ES2199285T3

ES2199285T3 - Imitadores de hormonas y de factores de crecimiento.

Info

Publication number: ES2199285T3
Application number: ES96907595T
Authority: ES
Inventors: T. W. University Col. London Med. Sch Rademacher; H. N. University Col. London Med. Sch. Caro; G. A. W. University Col. London Med. Sch. Rook
Original assignee: Innopeg Ltd
Current assignee: Innopeg Ltd
Priority date: 1995-03-21
Filing date: 1996-03-20
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2016-03-20
Also published as: DK0815255T3; ATE240402T1; GB9505658D0; US6106822A; DE69628155D1; EP0815255A1; EP0815255B1; JPH11503307A; DE69628155T2; WO1996029425A1; AU713221B2; AU5116496A

Abstract

UN SEGUNDO MENSAJERO MIMETICO DE UNA HORMONA O FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DE UN MICROORGANISMO DEL GENERO MYCOBACTERIUM, CONVENIENTEMENTE M. VACCAE. EL SEGUNDO MENSAJERO MIMETICO PUEDE MIMETIZAR LA ACCION DE LA INSULINA, DE LA ACTH, DEL NGF, DEL EGF, DEL FGF, DEL TGF{BE} O DEL HGF.

Description

Miméticos fosfoglicanos de hormonas y factor de crecimiento de Myccobacterium vaccae.

La presente invención se refiere a segundos mensajeros que imitan la acción de la insulina y de otros factores de crecimiento y hormonas de mamíferos.

La diabetes melitus no dependiente de insulina es una de las alteraciones metabólicas más comunes en el mundo industrial. Asociados con la alteración están las dislipidemias, la aterosclerosis, la hipertensión, las alteraciones cardiovasculares y la disfunción renal. La obesidad constituye el mayor factor de riesgo para la enfermedad. Los dos defectos fisiológicos que conducen al desarrollo de la diabetes son la resistencia de los tejidos a los efectos de la insulina y la secreción alterada de insulina.

Para desarrollar nuevos tratamientos de esta alteración es necesario comprender lo específico de las rutas de señalización de la insulina y otras rutas de señalización que puedan interferir en la acción de la insulina. Se ha demostrado recientemente que inositolglicanos fosforilados (IPG) de bajo peso molecular, son liberados tras la estimulación de la insulina de una manera específica del tejido. Estos compuestos están en la familia de las fosfoglicoquinas (PGK), definidas como compuestos de bajo peso molecular biológicamente activos que contienen carbohidratos fosforilados. Los IPG derivados de tejidos median algunas de las acciones de la insulina. Tales miméticos de insulina tienen un potencial terapéutico ya que pueden:

(i) sustituir a la insulina ya sea en el tratamiento parenteral u oral en pacientes con diabetes donde la patología primaria hace referencia o bien a una disminución de la síntesis (diabetes de tipo I) o bien a una carencia de insulina biodisponible (defectos en la conversión de proinsulina en insulina o bien en la formación de anticuerpos anti-insulina).

(ii) ser utilizados para tratar pacientes con resistencia a la insulina en los tejidos, que se observa en muchos casos de comienzo en adultos o diabetes de tipo II.

(iii) ser utilizados para tratar o prevenir complicaciones de la diabetes incluyendo las dislipidemias, la aterosclerosis, la hipertensión, las alteraciones vasculares y la disfunción renal. Se ha descubierto adicionalmente que los IPG son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y afectar a la glucosa cerebral y al metabolismo energético. Puesto que la propia insulina tiene una capacidad limitada para atravesar la barrera hematoencefálica, la liberación de los compuestos a la circulación tras la estimulación de la insulina puede ser crucial en el control del metabolismo energético en el cerebro. En pruebas clínicas, se ha demostrado que los IPG derivados de tejidos son eficaces al revertir la pérdida de memoria asociada con la edad y al proporcionar un efecto protector en condiciones de hipoxia cerebral.

Como se detalla más abajo, también se ha demostrado que el efecto de transducción de la señal del segundo mensajero de inositolfosfoglicano es funcionalmente relevante para la señalización de otros factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento de fibroblastos (importante en la curación de heridas), el factor de crecimiento transformante \beta (importante en la autoinmunidad) y el factor de crecimiento de hepatocitos (también conocido como factor de dispersión), que junto con otros factores de crecimiento, es importante para la regeneración tejido del hígado tras la lesión por infección, abuso del alcohol, sensibilidad a los fármacos, o la autoinmunidad.

Las presente invención proporciona una fuente valiosa de fosfoglicoquinas (PGK) que imitan la actividad de los IPG derivados de tejidos, que no son fácilmente asequibles de otro modo. Sólo cantidades muy pequeñas de IPG pueden ser aisladas de tejidos de mamíferos. Puesto que los IPG no tienen una composición proteica, no pueden ser producidos mediante tecnología de recombinación de ADN. Los enfoques de la química sintética son complicados por la carencia actual de detalles estructurales de IPG derivados de tejidos y las complicaciones asociadas con la síntesis de oligosacáridos.

Inmunoterapia con M. Vaccae

Los autores de la presente invención han descrito previamente el uso de material antigénico y/o inmuno-regulador derivado de Myccobacterium vaccae en el tratamiento de la tuberculosis (ver, por ejemplo, la Patente Británica Núm. 2156673 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4724144). En la Solicitud de Patente Internacional de los autores de la presente invención Núm. PCT/GB90/01169 (publicación Núm. WO/91/01751), los autores de la presente invención han descrito el uso del mismo material para el tratamiento inmunoprofiláctico contra el SIDA, es decir, para incrementar el período entre la infección por el HIV y el desarrollo del SIDA.

