ES2199227T5 - Vacunas clostridiales multicomponente que usan adyuvantes de saponina. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN NUEVAS FORMULACIONES PARA VACUNAS CLOSTRIDIALES MULTICOMPONENTES QUE UTILIZAN COADYUDANTES DISPERSIBLES QUE NO FORMAN DEPOSITOS, TALES COMO LA SAPONINA. LAS VACUNAS PUEDEN ADMINISTRARSE AL GANADO INTRAMUSCULARMENTE O SUBCUTANEAMENTE SIN REACCIONES LOCALES, SEVERAS, PERSISTENTES, TALES COMO GRANULOMAS, ABSCESOS Y CICATRICES, QUE NORMALMENTE SE VEN CON OTRAS VACUNAS CLOSTRIDIALES MULTICOMPONENTES.
Description
Vacunas clostridiales multicomponente que usan
adyuvantes de saponina.
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La presente invención se refiere de forma
general a composiciones de vacuna y a la aplicación médica de las
mismas. Más específicamente, la invención se refiere a vacunas
clostridiales multicomponente fabricadas sin vehículos
estabilizantes o adyuvantes del almacenamiento pero con una saponina
como adyuvante soluble en agua fácilmente dispersable.
El género Clostridium se compone de
bacterias anaeróbicas con forma de varilla formadoras de esporas.
Los organismos se dan de forma natural en el suelo así como en el
tracto intestinal de animales, incluyendo el hombre. Se adquieren
cepas patogénicas por contaminación de heridas o por ingestión. Los
miembros del género son responsables de una amplia variedad de
enfermedades las cuales, en ausencia de vacunación, producen
pérdidas económicas significativas a la industria agraria. Tales
enfermedades incluyen la enfermedad de la fiebre del agua roja,
cabeza grande, pierna negra, las enterotoxemias, hepatitis necrótica
infecciosa, edema maligno, botulismo y tétanos, entre otros.
El tratamiento de infecciones clostridiales con
antibióticos es raramente predecible y a menudo ineficaz. De acuerdo
con esto, tales infecciones se controlan por lo general
profilácticamente, usando composiciones de vacuna que contienen una
o más bacterinas o toxoides clostridiales. Ver, por ejemplo, las
patentes de EE.UU n^{os} 4.292.307; 4.264.588; 3.579.633; Webster,
A.C., and Frank, C.L. (1985) Austral. Vet. J. 62:
112-114; Kerry, J.B., and Craig G.R. (1979) The
Veterinary Record 105: 551-554; Sterne
et al. (1962) The Veterinary Record 74:
909-913. Los toxoides clostridiales son proteínas
solubles de capacidad antigénica relativamente baja y,
tradicionalmente, de baja estabilidad. De esta manera, las vacunas
clostridiales requieren adyuvantes para aumentar la potencia
antigénica y mejorar la estabilidad. En particular, se usan
típicamente compuestos de aluminio, los cuales son capaces de
absorber y/o precipitar toxoides clostridiales, así como de retener
los toxoides en el sitio de inyección. Ver, por ejemplo, Thomsom,
R.O., and Knight, P.A. (1976) Develop. Biol. Standard
32: 265-269; Thomsom et al. (26 de
julio, 1969) The Veterinary Record páginas
81-85. Se han usado también en vacunas clostridiales
otros potentes adyuvantes de depósito, como por ejemplo emulsiones
de agua en aceite y carbopol. Los adyuvantes descritos
anteriormente, aunque aumentan la capacidad antigénica,
generalmente provocan reacciones locales persistentes graves, como
por ejemplo granulomas, abscesos y marcas de cicatrices, cuando se
inyectan subcutáneamente o intramuscularmente. Estas reacciones
locales son, a su vez, responsables de defectos en la res muerta, lo
que requiere un proceso de recortado caro, una consideración cuando
la vacuna se ha inyectado en el tejido muscular destinado a ser un
trozo de carne de valor.
