ES2199330T3 - Metodo para producir ester nucleosido-5'-fosfato. - Google Patents

Metodo para producir ester nucleosido-5'-fosfato.

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Takashi C/O Ajinomoto Co. Inc. Utagawa
Hideaki Yamada
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Abstract

UN METODO PARA LA PRODUCCION DE ESTER NUCLEOSIDO 5 FOSFATO IMPLICA LA FOSFORILACION BIOQUIMICA DEL NUCLEOSIDO. EL ESTER NUCLEOSIDO 5 FOSFATO SE PRODUCE PERMITIENDO QUE UNA FOSFATASA ACIDA, ESPECIALMENTE UNA FOSFATASA ACIDA QUE TIENE UNA AFINIDAD AUMENTADA PARA UN NUCLEOSIDO Y/O UNA ESTABILIDAD TERMICA AUMENTADA, ACTUE A PH ENTRE 3,0 Y 5,5 SOBRE UN NUCLEOSIDO Y UN DONANTE DE GRUPOS FOSFATOS. EL DONANTE DE GRUPOS FOSFATO PUEDE SELECCIONARSE ENTRE EL ACIDO POLIFOSFORICO O UNA SAL DE EL, EL ACIDO FENILFOSFORICO O UNA SAL DE EL Y EL CARBAMIL FOSFATO O UNA SAL DE EL. EL ESTER NUCLEOSIDO 5 FOSFATO RESULTANTE PUEDE RECOGERSE A CONTINUACION. PARA CATALIZAR LA REACCION PUEDE EMPLEARSE UN MICROORGANISMO TRANSFORMADO CON UN GEN QUE CODIFIQUE UNA PROTEINA QUE TENGA ACTIVIDAD FOSFATASA ACIDA, COMO ALTERNATIVA AL USO DE FOSFATASA ACIDA AISLADA.

Description

Método para producir éster nucleósido-5'-fosfato.
La presente invención se refiere a un método para producir éster nucleósido-5'-fosfato. La presente invención también se refiere a una fosfatasa ácida nueva, un gen que codifica la fosfatasa ácida, un DNA recombinante que contiene el gen, y un microorganismo que hospeda el DNA recombinante que son útiles para producir el éster nucleósido-5'-fosfato. El éster nucleósido-5'-fosfato es útil como ingrediente, producto farmacéutico o materia prima para producir dichas sustancias.
Se conocen métodos de fosforilación bioquímica de un nucleósido para producir éster nucleósido-5'-fosfato utilizando los siguientes donantes de grupos fosfato, incluyendo un método que utiliza ácido p-nitrofenilfosfórico (Publicación de Patente Japonesa Nº 39-29.858), un método que utiliza ácido fosfórico inorgánico (Publicación de Patente Japonesa Nº 42-1.186), un método que utiliza ácido polifosfórico (Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 53-56.390), un método que utiliza ácido acetilfosfórico (Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 56-82.098) y un método que utiliza adenosín trifosfato (ATP) (Patente Japonesa abierta a inspección pública Nº 63-230.094). Sin embargo estos métodos no han sido satisfactorios para producir éster nucleósido-5'-fosfato eficazmente y de forma económica porque los sustratos que deben utilizarse son caros o porque se producen productos secundarios en la reacción.
Por lo tanto, los inventores han desarrollado un método para producir eficazmente éster nucleósido-5'-fosfato sin producir como subproductos los isómeros 2'- y 3'-nucleótido, permitiendo que las células de un microorganismo específico actúen en condiciones acídicas sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales (Patente japonesa abierta a inspección pública Nº 7-231.793).
Sin embargo, incluso este método ha tenido los siguientes inconvenientes. Principalmente, por ejemplo, una parte del sustrato se degrada durante la reacción debido a la actividad degradante del nucleósido que desafortunadamente existe en pequeña cantidad en la células del microorganismo que se debe utilizar. Además, si la reacción continúa, el éster nucleósido-5'-fosfato producido y acumulado se degrada. Por lo tanto, se producen productos secundarios en la disolución de reacción, y ha sido imposible obtener un rendimiento suficiente. Además, la reacción no se puede realizar si el sustrato se añade en una concentración elevada debido a la pequeña actividad de transfosforilación por célula microbiana.
En una forma de realización, la presente invención proporciona adecuadamente un método para producir de forma económica y eficaz éster nucleósido-5'-fosfato. Según otras formas de realización de la presente invención se proporcionan una enzima, un gen que codifica la enzima, un DNA recombinante que contiene el gen y un microorganismo que hospeda el DNA recombinante, que son útiles para el método para producir éster nucleósido-5'-fosfato.
Como resultado de varias investigaciones realizadas por los inventores con el fin de desarrollar un método para producir éster nucleósido-5'-fosfato que sea más eficaz que los métodos convencionales, se ha encontrado que el éster nucleósido-5'-fosfato puede producirse eficazmente con un alto rendimiento haciendo que una fosfatasa ácida purificada a partir de un extracto libre de células de un microorganismo actúe en condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales. Además, los inventores han logrado obtener genes de tipo salvaje que codifican las fosfatasas ácidas de varias bacterias y genes que codifican las fosfatasas ácidas que tienen una afinidad por el nucleósido aumentada en comparación con la fosfatasa ácida de tipo salvaje, introduciendo una mutación en una fosfatasa ácida derivada de una bacteria que pertenece al género esterichia. Además, los inventores han encontrado que la productividad del éster nucleósido-5'-fosfato puede mejorarse de forma notable expresando el gen en una gran cantidad según técnicas de ingeniería.
Además los inventores han intentado preparar una fosfatasa ácida mutante con estabilidad térmica aumentada, con el propósito de realizar una reacción de transferencia de fosfato utilizando la fosfatasa ácida a una temperatura más elevada para obtener una producción mucho más eficaz de nucleósido-5'-fosfato, debido a que la velocidad de reacción se aumenta y la concentración del receptor de fosfato en la disolución de reacción puede ser superior. Luego los inventores han logrado la preparación de una fosfatasa ácida mutante que tiene estabilidad térmica aumentada con respecto a las fosfatasas ácidas mutantes descritas en el ejemplo 19 y puede emplearse en una reacción a una temperatura superior, y se ha completado la invención.
A saber, la presente invención proporciona un método para producir éster nucleósido-5'-fosfato que comprende las etapas de permitir que una fosfatasa ácida tenga afinidad por un nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada para actuar en condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato, preferiblemente elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales, ácido acetilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales, para producir éster nucleósido-5'-fosfato, y recogerlo.
La expresión ``fosfatasa ácida que tiene afinidad por el nucleósido aumentada'' incluye aquellas fosfatasas ácidas cuya afinidad por el nucleósido es superior en comparación con la fosfatasa ácida del tipo salvaje. Las fosfatasas ácidas preferidas tienen una constante de Michaelis, Km, para la transfosforilación del nucleósido, que está por debajo de 100 mM.
La expresión ``fosfatasa ácida que tiene estabilidad térmica aumentada'' incluye aquellas fosfatasas ácidas que conservan más actividad residual después del tratamiento a temperatura elevada que la correspondiente fosfatasa ácida del tipo salvaje.
Preferiblemente, la fosfatasa ácida conserva más actividad que la de tipo salvaje después de mantenerse a 50ºC durante 30 minutos a pH 7,0. De forma particular, preferiblemente la fosfatasa ácida no presenta esencialmente disminución de la actividad después de un tratamiento durante 30 minutos a 50ºC y pH 7.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir éster nucleósido-5'-fosfato que comprende las etapas de permitir que un microorganismo actúe en unas condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato para producir éster nucleósido-5'-fosfato y recogerlo, en el que el microorganismo se transforma con un DNA recombinante que comprende un gen que codifica una fosfatasa ácida que tiene afinidad por el nucleósido mejorada y/o estabilidad térmica aumentada.
En otro aspecto, la presente invención proporciona fosfatasas ácidas mutantes que tienen afinidad por un nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada, genes que codifican las fosfatasas ácidas, DNA recombinantes que contienen los genes y microorganismos que hospedan el DNA recombinante.
A continuación se describen formas de realización de la invención, a modo de ejemplo únicamente y con referencia a las figuras adjuntas, de las que:
La figura 1 ilustra la relación entre el pH de reacción y la cantidad producida de ácido 5'-inosínico en una reacción realizada utilizando una enzima derivada de morganella morganii.
La figura 2 ilustra la relación entre el pH de reacción y la cantidad producida de ácido 5'-inosínico en una reacción realizada utilizando una enzima derivada de escherichia blattae.
La figura 3 ilustra un mapa de enzimas de restricción de un fragmento de DNA cromosómico de morganella morganii que contiene un gen que codifica una fosfatasa ácida.
La figura 4 ilustra la cantidad producida de ácido 5'-inosínico en una reacción realizada utilizando una cepa que hospeda el gen de fosfatasa derivado de morganella morganii.
La figura 5 ilustra un mapa de enzimas de restricción de un fragmento de DNA cromosómico de escherichia blattae que contiene un gen que codifica una fosfatasa ácida.
La figura 6 ilustra un diagrama que muestra la cantidad producida de ácido 5'-inosínico en una reacción realizada utilizando una cepa que hospeda el gen de fosfatasa ácida derivado de escherichia blattae.
La figura 7 ilustra la cantidad producida de ácido 5'-inosínico en reacciones realizadas utilizando una cepa que hospeda el gen de fosfatasa ácida del tipo salvaje y una cepa que hospeda el gen de fosfatasa ácida mutante derivado de escherichia blattae respectivamente.
La figura 8 ilustra la cantidad producida de ácido 5'-inosínico en una reacción realizada utilizando una capa que hospeda el nuevo gen de fosfatasa mutante derivado de escherichia blattae.
La figura 9 ilustra un mapa de enzimas de restricción de un fragmento de DNA cromosómico derivado de enterobacter aerogenes que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida.
La figura 10 ilustra un mapa de enzimas de restricción de un fragmento de DNA cromosómico derivado de klebsiella planticola que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida.
La figura 11 ilustra un mapa de enzimas de restricción de un fragmento de DNA cromosómico derivado de serratia ficaria que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida.
La figura 12 ilustra secuencias de aminoácidos expresadas en código de una letra deducidas de las secuencias de nucleótidos de fosfatasas ácidas derivadas de morganella morganii, escherichia blattae, providencia stuartii, enterobacter aerogenes, klebsiella planticola y serratia ficaria. Estas secuencias de aminoácidos se ilustran en las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28 en el listado de secuencias en código de tres letras. En la figura, los restos aminoácidos que son comunes en todas las secuencias de aminoácidos se marcan con un * debajo de la secuencia.
La figura 13 ilustra la estabilidad térmica de la actividad de la fosfatasa ácida en la disolución de extracto libre de células preparada a partir de una cepa que hospeda el nuevo gen de fosfatasa mutante derivado de escherichia blattae.
1) Preparación de la fosfatasa ácida
La fosfatasa ácida que se va a utilizar en la presente invención cataliza la reacción para producir éster nucleósido-5'-fosfato por transferencia del grupo fosfato al nucleósido a partir del donante del grupo fosfato, por ejemplo elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales, en condiciones de pH de 3,0 a 5,5. Tal fosfatasa ácida incluye preferiblemente las derivadas de microorganismos. En un modo de realización especialmente preferido, la presente invención utiliza una enzima derivada de una bacteria que pertenece a los géneros morganella, escherichia, providencia, enterobacter, klebsiella o serratia. Ejemplos representativos de tales bacterias incluyen las siguientes cepas bacterianas:
Morganella morganii NCIMB 10466
Morganella morganii IFO 3168
Morganella morganii IFO 3848
Escherichia blattae JCM 1650
Escherichia blattae ATCC 33429
Escherichia blattae ATCC 3230
Providencia stuartii ATCC 29851
Providencia stuartii ATCC 33672
Enterobacter aerogenes IFO 12010
Enterobacter aerogenes IFO 13534
Klebsiella planticola IFO 14939
Klebsiella planticola IAM 1133
Serratia ficaria IAM 13540
Serratia marcescens IAM 12143
Se señala que la fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2) es originariamente una enzima que cataliza una reacción para hidrolizar el éster fosfato en condiciones acídicas, y tiene actividad nucleotidasa para degradar el éster nucleósido-5'-fosfato producido por la reacción de transfosforilación (de aquí en adelante la actividad nucleotidasa se denomina ``actividad fosfomonoesterasa''). Con el fin de obtener el éster nucleósido-5'-fosfato con un alto rendimiento, es adecuado utilizar la fosfatasa ácida mutante en la que la afinidad por un nucleósido en la reacción de transfosforilación sobre el nucleósido está aumentada en comparación con la fosfatasa ácida de tipo salvaje producida por la bacteria como se ha descrito anteriormente (de aquí en adelante denominada simplemente ``fosfatasa ácida mutante'', si es necesario). Preferiblemente se utiliza la fosfatasa ácida mutante que tiene un valor de Km por debajo de 100.
La fosfatasa ácida mutante se puede obtener mediante la expresión de un gen mutante obtenido mutando directamente un gen que codifica una fosfatasa ácida como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, la fosfatasa ácida mutante puede obtenerse también tratando un microorganismo que produce una fosfatasa ácida con irradiación de luz ultravioleta o con un agente mutante generalmente utilizado para la mutación artificial tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), y cultivando un microorganismo mutado para producir una fosfatasa ácida mutante que tenga afinidad por un nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada.
Se puede obtener una proteína que tiene actividad fosfatasa ácida a partir de microorganismos como se ha descrito anteriormente cultivando la cepa microbiana que tiene la actividad en un medio apropiado, recogiendo las células microbianas proliferadas, rompiendo las células microbianas para preparar un extracto libre de células y purificando adecuadamente la proteína a partir de él.
El medio para cultivar el microorganismo no se limita específicamente, por lo que puede disponerse un medio común que contiene una fuente común de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos, y opcionalmente una fuente de nutrientes orgánicos. La fuente de carbono que puede ser utilizada adecuadamente incluye, por ejemplo, sacáridos, tales como glucosa y sacarosa, alcoholes tales como glicerol y ácidos orgánicos. La fuente de nitrógeno que puede utilizarse incluye, por ejemplo, amoníaco gaseoso, amoníaco acuoso y sales de amonio. Los iones inorgánicos que pueden utilizarse adecuadamente si es necesario incluyen, por ejemplo, ion magnesio, ion fosfato, ion potasio, ion hierro e ion manganeso. La fuente de nutrientes orgánicos que puede utilizarse adecuadamente incluye, por ejemplo, vitaminas y aminoácidos así como aquellas que las contienen, tales como extracto de levaduras, peptona, extracto de carne, agua empleada para remojar el maíz, hidrosilato de caseína e hidrosilato de semillas de soja.
Las condiciones de cultivo tampoco se limitan específicamente. Los microorganismos se pueden cultivar, por ejemplo, en condiciones aeróbicas durante aproximadamente 12 a 48 horas controlando adecuadamente el pH y la temperatura con intervalos de pH de 5 a 8 y de temperatura de 25 a 40ºC.
La células microbianas proliferadas se pueden recoger a partir de un líquido de cultivo, por ejemplo, por centrifugación. El extracto libre de células se prepara a partir de las células microbianas recogidas utilizando un método convencional. A saber, el extracto libre de células se obtiene rompiendo las células microbianas mediante un método tal como tratamiento con ultrasonidos, molino dyno y prensa francesa, y eliminando los residuos celulares por centrifugación.
La fosfatasa ácida se purifica a partir del extracto libre de células utilizando una combinación adecuada de técnicas utilizadas generalmente para purificación de enzimas, tales como fraccionamiento del sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de filtración en gel y purificación isoeléctrica. En lo que respecta a la precipitación, no es necesariamente indispensable purificar completamente la fosfatasa ácida. Es suficiente lograr la eliminación de contaminantes tales como la enzima que participa en la degradación del nucleósido como sustrato.
2) Preparación del gen de la fosfatasa ácida
Un fragmento de DNA que contiene un gen estructural que codifica la proteína que tiene la actividad fosfatasa ácida, puede clonarse a partir de, por ejemplo, células del microorganismo que tiene la actividad enzimática. El método de clonación incluye, por ejemplo, un método en el que una biblioteca de expresión del gen cromosómico se investiga utilizando la actividad enzimática como índice, un método en el que se prepara un anticuerpo contra la proteína para investigar una biblioteca de expresión del gen cromosómico, un método en el que se analiza una secuencia de aminoácidos, tal como una secuencia N-terminal de la proteína purificada, en función de la cual se prepara una sonda para investigar una biblioteca génica.