Asimismo se ha demostrado que Myccobacterium vaccae tiene potencial terapéutico como tratamiento para pacientes infectados tanto por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) como por tuberculosis como describen Stanford, J.L. en AIDS (1.993) 7, pág. 1275-1277. El mecanismo del efecto inmunoterapéutico no está completamente establecido, pero puede hacer referencia a la capacidad de los compuestos dentro del organismo para evocar un patrón Th1 de respuesta de las células T a las proteínas ricas en epítopos compartidos entre especies de micobacterias como describen Boyden, S.V. en J. Immunol. (1.995), 75 pág. 15. Las homologías humanas de varias de estas proteínas están implicadas en enfermedades autoinmunes humanas tales como la artritis reumatoide y quizás también en la esquizofrenia, y M. vaccae también puede tener propiedades inmunorreguladoras relevantes en estos estados.

En Bras. J. Med. Biol. Res. 1.994, 27(2), págs. 327-341 se proporciona una revisión del papel de los IPG en la transducción de la señal por los factores de crecimiento con un énfasis especial en la insulina y los factores similares a la insulina. Los tópicos específicos de la revisión son el origen de los precursores de IPG - glicosilfosfatidinilinositolglicanos y su efecto sobre la síntesis de células diana frente al de la hormona circulante y frente al de la proteína anclada a la membrana.

Los autores de la presente invención han descubierto inesperadamente que las fosfoglicoquinas (PGK) que se purifican simultáneamente con inositolfosfoglicanos (IPG) miméticos de insulina de hígado de rata o humano pueden ser obtenidos de cultivos de Mycobacterium. vaccae. Los productos derivados de M. vaccae son capaces de imitar la acción de segundos mensajeros de IPG de mamífero de las siguientes maneras:

(i) estimulación de células 3T3 transfectadas con EGF(Rc),

(ii) estimulación de la actividad piruvato deshidrogenasa fosfatasa,

(iii) inhibición de la actividad proteína quinasa dependiente de AMPc, y

(iv) estimulación de la lipogénesis en adipocitos aislados.

También es probable que los productos derivados de M. vaccae modulen el metabolismo esteroide en las células adrenales.

Está claro que M. vaccae y las cepas afines de micobacterias son una fuente de PGK que o bien imitan la actividad, o bien tienen una estructura muy similar, al tipo de IPG del segundo mensajero de PGK presente en los tejidos de mamíferos. Previamente, tales segundos mensajeros solo podían ser aislados en cantidades extremadamente pequeñas de tejidos de mamíferos, tales como el hígado. Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que los compuestos extraídos de M. vaccae imitan la acción de los segundos mensajeros de IPG. Esto proporciona ventajas sobre el material derivado de tejido hepático, tanto en facilidad de extracción como en las cantidades de mensajero que se pueden obtener.

Por consiguiente la presente invención proporciona un segundo mensajero que imita una hormona y un segundo mensajero mimético de un factor de crecimiento que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de mycobacterium, preferiblemente Mycobacterium vaccae. El segundo mensajero mimético puede imitar la acción de numerosas hormonas y factores de crecimiento. Por ejemplo, el segundo mensajero mimético puede imitar la acción de la insulina, la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento transformante \beta (TGF\beta), y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

El segundo mensajero mimético es una fosfoglicoquina de bajo peso molecular que es o imita un inositolglicano fosforilado (IPG) de origen mamífero.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un segundo mensajero mimético de insulina que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de micobacterium, preferiblemente Mycobacterium vaccae, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes melitus de Tipo I o de Tipo II, el síndrome del ovario poliquísitico, la lipodistrofia, la pérdida de memoria relacionada con la edad, y la lesión post-isquémica resultante de un ataque o las complicaciones post-transplante.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un segundo mensajero mimético de un factor de crecimiento nervioso o de neuritas que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de mycobacterium, preferiblemente Mycobacterium vaccae, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la lesión de los nervios, la médula espinal o el sistema nervioso central resultante de un trauma, o una lesión autoinmune o metabólica, o una lesión post-isquémica resultante de un ataque o complicaciones post-transplante.

Asimismo la invención proporciona el uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de hepatocitos que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de mycobacterium, preferiblemente Mycobacterium vaccae, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la lesión hepática causada por una infección, abuso de alcohol, sensibilidad a los fármacos, o autoinmunidad.

Asimismo la invención proporciona el uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de fibroblastos y un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento epidérmico que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de mycobacterium, preferiblemente Mycobacterium vaccae, en la preparación de un medicamento para promover la curación de heridas tras cirugía o trauma o lesión tisular inducida por isquemia o autoinmunidad.

La invención también proporciona el uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de células adrenales y un segundo mensajero mimético de ACTH que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de mycobacterium, preferiblemente Mycobacterium vaccae, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de estados de enfermedad que implican atrofia adrenal tal como la tuberculosis.

Adicionalmente la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un segundo mensajero mimético de una hormona o un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento que es una fosfoglicoquina como se define aquí.

