ES2199778T3 - Procedimiento de fabricacion de morfolinonucleotidos, y su uso para el analisis y el marcaje de secuencias de acidos nucleicos. - Google Patents
Procedimiento de fabricacion de morfolinonucleotidos, y su uso para el analisis y el marcaje de secuencias de acidos nucleicos.Info
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Abstract
Procedimiento de fabricación de un fragmento de ácido nucleico (ADN o ARN) marcado en 3¿, que comprende la incorporación enzimática de un derivado de nucleótido que tiene como precursor un compuesto de fórmula: en la que R1 representa una base nucleica y R2 representa un grupo que responde a una de las fórmulas siguientes: -(CH2)n-NH2 -(CH2)n-SH -(CH2)n-COOH -(CH2)n-OH -(CH2)n-NH-R3 -(CH2)n-SR3 -(CH2)n-CO-R3 -(CH2)n-OR3 en las que n es un número entero que va desde 1 hasta 12 y R3 es un grupo derivado de un marcador, de una proteína, de una enzima, de un ácido graso o de un péptido en el extremo 3¿ OH del fragmento de ácido nucleico.
Description
Procedimiento de fabricación de
morfolinonucleótidos, y su uso para el análisis y el marcaje de
secuencias de ácidos nucleicos.
La presente invención tiene por objeto la
fabricación de fragmentos de ácidos nucleicos (ADN o ARN) alargados
enzimáticamente por medio de morfolinonucleótidos trifosfato. Este
alargamiento puede usarse para el análisis de secuencias de ácidos
nucleicos por incorporación de estos derivados en las cadenas de
ácidos nucleicos así como para el marcaje enzimático y la
inmovilización o la detección de secuencias.
Estos morfolinonucleotidos trifosfato pueden
usarse además con una molécula suplementaria que puede desempeñar
diversos papeles en numerosas aplicaciones.
El procedimiento más extendido para analizar las
secuencias de ácidos nucleicos es la técnica enzimática llamada de
terminación de cadena, desarrollada por Sanger y col. en
Proceedings of National Academy of Science, 74, 1977, pág.
5463-5467 [1]. Se basa en las propiedades que
tienen las polimerasas de ADN dependientes de ADN para originar
polímeros de ADN complementarios a la secuencia de una hebra de ADN
que sirve de molde, a partir de una mezcla de monómeros de
nucleósidos trifosfato naturales. El procedimiento consiste, a
partir de una hebra de ADN para analizar, en hacer una serie de
ejemplares de la hebra complementaria añadiendo al medio de la
reacción clásica moléculas llamadas "terminadores de cadena",
después en analizar la longitud de las nuevas hebras formadas para
determinar la secuencia de bases del molde. El principio del
procedimiento se explica en la tabla 1 siguiente.
\newpage
Esta tabla 1 ilustra lo que se produce cuando se
pone en presencia de la ADN polimerasa, un cebador constituido por
un oligonucleótido de tamaño pequeño, generalmente inferior a 25
bases, y la mezcla de los cuatro nucleótidos trifosfato naturales
con la hebra de ADN cuya secuencia se quiere determinar, que
constituye el molde. El cebador corresponde al principio de la
secuencia complementaria de la hebra de ADN para analizar. A partir
de este cebador, que interacciona espontáneamente con la secuencia
complementaria de la hebra de ADN para analizar (hibridación), la
enzima incorpora oligonucleótidos complementarios del molde para
constituir por alargamiento y polimerización una nueva hebra de
ADN, copia complementaria de ésta última. Los nuevos nucleótidos se
incorporan exclusivamente a partir del extremo 3'-OH
terminal de la cadena en crecimiento, de manera secuencial y
respetando las reglas de complementariedad entre bases de Watson y
Crick. Una timina se incorpora en la nueva hebra formada por
complementariedad con una adenina presente en la hebra que sirve de
molde, una guanina se incorpora en complementariedad con una
citosina y recíprocamente. Si se proporcionan todos los compuestos
necesarios en cantidades no limitantes, la enzima cataliza la
polimerización de la cadena formada hasta que ésta última
representa la totalidad de la hebra perfectamente complementaria del
molde.
Por el contrario, si se adiciona al medio de la
reacción una molécula que sea reconocida por la polimerasa pero que
no presenta un extremo 3'-OH terminal libre, cada
vez que esta molécula se incorpore, el trabajo de la polimerización
de la enzima se interrumpirá porque la cadena no podrá crecer más
debido a la ausencia de un sitio disponible para que entre un nuevo
nucleótido (creación de nuevas hebras formadas interrumpidas). Es
lo que se ilustra en la tabla 2 siguiente con la
3'-desoxitimidina,
5'-trifosfato.
\newpage
Utilizando este derivado de timidina que se
denominará "terminador de cadena T" a una concentración
adecuada, se obtiene dado un molde, una serie de hebras de ADN cuyo
tamaño se fija estadísticamente por la posición de las adeninas del
molde. El resultado obtenido se ilustra en la tabla 3. La secuencia
del molde está escrita en la primera línea, la secuencia de las
nuevas hebras originadas con el terminador de cadena T (llamado S)
están escritas en las líneas siguientes.
| Molde |
| 3'- A T G C A T T C C G A C C T C T G A T C A G -5' |
| Copias del molde |
| 5'-S |
| 5'-T A C G S |
| 5'-T A C G T A A G G C S |
| 5'-T A C G T A A G G C T G G A G A C S |
| 5'-T A C G T A A G G C T G G A G A C T A G S |
En este ejemplo, el molde tiene 5 adeninas en la
zona que se detalla, la ADN polimerasa entonces podrá producir 5
nuevas hebras interrumpidas, de distintas longitudes.
Después es suficiente con analizar esta mezcla
por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes para determinar la longitud de cada una de las
hebras obtenidas usando el terminador de cadena T. El tamaño de las
nuevas hebras formadas interrumpidas permite deducir la posición de
las adeninas en el molde.
Comenzando de nuevo tres veces este ensayo con
los terminadores de cadena respectivos A, G, y C, se obtiene un
total de cuatro series de fragmentos de ADN cuya longitud permite
determinar la secuencia completa de la hebra molde.
La tecnología de la secuenciación del ARN se basa
en los mismos principios, la diferencia radica en que la enzima
empleada es una transcriptasa inversa (o ADN polimerasa dependiente
de ARN).
Los productos más usados como terminadores de
cadena para detener la acción de las ADN polimerasas son los
2',3'-didesoxinucleósidos trifosfato de fórmula:
en la que B representa una de las bases nucleicas
A, C, G o T, como se describe en el documento
[1].
La estructura de estos productos en comparación
con la de los nucleósidos trifosfato naturales muestra la ausencia
de la función de hidroxilo en la posición 3' que sirve de posición
de enlace del siguiente nucleótido.
La síntesis química de los
2',3'-didesoxinucleósidos trifosfato se realiza
según un protocolo largo y tedioso que comprende tres grandes
etapas. En el caso de la guanina, la primera etapa de este
procedimiento es la protección de la función de amina exocíclica de
la guanina y de la función de hidroxilo primario en el 5' del
glúcido. Después se realiza la supresión de la función hidroxilo en
el 3', por eliminación después de una reducción del enlace doble
2'-3' generado. La última etapa es la preparación
del derivado trifosfato.
Otros terminadores de cadena se han descrito en
el documento WO-A-96/23807 [2]. Son
los 5'-trifosfato de los arabinonucleósidos, los
3'-fluoro-2',3'-didesoxinucleósidos,
los
3'-acido-2'-3'-didesoxinucleósidos
o los
3'-amino-2',3'-didesoxinucleósidos.
Su síntesis es también muy laboriosa.
En los orígenes del procedimiento de Sanger, la
visualización de fragmentos de ADN sintetizados se hacía por
marcaje radioactivo con ^{32}P en el 5' del cebador usado para
iniciar la polimerización de la hebra complementaria. Una
modificación se aportó usando cebadores que llevan un fluoróforo.
Esta mejora radica únicamente en la facilidad de empleo, porque
elimina el uso de materiales radiactivos, pero aún es necesario
realizar cuatro reacciones de secuenciación, usando en cada una un
terminador de polimerización diferente (terminador A, G, T o C).
Se ha salvado una nueva etapa mediante el empleo
de terminadores de secuencia que llevan fluoróforos en su base
nucleica, como se describe por Prober y col., en Science, 238,
1987, págs. 336-341 [3].
En estas condiciones, el marcaje de las nuevas
hebras sintetizadas ya no se realiza antes de la reacción de
secuenciación, sino que directamente en el momento de la
incorporación del terminador de secuencia. Teniendo cuidado de
elegir un fluoróforo que presente propiedades ópticas diferentes
para cada base del ADN, el protocolo experimental se ha simplificado
enormemente. Ya no se realiza más que una sola reacción con los
cuatro terminadores mezclados. De este modo, a partir de una única
calle de electroforesis, se distinguen los cuatro nucleótidos de la
secuencia gracias a las diferentes longitudes de onda de emisión de
los cuatro terminadores.
Esta simplificación en el protocolo de análisis
no tiene más que ventajas. En efecto, los fluoróforos se integran
directamente en la base. Esta modificación estructural, localizada
directamente al lado de los sitios de enlace de hidrógeno
relacionados con el reconocimiento entre las bases, conlleva una
disminución del reconocimiento por las enzimas. Para compensar esto,
se previó un aumento de la concentración de los terminadores, que
dirige a un gran consumo de la materia prima que tiene un gran
valor añadido. Además, la síntesis de estas moléculas es siempre
más delicada.
El documento WO95/07907 describe los derivados de
morfolinonucleósidos en los que el hidroxilo de la posición 5' puede
incorporar un grupo monofosfato, difosfato o trifosfato. Estos
derivados que llevan un ciclo morfolino sustituido se usan para la
preparación de anticuerpos específicos contra un hapteno fijado al
ciclo morfolino.
El documento de Brown y col.: "The Reduction of
the Adduct of Periodate-oxidised
Adenosine-5' Phosfate and Methilamine" J. Chem.
Soc., 1965, págs. 5072-5073 describe la reducción
de un derivado de morfolinonucleósdio monofosfato.
El documento de patente
US-A-4.515.781 hace referencia a
oligonucleótidos que tienen un grupo morfolinoadenilato en la
cadena terminal que permite aumentar la resistencia a las nucleasas
y aumentar la actividad biológica del oligonucleótido molde.
La presente invención tiene particularmente por
objeto el uso, en un procedimiento de secuenciación de este tipo, de
terminadores de cadena constituidos por análogos de nucleósidos
trifosfato más fáciles de sintetizar, que permiten además realizar
un marcaje eficaz sin modificar las bases nucleicas.
