ES2199936T3

ES2199936T3 - Oligonucleotidos cerrados de las clases "sentido" y "antisentido", y sus aplicaciones.

Info

Publication number: ES2199936T3
Application number: ES92910423T
Authority: ES
Inventors: Marta Blumenfeld; Pascal Brandys; Luc D'auriol; Marc Vasseur
Original assignee: Genset SA
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1991-04-25
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2012-04-24
Also published as: EP0572287A2; EP0572287A3; EP0581848A1; ATE244303T1; DE69233117T2; DK0581848T3; FR2675803B1; AU1759692A; JPH06506834A; WO1992019732A1; EP0581848B1; DE69233117D1; CA2102229A1; US6369038B1; AU660679B2; FR2675803A1

Abstract

EL OBJETO DE LA INVENCION ES UNA NUEVA ESTRUCTURA DE OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENS O SENS, LOS OLIGONUCLEOTIDOS CERRADOS. LA INVENCION CONCIERNE A LA UTILIZACION DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS CERRADOS QUE PUEDEN SER VENTAJOSAMENTE POR EJEMPLO UNOS OLIGONUCLEOTIDOS CIRCULARES CON FINES FARMACOLOGICOS, COMO MELECULAS ANTISENS O SENS. LA INVENCION CONCIERNE IGUALMENTE A LOS METODOS DE OBTENCION DE TALES MOLECULAS POR VIAS QUIMICAS Y/O BIOLOGICAS. LA UTILIZACION TERAPEUTICA DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS COMO AGENTES ANTISENS O SENS PLANTEA VARIOS PROBLEMAS, SIENDO PRINCIPALMENTE EL DE LA ESTABILIDAD DE LAS MOLECULAS. LOS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENS ESTAN SUJETOS A DEGRADACION NUCLEOLITICA, Y SON PRINCIPALMENTE SENSIBLES A LAS EXONUCLEASAS. LOS ANTISENS CERRADOS QUE FORMAN EL OBJETO DE LA PRESENTE INVENCION SON UNAS MOLECULAS QUE NO PRESENTAN EXTREMOS LIBRES Y QUE PRESENTAN POR CONSIGUIENTE UNA RESISTENCIA AUMENTADA A LOS ATAQUES EXONUCLEASICOS. LOS OLIGONUCLEOTIDOS CERRADOS PUEDEN POR CONSIGUIENTE ACTUAR COMO FACTORES ANTISENS CON UNA MAYOR PERENNIDAD QUE LOS OLIGONUCLEOTIDOS LINEALES CORRESPONDIENTES. ADEMAS, UNOS OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENS CERRADOS CIRCULARES O DE ESTRUCTURA SECUNDARIA COMPLEJA PERMITEN TOMAR EN CUENTA LAS ESTRUCTURAS SECUNDARIAS Y TERCIARIAS DE LOS ARN MENSAJEROS DE BLANCOS. POR EJEMPLO, TALES ANTISENS PUEDEN SER MULTIFUNCIONALES, E INTERACTUAR CON VARIAS REGIONES NO CONTIGUAS DEL ARN BLANCO. ADEMAS, UNO OLIGONUCLEOTIDOS CERRADOS PUEDEN SER UTILIZADOS SEGUN UNA ESTRATEGIA DE TIPO "SENS" PARA INTERACTUAR DE FORMA ESPECIFICA CON UNOS FACTORES PROTEICOS QUE PRESENTAN UNA AFINIDAD PARA CIERTAS SECUENCIAS Y ESTRUCTURAS DEL ARN O DEL ADN. DE FORMA GENERAL, LOS OLIGONUCLEOTIDOS CERRADOS, EN PARTICULAR CIRCULARES, QUE HACEN EL OBJETO DE LA INVENCION DESCRITA AQUI, PUEDEN SER UTILIZADOS EN TODOS LOS CASOS DONDE SERA VENTAJOSO DISPONER DE UN OLIGONUCLEOTIDO QUE PRESENTA UNA RESISTENCIA AUMENTADA A LAS EXONUCLEASAS EN RELACION A UN OLIGONUCLEOTIDO DE LA MISMA SECUENCIA PERO LINEAL.

Description

Oligonucleótidos cerrados de las clases "sentido" y "antisentido", y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a compuestos del tipo oligonucleótido, así como a sus aplicaciones.