La invención también proporciona métodos para el tratamiento de

(i) diabetes melitus de tipo I o de tipo II, síndrome del ovario poliquístico, lipodistrofia, pérdida de memoria relacionada con la edad y lesión post-isquémica resultante de un ataque o de complicaciones post-transplante, que comprende administrar un segundo mensajero mimético de insulina derivado de un microorganismo del género Mycobacterium, preferiblemente M. vaccae;

(ii) lesión de los nervios, la médula espinal o el sistema nervioso central resultante de trauma, lesión autoinmune o metabólica, o lesión post-isquémica resultante de un ataque o complicaciones post-transplante que comprende administrar un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento nervioso o de neuritas derivado de un microorganismo del género Mycobacterium, preferiblemente M. vaccae;

(iii) lesión hepática causada por infección, abuso del alcohol, sensibilidad a los fármacos o autoinmunidad que comprende administrar un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de hepatocitos derivado de un microorganismo del género Mycobacterium, preferiblemente M. vaccae;

(iv) un estado de enfermedad que implica atrofia adrenal, tal como la tuberculosis, que comprende administrar un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de las células adrenales y un segundo mensajero mimético de ACTH derivado de un microorganismo del género Mycobacterium, preferiblemente M. vaccae.

La invención también proporciona adicionalmente

(v) un método para promover la curación de heridas tras cirugía o trauma o lesión tisular inducida por isquemia o autoinmunidad que comprende administrar un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de fibroblastos y un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento epidérmico derivados de un microorganismo del género Mycobacterium, preferiblemente M. vaccae.

Señalización celular

Se han descrito numerosos ejemplos de disposiciones de señalización celular en la literatura. Al menos tres clases de receptores de la superficie celular están implicados en la regulación celular. Lowe, D. G en EMBO (1.989) 8, 1377 - 1384 describen un único dominio trans-membrana y múltiples dominios membrana. Bamezai y Rock en Oncogene (1.991) 6, 1445-1451 describen dominios con anclas en la membrana de GPI.

Las tirosina quinasas receptoras (TRK), incluyendo el receptor de insulina requieren una actividad quinasa estimulada por el ligando para una respuesta biológica, según Lammers en EMBO (1.989) 8, 1369-1375. Las interacciones proteína-proteína que se producen más allá de la activación de la quinasa han sido descritas con detalle para numerosos receptores específicos de factores de crecimiento. Estos pueden clasificados en sentido amplio en rutas que dan como resultado la translocación de proteína quinasas activadas en el núcleo donde se fosforilan y activan los factores de transcripción nuclear tales como los descritos por Egan y Weinberg en Nature (1.993) 365, 781-783, o aquellas que implican la fosforilación y la activación de las subunidades de los factores de transcripción en el citoplasma que después se translocan al núcleo e inducen la transcripción como describe v.g., Muller en Nature (1.993) 366, 129-135.

i) Los segundos mensajeros de inositolfosfoglicano son liberados de la célula y son activos cuando se añaden extracelularmente

Ninguna de las rutas de señalización descritas en la actualidad puede explicar el efecto comunitario por medio del cual se requiere una densidad crítica de células antes de poder mantener una respuesta biológica. Este fenómeno biológico común sugiere la existencia de un bucle extracelular implicado en la señalización celular. Se ha informado previamente que, tras la estimulación del factor de crecimiento, se liberan al medio factores no peptídicos de bajo peso molecular. Estos factores son capaces después de imitar algunas de las acciones de ese factor de crecimiento cuando se añaden a células no estimuladas. Estos pueden ser considerados por lo tanto como "segundos mensajeros". El análisis estructural preliminar ha sugerido que estos compuestos contienen inositol, carbohidratos y grupos fosfato, y estos compuestos han sido clasificados recientemente como inositolfosfoglicanos de tipo A o P (como se define más abajo). Estos compuestos están en la familia de las fosfoglicoquinas (PGK), definidas como compuestos de bajo peso molecular biológicamente activos que contienen carbohidratos fosforilados. Rademacher y col. en Brazilian J. Med. Biol. Res. (1.994) 27, 327-341, han demostrado por ejemplo, que las formas precursoras de los IPG son glicosilfosfatidilinositoles (GPI).

ii) Integración de las rutas de señalización dependientes del factor de crecimiento y el mediador soluble

Muchas citoquinas y factores de crecimiento comparten rutas de transducción de la señal comunes. se ha propuesto que la especificidad para cada factor podía ser lograda por medio de tirosina-proteínas fosforiladas únicas desencadenadas por factores individuales. Alternativamente también se han descrito numerosas rutas de señalización accesoria que dan lugar a numerosos mediadores solubles tales como AMPc, IP3, Ca+^{2}, GMPc, diacilglicerol y cADPR. las rutas de señalización dependientes del factor de crecimiento y el mediador soluble pueden converger para estimular sinérgicamente la expresión génica (v.g. FGF y AMPc). Tan y col. en Mol. Cell Biol. (1.994) 14, 7546-7556 han sugerido recientemente que, además de IPG, cADPR también es liberado extracelularmente, todavía no se sabe cómo alcanzan sus dianas intracelulares.

iii) Los inositolfosfoglicanos están implicados en la acción de muchos factores de crecimiento y hormonas diferentes

Los segundos mensajeros de inositolfosfoglicano (IPG) son capaces de imitar la acción de un gran número de efectos biológicos dependientes de insulina tales como la esteroidogénesis placentaria, la estimulación por insulina de los adipocitos, los hepatocitos, los miocitos y los linfocitos T, y la síntesis de progesterona dependiente de insulina en células granulosas de ovario porcino.

