ES2216080T3 - Dispositivo automatizado y procedimiento para medir y determinar moleculas o partes de moleculas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN DISPOSITIVO AUTOMATIZADO PARA DETERMINAR Y MEDIR UN NUMERO CUALQUIERA DE DIFERENTES TIPOS DE MOLECULAS, PARTES DE MOLECULAS O GRUPOS DE MOLECULAS EN OBJETOS LIQUIDOS O SOLIDOS, EN PARTICULAR EN CELULAS O PRUEBAS DE TEJIDO, QUE COMPRENDE UNA COMBINACION DE UN SISTEMA DE PIPETEADO, UN SISTEMA DE MANEJO EN 3D Y UN SISTEMA DE MEDICION OPTICO, PREFERENTEMENTE UN SOPORTE DE MICROSCOPIO EQUIPADO CON UN SISTEMA TOMAVISTAS. LA INVENCION TRATA TAMBIEN DE UN PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO PARA DETERMINAR Y CLASIFICAR UN NUMERO CUALQUIERA DE TIPOS DE MOLECULAS, PARTES DE MOLECULAS Y GRUPOS DE MOLECULAS EN OBJETOS, CON EL QUE PUEDEN APLICARSE Y MEDIRSE AUTOMATICAMENTE, AL MISMO TIEMPO O DE FORMA SECUENCIAL, UN NUMERO CUALQUIERA DE SOLUCIONES REACTIVAS DIFERENTES SOBRE UN OBJETO LIQUIDO O SOLIDO, EN PARTICULAR UNA CELULA, CELULAS O UNA PRUEBA DE TEJIDO. UN CAMPO DE APLICACION IMPORTANTE DE LA INVENCION ES LA INVESTIGACION DEL CANCER E INMUNOLOGICA. LA INVENCION PERMITE OBTENR ENMUY POCO TIEMPO UNOS RESULTADOS DE ANALISIS EXACTOS DESDE EL PUNTO DE VISTA CUALITATIVO Y CUANTITATIVO SOBRE LA DISPOSICION Y LA DISTRIBUCION CORRELATIVA DEL TIPO DE MOLECULAS EXISTENTES EN EL OBJETO A ANALIZAR QUE PROPORCIONAN INFORMACION POR EJEMPLO, ACERCA DE DIFERENTES ENFERMEDADES Y SU TRATAMIENTO.

Description

Dispositivo automatizado y procedimiento para medir y determinar moléculas o partes de moléculas.

La presente invención se refiere a un dispositivo automatizado para determinar y medir cualquier número Xn (n = 1, 2, 3 ... N) de clases de moléculas, partes de moléculas o grupos de moléculas en un objeto líquido o sólido. Además, la invención se refiere a un procedimiento para determinar y cartografiar cualquier número Xn (n = 1, 2, 3 ...N) de clases de moléculas, partes de moléculas o grupos de moléculas en un objeto líquido o sólido aplicando a un objeto simultáneamente o secuencialmente cualquier número de reactivos para medirlas.

En el ámbito de las ciencias naturales, sobre todo, de la biología, química, bioquímica y medicina, se emplean diferentes técnicas y procedimientos para analizar y determinar la dispersión correlativa y/ó la combinación y disposición de diferentes clases de moléculas o grupos de moléculas, como por ejemplo de moléculas de proteínas o polímeros, o el comportamiento colorante del objeto. El objetivo de dichos procedimientos y técnicas consiste en conseguir conocimientos sobre la disposición, la distribución y la estructura de grupos de moléculas en los objetos correspondientes líquidos o sólidos. En el transcurso del proceso, los objetos a analizar se diluyen en soluciones específicas para poder analizar y determinar, por ejemplo a base de los complejos formados (p.ej. EDTA complejos de metal o complejos de antígeno-anticuerpo etc.) las clases específicas de moléculas o grupos de moléculas. Sobre todo en la medicina y en la biología, tales procedimientos se emplean para conseguir a partir de la disposición y la dispersión de tales especies de moléculas en el objeto correspondiente mediciones diagnósticas sobre ciertas imágenes de enfermedades o para ganar conocimientos sobre la organización molecular de células o sistemas celulares.

Los procedimientos manuales conocidos del estado de la técnica se llevan a cabo siguiendo un esquema determinado. Así, en el ámbito biológico o medicinario, el objeto a analizar se diluye en una solución que contiene un reactivo específico. Este reactivo puede ser un colorante, un anticuerpo etc. que reacciona con un grupo determinado de moléculas, formando sobre todo un complejo específico. Esto quiere decir que el reactivo específico marca grupos o puntos específicos en el objeto a analizar. Después de un tiempo de actuación determinado se analiza el objeto específicamente marcado. Por regla general, esto se hace mediante modelos de dispersión de señales, por ejemplo, en el análisis microscópico de células, mediante varias señales de fluorescencia utilizando isotiocianato de fluoresceína o ficoeritrina.

Según el estado de la técnica parte de los procedimientos manuales, como p.ej. la tinción de cortes de tejido con soluciones colorantes simples, también los pueden ejecutar máquinas automáticas de tinción especiales, y para el marcaje simple de moléculas existen máquinas automáticas de marcaje.

