ES2344552T3 - Metodo para producir nucleosido difosfato usando polifosfato: amp fosfotransferasa. - Google Patents
Metodo para producir nucleosido difosfato usando polifosfato: amp fosfotransferasa. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para producir nucleósido difosfato en el que el nucleósido difosfato se produce enzimáticamente a partir de nucleósido monofosfato seleccionado entre IMP, CMP, DCMP, UMP y TMP usando una polifosfato:AMP fosfotransferasa (PAP) recombinante que está libre de actividad degradadora de AMP, dicha PAP: (i) teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; o teniendo una homología de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; o (ii) estando codificada por un gen de PAP que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; estando codificada por un gen de PAP que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2; estando codificada por un gen que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2; o estando codificada por un gen que hibrida con la secuencia de la SEC ID Nº 2 en condiciones rigurosas; comprendiendo dicho método el uso del nucleósido monofosfato a una concentración de 10 a 100 mM y de polifosfato a una concentración de 10 a 200 mM.
Description
Método para producir nucleósido difosfato usando
polifosfato: AMP fosfotransferasa.
Esta invención se refiere a un método para
producir nucleósido difosfato usando una polifosfato:AMP
fosfotransferasa.
Los recientes avances en ingeniería genética han
permitido la producción a gran escala de diversas enzimas a bajo
coste, y también se ha permitido un proceso económico usando una
reacción enzimática para la producción de sustancias
fisiológicamente activas valiosas, que se han producido
convencionalmente por medio de bioconversión usando una bacteria
vivas, fermentación o síntesis química.
Mientras tanto, una reacción enzimática que
requiere energía, como en el caso de fosforilación y aminación
necesita adenosin 5'-trifosfato (ATP) como su
donador de energía o donador de fosfato. En la transformación y
fermentación microbiana convencionales, el ATP fue suministrado por
el microorganismo empleado, mientras que, en el caso del proceso
enzimático, se requieren la adición de ATP al sistema de reacción y
el desarrollo de un sistema eficaz de regeneración de ATP.
Sin embargo, el proceso de síntesis económica de
ATP aún no se ha establecido y el ATP disponible en el mercado
sigue siendo muy caro. Además, el sustrato y la enzima usados en el
sistema común de regeneración de ATP, concretamente, la combinación
de fosfocreatina y fosfocreatina quinasa, o acetil fosfato y acetato
quinasa son muy caros, y su uso ha sido poco práctico y ha estado
limitado a nivel del laboratorio.
En contraste con dicho alto precio del ATP,
puede producirse adenosin 5'-monofosfato (AMP) a un
coste relativamente bajo. El ATP se produce actualmente mediante
síntesis química o usando microorganismo o levadura a partir de AMP
o adenina. Por consiguiente, ha sido muy esperado el desarrollo de
un proceso eficaz de regeneración de ATP que pueda usarse en el
sistema de reacción enzimática que usa el ATP, en el que el ATP se
produzca enzimáticamente a partir del relativamente económico AMP y
el ATP consumido se regenere eficazmente en lugar de añadir el caro
ATP.
Al construir un sistema práctico de
generación/regeneración de ATP, la selección del donador de fosfato
usado también es importante, y el polifosfato, que es económico y
estable, se ha considerado el candidato más prometedor como donador
de fosfato. Las enzimas que se sabe que están implicadas en el
metabolismo del polifosfato que también actúan con adenosin
nucleótido incluyen polifosfato quinasa y polifosfato:AMP
fosfotransferasa (en lo sucesivo en este documento abreviada como
"PAP").
La PAP es una enzima que fosforila AMP para
producir ADP usando polifosfato como donador de fosfato (J.
Bacteriol., 173, 6484-6488(1991)). Zenhder
et al., describió que un sistema de generación/regeneración
de ATP en el que AMP y polifosfato son los sustratos funciona,
cuando la PAP obtenida de Acinetobacter johnsonii se purifica
parcialmente, y la PAP parcialmente purificada se usa junto con
adenilato quinasa (Appl. Environ. Microbiol., 66,
2045-2051(2000)). Kameda et al.,
describió que, en el sistema de reacción enzimática en el que se
consume ATP para generar AMP, un sistema en el que se genera ATP a
partir de AMP usando polifosfato como donador de fosfato funciona
eficazmente cuando se usa la combinación de la PAP de Myxococcus
xanthus y polifosfato quinasa de E. coli.
Sin embargo, PAP está presente en la célula de
Acinetobacter johnsonii en una cantidad extremadamente
pequeña, y con respecto al uso de la PAP en bruto tal como extracto
celular, se ha señalado el problema de que la contaminación de las
enzimas que descomponen la sustancia implicada en la reacción (AMP,
ADP, ATP, sustrato de reacción y/o producto de reacción) puede
provocar la pérdida de eficacia de la reacción. Dicho problema
puede obviarse mediante el uso de PAP altamente purificada en lugar
de la enzima en bruto. La PAP, sin embargo, es muy inestable, y el
procedimiento de purificación de PAP es demasiado complicado para
adoptar dicha PAP purificada en un uso práctico.
Al abordar dicho problema, los inventores de la
presente invención estimaron que dicho problema puede abordarse
produciendo la PAP de Acinetobacter johnsonii en gran
cantidad usando una técnica de ADN recombinante. Sin embargo, la
secuencia de aminoácidos de la enzima y el gen para dicha enzima no
se han descrito en absoluto.
Los inventores de la presente invención han
tenido éxito en la producción en masa de la PAP en E. coli
construyendo un sistema de cribado adaptado para la clonación de
genes mediante actividad de PAP, y la clonación del gen que
codifica la PAP usando el sistema de cribado construido de este
modo. En el análisis de la PAP recombinante producida de este modo,
los inventores también descubrieron que la enzima tiene una
actividad específica extremadamente alta, y la combinación de dicha
enzima con adenilato quinasa permite la construcción de un sistema
eficaz de generación/regeneración de ATP.