Además, la invención tiene por objeto un
procedimiento de secuenciación de un ácido nucleico (ADN o ARN) por
la técnica de polimerización enzimática de la secuencia
complementaria de este ácido nucleico usando terminadores de cadena,
en el que al menos uno de los terminadores de cadena tiene como
precursor un compuesto que responde a la fórmula:
en la que R^{1} representa una base nucleica y
R^{2} representa un grupo que responde a una de las siguientes
fórmulas:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-(CH _{2} ) _{n} -NH _{2} \+
-(CH _{2} ) _{n} -SH\cr
-(CH _{2} ) _{n} -COOH \+
-(CH _{2} ) _{n} -OH\cr
-(CH _{2} ) _{n} -NH-R ^{3}
\+ -(CH _{2} ) _{n} -SR ^{3} \cr
-(CH _{2} ) _{n} -CO-R ^{3}
\+
-(CH _{2} ) _{n} -OR ^{3} \cr}
en las que n es un número entero que va desde 1
hasta 12 y R^{3} es un grupo derivado de un marcador, de una
proteína, de una enzima, de un ácido graso o de un
péptido.
\newpage
Los terminadores de cadena usados en este
procedimiento son derivados de nucleótidos que llevan una base
nucleica R^{1} que permite el reconocimiento por las polimerasas
y las transcriptasas, y respeta las reglas de complementariedad de
Watson y Crick.
Las bases nucleicas usadas para R^{1} pueden
ser naturales o sintéticas. Las bases naturales se eligen
generalmente entre adenina, guanina, citosina, timina, uracilo,
xantina, hipoxantina, 2-aminopurina y sus
derivados.
Las bases sintéticas son análogos o derivados de
bases nucleicas naturales, que son capaces de interaccionar con las
bases naturales.
Preferiblemente, R^{1} responde a una de las
siguientes fórmulas:
En los derivados nucleotídicos de fórmula (I), la
parte glucídica se remplaza por un sustituyente morfolino adecuado
que comprende:
1º) Una función hidroximetilo adyacente al
oxígeno cíclico, esterificado por un grupo de ácido trifosfórico.
Esta parte de la molécula mimetiza la parte 4',5' de los
nucleótidos y permite la unión de la polimerasa o la transcriptasa a
la cadena de ADN o de ARN en crecimiento.
2º) Una función amina sustituida por R^{2}, que
puede permitir ocasionalmente la inserción de un cromóforo o de un
grupo biológicamente activo y sobretodo, que impide la unión de
otro nucleótido (interrupción de la polimerización).
En relación con los derivados usados clásicamente
en el procedimiento de Sanger como los que se describen en el
documento [1], [2] y [3], estos compuestos pueden ser sintetizados
en una sola etapa a partir directamente de los ribonucleósidos
trifosfato, como se verá más adelante.
El interés de estos compuestos radica en la gran
elección de grupos R^{2} (sustituyentes del ciclo morfolino) que
se pueden usar que permiten hacer funcional este ciclo. Pueden
añadirse funciones tales como ácido, amina, tioles o éteres y
permitirán la unión de compuestos químicos variados, particularmente
de marcadores útiles para la identificación de fragmentos de ADN o
ARN.
Los marcadores usados para R^{3} pueden
elegirse de un amplio grupo de moléculas conocidas para el marcaje
de nucleótidos. Pueden elegirse por ejemplo entre los productos
radiactivos, los productos luminiscentes, electroluminiscentes y
fluorescentes, las moléculas capaces de unirse a otras moléculas,
las moléculas que permiten interacciones de tipo
antígeno-anticuerpo, y los marcadores
enzimáticos.
Preferentemente, para la secuenciación de ácidos
nucleicos R^{3} es un fluoróforo, por ejemplo, elegido de entre
todos los derivados de la fluoresceína o de la rodamina. Se puede
también usar los derivados de la biotina. En particular, se elegirán
los de los derivados usados para el marcaje de ácidos
nucleicos.
Los derivados de nucleósidos en los que la parte
glucídica del nucleósido se ha remplazado por un morfolino, han
sido ya sintetizados en la técnica anterior, como aparece en los
siguientes documentos:
- Hileman y col., Bioconjugate Chemistry, 5,
1994, páginas 436-444 [4].
- Broker y col., Nucleic Acids Research, 5, 1978,
páginas 363-385 [5],
- Agrawal y col., Nucleic Acids Research, 14,
1986, páginas 6227-6245 [6],
- FR-A-2.710.068
[7], y
- Rayford y col., Journal of Biological
Chemistry, 260, 1985, páginas 15708-15713, [8].
Los derivados de nucleósidos del documento [4]
llevan un ciclo morfolino que se sustituye por una fluoresceína o
una rodamina. Se usan para el estudio de proteínas y no como
terminadores de cadena en un procedimiento de secuenciación de
ácidos nucleicos.
Su fabricación difiere del procedimiento al que
nos referimos, puesto que el fluoróforo se incorpora directamente
en el ciclo morfolino. La técnica que describimos hace referencia a
una etapa de purificación intermediaria que nos ha permitido aislar
y caracterizar perfectamente el producto final, al contrario de
Hileman y col.
En el documento [5], se trata de un ARN de
transferencia modificado en su extremo 3' por un derivado de
nucleósido que lleva un ciclo morfolino sustituido por una biotina.
Este producto se usa como marcador químico de los ARN de
transferencia para estudiar la localización cromosómica de los genes
de los ARN de transferencia.
En el documento [6], se trata de un
oligonucleótido que lleva un ciclo morfolino unido a una biotina,
que se usa como sonda para la detección y el aislamiento de genes
específicos.
El documento [7] describe derivados de
nucleósidos que llevan un ciclo morfolino sustituido. Se usan para
la preparación de anticuerpos específicos contra un hapteno fijado
al ciclo morfolino del derivado de nucleósido.
El documento [8] ilustra una morfolinoadenosina
sustituida con CH_{2}COOH, usada para cromatografía de
afinidad.
De este modo, ninguno de estos documentos hace
referencia al uso de derivados de nucleótidos como los de la
invención, como terminadores de cadena, en un procedimiento de
secuenciación de ácidos nucleicos según el procedimiento de
Sanger.
Los derivados de nucleótidos usados en el
procedimiento de la invención, pueden prepararse en una sola etapa,
directamente a partir de ribonucleósidos trifosfato según el
siguiente esquema de la reacción ilustrado representando R^{1}
adenina.
Este procedimiento es del mismo tipo que los
procedimientos descritos en los documentos [6] y [7] para formar el
ciclo morfolino.
Se pueden preparar además los derivados de
nucleótidos de fórmula [I] a partir de los morfolinonucleósidos e
introducir después el grupo trifosfato usando el protocolo de
Eckstein, como se describe por Ludgwig y col. en J. Org. Chem. 54,
1989, páginas 631-635 [9].
Las enzimas que pueden usarse para la
polimerización enzimática pueden ser las que se describen a
continuación.
Según la invención, el procedimiento de
preparación de morfolinonucleótidos de fórmula (I) comprende la
reacción de un nucleósido trifosfato de fórmula:
en la que R^{1} tiene el significado dado
anteriormente, con un periodato, un compuesto de fórmula R^{2}
NH_{2} en la que R^{2} tiene el significado dado anteriormente
y de borohidruro de
sodio.
La invención hace referencia igualmente al uso de
un derivado de nucleótido que tiene como precursor un compuesto de
fórmula (I) para el marcaje de 3' de los fragmentos de ácido
nucleico del derivado nucleótido en el extremo 3'-OH
del fragmento de ácido nucleico.
Hace referencia además al procedimiento de
fabricación de un fragmento de ácido nucleico (ADN o ARN) marcado en
3' por incorporación enzimática del derivado de nucleótido citado
anteriormente en el extremo 3'-OH del fragmento de
ácido nucleico.
La enzima usada puede ser el fragmento Klenow de
la ADN polimerasa, y se usa entonces un molde o templado de ADN
para fijar el morfolinonucleósido en el fragmento de ácido nucleico
que sirve de cebador.
Los fragmentos de ADN o ARN marcados de este modo
se usan para bloquear cualquier ligación posterior y asegurar una
protección contra las exonucleasas, así como para detectar los
fragmentos de ADN o ARN.
Se puede además usar un morfolinonucleótido
modificado que tiene como precursor un compuesto de fórmula (I) para
modificar un fragmento de ácido nucleico (ADN o ARN) para la
incorporación enzimática en su extremo 3' de un morfolinonucleótido
modificado que tiene como precursor un compuesto de fórmula (I) que
lleva en R^{3} un compuesto elegido entre los fotorreticulantes,
por ejemplo, para la reticulación sobre el ADN o sobre un soporte
cualquiera; los ácidos grasos, los péptidos hidrófobos, los
anticuerpos, por ejemplo para facilitar la penetración en las
células, las enzimas o partes de enzimas como las fosfatasas
alcalinas, las peroxidasas, las acetilcolinesterasas para la
detección, las enzimas de restricción para el corte del ADN
adyacente, y los fluoróforos.
Como anteriormente la incorporación de este
morfolinonucleótido modificado se realiza por vía enzimática. Las
bases añadidas, los marcadores y las enzimas que se puedan usar
pueden ser las mismas que las que se citan anteriormente.
Según la invención, el derivado de nucleótido, el
morfolinonucleótido modificado y el terminador de cadena usados
respectivamente para el marcaje en 3' de los fragmentos de ácido
nucleico, para la modificación de los fragmentos de ácido nucleico
o para la secuenciación de un ácido nucleico, pueden ser el
compuesto (I) en forma de monofosfato. Otras características y
ventajas de la invención constarán mejor durante la lectura de la
siguiente descripción de los ejemplos de la realización, dados se
entiende a título ilustrativo y no limitante, en referencia a los
dibujos adjuntos.
La figura 1 es un diagrama que ilustra los
resultados obtenidos por la secuenciación de ADN plasmídico con el
terminador de cadena de la invención (curva de trazo continuo) y
con el terminador de cadena de la técnica anterior (curva
discontinua).
La figura 2 es un diagrama que ilustra los
resultados obtenidos al ensayar los morfolino A putrescina (MATPP)
y morfolino A fluoresceína (MATPPF) en la secuenciación.
La figura 3 es un esquema que ilustra el
resultado obtenido en el gel de poliacrilamida de un ensayo que
permite seguir con el alargamiento de un oligonucleótido A y la
incorporación de morfolino A putrescina.