Sin embargo, ambos procedimientos - el tratamiento manual y automático de objetos, especialmente de células o cortes de tejido, con reactivos - exigen el control visual de los resultados y su evaluación con otro dispositivo específico a este fin después de haber ajustado el objeto en este dispositivo, por ejemplo, en un microscopio.

La DE-A-43 29 791 describe un robot de pipeteo con movimiento tridimensional, controlado y supervisado por un ordenador. Sirve para transportar recipientes de reacción y para extraer o introducir líquidos.

Según el estado de la técnica, los procedimientos más complejos para el tratamiento de objetos con reactivos, como por ejemplo, la aplicación secuente de soluciones muy diferentes sobre células, que, durante este procedimiento, tienen que ser evaluadas o registradas a tiempos fijos, son limitados completamente a procedimientos manuales con alto riesgo de errores, quiere decir, no sirven ni para la evaluación cuantitativa ni para fines de estadísticas. Cuando estos métodos exigen plazos de control muy exactos (p.ej. 20 minutos exactos) para cada uno de los pasos intermedios durante un gran intervalo de tiempo total (p.ej. durante 34 horas), las capacidades de un operador se sobrepasan.

Para determinar la dispersión correlativa de varias clases de moléculas, en la biomedicina se utilizan muchas veces varios fluorocromos diferentes, acoplándolos (directa o indirectamente) a las clases de moléculas a localizar. En este caso, las señales de fluorescencia emitidas por estos fluorocromos diferentes se detectan por separado. El poner en relación recíproca estas señales suministra por fin informaciones sobre la dispersión correlativa de las diferentes clases de moléculas.

Sin embargo, estos procedimientos, importantes sobre todo para el análisis de procesos combinatorios de diferenciación molecular, son limitados al análisis de, como máximo, 4 hasta 5 señales de fluorescencia diferentes en una muestra dada, no pudiendo distinguirse entre un mayor número de señales de fluorescencia diferentes. Por eso, los procedimientos existentes hasta ahora están muy limitados respecto a las clases de moléculas que se pueden determinar y localizar en una misma muestra. Resulta que, hasta ahora, la detección de combinaciones de orden superior no es posible.

Esta limitación solamente puede superarse destruyendo, en un primer paso, por decoloración mediante radiación UV los fluorocromos ligados en el lugar de marcaje, después de haber marcado, de la manera descrita más arriba, determinados clases o grupos de moléculas.

Después, se añade una segunda o siguiente solución al objeto, que contiene desde 1 hasta, como máximo, 5 fluorocromos diferentes para el marcaje de más clases de moléculas. Después del tiempo de actuación necesario se consiguen nuevos modelos de dispersión de señales de las moléculas marcadas específicamente. Después de la decoloración de los fluorocromos, este proceso se repite varias veces. De esta manera, la cantidad de modelos de dispersión de señales aumenta con la cantidad de soluciones reactivas utilizadas. Estos modelos de dispersión de señales pueden suministrar informaciones sobre la disposición y la dispersión de los grupos de moléculas en el objeto.

Sin embargo, los procedimientos, conocidos hasta ahora, para determinar clases de moléculas o grupos de moléculas presentan desventajas importantes, ya que los pasos de procedimiento se realizan a mano. Estos pasos de procedimiento realizados a mano tardan mucho y, respecto a procedimientos modernos, que deben suministrar evaluaciones cuantitativas exactas, presentan alto riesgo de errores y no pueden ser estandarizados.

Por ejemplo, la solución reactiva se pipetea en general a mano sobre el objeto; después, el objeto se pone y se ajusta a mano en una mesa para microscopio. Todos los demás procesos de pipeteado se realizan entonces a mano, encontrándose el objeto invariablemente en la platina portaobjetos del microscopio. Durante el pipeteado manual no se satisface siempre la dosis exacta de la solución reactiva. Además, no es posible posicionar la pipeta exactamente en el mismo punto del objeto cuando se pipetea repetidamente. Adicionalmente, ocurre muy fácilmente que la pipeta entra en contacto con el objeto a analizar, de manera que el punto de contacto del objeto puede ser cambiado. El resultado es una falsificación de los resultados de evaluación.

La ejecución de una serie de pruebas con más de 20 marcadores diferentes, aplicados a mano cada media hora, tarda varios días. Una evaluación consiguiente de las señales o imágenes, quiere decir, la determinación de los modelos correlativos de dispersión molecular, también puede exigir varios días hasta semanas, ya que los modelos de dispersión de señales tienen que ser evaluados uno por uno antes de poder integrarlas dentro de una imagen completa. Este procedimiento de evaluación también exige mucho tiempo. Para conseguir por fin a un resultado de evaluación se necesitan muchas veces varias semanas.

Por las causas señaladas los procedimientos conocidos permiten solamente localizar y determinar por lo máximo 4 - 5 clases de moléculas en un objeto, es decir, la cantidad de clases de moléculas o grupos de moléculas, que hasta ahora se podían analizar y determinar, era muy limitada.

Por consiguiente, actualmente, con muestras particulares, no es factible una microscopía cuantitativa exacta de modelos de combinaciones moleculares más complejos.

El objetivo de la presente invención consiste en superar las desventajas o limitaciones de procedimientos tradicionales para determinar clases de moléculas, grupos de moléculas o partes de moléculas (p.ej. epitopos, dominios) en varios objetos.