De forma inesperada, los inventores también
descubrieron que la PAP recombinante tiene la actividad de
transferencia de fosfato usando polifosfato como donador de fosfato
para generar nucleósido difosfato incluso si el nucleósido
monofosfato no era AMP ni GMP, y esto constituye una diferencia
respecto a la PAP convencional obtenida a partir de
Acinetobacter johnsonii.
Aunque el nucleósido difosfato se ha mostrado
generalmente útil como un material de partida para sintetizar
enzimáticamente polinucleótido usado en instalaciones médicas o
químicas, su síntesis distaba de ser fácil. En el caso de la
bioconversión, la fosforilación no puede terminarse en la fase de
difosfato, y la fosforilación química fue la única manera
utilizable para la producción de nucleósido difosfato. Sin embargo,
la fosforilación química se asocia con el problema de que se
produce de forma simultánea la reacción secundaria que da como
resultado la formación de sub-productos, y el
aislamiento y purificación del nucleósido difosfato diana a partir
de la solución de reacción ha sido extremadamente complicada. En
vista de dicha situación, el desarrollo de un proceso eficaz para
sintetizar el nucleósido difosfato mediante fosforilación enzimática
del nucleósido monofosfato es altamente esperado, y la PAP se ha
considerado un candidato como enzima usada en la síntesis
enzimática.
Sin embargo, Zehnder et al., describió
que, la PAP de Acinetobacter johnsonii es específica de AMP,
y aunque se descubrió alguna transferencia de fosfato para GMP, no
se descubrió fosfotransfererencia en absoluto para otros
nucleótidos (CMP, UMP, e IMP) (Appl. Environ. Microbiol., 66,
2045-2051 (2000)), y se ha considerado que, la PAP
no puede usarse en la síntesis de nucleósido difosfato mediante
fosforilación enzimática del nucleósido monofosfato.
Los inventores de la presente invención
realizaron un estudio intensivo en base a los nuevos descubrimientos
que se han descrito anteriormente, y completaron la presente
invención. La PAP usada de acuerdo con la presente invención tiene
las propiedades físicas y químicas que se describen a
continuación:
- (A)
- acción: catalizar las siguientes dos reacciones:
NMP + PoliP_{(n)} \rightarrow NDP
+
PoliP_{(n-1)}
dNMP + PoliP_{(n)} \rightarrow
dNDP +
PoliP_{(n-1)}
- (en las que NMP representa nucleósido monofosfato, NDP representa nucleósido difosfato, dNMP representa desoxinucleósido monofosfato, dNDP representa desoxinucleósido difosfato, n representa el grado de polimerización del polifosfato, que es un número entero de hasta 100);
- (B)
- especificidad por el sustrato: específica para AMP, GMP, IMP, dAMP y dGMP, también actúa con CMP, UMP, dCMP y TMP;
- (C)
- peso molecular: de aproximadamente 55 a 56 Kd (kilodalton); y
- (D)
- actividad específica: al menos 70 unidades por 1 mg de proteína enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta invención usa una PAP que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº 1 en la que se ha producido la
deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos, como se
especifica mediante la reivindicación.
La PAP puede estar codificada por un gen de PAP
que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 o la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 en la que se ha producido
la deleción, sustitución o adición de uno o más aminoácidos, como
se especifica mediante la reivindicación.
La PAP también puede estar codificada por un gen
de PAP que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2 o la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2 en la que se ha producido
la deleción, sustitución o adición de uno o más nucleótidos, como
se especifica mediante la reivindicación.
La PAP puede estar codificada por un fragmento
de ADN que hibrida con el gen como se ha descrito anteriormente en
condiciones rigurosas, y que codifica el polipéptido que tiene
actividad de PAP.
Esta invención se refiere a un método para
producir nucleósido difosfato, en el que el nucleósido difosfato es
producido enzimáticamente a partir de nucleósido monofosfato usando
la PAP de la presente invención como enzima y polifosfato como
donador de fosfato, como se define adicionalmente mediante la
reivindicación.
Se describe un método para producir ATP, en el
que se produce ATP enzimáticamente a partir de AMP usando dos
enzimas, concretamente, la PAP de la presente invención y adenilato
quinasa como enzima y polifosfato como donador de fosfato.
También se describe un sistema de
generación/regeneración de ATP que comprende AMP, polifosfato, PAP y
adenilato quinasa.
Finalmente, se describe un método para producir
un compuesto usando una reacción enzimática que consume ATP, en el
que el ATP se regenera a partir del AMP simultáneamente con la
reacción enzimática usando un sistema de regeneración de ATP que
comprende polifosfato, PAP y adenilato quinasa.
La figura 1 es un mapa de restricción del
fragmento de ADN de aproximadamente 10 kb que incluye el gen de PAP
obtenido de la cepa 210A de Acinetobacter johnsonii. El gen
de PAP está incluido en el fragmento de ADN
SacI-HpaI.
La figura 2 muestra la primera mitad de la
secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de 2,5 kb que incluye
el gen de PAP, y la primera mitad de la secuencia de aminoácidos de
la PAP.
La figura 3 muestra la segunda mitad de la
secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de 2,5 kb que incluye
el gen de PAP, y la segunda mitad de la secuencia de aminoácidos de
la PAP.
La figura 4 muestra los resultados de la
evaluación de la estabilidad al pH de acuerdo con la PAP usada en
la presente invención.
La figura 5 muestra los resultados de la
evaluación de pH óptimo de acuerdo con la PAP usada en la presente
invención.
La figura 6 muestra los resultados de la
evaluación de estabilidad térmica de acuerdo con la PAP usada en la
presente invención.