Específicamente, los genes que codifican la fosfatasa ácida de morganella morganii, escherichia blattae, providencia stuartii, enterobacter aerogenes, klebsiella planticola, serratia ficaria o serratia marcescens descritas anteriormente pueden clonarse preparando una biblioteca de expresión del gen cromosómico de cada uno de los microorganismos e investigando la biblioteca utilizando la actividad fosfatasa como índice.
A saber, se puede preparar una biblioteca de expresión del gen cromosómico preparando en primer lugar DNA cromosómico a partir de morganella morganii o escherichia blattae, degradándolo parcialmente con una enzima de restricción adecuada, uniéndolo posteriormente con un vector replicable autónomamente en la escherichia coli, y transformado la escherichia coli con el DNA recombinante obtenido. Se puede emplear una gran variedad de enzimas de restricción para la digestión del DNA cromosómico ajustando el tiempo de la reacción de digestión para ajustar el grado de digestión. Se puede utilizar cualquier vector para clonar el gen con la condición de que sea replicable autónomamente en la escherichia coli. Es posible utilizar, por ejemplo, pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 y pBluescript II.
El vector puede ligarse con el fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida para preparar el DNA recombinante realizando previamente la digestión del vector con la misma enzima de restricción que se ha utilizado para la digestión del DNA cromosómico, o con una enzima de restricción que genera una hebra separada complementaria con una hebra separada del fragmento de DNA cromosómico, y ligándolo con el fragmento de DNA utilizando una ligasa, tal como la DNA ligasa T4. Cualquier cepa microbiana puede utilizarse como receptor para el DNA recombinante preparado con la condición de que sea apropiado para la replicación del vector. Es posible utilizar, por ejemplo, cepas microbianas de escherichia coli, tales como HB101, JM109 y DH5.
Las transformantes obtenidas de este modo se hacen crecer en un medio de agar para formar sus colonias. Después de esto, cuando se vierte una disolución de reacción que contiene ácido p-nitrofenilfosfórico sobre una superficie del medio para realizar la reacción, entonces una cepa que ha expresado la actividad fosfatasa, libera p-nitrofenol y presenta color amarillo. Se puede elegir una transformante que hospeda un fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida objetivo realizando la reacción descrita anteriormente en condiciones acídicas, y eligiendo la transformante utilizando el desarrollo del color como índice.
Después de esto, el DNA recombinante se recupera a partir de la transformante elegida para analizar la estructura del fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida ligada con el vector. Una secuencia de nucleótidos del gen que codifica la fosfatasa ácida se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias en el caso de un gen derivado de morganella morganii NCIMB 10466, la secuencia SEQ ID NO: 6 del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de escherichia blattae JCM 1650, la secuencia SEQ ID NO: 21 del listado de secuencias en el caso de un gen derivado de providencia stuartii ATCC 29851, la secuencia SEQ ID NO: 23 del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de enterobacter aerogenes IFO 12010, la secuencia SEQ ID NO: 25 del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de klebsiella planticola IFO 14939 o la secuencia SEQ ID NO: 27 del listado de secuencias en al caso de un gen derivado de serratia ficaria IAM 13540.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de las fosfatasas ácidas codificadas por los genes anteriores se ilustran en las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28.
Para la presente invención, se utilizan preferiblemente variantes de las fosfatasas ácidas codificadas por los genes anteriores que tienen la afinidad por el nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada. También se utiliza preferiblemente para la presente invención una fosfatasa ácida que comprende una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las fosfatasas ácidas codificadas por los genes anteriores. La expresión ``esencialmente idéntica'' significa que las secuencias de aminoácidos de las fosfatasas ácidas pueden presentar sustitución, deleción, inserción o transición de uno o varios restos de aminoácidos sin perder la actividad para producir éster nucleósido-5'-fosfato (de aquí en adelante denominada ``actividad de transfosforilación''). Preferiblemente, las variantes tienen una constante de Michaelis, Km, por debajo de 100ºC como se ha descrito anteriormente y no presentan esencialmente pérdida de actividad cuando se mantienen a 50ºC y pH 7 durante 30 minutos.
3) Preparación del gen que codifica la fosfatasa ácida mutante
La fosfatasa ácida del tipo salvaje obtenida como se ha descrito anteriormente tiene actividad fosfomonoesterasa. Por lo tanto, la actividad fosfomonoesterasa puede servir como factor para producir la degradación subsecuente del producto a medida que el tiempo de reacción transcurre en la producción del éster nucleósido-5'-fosfato, lo que resulta en una disminución del rendimiento de la reacción. Con el fin de superar tal circunstancia, es ventajoso producir una mutación artificial en el gen que codifica la fosfatasa ácida de manera que la afinidad por un nucleósido se aumente.
La realización posterior de una reacción de transferencia de fosfato por la fosfatasa ácida a una temperatura superior lleva a una producción mucho más efectiva del nucleósido-5'-fosfato porque la velocidad de reacción aumenta y la concentración de un receptor de fosfato en la disolución de reacción puede ser superior. Para este fin es ventajoso producir una mutación artificial en el gen que codifica la fosfatasa ácida de manera que la estabilidad térmica aumente.
Los métodos de mutagénesis dirigida para producir la mutación objetivo en un lugar objetivo del DNA incluyen, por ejemplo, un método que utiliza PRC [Higuchi, R. 61, en PCR Technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P. Meth. in Enzymol. 154, 382 (1987) y un método que utiliza un fago (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol. 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al. Meth. in Enzymol. 154, 367 (1987)].
La fosfatasa ácida mutante que tiene la afinidad por el nucleósido aumentada se ejemplifica por la fosfatasa ácida que comprende una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que consta de las secuencias ilustradas por las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28 del listado de secuencias, y tiene una mutación que aumenta la afinidad por el nucleósido en comparación con la fosfatasa ácida del tipo salvaje. Concretamente, la fosfatasa ácida mutante se ejemplifica, para la enzima derivada de escherichia blattae JCM 1650, con una en la que el resto 74º glicina y/o el resto 153º isoleucina se sustituye por otro resto aminoácido en una secuencia de aminoácidos ilustrada en la secuencia SEQ ID Nº: 8 en el listado de secuencias. En los ejemplos descritos a continuación, un gen que codifica la fosfatasa ácida mutante se ilustra como ejemplo en el que el resto 74º glicina se sustituye con un resto ácido aspártico, y el resto 153º isoleucina se sustituye con un resto treonina.
Mutaciones adicionales elegidas entre el grupo que consta de sustituciones del resto 63º leucina, el resto 65º alanina, el resto 66º ácido glutámico, el resto 69º asparagina, el resto 71º serina, el resto 72º serina, el resto 85º serina, el resto 92º alanina, el resto 94º alanina, el resto 116º ácido aspártico, el resto 130º serina, el resto 135º treonina y/o el resto 136º ácido glutámico por otro aminoácido en la secuencia SEQ ID NO: 8 del listado de secuencias, aumentan adicionalmente la afinidad por el nucleósido de la fosfatasa ácida.
La fosfatasa ácida mutante que tiene la estabilidad térmica aumentada se ejemplifica por la fosfatasa ácida que comprende una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que consta de las secuencias ilustradas en las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28 del listado de secuencias, y tiene una mutación que aumenta la estabilidad térmica de la fosfatasa ácida del tipo salvaje. Concretamente, la fosfatasa ácida mutante se ejemplifica, para la enzima derivada de escherichia blattae JCM 1650, por una en la que el resto 104º ácido glutámico y/o el resto 151º treonina se sustituye por otro resto aminoácido en la secuencia de aminoácidos ilustrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 del listado de secuencias. En los ejemplos descritos a continuación, un gen que codifica la fosfatasa ácida mutante se ilustra como un ejemplo en el que el resto 104º ácido glutámico se sustituye con un resto glicina, y el resto 151º treonina se sustituye por un resto alanina.
Por lo tanto, el nucleótido puede sustituirse en un lugar específico del gen de tipo salvaje según el método de mutagénesis dirigida descrito anteriormente, de manera que estas fosfatasas ácidas mutantes se codifiquen. La mutación para aumentar la afinidad por el nucleósido es adecuadamente un tipo de mutación por la que la actividad para producir éster nucleósido-5'-fosfato no disminuye esencialmente en comparación con la fosfatasa ácida del tipo salvaje. Sin embargo, incluso en el caso en el que la actividad para producir éster nucleósido-5'-fosfato disminuya, será suficiente si el grado de disminución de la actividad fosfomonoesterasa es mayor que la de la actividad para producir éster nucleósido-5'-fosfato, con el resultado que la relación entre la actividad fosfomonoesterasa y la actividad para producir éster nucleósido-5'-fosfato de la fosfatasa ácida mutante disminuye en comparación con la de la fosfatasa ácida del tipo salvaje. Como en el caso del grado de aumento en la afinidad por el nucleósido, el valor de Km para el nucleósido en la reacción de transfosforilación es preferiblemente inferior a 100.
La mutación que aumenta la estabilidad térmica significa una que tiene más actividad residual después de un tratamiento térmico que la que tiene la fosfatasa ácida del tipo salvaje. El grado de aumento de la estabilidad térmica es preferiblemente el que no produce disminución en la actividad con el tratamiento a pH 7,0, 50ºC, 30 minutos.
Como se ilustra a continuación en los modos de realización, la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa ácida de escherichia blattae JCM 1650 es altamente homóloga con la de morganella morganii NCIMB 10466, y el resto 72º glicina, el resto 102º ácido glutámico, el resto 149º treonina y el resto 151º isoleucina en la secuencia de aminoácidos ilustrada por la secuencia SEQ ID NO: 4 corresponde al resto 74º glicina, el resto 104º ácido glutámico, el resto 151º treonina y el resto 153º isoleucina en la secuencia de aminoácidos ilustrada por la secuencia SEQ ID NO: 8 respectivamente. Adicionalmente, además de la escherichia blattae JCM 1650, las secuencias de aminoácidos de las fosfatasas ácidas derivadas de microorganismos tales como de providencia stuartii ATCC 29851, enterobacter aerogenes IFO 12010, klebsiella planticola IFO 14939 y serratia ficaria IAM 13450 tienen una gran homología con la de morganella morganii NCIMB 10466, y las secuencias de aminoácidos de estas fosfatasas ácidas incluyen restos de aminoácidos cada uno de los cuales se corresponden con el resto 72º glicina, el resto 102º ácido glutámico, el resto 149º treonina y el resto 151º isoleucina en una secuencia de aminoácidos ilustrada por la secuencia SEQ ID Nº: 4, respectivamente. Por lo tanto, los genes que codifican las fosfatasas ácidas mutantes derivadas de estos microorganismos pueden obtenerse como se ha descrito anteriormente. El resto 92º glicina, el resto 122º ácido glutámico, el resto 169º treonina y el resto 171º isoleucina en la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa ácida derivada de la providencia stuartii ATCC 29851, enterobacter aerogenes IFO 12010 o klebsiella planticola IFO 14939 ilustradas en las secuencias SEQ ID NO: 22, 24 ó 26, y el resto 88º glicina, el resto 118º ácido glutámico, el resto 165º treonina y el resto 167º isoleucina en la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa ácida derivada de la serratia ficaria IAM 13450 ilustrada en la secuencia SEQ ID NO: 28 respectivamente corresponden al resto 72º glicina, el resto 102º ácido glutámico, el resto 149º treonina y el resto 151º isoleucina en la secuencia de aminoácidos ilustrada en la secuencia SEQ ID NO: 4.
El resultado de la comparación de las secuencias de aminoácidos de la fosfatasa ácida anterior se ilustra en la figura 12. Basándose en la figura 12, se decide cual resto aminoácido de una fosfatasa ácida corresponde con otro resto aminoácido de otra fosfatasa ácida.
4) Introducción del gen de la fosfatasa ácida en el huésped
Se puede obtener un microorganismo recombinante para expresar la actividad fosfatasa ácida a un alto nivel introduciendo el fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la proteína que tiene la actividad fosfatasa ácida obtenido como se ha descrito anteriormente en células de un huésped después de recombinar el fragmento de DNA de nuevo con un vector apropiado. En tal procedimiento, la fosfatasa ácida del tipo salvaje se expresa utilizando el gen que codifica la fosfatasa ácida de tipo salvaje, mientras que la fosfatasa ácida mutante se expresa utilizando el gen que codifica la fosfatasa ácida mutante.
El huésped incluye las cepas microbianas de escherichia coli, tales como HB101, JM109 y DH5 descritas anteriormente. Además de estas cepas, se puede utilizar cualquier bacteria como huésped con la condición de que el origen de replicación de DNA recombinante construido y el gen de la fosfatasa ácida realicen sus funciones, el DNA recombinante sea replicable y el gen de la fosfatasa ácida sea expresable. Uno de los huéspedes más preferidos es la escherichia coli JM109.
El vector para incorporar el gen que codifica la fosfatasa ácida en éste no se limita específicamente, con la condición de que sea replicable en el huésped. Cuando se utiliza escherichia coli como huésped, el vector puede ejemplificarse mediante plásmidos replicables autónomamente en esta bacteria. Por ejemplo, es posible utilizar plásmidos del tipo ColE1, plásmidos del tipo p15A, plásmidos del tipo factor R y plásmidos del tipo fago. Tales plásmidos incluyen específicamente, por ejemplo, el pBR322 (Gene, 2, 95 (1997), pUC19 (Gene, 33, 103 (1985), el pU119 (Methods in Enzymology, 153, 3 (1987), el pACYC184 (J. Bacteriol., 134, 1141 (1978) y el pSC101 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3.240 (1973).
Cuando el fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida contiene un promotor que es funcional en el huésped, el fragmento de DNA puede unirse con el vector tal como es. Cuando el fragmento de DNA no contiene tal promotor, otro promotor que actúe en el microorganismo huésped, tal como lac, trp y PL, puede unirse en una posición más arriba del gen. Incluso cuando el fragmento de DNA contiene el promotor, el promotor puede sustituirse por otro promotor con el fin de expresar eficazmente el gen que codifica la fosfatasa ácida.
No hay limitación especial para el método para introducir en el huésped el DNA recombinante construido uniendo el vector con el fragmento de DNA que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida. El DNA recombinante puede introducirse en el huésped utilizando un método convencional. Cuando se utiliza escherichia coli como huésped, es posible utilizar, por ejemplo, el método del cloruro de calcio [J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)], el método de Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)], un método por SEM [Gene, 96, 23 (1990)] el método de Chung et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2.172 (1989)] y electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6.127 (1988)].
El gen de la fosfatasa ácida puede insertarse en el DNA vector replicable autónomamente, el cual puede introducirse en el huésped de manera que es hospedado por el huésped como DNA extracromosómico como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, el gen de la fosfatasa ácida puede incorporarse en un cromosoma del microorganismo huésped conforme a un método que utiliza transducción, transposón (Biotechnol., 1, 417 (1983), fago Mu (Patente japonesa abierta a inspección pública Nº 2-109.985) o recombinación homóloga[Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)].
5) Expresión del gen de la fosfatasa ácida por el microorganismo recombinante
La transformante obtenida como se ha descrito anteriormente, en la que se ha introducido el DNA recombinante que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida, es capaz de expresar la actividad fosfatasa ácida a un alto nivel en sus células cultivándolas en un medio apropiado que contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones inorgánicos y opcionalmente una fuente de nutrientes orgánicos. La fuente de carbono que puede ser utilizada adecuadamente incluye, por ejemplo, carbohidratos tales como glucosa, alcoholes tales como glicerol, y ácidos orgánicos. La fuente de nitrógeno que puede utilizarse incluye, por ejemplo, amoníaco gaseoso, amoníaco acuoso y sales de amonio. Los iones inorgánicos que pueden ser utilizados adecuadamente si es necesario incluyen, por ejemplo, ion magnesio, ion fosfato, ion potasio, ion hierro e ion manganeso. La fuente de nutrientes orgánicos que puede ser utilizada adecuadamente incluye, por ejemplo, vitaminas y aminoácidos así como aquellas que las contienen, tales como extracto de levadura, peptona, extracto de carne, agua empleada para remojar el maíz, hidrosilato de caseína e hidrosilato de semillas de soja. La cantidad de expresión de la actividad fosfatasa ácida puede aumentarse añadiendo al medio un agente inductor de expresión que depende de un promotor tal como IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido).
Las condiciones de cultivo tampoco están específicamente limitadas. El cultivo se puede realizar, por ejemplo, en condiciones aerobias durante aproximadamente 12 a 48 horas controlando el pH y la temperatura adecuadamente, en intervalos de pH de 5 a 8 y de temperatura de 25 a 40ºC.