Por eso, la invención presente se refiere a un dispositivo automatizado para determinar y medir cualquier número Xn (n = 1, 2,3 ... n) de clases de moléculas, grupos de moléculas y partes de moléculas en un objeto líquido o sólido. Con este dispositivo se pueden tomar imágenes de cualquier número de modelos de marcaje individuales de un mismo objeto para conducirlas por medio de la superposición de imágenes computerizada en modelos de combinaciones moleculares muy complejos.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento automatizado para determinar automáticamente cualquier número X (X = 1, 2, 3 ...N) de clases o grupos de moléculas diferentes en un objeto líquido o sólido.

Con este procedimiento automatizado se pueden determinar cualquieras combinaciones complejas de diferentes especies de moléculas y clases de moléculas dentro de una misma estructura (de preferencia biológica) haciendo una serie consecutiva de cualquier número de marcajes fluorescentes y decoloraciones de fluorescencia. De esta manera se pueden determinar formas superiores del orden combinatorio de sistemas, de preferencia, de sistemas biológicas.

El dispositivo según la presente invención comprende un sistema de pipeteado, un sistema de manipulación tridimensional así como un sistema óptico de medida. Se prefiere sobre todo el empleo de un estativo del microscopio inverso o vertical. El sistema de manipulación tridimensional comprende un sistema de robot o de guiado lineal. Un sistema de guiado lineal con la consiguiente disposición lineal del portareactivos completo es técnicamente menos complicado y, por eso, barato. Además, el dispositivo está provisto de un captador de imágenes unido sobre todo al módulo del microscopio. Es un dispositivo automatizado, quiere decir, las secuencias funcionales de los componentes individuales y combinados son controladas y supervisadas por ordenador.

La figura muestra la estructura esquemática de una configuración del dispositivo según la invención.

Dispositivos de pipeteado automáticos están suficientemente conocidos del estado de la técnica anterior. Sin embargo, no sirven para el dispositivo según la invención, ya que, la detección y la cartografía exactas de las diferentes clases de moléculas exigen, que la punta de la pipeta pueda ser colocada varias veces exactamente en el mismo punto del objeto líquido o sólido. Además, es necesario o deseable un cambio automático de la punta de pipeta antes de aspirar una nueva solución, para poder excluir que la punta contenga todavía una porción pequeña de la solución utilizada previamente. El sistema de pipeteado comprende un depósito para las soluciones, un depósito colector para soluciones y puntas de pipetas utilizadas, un depósito para soluciones de lavado, un depósito para las puntas de pipetas utilizables, un recipiente para las puntas de pipetas utilizadas y expulsadas así como un recipiente para las soluciones de lavado después del tiempo de actuación. Adicionalmente, el módulo de pipeteado puede tener un control de temperatura para los reactivos almacenados.

El sistema de pipeteado integrado en el dispositivo según la invención tiene una adecuada repetibilidad del posicionamiento de la pipeta sobre la muestra del objeto, para que la pipeta pueda ser movida tantas veces como sea necesario hacia un punto determinado del objeto. Es preferible una repetibilidad del posicionamiento de por lo menos \pm 01 mm. Además, el sistema de pipeteado se manda de manera que cada solución utilizada sea tomada y emitida automáticamente. El sistema de pipeteado se caracteriza por su alta movilidad y flexibilidad.

Sistemas de manipulación tridimensional se emplean hoy en día en casi todos los sectores industriales. El sistema de manipulación tridimensional según la presente invención, que introduce la pipeta en la solución, transfiere la pipeta hacia el objeto y vuelve a la posición original después de haber emitido la solución, tiene de tener una repetibilidad del posicionamiento adaptada al objeto. La repetibilidad del posicionamiento del sistema de manipulación tridimensional es necesaria, sobre todo, para determinar ciertos puntos o lugares de los objetos que, durante una serie de pruebas, se mezclan con varias soluciones para analizar las clases específicas de moléculas. El sistema de manipulación tridimensional debe ser capaz de dirigirse a puntos predeterminados del objeto, cuantas veces se deseen, puesto que desviaciones podrían conducir a resultados de evaluación erróneos. Por consiguiente, también tiene una repetibilidad del posicionamiento, de preferencia, en el orden de \pm 0,1 mm por lo menos. El sistema de manipulación tridimensional se mueve dentro de un área de trabajo tridimensional y tiene un eje de rotación para el posicionamiento exacto del dispositivo de pipeteado. Las funciones individuales del sistema de pipeteado y del sistema de manipulación tridimensional así como las relaciones técnicas de ambos sistemas son controladas por ordenador.

Otra componente importante del dispositivo automatizado según la invención es el sistema óptico de medida, especialmente un microscopio. Se prefiere sobre todo el empleo de un estativo del microscopio inverso o vertical. De ser necesario, este microscopio puede estar provisto de una caja climatizada para asegurar condiciones fisiológicas exactas para células vivas, sobre todo para experimentos de larga duración. El estativo del microscopio está provisto de un cambio automático de filtros y objetivos.

El estativo del microscopio está unido a un dispositivo de captación de imágenes. Este dispositivo de captación de imágenes permite la evaluación computerizada de imágenes, captando al final de cada paso el modelo de dispersión de señales observado visualmente a través del microscopio.