Las saponinas son productos glicosídicos
naturales de plantas, agrupados juntos en base a varias propiedades
comunes. Las saponinas son agentes tensioactivos, una característica
ilustrada por su tendencia a formar espuma cuando se agitan. Las
saponinas son capaces de lisar células rojas sangíneas, formar
complejos con el colesterol y son tóxicas para los peces. Las
saponinas se han empleado como adyuvantes en varias composiciones de
vacuna, incluyendo vacunas contra infecciones por protozoos
(patente de EE.UU nº 4.767.622), vacunas del moquillo canino
(patente de EE.UU nº 5.178.862), vacunas contra la enfermedad de la
fiebre aftosa, entre otras. Awad et al. (1986) Assiut
Vet. Med. J. 17: 201-214 describen una
comparación de vacunas de pierna negra de un único componente
incluyendo alumbre, gel de aluminio con saponina o adyuvantes
oleosos. Sin embargo, no se ha descrito hasta ahora el uso de
adyuvantes solubles que se dispersan fácilmente a partir del sitio
de inyección y no tienen efecto de depósito, como por ejemplo una
saponina, con una vacuna clostridial multicomponente.
La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que el adyuvante soluble en agua, la saponina, se
puede usar en lugar de un adyuvante de depósito en vacunas
clostridiales multicomponente para ganado vacuno. Las composiciones
de vacuna de la invención contienen una saponina como su único
componente adyuvante; son seguras y no tóxicas.
La presente invención se refiere a una
composición de vacuna clostridial multicomponente que comprende:
- (a)
- bacterinas o toxoides clostridiales que proceden de cada uno de Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo D; y
- (b)
- una saponina como único adyuvante y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Opcionalmente, la composición de vacuna
comprende adicionalmente bacterinas o toxoides clostridiales
procedentes de Clostridium haemolyticum.
Opcionalmente, la composición de vacuna de la
invención comprende bacterinas de Clostridium chauvoli y
toxoides de Clostridium septicum, Clostridium novyi, Clostridium
sordelli, Clostridium perfringes de Tipos C y D, y opcionalmente
Clostridium haemolyticum.
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Opcionalmente, la vacuna clostridial
multicomponente comprende adicionalmente un antígeno que procede de
uno o más de Moraxella bovis, Haemophilus somnus o
Pasteurella haemolytica y/o un antígeno que procede de uno o más
virus respiratorios.
En una realización adicional más, la presente
invención se refiere al uso de las composiciones de vacuna
mencionados anteriormente en la fabricación de un medicamento para
prevenir o tratar la infección clostridial en un animal bovino.
La administración puede realizarse por vía
intramuscular o subcutánea.
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales
conocidas en la técnica de microbiología e inmunología clostridial.
Tales técnicas se explican en, por ejemplo, Sterne and Batty (1975)
Pathogenic Clostridia (Butterworths, Boston); Joint
OIE-1ABS "Symposium on Clostridial Products in
Veterinary Medicine" en Developments in Biological
Standardization, Vol. 32, S. Karger, Basel (1976).
Tal y como se ha usado en esta especificación y
en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares, "un",
"una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a
menos que el contenido dicte claramente otra cosa.
Al describir la presente invención, se emplearán
los siguientes términos, y se tiene intención de definir tal y como
se indican posteriormente.
Por "saponina" se entiende cualquiera de
los glucósidos sapogénicos que se encuentran en una amplia variedad
de plantas, así como derivados de los mismos, los cuales son capaces
de aumentar la potencia de un antígeno administrado con ésta. El
resto de sapogenina es generalmente un esteroide, un triterpenoide o
un esteroidealcaloide. El resto de azúcar puede variar ampliamente
y puede ser, por ejemplo, una glucosa, galactosa, pentosa,
metilpentosa, entre otros.
Una composición de vacuna clostridial
"multicomponente" se refiere a una vacuna que procede de
cultivos de dos o más serotipos de la misma especie de
Clostridium y/o cultivos que proceden de diferentes especies
de Clostridium.
Un "inmunógeno" se refiere a una sustancia
que, cuando se introduce en un animal, estimula una respuesta
inmunológica, tal y como se define posteriormente. Para propósitos
de la presente invención, un inmunógeno se refiere a un organismo
completo (vivo, muerto o atenuado), una preparación separada y
discreta a partir del organismo completo con el cual la preparación
se asocia en la naturaleza (por ejemplo, una preparación de toxoide
elaborada por inactivación de una toxina liberada del organismo, o
una proteína contenida en un extracto libre de células que procede
del organismo completo), o una molécula que contiene uno o más
epítopos que estimularán una respuesta inmunológica.
Una "respuesta inmunológica" a una
composición o vacuna es el desarrollo de una respuesta inmune
celular y/o por anticuerpos del huésped a la composición o vacuna
de interés, de tal forma que se prevengan o reduzcan los síntomas
de la enfermedad por Clostridium.