Los oligonucleótidos antisentido son cortas moléculas sintéticas de ADN -o de ARN- de secuencia complementaria a una secuencia diana que pertenece a gen o a un ARN mensajero del cual se desea bloquear específicamente la expresión.

Los oligonucleótidos antisentido pueden ser dirigidos contra una secuencia de ARN mensajero, o bien contra una secuencia de ADN. Los oligonucleótidos antisentido hibridan a la secuencia de la cual son complementarios y pueden así bloquear la expresión del ARN mensajero que lleva esta secuencia.

El término "oligonucleótido" se utiliza de manera general para designar un polinucleótido en serie ribo- o
desoxiribo-. Cuando se trata de una propiedad particular unida a la utilización de una serie desoxiribo- o de una serie ribo-, se utilizará la denominación completa oligodesoxiribonucleótido u oligoribonucleótido. Un oligonucleótido puede ser monocatenario, es decir, que no incluye más que un alineamiento de los nucleótidos, no apareados a otra cadena, o bien puede ser bicatenaria, es decir, incluye nucleótidos apareados a otra cadena polinucleótida. Dos oligonucleótidos complementarios forman una estructura bicatenaria. Un oligonucleótido monocatenario puede, sin embargo, presentar regiones bicatenarias por apareamientos intercatenarios entre secuencias complementarias llevadas sobre el mismo filamento.

El término hibridación aquí utilizado significa la formación de enlaces de hidrógeno entre pares de bases complementarias, formando la guanina y la citosina tres enlaces de hidrógeno, y formando la adenina y la timina dos de dichos enlaces.

Los oligonucleótidos antisentido se sintetizan por vía química e incluyen frecuentemente modificaciones que alteran la cadena principal misma de la molécula o llevan grupos reactivos adicionales, localizados en sus extremos. Estas modificaciones introducidas en los oligonucleótidos, antisentido tienen como objetivo bien sea aumentar la resistencia de estas moléculas la degradación nucleótida, bien favorecer sus interacciones con sus dianas, bien permitir reacciones de degradación/modificación específicas de las dianas, ARN o ADN, o bien aumentar su penetración intracelular.

Los oligonucleótidos antisentido son sensibles a las degradaciones nucleásicas, y principalmente a la acción de las exonucleasas. Las nucleasas se encuentran en todos los compartimentos -celulares y extracelulares, en particular, en el suero- y provocan una degradación rápida de estas moléculas. Una utilización farmacológica de moléculas antisentido implica la resolución de estos problemas de degradación con el fin de llegar una farmacocinética satisfactoria y, por lo tanto, a una perennización suficiente de los efectos de estas moléculas. Numerosas modificaciones químicas permiten a los oligonucleótidos antisentido hacerse resistentes a las nucleasas. Algunas modificaciones afectan directamente a la estructura o a la naturaleza del enlace fosfodiéster (metilfosfonatos, fosforotioatos, oligonucleótidos alfa y fosforamidatos por citar algunos ejemplos), otros consisten en la adición de grupos de bloqueo en los extremos 3' y 5' de las moléculas (Perbost et al, 1989; Bertrand et al, 1989; Bazile et al, 1989; Andrus et al, 1989; Cazenave et al, 1989; Zon, 1988; Maher and Dolnick, 1988; Gagnor et al, 1987; Markus-Sekura, 1987).

Para aumentar la eficacia de las interacciones entre un oligonucleótido y su diana, se puede añadir a un extremo del oligonucleótido antisentido un grupo que intercala (acridinas por ejemplo). Por último, se puede añadir a los oligonucleótidos antisentido grupos reactivos (agentes alquilantes, psoralenos y Fe-EDTA por ejemplo) capaces de provocar cortes o alteraciones químicas definitivas al nivel de la diana (Sun et al, 1989; Helene, 1989; Durand et al, 1989; Sun et al, 1988; Helene and Thuong, 1988; Verspieren et al, 1987; Sun et al, 1987; Cazenave et al, 1988, 1987; Le Doan et al, 1987; Toulme et al, 1986; Vlassov et al, 1986).

El último tipo de modificación clásica de los oligonucleótidos antisentido consiste en la adición de grupos que modifican la carga y/o la hidrofilia de las moléculas con el fin de facilitar su paso trans-membranal (Kabanov et al, 1990; Degols et al 1989; Stevenson et al, 1989; Leonetti et al, 1988).