Además, otros numerosos factores de crecimiento también parecen estimular la producción de IPG incluyendo:

factor de crecimiento transformante \beta,

factor de crecimiento nervioso,

factor de crecimiento de hepatocitos,

factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-1),

activación dependiente de IgE de mastocitos,

señalización ACTH de células adrenocorticales,

activación de plaquetas humanas,

estimulación por FSH y HCG de células granulosas,

estimulación por tirotropina de células de tiroides,

proliferación celular en oído en desarrollo temprano,

glándula mamaria de rata,

control de la proliferación de fibroblastos, y

estimulación por IL-2 de linfocitos T y B.

iv) mediadores de tipo A y P relacionados con la acción de la insulina

La familia de IPG que contienen mio-inositol (tipo A) tiene las siguientes propiedades o actividades.

1) estimulación de la lipogénesis en adipocitos,

2) inhibición de la proteína quinasa dependiente de AMPc y modificación de la actividad de la adenilato ciclasa y las AMPc-fosfodiesterasas con el fin de regular el nivel de AMPc en células, contribuyendo de ese modo al control del AMPc y los procedimientos intracelulares regulados por AMPc, y

3) soporte en el crecimiento de neuronas a partir de ganglio estatoacústico de embrión de pollo.

La familia de IPG que contienen quiro-inositol (tipo P) tiene las siguientes propiedades o actividades:

1) activación de la piruvato deshidrogenasa fosfatasa (PDH Pasa), la glicógeno sintetasa y otras enzimas, y

2) soporte en el crecimiento y diferenciación (sobrecrecimiento de neuritas) de las neuronas presentes en las neuronas de ganglio estatoacústico de pollo.

Ambos mediadores de tipo A y P también pueden soportar el crecimiento y la proliferación de células NIH 3T3 transfectadas con EGF(Rc).

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v) Papel de los mediadores en la señalización de la insulina y la diabetes de tipo II

Estos compuestos son importantes en la señalización de la insulina. Los experimentos han demostrado que la adición de anticuerpo con especificidad anti-IPG es capaz de bloquear las acciones tanto metabólicas como mitogénicas de la insulina. Además, células mutantes que no son capaces de sintetizar IPG responden a la insulina como se determina mediante la fosforilación de tirosina, pero no son estimuladas para lograr los efectos metabólicos de la hormona.

Estos compuestos también son importantes en la patogénesis de la diabetes de tipo II resistente a la insulina. Se ha reconocido que ratas diabéticas GK tienen un defecto en la síntesis o liberación de IPG funcionales y que la disminución de la tasa de secreción urinaria de quiro-inositol está asociada directamente con la resistencia a la insulina tanto en pacientes humanos con diabetes de tipo II como en monos rhesus diabéticos por naturaleza. Además, la infusión de quiro-inositol en ratas normales a las que se ha administrado una carga de glucosa o ratas tratadas con estreptozotocina produce un descenso de glucosa en plasma y un aumento de la actividad de la glicógeno sintetasa I.

El mycobacterium preferido es una cepa de M. vaccae, muy preferiblemente la indicada como R877R aislada de muestras de fango del distrito Lango de Uganda Central (J.L. Stanford y R.C. Paul, Ann. Soc. Belge Med, Trop. 1.973, 53, 141-389). La cepa es una variante general estable y pertenece a la sub-especie aurum. Puede ser identificada como perteneciente a M. vaccae por criterios bioquímicos y antigénicos (R. Bonicke, S.E. Juhasz., Zentr albl. Bakteriol. Parasitenkd. Infection skr. Hyg. Abt. 1, Orig., 1.964, 192, 133).

La cepa indicada como R877R ha sido consignada en la National Collection of Type Cultures (NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom el 13 de Febrero de 1.984 con el número NCTC 11659.

Se incluyen las siguientes Figuras.

Figura 1. Se incubaron células 3T3 transfectadas con EGF(Rc) con medio de cultivo (control), medio más FCS o medio más varias diluciones de IPG de tipo A y P de hígado. Los IPG de tipo tanto A como P son capaces de estimular la proliferación de los fibroblastos en medio sin suero. Ver las notas para la Tabla 1 más abajo para el peso húmedo de tejido al cual corresponden estas diluciones.

Figura 2. Se incubaron células 3T3 transfectadas con EGF(Rc) con medio de cultivo (control), medio más FCS o medio más varias diluciones de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae que se purificaron simultáneamente con IPG de tipo A derivados de hígado. La PGK derivada de M. vaccae (VSB-A) a una dilución de 1/160 era tan potente como una dilución 1/40 de IPG derivado de hígado de rata. Ver las notas para la Tabla 1 más abajo para el peso húmedo de tejido al cual corresponden estas diluciones.

Figura 3. Se incubaron células 3T3 transfectadas con EGF(Rc) con medio de cultivo (control), medio más FCS o medio más varias diluciones de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae que se purificaron simultáneamente con IPG de tipo A derivados de hígado. La PGK derivada de M. vaccae (VBS-A) a una dilución de 1/60 era tan potente como una dilución 1/40 de IPG derivado de hígado de rata. Ver las notas para la Tabla 1 más abajo para el peso húmedo de tejido al cual corresponden estas diluciones.

Figura 4. Se incubaron células 3T3 transfectadas con EGF(Rc) con medio de cultivo (control), medio más FCS o medio más varias diluciones de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae que se purificaron simultáneamente con IPG de tipo P derivados de hígado. La PGK derivada de M. vaccae (VBS-P) a una dilución de estimulación máxima de 1/80 no era tan potente como el FCS al 10% sólo. Ver las notas para la Tabla 1 más abajo para el peso húmedo de tejido al cual corresponden estas diluciones.