Por "sujeto bovino" se entiende cualquiera
de las muchas especies de vaca y buey, machos y hembras. El término
no conlleva una edad en particular. De esta forma, se pretende
cubrir tanto animales adultos como recién nacidos.
Una parte importante de la presente invención es
el sorprendente descubrimiento de que se pueden fabricar vacunas
clostridiales multicomponente estables y potentes sin el uso de
adyuvantes de depósito. En particular, la presente invención
proporciona vacunas que incluyen adyuvantes solubles de rápida
dispersión, esto es, adyuvantes que no se retienen en el sitio de
inyección durante un período de tiempo significativo, mostrando
así una baja reactividad tisular. Las vacunas se pueden administrar
intramuscularmente y subcutáneamente sin los efectos secundarios
dañinos y respuestas inflamatorias crónicas que producen granulomas
y abscesos, vistos con otras composiciones de vacuna clostridiales
cuando se administran a través de estas rutas.
Los inmunógenos pueden proceder de cualquier de
las especies de Clostridium y serotipos del mismo,
dependiendo de la enfermedad o enfermedades diana, como por
ejemplo, pero que no se limitan a C. perfringens; C. septicum;
C. tetani; C. chauvoei; C. novyi; C. sordellii; C. haemolyticum;
C. botulinum; y serotipos de estas especies.
Son de particular interés las composiciones de
vacuna multicomponente que proceden de bacterinas de C.
chauvoei y toxoides de C. haemolyticum, C. chauvoei, C.
septicum, C. novyi, C. sordellii y C. perfringens de
Tipo C y D. Tal composición de vacuna multicomponente se designa en
esta memoria descriptiva con el término de vacuna de "8 vías"
porque no sólo proporciona inmunidad contra los organismos
específicos identificados, sino también contra C.
perfringens de Tipo B. Otra vacuna particularmente preferida
contiene las mismas fracciones como anteriormente, con la excepción
de la de C. haemolyticum y , por lo tanto, se hace referencia
como una vacuna de "7 vías".
También se pueden añadir antígenos no
clostridiales a las vacunas para ofrecer protección contra un amplio
espectro de enfermedades. Por ejemplo, antígenos derivados de
Moraxella bovis, Haemophilus somnus, Pasteurella
haemolytica, varios virus respiratorios, así como otros, se
pueden añadir a las composiciones de vacuna clostridial
multicomponente de la presente invención para uso en sujetos
bovinos.
Los inmunógenos clostridiales generalmente se
proporcionan en forma de toxoides (toxinas inactivadas) y/o
bacterinas (cultivos enteros inactivados, muertos) y se pueden
preparar usando procedimientos convencionales bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, los organismos de interés se crecen en un
medio adecuado en condiciones anaerobias y en condiciones
controladas de temperatura, pH y así sucesivamente, se determinan
fácilmente por los expertos en la técnica. Las soluciones acuosas
de peptonas generalmente son medios adecuados, generalmente a
concentraciones de un 1 a un 4% (peso/volumen), los cuales se pueden
enriquecer con extractos de levadura u órganos como por ejemplo
músculo, hígado y páncreas, o con vitaminas y otros factores de
crecimiento. Un azúcar, como por ejemplo glucosa, se añade como una
fuente de carbono y energía. También se pueden añadir en bajas
concentraciones agentes reductores, como por ejemplo clorhidrato de
cisteína, por ejemplo de un 0,01 a un 0,05% (peso/volumen). Los
organismos generalmente se incuban durante 4 a 72 horas, o durante
más tiempo, dependiendo de la velocidad de crecimiento o producción
de toxinas de un cultivo particular. El cultivo se procesa luego tal
y como sigue.
Los cultivos se inactivan primero usando
formalina (Solución de Formaldehído USP) a una concentración,
temperatura y pH apropiados, durante un período de 1 a 5 días,
dependiendo del cultivo en particular. Se prefiere minimizar la
exposición al formaldehído. La inactivación mata a las bacterias y
convierte a las toxinas en no dañinas, pero en toxoides eficazmente
antigénicos. Los procedimientos para inactivar cultivos bacterianos
se conocen bien, o se determinan fácilmente por uno de los expertos
en la técnica.