Los ejemplos 1 a 4 siguientes, ilustran la
síntesis de morfolinonucleótidos de fórmula (I).
Esta morfolino A glicina responde a la fórmula
(I) en la que R^{1} es adenina y R^{2} es el grupo
-CH_{2}-COOH.
En este ejemplo, todas las reacciones se llevan a
cabo a temperatura ambiente, con agitación magnética, en un matraz
de 50 ml.
Se disolvió 1,000 g, (1,8 mmol, 5 eq.) de
5'-adenosina trifosfato en 10 ml de agua, después
se añade 1 eq. de periodato de sodio (388 mg, 1,8 mmol). La
disolución se agitó después durante 35 minutos.
Se añadió la glicina (682 mg, 9,1 mmol, 5 eq.) en
disolución en 2 ml de agua (pH = 9,5-10) y se sube
el pH de la disolución a 9,5-10 con carbonato de
potasio sólido. La disolución se agitó durante 55 minutos. La
mezcla de la reacción se tiñe de amarillo.
Se añadió borohidruro de sodio (al total de 166
mg, 4,4 mmol, 2,5 eq.) en seis fracciones equivalentes, cada una se
disolvió en 0,2 ml de agua. Tras la adición de la primera, se
aprecia una liberación gaseosa. Las otras fracciones, cada una
disuelta justo antes de la adición, se adicionaron cada hora.
\newpage
Después de una noche, la disolución se neutralizó
mediante la adición de ácido fórmico 1M hasta un pH de
4-5, después se evaporó.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa en una columna Merck LiChrocart 125-4
LiChrospher 100 RP-18 ("sellada en el extremo",
5 \mum. 125 x 4 mm) usando un flujo de 1 ml/min y el eluyente
acetato de trietilamonio ATEA 25 mM/metanol MeOH [98/2], indica un
rendimiento del 40% (k'= 3,85).
Purificación
Se realiza por cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) de preparación usando una columna Macherey Ángel
Nucleosil / C-18 7 \mum, 250 x 21 mm) con un
flujo de 8 ml/min y el bicarbonato de trietilamonio BTEA 25 mM, como
eluyente.
Caracterización
- RMN ^{1}H: \delta (ppm): 8,47 (s, 1H, H2);
8,37 (s, 1H, H8); 6,26 (dd, 1H, H5'); 4,54 (m, 1H, H4'); 4,28 (m,
1H, H5''); 4,22 (m, 1H, H5'); 3,70 (m, 1H H2'); 3,68 (s, 2H,
CH_{2}-Glicina); 3,41 (m, 1H, H2''); 3,45 (m, 1H,
H3'); 3,30 (M, 1H, H3'');
- RMN ^{13}C: \delta (ppm): 152,7 (C2); 140,5
(C8); 78,6 (C1'); 74,1 (C4'); 66,4 (C5'); 60,6 (CH_{2}); 54,5
(C2'); 53,6 (C3');
- RMN ^{31}P: \delta (ppm): -5,44 (d, 1P,
\gammaP); -11,68 (d, 1P, \alphap); -22,11 (t, 1P, \betaP)
- Espectrometría de masas:
M-H^{-}= 547,04 g.mol^{-1}
Este compuesto 4 responde a la fórmula (I)
representando R^{1} timina y representando R^{2} el grupo
-CH_{2}-COOH.
En este ejemplo, se prepara todo antes que el
morfolinonucleósido, después se transforma en trifosfato.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 250
ml.
La ribotimidina (3,500 g, 13,5 mmol, 1 eq.) se
diluyó en 35 ml de agua, después se añadió 1 eq. de periodato de
sodio (2,900 g, 13,5 mmol). La disolución, se agitó después durante
45 minutos.
Se añadió la glicina (5,089 8, 67,8 mmol, 5 eq.)
en 35 ml de agua (pH= 9,5-10) y el pH de la
disolución e subió a 9,5-10 mediante carbonato de
potasio. La disolución se agitó durante una hora y 45 minutos. La
mezcla de la reacción se tiñó de amarillo.
Se añadió a la disolución una sexta parte de
borohidruro de sodio (al total de 1,280 g, 33,8 mmol, 2,5 eq.)
disuelta en 3,5 ml de agua. Se aprecia una liberación gaseosa. Las
otras sextas partes, cada una disuelta justo antes de la adición,
se añadieron cada hora.
Después de una noche, la disolución se neutralizó
mediante la adición de ácido fórmico 1M hasta un pH
4-5, después se evaporó.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa sobre una columna Merck LiChrocart
125-4 LiChrospher 100 RP-18
("sellada en el extremo", 5\mum, 125 x 4 mm), con un flujo
de 1 ml/min, usando como eluyente: ATEA 25 mM/MeOH (99/1), indica un
rendimiento del 32% (k'= 8,83).
Purificación
Se realiza por cromatografía "flash" sobre
una columna de sílice en polaridad de fase inversa
C-18 (Matrex, Amicon). El eluyente es el agua.
Caracterización
- RMN ^{1}H: \delta (ppm): 7,77 (s, 1H, H6);
5,92 (dd, 1H, H1'); 4,07 (m, 1H, H4'); 3,77 (m, 2H, H5', H5'');
3,22 (s, 2H, CH_{2} glicina); 3,13 (dd, 1H, H2''); 2,99 (dd, 1H,
H3''); 2,51 (t, 1H, H2'); 2,34 (t, 1h, H3'); 1,98 (s, 3H, CH_{3}
base).
A 342 mg de imidazol (5,0 mmol, 3 eq.) secados en
un desecador y recogidos después en 5 ml de piridina rigurosamente
anhidro, se añaden 234 \mul de oxicloruro tricloruro de fósforo
(2,5 mmol, 1,5 eq.). La mezcla se colocó bajo agitación durante 30
minutos en aire seco.
Paralelamente, se secaron 3 veces 500 mg de la
morfolinotimidina (1,7 mmol, 1 eq.) obtenidos en a) en la piridina,
después se recogen en 5 ml de piridina anhidro.
La mezcla imidazol/POCl_{3}/piridina bajo argón
se adicionó a la disolución de morfolinonucleósido y el conjunto se
colocó bajo agitación durante 48 horas a temperatura ambiente.
Después se añaden 100 \mul de agua teniendo cuidado de refrigerar
el matraz de la reacción en un baño de agua helada. La mezcla de la
reacción se evaporó en seco, después se recogió dos veces con el
agua y se evaporó para eliminar la piridina.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa sobre una columna Macherey Angel Nucleosil 5
C-18 (7 \mum, 120 x 3 mm), con un flujo de: 1
ml/min, usando como eluyente: ATEA 25 mM-MeOH
(97/3), indica un rendimiento del 33% (k'= 0,62)
Purificación
Se realiza por HPLC de preparación sobre H:
columna Macherey Ángel Nucleosil 7: C-18 (7 \mum,
250 x 21 mm) con un flujo de 5 ml/min usando agua como
eluyente.
Caracterización
- RMN ^{1}H: \delta (ppm): 7,80 (s, 1H, H6);
5,95 (dd, 1H, H1'); 4,19 (m, 1H, H4'); 3,94 (t, 2H, H5', H5'');
3,28 (s, 2H, CH_{2} glicina); 3,24 (m, 1H, H2''); 3,10 (m, 1H,
H3''); 2,53 (t, 1H, H2'); 2,39 (t, 1H, H3'); 2,00 (s, 3H, CH_{3}
base)
- RMN ^{31}P: \delta (ppm): 1,74 (s)
Se añaden 1,097 g de carbonilimidazol (6,7 mmol,
5 eq.) disueltos en 5 ml de dimetilformamida anhidro a la sal de
tributilamonio del morfolinonucleósido monofosfato de la timina 3
obtenida en b) (511 mg, 1,3 mmol, 1eq.) disueltos en 3 ml de
dimetilformamida anhidro. La mezcla se colocó bajo agitación a
temperatura ambiente durante cinco horas. El exceso de
carbonilimidazol se destruyó mediante la adición de 436 \mul de
metanol (10,8 mmol, 8 eq.). Después de 30 minutos, se añadieron 5
equivalentes de pirofosfato de tributilamonio en disolución en 5 ml
de dimetilformamida. La mezcla se colocó bajo agitación durante dos
horas, después la mezcla de la reacción se filtró y se evaporó en
seco.
Se realizó un análisis por cromatografía de
polaridad en fase inversa sobre una columna SFCC PVDI 31 (5 \mul,
100 x 4,6 m,), con un flujo de 1 ml/min, usando como eluyente un
gradiente de formiato de amonio (FA), en las condiciones
siguientes:
| t (min) | FA 25 mM (%) | FA 0,9 M (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 10 | 100 | 0 |
| 40 | 0 | 100 |
| 41 | 0 | 100 |
| 43 | 100 | 0 |
Esto indica un rendimiento del 27% (k'=
13,84).
Purificación
Se realiza por cromatografía "flash" sobre
una columna de fase de intercambio iónico (DEAE Sepharose Fast Flow,
Pharmacia Biotech). El eluyente es un gradiente de BTEA (de 25 mM a
0,9 M).
\newpage
Caracterización
- RMN ^{1}H: \delta (ppm): 7,74 (s, 1H, H6);
5,92 (dd, 1H, H1'); 4,25 (m, 1H, H4'); 4,15 (m,2H, H5', H5''); 3,81
(s, 2H, CH_{2} glicina); 3,54 (d, 1H, H2''); 3,10 (t, 1H, H3'');
2,56 (t, 1H, H2'); 2,45 (t, 1H, H3'); 1,95 (s, 3H, CH_{3}
base)
- RMN ^{31}P: \delta (ppm): -10,03 (d, 1P,
\gammaP); -10,88 (d, 1P, \alphaP); -22,65 (t, 1P, \betaP)
- Espectrometría de masas:
M-H^{-}= 540,41 g.mol^{-1}
Esta morfolino G glicina 5 responde a la fórmula
(I) en la que R^{1}= guanina y R^{2}= -CH_{2}COOH.
