ES2199227T3

ES2199227T3 - Vacunas clostridiales multicomponentes que usan adyuvantes de saponina.

Info

Publication number: ES2199227T3
Application number: ES94912333T
Authority: ES
Inventors: David S. Roberts
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Corp SRL
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Corp SRL
Priority date: 1993-03-29
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2014-03-29
Also published as: DK0692974T3; DK0692974T4; AU689772B2; US6083512A; DE69432665T3; JP4129544B2; ES2199227T5; CA2158651C; CA2158651A1; DE69432665D1; US20010002256A1; JPH08510206A; PT692974E; EP0692974B1; AU6493994A; EP0692974A1; DE69432665T2; EP0692974B2; ATE240117T1; WO1994022476A1

Abstract

SE PRESENTAN NUEVAS FORMULACIONES PARA VACUNAS CLOSTRIDIALES MULTICOMPONENTES QUE UTILIZAN COADYUDANTES DISPERSIBLES QUE NO FORMAN DEPOSITOS, TALES COMO LA SAPONINA. LAS VACUNAS PUEDEN ADMINISTRARSE AL GANADO INTRAMUSCULARMENTE O SUBCUTANEAMENTE SIN REACCIONES LOCALES, SEVERAS, PERSISTENTES, TALES COMO GRANULOMAS, ABSCESOS Y CICATRICES, QUE NORMALMENTE SE VEN CON OTRAS VACUNAS CLOSTRIDIALES MULTICOMPONENTES.

Description

Vacunas clostridiales multicomponente que usan adyuvantes de saponina.

Campo técnico

La presente invención se refiere de forma general a composiciones de vacuna y a la aplicación médica de las mismas. Más específicamente, la invención se refiere a vacunas clostridiales multicomponente fabricadas sin vehículos estabilizantes o adyuvantes del almacenamiento pero con una saponina como adyuvante soluble en agua fácilmente dispersable.

Antecedentes de la invención

El género Clostridium se compone de bacterias anaeróbicas con forma de varilla formadoras de esporas. Los organismos se dan de forma natural en el suelo así como en el tracto intestinal de animales, incluyendo el hombre. Se adquieren cepas patogénicas por contaminación de heridas o por ingestión. Los miembros del género son responsables de una amplia variedad de enfermedades las cuales, en ausencia de vacunación, producen pérdidas económicas significativas a la industria agraria. Tales enfermedades incluyen la enfermedad de la fiebre del agua roja, cabeza grande, pierna negra, las enterotoxemias, hepatitis necrótica infecciosa, edema maligno, botulismo y tétanos, entre otros.

El tratamiento de infecciones clostridiales con antibióticos es raramente predecible y a menudo ineficaz. De acuerdo con esto, tales infecciones se controlan por lo general profilácticamente, usando composiciones de vacuna que contienen una o más bacterinas o toxoides clostridiales. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU n^{os} 4.292.307; 4.264.588; 3.579.633; Webster, A.C., and Frank, C.L. (1985) Austral. Vet. J. 62: 112-114; Kerry, J.B., and Craig G.R. (1979) The Veterinary Record 105: 551-554; Sterne et al. (1962) The Veterinary Record 74: 909-913. Los toxoides clostridiales son proteínas solubles de capacidad antigénica relativamente baja y, tradicionalmente, de baja estabilidad. De esta manera, las vacunas clostridiales requieren adyuvantes para aumentar la potencia antigénica y mejorar la estabilidad. En particular, se usan típicamente compuestos de aluminio, los cuales son capaces de absorber y/o precipitar toxoides clostridiales, así como de retener los toxoides en el sitio de inyección. Ver, por ejemplo, Thomsom, R.O., and Knight, P.A. (1976) Develop. Biol. Standard 32: 265-269; Thomsom et al. (26 de julio, 1969) The Veterinary Record páginas 81-85. Se han usado también en vacunas clostridiales otros potentes adyuvantes de depósito, como por ejemplo emulsiones de agua en aceite y carbopol. Los adyuvantes descritos anteriormente, aunque aumentan la capacidad antigénica, generalmente provocan reacciones locales persistentes graves, como por ejemplo granulomas, abscesos y marcas de cicatrices, cuando se inyectan subcutáneamente o intramuscularmente. Estas reacciones locales son, a su vez, responsables de defectos en la res muerta, lo que requiere un proceso de recortado caro, una consideración cuando la vacuna se ha inyectado en el tejido muscular destinado a ser un trozo de carne de valor.