El conjunto del dispositivo automatizado, según la presente invención, tiene los siguientes parámetros técnicos:

1.

Controlabilidad por medio de un ordenador central.

2.

Cambio automático de las puntas de pipeta.

3.

Repetibilidad del posicionamiento del sistema de manipulación tridimensional y del sistema de pipeteado, de preferencia, por lo menos \pm 0,1 mm.

4.

Ninguna perjudicación de los sistemas individuales por oscilaciones, emisiones, campos, ni perjudicación del usuario por ruidos.

5.

En caso dado, insalación de termostatos.

6.

Garantía de un área de trabajo tridimensional y de un eje de rotación para el posicionamiento exacto del dispositivo de pipeteado.

El dispositivo automático según la invención puede utilizarse en muchas aplicaciones de la ciencias naturales, sobre todo en la biología y la medicina. Campos de aplicación muy importantes son la investigación o el diagnóstico del cáncer o de la inmunología.

El procedimiento según la invención para determinar clases de moléculas o grupos de moléculas en objetos sólidos o líquidos es caracterizado por las características de la reivindicación 1.

El procedimiento se compone de los siguientes pasos automáticos del procedimiento:

I.

Por medio del sistema de pipeteado se extrae automáticamente una solución reactiva Y1 de un recipiente que contiene la solución Y1.

II.

La solución Y1 se aplica automáticamente sobre el objeto (sólido o líquido), situado en un dispositivo portaobjetos.

III.

La solución Y1 acciona sobre el objeto durante un tiempo determinado y ajustado automáticamente.

IV.

Inmediatamente después de esta acción, ó, en caso dado, incluso durante la acción, se puede tomar una imagen del objeto tratado con la solución Y1 por operación automática del sistema de captación de imágenes del microscopio. Alternativamente, se puede interponer el paso V antes del paso IV.

V.

Después de haber accionado la solución Y1 sobe el objeto durante un tiempo determinado ajustado automáticamente, la solución Y1 se aspira por medio del sistema de pipeteado.

Dependiendo del objeto y de la determinación específica, que se quiere realizar, el paso VI ofrece varias alternativas.

VIa.

Una segunda solución Y2 o la solución Y1 o una mezcla de Y1 y Y2 se aplica por medio del sistema de pipeteado.

VIb.

Después de haber quitado la solución Y1, de la solución Y2 o de una mezcla de Y1 e Y2 se aplica automáticamente una solución de lavado por medio del sistema de pipeteado en el objeto, accionando sobre éste durante un período determinable.

VIc.

Inmediatamente después de haber quitado la solución Y1 se aplica automáticamente una solución de lavado Z2 o Z3 o Zn (v = 1, 2, 3 ... N) por medio del sistema de pipeteado.

VId.

Inmediatamente después de haber quitado la solución Y1 las soluciones de lavado Z1 hasta Zn se aplican sobre el objeto en un orden determinable de manera variable.

VIe.

Cuando la solución Y1 ha accionado sobre el objeto y ha sido quitada de este, después de un tiempo variable ajustado automáticamente, se aplica una solución de lavado Z1 sobre el objeto.

VIf.

Solamente después de un tiempo determinado y variable se aplican sobre el objeto automáticamente las soluciones de lavado Z1 hasta Zn en un orden determinado y con un tiempo de acción determinado.

VII.

Los pasos I - VIf pueden repetirse, cuantas veces se desean, con una solución Y3 o con cualquier número de soluciones Yn o con una mezcla de soluciones diferentes Yn.

Los pasos I-VII pueden interrumpirse en cualquier momento y punto de los pasos del procedimiento, por lo menos en la medida que el objeto a analizar lo permita. Los ciclos particulares del procedimiento pueden realizarse muy rápidamente, de preferencia. dentro de un período de 5 minutos hasta 30 minutos.

Este procedimiento, según la invención, puede realizarse con el dispositivo automatizado de la presente invención que se compone de un sistema de manipulación tridimensional, un sistema de pipeteado, un sistema óptico de medida, sobre todo, un estativo de microscopio, y un dispositivo de captación de imágenes, controlados automáticamente por un ordenador.

El procedimiento según la invención lleva, dentro de un tiempo determinado, a resultados de evaluación cuantitativa y cualitativamente exactos. Además, se pueden analizar y determinar cualquieras cantidades de clases de moléculas, especies de moléculas o partes de moléculas en un objeto. Las fuentes de error que se presentan durante la realización a mano son más o menos excluidas. Por consiguiente, el procedimiento automatizado, según la presente invención, tiene aventajas importantes respecto a los procedimientos conocidos del estado de la técnica anterior para analizar y determinar grupos de moléculas diferentes.

En una configuración preferida de la presente invención el procedimiento se aplica para detectar y cartografiar automáticamente cualquiera cantidad de especies de moléculas o epitopos en una célula o una muestra de tejido. De esta manera se quiere conocer la disposición y la dispersión correlativa de los grupos de moléculas para conseguir informaciones sobre varias enfermedades y su tratamiento. A este fin, las células o muestras de tejido se diluyen en un primer reactivo Y1 que contiene, por ejemplo, ligandos o anticuerpos fluorescentes. Después de un período de incubación determinado se toman y registran modelos específicos de dispersión del marcaje de las muestras de tejido o células marcadas específicamente.