Después de esto, las células microbianas se recogen del cultivo, y se obtiene un extracto libre de células por ruptura, a partir del cual se puede purificar la fosfatasa ácida. La purificación se realiza utilizando una combinación apropiada de técnicas empleadas generalmente para la purificación de enzimas, tales como las descritas en el apartado 1) anterior. En lo que se refiere a la purificación, no es necesariamente indispensable purificar completamente la fosfatasa ácida. Es suficiente lograr la eliminación de contaminantes tales como la enzima que participa en la degradación del nucleósido como sustrato.
6) Producción del éster nucleósido-5'-fosfato
El éster nucleósido-5'-fosfato se puede producir en una mezcla de reacción permitiendo que la fosfatasa ácida obtenida como se ha descrito anteriormente, y que tiene afinidad por el nucleósido aumentada y/o estabilidad térmica aumentada, tal como la fosfatasa ácida mutante obtenida expresando el gen en una gran cantidad de acuerdo con la técnica de ingeniería genética como se ha descrito en el apartado 5), entre en contacto y produzca la reacción de un nucleósido con un donante de grupo fosfato elegido entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales, ácido acetilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales. Con el fin de obtener una productividad elevada en esta reacción es importante ajustar el pH de la disolución de reacción para que sea débilmente acídica en un intervalo de 3,0 a 5,5.
Cuando el gen que codifica la fosfatasa ácida se expresa en una gran cantidad mediante la técnica de ingeniería genética, especialmente cuando el gen que codifica la fosfatasa ácida mutante que tiene la afinidad por el nucleósido aumentada se expresa en una gran cantidad, entonces es posible también producir el éster nucleósido-5'-fosfato de manera económica y eficaz utilizando un cultivo que contiene células microbianas de la transformante, las células microbianas separadas y recogidas del cultivo, o un producto obtenido de las células microbianas conforme a, por ejemplo, un tratamiento inmovilizador, un tratamiento de acetona o un tratamiento de liofilización, en lugar de la fosfatasa ácida purificada.
El nucleósido que debe ser utilizado incluye, por ejemplo, nucleósidos de purina, tales como inosina, guanosina, adenosina, xantosina, purina ribósida, 6-metoxipurina ribósida, 2,6-diaminopurina ribósida, 6-fluoropurina ribósida, 6-tiopurina ribósida, 2-amino-6-tiopurina ribósida y mercaptoguanosina; y nucleósidos de pirimidina tales como uridina, histidina, 5-aminouridina, 5-hidroxiuridina, 5-bromoutidina y 6-azauridina. Como resultado de la reacción, estos nucleósidos de tipo natural y nucleósidos de tipo no natural se fosforilan específicamente en sus posiciones 5', y se producen los correspondientes ésteres nucleósido-5'-fosfato respectivamente.
El nucleósido se añade adecuadamente a la disolución de reacción a una concentración de 1 a 20 g/dL. En el caso de utilizar un nucleósido que sea escasamente soluble en agua, el rendimiento de la reacción puede aumentarse añadiendo ácido bórico o un tensioactivo tal como dimetilsulfóxido.
Cuando se produce el nucleósido por fermentación, el medio de fermentación después de la propia fermentación puede añadirse al líquido de la reacción de fosforilación.
Cuando se incluye en el medio un elemento que descompone el éster nucleósido-5'-fosfato, se emplea preferiblemente una etapa de purificación de manera que se elimine dicho elemento.
En lo que respecta al donante de grupo fosfato que debe utilizarse, aquellos utilizables como ácido polifosfórico o una de sus sales incluyen, por ejemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico, sus mezclas, sus sales sódicas, sus sales potásicas y mezclas de estas sales. Aquellos utilizables como ácido fenilfosfórico o una de sus sales incluyen, por ejemplo, fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, y sus mezclas. Aquellos utilizables como carbamilfosfato o una de sus sales incluyen, por ejemplo, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio, carbamilfosfato de dilitio, y sus mezclas. Aquellos utilizables como ácido acetilfosfórico o una de sus sales incluyen, por ejemplo, acetilfosfato de litio y potasio. La concentración a la que el donante de grupo fosfato se utiliza está determinada por la concentración del nucleósido como aceptor de grupo fosfato. El donante de grupo fosfato se utiliza generalmente en una cantidad que es de 1 a 5 veces la del nucleósido.
Se obtiene un resultado preferido en la reacción generalmente a una temperatura de 20 a 60ºC, preferiblemente de 30 a 40ºC, a un pH en una zona ligeramente ácida de 3,5 a 6,5, preferiblemente de 4,0 a 5,0. La temperatura de reacción cuando se utiliza la fosfatasa ácida mutante con la estabilidad térmica aumentada es 20 a 70ºC, preferiblemente de 30 a 60ºC. La reacción puede realizarse adoptando uno cualquiera de los métodos estacionarios y métodos con agitación. El tiempo de reacción se prolonga dependiendo de las condiciones tal como la actividad de la enzima que se va a utilizar y de la concentración del sustrato, sin embargo, es de 1 a 100 horas.
El éster nucleósido-5'-fosfato producido de este modo puede recogerse y ser separado de una mezcla después de la finalización de la reacción adoptando un método para utilizar una resina sintética para adsorción, un método para utilizar un agente de precipitación, y otros métodos convencionales de recogida y separación.
Ejemplo
Los modos de realización de la presente invención se explicarán específicamente a continuación con referencia a los ejemplos, sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos.
La actividad de transfosforilación se midió en las condiciones siguientes utilizando inosina como sustrato. La reacción se realizó a pH 5,0 a 30ºC durante 10 minutos en una disolución de reacción (1 mL) que contiene 40 \mumoles/mL de inosina, 100 \mumoles/mL de pirofosfato de sodio, 100 \mumoles/mL de una disolución tampón de acetato de sodio (pH 5,0) y una enzima. La reacción se detuvo añadiendo 200 \muL de ácido clorhídrico 2N. Después de esto, los precipitados se eliminaron por centrifugación. Luego, el ácido 5'-inosínico producido por la reacción de transfosforilación se midió cuantitativamente. Una cantidad de enzima para producir 1 \mumol de ácido 5'-inosínico por 1 minuto en las condiciones estándar de reacción se definió como 1 unidad.
La actividad fosfomonoesterasa se midió en las siguientes condiciones utilizando ácido 5'-inosínico como sustrato. La reacción se realizó a 30ºC durante 10 minutos en una disolución de reacción (1 mL) que contenía 10 \mumoles/mL de ácido 5'-inosínico, 100 \mumoles/mL de una disolución tampón de MES/NaOH (pH 6,0) y una enzima. La reacción se detuvo añadiendo 200 mL de ácido clorhídrico 2N. Después de esto, los precipitados se eliminaron por centrifugación. Luego, la inosina producida por la reacción hidrolítica se midió cuantitativamente. Una cantidad de enzima para producir 1 \mumol de inosina por 1 minuto en estas condiciones estándar de reacción se definió como 1 unidad.
La inosina y el ácido 5'-inosínico se analizaron en las condiciones siguientes mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC):
Columna: Cosmosil 5C18-AR (4,6 x 150 mm) (producida por nacalai tesque);
Fase móvil: disolución tampón de fosfato de potasio 5 mM (pH 2,8)/metanol = 95/5;
Caudal: 1,0 mL/min;
Temperatura: temperatura ambiente;
Detección: UV 245 nm,
Incidentalmente, en la reacción para producir ésteres nucleósido-5'-fosfato utilizando nucleósidos distintos de la inosina como materia prima, los nucleósidos como materia prima y los ésteres nucleósido-5'-fosfato producidos se analizaron por HPLC como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 1 Purificación y caracterización de la fosfatasa ácida derivada de morganella morganii
Un medio nutriente (pH 7,0, 50 mL) que contenía 1 g/dL de peptona, 0,5 g/dL de extracto de levadura y 1 g/dL de cloruro de sodio se vertió en matraces de Sakaguchi (500 mL) que se esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos. Un cultivo inclinado de morganella morganii NCIMB 10466 se inoculó en cada uno de los matraces una vez con un asa de extensión de platino, el cual se incubó a 30ºC durante 16 horas con agitación. Las células microbianas (aproximadamente 3,000 g), que se recogieron del cultivo por centrifugación, se pusieron en suspensión en una disolución tampón de fosfato de sodio 100 mM (1 L, pH 7,0). Se realizó un tratamiento por ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para romper las células microbianas. La suspensión tratada se centrifugó para eliminar su fracción insoluble. Se preparó de este modo un extracto libre de células.
Se añadió sulfato de amonio al extracto libre de células de manera que se obtuvo un 30% de saturación. El precipitado que aparece se eliminó por centrifugación, y luego se añadió adicionalmente sulfato de amonio al sobrenadante de manera que se obtuvo un 60% de saturación. El precipitado que aparece se recogió por centrifugación y se disolvió en una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM.
Esta disolución enzimática bruta se dializó cuatro veces frente a 5 L de una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y luego se aplicó a una columna DEAE-Toyopeal 650M (\phi 4,1 x 22 cm) equilibrada con disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0), seguido por lavado con 800 mL de una disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0). La actividad de transfosforilación se encontró en una fracción que pasó a través de la columna y por lo tanto la fracción se recuperó.
Se añadió sulfato de amonio a la fracción activa de manera que se obtuvo 35% de saturación, la cual se adsorbió en una columna de butil-Toyopeal (\phi 3,1 x 26 cm) equilibrada con una disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) que contenía sulfato de amonio con 35% de saturación. La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración de 35% de saturación a 20% de saturación en una disolución tampón de fosfato de potasio (pH 7,0).
Las fracciones activas se recogieron y se dializaron frente a 1 L de disolución tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,0), seguido por aplicación a una columna de hidroxiapatita (\phi 5 x 6,5 cm) equilibrada con una disolución tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,0). La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración de 50 mM a 300 mM de disolución tampón de fosfato de potasio (pH 7,0).
Las fracciones activas se recogieron y se concentraron por ultrafiltración. Esta disolución enzimática se aplicó en una columna HiLoad TM 16/60 Superdex 200 (producida por Pharmacia). La elución se realizó con un caudal de 1,0 mL/minuto utilizando una disolución tampón de fosfato de potasio 50 mM que contenía cloruro de sodio 100 mM.
Conforme al procedimiento descrito anteriormente, la enzima que presenta actividad de transfosforilación se purificó a partir del extracto libre de células consecuentemente aproximadamente 550 veces a una relación de recuperación de aproximadamente 10%. La actividad específica y la relación de recuperación en este procedimiento de purificación se muestran en la tabla 1. Esta muestra de enzima fue homogénea por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
TABLA 1
Recuperación por Actividad Proteína total Actividad Relación
etapas total (mg) específica (%)
(unidad) (unidad/mg)
1. Extracto libre de 597 127.200 0,005 100
células
2. Fraccionamiento 568 122.210 0,005 95
del sulfato de amonio
(30 al 60%)
3. DEAE-Toyopearl 517 36.498 0,014 87
4. Butil-Toyopearl 394 1.121 0,351 66
5. Hidroxiapatita 112 50 2,244 19
6. Superdex 200 63 24 2,60 10
La enzima purificada presentó las siguientes propiedades:
(1)
Acción: el grupo fosfato se transfiere de un donante de grupo fosfato, tal como ácido polifosfórico, al nucleósido, y se produce el éster nucleósido-5'-fosfato. Inversamente, esta enzima también presenta actividad para hidrolizar el éster fosfato.
(2)
Especificidad de sustrato: los compuestos que sirven como donantes de grupo fosfato en la reacción de transfosforilación incluyen, por ejemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico, fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio, carbamilfosfato de dilitio. Los compuestos que sirven como aceptor del grupo fosfato incluyen, por ejemplo, purina ribósida, inosina, guanosina, adenosina, xantosina, uridina y citidina. Por otra parte, los compuestos que experimentan la acción en la reacción hidrolítica del éster fosfato incluyen, por ejemplo, ácido fosfórico inorgánico, tales como ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico; éster fosfato, tal como fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio y carbamilfosfato de dilitio; y 5'-nucleótidos, tales como 5'-purina ribósida, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-adenílico, ácido 5'-xantílico, ácido 5'-uridílico y ácido 5'-citidílico.
(3)
pH óptimo: 5,2 (reacción de transfosforilación), 6,5 (reacción hidrolítica del éster fosfato).
(4)
Estabilidad del pH: pH 3,0 a 12,0 (tratamiento a 30ºC durante 60 minutos).
(5)
Temperatura óptima: 35ºC aproximadamente.
(6)
Estabilidad térmica: estable hasta 30ºC (tratamiento a pH 7,0 durante 30 minutos).
(7)
Efecto de la adición de un ion metálico e inhibidor: esta enzima no presenta fenómenos de activación relacionados con su actividad por adición de ningún ion metálico. La actividad es inhibida por Ag^{2+}, Pb^{2+}, Hg^{2+} y Cu^{2+}. La actividad también es inhibida por el ácido yodoacético.
(8)
Peso molecular: el peso molecular calculado es aproximadamente 190.000 conforme a cromatografía de líquidos de alta resolución (TSK gel G-3000SW, producido por Toyo Soda)
(9)
Peso molecular de la subunidad: el peso molecular calculado de la subunidad es 25.000 conforme con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Esta enzima presenta no sólo actividad para transferir el grupo fosfato al nucleósido, sino también actividad para hidrolizar reversiblemente el éster fosfato. Además, esta enzima presenta actividad hidrolítica del éster fosfato (actividad fosfomonoesterasa) que es mayor que la actividad de transfosforilación en no menos de 20 veces. Otras propiedades coinciden bien con las de una fosfatasa ácida conocida producida por una bacteria perteneciente al género morganella [Microbiology, 140, 1.341-1.350 (1994)]. Consecuentemente, se ha demostrado que esta enzima es una fosfatasa ácida.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (10 g/dL) e inosina (2 g/dL) en disoluciones tampones de acetato de sodio que tenían cada una de ellas un pH de 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 y 3,5, a lo que se añadió la muestra de enzima descrita anteriormente de manera que se obtuvo una concentración de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 6 horas, manteniendo cada pH, y se midió la cantidad de ácido 5'- inosínico producido a lo largo del tiempo. El ácido inosínico producido contenía solamente ácido 5'-inosínico. No se observó en absoluto producción secundaria de ácido 2'-inosínico ni de ácido 3'-inosínico. El resultado se muestra en la figura 1. La velocidad de producción de ácido 5'-inosínico fue máxima a pH 5,0. Sin embargo, la cantidad máxima acumulada de ácido 5'-inosínico fue mayor a menor pH. La condición de reacción a pH 4,0 fue más eficiente para la producción de ácido 5'-inosínico, en la que el ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló en una cantidad de 2,60 g/dL realizando la reacción durante 3 horas.
Ejemplo 2 Reacción de fosforilación de varios nucleósidos mediante una muestra de fosfatasa ácida derivada de morganella morganii
Se disolvieron pirofosfato de sodio (10 g/dL) e inosina, guanosina, uridina o citidina (2 g/dL), como aceptores del grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a lo que se añadió la muestra de enzima preparada en el ejemplo 1 de manera que su concentración fue de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de nucleósido-5'-éster producida por la reacción se muestra en la tabla 2.
El nucleótido producido contenía sólo nucleósido-5'-éster. No se observó en absoluto producción secundaria de nucleósido-2'-éster ni de nucleósido-3'-éster.
TABLA 2
Donante de grupo fosfato Producto Cantidad producida (g/dL)
Inosina Ácido 5'-inosínico 2,60
Guanosina Ácido 5'-guanílico 1,90
Uridina Ácido 5'-uridílico 1,30
Citidina Ácido 5'-citidílico 0,98
Ejemplo 3 Producción de ácido 5'-inosínico a partir de varios compuestos de fosfato como donantes de grupo fosfato mediante la muestra de fosfatasa ácida derivada de morganella morganii
Se disolvieron inosina (2 g/dL) y tripolifosfato de sodio, polifosfato de sodio (nombre comercial: Polygon P, producido por Chiyoda Chemical), fenilfosfato de disodio, o carbamilfosfato de disodio (10 g/dL), como donantes de grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a la que se añadió la muestra de la enzima preparada en el ejemplo 1 de manera que su concentración fue de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de ácido 5'-inosínico producido por la reacción se muestra en la tabla 3.
El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló eficazmente utilizando cualquiera de los donantes de grupo fosfato. Sin embargo, la cantidad de ácido 5'-inosínico acumulada cuando se usó polifosfato de sodio como donante de grupo fosfato fue la más alta.