Las saponinas son productos glicosídicos naturales de plantas, agrupados juntos en base a varias propiedades comunes. Las saponinas son agentes tensioactivos, una característica ilustrada por su tendencia a formar espuma cuando se agitan. Las saponinas son capaces de lisar células rojas sanguíneas, formar complejos con el colesterol y son tóxicas para los peces. Las saponinas se han empleado como adyuvantes en varias composiciones de vacuna, incluyendo vacunas contra infecciones por protozoos (patente de EE.UU nº 4.767.622), vacunas del moquillo canino (patente de EE.UU nº 5.178.862), vacunas contra la enfermedad de la fiebre aftosa, entre otras. Awad et al. (1986) Assius Vet. Med. J. 17: 201-214 describen una comparación de vacunas de pierna negra de un único componente incluyendo alumbre, gel de aluminio con saponina o adyuvantes oleosos. Sin embargo, no se ha descrito hasta ahora el uso de adyuvantes solubles que se dispersan fácilmente a partir del sitio de inyección y no tienen efecto de depósito, como por ejemplo una saponina, con una vacuna clostridial multicomponente.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que el adyuvante soluble en agua, la saponina, se puede usar en lugar de un adyuvante de depósito en vacunas clostridiales multicomponente para ganado vacuno. Las composiciones de vacuna de la invención contienen una saponina como su único componente adyuvante; son seguras y no tóxicas.

De acuerdo con esto, en una realización, la invención va dirigida a una composición de vacuna clostridial multicomponente que comprende inmunógenos de seis o más especies o serotipos de Clostridium, un adyuvante de tipo saponina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la invención que se trata va dirigida a una vacuna clostridial multicomponente la cual comprende además un antígeno que procede de uno o más de Moraxella bovis, Haemophilus somnus o Pasteurella haemolytica y/o un antígeno que procede de uno o más virus respiratorios.

En una realización adicional, la invención va dirigida a una composición de vacuna clostridial multicomponente que consta de inmunógenos de seis o más especies o serotipos de Clostridium, un adyuvante de tipo saponina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización adicional, la invención va dirigida a una composición de vacuna clostridial multicomponente la cual consta también de un antígeno que procede de uno o más de Moraxella bovis, Haemophilus somnus o Pasteurella haemolytica y/o un antígeno que procede de uno o más virus respiratorios.

En otra realización, el objeto de la invención va dirigido a una vacuna clostridial multicomponente, en la que dichas especies o serotipos se seleccionan a partir del grupo que consta de Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium tetani, Clostridium chauvoei, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium haemolyticum y Clostridium botulinum.

En otra realización, la invención que se trata va dirigida a una composición de vacuna clostridial multicomponente que comprende:

(a): bacterinas o toxoides clostridiales que proceden de cada uno de Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo D; y

(b): un adyuvante de saponina.

Aún en otra realización, la invención va dirigida a una composición de vacuna clostridial multicomponente que comprende:

(a): bacterinas o toxoides clostridiales que proceden de cada uno de Clostridium haemolyticum, Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo D; y

(b): un adyuvante de saponina.

Todavía en una realización adicional, la presente invención va dirigida al uso de las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección clostridial en un animal bovino.

En realizaciones particularmente preferidas la administración se hace intramuscularmente o subcutáneamente.

Éstas y otras realizaciones de la invención que se trata se les ocurrirá fácilmente a los expertos en la técnica en vista de la descripción en esta memoria descriptiva.

Descripción detallada

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales conocidas en la técnica de microbiología e inmunología clostridial. Tales técnicas se explican en, por ejemplo, Sterne and Batty (1975) Pathogenic Clostridia (Butterworths, Boston); Joint OIE-1ABS "Symposium on Clostridial Products in Veterinary Medicine" en Developments in Biological Standardization, Vol. 32, S. Karger, Basel (1976).

Tal y como se ha usado en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares, "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa.

A. Definiciones

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se tiene intención de definir tal y como se indican posteriormente.

Por "saponina" se entiende cualquiera de los glucósidos sapogénicos que se encuentran en una amplia variedad de plantas, así como derivados de los mismos, los cuales son capaces de aumentar la potencia de un antígeno administrado con ésta. El resto de sapogenina es generalmente un esteroide, un triterpenoide o un esteroidealcaloide. El resto de azúcar puede variar ampliamente y puede ser, por ejemplo, una glucosa, galactosa, pentosa, metilpentosa, entre otros.

Una composición de vacuna clostridial "multicomponente" se refiere a una vacuna que procede de cultivos de dos o más serotipos de la misma especie de Clostridium y/o cultivos que proceden de diferentes especies de Clostridium. Una vacuna multicomponente procederá de 6 o más serotipos o especies diferentes, dependiendo de las enfermedades en cuestión y del sujeto que va a ser tratado.

Un "inmunógeno" se refiere a una sustancia que, cuando se introduce en un animal, estimula una respuesta inmunológica, tal y como se define posteriormente. Para propósitos de la presente invención, un inmunógeno se refiere a un organismo completo (vivo, muerto o atenuado), una preparación separada y discreta a partir del organismo completo con el cual la preparación se asocia en la naturaleza (por ejemplo, una preparación de toxoide elaborada por inactivación de una toxina liberada del organismo, o una proteína contenida en un extracto libre de células que procede del organismo completo), o una molécula que contiene uno o más epítopos que estimularán una respuesta inmunológica.

Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo de una respuesta inmune celular y/o por anticuerpos del huésped a la composición o vacuna de interés, de tal forma que se prevengan o reduzcan los síntomas de la enfermedad por Clostridium.

Por "sujeto bovino" se entiende cualquiera de las muchas especies de vaca y buey, machos y hembras. El término no conlleva una edad en particular. De esta forma, se pretende cubrir tanto animales adultos como recién nacidos.