La figura 7 muestra los resultados de la
evaluación de temperatura óptima de acuerdo con la PAP usada en la
presente invención.
La figura 8 muestra la síntesis de ADP y ATP a
partir de AMP usando polifosfato como donador de fosfato y usando
la PAP y adenilato quinasa.
La PAP de la presente invención tiene las
propiedades físicas y químicas que se describen a continuación.
(Véase también los Ejemplos como se presentarán más adelante.)
- (A)
- Acción: la PAP cataliza las siguientes dos reacciones:
NMP + PoliP_{(n)} \rightarrow NDP
+
PoliP_{(n-1)}
dNMP + PoliP_{(n)} \rightarrow
dNDP +
PoliP_{(n-1)}
- (en las que NMP representa nucleósido monofosfato, NDP representa nucleósido difosfato, dNMP representa desoxinucleósido monofosfato, dNDP representa desoxinucleósido difosfato, n representa el grado de polimerización del polifosfato, que es un número entero de hasta 100).
- (B)
- Especificidad por el sustrato: PAP actúa específicamente para AMP, GMP, IMP, dAMP y dGMP, y también actúa con CMP, UMP, dCMP y TMP.
- (C)
- Peso molecular: la PAP tiene un peso molecular de aproximadamente 55 a 56 Kd (kilodalton).
- (D)
- Actividad específica: la PAP tiene una actividad específica de al menos 70 unidades por 1 mg de proteína enzimática.
- (E)
- pH óptimo: aproximadamente pH 8,5.
- (F)
- Temperatura óptima: aproximadamente 50ºC.
- (G)
- estabilidad al pH: aproximadamente pH 7 a 9.
- (H)
- Estabilidad térmica: la PAP es estable hasta aproximadamente 50ºC.
La "unidad" usada en este documento es la
unidad medida en las siguientes condiciones, y 1 unidad corresponde
a la actividad para producir 1 \mumol de ADP a 37ºC en 1
minuto.
Se añade enzima de muestra a una solución tampón
Tris HCl 50 mM (pH 7,8) que contiene cloruro de magnesio 20 mM, AMP
10 mM y polifosfato (30 mM calculado en términos de fosfato
inorgánico) y la reacción se deja continuar incubando la
temperatura a 37ºC, y la reacción se termina en lo sucesivo mediante
un tratamiento térmico a 100ºC durante 1 minuto, y la cantidad de
ADP en la solución de reacción se mide mediante cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC).
La PAP usada en la presente invención tiene la
secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº 1 y, en
particular, la PAP recombinante producida mediante un proceso de ADN
recombinante es sustancialmente pura en términos de actividad
enzimática, y dicha PAP recombinante está libre de la actividad de
degradación de AMP que es desventajosa para la fosforilación del
AMP.
La secuencia de aminoácidos también puede ser
aquella en la que se ha producido la deleción, sustitución,
modificación o adición de uno o más aminoácidos como se especifica
mediante la reivindicación, siempre que se conserve la actividad de
catalizado de las reacciones como se ha descrito anteriormente. La
deleción, sustitución, modificación o adición de la secuencia de
aminoácidos puede inducirse mediante mutagénesis específica de sitio
(por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,
4662-5666(1984); Nucleic Acid Res. 10,
6487-6500(1982); Nature 316,
601-605(1985)) o similar que se conocían en
la técnica antes de la presentación de la presente invención. La
PAP de la presente invención también incluye una enzima que tiene
una homología de al menos el 90%, y más preferiblemente al menos el
95% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, siempre que
se conserve la actividad de catalizado de las reacciones como se ha
descrito anteriormente.
La PAP usada en la presente invención se prepara
clonando el gen que codifica la enzima que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1, típicamente, el gen de PAP
que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 de
Acinetobacter johnsonii, y usando este gen. Cuando se explica
en referencia a un caso ejemplar del gen de Acinetobacter
johnsonii, las figuras 2 y 3 muestran el resultado de
secuenciación de la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN
escindido por SacI y HpaI en el mapa de restricción de la figura 1,
y los números de la secuencia de nucleótidos 604 a 2031 en las
figuras 2 y 3 corresponden al gen estructural de PAP, y esta
secuencia es la misma que la secuencia de nucleótidos mostrada en la
SEC ID Nº 2.
Un gen que tiene la secuencia de nucleótidos de
la SEC ID Nº 2 en la que se ha producido la deleción, sustitución,
inserción o adición de uno o más nucleótidos en dicha secuencia,
como se especifica mediante la reivindicación; un gen que hibrida
con dicho gen en condiciones rigurosas; y un gen que tiene una
homología de al menos el 90%, y más preferiblemente al menos el 95%
con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 2 también
puede emplearse, siempre que el gen sea capaz de producir la PAP
usada en la presente invención.
Como en el caso de la secuencia de aminoácidos
que se ha descrito anteriormente, el gen en el que se ha producido
deleción, sustitución, inserción o adición de uno o más nucleótidos,
significa que el gen en el que el número nucleótidos que puede
delecionarse, sustituirse, insertarse o añadirse mediante la técnica
conocida en la técnica, tal como mutagénesis específica de sitio,
se ha delecionado, sustituido, insertado, o añadido. La hibridación
en condiciones rigurosas significa la hibridación usando una
solución que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a 8,76 g de
cloruro sódico y 4,41 g de citrato sódico disueltos en 1 litro de
agua), el 0,1% p/v de sal sódica de
N-lauroilsalcosina, el 0,02% p/v de SDS, y el 0,5%
p/v de agente bloqueante, en las condiciones de temperatura de
reacción de aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 20
horas.
El uso de un gen que comprende además la
secuencia SD (secuencia Shine-Dalgarno) cadena
arriba del gen que codifica la PAP también es favorable, puesto que
el rendimiento de la enzima puede mejorar marcadamente mediante el
uso de dicho gen.