TABLA 3
Donante de grupo fosfato Ácido 5'-inosínico producido (g/dL)
Tripolifosfato de sodio 2,10
Polifosfato de sodio 2,72
Fenilfosfato de disodio 2,33
Carbamilfosfato de disodio 2,54
Ejemplo 4 Purificación y caracterización de la fosfatasa ácida derivada de escherichia blattae
Un medio nutriente (pH 7,0, 50 mL) que contenía 1 g/dL de peptona, 0,5 g/dL de extracto de levadura y 1 g/dL de cloruro de sodio se vertió en matraces de Sakaguchi (500 mL) que se esterilizaron a 120ºC durante 20 minutos. Un cultivo inclinado de escherichia blattae JCM1650 se inoculó en cada uno de los matraces una vez con un asa de extensión de platino, el cual se cultivó a 30ºC durante 16 horas con agitación. Las células microbianas se recogieron del cultivo por centrifugación. Las células microbianas (3,300 g aproximadamente) se pusieron en suspensión en una disolución tampón de fosfato de sodio 100 mM (1 L, pH 7,0). Se realizó un tratamiento por ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para romper las células microbianas. La suspensión tratada se centrífugo para eliminar su fracción insoluble. Se preparó de este modo un extracto libre de células.
Se añadió sulfato de amonio al extracto libre de células de manera que se obtuvo un 30% de saturación. El precipitado que apareció se eliminó por centrifugación, y luego se añadió adicionalmente sulfato de amonio al sobrenadante de manera que se obtuvo un 60% de saturación. El precipitado que apareció se recogió por centrifugación y se disolvió en una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM.
Esta disolución enzimática bruta se dializó cuatro veces frente a 5 L de una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y luego se aplicó a una columna DEAE-Toyopeal 650M (\phi 6,2 x 35 cm) equilibrada con disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0), seguido por lavado con 800 mL de una disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0). La actividad de transfosforilación se encontró en una fracción que pasó a través de la columna y por lo tanto la fracción se recogió.
Se añadió sulfato de amonio a la fracción activa de manera que se obtuvo 35% de saturación, lo que se aplicó a una columna de butil-Toyopeal (\phi 5,0 x 22,5 cm) equilibrada con una disolución tampón de fosfato de potasio 20 mM (pH 7,0) que contenía sulfato de amonio con 35% de saturación. La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración de 35% de saturación a 20% de saturación en una disolución tampón de fosfato de potasio (pH 7,0).
Las fracciones activas se recogieron y se dializaron frente a 1 L de disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0), seguido por aplicación a una columna de hidroxiapatita (\phi 3,0 x 7,0 cm) equilibrada con una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0). La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración de 50 mM a 100 mM de disolución tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) y se recogieron las fracciones activas.
Esta disolución enzimática se dializó frente a 1 L de disolución tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH 6,0). La elución se realizó utilizando un gradiente lineal de concentración en una disolución tampón de fosfato de potasio (pH 6,0) que contenía de cloruro de potasio de 0 mM a 300 mM. Se recogieron las fracciones activas eluídas de la columna.
Conforme al procedimiento descrito anteriormente, la enzima que presentaba actividad de transfosforilación se purificó a partir del extracto libre de células consecuentemente aproximadamente 600 veces a una relación de recuperación de aproximadamente 16%. La actividad específica y la relación de recuperación en este procedimiento de purificación se muestran en la tabla 4. Esta muestra de enzima fue homogénea por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
TABLA 4
Recuperación por Actividad Proteína Actividad Relación
etapas total total (mg) específica (%)
(unidad) (unidad/mg)
1. Extracto libre de 365 160.650 0,002 100
células
2. Fraccionamiento 340 138.895 0,002 93
del sulfato de amonio
(30 al 60%)
3. DEAE-Toyopearl 318 30.440 0,010 87
4. Butil-Toyopearl 232 661 0,347 63
5. Hidroxiapatita 96 96 1,000 26
6. Superdex 200 59 43 1,365 16
La enzima purificada presentó las siguientes propiedades:
(1)
Acción: el grupo fosfato se transfiere de un donante de grupo fosfato tal como ácido polifosfórico al nucleósido, y se produce el éster nucleósido-5'-fosfato. Inversamente, esta enzima también presenta actividad para hidrolizar el éster fosfato.
(2)
Especificidad de sustrato: los compuestos que sirven como donantes de grupo fosfato en la reacción de transfosforilación incluyen, por ejemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico, fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio y carbamilfosfato de dilitio. Los compuestos que sirven como aceptor del grupo fosfato incluyen, por ejemplo, purina ribósida, inosina, guanosina, adenosina, xantosina, uridina y citidina. Por otra parte, los compuestos que experimentan la acción en la reacción hidrolítica del éster fosfato incluyen, por ejemplo, ácido fosfórico inorgánico, tales como ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico, ácido hexametafosfórico; éster fosfato, tal como fenilfosfato de disodio, fenilfosfato de dipotasio, anhídrido del ácido O,O-difenilfosfórico, carbamilfosfato de disodio, carbamilfosfato de dipotasio, carbamilfosfato de diamonio y carbamilfosfato de dilitio; y 5'-nucleótidos, tales como 5'-purina ribósida, ácido 5'-inosínico, ácido 5'-guanílico, ácido 5'-adenílico, ácido 5'-xantílico, ácido 5'-uridílico y ácido 5'-citidílico.
(3)
pH óptimo: 5,2 (reacción de transfosforilación), 6,5 (reacción hidrolítica del éster fosfato).
(4)
Estabilidad del pH: pH 3,5 a 12,0 (tratamiento a 30ºC durante 60 minutos)
(5)
Temperatura óptima: 35ºC aproximadamente.
(6)
Estabilidad térmica: estable hasta 40ºC (tratamiento a pH 7,0 durante 30 minutos)
(7)
Efecto de la adición de un ion metálico e inhibidor: Esta enzima no presenta fenómenos de activación relacionados con su actividad por adición de ningún ion metálico. La actividad es inhibida por Fe^{2+}, Ag^{2+}, Pb^{2+}, Hg^{2+} y Cu^{2+}. La actividad también es inhibida por el ácido yodoacético.
(8)
Peso molecular: el peso molecular calculado es aproximadamente 188.000 conforme a cromatografía de líquidos de alta resolución (TSK gel G-3000SW, producido por Toyo Soda)
(9)
Peso molecular de la subunidad: el peso molecular calculado de la subunidad es 24.500 conforme con electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.
Esta enzima presenta no sólo actividad para transferir el grupo fosfato al nucleósido, sino también actividad para hidrolizar reversiblemente el éster fosfato, de la misma forma que la enzima purificada a partir del extracto libre de células de morganella morganii NCIMB 10466. Además, esta enzima presenta actividad hidrolítica del éster fosfato (actividad fosfomonoesterasa) que es mayor que la actividad de transfosforilación en no menos de 30 veces. Consecuentemente, se ha demostrado que esta enzima es una fosfatasa ácida.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (15 g/dL) e inosina (3 g/dL) en disoluciones tampones de acetato de sodio que tenían cada una de ellas un pH de 5,5, 5,0, 4,5, 4,0 y 3,5, a las que se añadió la muestra de enzima descrita anteriormente de manera que se obtuvo una concentración de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 6 horas, manteniendo cada pH, y se midió la cantidad de ácido 5'-inosínico producido a lo largo del tiempo. El ácido inosínico producido contenía solamente ácido 5'-inosínico. No se observó en absoluto producción secundaria de ácido 2'-inosínico ni de ácido 3'-inosínico. El resultado se muestra en la figura 2. La velocidad de producción de ácido 5'-inosínico fue máxima a pH 5,0. Sin embargo, la cantidad máxima acumulada de ácido 5'-inosínico fue mayor a menor pH. La condición de reacción a pH 4,0 fue la más eficiente para la producción de ácido 5'-inosínico. El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló en una cantidad de 1,56 g/dL realizando la reacción a 30ºC y pH 4,0 durante 3 horas.
Ejemplo 5 Reacción de fosforilación de varios nucleósidos mediante una muestra de fosfatasa ácida derivada de escherichia blattae
Se disuelven pirofosfato de sodio (15 g/dL) e inosina, guanosina, uridina o citidina (3 g/dL) en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a lo que se añadió la muestra de enzima preparada en el ejemplo 4 de manera que su concentración fue de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de nucleósido-5'-éster se muestra en la tabla 5.
El nucleótido producido contenía sólo nucleósido-5'-éster. No se observó en absoluto producción secundaria de nucleósido-2'-éster ni de nucleósido-3'-éster.
TABLA 5
Donante de grupo fosfato Producto Cantidad producida (g/dL)
Inosina Ácido 5'-inosínico 1,56
Guanosina Ácido 5'-guanílico 1,05
Uridina Ácido 5'-uridílico 1,87
Citidina Ácido 5'-citidílico 1,22
Ejemplo 6 Producción de ácido 5'-inosínico a partir de varios compuestos de fosfato como donantes de grupo fosfato mediante la muestra de fosfatasa ácida derivada de escherichia blattae
Se disolvieron inosina (2 g/dL) y tripolifosfato de sodio, polifosfato de sodio (nombre comercial: Polygon P, producido por Chiyoda Chemical), fenilfosfato de disodio, o carbamilfosfato de disodio (10 g/dL), como donantes de grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a la que se añadió la muestra de la enzima preparada en el ejemplo 4 de manera que su concentración fuera de 50 unidades/dL. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 3 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de ácido 5'-inosínico producido se muestra en la Tabla 6.
El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló eficazmente utilizando cualquiera de los donantes de grupo fosfato. Sin embargo, la cantidad de ácido 5'-inosínico acumulada cuando se usó polifosfato de sodio como donante de grupo fosfato fue la más alta.
TABLA 6
Donante de grupo fosfato Ácido 5'-inosínico producido (g/dL)
Tripolifosfato de sodio 1,20
Polifosfato de sodio 1,79
Fenilfosfato de disodio 1,50
Carbamilfosfato de disodio 1,53
Ejemplo 7 Aislamiento del gen que codifica la fosfatasa ácida del cromosoma de morganella morganii 1) Determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal
La fosfatasa ácida purificada a partir del extracto libre de células de morganella morganii NCIMB 10466 según el método descrito en el ejemplo 1 se adsorbió en una membrana DITC (producida por Milligen/Biosearch), y su secuencia de aminoácidos N-terminal se determinó utilizando un Prosequencer 6625 (producido por Milligen/Biosearch). Se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende 20 restos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias.
2) Aislamiento del fragmento que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida
Se extrajo el DNA cromosómico a partir de células microbianas cultivadas de morganella morganii NCIMB 10466 según el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res., 4.321, 8 (1980)]. El DNA cromosómico se degradó parcialmente con la enzima de restricción Sau3Al. Después de esto, fragmentos de DNA de 3 a 6 kbp se fraccionaron mediante centrifugación con gradiente de densidad de sacarosa. Se realizó la digestión de un vector plásmido pUC118 (producido por Takara Shuzo) con la enzima de restricción BamHI, que se ligó con los fragmentos de DNA cromosómico parcialmente degradado. La ligadura del DNA se realizó utilizando un kit de ligadura de DNA (producido por Takara Shuzo) se acuerdo con un método diseñado. Después de esto, la escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) se transformó con una mezcla de DNA obtenida según un método convencional. Las transformantes se dispusieron en placas sobre un medio de L de agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina, y se hicieron crecer para preparar una biblioteca de genes.
Una disolución de reacción que contenía ácido p-nitrofenilfosfórico 4 mM y una disolución tampón de MES 100 mM/NaOH (pH 6,5) se vertió sobre la superficie del medio de agar sobre el que se habían hecho crecer las transformantes, y se mantuvo la temperatura a 30ºC durante 15 minutos. Las cepas que habían expresado la actividad fosfatasa liberaron p-nitrofenol y presentaron un color amarillo. Consecuentemente, las transformantes se eligieron utilizando este fenómeno como índice. Como resultado de la investigación de una biblioteca de expresión génica que comprendía aproximadamente 20.000 cepas de transformantes, se obtuvieron 30 cepas de transformantes que habían expresado la actividad fosfatasa.
Las transformantes (30 cepas) que habían expresado la actividad fosfatasa se sometieron a aislamiento en colonias aisladas. Las colonias aisladas se inocularon en un medio L (2,5 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Se añadió una disolución tampón de acetato de sodio (100 mM, pH 5,0, 50 \muL) que contenía inosina (2 g/dL) y pirofosfato de sodio (10 g/dL) a las células microbianas recogidas del cultivo, y la mezcla de reacción se incubó a 30ºC durante 16 horas. La producción de ácido 5'-inosínico se detectó mediante análisis por HPLC para elegir las cepas microbianas que tenían actividad de transfosforilación. Como resultado, se lograron obtener 5 cepas de transformantes que presentaban actividad de transfosforilación y que se suponía que hospedaban el fragmento de DNA que contenía el gen de la fosfatasa ácida objetivo.
Ejemplo 8 Determinación de la secuencia de nucleótidos del gen de la fosfatasa ácida derivado de morganella morganii NCIMB 10466
El fragmento de DNA insertado se analizó preparando un plásmido según un método de lisis alcalina [Molecular Cloning 2ª Ed. (J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pág. 25 (1989)] a partir de una cepa de las transformantes que se suponía que hospedaba el fragmento de DNA que contenía el gen de la fosfatasa ácida derivado de morganella morganii NCIMB 10466 obtenida en el ejemplo 7. Este plásmido se denominó pMPI501. La figura 3 muestra un mapa de enzima de restricción determinado del fragmento de DNA insertado.
La región del gen de la fosfatasa ácida se especificó posteriormente por subclonación. Como resultado se sugirió que este gen de fosfatasa ácida estaba contenido en un fragmento que tenía un tamaño de 1,2 Kbp escindido mediante enzimas de restricción HindIII y EcoRI. Por lo tanto, con el fin de determinar la secuencia de nucleótidos, se construyo un DNA plásmido en el que el fragmento de 1,2 kbp se ligó con pUC118 que había sido sometido a digestión con HindIII y EcoRI. La escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) se transformó con este DNA plásmido, denominado pMPI505, de acuerdo con un método convencional, que se situó en placas sobre un medio L de agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina para obtener una transformante.
El plásmido se extrajo según el método de lisis alcalina de la transformante a partir de escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) que hospedaba el pMPI505 para determinar la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos se determinó según el método de Sanger [J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)] utilizando un kit TaqDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing (producido por Applied Biochemical). Una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto determinado se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias. Una secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias. Una secuencia parcial, que fue totalmente coincidente con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la enzima purificada, se encontró en la secuencia de aminoácidos. La N-terminal de la enzima purificada comienza con el resto 21º alanina de la secuencia mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 3. Consecuentemente, se supone que la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 3 es la de una proteína precursora, y que se elimina un péptido que comprende una cadena desde el resto 1º metionina al resto 20º alanina después de la traducción. Una secuencia de aminoácidos de una proteína madura deducida de este modo se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencias. Se calcula que el peso molecular de la proteína madura calculado a partir de la secuencia de aminoácidos es 24,9 kilodaltons, que coincide bien con el resultado de SDS-PAGE para la enzima purificada. Conforme a los resultados descritos anteriormente, y debido al hecho de que la transformante que hospeda el plásmido que contiene este fragmento presentaban actividad de transfosforilación, se identificó que este marco de lectura abierto era la región que codifica la fosfatasa ácida objetivo.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos se compararon por homología respectivamente con secuencias conocidas. Se utilizaron las bases de datos de EMBL y de SWISS-PROT. Como resultado, se ha demostrado que la secuencia de nucleótidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias es coincidente con la secuencia de nucleótidos de un gen de la fosfatasa ácida conocido derivado de morganella morganii [Thaller, M. C. et al., Microbiology, 140, 1.341 (1994)], excepto que el 54º G es A, el 72º G es A, el 276º T es G, el 378º T es C, el 420º G es T, el 525º C es G, el 529º C es T, y el 531º G es A en el último, y que la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencias es la misma que la del gen de la fosfatasa ácida derivado de la morganella morganii. A saber, el gen que codifica la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencias es el gen de la fosfatasa ácida de la morganella morganii NCIMB 10466.
La proteína precursora comprende 249 aminoácidos, y el peso molecular de la proteína deducida a partir de su secuencia es 27,0 kilodaltons.
La cepa de escherichia coli JM109 transformada por un plásmido pMPI505 se ha denominado AJ13143, que ha sido registrada internacionalmente el 23 de Febrero de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) de acuerdo con lo estipulado por el Tratado de Budapest, y se le ha otorgado el número de registro FERM BP-5422.