Todas estas modificaciones pueden obviamente ser combinadas entre sí.

Todas las regiones de un ARN mensajero no son sensibles de la misma manera a los efectos del oligonucleótido antisentido. Un ARN mensajero no es una molécula lineal cuajada, sino al contrario es una molécula que incluye numerosas estructuraciones secundarias (hibridaciones intramoleculares complejos), estructuraciones terciarias (repliegues y conformaciones particulares, pseudo nudos), y que interactúa con nucleoproteínas estructurales y funcionales (proteínas básicas, complejos de corte y empalme, de poli-adenilación, de caperuza (capping), complejo de traducción por ejemplo). La disponibilidad efectiva y la accesibilidad de las distintas regiones de un ARN mensajero van a depender de sus acoplamientos a estas estructuraciones. Correlativamente, la eficacia de un agente inhibidor que interactúa con una u otra secuencia va a depender igualmente del acoplamiento de estas secuencias a una función particular. Las regiones dianas para las moléculas de antisentido deben ser accesibles al oligonucleótido.

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La utilización de programas informáticos de predicción de estructuras secundarias permite prever grados de accesibilidad teóricos y por lo tanto orientar la elección de dianas para los oligonucleótidos antisentido. Globalmente, las regiones más utilizadas como dianas son los sitios de arranque de la traducción (región del AUG iniciador) así como los sitios de corte y empalme (uniones SD/SA). Igualmente, otras numerosas secuencias que no tienen funcionalidades particulares y que no acoplan por apareamientos intramoleculares resultaron eficaces como diana para oligonucleótidos antisentido (véase los ejemplos citados más adelante).

Igualmente, los oligodesoxiribonucleótidos antisentido pueden ser dirigidos contra algunas regiones del ADN bicatenario (secuencias homopurinas/homopirimidinas o ricas en purinas/pirimidinas) y formar así triples hélices (Perroualt et al, 1990; François et al (A), 1989; François et al (B), 1989; François et al (C), 1989; Wang et al, 1989; Maher et al, 1989; Sun et al, 1989; Boidot-Forget et al, 1988; Moser and Dervan, 1987; Dervan, 1986). Los oligonucleótidos dirigidos así contra el ADN se denominaron "anti-gen" o también "anti-código". La formación de triple hélice, a nivel de una secuencia particular, puede bloquear la fijación de proteínas que intervienen en la expresión de un gen y/o permitir la introducción de daños irreversibles en el ADN si el oligonucleótido considerado posee un grupo reactiva particular. Dichos oligonucleótidos antisentido pueden pasar a ser verdaderas endonucleasas de restricción artificiales, dirigidas, según demanda, contra secuencias específicas.

La hibridación entre el oligonucleótido antisentido y un ARN mensajero diana puede bloquear la expresión de varios maneras, bien sea de manera estérica, o bien de manera pseudo-catalítica (Gagnor, et al, 1989; Jesus et al, 1988; Markus-Sekura, 1987):

- la interacción entre el ARN mensajero y un oligonucleótido antisentido complementario puede crear una barrera física que impide la fijación y/o la progresión de proteínas o de complejos proteicos necesarios para la traducción, para la maduración, para la estabilización o para el transporte del ARN mensajero. Este bloqueo físico se termina finalmente en una inhibición de la expresión del ARN mensajero que actúa como diana.

- la hibridación entre un ARN mensajero y un oligodesoxiribonucleótido antisentido va a crear un substrato para la RNasa H, enzima presente en todas las células eucariotas. La RNasa H es una enzima que deteriora específicamente el ARN cuando se hibrida con el ADN. La hibridación de un oligonucleótido antisentido con un ARN diana se llega entonces al corte de este ARN diana y al emplazamiento de esta hibridación, y por lo tanto a su inactivación definitiva.

- por otra parte, tal como se indica anteriormente, los oligonucleótidos antisentido pueden incluir grupos reactivos capaces de producir directamente daños irreversibles en las moléculas de ARN diana.

En lo que se refiere a los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra el ADN, pueden actuar bien sea inhibiendo la fijación de una proteína de regulación indispensable para la expresión del gen diana (factor de transcripción por ejemplo), o bien introduciendo daños irreversibles (cortes, cross-links) en la molécula de ADN, volviéndola no apta, localmente para la expresión genética.