Figura 5. Se incubaron células 3T3 transfectadas con EGF(Rc) con medio de cultivo (control), medio más FCS o medio más varias diluciones de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae que se purificaron simultáneamente con IPG de tipo P derivados de hígado. La PGK derivada de M. vaccae (VSB-P) a una dilución de 1/40 no era tan potente como el FCS al 10%. Ver las notas para la Tabla 1 más abajo para el peso húmedo de tejido al cual corresponden estas diluciones.

Figura 6, A y B. Se incubaron células adrenales Y1 con medio de cultivo (RPMI sólo), medio de cultivo más FCS al 7%, o medio más varias diluciones de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae que se purificaron simultáneamente con IPG de tipo A derivados de hígado. A elevas concentraciones (1/40) ambas preparaciones (VSB-A y VBS-A) estimulaban sólo la proliferación de algunas células. A concentraciones más bajas (1/80-1/1.280) la proliferación era inhibida. Se observan patrones similares para la estimulación por ACTH de las células Y1 donde la inhibición de la proliferación está acompañada por la producción de esteroides.

Figura 7A y 7B. Se incubaron células adrenales Y1 con medio de cultivo (RPMI sólo), medio de cultivo más FCS al 7%, o medio más varias diluciones de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae que se purificaron simultáneamente con IPG de tipo P derivados de hígado. A todas las concentraciones sometidas a ensayo, ambas preparaciones (VSB-P y VBS-P) inhibían la proliferación celular resultante de la estimulación de la producción de esteroides. Las células eran viables a todas las concentraciones sometidas a ensayo.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos.

Ejemplos Crecimiento de M. vaccae

Se hizo crecer Mycobacterium vaccae NCTC11659 propagándolo sobre la superficie de medio de Sauton modificado, solidificado con agar al 1,5%. Los cultivos se mantuvieron a 32ºC durante 3 semanas.

Ejemplo 1 Aislamiento de segundos mensajeros de M. vaccae

El crecimiento bacteriano se quitó raspando la superficie del medio de Sauton modificado con una espátula, y se pesó. Las bacterias fueron suspendidas en ácido fórmico 50 mM, conteniendo EDTA 1 mM y \beta-mercaptoetanol 1 mM (3 ml de tampón por gramo de organismo). Después se adoptó cualquiera de los siguientes procedimientos:

(i) los organismos en tampón fueron desorganizados ultrasónicamente durante 30 minutos en un recipiente de vidrio enfriado con la distancia de pico a pico de onda ajustada a 8 \mu. Después el producto sometido a sonicación se hirvió durante 3 minutos y se enfrió sobre hielo. Cuando se hubo enfriado se centrifugó a 29.500 g durante 90 minutos a 4ºC.

(ii) los organismos del tampón fueron hervidos durante 3 minutos y enfriados con hielo. Cuando se hubo enfriado la suspensión se desorganizó ultrasónicamente durante 30 minutos en un contenedor de vidrio enfriado con la distancia de pico a pico de onda ajustada a 8 \mu. Después el producto sometido a sonicación se centrifugó a 29.500 g durante 90 minutos a 4ºC.

El sobrenadante claro de cualquiera de los procedimientos se recuperó después y se trató exactamente como los extractos de tejidos de rata o humano descritos más abajo.

Ejemplo 2 Aislamiento de segundos mensajeros de tejidos de mamífero y M. vaccae A. Aislamiento de IPG de tejidos de rata o humano tras la estimulación con insulina

Se mantienen en ayunas durante la noche ratas Wistar macho adultas. Las ratas se anestesian después mediante inyección de Hypnome y 20 minutos más tarde se les inyectan a través de la vena de la cola o bien 0,1 ml de solución salina o bien 0,1 ml de solución salina conteniendo 50 mU de insulina. Al cabo de 120 segundos los animales se sacrifican mediante dislocación cervical, y los tejidos se eliminan en el siguiente orden: hígado, corazón, tejido adiposo, riñón y músculo. Todos los tejidos son inmediatamente fijados mediante liofilización (nitrógeno líquido) y almacenados congelados a -80ºC. Las ratas todavía son normoglicémicas en el momento de la separación de los tejidos.

Con el fin de extraer los IPG liberados tras la estimulación con insulina, el tejido congelado es pulverizado en nitrógeno líquido y el tejido colocado directamente en ácido fórmico 50 mM hirviendo conteniendo EDTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol 1 mM (3 ml de tampón por gramo (peso húmedo) de tejido), y homogeneizado con un Ultra-Turrex durante 30 segundos y después hervido durante 5 minutos. La solución es enfriada después sobre hielo y centrifugada a 29.500 x g durante 90 minutos a 4ºC. La fracción sobrenadante es recuperada y se añaden 10 mg/ml de carbón activado durante 10 minutos con agitación a 4ºC. El carbón es separado por centrifugación a 29.500 x g durante 30 minutos a 4ºC y el sobrenadante claro recuperado. Después la solución se diluye con 10 volúmenes de agua y el pH se ajusta a 6,0 con una solución de NH_{4}OH al 10% y después se sacude suavemente durante la noche con resina AG1X8 (malla 20-50, forma formiato) (0,3 ml de resina/ml de solución). La resina se vierte después en una columna de cromatografía y se lava con 2 veces el volumen del lecho de agua seguido de 2 veces el volumen del lecho de HCl 1 mM. Después la columna se hace eluir con HCl 10 mM (5 veces el volumen del lecho) para obtener IPG de tipo P, y después HCl 50 mM (5 veces el volumen del lecho) para obtener los IPG de tipo A. Ambas fracciones se ajustan a pH 4,0 con una solución de NH_{4}OH al 10% y después se secan en un evaporador giratorio (37ºC). El material secado se disuelve de nuevo con agua y después se liofiliza y esto se repite dos veces. Normalmente se combina el material de dos ratas y se somete a cromatografía en papel descendente (butanol/etanol/agua 4:1:1, papel Whatman 3 MM) durante 9 horas y el material de las fracciones de -1 a 7 cm del origen se hace eluir del papel con agua. Tras la evaporación mediante liofilización, el material se disuelve en 200 \mul de solución de Hanks y el pH se ajusta a 7 con KOH 1 M. Para el caso del tejido adiposo, tras pulverizar y hervir, la solución se enfría sobre hielo y se añade el mismo volumen de cloroformo. La suspensión se agita después durante 10 minutos y después se centrifuga. Tras la centrifugación, la fase de cloroformo se separa y se descarta y la fase acuosa se trata como en el caso de los otros tejidos.