Para captar los modelos de dispersión del marcaje, se excita automáticamente, por ejemplo, bajo el control automático de un ordenador, un fluorocromo y se abre una corredera de la cámara de vídeo durante un tiempo determinado. De esta manera, la señal de fluorescencia se registra, de preferencia, en forma digital, quiere decir, en forma de una imagen digitalizada. Después del tiempo de apertura determinado de la corredera ésta se cierra automáticamente, igual que la corredera para la excitación automática de la fluorescencia. El mismo procedimiento puede repetirse automáticamente para otros fluorocromos ligados que se encuentran simultáneamente en la muestra, interponiendo los filtros de fluorescencia correctas y actuando las correderas correspondientes.

Acto seguido, las muestras marcadas específicamente se decoloran y se lavan antes de diluirlas en un segundo reactivo Y2 o en cualquiera cantidad de reactivos Yn o sus mezclas. El procedimiento automático que se puede realizar mediante cualquier número de tales ciclos de marcaje, captación de imágenes y decoloración se aplica sobre todo en la medicina y en la biología. Mientras lo permite el objeto sólido o líquido a analizar, los pasos particulares del procedimiento pueden repetirse a voluntad. El primer y/o los subsiguientes pasos del procedimiento o estos ciclos repetitivos se realizan por medio de un procedimiento óptico como por ejemplo la microscopía a fluorescencia en combinación con la microscopia penetrante. El primer ciclo del procedimiento se termina, registrando por medio de un procedimiento penetrante una imagen de la muestra de tejido o de la célula marcada, por ejemplo una imagen de contraste de fases o una imagen de contraste diferencial de interferencia. Cada ciclo se termina con este registro de una imagen de la muestra de tejido o de la célula marcada específicamente.

De esta manera, por medio de ciclos repetitivos de marcaje, captación de imágenes y decoloración es posible conseguir imágenes de cualquiera cantidad de modelos de marcaje de cada muestra, célula o muestra de tejido; se pueden determinar los modelos de combinación complejos resultantes proyectándolos casi sobre la estructura biológica (por ej. de una célula) por superposición computerizada de las imágenes de estos modelos individuales. La superposición y el análisis de imágenes puede realizarse automáticamente por medio de ordenadores especiales. Por medio de superposiciones computerizadas de imágenes de células unitarias o múltiples se consigue detectar y evaluar de manera racional, p.ej. durante la noche, las formas complejas de la organización molecular de células que ya no pueden concebirse directamente de manera visual como modelos de estructura fija. Entonces, no procede una evaluación laboriosa de cada una de las imágenes, como por ejemplo, de las copias de modelos hechas a mano. Además, importantes informaciones cuantitativas sobre concentraciones moleculares correlativas y relaciones topológicos se pueden conseguir solamente por medio de algoritmos especiales. Además, hasta ahora era casi imposible integrar las imágenes individuales en una imagen general o analizar el comportamiento combinatorio muy complejo en sistemas celulares completos.

Ahora, con ayuda del procedimiento según la invención, el marcaje específico de una muestra, célula o muestra de tejido con cualquier número de soluciones de reactivos es posible a discreción. Inconvenientes estéricos importantes no proceden, lo que puede comprobarse por el cambio del orden de los reactivos en cualquiera muestra, manteniéndose prácticamente constantes los resultados individuales del marcaje. Los reactivos empleados en esta configuración de la invención comprenden anticuerpos, lectinos, ácidos nucleicos, biotoxinas, moléculas ligantes de inmunoglobulina (p. ej. proteínas) u otros ligandos, como por ejemplo fluorocromos o enzimas. Se prefieren ligandos o anticuerpos fluorescentes, sobre todo ligandos o anticuerpos conjugados con fluorocromo. En esta configuración, los objetos pueden ser células unitarias, varias células, cortes de tejido pero también moléculas aplicadas sobre bases determinadas o contenidas en medios determinados (p.ej. en geles).

Sigue una descripción general de los pasos particulares del procedimiento automatizado para marcar y medir clases de moléculas en una muestra de células o de tejido, sin limitar a eso el procedimiento según la invención. Los pasos particulares pueden intercambiarse o eliminarse según necesidad.

Un objeto, por ejemplo una célula (p.ej. células fijadas, p.ej. células fijadas con acetona, células tratadas con azida de sodio o células vivas) se encuentra en la platina portaobjetos del microscopio. Después de haber preparado y posicionado a mano la muestra sobre la platina portaobjetos, los pasos del procedimiento automatizado se ejecutan de la manera siguiente:

1.

Aspirar una primera solución de incubación Y1 (un o más reactivos conjugados con fluorocromo).

2.

Pipetear esta solución Y1 sobre el objeto.

3.

Incubación del objeto con esta solución Y1 a una temperatura determinada, p. ej., a temperatura ambiental.

4.

Quitar la solución de incubación Y1.

5.

Gotear una o más veces una solución de lavado Z1, p.ej. una solución de tampón.

6.

Quitar la solución de lavado Z1.

7.

Registrar el modelo de dispersión de fluorescencia (captación de imagen). (En el caso de varios fluorocromos se utilizan filtros selectivos de captación de fluorescencia para la captación de las imágenes.)