B. Procedimientos generales

Una parte importante de la presente invención es el sorprendente descubrimiento de que se pueden fabricar vacunas clostridiales multicomponente estables y potentes sin el uso de adyuvantes de depósito. En particular, la presente invención proporciona vacunas que incluyen adyuvantes solubles de rápida dispersión, esto es, adyuvantes que no se retienen en el sitio de inyección durante un período de tiempo significativo, mostrando así una baja reactividad tisular. Las vacunas se pueden administrar intramuscularmente y subcutáneamente sin los efectos secundarios dañinos y respuestas inflamatorias crónicas que producen granulomas y abscesos, vistos con otras composiciones de vacuna clostridiales cuando se administran a través de estas rutas.

Las vacunas son polivalentes, esto es, proceden de cultivos de dos o más serotipos de Clostridium y/o de diferentes especies de Clostridium. De acuerdo con esto, los inmunógenos pueden proceder de cualquier de las especies de Clostridium y serotipos del mismo, dependiendo de la enfermedad o enfermedades diana, como por ejemplo, pero que no se limitan a C. perfringens; C. septicum; C. tetani; C. chauvoei; C. novyi; C. sordellii; C. haemolyticum; C. botulinum; y serotipos de estas especies.

Son de particular interés las composiciones de vacuna multicomponente que proceden de bacterinas de C. chauvoei y toxoides de C. haemolyticum, C. chauvoei, C. septicum, C. novyi, C. sordellii y C. perfringens de Tipo C y D. Tal composición de vacuna multicomponente se designa en esta memoria descriptiva con el término de vacuna de "8 vías" porque no sólo proporciona inmunidad contra los organismos específicos identificados, sino también contra C. perfringens de Tipo B. Otra vacuna particularmente preferida contiene las mismas fracciones como anteriormente, con la excepción de la de C. haemolyticum y , por lo tanto, se hace referencia como una vacuna de "7 vías".

También se pueden añadir antígenos no clostridiales a las vacunas para ofrecer protección contra un amplio espectro de enfermedades. Por ejemplo, antígenos derivados de Moraxella bovis, Haemophilus somnus, Pasteurella haemolytica, varios virus respiratorios, así como otros, se pueden añadir a las composiciones de vacuna clostridial multicomponente de la presente invención para uso en sujetos bovinos.

Los inmunógenos clostridiales generalmente se proporcionan en forma de toxoides (toxinas inactivadas) y/o bacterinas (cultivos enteros inactivados, muertos) y se pueden preparar usando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los organismos de interés se crecen en un medio adecuado en condiciones anaerobias y en condiciones controladas de temperatura, pH y así sucesivamente, se determinan fácilmente por los expertos en la técnica. Las soluciones acuosas de peptonas generalmente son medios adecuados, generalmente a concentraciones de un 1 a un 4% (peso/volumen), los cuales se pueden enriquecer con extractos de levadura u órganos como por ejemplo músculo, hígado y páncreas, o con vitaminas y otros factores de crecimiento. Un azúcar, como por ejemplo glucosa, se añade como una fuente de carbono y energía. También se pueden añadir en bajas concentraciones agentes reductores, como por ejemplo clorhidrato de cisteína, por ejemplo de un 0,01 a un 0,05% (peso/volumen). Los organismos generalmente se incuban durante 4 a 72 horas, o durante más tiempo, dependiendo de la velocidad de crecimiento o producción de toxinas de un cultivo particular. El cultivo se procesa luego tal y como sigue.

Los cultivos se inactivan primero usando formalina (Solución de Formaldehído USP) a una concentración, temperatura y pH apropiados, durante un período de 1 a 5 días, dependiendo del cultivo en particular. Se prefiere minimizar la exposición al formaldehído. La inactivación mata a las bacterias y convierte a las toxinas en no dañinas, pero en toxoides eficazmente antigénicos. Los procedimientos para inactivar cultivos bacterianos se conocen bien, o se determinan fácilmente por uno de los expertos en la técnica.

Si se desean bacterinas, se pueden dejar enteros los cultivos inactivados o separar del medio las bacterias muertas, por ejemplo, por centrifugación y/o filtración. Las células se pueden purificar aún más usando medios convencionales, como por ejemplo por centrifugación adicional y/o diálisis. Si los toxoides son para ser usados en las composiciones de vacuna, los cultivos inactivados se pueden concentrar y los toxoides purificar parcialmente por eliminación de sales del filtrado, usando por ejemplo, sulfato de amonio, o por filtración molecular, con o sin diafiltración. Los toxoides se pueden purificar adicionalmente por diálisis o centrifugación para eliminar sales. Cualquier agente inactivante residual se puede neutralizar parcial o completamente usando un neutralizador, como por ejemplo, una solución de bisulfito de sodio, añadida entre aproximadamente un 0,1 a un 0,25% volumen/volumen. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU n^{os} 3.579.633; 4.264.588; y 4.292.307; así como Lozano, E.A. (1981) Am. J. Vet. Res. 42: 1641-1644, para procedimientos para producir toxoides clostridiales.

Las bacterinas y toxoides descritos anteriormente se administran en composiciones de vacuna incluyendo un adyuvante soluble fácilmente dispersable (es decir, de no depósito) que evita la irritación crónica en el sitio de inyección.