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B. Aislamiento de segundos mensajeros de M. vaccae

Se trató con calor M. vaccae y después se sometió a sonicación o vice versa. El extracto se colocó directamente en ácido fórmico 500 mM hirviendo conteniendo EDTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol 1 mM (3 ml de tampón por gramo (peso húmedo) de tejido), y se homogeneizó con un Ultra-Turrex durante 30 segundos y después se hirvió durante 5 minutos. La solución se enfrió después sobre hielo y se centrifugó a 29.500 x g durante 90 minutos a 4ºC. La fracción sobrenadante se recuperó y se añadieron 10 mg/ml de carbón activado durante 10 minutos con agitación a 4ºC. El carbón se separó por centrifugación a 29.500 x g durante 30 minutos a 4ºC y el sobrenadante claro se recuperó. Después la solución se diluyó con 10 volúmenes de agua y el pH se ajustó a 6,0 con una solución de NH_{4}OH al 10% y después se sacudió suavemente durante la noche con resina AG1X8 (forma formiato) (0,3 ml de resina/ml de solución). La resina se vertió después en una columna de cromatografía y se lavó con 2 veces el volumen del lecho de agua seguido de 2 veces el volumen del lecho de HCl 1 mM. Después la columna se hizo eluir con HCl 10 mM (5 veces el volumen del lecho) para obtener PGK eluyendo en las mismas condiciones que los IPG de tipo P de mamífero y después HCl 50 mM (5 veces el volumen del lecho) para obtener PGK eluyendo en las mismas condiciones que los IPG de tipo A de mamífero. Ambas fracciones se ajustaron a pH 4,0 con una solución de NH_{4}OH al 10% y después se secaron en un evaporador giratorio (37ºC). El material secado se disolvió de nuevo con agua y después se liofilizó, esto se repitió dos veces. Los extractos fueron sometidos después a cromatografía en papel descendente (butanol/etanol/agua 4:1:1, Whatman 3 MM) durante 9 horas y el material de las fracciones a -1 a 7 cm del origen se hizo eluir del papel con agua. Tras la evaporación mediante liofilización, el material se disolvió en 200 \mul de solución de Hanks y el pH se ajustó a 7 con KOH 1 M.

Ejemplo 3 Efectos in vitro de segundos mensajeros derivados de M. vaccae sobre las actividades fosfatasa y quinasa y la lipogénesis y comparación con IPG derivados de hígado (a) análisis de la piruvato deshidrogenasa fosfatasa

La activación se sigue espectrofotométricamente como describen Lilley y col. en Arch. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1.992) 166, 765-771.

(b) análisis de la proteína quinasa dependiente de AMPc

La inhibición de la AMPc-PK se mide siguiendo la fosforilación de la histona II por el ATP-P^{32}.

(c) análisis de la lipogénesis

La activación de la lipogénesis se controla midiendo la incorporación de glucosa uniformemente marcada a lípidos de adipocitos aislados como describe Rodbell en J. Biol. Chem. (1.964) 239, 375-380.

Resultados

En la tabla I se resume la acción de los segundos mensajeros IPG derivados de M. vaccae y se compara el patrón cualitativo y cuantitativo de las actividades con el de los IPG derivados de hígado de rata. Para los experimentos se utilizaron dos preparaciones de PGK derivada de M. vaccae, y se obtuvieron resultados similares para ambas preparaciones. En la tabla 1 se demuestra claramente que los segundos mensajeros PGK derivados de M. vaccae que se purifican simultáneamente con los IPG de tipo P derivados de hígado son capaces de inhibir la proteína quinasa dependiente de AMPc, estimular la piruvato deshidrogenasa fosfatasa y estimular la proliferación de células 3T3 transfectadas con EGF(Rc). De un modo similar, los segundos mensajeros PGK derivados de M. vaccae que se purifican simultáneamente con los IPG de tipo A derivados de hígado son capaces de inhibir la proteína quinasa dependiente de AMPc, estimular la lipogénesis de adipocitos de rata y estimular la proliferación de células 3T3 EGF(Rc).