La guanosin,5'-trifosfato (50 mg,
0,08 mmol, 1 eq.) se disolvió en 2 ml de agua, después se añadió 1
eq. de periodato de sodio (18 ng, 0,08 mmol). La disolución se
agitó entonces durante 35 minutos. Se añadió la glicina (31 mg, 0,42
mmol, 5 eq.) en disolución en 2 ml (pH= 9,5-10) y
se subió el pH de la disolución a 9,5-10 con
carbonato de potasio sólido (controlado con una tira de pH). La
disolución se agitó durante 45 minutos. Se añadió borohidruro de
sodio (al total de 8 mg, 0,21 mmol, 2,5 eq.) en seis fracciones
equivalentes, cada una disuelta en 0,1 ml de agua. Las otras
fracciones, cada una disuelta justo antes de la adición, se
añadieron cada hora. Después de una noche, la disolución se
neutralizó mediante la adición de ácido fórmico 1M hasta un pH
4-5, después se evaporó.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa (Sistema E) sobre una columna SFCC 31 (15 \mum 100 x
4,6 mm) con un flujo de: 1ml/min, usando como eluyente un gradiente
de formiato de amonio, en las siguientes condiciones:
| t (min) | FA 25 mM (%) | FA 1M (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 3 | 100 | 0 |
| 10 | 0 | 100 |
| 15 | 0 | 100 |
| 17 | 100 | 0 |
Este análisis da un rendimiento del 39% (k'=
5,5).
Se purifica el compuesto 5 por HPLC de
preparación usando el sistema F: Columna Vydac
Sax-Protéin (8 \mum, 100 x 4,6 mm). Flujo: 10
ml/min. Eluyente: gradiente de formiato de amonio, en las siguientes
condiciones
| t (min) | FA 25 mM (%) | FA 1M (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 3 | 100 | 0 |
| 10 | 0 | 100 |
| 15 | 0 | 100 |
| 17 | 100 | 0 |
Se obtienen 14 mg del compuesto 5, siendo el
rendimiento del 26,1%.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
8,07 (s, 1H, H8); 6,06 (dd, 1H1, H1'); 4,51 (m, 1H, H4'); 4,22 (m,
2H, H5', H5''); 3,71 (m, 1H, H2''); 3,67 (s, 2H, -CH_{2} glicina);
3,46 (m, 1H, H3''); 3,38 (m, 1H, H2'); 2,95 (m, 1H, H3').
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
137,50 (-COOH); 158, 91 (C6); 153,98 (C2); 151,07 (C4); 137,39
(C8); 115,94 (C5); 77,87 (C1'); 73,62 (C4'); 65,61 (C5); 59,98
(-CH_{2}-); 53,28 (C2'); 51,88 (C3').
- RMN ^{31}P (U 400 Varian): \delta (ppm):
-7,14 (d, 1P, \gammaP); 8,68 (d, 1P, \alphaP); -20,28 (t, 1P,
\betaP).
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo positivo): M+H^{+}= 564,9 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 256 nm.
- Electroforesis capilar: \muep= -4,28 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
El compuesto 6 responde a la fórmula (I) en la
que R^{1}= citosina y R^{2}=
-CH_{2}-COOH.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 20
ml.
La reacción es la misma que para el compuesto 5 a
partir de 5'-citosina trifosfato (50,0 mg, 0,09
mmol, 1 eq.), de periodato de sodio (21 mg, 0,09 mmol, 1 eq.), de
glicina (36 mg, 0,048 mmol, 5 eq.) en disolución en 2 ml de agua
(pH= 9,5-10), de borohidruro de sodio (al total de
9 mg, 0,23 mmol 2,5 eq.), añadida en seis fracciones equivalentes,
cada una disuelta en 0,05 ml de agua.
Un análisis por cromatografía sobre una columna
de fase de intercambio iónico (sistema E) como en el ejemplo 3,
indica un factor de capacidad de k'= 4,08.
Se purifica el producto por HPLC de media
preparación el sistema F como en el ejemplo 3.
Se aísla 1 mg de producto, que corresponde a un
24,3% de rendimiento.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
7,93 (d, 1H, H6); 6,25 (dd, 1H, H1'); 6,20 (d,1H, H5); 4,51 (m, 1H,
H4'); 4,27 (m, 2H, H5', H5''); 3,85 (m, 4H, H2'' + H3'' + -CH_{2}
glicina); 3,33 (t, 1H, H2'); 3,22 (t, 1H, H3').
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
173,05 (-COOH); 165,13 (C4); 154,23 (C2); 140,93 (C6); 95,48 (C5);
80,42 (C1'); 78,44 (C4'); 69,37 (C5'); 64,57 (-CH_{2}-); 54,66
(C2'); 53,67 (C3').
- RMN ^{31}P (WM 250 Brüker): \delta (ppm):
-7,99 (d, 1P, \gammaP); -10,10 (d, 1P, \alphaP); -21,28 (t, 1P,
\betaP).
- Espectrometría de masas (dispositivo VG
ZAB-2-EQ, modo negativo):
M-H^{-}= 521,9 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 270 nm
- Electroforesis capilar: \muep= -4,28 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
Esta morfolino A putrescina 7 responde a la
fórmula (I) representando R^{1} adenina y representando R^{2}
el grupo -(CH_{2})_{4}-NH_{2}.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 100
ml.
La 5'-adenosina trifosfato (500
mg, 0,9 mmol, 1 eq.) se disolvió en 10 ml de agua, después se
añadió 1 eq. de periodato de sodio (194 mg, 0,9 mmol). La
disolución se agitó durante 45 minutos.
Se añadió la putrescina (456 \mul, 4,5 mmol, 5
eq.). La disolución se agitó durante 45 minutos. La mezcla de la
reacción se tiñó de amarillo.
Se añadió una sexta parte de borohidruro de sodio
(al total de 86 mg, 2,3 mmol, 2,5 eq.) disuelta en 0,1 ml de agua a
la disolución. Se aprecia una liberación gaseosa. Las otras sextas
partes, cada una disuelta justo antes de la adición, se añaden cada
hora.
Después de una noche, la disolución se neutralizó
mediante la adición de ácido fórmico 1M hasta un pH de
4-5, después se evaporó.
Se realiza un análisis por cromatografía de
polaridad en fase inversa sobre una columna de Merck LiChrocart
125-4 LiChrospher 100 RP-18
("sellada en el extremo", 5 \mum, 125 x 4 mm) con un flujo
de 1ml/min, usando como eluyente un gradiente de BTEA 25 mM/MeOH,
en las siguientes condiciones:
| t (min) | BTEA (%) | MeOH (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 2 | 97 | 3 |
| 10 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
| 17 | 97 | 3 |
Este análisis indica un rendimiento del 67% (k'=
3,81).
Se purifica el producto 7 por HPLC de media
preparación sobre la columna Phenomenex Utremex
5-C18 (250 x 10 mm) con un flujo de 4 ml/min. y
usando como eluyente un gradiente de BTEA 25 mM/MeOH, en las
siguientes condiciones:
| t (min) | BTEA (%) | MeOH (%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 3 | 95 | 5 |
| 8 | 90 | 10 |
| 10 | 95 | 5 |
Caracterización
- RMN ^{1}H: \delta (ppm): 8,44 (s, 1H, H2);
8,33 (s, 1H, H8); 6,06 (dd, 1H, H1'); 4,35 (m, 1H, H4'); 4,22 (m,
2H, H5', H5''); 3,39 (d, 1H, H2'); 3,22 (t; 1H, H3''); 3,14 (s, 2H,
CH_{2} putrescina); 2,54 (t, 1H, H3'); 1,78 (s, 4H,
(CH_{2})_{2}) putrescina.
- RMN ^{31}P: \delta (ppm): -8,45 (dd, 1P,
\gammaP); -13,25 (dd, 1P, \alphaP); -24,20 (t, 1P,
\betaP).
- Espectrometría de masas: M+H^{+}= 561,92
g.mol^{-1}
El compuesto 9 responde a la fórmula (I) en la
que R^{1}= timina y R^{2}=
-(CH_{2})_{4}-NH_{2}
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 250
ml.
La ribotimidina (2,000 g, 7,74 mmol, 1 eq.) se
disolvió en 30 ml de agua, después se añadió 1 eq. (1,656 g, 7,75
mmol) de periodato de sodio. La disolución se agitó después durante
70 minutos. Se añadió la putrescina (3,9 ml, 38,75 mmol, 5 eq.). La
disolución se agitó durante 50 minutos. La mezcla de la reacción se
tiñó de amarillo.
Se añadió a la disolución una sexta parte de
borohidruro de sodio (al total de 735 mg, 19,42 mmol, 2.5 eq.)
disuelta en 0,25 ml de agua. Se aprecia una liberación gaseosa. Las
otras sextas partes, cada una disuelta antes de la adición en los
0,25 ml de agua, se añaden cada hora. Después de una noche, la
disolución se neutralizó mediante la adición de ácido fórmico 1M
hasta un pH 4-5, después se evaporó.
\newpage
Se realiza un análisis por cromatografía de
polaridad en fase inversa usando el sistema G: columna
Merck-LiChrocart 125-4 LiChrospher
100 RP.18 ("sellada en el extremo", 5 \mum, 125 x 4 mm).
Flujo: 1 ml/min. Eluyente: gradiente de BTEA 25 mM/CH_{3}CN, en
las siguientes condiciones:
| t (min) | BTEA 25 mM(%) | CH_{3}CN (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 4 | 100 | 0 |
| 15 | 85 | 15 |
| 18 | 100 | 0 |
Lo que indica un rendimiento del 76% (k'=
5,7).
Se purifica por HPLC de preparación usando el
sistema H: columna Mecherey Ángel Nucléosil 7 C-18
(7 \mum, 250 x 21 mm). Flujo 10 ml/min. Eluyente: BTEA- 25
mM/CH_{3}CN (85/15).
Se obtienen 1,56 g del compuesto 8, siendo el
rendimiento del 64,6%.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AC 200 Brüker): \delta (ppm):
7,69 (s, 1H, H6); 5,88 (dd, 1H, H1'); 4,01 (m, 1H, H4'); 3,80 (m,
1H, H5', H5''); 3,08 (m, 4H, H2'', H3'', 2Ha); 2,63 (m, 2H, 2 Hd);
2,33 (t, 1H, H2'); 2,22 (t, 1H, H3'); 1,98 (m, SH, -CH_{3}); 1,74
(m, 4H, 2 Hb, 2 Hc).
- RMN ^{13}C (AC 200 Brüker): \delta (ppm):
171,16 (C2); 154,58 (C4); 135,93 (C6); 110,46; (C5); 78,62 (C1');
75,04 (C4'); 61,10 (C5'); 55,82 (C3'); 53,49 (C2'); 51,30 (Ca);
38,39 (Cd); 24,50 (Cc); 21,31 (Cb); 11,10 (-CH_{3}).
- Espectro UV: \lambda_{max}= 266 nm.