Ejemplo 9 Amplificación de la actividad por expresión del gen de fosfatasa ácida derivado de morganella morganii NCIMB 10466
Se inoculó escherichia coli JM109/pMPI505 construida en el ejemplo 8 en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante 16 horas. Las células microbianas se recogieron de su cultivo por centrifugación y se lavaron una vez con suero fisiológico salino. Las células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,2) y se rompieron mediante un tratamiento con ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20 minutos. La disolución tratada se centrifugó para eliminar la fracción insoluble y se preparó de este modo un extracto libre de células.
La actividad de transfosforilación del extracto libre de células obtenido se midió utilizando los controles de extractos libres de células preparados a partir de la cepa de tipo salvaje de morganella morganii y escherichia coli JM109 transformada con el plásmido pUC118 de la misma manera que la descrita anteriormente. El resultado se muestra en la figura 7. No se detectó actividad de transfosforilación en la escherichia coli JM109/pUC118. La actividad de transfosforilación fue también pequeña en la cepa de tipo salvaje de morganella morganii. Por otra parte, la escherichia coli JM109/pMPI505 presentó una actividad de transfosforilación elevada que fue 150 veces más alta en actividad específica que la cepa de tipo salvaje de morganella morganii. De acuerdo con el resultado, se ha demostrado que el fragmento de DNA introducido permite que la escherichia coli exprese la fosfatasa ácida en un alto nivel.
TABLA 7
Cepa microbiana Actividad de transfosforilación (unidad/mg)
Morganella morganii NCIMB 10466 0.008
Escherichia coli JM 109/pUC118 no detectado
Escherichia coli JM 109/pMPI505 1.250
Ejemplo 11 Aislamiento del gen que codifica la fosfatasa ácida del cromosoma de escherichia blattae 1) Determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal
La fosfatasa ácida purificada del extracto libre de células de escherichia blattae JCM 1650 se adsorbió en una membrana DITC (producida por Milligen/Biosearch), y su secuencia de aminoácidos N-terminal se determinó utilizando un Prosequencer 6625 (producido por Milligen/Biosearch). Se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal que comprende 15 restos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias.
\newpage
2) Aislamiento del fragmento que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida
Se extrajo el DNA cromosómico de células microbianas cultivadas de escherichia blattae JCM 1650 de acuerdo con el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res., 4.321, 8 (1980)]. El DNA cromosómico se degradó parcialmente con Sau3Al. Después de esto, fragmentos de DNA de 3 a 6 kbp se fraccionaron mediante centrifugación con gradiente de densidad de sacarosa. Se realizó la digestión de un vector plásmido pUC118 (producido por Takara Shuzo) con BamHI, que se ligó con los fragmentos de DNA cromosómico parcialmente degradados. La ligadura del DNA se realizó utilizando un kit de ligadura de DNA (producido por Takara Shuzo) según un método diseñado. Después de esto, la escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) se transformó con una mezcla de DNA obtenida según un método convencional. Las transformantes se dispusieron en placas sobre un medio de L agar que contenía 100 g/mL de ampicilina, y se hicieron crecer para preparar una biblioteca génica.
Una disolución de reacción que contenía ácido p-nitrofenilfosfórico 4 mM y una disolución tampón de MES 100 mM/NaOH (pH 6,5) se vertió sobre la superficie del medio de agar sobre el que se habían hecho crecer las transformantes, y se mantuvo la temperatura a 30ºC durante 15 minutos. Las cepas que habían expresado la actividad fosfatasa liberaron p-nitrofenol y presentaron un color amarillo. Consecuentemente, las transformantes se eligieron utilizando este fenómeno como índice. Como resultado de la investigación de una biblioteca de expresión génica que comprendía aproximadamente 8.000 cepas de transformantes, se obtuvieron 14 cepas de transformantes que habían expresado la actividad fosfatasa.
Las transformantes (14 cepas) que habían expresado la actividad fosfatasa se sometieron a aislamiento en colonias aisladas. Las colonias aisladas se inocularon en un medio L (2,5 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Se añadió una disolución tampón de acetato de sodio (100 mM, pH 5,0, 50 \muL) que contenía inosina (2 g/dL) y pirofosfato de sodio (10 g/dL) a las células microbianas recogidas de los líquidos de cultivo para realizar la reacción a 30ºC durante 16 horas. La producción de ácido 5'-inosínico se detectó mediante análisis por HPLC para elegir las cepas microbianas que tenían actividad de transfosforilación. Como resultado, se lograron obtener 3 cepas de transformantes que presentaban actividad de transfosforilación y que se suponía que hospedaban el fragmento de DNA que contenía el gen de la fosfatasa ácida objetivo.
Ejemplo 12 Determinación de la secuencia de nucleótidos del gen de la fosfatasa ácida derivado de escherichia blattae JCM 1650
Se analizó el fragmento de DNA insertado extrayendo un plásmido de acuerdo con el método de lisis alcalina a partir de una cepa de las transformantes que se suponía que hospedaba el fragmento de DNA que contenía el gen de la fosfatasa ácida derivado de la escherichia blattae JCM 1650 obtenida en el ejemplo 11. Este plásmido se denominó pEPI301. La figura 5 muestra un mapa de enzima de restricción determinado del fragmento de DNA insertado.
La región del gen de la fosfatasa ácida se especificó posteriormente por subclonación. Como resultado se sugirió que este gen de la fosfatasa ácida estaba contenido en un fragmento que tenía un tamaño de 2,4 Kbp escindido mediante enzimas de restricción ClaI y BamHI. Por lo tanto, con el fin de determinar la secuencia de nucleótidos, se construyo un DNA plásmido en el que el fragmento se unió con pBluescript KS (+) (producido por Stratagene) que había sido sometido a digestión con ClaI y BamHI. Se transformó la escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) con el DNA plásmido denominado pEPI305 según un método convencional, que se situó en placas sobre un medio L de agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina para obtener una transformante.
El plásmido se extrajo según el método de lisis alcalina de la transformante de escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) que hospedaba el pEPI305 para determinar la secuencia de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto determinado se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 6 del listado de secuencias. Una secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 7 del listado de secuencias. Una secuencia parcial, que fue totalmente coincidente con la secuencia de aminoácidos N-terminal de la enzima purificada, se encontró en la secuencia de aminoácidos. La N-terminal de la enzima purificada comienza con el resto 19º leucina de la secuencia mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 7. Consecuentemente, se supone que la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 7 es la de una proteína precursora, y que se elimina un péptido que comprende una cadena desde el resto 1º metionina hasta el resto 18º alanina después de la traducción. Una secuencia de aminoácidos de una proteína madura deducida de este modo se muestra en la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias. Consecuentemente, se calcula que el peso molecular aproximado de la proteína madura es 25,1 kilodaltons, que coincide bien con los resultados por SDS-PAGE para la enzima purificada. De acuerdo con los resultados descritos anteriormente, y debido al hecho de que la transformante que hospeda el plásmido que contiene este fragmento presentaba actividad de transfosforilación, se identificó que este marco de lectura abierto era la región que codifica la fosfatasa ácida objetivo.
A saber, el gen que codifica la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias es el gen de la fosfatasa ácida de la escherichia blattae JCM 1650.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos se compararon por homología respectivamente con secuencias conocidas. Se utilizaron las bases de datos de EMBL y de SWISS-PROT. Como resultado, se ha demostrado que la proteína mostrada en la secuencia SEQ ID NO: 8 y el DNA que la codifica son nuevas. Una proteína precursora codificada por este gen comprende 249 aminoácidos, y el peso molecular de la proteína deducido de su secuencia es 27,0 kilodaltons.
La secuencia de aminoácidos se comparó por homología con secuencias conocidas respectivamente. Como resultado, esta proteína presentó un alto grado de homología con la fosfatasa ácida de la providencia stuartii (77,1%), con la fosfatasa ácida de la morganella morganii del ejemplo 8 (77,1%) y con la fosfatasa ácida de la salmonella typhimurium (44,3%).
La cepa de escherichia coli JM109 transformada por un plásmido pEPI305 se ha denominado AJ13144, que ha sido registrada internacionalmente el 23 de Febrero de 1996 en el National Institute of Bioscience and Human Technology de la Agency of Industrial Science and Technology (código postal: 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) de acuerdo con lo estipulado por el Tratado de Budapest, y se le ha otorgado el número de registro FERM BP-5423.
Ejemplo 13 Amplificación de la actividad por expresión del gen de la fosfatasa ácida derivado de escherichia blattae JCM 1650
Se inoculó escherichia coli JM109/pEPI305 construida en el ejemplo 12 en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante 16 horas. Las células microbianas se recogieron de su cultivo por centrifugación y se lavaron una vez con suero fisiológico salino. Las células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,2) y se rompieron mediante un tratamiento de ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20 minutos. La disolución tratada se centrifugó para eliminar la fracción insoluble y se preparó de este modo un extracto libre de células.
La actividad de transfosforilación del extracto libre de células obtenido se midió utilizando controles de extractos libres de células preparados a partir de la cepa de tipo salvaje de escherichia blattae y escherichia coli JM109 transformada con el plásmido pBluescript KS (+) de la misma manera que la descrita anteriormente. El resultado se muestra en la tabla 8. La actividad de transfosforilación no se detectó en la escherichia coli JM109/pBluescript KS(+). La actividad de transfosforilación fue también pequeña en la cepa de tipo salvaje de la escherichia blattae. Por otra parte, la escherichia coli JM109/pEPI305 exhibió una actividad de transfosforilación elevada que fue 120 veces más alta en actividad específica que la cepa de tipo salvaje de escherichia blattae. De acuerdo con el resultado, se ha demostrado que el fragmento de DNA introducido permite que la escherichia coli exprese la fosfatasa ácida en un alto nivel.
TABLA 8
Cepa microbiana Actividad de transfosforilación (unidad/mg)
Escherichia blattae JCM 1650 0,002
Escherichia coli JM 109/pBluescript KS (+) no detectado
Escherichia coli JM 109/pEPI305 0,264
Ejemplo 14 Producción del ácido 5'-inosínico a partir de inosina utilizando una cepa que hospeda el gen de la fosfatasa ácida derivado de la escherichia blattae JCM 1650
Se disolvieron pirofosfato de sodio (12 g/dL) e inosina (6 g/dL) en una disolución tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,0), a la que se añadieron células microbianas de escherichia coli JM109/pEPI305 descritas anteriormente para dar una concentración de células de 200 mg/dL expresado en peso seco de las células microbianas. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 10 horas manteniendo el pH a 4,0 y la cantidad de ácido inosínico producido se midió a lo largo del tiempo. El ácido inosínico producido contenía sólo ácido 5'-inosínico. No se observó en absoluto producción secundaria de ácido 2'-inosínico ni de ácido 3'-inosínico. El resultado se muestra en la figura 6. El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló de forma extremadamente eficaz en un periodo corto de tiempo en la reacción para producir ácido 5'-inosínico a partir de pirofosfato e inosina utilizando este microorganismo.
Ejemplo 15 Preparación de un gen que codifica una fosfatasa ácida con actividad fosfomonoesterasa disminuida
Como se ha descrito en los ejemplos 13 y 14,la cepa que hospeda el gen de la fosfatasa ácida derivado de escherichia blattae expresa una cantidad considerable de la fosfatasa ácida, y el ácido 5'-inosínico se produce y se acumula de forma extremadamente eficaz en un período de tiempo corto en la reacción para producir ácido 5'-inosínico a partir de pirofosfato e inosina utilizando este microorganismo. Sin embargo, se ha demostrado que la cantidad acumulada de ácido 5'-inosínico no excede un cierto grado porque el ácido 5'-inosínico experimenta una degradación debido a la actividad fosfomonoesterasa que presenta la propia fosfatasa ácida. Por lo tanto se procuró mejorar la enzima introduciendo una mutación en el gen de la fosfatasa ácida derivado de la escherichia blattae clonada en el ejemplo 11, según el método de mutagénesis dirigida utilizando PCR.
Los oligonucleótidos MUT300, MUT310 y MUT320 mostrados en las secuencias SEQ ID NO: 9, 10 y 11 en el listado de secuencias se sintetizaron respectivamente según el método de fosfoamidita utilizando un sintetizador de DNA (Modelo 394 producido por Applied Biosystems).
Se añadieron plásmido pEPI305 (1 ng) como plantilla preparada en el ejemplo 12, M13 primer RV (producido por Takara Shuzo) y el oligonucleótido MUT310 (2,5 \mumoles de cada uno de ellos) como iniciadores, y Taq DNA-polimerasa (2,5 unidades, producida por Takara Shuzo) a una disolución tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 8,3, 100 \muL) que contenía dATP, dCTP, dGTP, dTTP (cada uno de ellos 200 \muM), cloruro de potasio (50 mM) y cloruro de magnesio (1,5 mM), para realizar una reacción PCR en la que se repetía 25 veces un ciclo que comprendía periodos de 30 segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 3 minutos a 72ºC. La reacción PCR se realizó utilizando un ciclador térmico tipo PJ2000 (producido por Takara Shuzo). Además se realizó una reacción PCR de la misma manera que la descrita anteriormente utilizando plásmido pEPI305 (1 ng) como plantilla, M13 primer M3 (producido por Takara Shuzo) y oligonucleótido MUT300 (2,5 \mumoles de cada uno) como iniciadores. Cada una de las disoluciones de reacción se purificó por filtración en gel para eliminar los iniciadores utilizando una columna Microspin S-400 (producida por Pharmacia).
Cada uno de los productos de la reacción PCR (1 \muL) se añadió a una disolución tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 8,3, 95 \muL) que contenía dATP, dCTP, dGTP, dTTP (cada uno 200 \muM), cloruro de potasio (50 mM) y cloruro de magnesio (1,5 mM), y se calentó a 94ºC durante 10 minutos, seguido por enfriamiento a 37ºC durante 60 minutos. Después de esto, la temperatura se mantuvo a 37ºC durante 15 minutos para formar un heteroduplex. La Taq DNA polimerasa (2,5 unidades) se añadió a ello para realizar la reacción a 72ºC durante 3 minutos de manera que se completara el heteroduplex. Después de esto se añadieron M13 primer RV y M13 primer M3 (2,5 \mumoles de cada uno) a esta disolución de reacción para realizar una reacción PCR en la que se repitió 10 veces un ciclo que comprendía periodos de 30 segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC, y 3 minutos a 72ºC.
Se realizó la digestión del producto de la segunda reacción PCR con ClaI y BamHI seguido por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Este fragmento de DNA se unió con pBluescript KS(+) al que se había realizado una digestión con ClaI y BamHI. La escherichia coli JM109 (producida por Takara Shuzo) se transformó como el DNA plásmido obtenido según un método convencional, la cual se colocó en placas sobre un medio L de agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina para obtener una transformante.
El plásmido se extrajo a partir de la transformante según el método de lisis alcalina para determinar la secuencia de nucleótidos, confirmando que el nucleótido objetivo había sido sustituido. Por lo tanto, se preparó un gen mutante que codifica una fosfatasa mutante en el que el resto 74º glicina (GGG) de la proteína madura se sustituyó con un resto ácido aspártico (G*A*T). El plásmido que contenía este gen mutante se denominó pEPI310.
Se preparó un gen mutante que codifica una fosfatasa mutante en el que el resto 153º isoleucina (ATC) de la proteína madura se sustituyó con un resto treonina (A*CC), según el mismo procedimiento que el descrito anteriormente, utilizando pEPI305 como plantilla, y los oligonucleótidos MUT300 y MUT320 como iniciadores. El plásmido que contenía este gen mutante se denominó pEPI320. A continuación, se preparó un gen mutante que codifica una fosfatasa mutante en el que el resto 74º glicina (GGG) de la proteína madura se sustituyó por un resto ácido aspártico (G*A*T) y el resto 153º isoleucina de la proteína madura se sustituyó por un resto treonina (A*CC), según el mismo procedimiento descrito anteriormente utilizando pEPI310 como plantilla, y los oligonucleótidos MUT300 y MUT320 como iniciadores. El plásmido que contenía este gen mutante se denominó pEPI330.