Ejemplo 4 Estimulación de células 3T3 transfectadas con el receptor EGF por segundos mensajeros derivados de M. vaccae en medio libre de suero y comparación con IPG derivados de hígado

Se hicieron crecer células de partida en matraces con DMEM conteniendo FCS al 10% más 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y glutamina 2 mM hasta que las células se aproximaran a una confluencia del 80-90%. Las células son liberadas de la placa utilizando tripsina (0,25%) y se añaden 10^{4} células a cada pocillo de placas de microtitulación de 96 pocillos en 100 \mul de medio. Se deja que las células se adhieran durante 24 horas en medio completo. Después se separa el medio y las células se lavan dos veces con 100 \mul de solución de Hanks. Las células son incubadas después en DMEM sin FCS durante 24 horas. Al cabo de 24 horas el medio se separa y se añade DMEM no conteniendo FCS, más FCS, o PGK sola. Al cabo de 18 horas, se añade timidina-H^{3} por pocillo y la incubación continúa durante 4-6 horas. Después se separa el medio, las células se lavan y se cosechan tras el tratamiento con tripsina. La incorporación de timidina-H^{3} radiactiva al ADN se determina transfiriendo suspensiones de células a discos de filtro Whatman GF/C utilizando una cosechadora celular. La radiactividad se mide mediante recuento de centelleo.

Resultados

En la Figura 1 se muestra la respuesta de fibroblastos 3T3 transfectados con EGF(Rc) a los IPG de tipo A y P derivados de hígado de rata. Ambos mediadores a la concentración máxima son más potentes que el FCS al 10% al estimular la proliferación celular. En las Figuras 2 y 3 se muestra el efecto de los segundos mensajeros PGK derivados de M. vaccae que se purifican simultáneamente con IPG de tipo A de hígado sobre la proliferación celular. El IPG de tipo A de hígado mostraba una estimulación mayor que la del FCS solo. Dos preparaciones separadas de PGK derivada de M. vaccae daban resultados similares. En las Figuras 4 y 5 se muestra el efecto de los segundos mensajeros derivados de M. vaccae que se purifican simultáneamente con IPG de tipo P de hígado sobre la proliferación celular. Si bien ambas preparaciones de M. vaccae son capaces de estimular la proliferación celular no son tan eficaces como el FCS solo. Estos resultados sugieren que M. vaccae libera predominantemente PGK que imita a los segundos mensajeros de tipo A, y libera cantidades más pequeñas de PGK que imita a los segundos mensajeros de tipo P. Este patrón se encuentra para la liberación de IPG en tejido adiposo y cardíaco tras la estimulación con insulina (datos no mostrados), en contraste con riñón e hígado que liberan cantidades iguales de mediadores de tipo A y P.

Ejemplo 5 Efecto de los segundos mensajeros derivados de M. vaccae sobre la proliferación de células adrenales Y1 en medio sin suero

La línea celular Y1 deriva de un carcinoma adrenal murino y expresa muchas de las enzimas implicadas en la biosíntesis de esteroides, así como receptores de adrenocorticotropina (ACTH) funcionales. Existe la evidencia de que las células adrenales contienen inositolfosfoglicanos y de que la ACTH estimula la rotura. Esta se encuentra seguida de la síntesis de fosfatidil-inositolglicanos en estas células. De este modo es probable que los inositolfosfoglicanos puedan actuar como segundos mensajeros para este receptor. La línea es mantenida en medio para el cultivo de tejidos RPMI 1640, suplementado con glutamina (2 mM) y suero de ternera fetal al 7%. Las células se adhieren al plástico, y antes de que el crecimiento llegue a la confluencia (2-4 días) las células son cosechadas utilizando EDTA al 0,02% p/v y tripsina (0,025%) en solución salina tamponada con fosfato, lavadas, resuspendidas en medio para el cultivo de tejidos completo y divididas en 2 o 3 matraces para el cultivo de tejidos. Para el análisis de los extractos de PGK de micobacterias (sea del tipo que eluye en las mismas condiciones que los IPG de mamífero de tipo A o de tipo P), las células son cosechadas como se ha descrito antes y después son cultivadas en placa en los pocillos de placas de cultivo de tejidos de microtitulación de 96 pocillos, 10^{4} células en 100 \mul de RPMI 1640 más glutamina y FCS. Tras incubar durante 24 horas para permitir el anclaje de las células a la placa, los pocillos se lavan cuidadosamente con RPMI 1640 no suplementado más glutamina solamente. El medio se retira y se repone con:

(i): RPMI 1640 con glutamina pero sin suero ni sustituto de suero (control negativo)

(ii): RPMI 1640 con glutamina y FCS al 7% (control positivo)

(iii): RPMI 1640 con glutamina y diluciones finales de segundos mensajeros de PGK derivados de M. vaccae (por ejemplo una dilución de 1/40 a 1/320 de solución de partida).

Tras la incubación durante 18-24 horas más, se añaden 0,2 \muCi de timidina-H^{3} a cada pocillo en RPMI 1640 no suplementado. La incubación continúa durante 8-16 horas y después el medio se retira, las células se liberan del plástico con EDTA/tripsina como se ha descrito antes, y se cosechan para la determinación de la incorporación de la timidina-H^{3} al ADN mediante recuento de centelleo en líquido, según los protocolos normalizados.

Resultados

Las células Y1 proliferan a una velocidad lenta en medio libre de suero. Esta es intensificada por la adición de FCS al 7% como se muestra en la Figura 7.

La adición de PGK de tipo P de micobacterias ocasiona un descenso progresivo de la proliferación de células Y1 en ausencia de suero (Figura 7). Este resultado es el contrario del observado con células NIH-3T3 transfectadas con el receptor EGF (ver Figuras 4 y 5).

