizado,
en el que sobre el soporte se registra una o varias posiciones de los mismos o diferentes materiales biológicos inmovilizados.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se lleva a cabo la detección del material biológico inmovilizado a investigar en el paso (a) con ayuda de una óptica buscadora, y en el paso (b) puede sustituirse la óptica buscadora por un dispositivo apropiado para la aplicación del reactivo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende adicionalmente el paso de:
(d)
posicionar un dispositivo para aplicar una cubierta local de pequeña extensión sobre la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se automatiza la aplicación del reactivo.
5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que se cubre o humecta con reactivo la cubierta local de pequeña extensión.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 5, en el que se automatiza la aplicación de la cubierta local de pequeña extensión.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que durante el paso (a) se registra una o varias fotografías del material biológico inmovilizado, detectado.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que se muestra conjuntamente las fotografías para la preselección del material biológico inmovilizado, apropiado.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que entre la detección del material biológico inmovilizado a investigar, con registro de su posición, se puede intercalar en el paso (a) y el posicionamiento de un dispositivo para aplicar al menos un reactivo sobre la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado en el paso (b) al menos un paso intermedio para tratar, preferentemente lavar el material biológico inmovilizado.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se puede realizar una valoración después del paso (c) o (d) por posicionamiento de un dispositivo de análisis mediante la posición registrada en el paso (a) del material biológico inmovilizado.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el material biológico inmovilizado a detectar comprende células.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que las células son marcadas con marcadores específicos.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el material biológico inmovilizado a detectar comprende cromosomas en metafase.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el reactivo comprende un ácido nucleico seleccionado entre ADN o ARN, o un polipéptido.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el reactivo está provisto de uno o varios marcados iguales o diferentes.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el marcado del reactivo comprende al menos un colorante fluorescente.
17. Procedimiento según la reivindicación 14 a 16, en el que el reactivo es capaz de hibridación o de reacción antígeno/anticuerpo o reacción ligandos/proteína.
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