La escherichia coli JM109/pEPI310, escherichia coli JM109/pEPI320 y escherichia coli JM109/pEPI330, en las que se habían introducido los plásmidos que contenían los respectivos genes de la fosfatasa ácida mutante, y la escherichia coli JM109/pEPI305, en la que se había introducido el plásmido que contenía el gen de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, se inocularon en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Las células microbianas se recogieron de su cultivo y se lavaron una vez con disolución salina fisiológica. Las células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,0), y se rompieron mediante un tratamiento con ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20 minutos. Las disoluciones tratadas se centrifugaron para eliminar las fracciones insolubles, y de este modo se prepararon extractos libres de células. Las actividades fosfomonoesterasa y las actividades de transfosforilación de los extractos libres de células se midieron a pH 4,0, y se compararon con la actividad de la cepa salvaje.
La tabla 9 muestra el resultado de la medida de las actividades fosfomonoesterasa y de las actividades de transfosforilación de la fosfatasa ácida de tipo salvaje y de las fosfatasas ácidas con actividad fosfomonoesterasa disminuida. Muestra que tanto las actividades fosfomonoesterasa como las actividades de transfosforilación de las fosfatasas ácidas con actividad fosfomonoesterasa disminuida, han disminuido en comparación con la fosfatasa ácida de tipo salvaje, y que los grados de disminución de las actividades fosfomonoesterasa son mayores que los de las actividades de transfosforilación, con el resultado que la relación entre la actividad fosfomonoesterasa y la actividad de transfosforilación de la fosfatasa ácida mutante disminuye en comparación con la fosfatasa ácida de tipo salvaje.
TABLA 9
Plásmido Actividad fosfomonoesterasa Actividad de transfosforilación Relación^{(1)}
(unidad/mg) (unidad/mg) (valor relativo)
pEPI305 2,38 0,132 18,03 (100)
pEPI310 0,26 0,019 13,68 (76)
pEPI320 0,88 0,123 7,15 (39)
pEPI330 0,42 0,070 6,00 (33)
^{(1)} Relación entre las actividades fosfomonoesterasa y las actividades para producir éster nucleó-
sido-5'-fosfato.
Ejemplo 16 Producción del ácido 5'-inosínico a partir de la inosina utilizando las cepas que hospedan un gen que codifica la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoestearasa disminuida
La escherichia coli JM109/pEPI310, escherichia coli JM109/pEPI320 y escherichia coli JM109/pEPI330 en las que se han introducido los plásmidos que contienen los genes que codifican las fosfatasas ácidas con actividad fosfomonoesterasa disminuida, y la escherichia coli JM109/pEPI305 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, se inocularon en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (12 g/dL) e inosina (6 g/dL) en una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) a la que se añadieron las células microbianas de cada una de las cepas de escherichia coli obtenidas mediante los cultivos descritos anteriormente, para obtener una concentración de 200 mg/dL expresada en peso seco de las células microbianas. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 32 horas manteniendo el pH a 4,0, y la cantidad de ácido 5'-inosínico producido se midió a lo largo del tiempo. El resultado se muestra en la figura 8.
En la figura 7, el eje de ordenadas indica la concentración de ácido 5'-inosínico (mg/dL) y el eje de abscisas indica el tiempo de reacción (h). El avance de la reacción, medido utilizando las cepas de las células respectivas, se indica por los círculos sólidos para la escherichia coli JM109/pEPI305, triángulos sólidos para la escherichia coli JM109/pEPI310, círculos vacíos para la escherichia coli JM109/pEPI320 y cuadrados vacíos para la escherichia coli JM109/pEPI330.
La velocidad de degradación del ácido 5'-inosínico producido disminuyó en la reacción para producir ácido 5'-inosínico a partir de inosina utilizando las cepas que hospedan la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoestearasa disminuida. Como resultado, el rendimiento y la cantidad acumulada de ácido 5'-inosínico aumentó. La acumulación más alta de ácido 5'-inosínico se obtuvo para la escherichia coli JM109/pEPI330 como cepa que hospeda el gen que codifica la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoestearasa disminuida en la que el resto 74º glicina y el resto 153º isoleucina se sustituyeron por el resto ácido aspártico y el resto treonina respectivamente.
Ejemplo 17 Producción de varios ésteres nucleósido-5-fosfato utilizando las cepas que hospedan un gen que codifica la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoesterasa disminuida
La escherichia coli JM109/pEPI330 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoestearasa disminuida se inoculó en un medio L (50 mL) que contenía 100 mg/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron pirofosfato de sodio (12 g/dL), e inosina, guanosina, uridina o citidina (6 g/dL) como aceptores de grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,0), a lo que se añadieron las células microbianas descritas anteriormente para obtener una concentración de células de 200 mg/dL expresada en peso seco de las células. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 32 horas manteniendo el pH a 4,0. Las cantidades de éster nucleósido-5'-fosfato producidas se muestran en la tabla 10. El nucleótido producido contenía sólo nucleósido-5'-ester fosfato. No se observó en absoluto producción secundaria de éster nucleósido-2'-fosfato ni de éster nucleósido-3'-fosfato.
TABLA 10
Nucleósido Producto Cantidad producida (g/dL)
Inosina Ácido 5'-inosínico 7,45
Guanosina Ácido 5'-guanílico 4,77
Uridina Ácido 5'-uridílico 8,93
Citidina Ácido 5'-citidílico 6,60
Ejemplo 18 Producción de ácido 5'-inosínico a partir de varios compuestos de fosfato como donantes de grupo fosfato utilizando la cepa que hospeda un gen que codifica la fosfatasa ácida con actividad fosfomonoesterasa disminuida
Se inoculó escherichia coli JM109/pEPI330 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron inosina (6 g/dL), y tripolifosfato de sodio, polifosfato de sodio (nombre comercial: Polygon P, producido por Chiyoda Chemical), fenilfosfato de disodio o carbamilfosfato de disodio (12 g/dL) como donantes de grupo fosfato, en una disolución tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 4,0), a lo que se añadieron las células microbianas descritas anteriormente para dar una concentración de 200 mg/dL, expresada en peso seco de las células. La mezcla de reacción se incubó a 35ºC durante 32 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de ácido 5'-inosínico producida se muestra en la tabla 11. El ácido 5'-inosínico se produjo y se acumuló eficazmente utilizando cualquiera de los donantes de grupo fosfato. Sin embargo, la cantidad acumulada de ácido 5'-inosínico cuando se utilizó ácido polifosfórico como donante de grupo fosfato fue la más elevada.
TABLA 11
Donante grupo fosfato Ácido 5'-inosínico producido (g/dL)
Tripolifosfato de sodio 5,96
Polifosfato de sodio 8,84
Fenilfosfato de disodio 7,80
Carbamilfosfato de disodio 7,73
Ejemplo 19 Estudios sobre la producción de un nuevo gen de la fosfatasa ácida mutante derivado de la E. Blattae JCM1650 y propiedades enzimológicas del gen de la fosfatasa ácida mutante
En los ejemplos 19 a 22, la actividad de transfosforilación a un nucleósido se midió utilizando las siguientes condiciones. La reacción se realizó a 30ºC y a un pH de 4,0 durante 10 minutos utilizando 1 mL de una disolución de reacción que contenía 40 \mumoles/mL de inosina, 100 \mumoles/mL de pirofosfato de sodio, 100 \mumoles/mL de una disolución tampón de acetato de sodio (pH 4,0) y una enzima. Esta reacción se terminó mediante la adición de 200 \muL de ácido clorhídrico 2N. Luego, se eliminó el precipitado por centrifugación, y la cantidad de ácido 5'-inosínico formado mediante la transfosforilación se determinó en las condiciones mencionadas anteriormente. La cantidad de la enzima con la que se produce 1 \mumol de ácido inosínico en estas condiciones estándar de reacción se definió como 1 unidad.
Posteriormente, la actividad de transfosforilación se midió variando la concentración de inosina de 10 a 100 mmoles/mL bajo las condiciones de reacción de la composición mencionada anteriormente, y la constante de velocidad de la inosina en la actividad de transfosforilación se determinó utilizando la gráfica de Haens-Woolf [Biochem. J., 26, 1.406 (1932)].
Como se describe a continuación, el análisis detallado se realizó con respecto a la enzima mutante con la que se aumenta la productividad del éster nucleósido-5'-fosfato descrita en el ejemplo 15. Consecuentemente, se encontró que la afinidad por el nucleósido de la enzima mutante se mejoró en 2 veces, en comparación con la de la enzima de tipo salvaje. Por lo tanto, los inventores consideraron que la productividad del éster nucleósido-5'-fosfato mejoraría aumentando la afinidad por el nucleósido de la enzima mencionada anteriormente, y modificaron posteriormente la enzima mediante el método de ingeniería genética.
\newpage
Se utilizó el plásmido pEPI305 que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida de tipo salvaje derivada de la E. Blattae descrita en el ejemplo 15, y la mutación dirigida se introdujo en este DNA plásmido por el método de ingeniería genética para producir un gen que codifica la fosfatasa ácida mutante. El pEPI305 es un DNA plásmido formado enlazando un fragmento de DNA de 2,4 Kbp escindido con endonucleasas de restricción ClaI y BamHI y que contienen un gen que codifica una fosfatasa ácida de tipo salvaje derivada de la E. Blattae JCM1650, con pBluescript KS(+) (proporcionado por Stratagene) escindido con ClaI y BamHI. Esta secuencia base del gen que codifica la fosfatasa ácida se representa por la secuencia SEQ ID NO: 6 en el listado de secuencias. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de una proteína precursora anticipada a partir de esta secuencia de bases se representa en la secuencia SEQ ID NO: 7 en el listado de secuencias. A partir de los resultados analíticos de la enzima purificada (descrita en el ejemplo 4), se supone que la secuencia de aminoácidos de la proteína de maduración está representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias.
Los oligonucleótidos MUT300 (SEQ ID NO: 9 en el listado de secuencias), MUT310 (SEQ ID NO: 10 en el listado de secuencias), MUT320 (SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias), MUT330 (SEQ ID NO: 12 en el listado de secuencias), MUT340 (SEQ ID NO: 13 en el listado de secuencias), MUT350 (SEQ ID NO: 14 en el listado de secuencias), MUT360 (SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias), MUT370 (SEQ ID Nº: 16 en el listado de secuencias), MUT380 (SEQ ID NO: 17 en el listado de secuencias) y MUT390 (SEQ ID NO: 18 en el listado de secuencias) que tienen las secuencias mostradas en el listado de secuencias, se sintetizaron por el método de la fosfoamidita utilizando un sintetizador de DNA (Modelo 394 proporcionado por Applied Biosystem).
Se añadieron un nanogramo de pEPI305 como plantilla, 2,5 \mumoles de M13 Primer RV (proporcionado por Takara Shuzo Co., Ltd.), 2,5 \mumoles del oligonucleótido MUT310 y 2,5 unidades de tac DNA polimerasa (proporcionada por Takara Shuzo Co. Ltd.) a 100 \muL de una disolución tampón de Tris-hidrocloruro (pH 8,3) que contenía 200 \muM de dATP, 200 \muM de dCTP, 200 \muM de dGTP, 200 \muM de dTTP, 50 mM de cloruro de potasio y 1,5 mM de cloruro de magnesio. Se realizó la PCR en la que se repitió 25 veces una etapa en tres partes, a saber, a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 3 minutos. En esta reacción se utilizó un ciclador térmico modelo PJ2000 (proporcionado por Takara Shuzo Co., Ltd.) Separadamente se realizó una PCR de forma análoga, utilizando 1 ng de DNA plásmido pEPI305 como plantilla, 2,5 \mumoles de M13 Primer M3 (proporcionado por Takara Shuzo Co., Ltd) como iniciador y 2,5 \mumoles de oligonucleótido MUT300. Cada una de las disoluciones de reacción se purificó por filtración en gel utilizando una columna microspin S-400 (proporcionada por Pharmacia) para eliminar el iniciador.
Se añadió un microlitro de cada una de las disoluciones de PCR a 95 mL de una disolución tampón de tris-clorhidrato 100 mM (pH 8,3) que contenía 200 \muM de dATP, 200 \muM de dCTP, 200 \muM de dGTP, 200 \muM de dTTP, 50 mM de cloruro de potasio y 1,5 mM de cloruro de magnesio. La mezcla se calentó a 94ºC durante 10 minutos y luego se enfrió a 37ºC a lo largo de 60 minutos, y se calentó a 37ºC durante 15 minutos para formar un heteroduplex. A esto se añadieron 2,5 unidades de tac DNA polimerasa y se realizó la reacción a 72ºC durante 3 minutos para completar el heteroduplex. A continuación, se añadieron 2,5 \mumoles de M13 Primer RV y 2,5 \mumoles de M13 Primer M3 a la disolución de reacción, y se realizó una PCR en la que se repitió 10 veces una etapa en tres partes, a saber: a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 3 minutos.
El segundo producto de PCR se escindió con ClaI y BamHI, luego se extrajo con una mezcla de fenol y cloroformo, y se precipitó con etanol. Este fragmento de DNA se ligó con pBluescript KS(+) escindido con ClaI y BamHI,. La escherichia coli JM109 (suministrada por Takara Shuzo Co., Ltd.) se transformó de la forma habitual utilizando el DNA plásmido resultante. Este se colocó en placas sobre un medio L de agar que contenía 100 \mug/mL de ampicilina para obtener una transformante. Se preparó un plásmido a partir de la transformante mediante un método de bacteriolisis alcalina, la secuencia de bases se determinó y se identificó que la base deseada estaba sustituida. La determinación de la secuencia de bases se realizó por el método de Sanger et al. [J. Mol. Biol. 143, 161 (1980)] utilizando el kit Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing (suministrado por Applied Biochemical). De esta forma, se produjo el gen mutante que codifica la fosfatasa mutante en la que el resto 74º glicina (GGG) de la proteína de maduración se sustituyó por el resto ácido aspártico (G*A*T). Este plásmido que contiene el gen mutante se denominó pEPI310 (ejemplo 15).
El procedimiento mencionado anteriormente se repitió utilizando el plásmido que tiene la mutación introducida en él como plantilla para introducir de forma acumulativa la mutación dirigida. Se produjo un plásmido a partir de la transformante mediante el método de bacteriolisis alcalina, se determinó la secuencia de bases, y se identificó que la base deseada se había sustituido. Los genes mutantes resultantes que codifican la fosfatasa mutante y los lugares de mutación se muestran en la tabla 12. El resto aminoácido en el lugar de mutación indica un resto aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la proteína madura representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias.
1
Cada una de las escherichia coli JM109/pEPI330, escherichia coli JM109/pEPI340, escherichia coli JM109/
pEPI350, escherichia coli JM109/pEPI360, escherichia coli JM109/pEPI370, escherichia coli JM109/pEPI380, escherichia coli JM109/pEPI390 y escherichia coli JM109/pEPI400 en cada una de las que se había introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante, y la escherichia coli JM109/pEPI305 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, se inocularon en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Las células se recogieron de 2 L de la disolución de cultivo de cada una de las cepas por centrifugación, y se lavaron una vez con una disolución salina fisiológica. Las células se pusieron en suspensión en 50 mL de una disolución tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0), y se trataron con ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para romper las células. La disolución tratada de esta forma se centrífugo para eliminar las fracciones insolubles y preparar un extracto libre de células. Cada una de las fosfatasas ácidas se purificaron a partir de cada uno de los extractos libres de células mediante el método descrito en el ejemplo 4. Cada uno de los productos enzimáticos se uniformizaron en la electroforesis por SDS-poliacrilamida.
Se midió la constante de velocidad de la inosina en la transfosforilación de la fosfatasa ácida mutante purificada y de la fosfatasa ácida de tipo salvaje, y los resultados se muestran en la tabla 13. Se encontró que la enzima mutante expresada en la E. Coli JM109/pEPI330 que tiene productividad mejorada del éster nucleósido-5'-fosfato como se ha descrito en el ejemplo 15, tiene la V_{max} disminuida pero el valor de Km de la inosina disminuido de manera importante, lo que significa una afinidad por la inosina aumentada en dos veces o más en comparación con la enzima de tipo salvaje expresada en la E. coli JM109/pEPI305. Esto sugirió que la productividad del éster nucleósido-5'-fosfato de esta enzima mutante se mejoró de manera importante no sólo por la disminución en la actividad nucleotidasa, sino también por la mejora de la afinidad por el nucleósido que fue un factor importante. Consecuentemente, se esperaba que el aumento en la afinidad por el nucleósido condujera a la mejora de la productividad.
Las nuevas enzimas mutantes expresadas en la E. coli JM109 en la que se ha introducido el nuevo gen de la enzima mutante producido en este ejemplo presentaron una afinidad por la inosina que fue más mejorada que la de la E. coli JM109/pEPI330 descrita en el ejemplo 15. Por lo tanto, se esperaba que la productividad del éster nucleósido-5'-fosfato hubiera mejorado. Además, la enzima mutante expresada en la E. coli JM109/pEPI380 no solo mejoró la afinidad por la inosina, sino que también aumentó el valor de la V_{max} en comparación con la enzima de tipo salvaje. Aún más, se esperaba que la productividad del nucleósido-5'-fosfato hubiera mejorado.