La adición de PGK de tipo A de micobacterias a células Y1 en RPMI 1640 sin suero también ocasiona la inhibición de la proliferación como se muestra en la Figura 6, pero este efecto es máximo a una dilución intermedia, con menos inhibición cuando la PGK está muy concentrada o muy diluida. Esta curva dosis/respuesta es de nuevo inversa a la observada cuando la misma preparación de PGK es sometida a ensayo sobre células NIH-3T3 transfectadas (ver las Figuras 2 y 3).

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Los resultados se resumen en la siguiente Tabla.

TABLA 1

Fuente del segundo	PKA (% de	PDH (% de	Lipogénesis (% de	EGF(Rc)3T3
mensajero	inhibición)	estimulación)	estimulación)	(crecimiento)
VB-P	53%	120%	- -*	n.d.
VBS-P	n.d.	23%	- -*	+
VSB-P	n.d.	42%	- -*	+
VB-A	43%	12% (n.s.)	22%	n.d.
VBS-A	n.d.	- -*	95%	+++
VSB-A	n.d.	- -*	100%	+++
L-A	85%	- -*	100%	+++
L-P	76%	38%	- -*	+++
FCS al 10%	n.d.	n.d.	n.d.	+++
Insulina	n.d.	n.d.	273%	+
EGF	n.d.	n.d.	n.d.	+

VBS-P:: PGK derivada de M. vaccae, organismo hervido después sometido a sonicación (imita la acción del segundo mensajero de tipo P de mamífero).

VSB-P:: PGK derivada de M. vaccae, organismo sometido a sonicación después hervido (imita la acción del segundo mensajero de tipo P de mamífero).

VBS-A:: PGK derivada de M. vaccae, organismo hervido después sometido a sonicación (imita la acción del segundo mensajero de tipo A de mamífero).

VSB-A:: PGK derivada de M. vaccae, organismo sometido a sonicación después hervido (imita la acción del segundo mensajero de tipo A de mamífero).

VB-P:: PGK derivada de M. vaccae, organismo hervido (imita la acción del segundo mensajero de tipo P de mamífero).

VB-A:: PGK derivada de M. vaccae, organismo hervido imita la acción del segundo mensajero de tipo A de mamífero).

L-A:: IPG de tipo A de hígado.

L-P:: IPG de tipo P de hígado.

Notas

* el tipo A no es activo en el análisis PDH; el tipo P no es activo en el análisis de la lipogénesis.

n.d. No determinado.

+++: Datos proliferativos referidos en las Figuras 1 a 5. Todos los datos fueron obtenidos en ausencia de FCS al 10% a menos que se indique de otro modo.

n.s. No significativo.

Para el tejido de hígado de rata, el material extraído de los 16 g (peso húmedo) se disuelve en 0,2 ml de tampón de Hanks (de partida). Por lo tanto, 10 \mul de sustancia de partida representan la cantidad de mediador recuperado de 800 mg de tejido de partida (peso húmedo).

Para el análisis de la lipogénesis, se añaden 10 \mul de la solución de partida a un volumen final de 1,25 ml.

Para el análisis de PDH, se añaden 10 \mul de la solución de partida a un volumen final de 0,27 ml.

Para el análisis de PKA, se añaden 10 \mul de la solución de partida a un volumen final de 0,1 ml.

Para los análisis de proliferación celular, las diluciones citadas son las diluciones finales. Por ejemplo, 2,5 \mul de la solución de partida se añaden a un volumen final de 0,1 ml, o 1/40 de la dilución final.

Para M. vaccae, 10 \mul de solución de partida representan la cantidad de mediador recuperado de 800 mg de peso húmedo de bacterias. Las cantidades utilizadas en los análisis son las descritas antes para los tejidos de hígado de rata.

Claims

1. Un segundo mensajero mimético de una hormona o un segundo mensajero mimético de un factor de crecimiento que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de un microorganismo del género Mycobacterium.

2. Un segundo mensajero mimético según la reivindicación 1, que imita la acción de la insulina, la hormona adrenocorticotropa (ACTH), el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento transformante \beta (TGF\beta) o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF).

3. Un segundo mensajero mimético según las reivindicaciones 1 ó 2, donde el mycobacterium es Mycobacterium vaccae.

4. El uso de un segundo mensajero mimético de la insulina que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de un microorganismo del género Mycobacterium, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes melitus de tipo I o de tipo II, el síndrome del ovario poliquístico, la lipodistrofia, la pérdida de memoria relacionada con la edad y la lesión post-isquémica resultante de un ataque o de complicaciones post-transplante.

5. El uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento nervioso o de las neuritas que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de un microorganismo del género Mycobacterium, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de los nervios, la lesión de la médula espinal o del sistema nervioso central resultante de trauma, lesión autoinmune o metabólica, lesión post-isquémica resultante de un ataque o de complicaciones post-transplante.

6. El uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de hepatocitos que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de un microorganismo del género Mycobacterium, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la lesión hepática causada por infección, abuso del alcohol, sensibilidad a los fármacos o autoinmunidad.

7. El uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento de fibroblastos que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de un microorganismo del género Mycobacterium, en la preparación de un medicamento para promover la curación de heridas tras cirugía o trauma o lesión de los tejidos inducida por isquemia o autoinmunidad.

8. El uso de un segundo mensajero mimético del factor de crecimiento adrenal y un segundo mensajero mimético de ACTH que comprende al menos una fosfoglicoquina derivada de un microorganismo del género Mycobacterium, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un estado de enfermedad que implica atrofia adrenal, tal como la tuberculosis.

9. Una composición farmacéutica que comprende una fosfoglicoquina segundo mensajero mimético de una hormona o segundo mensajero mimético de un factor de crecimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.