La morfolinotimidina/putrescina 8 (249 mg, 0,80
mol, 1 eq.) se secó en una bomba con paletas durante 1 hora. Se
añade después 356 mg de Proton-sponge(r)
(1,19 mmol, 1,5 eq.) y se le adicionan 2 ml de trimetilfosfato
anhidro; se enfría el medio en un baño de agua helada; bajo
agitación después se adicionan 109 \mul de oxicloruro de fósforo
(al total de 2,24 mmol, 2,8 eq.). Después de 2 h 30, se adiciona de
nuevo 50 ml de oxicloruro de fósforo, y se comienza de nuevo 12 h
después, se añade 8 ml de una disolución de pirofosfato 0,5M en
forma de sal de tributilamonio (4,0 mmol, 5 eq.), en el DMF anhidro.
Se deja bajo agitación a 0ºC durante un minuto, después el medio se
seca en rotavapor y bomba de paleta.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa usando el sistema I: columna Vydac
Sax-Protein (8 \mum, 100 x 4,6 mm) con un flujo:
10 ml/min usando como eluyente un gradiente de formiato de amonio,
en las siguientes condiciones:
| t (min) | FA 25 mM (%) | FA 1M (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 1 | 100 | 0 |
| 15 | 70 | 30 |
| 17 | 100 | 0 |
Indica un factor de capacidad K'= 3,2
Se purifica por HPLC de preparación usando el
sistema I descrito anteriormente.
Se obtienen 58 mg de 9, siendo el rendimiento del
13,2%.
\newpage
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
7,83 (s, 1H, H6); 6,31 (dd, 1H, H1'); 4,68 (m, 1H, H4'); 4,39 (m,
1H, H5', H5''); 4,01 (d, 1H, H2''); 3,93 (d, 1H, H3''); 3,58 (m,
2H, 2 Ha); 3,51 (t, 1H, H2'); 3,41 (m, 1H, H3'); 3,28 (m, 2H, 2 Hd);
2,10 (s, 5H, -CH_{3} + 2 Hb); 2,00 (m, 2H, 2Hc).
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
166, 36 (C2); 151,03 (C4); 136,73 (C6); 112,42 (C5); 77,33 (C1');
72,46 (C4'); 65,10 (C5'); 57,04 (C3); 51,71 (C2'); 51,13 (Ca);
98,91 (Cd); 23,85 (Cc); 20,50 (Cb); 11,62 (-CH_{3}).
- RMN ^{31}P (U 400 Varian): \delta (ppm):
-8,19 (s, 2P, \Gammap, \alphaP); -18,99 (T, 1p, \betap).
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo negativo): M-H^{-}= 551,3 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 262 nm.
- Electroforesis capilar: \muep= -4,69 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
El compuesto 10 responde a la fórmula (I) en la
que R^{1}= guanina y R^{2}=
-(CH_{2})_{4}-NH_{2}-.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 50
ml.
La guanosina, 5'-trifosfato (50
mg, 0,17 mmol, 1 eq.) se disuelve en 5 ml de agua, después se añade
un 1 eq. de periodato de sodio (37 mg, 0,17 mmol, 1 eq.). La
disolución se agitó después durante 30 minutos.
Se añadió la putrescina (85 \mul, 0,84 mmol, 5
eq.) y y se midió el pH de la disolución que es igual a 10. Si se
hubiera encontrado un valor inferior, se habría añadido carbonato de
potasio para obtener dicho valor. La disolución se agitó durante 45
minutos.
Se añadió borohidruro de sodio (al total de 8,7
mg, 0,45 mmol, 2,5 eq.) en seis fracciones equivalentes, cada una
disuelta en 0,1 ml de agua. Las otras fracciones cada una disuelta
justo antes de la adición, se añaden cada hora.
Después de una noche, la disolución se neutralizó
mediante la adición de ácido fórmico 1M hasta un pH de
4-5, después se evaporó.
Se purifica el compuesto 10 por precipitación en
metanol, después se pasa por 5 ml de resina Dowex en forma de
Na^{+}.
Se obtienen 68 mg del compuesto 10, siendo el
rendimiento del 62,2%.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
8,29 (s, 1h, h8); 6,31 (dd, 1h, h1'); 4,74 (m, 1h, h4'); 4,37 (m,
2h, h5', h5''); 3,99 (m, 1h, h2''); 3,96 (m, 1H, H3''); 3,79 (t, 1H,
H2'); 3,47 (m, 2H, 2 Hb); 3,39 (t, 1H, H3'); 3,19 (m, 2H, 2 Hc);
2,06 (m, 2H, 2 Ha); 1,91 (m, 2H, 2 Hd).
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
151,11 (C6); 154,12 (C2); 149,91 (C4); 136,95 (C8); 113,46 (C5);
76,99 (C1'); 72,58 (C4'); 65,25 (C5'); 56,95 (Ca); 51,81 (C2!60!);
50,52 (C3''); 30,04 (Cd); 23,76 (Cc); 20,36 (Cb).
- RMN ^{31}P (U 400 Varian): \delta (ppm): -
8,28 (d, 1P, \gammap); -8,97 (d, 1P, \alphaP); -20,45 (t, 1P,
\betaP).
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo negativo): M-H^{-}= 576,9 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 252 nm.
- Electroforesis capilar: \muep= -3,41 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1},s^{-1}.
Toda la reacción se realizó a temperatura
ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 50 ml.
La reacción es la misma que para el compuesto 7,
a partir de la citosina,5'-trifosfato (50 mg, 0,09
mmol, 1 eq.), de periodato de sodio (20 mg, 0,09 mmol, 1 eq.), de
la putrescina (47 \mul, 0,47 mmol, 5 eq.), borohidruro de sodio
(al total de 9,1 mg, 0,24 mmol, 2,5 eq.) añadido en seis fracciones
equivalentes, cada una disuelta en 0,1 ml de agua.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa (sistema O): columna Merck LiChrocart
125-4 LiChrospher 100RP-18
("sellada en el extremo", 5 \mum, 125 x 4 mm). Flujo: 1
ml/min. Eluyente gradiente de BTEA 25 mM/MeOH, en las siguientes
condiciones:
| t (min) | BTEA 25 mM (%) | MeOH (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 2 | 97 | 3 |
| 10 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
| 17 | 97 | 3 |
indica un factor de capacidad de k'=
4,18.
Se purifica el compuesto 11 por precipitación en
metanol, después se pasa sobre 5 ml de resina Dowex en forma de
Na^{+}.
Se obtienen 47 mg de 11, lo que corresponde a un
rendimiento del 85,4%.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
7,78 (d, 1H, H6; 6,17 (d, 1H, H5); 5,96 (dd, 1H, H1'); 4,22 (m, 1H,
H4'); 3,91 (m, 2H, H5', H5''); 3,28 (m, 1H, H2''); 3,20 (m, 1H,
H3''); 3,16 (m, 2H, 2 Ha); 2,80 (m, 2H, 2 Hd); 2,44 (m, 1H, H2');
2,32 (m, 1H, H3'); 1,79 (m, 4H, 2 Hb + 2 Hc).
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
166,056 (C4); 157,28 (C2); 142,43 (C6); 96,98 (C5); 80,57 (C1');
75,13 (C4'); 66,48 (C5'); 57,11 (Ca); 55,30 (C2'); 52,45 (C3');
30,66 (Cd); 25,29 (Cc); 22,70 (Cb).
- RMN ^{31}P (WM 250 Brüker): \delta (ppm):
-5,42 (d, 1P, \gammaP); -10,06 (d, 1P, \alphaP); -20,82 (m, 1P,
\betaB).
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo negativo): M-H^{-}= 536,0 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 268 nm.
- Electroforesis capilar \muep= -2,99 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
Este compuesto 12 responde a la fórmula (I)
representando R^{1} adenina, y representando R^{2}
(CH_{2})_{4}NHR^{3} en la que R^{3} es un grupo
derivado de la fluoresceína.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 100
ml.
Se añade en tres veces y de manera progresiva a
200 mg (0,3 mmol, 1 eq.) de la Morfolino A putrescina 7 del ejemplo
5, en una mezcla de agua/piridina (1/1), 184,9 mg (0,5 mmol, 1,5
eq.) de isotiocianato de fluoresceína. El medio se agitó durante 48
horas antes de evaporarse en seco.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa sobre la columna Merck LiChrocart
125-4 LiChrospher 100 RP-18
("sellada en el extremo", 5 \mum, 125 x 4 mm), con un flujo
de 1 ml/min usando como eluyente: ATEA 25 mM/MeOH (97/3), indica un
rendimiento del 48% aproximadamente (k'= 7,51).
\newpage
Purificación
se realiza por cromatografía "flash" sobre
una columna de sílice en polaridad de fase inversa
C-18 (Econosil prep. 90, Alltech, France). El
eluyente es un gradiente de agua/MeOH.
Caracterización
- RMN ^{1}H: \delta (ppm): 8,57 (s, 1H, H2);
8,31 (s, 1H, H8); 8,20-6,95 (9H, fluoresceína);
5,79 (dd, 1H, H1'); 4,25 (m, 1H, H4'); 4,11 (m,2H, H5', H5''); 3,60
(s,2H, CH_{2} putrescina); 3,12 (d, 1H, H3''); 2,93 (d, 1H, H2'');
2,81 (m, 1H, H2''); 2,59 (m, 2H, CH_{2} putrescina); 2,50 (dd,
1H, H3'); 1,79 (s, 2H, CH_{2} putrescina); 1,62 (m, 2H, CH_{2}
putrescina).
- RMN ^{11}P: \delta (ppm): -8,45 (dd, 1P,
\gammaP), -13,25 (dd, 1P, \alphaP); 24,20 (t, 1P, \betaP)
- Espectrometría de masas:
M-H^{-}= 949,2 g.mol^{-1}.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 25
ml.
A 30 mg (0,05 mmol, 1 eq.) del compuesto 9
disuelto en 2 ml de una mezcla agua/piridina (1/1), se añade en tres
veces 31 mg (0,08 mmol, 1,5 eq.) de isotiocianato de fluoresceína.
El medio se agitó durante 48 horas antes de evaporarse en seco.
Se purifica el compuesto 13 por cromatografía
líquida de alta resolución de preparación media, sobre una columna
de polaridad en fase inversa (Sistema L): columna Macherey Ángel
Nucléosil 7 C-18 (7 \mum 250 x 21 mm). Flujo 10
ml/min. Eluyente BTEA 25 mM/CH_{3}CN, en las siguientes
condiciones:
| t (min) | BTEA 25 mM(%) | CH_{3}CN (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 4 | 100 | 0 |
| 15 | 73 | 27 |
| 18 | 100 | 0 |
Caracterización
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo positivo): M-H^{+}= 942,1 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 488 nm.