La clonación de dicho gen, la preparación del
vector de expresión usando el fragmento de ADN clonado de este
modo, la preparación de la PAP usando dicho vector de expresión, y
similares son bien conocidas por los especialistas en la técnica de
biología molecular, y dicho proceso puede realizarse, por ejemplo,
usando el procedimiento descrito en el documento "Molecular
Cloning" (Maniatis et al. ed., Cold Spring Harbor
Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982)).
En un método ejemplar, la secuencia de
aminoácidos en el extremo N, extremo C, o similares de la PAP
purificada a partir de un microorganismo que pertenece al género
Acinetobacter puede secuenciarse parcialmente mediante un
método conocido, y el oligonucleótido correspondiente a la secuencia
determinada de este modo se sintetiza. A continuación, el fragmento
de ADN que contiene el gen que codifica la PAP puede clonarse a
partir del ADN cromosómico de la bacteria perteneciente al género
Acinetobacter usando el oligonucleótido sintetizado de este
modo como sonda. Como alternativa, el ADN cromosómico puede
escindirse usando enzimas de restricción apropiadas, y puede
producirse una biblioteca genómica mediante el método usado
habitualmente en la técnica. La biblioteca genómica resultante
puede cribarse en base a la actividad de PAP para clonar de este
modo el gen diana.
Existe, sin embargo, un riesgo cierto de que la
PAP se inactive cuando la PAP se purifique en alto grado, y por lo
tanto, el uso de un sistema de cribado que usa la actividad de PAP
es preferible. La actividad de PAP usada en el cribado es
preferiblemente la actividad de generar ATP a partir de AMP mediante
la combinación de la PAP con polifosfato quinasa (PPK). Más
específicamente, pueden usarse PAP y PPK para la generación del ATP
usando AMP como sustrato y polifosfato marcado con isótopo como
donador de fosfato, para detectar de este modo la generación del
ATP marcado con isótopo.
El huésped usado para la clonación no está
particularmente limitado. El uso de E. coli, sin embargo, es
preferible en vista de la conveniencia de trabajo y manejo.
Puede construirse un sistema de expresión con
una alta tasa de expresión del gen clonado preparando un vector de
expresión recombinante en el que señales reguladoras de la expresión
(señal de inicio de la transcripción y señal de inicio de la
traducción) se ligan cadena arriba del gen, después de la
identificación de la región codificante del gen mediante el método
para secuenciar la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN
clonado, por ejemplo, Maxam-Gilbert (Methods in
Enzymology, 65, 499(1980)), método de terminador de la cadena
didesoxi (Methods in Enzymology, 101, 20(1983)), o
similares.
Para producir la PAP en una gran cantidad en el
microorganismo heterólogo, las señales reguladoras de la expresión
usadas son señales de inicio de la transcripción y la traducción
deseables que pueden regularse mediante un medio artificial, y que
son señales fuertes que permiten un drástico aumento den la
producción de PAP. Los ejemplos de señal de inicio de la
transcripción que pueden usarse cuando el huésped es E. coli
incluyen promotor lac, promotor trp, y promotor tac (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 80, 21(1983), y Gene, 20, 231(1982)),
y promotor trc (J. Biol. Chem., 260, 3539(1985)).
Los vectores ejemplares que pueden usarse
incluyen vector plasmídico, vector de fagos y otros vectores, y el
uso de un vector plasmídico es deseable puesto que éste puede
amplificarse en el microorganismo, incluye un marcador resistente a
fármacos adecuado y un sitio de escisión para las enzimas de
restricción predeterminadas, y es copiado en gran número en el
microorganismo. Los ejemplos de los vectores plasmídicos que pueden
usarse cuando el huésped es E. coli incluyen pBR322 (Gene,
2, 95(1975)), pUC18 y pUC19 (Gene, 33, 103(1985)).
El microorganismo se transforma usando el vector
recombinante producido de este modo. El microorganismo usado para
el huésped no está limitado particularmente, siempre que tenga alta
seguridad y conveniencia de manejo, y pueden usarse E. coli,
levadura, y otros microorganismos usados habitualmente en las
técnicas de ADN recombinante, según se desee. El uso de E.
coli, sin embargo, es favorable, y las cepas ejemplares incluyen
K12, C600, JM105, JM109 (Gene, 33,
103-119(1985)), y otras cepas usadas
normalmente en los experimentos de ADN recombinante.
Se han descrito diversos métodos para su uso en
la transformación de un microorganismo, y un método adecuado puede
seleccionarse dependiendo del tipo de microorganismo usado como
huésped. Cuando se usa E. coli como huésped, puede
transformarse E. coli mediante el tratamiento con cloruro
cálcico seguido de la introducción del plásmido en el interior de
la célula a baja temperatura (J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
El transformante resultante se cultiva en un
medio de cultivo en el que el microorganismo es propagable, y el
cultivo continúa y la expresión del gen de PAP clonado se induce
hasta que gran cantidad de la PAP se acumula en el microorganismo.
El transformante puede cultivarse mediante un método usado
habitualmente en la técnica, usando un medio de cultivo que
contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, y otras
fuentes de nutrientes necesarios para la propagación del
microorganismo cultivado. Por ejemplo, cuando se usa E. coli
como huésped, el medio de cultivo usado pueden ser los usados
habitualmente para el cultivo de E. coli tal como medio 2xYT
(Methods in Enzymology, 100, 20 (1983)), medio LB, medio M9CA
(Molecular Cloning, anteriormente), y el cultivo puede realizarse a
una temperatura de incubación de 20 a 40ºC con agitación con
aireación. Cuando se usa un plásmido como vector, un agente
antibiótico apropiado (ampicilina, kanamicina, o similares
correspondientes al marcador resistente a fármacos) de una cantidad
apropiada se añade al medio de cultivo para prevenir de este modo
la pérdida del plásmido durante el cultivo.