8.

Pipetear una solución de lavado Z2.

9.

Decolorar una muestra por medio de una excitación de fluorescencia.

10.

El proceso de decoloración está terminado cuando ya no haya fluorescencia. Este momento será predeterminado a base de pruebas preliminares o comprobado o determinado por el sistema de captación de imágenes.

11.

Quitar la solución de lavado Z2.

12.

Aspirar una segunda solución de incubación Y2 (con un o más reactivos conjugados con fluorocromo).

13.

Gotear esta solución en la misma muestra de célula (como más arriba, sin tocar ni haber desplazado ésta).

14.

Continuar según 4-11. Después, repetir el proceso con una tercera, cuarta, quinta ... nta solución de incubación.

Cada ciclo se termina por el registro de la imagen de contraste de fases o una imagen de contraste diferencial de interferencia. Todos los pasos del procedimiento 1-14 se desarrollan automáticamente. Por medio de la superposición computerizada de las imágenes individuales se forma una imagen general que se evalúa. Esta imagen molecular general de una célula particular o de una muestra de tejido da informaciones sobre la forma compleja de la organización molecular de células que, por principio, no pueden detectarse ni evaluarse visualmente cuando se presentan muchos, p.ej. 18 clases de moléculas diferentes registradas, que conducen, en el caso de este ejemplo, a una cantidad de 218 combinaciones diferentes. Otro aumento de esta resolución diferenciador es fácilmente posible. Los procedimientos conocidos del análisis combinatorio de sistemas, sobre todo de sistemas celulares, están estrictamente limitados en cuanto a su capacidad de diferenciación combinatoria de 23 hasta 25, como máximo. Así, con los procedimientos conocidos no se pueden detectar formas superiores de organización molecular, que se basan en el análisis combinatorio.

A diferencia de todos los procedimientos conocidos hasta ahora para el análisis combinatorio de sistemas, sobre todo, de sistemas celulares, el procedimiento según la invención tiene una mejor capacidad de diferenciación combinatoria molecular (capacidad de resolución).

Con el procedimiento según la invención se pueden detectar, por ejemplo, espectros específicos combinatiorios de diferenciación en el sistema inmune, únicamente a base de una sola muestra de sangre. De esta manera, también es posible, sobre todo en la biología y en la medicina, conseguir con el procedimiento según la invención informaciones sobre la disposición o dispersión molecular de grupos de moléculas particulares, así como informaciones sobre imágenes de enfermedades específicas y sus posibilidades de tratamiento.

En la aplicación del procedimiento ya se ha evidenciado que por la "resolución" prácticamente ilimitada para la diferenciación molecular combinatoria (quiere decir, resolución diferenciador) hay combinaciones moleculares anormales sobre superficies celulares de células del sistema inmune. Estas ofrecen perspectivas completamente novedosas sobre codificaciones anormales de superficies para invasiones celulares, por ejemplo, en el caso de enfermedades neurodegenerativas, presentando al mismo tiempo nuevas posibilidades diagnósticas y terapéuticas.

Otro campo de aplicación del procedimiento según la invención puede ser la carteografía de modeles genéticos complejos, p.ej. sobre los "gen chips", que en el futuro serán de gran importancia para el "Multi Drug Testing" o para encontrar modelos de mutación complejos.

Sin embargo, el procedimiento según la invención es apropiado sobre todo para determinar y analizar formas de organización molecular en una muestra de células o de tejido, sin limitarse a esto.

Pero, de manera general, cada objeto en estado líquido o sólido se puede analizar respecto a su estructura molecular o respecto a la disposición o presencia de partes de moléculas. Como ejemplo, se pueden mencionar el análisis y la determinación de disposiciones y combinaciones moleculares en semiconductores, aleaciones o materias plásticas.

El siguiente ejemplo de ejecución debe explicar más en detalle la invención, sin limitarla.

Ejemplo de ejecución

Marcaje de 18 clases diferentes de moléculas en un conjunto de células particulares (leucocitos de sangre mononucleares isolados, aplicados sobre un portaobjetos), quiere decir, en una misma muestra mediante ciclos repetitivos de incubación, captación de imágenes y decoloración (RIIBZ = repetitive incubation -imaging-bleaching cycles).

Preparación

1.

Un cubreobjetos se recubre de una capa de células isoladas.

2.

Secar al aire las células durante aprox. 10 minutos a temperatura ambiente.

3.

Corta fijación con acetona durante 10 segundos (a temperatura ambiente).

4.

Secar al aire durante un momento.

5.

Congelar instantáneamente el cubreobjetos a través de isopentano prerefrigerado en nitrógeno liquido.

6.

(Almacenar a largo plazo a 80 grados bajo cero) o

7.

deshidratar durante 20 minutos en acetona a 20 grados bajo cero.

8.

Secar al aire a temperatura ambiente.

9.

Rehidratar en PBS (Phosphate buffered salive, pH 7,4).

10.

Incubación previa con suero de cabra normal 1:30.

11.

Lavar en PBS.

12.

Posicionar en seguida el cubreobjetos sobre un soporte especial en la platina portaobjetos del microscopio inverso.

13.

Ajustar las células buscadas por control visual a través del ocular empleando un objetivo de contraste de fase.

14.