- Electroforesis capilar: \muep= -4,23 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
Todas las reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 25
ml.
A 30 mg (0,05 mmol, 1 eq.) del compuesto 10,
disuelto en 2 ml de una mezcla agua/piridina (1/1), se añade en
tres veces y de manera progresiva 30 mg (0,08 mmol, 1,5 eq.) de
isotiocianato de fluoresceína. El medio se agitó durante 48 horas
antes de evaporarse en seco.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa (sistema M): columna Merck-LiChrocart
125-4 LiChrospher 100 RP-18
("sellada en el extremo", 5 \mum, 125 x 4 mm). Flujo 1
ml/min. Eluyente: gradiente BTEA 25 mM/CH_{3}CN, en las
siguientes condiciones:
\newpage
| t (min) | BTEA 25 mM(%) | CH_{3}CN (%) |
| 0 | 100 | 0 |
| 4 | 100 | 0 |
| 15 | 73 | 27 |
| 18 | 100 | 0 |
indica un rendimiento de alrededor del 24% (k'=
4,62).
Se purifica el compuesto 14 por cromatografía
líquida de alta resolución de preparación media, sobre una columna
de polaridad en fase inversa usando el Sistema L del ejemplo
10.
Se obtienen 14,5 mg del compuesto 14, siendo un
rendimiento del 30,0%.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
7,87 (s, 1H, H8); 7,70-6,63 (9H, fluoreseceína);
5,60 (dd, 1H, H1'); 4,18 (m, 1H, H4'); 4,12 (m, 2H, H5', H5'');
3,82 (m, 1H Ha); 3,61 (m, 1H, HA); 3.08 (d, 1H, H3''); 2,95 (d, 1H,
H2''), 2,82 (m, 1H, H2'); 2,71 (m, 1H, Hd); 2,55 (m, 1H, Hd); 2,39
(t, 1H, H3'); 1,77 (m, 2H, 2 Hb); 1,62 (m, 2H, 2 Hc).
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
180,58 (varias C fluoresceína); 158, 37 (varias C fluoresceína);
136,98 (C6); 131,06 (C2); 126,7 (C4); 122,85 (varias C
fluoresceína); 112,03 (C8); 103,80 (varias C fluoresceína); 78,91
(C1'); 74,83 (C4'); 65,96 (C5'); 57,27 (Ca); 53,79 (C2'); 52,56
(C3'); 48,87 (Cd); 25,70 (Cc); 22,75 (Cb).
- RMN ^{31}P (U 400 Varian): \delta (ppm):
-4,93 (dd, 1P, \gammaP); -9,82 (d, 1P, AP); -19,94 (t, 1P,
\betaP).
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo negativo): M-H^{-}= 985,3 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 494 nm.
- Electroforesis capilar: \muep= -3,83 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
Todas la reacciones se llevan a cabo a
temperatura ambiente, bajo agitación magnética, en un matraz de 10
ml.
A 30 mg (0,05 mmol, 1 eq.) del compuesto 11,
disueltos en 2 ml de una mezcla agua/piridina (1/1), se añaden en
tres veces 36 mg (0,09 mmol, 1,5 eq.) de isotiocianato de
fluoresceína. El medio se agitó durante 48 horas antes de evaporarse
en seco.
Un análisis por cromatografía de polaridad en
fase inversa (sistema M descrito en el ejemplo 11) indica un factor
de capacidad k'= 4,7.
Se purifica el compuesto 15 por cromatografía
líquida de alta resolución de preparación media, sobre una columna
de polaridad en fase inversa (Sistema L del ejemplo 10).
Se obtienen 22,7 mg del compuesto 15, siendo el
rendimiento del 44,3%.
Caracterización
- RMN ^{1}H (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
7,99 (s, 1H, H6); 7,87-6,69 (9H, fluoresceína);
5,78 (d, 2H, H5 + H1'); 4,14 (m, 1H, H4'); 3,77 (m, 2H, H5', H5'');
3,36 (m, 2H, 2 Ha); 3,32 (m, 1H, H2''); 3,03 (m, 1H, H3''); 2,81 (m,
1H, H2'); 2,69 (m, 2H, 2 Hd, 1,79; 2,30 (m, 1H, H3'); 1,79 (m, 2H,
2 Hb); 1,68 (m, 2H, 2 Hc).
- RMN ^{13}C (AM 400 Brüker): \delta (ppm):
175,06 (varias C fluoresceínas), 15557,62 (C2); 141,39 (varias C
fluoresceínas); 131,56 (C6); 121,06 (varias C fluoresceínas); 114,60
(varias C fluoresceínas); 103,30 (varias C fluoresceínas); 96,53
(C5); 79, 10 (C1'); 73,67 (C4'); 65,42 (C5'); 58,89 (Ca); 57,19
(C2'); 51,78 (C3'); 46,61 (Cd); 25,48 (Cc); 21,38 (Cb).
- RMN ^{31}P (U 400 Varian): \delta (ppm):
-2,97 (d, 1P, \gammaP); -7,54 (d, 1P, \alphaP); -18,56 (m, 1P,
\betaP).
- Espectrometría de masas (dispositivo LCQ en
modo negativo): M-H^{-}= 925,2 g.mol^{-1}.
- Espectro UV: \lambda_{max}= 491 nm.
- Electroforesis capilar: \muep= -4,26 x
10^{-4} cm^{2}.V^{-1}.s^{-1}.
Se ensaya la morfolino T glicina 4 del ejemplo 2
en reacción de secuencia con cebadores fluorescentes (Applied
Biosystems, Perkin Elmer, Foster City, CA, Estados Unidos) sobre un
molde patrón que es una ADN plasmídico Bluescript (Stratagene, La
Jolla, CA, Estados Unidos). La enzima usada es una Taq polimerasa
(Perkin Elmer) que se usa con su tampón (tampón TACS, Perkin
Elmer).
Se realizan dos reacciones con la morfolino T
glicina a 200 y 500 \muM (tabla 4), así como dos reacciones
control (tabla 5) con el didesoxinucleótido T (Boehringer).
El medio de la reacción con un volumen total de
10 \mul contiene 125 ng de molde, 1,25 pmol de cebador
fluorescente y los otros componentes dados en las tablas 4 y 5. El
medio se somete a ciclos térmicos con el propósito de realizar un
número de moléculas de nuevas hebras de ADN formadas. Se realizó
una amplificación sobre un dispositivo Perkin Elmer 9700, según las
siguientes secuencias: 3 min, 95ºC; 15 ciclos (15 s, 95ºC; 15 s,
55ºC; 1 min, 70ºC); 15 ciclos (15 s, 95ºC; 1 min, 70ºC). El producto
de amplificación se purificó sobre una columna de Sephadex G50.
La migración del producto de amplificación
obtenido en el eluído de la columna se realiza en un gel
desnaturalizante (urea 7M) de acrilamida de tipo Long Ranger (6%),
en TBE 1X, sobre un dispositivo Applied Biosystems 377. La
electroforesis se desarrolla durante 12 horas a 1500 V.
La preparación de la disolución de almacenamiento
de nucleótidos que representa en la presente invención una mezcla de
los cuatro nucleósidos trifosfato naturales, empobrecida en
timidina trifosfato (llamada mezcla dTTP) se realiza de la
siguiente manera.
Se mezclan 2 \mul de una disolución 1,25 mM de
dTTP (Promega) con 2 \mul de dATP 5 mM (Promega), 2 \mul de
dCTP 5 mM (Promega) y 2 \mul de dGTP 5 mM (Promega).
\vskip1.000000\baselineskip
| Morfolino T | Morfolino T | |
| glicina 200 \muM | glicina 500 \muM | |
| Tampón TACS (5X) | 2 \mul | 2 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul | 1 \mul |
| Mezcla dTTP | 1 \mul | 1 \mul |
| Morfolino T glicina 2 mM | 1 \mul | 2,5 \mul |
| Taq (3U/\mul) | 1 \mul | 1 \mul |
| Molde | 1 \mul | 1 \mul |
| Agua | 3 \mul | 1,5 \mul |
| ddTTP 250 \muM | ddTTP 300 \muM | |
| Tampón TACS (5X) | 2 \mul | 2 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul | 1 \mul |
| Mezcla dTTP | 1 \mul | 1 \mul |
| Morfolino T glicina 2 mM | 1 \mul | 2,5 \mul |
| Taq (3U/\mul) | 1 \mul | 1 \mul |
| Molde | 1 \mul | 1 \mul |
| Agua | 3 \mul | 1,5 \mul |
Se detectan los productos de las reacciones de
secuencia por fluorescencia. Los resultados obtenidos se
representan en la figura adjunta que ilustra la detección de los
productos en el gel de secuenciación analizados por el programa
Perkin Elmer Analisis, versión 3,0.
Para cada ensayo, los cebadores se identifican
por sus propiedades de fluorescencia, el marcador ROX (rojo) para la
reacción de control con didesoxinucleótidos trifosfato 250 mM (curva
discontinua) y el marcador JOE (verde) para la reacción que
concierne a la morfolino T glicina 200 \muM (curva en trazo
continuo).
Como muestra la figura, los resultados de estos
ensayos son del todo concluyentes ya que la morfolino T glicina ha
sido incorporada correctamente como una base específica por la Taq
polimerasa, y actúa correctamente como un terminador de cadena.
Los otros tres morfolinonucleótidos 1, 5 y 6,
pueden emplearse del mismo modo para determinar las posiciones de
las cuatro bases del ADN en el fragmento para analizar.
Se ensayan las morfolino A putrescina (MATPP) 7 y
morfolino A fluoresceína (MATPPF) 12 en una reacción de secuencia
con los cebadores fluorescentes (Applied Biosystems, Perkin Elmer,
Foster City, CA, Estados Unidos) sobre un molde control que es un
ADN plasmídico Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA, Estados
Unidos). La enzima usada es una Taq polimerasa (Perkin Elmer) que
se usa con su tampón (tampón Termo Sequenasa, Amersham, Life
Science).
Se realizan tres reacciones de secuencia con la
MATPP a 100, 200 y 400 \muM y cuatro reacciones de secuencia con
la MATPPF a 200, 500, 1000 y 5000 \muM, así como las reacciones
control con los didesoxinucleótidos a la concentración de 250
\muM (Boehringer).
El medio de la reacción de un volumen total de 10
\mul contiene 125 ng de molde, 1,25 pmol de cebador fluorescente
y los otros componentes como lo descrito en las tablas.