Las saponinas son adyuvantes de no depósito dispersables para uso con las presentes composiciones de vacuna. Las saponinas se pueden obtener comercialmente en, por ejemplo, Berghausen Corporation, (Cincinatti, OH); Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Aldrich (Milwaukee, WI), Alfa (Ward Hill, MA). De forma alternativa, las saponinas se pueden extraer a partir de cualquiera de las muchas especies de plantas, como por ejemplo a partir de Gypsophilia sp., Saponaria sp., Quillaja saponaria, Quillaja molina, las galénicas como por ejemplo Akebia quinata, Fatsia japonica, Caulophyllum robustum, Hedera rhombea, Clematis chinensis, Pulsatilla cernua, Sapindus mukurossi, Panax japonicum, Glycyrrhiza glabra, Glycyrrhiza uralensis, Polygala senega, Platycodon grandiflorum, Polygala tenuifolia, Achyranthes fauriei, Achyranthes bidentata, Cyclamen europaeum, Primula officinalis, Bupleurum falcatum, Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium, entre otras. En la técnica se conocen procedimientos para extraer saponinas a partir de estas fuentes. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU n^{os} 5.057.540 y 4.501.734, así como la publicación internacional nº WO88/09336.

Las composiciones de vacuna se formulan generalmente con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, son vehículos adecuados el agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener menores cantidades de sustancias auxiliares, como por ejemplo agentes humectantes o emulsionantes y agentes tamponadores de pH. Aunque los agentes inactivantes usados para producir los toxoides sirven también como conservantes, también se pueden añadir conservantes adicionales a las formulaciones de vacuna. Tales conservantes son conocidos en la técnica e incluyen timerosal, fenol y compuestos fenólicos, así como antibióticos. Se conocen vehículos adecuados para vacuna y aditivos, o serán evidentes, para los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18ª edición, 1990. Las composiciones particularmente preferidas se componen de una suspensión acuosa o una solución que contiene los componentes costridiales, preferiblemente tamponada a un pH de aproximadamente 7.

Por ejemplo, se preparan formulaciones de vacuna inyectables combinando una cantidad efectiva de dos o más bacterinas y/o toxoides preparados tal y como se ha descrito anteriormente, en proporciones determinadas por su contenido antigénico ensayado, determinando fácilmente un experto en la técnica la cantidad exacta. Para los propósitos de la presente invención, una "cantidad efectiva" de un componente clostridial será aquella cantidad requerida para generar una cantidad de anticuerpo circulante, suficiente para prevenir o reducir síntomas de enfermedad clostridial. Tales cantidades se pueden expresar usando cualquiera de las varias unidades. Por ejemplo, las cantidades efectivas de bacterinas clostridiales se expresan generalmente en términos de unidades de opacidad o absorbancia (U.O. o U.A., respectivamente). Estas unidades se basan en la densidad óptica (D.O.) del cultivo, medida a una longitud de onda adecuada, como por ejemplo a 625 nm. El valor de D.O. se multiplica luego por el volumen del cultivo en una dosis de vacuna. Por ejemplo, 0,5 ml de cultivo que tiene una D.O. de seis proporcionarían una dosis de antígeno de tres U.O. Se pueden medir cantidades efectivas de toxoides en términos de L+. Una unidad L+ de toxoide es equivalente a una unidad de antitoxina estándar, tal y como se determina por valoración de toxina-antitoxina en ratones. (B.C. Jansen en Developments in Biological Standardization, Vol. 32, P. 91, S. Karger, Basel (1976). También se pueden medir cantidades efectivas en ratones en base a la dosis letal mínima (MLD), la dosis que es letal al menos para un 80% de los ratones sometidos a ensayo. También se pueden expresar cantidades efectivas con respecto a las unidades de potencia de combinación total (TCP), que se determinan usando ensayos de inmunoabsorbente para medir la capacidad del toxoide en un cultivo para proteger y neutralizar los sitios de combinación en una molécula de antitoxina de un antisuero estandarizado.

Las cantidades efectivas de componentes clostridiales típicos son tal y como sigue:

C. chauvoei - aproximadamente de 1,5 a 4 U.O., preferiblemente aproximadamente de 2 a 2,5 U.O. y óptimamente aproximadamente 2,28 U.O.;

C. septicum - aproximadamente de 500 a 2000 MLD, preferiblemente aproximadamente de 800 a 1200 MLD, y óptimamente aproximadamente 900 MLD antes de la inactivación;

C. novyi - aproximadamente de 5000 a 3000 MLD, preferiblemente aproximadamente de 10000 a 20000 MLD, y óptimamente aproximadamente 15000 MLD antes de la inactivación;

C. sordellii - aproximadamente de 25 a 100 L+, preferiblemente aproximadamente de 80 a 120 L+ y óptimamente aproximadamente 50 L+ antes de la inactivación;

C. perfringens de Tipo C - aproximadamente de 200 a 500 L+, preferiblemente aproximadamente de 300 a 400 L+ y óptimamente aproximadamente 375 L+ antes de la inactivación;