Si se desean bacterinas, se pueden dejar enteros
los cultivos inactivados o separar del medio las bacterias muertas,
por ejemplo, por centrifugación y/o filtración. Las células se
pueden purificar aún más usando medios convencionales, como por
ejemplo por centrifugación adicional y/o diálisis. Si los toxoides
son para ser usados en las composiciones de vacuna, los cultivos
inactivados se pueden concentrar y los toxoides purificar
parcialmente por eliminación de sales del filtrado, usando por
ejemplo, sulfato de amonio, o por filtración molecular, con o sin
diafiltración. Los toxoides se pueden purificar adicionalmente por
diálisis o centrifugación para eliminar sales. Cualquier agente
inactivante residual se puede neutralizar parcial o completamente
usando un neutralizador, como por ejemplo, una solución de
bisulfito de sodio, añadida entre aproximadamente un 0,1 a un 0,25%
volumen/volumen. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU n^{os}
3.579.633; 4.264.588; y 4.292.307; así como Lozano, E.A. (1981)
Am. J. Vet. Res. 42: 1641-1644, para
procedimientos para producir toxoides clostridiales.
Las bacterinas y toxoides descritos
anteriormente se administran en composiciones de vacuna incluyendo
un adyuvante soluble fácilmente dispersable (es decir, de no
depósito) que evita la irritación crónica en el sitio de
inyección.
Las saponinas son adyuvantes de no depósito
dispersables para uso con las presentes composiciones de vacuna.
Las saponinas se pueden obtener comercialmente en, por ejemplo,
Berghausen Corporation, (Cincinatti, OH); Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MO), Aldrich (Milwaukee, WI), Alfa (Ward Hill, MA). De forma
alternativa, las saponinas se pueden extraer a partir de cualquiera
de las muchas especies de plantas, como por ejemplo a partir de
Gypsophilia sp., Saponaria sp., Quillaja saponaria, Quillaja
molina, las galénicas como por ejemplo Akebia quinata, Fatsia
japonica, Caulophyllum robustum, Hedera rhombea, Clematis chinensis,
Pulsatilla cernua, Sapindus mukurossi, Panax japonicum, Glycyrrhiza
glabra, Glycyrrhiza uralensis, Polygala senega, Platycodon
grandiflorum, Polygala tenuifolia, Achyranthes fauriei, Achyranthes
bidentata, Cyclamen europaeum, Primula officinalis, Bupleurum
falcatum, Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium,
entre otras. En la técnica se conocen procedimientos para extraer
saponinas a partir de estas fuentes. Ver, por ejemplo, las patentes
de EE.UU n^{os} 5.057.540 y 4.501.734, así como la publicación
internacional nº WO88/09336.
Las composiciones de vacuna se formulan
generalmente con un vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable. Por ejemplo, son vehículos adecuados el agua, solución
salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de
los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener menores
cantidades de sustancias auxiliares, como por ejemplo agentes
humectantes o emulsionantes y agentes tamponadores de pH. Aunque los
agentes inactivantes usados para producir los toxoides sirven
también como conservantes, también se pueden añadir conservantes
adicionales a las formulaciones de vacuna. Tales conservantes son
conocidos en la técnica e incluyen timerosal, fenol y compuestos
fenólicos, así como antibióticos. Se conocen vehículos adecuados
para vacuna y aditivos, o serán evidentes, para los expertos en la
técnica. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18ª
edición, 1990. Las composiciones particularmente preferidas se
componen de una suspensión acuosa o una solución que contiene los
componentes costridiales, preferiblemente tamponada a un pH de
aproximadamente 7.