Cuando la expresión del gen de PAP debe
inducirse durante el cultivo, la expresión génica puede inducirse
mediante el método usado habitualmente con el promotor usado. Por
ejemplo, cuando el promotor usado es el promotor lac o el promotor
tac, puede añadirse un agente que induce la expresión, tal como
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
(en lo sucesivo en este documento abreviado como IPTG) en una
cantidad apropiada en el periodo intermedio del cultivo.
Las células se recogen del cultivo producido de
este modo mediante separación en membrana, centrifugado, o
similares. Aunque las células recogidas pueden usarse como PAP sin
tratamiento adicional, la PAP usada es preferiblemente un extracto
libre de células preparado suspendiendo las células recogidas en una
solución tampón apropiada, lisando la células mediante un
tratamiento físico usando ultrasonicación, Prensa Francesa, o
similares, o mediante un tratamiento enzimático usando lisozima o
similares, y retirando el residuo bacteriano para obtener el
extracto. Aunque el extracto libre de células puede usarse como
fuente de enzima sin tratamiento adicional, puesto que el extracto
libre de células contiene una cantidad abundante de PAP, la PAP
usada también puede ser un producto parcialmente purificado o un
producto purificado preparado mediante uno o combinación de dos o
más de tratamiento térmico, precipitación con sulfato de amonio,
diálisis, tratamiento usando un disolvente tal como etanol,
diversos tratamientos cromatográficos y otros tratamientos usados
habitualmente en la purificación enzimática.
La PAP preparada de este modo puede usarse en la
síntesis de nucleósido difosfato o desoxinucleósido difosfato, y en
la síntesis o regeneración del ATP.
En primer lugar, el nucleósido
5'-monofosfato (NMP) o el desoxinucleósido
5'-monofosfato (dNMP) usado en la síntesis de
nucleósido 5'-difosfato (NDP) o desoxinucleósido
5'-difosfato (dNDP) puede ser un producto disponible
en el mercado, y se usa a una concentración en el intervalo de 10 a
100 mM.
El polifosfato usado también puede ser un
producto disponible en el mercado, y se usa a una concentración en
el intervalo de 10 a 200 mM calculada en términos de fosfato
inorgánico. El grado de polimerización (n) del polifosfato puede
ser de hasta 100, y preferiblemente de aproximadamente 10 a 50.
La síntesis del NDP o dNDP puede realizarse
mediante la reacción en la que se añaden NMP o dNDP y polifosfato a
una solución tampón a un pH en el intervalo de 4 a 9, y al menos
0,001 unidades/ml, y preferiblemente de 0,001 a 10 unidades/ml de
la PAP de la presente invención se añaden a la solución a 20ºC o
más, y preferiblemente a de 30 a 40ºC durante aproximadamente de 1
a 50 horas con agitación opcional.
El NDP o dNDP producido de este modo puede
aislarse y purificarse mediante un proceso cromatográfico u otro
proceso conocido en la técnica.
Una síntesis de ATP (que no forma parte de la
presente invención) puede realizarse convirtiendo AMP en ADP, y a
continuación, en ATP usando la PAP usada en la presente invención y
adenilato quinasa en presencia de polifosfato.
El AMP añadido a la solución de reacción puede
ser un producto disponible en el mercado, y puede usarse a una
concentración adecuada seleccionada entre el intervalo de, por
ejemplo, 1 a 200 mM, y preferiblemente de 10 a
100 mM.
100 mM.
El polifosfato añadido también puede ser un
producto disponible en el mercado, y puede usarse a una
concentración seleccionada en el intervalo de 1 a 1000 mM, y
preferiblemente de 10 a 200 mM calculada en términos de fosfato
inorgánico. El grado de polimerización (n) del polifosfato puede ser
de hasta 100, y preferiblemente de aproximadamente 10 a 50.
La síntesis del ATP puede realizarse añadiendo
AMP y polifosfato a una solución tampón apropiada a un pH en el
intervalo de 4 a 9, y añadiendo además al menos 0,001 unidades/ml, y
preferiblemente de 0,001 a 10 unidades/ml de la PAP usada en la
presente invención y al menos 0,01 unidades/ml, y preferiblemente de
0,01 a 100 unidades/ml o más de adenilato quinasa para permitir que
la reacción continúe a 20ºC o más, y preferiblemente a de 30 a 40ºC
durante aproximadamente de 1 a 50 horas con agitación opcional.
El ATP generado de este modo puede aislarse y
purificarse mediante un método cromatográfico u otro método
conocido en la técnica.
La unidad de la actividad adenilato quinasa es
la medida y calculada mediante el procedimiento que se describe a
continuación. La enzima de muestra se añade a la solución tampón de
Tris HCl 50 mM (pH 7,8) que contiene cloruro de magnesio 10 mM, AMP
10 mM y ATP 10 mM, y la solución se incuba a 37ºC para promover la
reacción, y la reacción se interrumpe mediante un calentamiento de
1 minuto a 100ºC. La cantidad de ADP en la solución de reacción se
mide usando HPLC, y la actividad de producir 2 \mumoles de ADP a
37ºC en 1 minuto se denomina 1 unidad.
El sistema de generación/regeneración de ATP que
comprende el AMP, el polifosfato, la PAP usada en la presente
invención y la adenilato quinasa, puede usarse para detectar una
mínima cantidad de ATP durante la detección de microorganismos
invisibles para comprobar la limpieza del alimento en la planta de
alimento, o en la detección de adenin nucleótido mediante
bioluminiscencia, que es aplicable en la medición de la frescura de
la carne, pescado, verduras y otros alimentos (véase, por ejemplo,
el documento WO01/53513).