C. perfringens de Tipo D - aproximadamente de 50 a 200 L+, preferiblemente aproximadamente de 80 a 120 L+ y óptimamente aproximadamente 100 L+ antes de la inactivación; y opcionalmente

C. haemolyticum - aproximadamente de 150 a 500 L+, preferiblemente aproximadamente de 250 a 300 L+ y óptimamente aproximadamente 270 L+ antes de la inactivación. También se pueden añadir células completas de C. haemolyticum en una cantidad de aproximadamente 2 a 8 U.O., más preferiblemente aproximadamente de 4 a 5 U.O. y óptimamente aproximadamente 4,5 U.O. Los expertos en la técnica determinarán fácilmente las cantidades efectivas adicionales de estos y otros antígenos clostridiales usando curvas dosis-respuesta patrón.

El adyuvante dispersable de no depósito se añade generalmente a una concentración final de entre aproximadamente un 0,01% peso/volumen a aproximadamente un 0,1% peso/volumen, más preferiblemente de aproximadamente un 0,03% peso/volumen a aproximadamente un 0,08% peso/volumen y óptimamente a aproximadamente un 0,05% peso/volumen. Después del montaje, se puede añadir agua estéril u otro vehículo adecuado al volumen requerido. El pH se ajusta entonces, generalmente a un valor de entre 6,5 a 7,5. El contenido de formaldehído residual se puede ensayar en términos de formalina y ajustar, si es necesario, a no más de un 0,3% (volumen/volumen), y preferiblemente, no más de un 0,2% (volumen/volumen), para evitar el efecto desestabilizante del formaldehído en los toxoides clostridiales no absorbidos durante un almacenamiento a largo plazo. De la forma más preferible, el contenido de formalina se mantiene en un 0,2% o menos, durante el almacenamiento de las composiciones de vacuna.

Para inmunizar un sujeto bovino, las composiciones de vacuna de la presente invención se administran generalmente parenteralmente, preferiblemente por inyección intramuscular o subcutánea. Otros modos de administración, sin embargo, como por ejemplo la inyección intraperitoneal y la intravenosa, se aceptan también. La cantidad que se administra depende del animal que va a ser tratado, la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado y la infección clostridial objetivo en particular. Por ejemplo, para inmunizar ganado vacuno con las composiciones de vacuna costridial descritas anteriormente, generalmente se administrarán entre 0,5 ml y 10 ml, más preferiblemente de 1 a 5 ml. Se pueden establecer fácilmente otras dosis efectivas por un experto medio en la técnica a través de pruebas rutinarias.

Al sujeto se le inmuniza por administración de la formulación de vacuna, en al menos una dosis, y preferiblemente en dos o más dosis. Sin embargo, al animal se le pueden administrar tantas dosis como se requieran para mantener un estado de inmunidad contra una infección clostridial. Por ejemplo, pueden ser deseables dosis de recuerdo dadas a intervalos regulares, por ejemplo, a los seis meses o anualmente, para mantener la inmunidad en un nivel efectivo.

Para resultados óptimos, las composiciones de vacuna anteriores se pueden administrar a los animales antes del destete, con una segunda dosis dada en la edad del destete. Los animales preñados que no han sido vacunados previamente, se les puede administrar dos dosis, una cerca del final del período de gestación. En animales previamente vacunados, se puede administrar una única dosis de recuerdo antes del libramiento.

C. Parte experimental

Posteriormente hay ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar en ningún sentido el alcance de la presente invención.

Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero se debería tener en cuenta algún error y desviación experimental.

Ejemplo 1 Preparación de una vacuna clostridial multicomponente de 8 vías que incluye un adyuvante de tipo saponina

Se formuló una vacuna clostridial de 8 vías usando C. chauvoei, C. haemolyticum, C. septicum, C. novyi, C. sordellii, C. perfringens Tipo C y C. perfringens Tipo D, tal y como sigue. (La vacuna se denomina con el término vacuna de 8 vías porque proporciona protección no solamente contra los organismos citados sino también contra C. perfringens de Tipo B).

Las especies de Clostridium anteriores se cultivaron usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los cultivos se controlaron midiendo la densidad óptica a 625 nm. Cuando la densidad óptica de los cultivos alcanzó un máximo, se añadió formalina a una concentración final de un 0,7% (volumen/volumen) a un 0,8% (volumen/volumen). Los cultivos se inactivaron entonces durante aproximadamente 1 a 3 días.

Después de la inactivación, los cultivos de C. perfringens se clarificaron asépticamente por centrifugación y se almacenaron a 4ºC. Si fue necesario, los cultivos clarificados inactivados se concentraron por ultrafiltración para reducir el volumen de cultivo requerido para un montaje en serie y para ayudar en la estandarización del producto.

Para evitar los efectos desestabilizantes que pueden causar las altas concentraciones de formalina en ausencia de geles de hidróxido de aluminio, se añadió una solución de bisulfito de sodio al 37% (peso/volumen) a todos los cultivos cuando se completó el procesamiento (es decir, después de la concentración y la clarificación), para neutralizar la formalina libre residual en exceso de un 0,2%.