Por ejemplo, se preparan formulaciones de vacuna
inyectables combinando una cantidad efectiva de dos o más
bacterinas y/o toxoides preparados tal y como se ha descrito
anteriormente, en proporciones determinadas por su contenido
antigénico ensayado, determinándo fácilmente un experto en la
técnica la cantidad exacta. Para los propósitos de la presente
invención, una "cantidad efectiva" de un componente clostridial
será aquella cantidad requerida para generar una cantidad de
anticuerpo circulante, suficiente para prevenir o reducir síntomas
de enfermedad clostridial. Tales cantidades se pueden expresar
usando cualquiera de las varias unidades. Por ejemplo, las
cantidades efectivas de bacterinas clostridiales se expresan
generalmente en términos de unidades de opacidad o absorbancia
(U.O. o U.A., respectivamente). Estas unidades se basan en la
densidad óptica (D.O.) del cultivo, medida a una longitud de onda
adecuada, como por ejemplo a 625 nm. El valor de D.O. se multiplica
luego por el volumen del cultivo en una dosis de vacuna. Por
ejemplo, 0,5 ml de cultivo que tiene una D.O. de seis
proporcionarían una dosis de antígeno de tres U.O. Se pueden medir
cantidades efectivas de toxoides en términos de L+. Una unidad L+
de toxoide es equivalente a una unidad de antitoxina estándar, tal
y como se determina por valoración de
toxina-antitoxina en ratones. (B.C. Jansen en
Developments in Biological Standardization, Vol. 32, P. 91,
S. Karger, Basel (1976). También se pueden medir cantidades
efectivas en ratones en base a la dosis letal mínima (MLD), la dosis
que es letal al menos para un 80% de los ratones sometidos a
ensayo. También se pueden expresar cantidades efectivas con respecto
a las unidades de potencia de combinación total (TCP), que se
determinan usando ensayos de inmunoabsorbente para medir la
capacidad del toxoide en un cultivo para proteger y neutralizar los
sitios de combinación en una molécula de antitoxina de un antisuero
estandarizado.
Las cantidades efectivas de componentes
clostridiales típicos son tal y como sigue:
C. chauvoei - aproximadamente de 1,5 a 4
U.O., preferiblemente aproximadamente de 2 a 2,5 U.O. y óptimamente
aproximadamente 2,28 U.O.;
C. septicum - aproximadamente de 500 a
2000 MLD, preferiblemente aproximadamente de 800 a 1200 MLD, y
óptimamente aproximadamente 900 MLD antes de la inactivación;
C. novyi - aproximadamente de 5000 a 3000
MLD, preferiblemente aproximadamente de 10000 a 20000 MLD, y
óptimamente aproximadamente 15000 MLD antes de la inactivación;
C. sordellii - aproximadamente de 25 a
100 L+, preferiblemente aproximadamente de 80 a 120 L+ y óptimamente
aproximadamente 50 L+ antes de la inactivación;
C. perfringens de Tipo C - -
aproximadamente de 200 a 500 L+, preferiblemente aproximadamente de
300 a 400 L+ y óptimamente aproximadamente 375 L+ antes de la
inactivación;
C. perfringens de Tipo D - -
aproximadamente de 50 a 200 L+, preferiblemente aproximadamente de
80 a 120 L+ y óptimamente aproximadamente 100 L+ antes de la
inactivación; y opcionalmente
C. haemolyticum - - aproximadamente
de 150 a 500 L+, preferiblemente aproximadamente de 250 a 300 L+ y
óptimamente aproximadamente 270 L+ antes de la inactivación. También
se pueden añadir células completas de C. haemolyticum en una
cantidad de aproximadamente 2 a 8 U.O., más preferiblemente
aproximadamente de 4 a 5 U.O. y óptimamente aproximadamente 4,5
U.O. Los expertos en la técnica determinarán fácilmente las
cantidades efectivas adicionales de estos y otros antígenos
clostridiales usando curvas dosis-respuesta
patrón.
El adyuvante dispersable de no depósito se añade
generalmente a una concentración final de entre aproximadamente un
0,01% peso/volumen a aproximadamente un 0,1% peso/volumen, más
preferiblemente de aproximadamente un 0,03% peso/volumen a
aproximadamente un 0,08% peso/volumen y óptimamente a
aproximadamente un 0,05% peso/volumen. Después del montaje, se
puede añadir agua estéril u otro vehículo adecuado al volumen
requerido. El pH se ajusta entonces, generalmente a un valor de
entre 6,5 a 7,5. El contenido de formaldehído residual se puede
ensayar en términos de formalina y ajustar, si es necesario, a no
más de un 0,3% (volumen/volumen), y preferiblemente, no más de un
0,2% (volumen/volumen), para evitar el efecto desestabilizante del
formaldehído en los toxoides clostridiales no adsorbidos durante un
almacenamiento a largo plazo. De la forma más preferible, el
contenido de formalina se mantiene en un 0,2% o menos, durante el
almacenamiento de las composiciones de vacuna.