El sistema de regeneración de ATP que comprende
polifosfato, la PAP usada en la presente invención, y adenilato
quinasa también es aplicable a la producción de un compuesto usando
una reacción enzimática que consume ATP para permitir que la
regeneración de ATP a partir del AMP tenga lugar simultáneamente con
la síntesis enzimática del compuesto diana, mejorando de este modo
la eficacia de la síntesis.
Las reacciones enzimáticas ejemplares que pueden
combinarse con dicho sistema de regeneración de ATP incluyen
sistema de síntesis de
galactosa-1-fosfato usando
galactoquinasa, sistema de síntesis de UDP usando UMP quinasa, y
sistema de síntesis de fosfocolina usando colina quinasa, y el
sistema de regeneración de ATP puede aplicarse a cualquier reacción
enzimática que consume ATP.
Las condiciones de reacción del sistema de
síntesis de ATP y la reacción enzimática pueden determinarse
adecuadamente realizando ensayos a menor escala, y el aislamiento y
la purificación del compuesto diana pueden realizarse mediante un
método conocido en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, la presente invención se
describe con más detalle en referencia a los Ejemplos, que no
limitan en absoluto el alcance de la invención. En los Ejemplos, la
preparación del ADN, escisión con la enzima de restricción, el
ligamiento del ADN usando T4 ADN ligasa, y la transformación con el
ADN se realizaron todos de acuerdo con el documento "Molecular
cloning II" (Sambrook et al. ed., Cold spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)). La enzima de
restricción, AmpliTaq ADN polimerasa, T4 ADN ligasa, y otras
enzimas relacionadas con el ADN se obtuvieron todas de Takara Shuzo
K.K. La medición cuantitativa de los nucleótidos se realizó
mediante HPLC, y más específicamente, la columna
ODS-AQ312 fabricada por YMC se usó para fines de
preparación con el eluyente de la solución de fosfato monopotásico
0,5 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó polifosfato quinasa de E. coli
mediante el método descrito en el documento (J. Biol. Chem., 268,
633-639 (1993)). Se preparó polifosfato marcado con
isótopo usando la polifosfato quinasa de E. coli preparada
de este modo de acuerdo con el método de Akiyama et al. (J.
Biosci. Bioeng., 91, 557-563(2001)).
La cepa 210A de Acinetobacter johnsonii
se inoculó en medio LB, y a continuación se cultivó durante una
noche a 30ºC con agitación. Las células se recogieron mediante
centrifugado, y el ADN cromosómico se purificó. El ADN cromosómico
de Acinetobacter johnsonii se descompuso parcialmente con la
enzima de restricción Sau3AI, y los fragmentos se fraccionaron
mediante centrifugado en gradiente de densidad de sacarosa para
recuperar la fracción de aproximadamente 7 a 10 Kb. Este fragmento
de ADN y el vector plasmídico pBlueScript SK(+) (adquirido de
Toyobo) que se había escindido con BamHI se ligaron usando T4 ADN
ligasa, y la cepa JM109 de E. coli (adquirida de Takara
Shuzo) se transformó con la solución de este ADN. Los 6000
transformantes resistentes a ampicilina producidos de este modo se
dividieron en grupos de 50 transformantes.
Después de cultivar cada grupo durante una noche
a 37ºC en medio LB, las células se recogieron mediante centrifugado
y se lavaron con Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), y se
suspendieron de nuevo en la misma solución tampón. Se añadió
BugBuster (adquirido de Takara Shuzo) a la suspensión celular a la
misma cantidad, y se dejó reposar a la suspensión a temperatura
ambiente durante 30 minutos para permitir la lisis celular. A
continuación se añadieron tres volúmenes de
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) para preparar el extracto
celular.
A 20 \mul de la solución detectora de
actividad (Tris HCl 50 mM (pH 8,0), (NH4)_{2}SO_{4} 40
mM, MgCl_{2} 4 mM, y AMP 1 mM) que contenía el polifosfato
marcado con isótopo (0,24 mM calculado en términos de fosfato)
preparada anteriormente, se le añadió 1 \mul del extracto celular,
y se dejó que la reacción continuara a 37ºC durante 1 hora. La
solución de reacción se sometió a continuación a cromatografía en
capa fina (usando el desarrollador: KH_{2}PO_{4} 0,75 M, pH
3,5), y la formación de ADP se detectó en un analizador
phospho-imager BASS2000 (fabricado por Fujix) para
el cribado de los transformantes. La actividad de PAP se detectó
para 1 clon en las 6000 cepas.
El plásmido pPAP2 que tiene el gen de PAP de la
cepa 210A de Acinetobacter johnsonii insertado en su interior se
obtuvo del clon resultante (Figura 1). Debe observarse que el
plásmido pPAP2 tenía insertado en su interior el ADN cromosómico de
la cepa 210A de Acinetobacter johnsonii que es de aproximadamente 10
kb, y éste estaba depositado internacionalmente en base al tratado
de Budapest el 22 de mayo de 2002 con la designación de ADN
plasmídico (pPAP2) a nombre del National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology (una Institución
Administrativa Independiente), Organismo Depositario de la Patente
Internacional (Chuo-6, 1, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón
(Código Postal, 305-8566)) con el número de entrada
de FERM BP-8047.
El ADN de la cepa 210A de Acinetobacter
johnsonii de 10 kb insertado en el pPAP2 se subclonó en diversos
plásmidos para determinar la actividad de PAP de estos
transformantes como se ha descrito anteriormente, y a continuación
se descubrió que el gen de PAP está situado en el fragmento de ADN
SacI-HpaI de aproximadamente 2,5 kb (figura 1). La
secuencia de nucleótidos de este fragmento de ADN se determinó
mediante el método del terminador de la cadena didesoxi (Science,
214, 1295(1981)), y a continuación se descubrió que el gen de
PAP codifica el polipéptido (peso molecular: 55,8 kd) que comprende
475 aminoácidos (figuras 2 y 3).