Los cultivos se combinaron de tal forma que cada dosis de vacuna contenía una cantidad estándar de cada fracción de cultivo tal y como sigue: C. chauvoei- 2,28 U.O., C. septicum- 900 MLD, C. novyi - 15000 MLD, C. sordellii- 50 L+, C. perfringens de tipo C - 375 L+, C. perfringens de tipo D – 150 L+, C. haemolyticum- 270 L+ y 4,5 U.O. de células bacterianas.

El volumen requerido de cada cultivo se determinó dividiendo la cantidad de antígeno requerida por dosis, por el contenido en antígeno del cultivo usado, y luego multiplicando por el número de dosis requeridas.

Por ejemplo, el ensayo con toxina por preinactivación de un cultivo de C. novyi mostró que contenía 80000 MLD/ml. El cultivo se estandarizó a 15000 MLD/dosis. La cantidad de cultivo requerida para una serie de 300000 dosis de 1500 litros fue: (15000/80.000) x 300000= 56,25 litros.

Se llevó a cabo un montaje en serie ejemplar tal y como sigue:

Asumiendo que los componentes del cultivo finalizado estaban disponibles, los cuales tenían los siguientes valores de antígeno calculados:

i.	C. chauvoei	D.O. 12,0
ii.	C. septicum	3000 MLD/ml
iii.	C. novyi	80000 MLD/ml
iv.	C. sordellii	70 L+/ml
v.	C. perfringens de tipo C	400 L+/ml
vi	C. perfringens de tipo D	120 L+/ml
vii	C. haemolyticum	360 L+/ml y D.O. 6,0.

Se montó una serie de 1500 litros a partir de los componentes tal y como se muestra en la tabla 1.

TABLA 1

Componente	Volumen (l)
C. chauvoei	57
C. septicum	90
C. novyi	56,25
C. sordellii	214
C. perfringens de tipo C	281,25
C. perfringens de tipo D	375
C. haemolyticum	275
Volumen de cultivo total	1298,5
	7,5 l de solución estéril de saponina (10% peso/volumen)
	194 l de agua estéril
Volumen total de 1500 l

El adyuvante, la saponina, tenía una concentración final de un 0,05% (peso/volumen). Se sometió a ensayo de nuevo la concentración de formalina del producto y se ajustó de un 0,15 a un 0,2%. La formalina era el único conservante. El pH de la serie montada se ajustó a 6,8-7,0.

Ejemplo 2 Potencia de la vacuna clostridial multicomponente

Una vacuna de 8 vías preparada tal y como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se sometió a ensayos de potencia en conejos y en cobayos. Se usaron ensayos normalizados de la USDA (9 CFR 113,106-,112) para cada organismo excepto para C. septicum, para el cual no existen ensayos de la USDA. Además del ensayo estándar en el cobayo, se valoraron las respuestas de antitoxina en C. haemolyticum.

Todas las valoraciones de antitoxina se realizaron en el suero a partir de un único lote de conejos vacunados. Al menos a ocho conejos, que pesaban entre 1,5 y 3 kg, se les inyectó subcutáneamente con la mitad de la dosis para ganado vacuno, dos veces en un intervalo de 20 a 23 días. Se extrajo sangre a los conejos 14 a 17 días después de la revacunación. Se agrupó el suero de al menos siete conejos y se ensayaron las diferentes antitoxinas.

Tal y como muestra la Tabla 2, el producto cumplió o excedió todos los patrones de potencia. El componente de C. haemolyticum cumplió muy bien en el ensayo de potencia oficial en el cobayo y en el ensayo no oficial de respuesta de antitoxina en conejos.

TABLA 2 Ensayos de potencia en animales de laboratorio con vacuna clostridial de 8 vías

Estímulo							Cobayo
	Antitoxina de conejo (unidades/ml de suero)	Vivo/Total
	septicum	novyi	sordellii	Perfringens	Perfringens	haemolyticum	Chauvoei	haemolyticum
				C	D
Vacuna ex-	4	4	4	20	2	20	10/10*	9/9*
perimental
Patrones de	1**	0,5	1	10	2	10**	7/8	7/8
potencia de
la USDA
*todos sanos
**patrones de laboratorio

Ejemplo 3 Preparación de una vacuna clostridial multicomponente de 7 vías que incluye un adyuvante de tipo saponina

Se preparó una vacuna clostridial multicomponente de 7 vías tal y como se describe en el Ejemplo 1, excepto que el componente de C. haemolyticum no se incluyó en la formulación. Esta vacuna se comparó con una vacuna idéntica sin adyuvante, así como con una vacuna clostridial multicomponente disponible en el mercado, Ultrabac 7 (SmithKline Beecham), la cual incluye un 25% de gel de Al(OH)_{3} como adyuvante, en estudios de reacciones locales en ganado vacuno, respuestas de anticuerpos en ganado vacuno y respuestas de anticuerpos y protección frente a una infección provocada en cobayos.

A. Seguridad

Estudio 1

Se vacunaron subcutáneamente diez reses con 5 ml de cada una de las tres vacunas, en sitios separados, dos veces en un intervalo de 4 semanas. Las reacciones en el sitio de inyección de las reses se observaron cuatro y seis semanas después de la revacunación. Los resultados se muestran en las siguientes tablas.