El medio se somete a ciclos térmicos con el
propósito de realizar un número de moléculas de nuevas hebras de
ADN formadas. Se realizó una amplificación en un dispositivo Perkin
Elmer 9700 (Gene Amp(r), PCR System 9700), según las
siguientes secuencias:
MATTP 7 3 min, 95ºC; 30 ciclos (15 s, 95ºC; 15 s
55ºC; 1 min, 70ºC)
MATTPF 12 3 min, 95ºC; 30 ciclos (15 s, 95ºC; 15
s 55ºC; 4 min, 60ºC)
Los productos de amplificación se purificaron
sobre una columna de Sephadex G50. Los productos de cada reacción
de secuencia se mezclaron con los productos de una reacción control
y se analizaron por electroforesis.
La migración de la mezcla obtenida se realiza en
un gel desnaturalizante (urea 7M) de acrilamida de tipo Long Ranger
(6%), en TBE 1X, en un dispositivo Applied Biosystems 377 (ABI Prism
DNA Sequencer, Perkin Elmer). La electroforesis se desarrolla
durante 7 horas a 1680 V, 50 mA.
que representan en la presente invención una
mezcla de los cuatro nucleótidos trifosfato naturales, empobrecidos
en desoxiadenosina trifosfato (llamada mezcla de dATP): se mezclan
4 \mul de una disolución 1,25 mM de dATP 5 mM (Promega) con 4
\mul de dTTP 5 mM (Promega), 4 \mul de dCTP 5 mM (Promega), 4
\mul de dGTP 5 mM (Promega).
| /reacción | /15 reacciones | |
| Tampón TACS (5X) | 2 \mul | 30 \mul |
| mezcla de dATP | 1 \mul | 15 \mul |
| Taq (5U/ml) | 1 \mul | 15 \mul |
| Molde (plásmido Bluescript) | 2 \mul | 30 \mul |
(1,17 mg de MATPP 7 se diluyeron en 1,04 ml de
H_{2}O)
Reacciones con la morfolino ATPP 2
mM
| Morfolino | Morfolino | Morfolino | |
| ATPP 400 \muM | ATPP 200 \muM | ATPP 100 \muM | |
| Mezcla común | 6 \mul | 6 \mul | 6 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul | 1 \mul | 1 \mul |
| Morfolino ATPP 2 mM | 2 \mul | 1 \mul | 0,5 \mul |
| H_{2}O | 1 \mul | 2 \mul | 2,5 \mul |
| ddATP 250 \muM | |
| Mezcla común | 6 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul |
| ddATP 2,5 mM | 1 \mul |
| H_{2}O | 2 \mul |
Disolución S_{o} 20 mM: diluir la
muestra (2,2 mg) en 110,5 \mul de agua.
Disolución S_{1} 20 mM: Extraer 10
\mul de S_{o} y añadirlos de nuevo a 90 \mul de agua.
| MATPFF 1000 \muM | MATTPF 5000 \muM | |
| Mezcla común | 6 \mul | 6 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul | 1 \mul |
| Morfolino ATPPF 20 mM | 0,5 \mul | 2,5 \mul |
| H_{2}O | 2,5 \mul | 0,5 \mul |
| MATPPF 500 \muM | MATTPF 200 \muM | |
| Mezcla común | 6 \mul | 6 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul | 1 \mul |
| Morfolino ATPPF 2 mM | 2,5 \mul | 1 \mul |
| H_{2}O | 0,5 \mul | 2 \mul |
| ddATP 250 \muM | |
| Mezcla común | 6 \mul |
| Cebador Z1M13 (JOE) | 1 \mul |
| ddATP 2,5 mM | 1 \mul |
| H_{2}O | 2 \mul |
En la figura 2 se dan los resultados obtenidos
con la morfolino A putrescina 7 100 \muM y la morfolino A
fluoresceína 12 5 mM, entre la 90ª y la 250ª base.
Se constata, por lo tanto, que estos dos
derivados actúan correctamente como terminadores de cadena. Además,
es de destacar que las reacciones realizadas con el derivado
fluorescente, la morfolino A fluoresceína, se detectaron por la
fluorescencia que lleva este derivado: se ha preparado pues un
terminador de cadena fluorescente.
Estos dos derivados de nucleósidos trifosfato se
ensayaron en la incorporación enzimática para marcar un
oligonucleótido de 13 bases de longitud en su extremo 3'. Este
marcaje se llama "dependiente de molde" ya que las enzimas
usadas necesitan el molde complementario para alargar el
oligonucleótido según las reglas de Watson y Crick. La secuencia A
(17870 pmol/ml) estudiada así como su molde C (16128) se muestran en
la siguiente figura:
\newpage
Molde C: 3'-TGC CAA CCA ACC CCA
CCT CAA CCT CTG-5'
Cebador A: 5'-ACG GTT GGT TGG G
(13 pb)
Fragmentos esperados y longitudes (pb):
5'-ACG GTT TGG GGT GGA (15 pb)
5'-ACG GTT GGT TGG GGT GGA GTT
GGA (24 pb)
5'-ACG GTT GGT TGG GGT GGA GTT
GGA GA (26 pb)
5'-ACG GTT GGT TGG GGT GGA GTT
GGA GAC (27 pb)
Se usaron tres enzimas para este marcaje: la Taq
ADN polimerasa (Boehringer Mannheim), la Klenow (Boehringer
Mannheim),y la Klenow sin actividad Exonucleasa (Amersham Life
Science). El cebador se marcó en su extremo 5' mediante la
incorporación de fosfato ^{32}P con el kit "Ready to go" T4
Polinucleótido quinasa (Pharmacia Biotech). El fragmento marcado
radiactivamente se denominó A*.
Se preparan los tampones de la reacción de las
tres enzimas para 10 reacciones:
| (en \mul) | Reacción Taq | Reacción Klenow sin Exo |
| C | 50 | 50 |
| A | 10 | 10 |
| A* | 10 | 10 |
| Tp 10x | 50 | 50 |
| H^{2}O | 50 | 50 |
| (en \mul) | Reacción Klenow |
| C | 50 |
| A | 10 |
| A* | 10 |
| Tp 5X | 100 |
| H_{2}O | 0 |
Las enzimas se diluyen a continuación de la
siguiente manera, para las 10 reacciones:
- - Taq (5U/ml): 10X 0,1 \mul de Taq + 10X 15,5 \mul de H_{2}O.
- - Klenow (20U/ml): 10X 0,1 \mul de Klenow + 10X 15,5 \mul de H_{2}O.
- - Klenow sin actividad Exo (5U/ml): 10X 0,1 \mul de Klenow sin actividad Exo + 10X 15,5 \mul de H_{2}O.
Se prepara igualmente las disoluciones que
contienen los nucleósidos trifosfato normales:
- - Disolución "2P" compuesta de una mezcla de dGTP y dTTP cada una de 0,1 mM.
- - Disolución "4P" compuesta de una mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP cada una de 0,1 mM.
Las reacciones puestas en marcha se describen en
la siguiente tabla 14:
| (en \mul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 400 \muM | 200 \muM | 50 \muM | 2,5 mM | 400 \muM | 200 \muM | 50 \muM | |||
| Reacción | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 |
| "2P" | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 0 |
| "4P" | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 |
| MATPP 2 | 0 | 10 | 5 | 1,25 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| mM | |||||||||
| MATPPF | 0 | 0 | 0 | 0 | 6,25 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 20 mM | |||||||||
| MATPPF 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 5 | 1,25 | 0 |
| mM | |||||||||
| H_{2}O | 33 | 2,7 | 7,4 | 11,15 | 6,15 | 2,4 | 7,4 | 11,15 | 12,4 |
| Enzima | 0 | 15,6 | 15,6 | 15,6 | 15,6 | 15,6 | 15,6 | 15,6 | 15,6 |
La morfolino A putrescina se ensaya así en tres
concentraciones: 400, 200 y 500 \muM mientras que la morfolino A
fluoresceína se pone en la reacción a 2,5 mM, 400, 200 y 50
\muM.
Antes de añadir la enzima, la mezcla se
desnaturaliza a 94ºC durante 5 minutos. Después se deja recuperar la
temperatura ambiente para que la hibridación tenga lugar. El
alargamiento se efectúa a 70ºC para la Taq, 37ºC para las dos
Klenows, y durante 10 minutos. Finalmente, el medio se desnaturaliza
de nuevo mediante una disolución de formamida y un calentamiento a
90ºC durante 5 minutos antes de cargarse en un gel de
poliacrilamida. La separación se realiza por electroforesis a 2000
V. La lectura del gel se realizó en un Phosphorimager; los
resultados obtenidos se muestran el la figura 3.
En esta figura, las calles número 1 sirven de
control de migración del oligonucleótido A marcado. Este
oligonucleótido tiene una longitud de 13 pb (13 mer). Las calles 2,
3 y 4 permiten seguir el alargamiento del oligonucleótido A y la
incorporación de la morfolino A putrescina. En estas condiciones,
sólo los nucleótidos dGTP y dTTP (disolución "2P") se
añadieron y utilizaron por la enzima para proceder a la extensión
del cebador. La presencia de la morfolino A putrescina en el medio
de la reacción permite su incorporación a nivel de la base 18. Se
realizó un control, poniendo en el medio sólo la mezcla "2P";
en este caso, la enzima prosiguió su extensión hasta la 17ª base ya
que no hay derivado de adenosina para continuar su polimerización.
Así, la diferencia entre este control, de una longitud de 17 bases,
y las reacciones 2, 3 y 4, confirma la incorporación de la MATPP y
la interrupción del alargamiento de la cadena. Las reacciones 5 a 8
corresponden a las mismas reacciones con la morfolino A
fluoresceína. Aún en ese caso, la MATPPF se incorpora y se detiene
correctamente la polimerización de la hebra complementaria. Sin
embargo se aprecia para las dos Klenow, que a veces se incorpora
otra base (G o T) en lugar del derivado morfolino. En efecto, se
encuentra que en estos casos los productos del alargamiento,
corresponden a los 18- y 24 mer.
El pocillo 9 (ver figura 4) es una reacción de
control: el medio de la reacción contiene los 4 desoxinucleótidos
normales y se puede alargar el cebador hasta su extensión máxima, es
decir, hasta obtener el 27 mer.
En conclusión, las tres enzimas incorporan la
morfolino A putrescina y la morfolino A fluoresceína en todas las
concentraciones ensayadas, incluidas las concentraciones más
bajas.
Se ha confirmado la capacidad de las
transcriptasas inversas para incorporar los derivados
morfolinonucleótidos a lo largo de la extensión de oligonucleótidos.