TABLA 13
Cepa de la enzima Km (mM) V_{max} (unidad/mg)
E. Coli JM 109/pEPI305 202 1,83
E. Coli JM 109/pEPI305 109 1,39
E. Coli JM 109/pEPI305 85 1,03
E. Coli JM 109/pEPI305 85 0,93
E. Coli JM 109/pEPI305 55 1,33
E. Coli JM 109/pEPI305 42 1,15
E. Coli JM 109/pEPI305 42 2,60
E. Coli JM 109/pEPI305 42 2,58
E. Coli JM 109/pEPI305 43 2,11
Ejemplo 20 Producción del ácido 5'-inosínico utilizando la cepa que contiene el nuevo gen de la fosfatasa ácida mutante
Cada una de las escherichia coli JM109/pEPI330, escherichia coli JM109/pEPI340, escherichia coli JM109/
pEPI360, escherichia coli JM109/pEPI370 y escherichia coli JM109/pEPI380, en cada una de las que se había introducido el plásmido que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante se inocularon en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron ácido pirofosfórico (15 g/dL) y 8 g/dL de inosina en una disolución tampón de acetato (pH 4,0). A esta disolución se le añadió la cepa de E. coli JM109 en la que se habían introducido los genes de la fosfatasa ácida mutante y de tipo salvaje mencionadas anteriormente, de forma que la concentración alcanzada fue de 200 mg/dL, expresada en peso seco de las células. La reacción se realizó a 35ºC durante 32 horas manteniendo el pH a 4,0, y se midió la cantidad de ácido 5'-inosínico formado a lo largo del tiempo. El ácido inosínico formado era sólo ácido 5'-inosínico, y no se observó en absoluto formación de ácido 2'-inosínico ni de ácido 3'-inosínico como subproductos. Los resultados se muestran en la figura 8.
La E. coli JM109/pEPI330 descrita en el ejemplo 15 mostró la acumulación de ácido 5'-inosínico en gran cantidad. Aunque todavía quedaba sustrato, la formación de ácido 5'-inosínico se detuvo cuando la cantidad de ácido 5'-inosínico acumulado alcanzó la cantidad de 7,5 g/dL, y la cantidad de ácido 5'-inosínico no aumentó más. Por el contrario, la cepas que contienen el nuevo gen de la fosfatasa ácida mutante proporcionaron una gran cantidad de ácido 5'-inosínico acumulado. Especialmente, las reacciones que utilizan la E. coli JM109/pEPI370 y la E. coli JM109/pEPI380, proporcionaron la cantidad acumulada más grande de ácido 5'-inosínico. Además, la velocidad de reacción fue elevada, mostrando que la productividad del ácido 5'-inosínico se mejoró además de forma importante. Particularmente, en la E. coli JM109/pEPI380, la velocidad de reacción fue alta, y mostró una reactividad bastante elevada.
Ejemplo 21 Producción de varios ésteres nucleósido-5'-fosfato utilizando una cepa que contiene el nuevo gen de la fosfatasa ácida mutante
Se inoculó E. coli JM109/pEPI380 en la que se había introducido el plásmido que contiene el nuevo gen de la fosfatasa ácida mutante en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubó a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron ácido pirofosfórico (15 g/dL) y 8 g/dL de inosina, guanina, uridina o citidina como aceptores de fosfato en una disolución tampón de acetato 100 mM (pH 4,5). A esto se le añadió la cepa mencionada anteriormente, de forma que la concentración alcanzada fue de 100 mg/dL, expresada en peso seco de las células. La reacción se realizó a 35ºC durante 12 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de éster nucleósido-5'-fosfato formado se muestra en la tabla 14. La fosforilación se produjo bien con cualquiera de los nucleósidos para formar y acumular los correspondientes ésteres nucleósido-5'-fosfato. El nucleótido formado fue sólo éster nucleósido-5'-fosfato, y no se observó en absoluto la formación de éster nucleósido-2'-fosfato ni de éster nucleósido-3'-fosfato como subproductos.
TABLA 14
Nucleósido Producto Cantidad producida (g/dL)
Inosina Ácido 5'-inosínico 12,05
Guanosina Ácido 5'-guanílico 5,78
Uridina Ácido 5'-uridílico 13,28
Citidina Ácido 5'-citidílico 10,65
Ejemplo 22 Producción de ácido 5'-inosínico utilizando una cepa que contiene el nuevo gen de la fosfatasa ácida y varios compuestos de ácido fosfórico como donantes de fosfato
Se inoculó E. coli JM109/pEPI380 en la que se ha introducido el plásmido que contiene el nuevo gen de la fosfatasa ácida mutante en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivó a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron inosina (6 g/dL), y 15 g/dL de un tripolifosfato, un polifosfato (Polygon P, nombre comercial de un producto de Chiyoda Kagaku K. K.), fenilacetato de disodio o carbamilfosfato de disodio, en una disolución tampón de acetato 100 mM (pH 4,0). A esto se le añadió la cepa mencionada anteriormente de manera que se alcanza una concentración de 100 mg/dL, expresada en peso seco de las células. La reacción se realizó a 35ºC durante 12 horas manteniendo el pH a 4,0. La cantidad de ácido 5'-inosínico formado se muestra en la tabla 15. El ácido 5'-inosínico se formó y se acumuló con buena eficacia con cualquiera de los donantes de fosfato. Especialmente, cuando se utilizó un polifosfato como donante de fosfato el ácido 5'-inosínico se acumuló en la cantidad más elevada.
TABLA 15
Donante de fosfato Ácido 5'-inosínico formado (g/dL)
Tripolifosfato de sodio 10,84
Polifosfato de sodio 13,35
Fenilfosfato de disodio 12,84
Carbamilfosfato de disodio 12,42
Acetilfosfato de potasio y litio 10,65
Ejemplo 23 Aislamiento de gen de la fosfatasa ácida derivado a partir del cromosoma de Providencia stuartii y determinación de la secuencia de nucleótidos del gen
Se sintetizaron los oligonucleótidos PRP1 y PRP2, que tienen las secuencias de nucleótidos ilustradas en las secuencias SEQ ID NO: 19 y 20 respectivamente en el listado de secuencias. Estos oligonucleótidos se diseñan para amplificar el gen que codifica la fosfatasa ácida de la providencia stuartii en función de la secuencia de nucleótidos conocida del gen que codifica la fosfatasa ácida de la providencia stuartii (Base de datos del EMBL, número de inventario X64820).
Se extrajo DNA cromosómico de células microbianas cultivadas de providencia stuartii ATCC 29851 según el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res. 4.321, 8 (1980)]. Se añadieron el DNA cromosómico (0,1 ng) como plantilla, los oligonucleótidos PRP1 y PRP2 (2,5 \mumoles de cada uno) como iniciadores y Taq DNA polimerasa (2,5 unidades, producida por Takara Shuzo) a una disolución tampón de Tris-HCl 100 mM (pH 8,3, 100 \muL) que contenía dATP, dCTP, dGTP, dTTP (cada uno de ellos 200 \muM), cloruro de potasio (50 mM) y cloruro de magnesio (1,5 mM), para realizar una reacción PCR en la que se repetía 30 veces un ciclo que comprendía periodos de 30 segundos a 94ºC, 2 minutos a 55ºC y 3 minutos a 72ºC. La disolución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa, seguida por recuperación del fragmento de DNA amplificado de aproximadamente 1 kbp mediante polvos de vidrio (fabricado por Takara Shuzo). Se realizó la digestión del fragmento de gen con BamHI, que se ligó con pUC118 y que había sido sometido a digestión con BamHI. El plásmido obtenido como se ha descrito anteriormente, se denominó pPRP100.
Se midieron la actividad fosfomonoesterasa y la actividad de transfosforilación de la escherichia coli JM109/
pPRP100, una transformante en la que se introdujo el pPRP100. Como resultado, la cepa presentó actividad de transfosforilación del nucleósido, así como actividad fosfomonoestearasa.
El plásmido se extrajo según el método de lisis alcalina a partir de la transformante de escherichia coli JM109/
pPRP100 para determinar la secuencia de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos de un marco de lectura abierto determinado y una secuencia de aminoácidos de la proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos se muestran en las secuencias SEQ ID NO: 21 y 22 del listado de secuencias. La secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto es completamente coincidente con la secuencia de nucleótidos del gen conocido de la fosfatasa ácida de providencia stuartii.
Ejemplo 24 Aislamiento de los genes de la fosfatasa ácida derivados a partir de los cromosomas de enterobacter aerogenes, klebsiella planticola y serratia ficaria y determinación de la secuencia de nucleótidos de los genes
Se extrajo DNA cromosómico de células microbianas cultivadas de enterobacter aerogenes IFO 12010, klebsiella planticola IFO 14939, y serratia ficaria IAM 13540 según el método de Murray y Thomson [Nucl. Acid. Res. 4.321, 8 (1980)]. Luego, según el método descrito en el ejemplo 7 (2), se construyó una biblioteca de expresión del gen cromosómico que comprendía aproximadamente 20.000 transformantes de escherichia coli JM109 y se investigó para obtener transformantes que mostraran actividad de transfosforilación. Se consideró que cada una de estas transformantes hospedaba el gen de la fosfatasa ácida derivado de cada una de las cepas originales.
El DNA plásmido se extrajo a partir de una de las transformantes de escherichia coli que se consideró que tenía el gen de la fosfatasa ácida derivado de la enterobacter aerogenes IFO 12010 según un método de lisis alcalina y se analizó el DNA insertado del plásmido. El plásmido anterior se denominó pENP100. Un mapa de enzimas de restricción del DNA insertado derivado de la enterobacter aerogenes IFO 12010 se muestra en la figura 9.
Como resultado de especificar la región del gen de la fosfatasa ácida mediante subclonación, se sugirió que el gen de la fosfatasa ácida está contenido en el fragmento de 1,6 kbp escindido por las enzimas de restricción Sall y Kpnl para construir el plásmido. El plásmido resultante se denominó pENP110.
Según el procedimiento descrito anteriormente, el DNA plásmido se extrajo de una de las transformantes de escherichia coli que se consideró que tenía el gen de fosfatasa ácida derivado de klebsiella planticola IFO 14939 según un método de lisis alcalina y se analizó el DNA insertado del plásmido. El plásmido anterior se denominó pKL100. Un mapa de enzimas de restricción del DNA insertado derivado de klebsiella planticola IFO 14939 se muestra en la figura 10.
Como resultado de especificar la región del gen de la fosfatasa ácida mediante subclonación, se sugirió que el gen de la fosfatasa ácida está contenido en el fragmento de 2,2 kbp escindido mediante las enzimas de restricción Kpnl y EcoRI. Luego, el fragmento Kpnl-EcoRI se ligó con el pUC118 que se sometió a digestión con Kpnl y EcoRI para construir un plásmido. El plásmido resultante se denominó pKL110.
Similarmente, se extrajo el DNA plásmido de una de las transformantes de escherichia coli que se consideró que tenía el gen de la fosfatasa ácida derivado de la serratia ficaria IAM 13540 según un método de lisis alcalina y se analizó el DNA insertado del plásmido. El plásmido anterior se denominó pSEP100. Un mapa de enzimas de restricción del DNA insertado derivado de la serratia ficaria IAM 13540 se muestra en la figura 11.
Como resultado de especificar la región del gen de la fosfatasa ácida mediante subclonación, se sugirió que el gen de la fosfatasa ácida está contenido en el fragmento de 1,4 kbp escindido mediante enzimas de restricción HindIII. Luego, el fragmento HindIII se ligó con el pUC118 que se sometió a digestión con HindIII para construir un plásmido. El plásmido resultante se denominó pSEP110.
Luego, los DNA plásmidos se extrajeron a partir de las transformantes, escherichia coli JM109/pENP110, escherichia coli JM109/pKLP110 y escherichia coli JM109/pSEP110, en las que se habían introducido pNEP110, pKLP110 y pSEP110 respectivamente, según un método de lisis alcalina. Las secuencias de nucleótidos de los insertos de estos plásmidos se determinaron según un el método descrito en el ejemplo 8. Las secuencias de nucleótidos determinadas de los marcos de lectura abiertos de los insertos se muestran en la secuencia SEQ ID NO: 23 para la enterobacter aerogenes IFO 12010, en la secuencia SEQ ID NO: 25 para la klebsiella planticola IFO 14939 y en la secuencia SEQ ID NO: 27 para la serratia ficaria IAM 13540. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos deducidas se muestran en las secuencias SEQ ID NO: 24, 26 y 28 respectivamente. Debido al hecho de que las transformantes que hospedan los plásmidos que contienen estos fragmentos presentaron actividad de transfosforilación, se identificó que estos marcos de lectura abiertos eran los genes de la fosfatasa ácida objetivos.
Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas se compararon por homología respectivamente con secuencias conocidas. Se utilizaron las bases de datos EMBL y SWISS-PROT. Como resultado, se ha demostrado que los genes ilustrados en las secuencias SEQ ID NO: 23, 25 y 27 en el listado de secuencias son genes nuevos. Se supuso que la proteína codificada por el gen derivado de la enterobacter aerogenes IFO 12010 comprende 248 restos aminoácidos, la proteína codificada por el gen derivado de la klebsiella planticola IFO 14939 comprende 248 restos aminoácidos y que la proteína codificada por el gen derivado de la serratia ficaria IAM 13540 comprende 244 restos aminoácidos. Hay una posibilidad de que estas proteínas puedan ser proteínas precursoras como las fosfatasas ácidas derivadas de la morganella morganii y la escherichia blattae.
Las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos se muestran en la figura 12 en nomenclatura de una letra, junto con la secuencia de aminoácido deducida de la fosfatasa ácida derivada de la morganella morganii NCIMB 10466 obtenida en el ejemplo 8, la de la escherichia blattae JCM1650 obtenida en el ejemplo 12 y la secuencia de aminoácidos conocida de la fosfatasa ácida de la providencia stuartii (EMBL número de inventario X64820). Los restos aminoácidos comunes entre todas las secuencias de aminoácidos se indican con asteriscos debajo de las secuencias en la figura 12.
Como se muestra en la figura 12, las secuencias de aminoácidos de las fosfatasas ácidas derivadas de seis cepas son muy homogéneas entre ellas y 130 restos aminoácidos son comunes entre todas las secuencias de aminoácidos. Por lo tanto, se supone que estas fosfatasas ácidas tienen funciones similares.
Ejemplo 25 Amplificación de la actividad por el gen que expresa la fosfatasa ácida derivado de enterobacter aerogenes, klebsiella planticola y serratia ficaria
Se inocularon escherichia coli JM109/pPRP100 construida en el ejemplo 23, escherichia coli JM109/pENP110, escherichia coli JM109/pKLP110 y escherichia coli JM109/pSEP110 construidas en el ejemplo 24 en un medio L (50 mL) que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se cultivaron a 37ºC durante 16 horas. Las células microbianas se recogieron de estos cultivos por centrifugación, y se lavaron una vez con suero fisiológico salino. Las células microbianas se pusieron en suspensión en una disolución tampón de fosfato de potasio 100 mM (5 mL, pH 7,0), y se rompieron mediante un tratamiento por ultrasonidos realizado a 4ºC durante 20 minutos. Las disoluciones tratadas se centrifugaron para eliminar la fracción insoluble, y de esta forma se prepararon extractos libres de células.
Las actividades de transfosforilación de los extractos libres de células obtenidos se midieron utilizando controles de extractos libres de células preparados a partir de providencia stuartii ATCC 29851, enterobacter aerogenes IFO 12010, klebsiella planticola IFO 14939, serratia ficaria IAM 13540 y escherichia coli JM109 transformadas con el plásmido pUC118 de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 16. Las actividades de transfosforilación fueron bajas en todas las cepas de tipo salvaje. La actividad de transfosforilación no se detectó en la escherichia coli JM109/pUC118. Por otra parte, las transformantes de la escherichia coli JM109 en las que se introdujeron los genes de la fosfatasa ácida exhibieron actividades de transfosforilación elevadas en comparación con las cepas de tipo salvaje. Según el resultado, se ha demostrado que cada uno de los fragmentos de DNA introducidos permiten que la escherichia coli exprese la fosfatasa ácida a un nivel elevado.