Las ribozimas son moléculas de ARN dotadas de actividades enzimáticas, capaces en particular de provocar cortes endonucleásicos en ARNs dianas. Una ribozima puede ser considerada como un oligonucleótido antisentido particular, dotado de una actividad catalítica endonucleásica natural (Vasseur, 1990; Symons, 1989; Jeffrie and Symons, 1989; Haseloff and Gerlach, 1988; Uhlenbeck, 1987; Symons et al, 1987). Típicamente, una ribozima está constituida por dos partes, por una parte incluye una secuencia complementaria a la secuencia diana que se desea cortar, y por otra parte, una secuencia catalítica, que hace las veces de grupo reactivo (Fedor and Uhlenbeck, 1990; Uhlenbeck et al; 1989; Sheldon and Symons, 1989; Sampson et al, 1987). Actualmente es posible, al utilizar un sitio activo acorde deducido de la secuencia de ribozimas virales, cortar teóricamente cualquier ARN mensajero, en una posición determinada de antemano (Haseloff and Gerlach, 1988; Uhlenbeck, 1987). Las ribozimas chocan con los mismos problemas de utilización que los oligonucleótidos antisentido clásicos, en particular en lo que se refiere a los fenómenos de degradación, estando los ARNs aún más sensibles a la degradación nucleótida que los ADNs.

Los oligonucleótidos antisentido permiten bloquear específicamente la expresión de ARN mensajeros celulares, por ejemplo mensajeros de tipo oncogénico, (Tortora et al, 1990; Chang et al, 1989; Anfossi et al, 1989; Zheng et al, 1989; Shuttleworth et al, 1988; Cope and Wille, 1989; Cazenave et al, 1989) y otros tipos distintos de ARN mensajero virales, procedente de virus tan variados como el VSV (Degols et al, 1989; Leonetti et al, 1989), el SV40 (Westermann, et al, 1989), los virus influenza (Kabanov et al, 1990; Zerial et al, 1987), el virus de la encefalomiocardita (Sankar et al, 1989), el adenovirus (Miroshnichenko et al, 1989) el HSV (Gao et al, 1988) y el HIV (Matzukura et al, 1989; Stevenson et al, 1989; Matzukura et al, 1988; Goodchild et al, 1988).

Con ribozimas, se puede escindir in vivo el ARN mensajero codificador, para el gen marcador CAT (Cameron and Jennings, 1989), inhibir el proceso de maduración del ARN mensajero de histona (Cotten et al 1989; Cotten and Birnstiel, 1989) o proteger parcialmente la célula contra la infección por HIV-1 (Sarver et al, 1990).

Igualmente, los oligonucleótidos pueden ser utilizados en el marco de estrategias de tipo "sentido". Esta aproximación consiste en utilizar un oligonucleótido en serie desoxiribo- o ribo-, monocatenario o bicatenario, de secuencia específica, como agente de fijación de una proteína que presenta una afinidad para esta secuencia y de la que se desea disminuir la concentración eficaz, por competencia, en el interior de las células. Se puede prever así la utilización de los oligonucleótidos que interactúan con factores de transcripción, factores de encapsidaciones virales, factores de regulación de la traducción, etc... Esta aproximación no está aún explotada como lo es la estrategia de antisentido más clásica. En este caso, el problema de la estabilidad de los oligonucleótidos es igualmente un factor crítica importante para la eficacia y la perennidad de su acción. La utilización de los oligonucleótidos modificados para dicha aproximación puede chocarse con los problemas estructurales de reconocimiento por las proteínas. La posibilidad de disponer de oligonucleótidos naturales estables en el suero y las células permitiría prever el desarrollo de nuevas vías terapéuticas que actúan como dianas en particular sobre los factores de regulaciones de afinidad para los ácidos nucleicos.

Los oligonucleótidos antisentido, y sentido, son por lo tanto agentes farmacológicos potenciales, potentes y altamente específicos, que permiten inhibir la expresión de mensajeros codificadores para los productos que ejercen efectos patógenos.

La utilización terapéutica de los oligonucleótidos se choca, sin embargo, con varios problemas de tipo fisiológico, en particular el de la liberación intracelular de estas moléculas y el de su sensibilidad la degradación nucleolítica. La utilización de derivados modificados permite superar el problema de la sensibilidad a las nucleasas, pero introduce un nuevo problema, el de la toxicidad eventual de las modificaciones químicas introducidas en la molécula.