\newpage
La JM109 de E. coli que porta el plásmido
pPAP2 se cultivó durante una noche a 28ºC en medio 2xYT que
contiene ampicilina a 100 \mug/ml. Las células se recogieron
mediante centrifugado, y se suspendieron en la solución tampón que
comprende Tris HCl 50 mM (pH 7,8) y EDTA 1 mM. Después de la
ultrasonicación, el extracto celular se recogió mediante
centrifugado. En la medición del extracto en busca de la actividad
de PAP, se descubrió que la PAP se producía a una tasa de 18,1
unidades por 1 ml de la solución de cultivo, y que la actividad era
aproximadamente 9000 veces más alta que la del contraste (la JM109
de E. coli que no lleva el plásmido).
Debe observarse que esta productividad
corresponde a aproximadamente 150 veces la productividad del
Acinetobacter Johnsonii. La PAP se purificó parcialmente
fraccionando el extracto mediante cromatografía de intercambio
iónico usando DEAE TOYOPEARL 650M (TOSO) (eluyente: Tris HCl 50 mM
(pH 7,8), gradiente de concentración de NaCl de 0 a 0,5 M), y la
fracción recogida se usó para la muestra de enzima. La actividad
específica de la PAP en la fracción recogida era de 80,5
unidades/mg de proteína.
A una solución tampón de Tris HCl 50 mM (pH 8,0)
que contenía MgCl_{2} 100 mM, polifosfato (10 mM calculado en
términos de fosfato inorgánico), y 5 mM de diversos NMP o dNMP, se
le añadió PAP a diversas concentraciones, y la solución se incubó a
37ºC durante 10 minutos. La reacción se interrumpió mediante
tratamiento térmico a 100ºC durante 1 minuto, y la solución después
de la reacción se sometió a HPLC para medir la cantidad del NDP o
el dNDP producida. La actividad específica de cada NMP o dNMP se
muestra en la Tabla 1 como un valor relativo con respecto a la
actividad específica de la PAP en la fosforilación del AMP, que se
supone del 100%.
Se incubó PAP en solución tampón de maleato 50
mM o Tris HCl 50 mM de diversos pH a 37ºC durante 10 minutos en
presencia de cloruro de magnesio 100 mM para medir la actividad
residual. La actividad residual se midió dejando que la reacción
tuviera lugar a 37ºC durante 10 minutos en presencia de solución
tampón de Tris 50 mM (pH 8,0), cloruro de magnesio 100 mM, AMP 5
mM, y polifosfato (10 mM calculado en términos de fosfato
inorgánico), y midiendo el ADP resultante mediante HPLC.
Como se muestra en la figura 4, se descubrió que
la enzima de la presente invención muestra una actividad enzimática
del 80% o más a un pH en el intervalo de 7 a 9 cuando la actividad
enzimática a pH 8 era del 100%.
Se dejó continuar a la reacción en solución
tampón de maleato 50 mM o Tris HCl 50 mM de diversos pH a 37ºC
durante 10 minutos en presencia de cloruro de magnesio 100 mM,
polifosfato (10 mM calculado en términos de fosfato inorgánico), y
AMP 5 mM para medir la cantidad del ADP producido, mediante
HPLC.
Como se muestra en la figura 4, el pH óptimo de
la enzima de la presente invención era de aproximadamente 8,5.
Se incubó PAP durante 10 minutos en solución
tampón de Tris HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía cloruro de magnesio
100 mM en presencia o en ausencia de polifosfato (10 mM calculado en
términos de fosfato inorgánico) en el baño a
diversas temperaturas para medir la actividad residual mediante el procedimiento que se ha descrito anteriormente.
diversas temperaturas para medir la actividad residual mediante el procedimiento que se ha descrito anteriormente.
Como se muestra en la figura 6, se descubrió que
la enzima de la presente era estable hasta aproximadamente 50ºC en
presencia del polifosfato.
Se incubó PAP durante 10 minutos en solución
tampón de Tris HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía cloruro de magnesio
100 mM en presencia de polifosfato (10 mM calculado en términos de
fosfato inorgánico) y AMP 5 mM en el baño a diversas temperaturas,
y se evaluó la actividad enzimática midiendo la cantidad de ADP
producido, mediante HPLC.
Como se muestra en la figura 7, se descubrió que
la temperatura de reacción óptima de la enzima de la presente
invención era de aproximadamente 50ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó adenilato quinasa de E. coli
mediante el procedimiento descrito en el documento (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 97, 14168-14171 (2000)). Sin
embargo, el extracto celular producido mediante ultrasonicación se
usó para la solución enzimática, y la actividad específica de la
adenilato quinasa en la solución enzimática era de 12,5 unidades/mg
de proteína.
A una solución tampón de Tris HCl 50 mM (pH 7,8)
que contenía MgCl_{2} 20 mM, polifosfato (30 mM calculado en
términos de fosfato inorgánico) y AMP 10 mM, se le añadieron 1,5
unidades/ml de PAP y 0,4 unidades/ml de adenilato quinasa, y la
solución se incubó a 37ºC durante 60 minutos. Una vez finalizada la
reacción, se midió la cantidad del nucleótido en la solución de
reacción, mediante HPLC.