Para inmunizar un sujeto bovino, las
composiciones de vacuna de la presente invención se administran
generalmente parenteralmente, preferiblemente por inyección
intramuscular o subcutánea. Otros modos de administración, sin
embargo, como por ejemplo la inyección intraperitoneal y la
intravenosa, se aceptan también. La cantidad que se administra
depende del animal que va a ser tratado, la capacidad del sistema
inmune del animal para sintetizar anticuerpos, el grado de
protección deseado y la infección clostridial objetivo en
particular. Por ejemplo, para inmunizar ganado vacuno con las
composiciones de vacuna costridial descritas anteriormente,
generalmente se administrarán entre 0,5 ml y 10 ml, más
preferiblemente de 1 a 5 ml. Se pueden establecer fácilmente otras
dosis efectivas por un experto medio en la técnica a través de
pruebas rutinarias.
Al sujeto se le inmuniza por administración de
la formulación de vacuna, en al menos una dosis, y preferiblemente
en dos o más dosis. Sin embargo, al animal se le pueden administrar
tantas dosis como se requieran para mantener un estado de inmunidad
contra una infección clostridial. Por ejemplo, pueden ser deseables
dosis de recuerdo dadas a intervalos regulares, por ejemplo, a los
seis meses o anualmente, para mantener la inmunidad en un nivel
efectivo.
Para resultados óptimos, las composiciones de
vacuna anteriores se pueden administrar a los animales antes del
destete, con una segunda dosis dada en la edad del destete. Los
animales preñados que no han sido vacunados previamente, se les
puede administrar dos dosis, una cerca del final del período de
gestación. En animales previamente vacunados, se puede administrar
una única dosis de recuerdo antes del libramiento.
Posteriormente hay ejemplos de realizaciones
específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos
se ofrecen solamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar
en ningún sentido el alcance de la presente invención.
Se han realizado esfuerzos para asegurar la
exactitud con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades,
temperaturas, etc.), pero se debería tener en cuenta algún error y
desviación experimental.
\vskip1.000000\baselineskip
Se formuló una vacuna clostridial de 8 vías
usando C. chauvoei, C. haemolyticum, C. septicum, C. novyi, C.
sordellii, C. perfringens Tipo C y C. perfringens Tipo D,
tal y como sigue. (La vacuna se denomina con el término vacuna de 8
vías porque proporciona protección no solamente contra los
organismos citados sino también contra C. perfringens de
Tipo B).
Las especies de clostridiales anteriores se
cultivaron usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los
cultivos se controlaron midiendo la densidad óptica a 625 nm.
Cuando la densidad óptica de los cultivos alcanzó un máximo, se
añadió formalina a una concentración final de un 0,7%
(volumen/volumen) a un 0,8% (volumen/volumen). Los cultivos se
inactivaron entonces durante aproximadamente 1 a 3 días.
Después de la inactivación, los cultivos de
C. perfringens se clarificaron asépticamente por
centrifugación y se almacenaron a 4ºC. Si fue necesario, los
cultivos clarificados inactivados se concentraron por
ultrafiltración para reducir el volumen de cultivo requerido para
un montaje en serie y para ayudar en la estandarización del
producto.
Para evitar los efectos desestabilizantes que
pueden causar las altas concentraciones de formalina en ausencia de
geles de hidróxido de aluminio, se añadió una solución de bisulfito
de sodio al 37% (peso/volumen) a todos los cultivos cuando se
completó el procesamiento (es decir, después de la concentración y
la clarificación), para neutralizar la formalina libre residual en
exceso de un 0,2%.
Los cultivos se combinaron de tal forma que cada
dosis de vacuna contenía una cantidad estándar de cada fracción de
cultivo tal y como sigue: C. chauvoei - 2,28 U.O., C.
septicum - 900 MLD, C. novyi - 15000 MLD, C.
sordellii - 50 L+, C. perfringens de tipo C - 375 L+,
C. perfringens de tipo D - 150 L+, C. haemolyticum -
270 L+ y 4,5 U.O. de células bacterianas.
El volumen requerido de cada cultivo se
determinó dividiendo la cantidad de antígeno requerida por dosis,
por el contenido en antígeno del cultivo usado, y luego
multiplicando por el número de dosis requeridas.
Por ejemplo, el ensayo con toxina por
preinactivación de un cultivo de C. novyi mostró que
contenía 80000 MLD/ml. El cultivo se estandarizó a 15000 MLD/dosis.
La cantidad de cultivo requerida para una serie de 300000 dosis de
1500 litros fue: (15000/80.000) x 300000 = 56,25 litros.