Cerrar la cámara húmeda de la mesa del microscopio.

15.

Conectar el robot de pipetear.

16.

Entrar en la computadora el orden y el ritmo de los pasos de pipeteado, de imaging y de bleaching.

17.

Llenar los reactivos (soluciones de anticuerpos, tampones) en los recipientes predeterminados (p.ej. recipientes de reacción Eppendorf) situados en el bastidor del equipo de automatización.

Realización del ciclo RIIBZ por medio del equipo de automatización

Ciclo 1

1.

Una solución A (100 microlitros de solución, consistente de 80 microlitros de sal tamponado con fosfato, pH 7,4, + 10 microlitros de 1-anticuerpos monoclonales, acoplada a isotiocianato de fluoresceína (FITC), + 10 microlitros de 2-anticuerpos monoclonales, acoplados a o ficoeritrina (PE), se extrae por medio del robot de pipetear de un contenedor, que contiene la solución. El recipiente es un recipiente de reacción de plástico.

2.

La solución A se aplica por medio del robot de pipetear sobre el objeto (células en el cubiertaobjetos), que se encuentra en la platina portaobjetos del microscopio.

3.

La solución A acciona durante un tiempo determinado sobre el objeto (p.ej. durante 20 minutos a temperatura ambiental).

4.

Inmediatamente después del paso 3, esta solución de incubación se aspira y se desecha por medio del robot de pipetear; facultativamente se pipetea en un recipiente especial de descarga (recipiente de reacción) situado en el bastidor del equipo automatizado.

5.

Siguen 10 pasos consiguientes de lavado con tampones, que se extraen uno por uno, por medio del robot de pipetear, de los recipientes de reacción, situados en el bastidor, se aplican sobre la muestra celular para ser aspirados y desechados otra vez. Cada paso de lavado dura aproximadamente 2 minutos.

6.

Al término de los 10 pasos de lavado se aplica otra vez una solución de tampón sobre la muestra.

7.

Inmediatamente después del paso 6, se capta y se memoriza automáticamente, en el modo de contraste de fase, por medio de un equipo de captación de imágenes (por ej. una cámara CCD), una imagen durante un tiempo determinado. A través del preparado se captan imágenes en varios niveles Z para determinar con ayuda de algoritmos el nivel de nitidez óptima.

8.

Después del paso 7 se abre la corredera de fluorescencia y se registra la señal de fluorescencia emitida por el fluorocromo ficoeritrina. En el microscopio, hay que elegir las características correspondientes del filtro de fluorescencia para facilitar una separación prácticamente absoluta entre PE y FITC: p.ej., filtros de emisión para PE (DEPIL 575 \pm 7 nm) y para FITC (BP 515 - 545 nm). La captación se realiza por separado para cada una de las dos señales de fluorescencia durante tiempos libremente programables (adaptados a la muestra celular) o, facultativamente, simultáneamente a través de filtros dicroíticos. Después de un tiempo determinado de registro la corredera de fluorescencia se cierra.

9.

Después del paso 8 se realiza directamente la decoloración de la muestra por la apertura permanente de la corredera de fluorescencia y la excitación de la muestra por medio de la longitud de las ondas de excitación (este tipo de decoloración suave destruye los fluorocromos ligados, preservando las características de los dominios inmunogenos).

10.

Al término del período de decoloración la corredera de fluorescencia vuelve a abrirse automáticamente y, durante el período arriba mencionado, el dispositivo de captación de imágenes registra una señal para cada uno de los fluorocromos (de esta señal registrada se desprende si el período de decoloración era suficiente para la eliminación completa de una señal de emisión: el criterio decisivo está radicado en el software del dispositivo automatizado, o se han programados períodos fijos para este proceso).

Ciclo 2

11.

Después del paso 10 la solución de tampón se aspira por el robot de pipetear antes de aplicar una solución B (consistente de 10 microlitros de tampón + 10 microlitros de 3-anticuerpos monoclonal, acoplado a FITC + 10 microlitros de 4-anticuerpos, acoplados a PE).

12.

Después del paso 11 se realizan los mismos pasos que más arriba (2 - 10: ciclo 2).

Ciclo 3

13.

Al término del ciclo 2, se realiza, por analogía, el ciclo 3 con otra solución C (para otros dos anticuerpos de la especificidad 5 y 6, acoplados a FITC y PE, respectivamente).

Después del ciclo 3, se pueden desarrollar N ciclos más para casi cualquier número de anticuerpos diferentes, sin perjudicar la especificidad del marcaje.

Según este principio, los anticuerpos con los fluorocromos destruidos por decoloración quedan ligados a las células, mientras que las células se cargan cada vez más de nuevos anticuerpos acoplados con fluorocromos en los sitios de combinación correspondientes. Estas combinaciones no producen ningún impedimento estérico: esto puede demostrarse, cambiando el orden de las reacciones de los anticuerpos en cualquiera suposición.

De esta manera, se puede demostrar casi cualquier número de clases de moléculas en células unitarias. También resulta la posibilidad de analizar sistemáticamente la combinatoria molecular dentro de células.