Como se muestra en la figura 8, se confirmó que
el AMP es fosforilado de inmediato por la PAP para producir ADP, y
el ADP producido de este modo es convertido de inmediato en ATP y
AMP por la adenilato quinasa que también está presente en el
sistema, dando como resultado, la repetición de este ciclo, la
acumulación de ATP.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa JM109 de E. coli que tiene el
plásmido pDR540 que contiene el gen de galactoquinasa de E.
coli (Gene, 20, 231(1982), obtenido de Pharmacia) se
inoculó en medio 2xYT que contenía 100 \mug/ml de ampicilina, y
el E. coli se cultivó a 37ºC con agitación. Cuando la
densidad celular alcanzó 4x10^{8}/ml, se añadió IPTG al medio de
cultivo hasta una concentración final de 1 mM, y la incubación
continuó a 30ºC durante otras 5 horas. Un vez completado el
cultivo, las células se recogieron mediante centrifugado y se
suspendieron en 30 ml de solución tampón (Tris HCl 50 mM (pH 7,8),
EDTA 1 mM). Las células se lisaron mediante ultrasonicación, y el
residuo bacteriano se retiró mediante centrifugado adicional. La
solución recogida se sometió a cromatografía de intercambio iónico
usando DEAE Toyopearl 650M (Toso) (eluyente: Tris HCl 50 mM (pH
7,8), gradiente de concentración de NaCl de 0 a 0,5 M) para el
fraccionamiento y la purificación parcial de la galactoquinasa. La
fracción recuperada de este modo se usó para la solución enzimática
de galactoquinasa. La actividad específica de la galactoquinasa en
la solución enzimática era de 6,5 unidades/mg de proteína.
La unidad de la actividad galactoquinasa era la
medida y calculada mediante el procedimiento que se describe a
continuación. A la enzima de muestra se le añadió la solución tampón
de Tris HCl 100 mM (pH 7,8) que contenía MgCl_{2} 5 mM, ATP 10
mM, y galactosa 10 mM, y la solución se incubó a 37ºC para promover
la reacción, y la reacción se interrumpió mediante 1 minuto de
tratamiento térmico a 100ºC. La cantidad de la
galactosa-1-fosfato en la solución
de reacción se midió usando un analizador de azúcar (Dionex), y la
actividad de producir 1 \mumol de
galactosa-1-fosfato a 37ºC en 1
minuto se denominó 1 unidad.
A una solución tampón de Tris HCl 50 mM (pH 7,8)
que contenía MgCl_{2} 20 mM, polifosfato (30 mM calculado en
términos de fosfato inorgánico), AMP 5 mM, y (d) galactosa 50 mM se
le añadieron 0,2 unidades/ml de PAP y 0,2 unidades/ml de adenilato
quinasa, y a continuación, galactoquinasa a 0,5 unidades/ml, y la
solución se incubó a 37ºC durante 8 horas. Durante la reacción,
también se añadió polifosfato respectivamente a las 2 horas y las 4
horas después del inicio de la reacción hasta 20 mM calculado en
términos de fosfato inorgánico. La solución de reacción se analizó
con un analizador de azúcar (Dionex), y se confirmó la producción de
galactosa-1-fosfato 37,8 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución tampón de Tris HCl 50 mM que
contenía MgCl_{2} 100 mM, polifosfato (30 mM calculado en términos
de fosfato inorgánico), y 10 mM de un NMP (AMP, GMP, CMP, UMP, o
IMP) se le añadió PAP a 16 unidades/ml, y la solución se incubó a
37ºC durante 30 minutos. Los resultados del análisis por HPLC de la
solución de reacción se muestran en la Tabla 2. Debe observarse que
no se descubrió generación de NDP cuando se usó extracto celular de
JM109 de E. coli como contraste.
A una solución tampón de Tris HCl 50 mM que
contenía MgCl_{2} 100 mM, polifosfato (65 mM calculado en términos
de fosfato inorgánico), e IMP 40 mM, se le añadió PAP a 16
unidades/ml, y la solución se incubó a 37ºC durante 19 horas. La
solución de reacción se analizó mediante HPLC, y se confirmó la
formación de IDP 21,2 mM.
Esta invención proporciona un método para
producir nucleósido difosfato. Se proporciona una producción a gran
escala de la PAP sin dificultad, que no se podría haber realizado
mediante la tecnología convencional. Se ha realizado una síntesis y
regeneración eficaces de ATP a partir de AMP a un coste bajo, y la
combinación de esto con un sistema de reacción enzimática que
consume ATP permite la regeneración del ATP consumido en el sistema
de reacción para facilitar la síntesis eficaz del compuesto
diana.
En contraste con la PAP convencional, la PAP
usada en la presente invención muestra actividad de fosforilación
para diversos tipos de nucleósido 5'-monofosfato
diferentes del AMP y desoxinucleósido
5'-monofosfato, y esto permite la producción sin
complicaciones de diversos tipos de nucleósido
5'-difosfato y desoxinucleósido
5'-difosfato mediante un proceso enzimático.
<110> Yamasa Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva Polifosfato:AMP
Fosfotransferasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> YS0007
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP P2002-156049
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
29-05-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<150> IP P2003-008931
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-01-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentin Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter johnsonii
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1847
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Acinetobacter johnsonii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (1)
1. Un método para producir nucleósido difosfato
en el que el nucleósido difosfato se produce enzimáticamente a
partir de nucleósido monofosfato seleccionado entre IMP, CMP, DCMP,
UMP y TMP usando una polifosfato:AMP fosfotransferasa (PAP)
recombinante que está libre de actividad degradadora de AMP, dicha
PAP:
- (i)
- teniendo la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; o teniendo una homología de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; o
- (ii)
- estando codificada por un gen de PAP que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1;
- estando codificada por un gen de PAP que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2;
- estando codificada por un gen que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 2; o
- estando codificada por un gen que hibrida con la secuencia de la SEC ID Nº 2 en condiciones rigurosas;
comprendiendo dicho método el uso del nucleósido
monofosfato a una concentración de 10 a 100 mM y de polifosfato a
una concentración de 10 a 200 mM.
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