Se llevó a cabo un montaje en serie ejemplar tal
y como sigue:
Asumiendo que los componentes del cultivo
finalizado estaban disponibles, los cuales tenían los siguientes
valores de antígeno calculados:
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Se montó una serie de 1500 litros a partir de
los componentes tal y como se muestra en la tabla 1.
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El adyuvante, la saponina, tenía una
concentración final de un 0,05% (peso/volumen). Se sometió a ensayo
de nuevo la concentración de formalina del producto y se ajustó de
un 0,15 a un 0,2%. La formalina era el único conservante. El pH de
la serie montada se ajustó a 6,8-7,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vacuna de 8 vías preparada tal y como se
describe en el Ejemplo 1 anterior, se sometió a ensayos de potencia
en conejos y en cobayos. Se usaron ensayos normalizados de la USDA
(9 CFR 113,106-,112) para cada organismo excepto para C.
septicum, para el cual no existen ensayos de la USDA. Además del
ensayo estándar en el cobayo, se valoraron las respuestas de
antitoxina en C. haemolyticum.
Todas las valoraciones de antitoxina se
realizaron en el suero a partir de un único lote de conejos
vacunados. Al menos a ocho conejos, que pesaban entre 1,5 y 3 kg,
se les inyectó subcutáneamente con la mitad de la dosis para ganado
vacuno, dos veces en un intervalo de 20 a 23 días. Se extrajo
sangre a los conejos 14 a 17 días después de la revacunación. Se
agrupó el suero de al menos siete conejos y se ensayaron las
diferentes antitoxinas.
Tal y como muestra la Tabla 2, el producto
cumplió o excedió todos los patrones de potencia. El componente de
C. haemolyticum cumplió muy bien en el ensayo de potencia
oficial en el cobayo y en el ensayo no oficial de respuesta de
antitoxina en conejos.
Se preparó una vacuna clostridial
multicomponente de 7 vías tal y como se describe en el Ejemplo 1,
excepto que el componente de C. haemolyticum no se incluyó
en la formulación. Esta vacuna se comparó con una vacuna idéntica
sin adyuvante, así como con una vacuna clostridial multicomponente
disponible en el mercado, Ultrabac 7 (SmithKline Beecham), la cual
incluye un 25% de gel de Al(OH)_{3} como adyuvante,
en estudios de reacciones locales en ganado vacuno, respuestas de
anticuerpos en ganado vacuno y respuestas de anticuerpos y
protección frente a una infección provocada en cobayos.
Estudio 1. Se vacunaron subcutáneamente
diez reses con 5 ml de cada una de las tres vacunas, en sitios
separados, dos veces en un intervalo de 4 semanas. Las reacciones
en el sitio de inyección de las reses se observaron cuatro y seis
semanas después de la revacunación. Los resultados se muestran en
las siguientes tablas.
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Tal y como se muestra en las tablas 3 y 4,
Ultrabac 7, la cual contiene un 25% volumen/volumen de gel de
hidróxido de aluminio, cuando se inyectó subcutáneamente en las
reses, indujo reacciones locales. Las reses mostraron peores
reacciones con la segunda dosis, evidentemente habiendo
sensibilizado los animales la primera dosis. Las tablas
proporcionan los volúmenes de hinchazón que resultaron de la segunda
dosis, tal y como se midió a las 4 y 6 semanas. Las reacciones
resultaron crónicas en 6 de las 10 reses, siendo todavía medibles a
las 6 semanas. Las otras dos vacunas con sólo saponina o sin
adyuvante, indujeron hinchazones transitorias durante unos pocos
días. No hubo nada detectable en los sitios de inyección con vacuna
a las 4 y 6 semanas. Ninguna de las reses mostró ninguna otra señal
clínica, local o sistémica.
Estudio 2. Se vacunaron cuarenta reses de
vacuno (20 terneros y 20 lecheras) con una vacuna clostridial de 8
vías que contiene un adyuvante de tipo saponina, hecha como en el
Ejemplo 2. Las reses se vacunaron profundamente con 5 ml en el la
corva (nalga) dos veces en un intervalo de dos semanas. Se
sacrificaron diez animales, cinco de cada tipo, 30 días después de
la segunda dosis, y se sacrificaron otros cinco 61 días después de
la segunda dosis. Se analizaron minuciosamente los sitios de
inyección y se tomaron muestras para una histopatología.