En este ensayo, se eligió como modelo la transcriptasa inversa
(M-MLV, Promega; actividad: 200000U/ml). Esta
última es capaz de sintetizar una hebra de ADN complementaria de un
molde (ADN o ARN), a partir de un oligonucleótido cebador, en
presencia de nucleósidos trifosfato. Se ensaya pues la morfolino A
putrescina y la morfolino A fluoresceína en dos concentraciones
finales de 250 \muM. Una copia de control se carga además en el
gel, con los cuatro nucleósidos trifosfato de la disolución
"4P".
La secuencia del molde C (27 mer, 16128 pmol/l) y
la del cebador B (14 mer, 56368 pmol/l) se muestran a continuación.
Este cebador B, marcado radiactivamente se denomina B*.
\newpage
La disolución B* contiene pues 10 pmol del
cebador B en un volumen de 50 \mul. Se diluye igualmente las
disoluciones de C y B diez veces; estas disoluciones se denominan
respectivamente C/10 y B/10.
Molde C: 3'-TGC CAA CCA
ACC CCA CCT CAA CCT CTG-5'
Cebador B: 5'-ACG GTT GGT
TGG GG (14 pb)
| (en \mul) | Reacción 1 | Reacción 2 | Reacción 3 | Reacción 4 |
| C/10 | 2 | 2 | 2 | 0 |
| B* | 5 | 5 | 5 | 5 |
| B/10 | 3 | 3 | 3 | 0 |
| Tampón 5x | 4 | 4 | 4 | 0 |
| MATPP 2 mM | 2,5 | 0 | 0 | 0 |
| MATPPF 2mM | 0 | 2,5 | 0 | 0 |
| "2P" | 2,5 | 2,5 | 0 | 0 |
| "4P" | 0 | 0 | 2,5 | 0 |
| H_{2}O | 0 | 0 | 0 | 15 |
| Enzima | 1 | 1 | 1 | 0 |
Como anteriormente, la mezcla se desnaturaliza,
antes de la adición de la enzima, a 94ºC durante 5 minutos y se deja
recuperar la temperatura ambiente. El alargamiento se realiza a 37ºC
durante 60 minutos. El medio se desnaturalizó mediante una
disolución de formamida y calentamiento a 90ºC durante 5 minutos
antes de cargarse en un gel de poliacrilamida. La separación se
realizó por electroforesis a 1500 V. La lectura del gel se realizó
con un Phosphorimager; los resultados obtenidos se muestran en la
figura 4.
En esta figura, la calle 4 permite estimar la
longitud del cebador B marcado. La calle 3 muestra el alargamiento
máximo del cebador B hasta un producto final de 27 pares de bases
en presencia de los 4 desoxinucleótidos naturales. Las reacciones 1
y 2 muestran que los derivados morfolino se incorporaron a lo largo
del alargamiento del cebador B por la transcriptasa inversa. Esta
incorporación es cuantitativa y produjo un producto de 18 pares de
bases (en ausencia del derivado morfolino, la extensión se bloqueó
en la 17ª base).
En conclusión, los derivados morfolino son
reconocidos perfectamente por la transcriptasa inversa y se
incorporan en los cebadores a lo largo del alargamiento según un
procedimiento específico de base.
[1]: Sanger y col., Proceedings of
National Academy of Science, 74, 1977, pág.
5463-5467.
[2]:
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[3]: Prober y col., Science, 238,
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[8]: Rayford y col., Journal of
Biological Chemistry, 260, 1985, páginas
15708-15713.
Claims (17)
1. Procedimiento de fabricación de un fragmento
de ácido nucleico (ADN o ARN) marcado en 3', que comprende la
incorporación enzimática de un derivado de nucleótido que tiene como
precursor un compuesto de fórmula:
en la que R^{1} representa una base nucleica y
R^{2} representa un grupo que responde a una de las fórmulas
siguientes:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
- (CH _{2} ) _{n} -NH _{2} \+ -
(CH _{2} ) _{n} -SH\cr -
(CH _{2} ) _{n} -COOH \+ -
(CH _{2} ) _{n} -OH\cr -
(CH _{2} ) _{n} -NH-R ^{3}
\+ - (CH _{2} ) _{n} -SR ^{3} \cr -
(CH _{2} ) _{n} -CO-R ^{3}
\+ -
(CH _{2} ) _{n} -OR ^{3} \cr}
en las que n es un número entero que va desde 1
hasta 12 y R^{3} es un grupo derivado de un marcador, de una
proteína, de una enzima, de un ácido graso o de un péptido en el
extremo 3' OH del fragmento de ácido
nucleico.
2. Procedimiento de modificación de un fragmento
de ácido nucleico mediante la incorporación enzimática en 3' de un
morfolinonucleótido modificado que tiene como precursor un
compuesto que responde a la fórmula:
en la que R^{1} representa una base nucleica y
R^{2} representa un grupo que responde a una de las siguientes
fórmulas:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-
(CH _{2} ) _{n} -NH-R ^{3} \cr
-
(CH _{2} ) _{n} -CO-R ^{3} \cr
- (CH _{2} ) _{n} -SR ^{3} \cr -
(CH _{2} ) _{n} -OR ^{3} \cr}
en las que n es un número entero que va del 1 al
12 y R^{3} representa un compuesto elegido entre los
fotorreticulantes, los ácidos grasos, los péptidos hidrófobos, los
anticuerpos, las enzimas y los
fluoróforos.
3. Procedimiento de secuenciación de un ácido
nucleico (ADN o ARN) mediante la técnica de polimerización
enzimática de la secuencia complementaria de este ácido nucleico
usando los terminadores de cadena, en el que al menos uno de los
terminadores de cadena tiene como precursor un compuesto que
responde a la fórmula:
en la que R^{1} representa una base nucleica y
R^{2} representa un grupo que responde a una de las siguientes
fórmulas:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
- (CH _{2} ) _{n} -NH _{2} \+ -
(CH _{2} ) _{n} -SH\cr -
(CH _{2} ) _{n} -COOH \+ -
(CH _{2} ) _{n} -OH\cr -
(CH _{2} ) _{n} -NH-R ^{3}
\+ - (CH _{2} ) _{n} -SR ^{3} \cr -
(CH _{2} ) _{n} -CO-R ^{3}
\+ -
(CH _{2} ) _{n} -OR ^{3} \cr}
en las que n es un número entero que va del 1 al
12 y R^{3} es un grupo derivado de un marcador, de una proteína,
de una enzima, de un ácido graso o de un
péptido.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la enzima es el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3, en el que la enzima es una polimerasa termorresistente de una
bacteria Termófila o la terminal transferasa o la transcriptasa
inversa.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la base nucleica es la base
nucleica natural elegida entre adenina, guanina, citosina, timina,
uracilo, xantina, hipoxantina, 2-aminopurina y sus
derivados.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que R^{1} responde a una de las
siguientes fórmulas:
8. Procedimiento según una cualquiera de la
reivindicaciones 1 a 7, en el que el marcador se elige entre los
productos radiactivos, los productos luminiscentes,
electroluminiscentes y fluorescentes, las moléculas capaces de
unirse a otras moléculas, las moléculas que permiten interacciones
de tipo antígeno-anticuerpo, y los marcadores
enzimáticos.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que R^{3} es un fluoróforo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que R^{3} se elige entre los derivados de la fluoresceína, de
la biotina y de la rodamina.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó
3 en el que el derivado, el morfolinonucleótido modificado, o el
terminador de cadena es el compuesto (I) en forma de
monofosfato.
12. Morfolinonucleótido que responde a la
fórmula:
en la que R^{1} es adenina y R^{2} representa
-CH_{2}-COOH,
-(CH_{2})_{4}-NH_{2} o
-(CH_{2})_{4}-NH-R^{3}
representando R^{3} un grupo derivado de la
fluoresceína.
13. Morfolinonucleótido de fórmula:
en la que R^{1} es timina y R^{2} representa
-CH_{2}-COOH,
-(CH_{2})_{4}-NH_{2} o
-(CH_{2})_{4}-NH-R^{3}
representando R^{3} un grupo derivado de la
fluoresceína.
14. Morfolinonucleótido que responde a la
fórmula:
en la que R^{1} es citosina y R^{2}
representa -CH_{2}-COOH, -
(CH_{2})_{4}-NH_{2} o
-(CH_{2})_{4}-NH-R^{3},
representando R^{3} un grupo derivado de la
fluoresceína.
\newpage
15. Morfolinonucleótido que responde a la
fórmula:
en la que R^{1} es guanina y R^{2} representa
-CH_{2}-COOH,
-(CH_{2})_{4}-NH_{2} o
-(CH_{2})_{4}-NH-R^{3},
representando R^{3} un grupo derivado de la
fluoresceína.
16. Procedimiento de fabricación de un
morfolinonucleótido de fórmula:
en la que R^{1} representa una base nucleica y
R^{2} representa un grupo que responde a una de las siguientes
fórmulas:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
- (CH _{2} ) _{n} -NH _{2} \+ -
(CH _{2} ) _{n} -SH\cr -
(CH _{2} ) _{n} -COOH \+ -
(CH _{2} ) _{n} -OH\cr -
(CH _{2} ) _{n} -NH-R ^{3}
\+ - (CH _{2} ) _{n} -SR ^{3} \cr -
(CH _{2} ) _{n} -CO-R ^{3}
\+ -
(CH _{2} ) _{n} -OR ^{3} \cr}
en las que n es un número entero que va de 1 a 12
y R^{3} es un grupo derivado de un marcador, de una proteína, de
una enzima, de un ácido graso o de un péptido, la reacción de un
trifosfato de
fórmula:
en la que R^{1} tiene el significado dado
anteriormente, con un periodato, un compuesto de fórmula R^{2}
NH_{2} en la que R^{2} tiene el significado dado anteriormente
y borohidruro de
sodio.
17. Uso de un morfolinonucleótido de fórmula:
en la que R^{1} representa una base nucleica y
R^{2} representa un grupo que responde a una de las siguientes
fórmulas:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
-(CH _{2} ) _{n} -NH _{2} \+
-(CH _{2} ) _{n} -SH\cr
-(CH _{2} ) _{n} -COOH \+
-(CH _{2} ) _{n} -OH\cr
-(CH _{2} ) _{n} -NH-R ^{3}
\+ -(CH _{2} ) _{n} -SR ^{3} \cr
-(CH _{2} ) _{n} -CO-R ^{3}
\+
-(CH _{2} ) _{n} -OR ^{3} \cr}
en las que n es un número entero que va de 1 a
12, y R^{3} es un grupo derivado de un marcador, de una proteína,
de una enzima, de un ácido graso o de un péptido, para el marcaje
de fragmentos de ADN o de
ARN.
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