TABLA 16
Cepa microbiana Actividad de transfosforilación (unidades/mg)
Providencia stuartii ATCC 29851 0,005
Enterobacter aerogenes IFO 12010 0,002
Klebsiella planticola IFO 14939 0,002
Serratia ficaria IAM 13450 0,001
Escherichia coli JM109/pUC118 no detectado
Escherichia coli JM109/pPRP100 0,833
Escherichia coli JM109/pENP110 0,301
Escherichia coli JM109/pKLP110 0,253
Escherichia coli JM109/pSEP110 0,123
Ejemplo 26 Producción de un gen de la fosfatasa ácida mutante que tiene estabilidad térmica mejorada
Como se ha descrito en los ejemplos 20, 21 y 22 la cepa que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante derivada de la E. blattae producida en el ejemplo 19 expresó una cantidad considerable de la fosfatasa ácida. En la producción del ácido 5'-inosínico a partir de ácido pirofosfórico e inosina utilizando esta cepa, el ácido 5'-inosínico se formó y se acumuló con un alto rendimiento de conversión. La temperatura de reacción óptima de esta fosfatasa ácida fue 35ºC. Sin embargo, cuando esta reacción se realizó a temperatura más alta, la velocidad de la reacción aumentó y la reacción se realizó aumentando la concentración de nucleósido del aceptor de fosfato en la disolución de reacción. Consecuentemente, se esperaba que el éster nucleósido-5'-fosfato se podría producir más eficazmente durante un período de tiempo más corto. Así, la estabilidad térmica de la enzima se mejoró introduciendo la mutación en el gen de la fosfatasa ácida derivado de la E. blattae clonado en el ejemplo 19 por el método de mutación dirigida utilizando PCR.
Se utilizó el plásmido pEPI380 que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida mutante derivada de la E. blattae JCM1650 descrito en el ejemplo 19, y la mutación dirigida se introdujo en este DNA plásmido mediante un método de ingeniería genética para producir el gen que codifica la fosfatasa ácida mutante que tiene la estabilidad térmica aumentada. El pEPI380 es un DNA plásmido obtenido enlazando un fragmento de DNA de 2,4 Kbp que contiene el gen que codifica la fosfatasa ácida mutante derivada de E. blattae JCM1650 y escindida con endonucleasas de restricción C1al y BamHI a pBluescript KS(+) (suministrado por Stratagene) escindido con C1al y BamHI. Se supone que la secuencia de aminoácidos de la proteína madura anticipada a partir de la secuencia de bases del gen que codifica la fosfatasa ácida son los 11 restos aminoácidos mostrados en la tabla 12 en el ejemplo 19, en la secuencia representada por la secuencia SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias.
Los oligonucleótidos MUT300 (SEQ ID NO: 9 en el listado de secuencias), MUT400 (SEQ ID NO: 29 en el listado de secuencias) y MUT410 (SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias) que tienen las secuencias mostradas en la tabla de secuencias se sintetizaron por el método de la fosfoamidita utilizando un sintetizador de DNA (Modelo 394 suministrado por Applied Biosystem).
Se produjo un gen mutante que codifica la fosfatasa mutante en la que el resto 104º ácido glutámico (GAG) de una proteína de maduración se sustituyó con un resto glicina (GG*T*) por el método con PCR, como en el ejemplo 15, utilizando el pEPI380 descrito en el ejemplo 19 como plantilla y MUT300 y MUT410 como iniciadores para introducir la mutación. El plásmido que contiene el gen mutante se denominó pEPI410. Similarmente, se produjo un gen mutante que codifica una fosfatasa mutante en el que el resto 151º treonina (ACC) se sustituyó por un resto alanina (G*CC) utilizando pEPI380 como plantilla y los oligonucleótidos MUT300, MUT310 y MUT420 como iniciadores para introducir la mutación. Este plásmido que contiene el gen mutante se denominó pEPI420.
Se produjo un plásmido a partir de la transformante de E. coli JM109 en la que se habían introducido los plásmidos pEPI410 y pEPI420 que contienen el gen de la fosfatasa mutante mediante el método de bacteriolisis alcalina, se determinó la secuencia de bases y se identificó que se había sustituido la base deseada.
Se inocularon cada una de las E. coli JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420 en las que se había introducido el gen de la fosfatasa ácida mutante como se han producido en este ejemplo y E. coli JM109/pEPI380 descrita en el ejemplo 19 en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas. Las células se recogieron de 50 mL de la disolución de cultivo de cada una de las cepas, y se lavaron una vez con una disolución de suero salino fisiológico. Estas células se prepararon en suspensión en 5 mL de una disolución tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0), y se trataron con ultrasonidos a 4ºC durante 20 minutos para moler las células. La disolución así tratada se centrifugó para eliminar las fracciones insolubles y preparar un extracto libre de células.
El extracto libre de células formado a partir de cada una de las cepas se calentó a temperaturas que iban de 0ºC a 80ºC con un pH de 7,0 durante 30 minutos. Después de finalizar el calentamiento, se realizó la transfosforilación en las condiciones de reacción estándar de pH de 4,0 y 30ºC utilizando los extractos libres de células tratados a varias temperaturas, y se midió la actividad residual. Los resultados se muestran en la figura 13. La enzima mutante expresada en la E. coli JM109/pEPI380 descrita en el ejemplo 19 fue estable en el tratamiento a 40ºC durante 30 minutos, pero la disminución en la actividad se observó a temperaturas más altas. Por el contrario, la nueva enzima mutante expresada en la E. coli JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420, en las que se había introducido el nuevo gen de la enzima mutante como se ha producido en este ejemplo, mejoraron la estabilidad térmica, y la disminución de la actividad no se observó incluso durante el tratamiento a 50ºC durante 30 minutos. Se esperaba por lo tanto que cuando se produjera un éster nucleósido-5'-fosfato utilizando estas cepas a alta temperatura, la productividad fuera adicionalmente mejorada.
Ejemplo 27 Producción del ácido 5'-inosínico y ácido 5'-guanílico utilizando una cepa que contiene el gen de la fosfatasa ácida mutante que tiene la estabilidad térmica mejorada
Se inocularon cada una de las E. coli JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420 en las que se había introducido el gen de la fosfatasa ácida mutante y E. coli JM109/pEPI380 descrita en el ejemplo 19 en 50 mL de un medio L que contenía 100 \mug/mL de ampicilina y 1 mM de IPTG, y se incubaron a 37ºC durante 16 horas.
Se disolvieron ácido pirofosfórico (15 g/dL) y 8 g/dL de inosina o guanosina en un tampón de acetato (pH 4,0). A esto se le añadió la cepa de E. coli JM109 en la que se había introducido cada gen de la fosfatasa ácida mutante de manera que se alcanzara una concentración de 100 mg/dL expresada en peso seco de las células. La reacción se realizó a 50ºC durante 9 horas mientras se mantenía el pH a 4,0 y se midió la cantidad de ácido 5'-inosínico y de ácido 5'-guanílico formados. Los resultados se muestran en la tabla 17. El éster nucleósido fosfato formado fue solo un éster nucleósido-5'-fosfato, y no se observó en absoluto la formación de éster nucleósido-2'-fosfato ni de éster nucleósido-3'-fosfato como productos secundarios. La reacción se realizó también a 35ºC durante 12 horas utilizando la cepa de E. coli JM109/pEPI380 como control. Los resultados se muestran también en la tabla 17.
Como se ha descrito en el ejemplo 21, el éster nucleósido-5'-fosfato se formó y se acumuló eficazmente con E. coli JM109/pEPI380. Por el contrario, cuando la reacción se realizó utilizando E. coli JM109/pEPI410 y E. coli JM109/pEPI420 en las que se había introducido el nuevo de la fosfatasa ácida mutante derivado de la E. blattae como se produjo en el ejemplo 26, se formaron y se acumularon ácido 5'-inosínico o ácido 5'-guanílico en la misma cantidad durante un período de tiempo más corto. Por lo tanto, el éster nucleósido-5'-fosfato se podría producir más eficazmente. Especialmente cuando se utilizó E. coli JM109/pEPI420 no solo se acortó el tiempo de reacción, sino que también los ácidos 5'-inosínico y 5'-guanílico se acumularon en cantidades más grandes, y se demostró una productividad bastante elevada.
TABLA 17
Cepa Temperatura Tiempo de Cantidad de ác. Cantidad de ác.
de reacción reacción 5'-inosínico 5'-guanílico
(ºC) (h) formado (g/dL) formado (g/dL)
E. Coli 30 12 12,05 5,78
JM109/pEPI380
E. Coli 50 9 11,85 5,80
JM109/pEPI410
E. Coli 50 9 12,60 6,11
JM109/pEPI420
INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Ajinomoto Co., Inc.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Nº 15-1, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Tokio
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Japón
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 104 Japón
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para producir éster nucleósido-5'-fosfato
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 30
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
CLASE DE MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Patentin edición 1.0, Versión 1.25 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip1.000000\baselineskip
NÚMERO DE SOLICITUD: 97309365.1
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: morganella morganii 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: NCIMB 10466
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
26
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 720 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: morganella morganii 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: NCIMB 10466
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...747
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...60
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 61...747
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
2
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 249 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: morganella morganii 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: NCIMB 10466
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
3
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 229 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: morganella morganii 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: NCIMB 10466
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4
4
40
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO DE PROTEÍNA: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: escherichia blattae 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
27
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 750 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: escherichia blattae 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...747
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...54
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat...péptido
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 55...747
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6
5
50
51 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 249 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: escherichia blattae 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
6
60
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 231 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: escherichia blattae 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: JCM 1650
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8
7
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 9
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCTCGAGGTC GACGGTATATCG 
\hfill
20
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 10
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ATTCGCCACATGGCCACTGC T 
\hfill
21
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 11
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG 
\hfill
22
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 12
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGCATCTGCC TGCGCCTGCT TAC 
\hfill
23 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 13
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AACGCGCCGT AGAAAGCATT 
\hfill
20
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 14
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GTCCTGGTCT TTGGTATTAC A 
\hfill
21
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 15
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CACATCGCCA GCGGCCAGGT CTGCAT 
\hfill
26
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 16
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCATATAGTG TTCTTTCGCG C 
\hfill
21 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 17
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ATTACAGGTT TCGACCCCAT AA 
\hfill
22
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 18
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
TGATGCATGT CCGGGCTGTC TTTTT 
\hfill
25
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 19
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: sí
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT 
\hfill
25
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 20
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA 
\hfill
25 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 21
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 747 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: providencia stuartii 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 29851
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...744
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21
\vskip1.000000\baselineskip
8
80 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 22
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: providencia stuartii 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: ATCC 29851
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22
9
90 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 23
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 744 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: enterobacter aerogenes 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: IFO 12010
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...744
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23
\vskip1.000000\baselineskip
10
100 
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 24
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: enterobacter aerogenes 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: IFO 12010
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24
11
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 25
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 747 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: klebsiella planticola 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: IFO 14939
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...747
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\newpage
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 26
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 248 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: klebsiella planticola 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: IFO 14939
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26
13
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 27
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 735 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: serratia ficaria 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: IAM 13540
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1...732
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27
\vskip1.000000\baselineskip
14
140
141
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 28
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 244 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: serratia ficaria 
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: IAM 13540
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28
15
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 29
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCCGGCGTCA CCAATCATAT T 
\hfill
21
INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEQ ID NO: 30
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro DNA...DNA sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCCGGTAGAG GCATGCCCGG A 
\hfill
21

Claims (15)

1. Un método para producir éster nucleósido-5'-fosfato que comprende las etapas de permitir que una fosfatasa ácida actúe en condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato para producir éster nucleósido-5'-fosfato, y recogerlo,
en el que la fosfatasa ácida tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que consta de las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28, y dicha fosfatasa ácida tiene una mutación o mutaciones que aumenta la afinidad por el nucleósido y/o la estabilidad térmica con respecto a dicha secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que consta de las secuencias SEQ ID NOs: 4, 8, 22, 24, 26 y 28,
y en el que la fosfatasa ácida tiene una secuencia de aminoácidos que es distinta de:
i.
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, mutada sólo en el resto 72º glicina y/o el resto 151º isoleucina;
ii.
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, mutada sólo en el resto 74º glicina y/o el resto 153º isoleucina;
iii.
las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 22, 24 ó 26 mutadas sólo en el resto 92º glicina y/o el resto 171º isoleucina; y
iv.
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28, mutada sólo en el resto 88º glicina y/o el resto 167º isoleucina;
2. Un método para producir éster nucleósido-5'-fosfato que comprende las etapas de permitir que un microorganismo actúe en condiciones de pH de 3,0 a 5,5 sobre un nucleósido y un donante de grupo fosfato para producir éster nucleósido-5'-fosfato, y recogerlo, en el que el microorganismo se transforma con un DNA recombinante que comprende un gen que codifica una fosfatasa ácida según la reivindicación 1.
3. El método según las reivindicaciones 1 y 2, en el que el valor de Km para el nucleósido es inferior a 100.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida conserva más actividad que la del tipo salvaje después de haberse mantenido a 50ºC durante 30 minutos a pH 7,0.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida que tiene una afinidad por el nucleósido aumentada se deriva de una bacteria que pertenece al género escherichia, al género morganella, al género providencia, al género enterobacter, al género klebsiella o al género serratia.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha mutación se elige entre el grupo que consta de las sustituciones del resto 63º leucina, el resto 65º alanina, el resto 66º ácido glutámico, el resto 69º asparagina, el resto 71º serina, el resto 72º serina, el resto 74º glicina, el resto 85º serina, el resto 92º alanina, el resto 94º alanina, el resto 104º ácido glutámico, el resto 116º ácido aspártico, el resto 130º serina, el resto 135º treonina, el resto 136º ácido glutámico, el resto 151º treonina y/o el resto 153º isoleucina con otro aminoácido en la secuencia SEQ ID NO: 8.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 y que está mutada mediante una sustitución del resto 74º glicina y/o el resto 153º isoleucina, y adicionalmente comprende mutaciones elegidas entre el grupo que consta de sustituciones del resto 63º leucina, el resto 65º alanina, el resto 66º ácido glutámico, el resto 69º asparagina, el resto 71º serina, el resto 72º serina, el resto 85º serina, el resto 92º alanina, el resto 94º alanina, el resto 104º ácido glutámico, el resto 116º ácido aspártico, el resto 130º serina, el resto 135º treonina, el resto 136º ácido glutámico y/o el resto 151º treonina.
8. El método según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el resto 63º leucina se sustituye con un resto glutamina, el resto 65º alanina se sustituye con un resto glutamina, el resto 66º ácido glutámico se sustituye con un resto alanina, el resto 69º asparagina se sustituye con un resto ácido aspártico, el resto 71º serina se sustituye con un resto alanina, el resto 72º serina se sustituye con un resto alanina, el resto 74º glicina se sustituye con un resto ácido aspártico, el resto 85º serina se sustituye con un resto tirosina, el resto 92º alanina se sustituye con un resto serina, el resto 94º alanina se sustituye con un resto ácido glutámico, el resto 104º ácido glutámico se sustituye con un resto glicina, el resto 116º ácido aspártico se sustituye con un resto ácido glutámico, el resto 130º serina se sustituye con un resto ácido glutámico, el resto 135º treonina se sustituye con un resto lisina, el resto 136º ácido glutámico se sustituye con un resto ácido aspártico, el resto 151º treonina se sustituye con un resto alanina y/o el resto 153º isoleucina se sustituye con un resto treonina.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fosfatasa ácida tiene estabilidad térmica mejorada y se elige entre el grupo que consta de:
\newpage
(a)
una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 102º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 149º treonina;
(b)
una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 104º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 151º treonina;
(c)
una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 22, 24 ó 26 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 122º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 169º treonina; y
(d)
una fosfatasa ácida que tiene una secuencia de aminoácidos que es esencialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28 y que tiene una mutación que es una sustitución del resto 118º ácido glutámico y/o una mutación que es una sustitución del resto 165º treonina.
10. El método según la reivindicación 9, en el que dicho resto ácido glutámico se sustituye con un resto glicina y/o dicho resto treonina se sustituye con un resto alanina.
11. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho donante de grupo fosfato se elige entre el grupo que consta de ácido polifosfórico o una de sus sales, ácido fenilfosfórico o una de sus sales, ácido acetilfosfórico o una de sus sales y carbamilfosfato o una de sus sales.
12. Una fosfatasa ácida mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 10.
13. Un gen que codifica la fosfatasa ácida según la reivindicación 12.
14. Un DNA recombinante que comprende el gen según la reivindicación 13.
15. Un microorganismo que hospeda el DNA recombinante según la reivindicación 14.
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