TABLA 3 Reacciones en el sitio de inyección de reses a las que se les han dado inyecciones múltiples de vacuna clostridial de 7 vías con diferentes adyuvantes 4 semanas después de la revacunación

Adyuvante	Número de	Peor reacción	Reacción de	Reacción
	reaccionantes/	(cm^{3})*	alcance medio	promedio por
	total		(cm^{3})*	grupo (cm^{3})*
Gel de	9/10	32,5	10,0	9,0
Al(OH)_{3}
(Ultrabac 7)
Saponina	0/10	0,0	0,0	0,0
No adyuvante	0/10	0,0	0,0	0,0
*Volumen = (\pi/24) x profundidad (3 x diámetro^{2} + 4 x profundidad^{2}) cm^{3} (Cúpula de curvatura constante)

TABLA 4 Reacciones en el sitio de inyección de reses a las que se les han dado inyecciones múltiples de vacuna clostridial de 7 vías con diferentes adyuvantes 6 semanas después de la revacunación

Adyuvante	Número de	Peor reacción	Reacción de	Reacción
	reaccionantes/	(cm^{3})*	alcance medio	promedio por
	total		(cm^{3})*	grupo (cm^{3})*
Gel de	6/10	16,5	5,2	3,1
Al(OH)_{3}
(Ultrabac 7)
Saponina	0/10	0,0	0,0	0,0
No adyuvante	0/10	0,0	0,0	0,0
*Volumen = (\pi/24) x profundidad (3 x diámetro^{2} + 4 x profundidad^{2}) cm^{3} (Cúpula de curvatura constante)

Tal y como se muestra en las tablas 3 y 4, Ultrabac 7, la cual contiene un 25% volumen/volumen de gel de hidróxido de aluminio, cuando se inyectó subcutáneamente en las reses, indujo reacciones locales. Las reses mostraron peores reacciones con la segunda dosis, evidentemente habiendo sensibilizado los animales la primera dosis. Las tablas proporcionan los volúmenes de hinchazón que resultaron de la segunda dosis, tal y como se midió a las 4 y 6 semanas. Las reacciones resultaron crónicas en 6 de las 10 reses, siendo todavía medibles a las 6 semanas. Las otras dos vacunas con sólo saponina o sin adyuvante, indujeron hinchazones transitorias durante unos pocos días. No hubo nada detectable en los sitios de inyección con vacuna a las 4 y 6 semanas. Ninguna de las reses mostró ninguna otra señal clínica, local o sistémica.

Estudio 2

Se vacunaron cuarenta reses de vacuno (20 terneros y 20 lecheras) con una vacuna clostridial de 8 vías que contiene un adyuvante de tipo saponina, hecha como en el Ejemplo 2. Las reses se vacunaron profundamente con 5 ml en el la corva (nalga) dos veces en un intervalo de dos semanas. Se sacrificaron diez animales, cinco de cada tipo, 30 días después de la segunda dosis, y se sacrificaron otros cinco 61 días después de la segunda dosis. Se analizaron minuciosamente los sitios de inyección y se tomaron muestras para una histopatología.

Se encontró una banda estrecha de tejido cicatrizal fibroso que recorría verticalmente el músculo inyectado en cada caso. La longitud de la banda era de 5 a 10 cm. Las bandas promediaron aproximadamente 1 cm en grosor a las 4 a 6 semanas. Alrededor de las 9 a 11 semanas la mayoría del tejido cicatrizal había desaparecido y fue reemplazado por tejido normal. En esta etapa, el tejido cicatrizal estaba en forma de lazo plano, lo que era difícil de detectar y de distinguir de los tejidos fibrosos normales en los planos fasciales entre los músculos. La histopatología confirmó la naturaleza puramente fibrosa de la reacción y no mostró evidencia de formación de pus o absceso. Tal acción cicatrizante leve no es probable que se detecte o que conduzca a una pérdida de buen aspecto en el matadero.

Estudio 3

Para proporcionar evidencia de la diferencia en reactividad en la inyección subcutánea, se vacunaron reses detrás de la paletilla, sobre el costillar, dos veces en un intervalo de 21 días. La segunda dosis se dio de 15 a 20 cm detrás de la primera. Se vacunaron cinco con 5 ml de Ultrabac 8 y cinco con 5 ml de la vacuna de 8 vías que contiene saponina usada en el estudio 2. Durante la primera semana, el producto con saponina indujo hinchazones planas difusas, más pequeñas que aquellas inducidas por Ultrabac 8. A las 2 a 3 semanas, las hinchazones inducidas por el producto con saponina casi habían desaparecido completamente. Las hinchazones inducidas por Ultrabac 8 comenzaron a ser más compactas y circunscritas, teniendo la apariencia de un huevo de gallina plantado bajo la piel. Éstas mostraron una pequeña resolución a las cinco semanas y media. A ese tiempo, los sitios de la inyección del producto de saponina resultaron completamente indetectables.

Las reses usadas en este estudio eran de pura raza o cruzadas Aberdeen Angus o Herefords, aparte de un/a ternero/a considerado de ser de raza Charolais. Este/a ternero/a se vacunó con Ultrabac 8 y fue el/la único/a ternero/a en el grupo de Ultrabac 8 que dejó de reaccionar como se ha descrito.