Se encontró una banda estrecha de tejido
cicatrizal fibroso que recorría verticalmente el músculo inyectado
en cada caso. La longitud de la banda era de 5 a 10 cm. Las bandas
promediaron aproximadamente 1 cm en grosor a las 4 a 6 semanas.
Alrededor de las 9 a 11 semanas la mayoría del tejido cicatrizal
había desaparecido y fue reemplazado por tejido normal. En esta
etapa, el tejido cicatrizal estaba en forma de lazo plano, lo que
era difícil de detectar y de distinguir de los tejidos fibrosos
normales en los planos fasciales entre los músculos. La
histopatología confirmó la naturaleza puramente fibrosa de la
reacción y no mostró evidencia de formación de pus o absceso. Tal
acción cicatrizante leve no es probable que se detecte o que
conduzca a una pérdida de buen aspecto en el matadero.
Estudio 3. Para proporcionar evidencia de
la diferencia en reactividad en la inyección subcutánea, se
vacunaron reses detrás de la paletilla, sobre el costillar, dos
veces en un intervalo de 21 días. La segunda dosis se dio de 15 a
20 cm detrás de la primera. Se vacunaron cinco con 5 ml de Ultrabac
8 y cinco con 5 ml de la vacuna de 8 vías que contiene saponina
usada en el estudio 2. Durante la primera semana, el producto con
saponina indujo hinchazones planas difusas, más pequeñas que
aquellas inducidas por Ultrabac 8. A las 2 a 3 semanas, las
hinchazones inducidas por el producto con saponina casi habían
desaparecido completamente. Las hinchazones inducidas por Ultrabac
8 comenzaron a ser más compactas y circunscritas, teniendo la
apariencia de un huevo de gallina plantado bajo la piel. Éstas
mostraron una pequeña resolución a las cinco semanas y media. A ese
tiempo, los sitios de la inyección del producto de saponina
resultaron completamente indetectables.
Las reses usadas en este estudio eran de pura
raza o cruzadas Aberdeen Angus o Herefords, aparte de un/a ternero/a
considerado de ser de raza Charolais. Este/a ternero/a se vacunó
con Ultrabac 8 y fue el/la único/a ternero/a en el grupo de
Ultrabac 8 que dejó de reaccionar como se ha descrito.
Se vacunaron subcutáneamente grupos de 8 reses
con la vacuna de 7 vías que contiene saponina, o Ultrabac 7, o se
dejaron sin vacunar en forma de controles negativos. Las vacunas se
inyectaron con 5 ml dos veces en un intervalo de 4 semanas, y se
tomaron muestras de sangre a las 2 semanas y de nuevo, 3 meses más
tarde. Sus respuestas de anticuerpos se muestran en las Tablas 5 y
6. Se vacunaron de forma similar cobayos y los resultados se
muestran en la Tabla 7. Como se puede ver, las respuestas de
anticuerpos de los cobayos apoyan los resultados en ganado vacuno.
Este estudio mostró también que la saponina era mejor que el gel de
Al(OH)_{3} (Ultrabac 7) en la protección de los
cobayos frente a una infección provocada virulenta en el ensayo de
potencia normalizado de la USDA para C. chauvoei.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
De esta manera, se describen nuevas
composiciones de vacuna clostridial multicomponente que usan
adyuvantes de tipo saponina y procedimientos para la administración
de los mismos.
Claims (7)
1. Una composición de vacuna clostridial
multicomponente que comprende bacterinas o toxoides clostridiales
derivados de cada uno de Clostridium chauvoei, Clostridium
septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium
perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo
D, una saponina como único componente adyuvante y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
2. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende además bacterinas o toxoides
clostridiales derivados de Clostridium haemolyticum.
3. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dicha composición comprende bacterinas
de Clostridium chauvoei, y toxoides de Clostridium
septicum, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium
perfringens de Tipo C y Clostridium perfringens de Tipo
D.
4. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 3, que comprende además toxoides de Clostridium
haemolyticum.
5. Una composición de vacuna de acuerdo con una
de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un antígeno que
derivado de uno o más de Moraxella bovis, Haemophilus somnus
o Pasteurella haemolytica o uno o más virus
respiratorios.
6. Una composición de vacuna de acuerdon con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un
conservante.
7. Uso de una composición de vacuna de acuerdon
con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente en
la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una
infección por Clostridium en un animal bovino.
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