Claims (11)

1. Dispositivo automatizado para determinar y medir clases de moléculas, grupos de moléculas y partes de moléculas sobre un objeto líquido o sólido o en un objeto líquido o sólido, comprendiendo el dispositivo una combinación de un sistema de pipeteado, un sistema de manipulación tridimensional y un sistema óptico de medida, siendo mandados y controlados el sistema de pipeteado, el sistema de manipulación tridimensional y el sistema óptico de medida por medio de un ordenador y teniendo el sistema de pipeteado un pipeteado automático para aspirar y emitir líquidos, un cambio automático de pipetas y una repetibilidad del posicionamiento de, a lo mejor, por lo menos
\pm 0,1 mm,

caracterizado porque

el dispositivo está equipado de un equipo de captación de imágenes, especialmente de una cámara, y que el equipo de captación de imágenes capta cualquier número de modelos individuales de marcaje de un mismo objeto a analizar para transferirlas por medio de la superposición computerizada de imágenes en modelos moleculares de combinaciones muy complejas, determinándose y midiéndose en un mismo objeto por lo menos dos clases de moléculas, grupos de moléculas o partes de moléculas.

2. Dispositivo automatizado según reivindicación 1,

caracterizado porque

el sistema de manipulación tridimensional puede mover el sistema de pipeteado con la repetibilidad determinada del posicionamiento.

3. Dispositivo automatizado según reivindicación 1 ó 2,

caracterizado porque

el sistema óptico de medida contiene un estativo de microscopio inverso o vertical.

4. Dispositivo automatizado según reivindicación 3,

caracterizado porque

el estativo de microscopio está equipado de una caja climatizada.

5. Dispositivo automatizado según una de las reivindicaciones 1 hasta 4,

caracterizado porque

el sistema de manipulación tridimensional comprende de un robot o de un sistema de guiado lineal.

6. Procedimiento automatizado para determinar clases de moléculas, grupos de moléculas y partes de moléculas en un objeto líquido o sólido,

caracterizado porque

en un mismo objeto se analizan y se miden por lo menos dos clases de moléculas, grupos de moléculas o partes de moléculas aplicando simultáneamente o secuencialmente cualquier número de reactivos Yn (n = 1, 2,3 ... N), comprendiendo el procedimiento ciclos de incubación y/ó decoloración, que pueden repetirse a voluntad, mientras que después de cada ciclo del procedimiento se registra el modelo de dispersión de señales del objeto a analizar y se transfieren los modelos de dispersión de señales, obtenidos en cada ciclo del procedimiento, en una imagen general compleja del objeto a analizar, a saber en un modelo muy complejo de combinación molecular.

7. Procedimiento automatizado según reivindicación 6,

caracterizado porque

el procedimiento comprende los siguientes pasos automatizados:

I.

Aspiración de una primera solución reactiva Y1 de un recipiente que contiene la solución.

II.

Aplicación de la solución reactiva Y1 sobre el objeto (sólido o líquido), situado en un dispositivo portaobjetos.

III.

Acción de la solución reactiva durante un tiempo determinado ajustado automáticamente.

IV.

Registro de una imagen o de un valor de medida del objeto tratado anteriormente con la primera solución reactiva Y1, o, alternativamente, adelantar el paso V antes del paso IV.

V.

Quitar la solución reactiva Y1.

VI.

Repetición de los pasos I-V, aplicando varias veces la primera solución reactiva Y1 o una segunda solución Y2 o una mezcla de la primera y segunda solución reactiva; y

VII.

Repetición de los pasos I hasta VI con cualquier número de soluciones Yn (n = 1, 2, 3 ... N) o con una mezcla de estas.

8. Procedimiento automatizado según reivindicación 6 ó 7,

caracterizado porque

o inmediatamente o al término de un período determinable de manera variable después de haber quitado la primera o segunda solución reactiva o de la solución reactiva Yn o de una mezcla de éstas, se aplica por lo menos una solución de lavado Z1 o Z2 o Zn (n = 1, 2, 3 ... N) sobre el objeto.

9. Procedimiento automatizado según reivindicación 6 hasta 8,

caracterizado porque

las soluciones reactivas comprenden colorantes formadores de complejos, anticuerpos, ligandos, sobre todo ligandos o anticuerpos conjugados con fluorocromo.

10. Procedimiento automatizado según reivindicación 6 hasta 9,

caracterizado porque

el objeto es una muestra, una muestra de tejido, una célula o varias células.

11. Procedimiento automatizado según una de las reivindicación 6 hasta 10,

caracterizado porque

el procedimiento comprende los siguientes pasos automatizados:

I.

Aspiración de una primera solución reactiva Y1, sobre todo de una solución que contiene un fluorocromo, del recipiente para pipetearla sobre una muestra, una muestra de tejido, una célula o varias células.

II.

Incubación de la muestra, de la muestra de tejido, de la célula o de las células durante un tiempo determinado.

III.

Quitar la solución reactiva Y1, pipetear una vez o más veces una solución de lavado Z1 hasta Zn.

IV.

Registro del modelo de dispersión del marcaje.

V.

Decolorar el objeto hasta que ya no se pueda comprobar fluorescencia.

VI.

Aspirar una segunda solución reactiva; y

VII.

Repetición de los pasos I hasta VI con cualquier número de soluciones reactivas Yn (n = 1, 2, 3 ... N) o mezclas de estas (ciclos repetitivos de marcaje, captación de imágenes y decoloración).