B. Respuestas de anticuerpos

Se vacunaron subcutáneamente grupos de 8 reses con la vacuna de 7 vías que contiene saponina, o Ultrabac 7, o se dejaron sin vacunar en forma de controles negativos. Las vacunas se inyectaron con 5 ml dos veces en un intervalo de 4 semanas, y se tomaron muestras de sangre a las 2 semanas y de nuevo, 3 meses más tarde. Sus respuestas de anticuerpos se muestran en las Tablas 5 y 6. Se vacunaron de forma similar cobayos y los resultados se muestran en la Tabla 7. Como se puede ver, las respuestas de anticuerpos de los cobayos apoyan los resultados en ganado vacuno. Este estudio mostró también que la saponina era mejor que el gel de Al(OH)_{3} (Ultrabac 7) en la protección de los cobayos frente a una infección provocada virulenta en el ensayo de potencia normalizado de la USDA para C. chauvoei.

TABLA 5 Respuestas de ganado vacuno a vacunas clostridiales de 7 vías

Títulos de anticuerpos de acúmulos de suero a las dos semanas (8/grupo)

	Aglutinina*				Antitoxina ui/ml
Adyuvante
	chauvoei	septicum	novyi	sordellii	perfringens C	perfringens D
Saponina	4096	8	4	20	40	>8
Gel de Al(OH)_{3}	512	8	1	20	40	4
(Ultrabac 7)
Controles no	32	<1	<0,1	<0,1	<2,5	<0,25
vacunados
Estándar de		1**	0,5	1	10	2
actividad USDA
(conejos)
*C. chauvoei no produce toxina y no induce antitoxina.
**estándar de laboratorio

TABLA 6 Respuestas de ganado vacuno a vacunas clostridiales de 7 vías

Títulos de anticuerpos de acúmulos de suero a los tres meses (8/grupo)

	Aglutinina*				Antitoxina ui/ml
Adyuvante
	chauvoei	septicum	novyi	sordellii	perfringens C	perfringens D
Saponina	1280	1	0,5	2	<10	2
Gel de Al(OH)_{3}	160	1	0,1	<1	<5	0,5
(Ultrabac 7)
Controles no	40	<1	<0,1	<0,1	<2,5	<0,25
vacunados
Estándar de		1**	0,5	1	10	2
actividad USDA
(conejos)
*C. chauvoei no produce toxina y no induce antitoxina.
**estándar de laboratorio

TABLA 7 Respuestas de cobayos a vacunas clostridiales de 7 vías experimentales o Ultrabac 7

Antitoxina ui/ml
Adyuvante	Vivos/estímulo
	chauvoei	septicum	novyi	sordellii	perfringens C	perfringens D
Saponina	8/8, todos sanos	4	8	8	40	4
Gel de Al(OH)_{3}	8/8, 2 enfermos	2	8	8	40	2
(Ultrabac 7)
Controles sin	4/8, 1 enfermo	<1	<1	<1	<10	2
adyuvante
Estándar de	7/8 o 12/16*	1	0,5	1	10	2
actividad USDA
*Infección provocada con cobayos, primera y segunda etapa

De esta manera, se describen nuevas composiciones de vacuna clostridial multicomponente que usan adyuvantes de tipo saponina y procedimientos para la administración de los mismos.

Claims

1. Una composición de vacuna clostridial multicomponente que comprende inmunógenos de seis o más especies o serotipos de Clostridium, una saponina como único componente adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición de vacuna de la reivindicación 1, la cual comprende además un antígeno que procede de uno o más de Moraxella bovis, Haemophilus somnus o Pasteurella haemolytica y/o un antígeno que procede de uno o más virus respiratorios.

3. La composición de vacuna de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que dichas especies o serotipos se seleccionan del grupo que consta de Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium tetani, Clostridium chauvoei, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium haemolyticum y Clostridium botulinum.

4. Una composición de vacuna clostridial multicomponente que consta de inmunógenos de seis o más especies o serotipos de Clostridium, un adyuvante de tipo saponina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La composición de vacuna de la reivindicación 4, la cual consta también de un antígeno que procede de uno o más de Moraxella bovis, Haemophilus somnus o Pasteurella haemolytica y/o un antígeno que procede de uno o más virus respiratorios.

6. La composición de vacuna de la reivindicación 4 o reivindicación 5, en la que dichas especies o serotipos se seleccionan del grupo que consta de Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium tetani, Clostridium chauvoei, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium haemolyticum y Clostridium botulinum.

7. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que los inmunógenos son bacterinas o toxoides clostridiales.

8. La composición de la vacuna de la reivindicación 7, en la que los inmunógenos son bacterinas o toxoides clostridiales que proceden de cada uno de: (i) Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo D; o (ii) Clostridium haemolyticum, Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo D.

9. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 7 y 8, la cual comprende además un conservante.

10. La composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 6, 7 y 8, la cual consta también de un conservante.

11. El uso de la composición de vacuna de cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección por Clostridium en un animal bovino.