La utilización de los oligonucleótidos antisentido modificados plantea, en efecto, problemas de naturaleza toxicológica. Si algunas de las modificaciones se consideraron antes neutros, la mayoría no está desprovista de toxicidad potencial.

Los oligonucleótidos antisentido modificados químicamente pueden presentar una toxicidad de varios niveles, bien sea directamente por efectos de la molécula entera, o bien indirectamente vía los efectos de los productos de degradación. Los nucleótidos portadores de modificaciones químicas, y presentes en una célula en una concentración elevada pueden así presentar una toxicidad, -y más particularmente un genotoxicidad- no desdeñable en el plano farmacológico.

Por ejemplo, numerosos problemas surgidos por el empleo de los oligonucleótidos antisentido modificados, en particular efectos antivirales no secuencia-específicos, parecen ser bien debidos a la naturaleza de algunas de las modificaciones químicas introducidas en los oligonucleótidos antisentido para hacerlos nuevamente resistentes a las nucleasas.

En el plano toxicológico, está claro, por lo tanto, que cuanto menos se modifica la estructura natural del oligonucleótido, menos se arriesga en enfrentarse a problemas farmacológicos. Una molécula natural de ADN o de ARN, así como sus productos de degradación, plantea poco o nada de problemas de toxicología y de farmacocinético, lo que no es el caso de una estructura modificada que puede dar, después de la metabolización, derivados múltiples y potencialmente tóxicos.

Por lo tanto, sería ventajoso poder disponer de oligonucleótidos naturales, que solo incluyen desoxi o ribonucleótidos normales, unidos entre sí por un enlace fosfodiéster normal, pero que presenta, sin embargo, una resistencia la degradación.

La invención presentada aquí tiene por objeto un nuevo tipo estructural de oligonucleótido antisentido, o sentido, que resiste a las exonucleasas sin la intervención de modificaciones químicas estabilizantes. Los oligonucleótidos que constituyen el objeto de la invención tienen la particularidad de presentar una estructura cerrada, que no ofrecen extremo disponible para la degradación exonucleásica.

Dichos oligonucleótidos pueden ser utilizados en su estado natural pero pueden, sin embargo, incluir igualmente nucleótidos modificados, grupos reactivas, o estar asociados físicamente a otras moléculas o macromoléculas con el objetivo de reforzar su eficacia de inhibición, su penetración, su afinidad para sus dianas, su actuación como diana celular o intracelular, o para optimizar cualquier otra propiedad.

II. Descripción de la invención

En las células, y más aún en un organismo, en la circulación sanguínea por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido naturales son sensible a las nucleasas. Las nucleasas son enzimas de degradación capaces de cortar los enlaces fosfodiéster del ADN o del ARN, bien sea introduciendo cortes internos sobre moléculas mono- o bicatenarias, o bien atacando estas moléculas a partir de sus extremos. Las enzimas que atacan de manera interna se denominan endonucleasas y las que atacan por los extremos se denominan exonucleasas.

La estabilidad de los oligonucleótidos antisentido -y por lo tanto su eficacia- puede ser considerablemente aumentada al introducirlas distintas modificaciones químicas que les hace resistentes a la degradación tal como se describe anteriormente.

Se estableció que las exonucleasas son la principal causa de la degradación de los oligonucleótidos antisentido en el suero y en la célula. Más particularmente, parece que las exonucleasas que atacan el extremo 3' OH sean sobretodo a incriminar en este fenómeno.

Las modificaciones aportadas a la estructura de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pueden protegerlos, bloquear las actividades de las exonucleasas, y conferir a los oligonucleótidos una estabilización creciente.

La invención descrita aquí está basada en la nueva idea que de los oligonucleótidos cerrados, que no incluyen extremos libres, serán, por lo tanto, por definición, resistentes a este tipo de degradación. Los oligonucleótidos cerrados, circulares por ejemplo, no presentan substrato accesible a las exonucleasas 3' ó 5' y por lo tanto son así estabilizados.

Más particularmente, la invención se refiere, por lo tanto, a un agente antisentido o sentido del tipo oligonucleótido, caracterizado porque está constituido por una o varia(s) secuencia(s) de oligonucleótidos monocatenarios cuyos extremos están unidos entre sí por enlaces covalentes para formar al menos parcialmente una estructura monocatenaria cerrada.

A veces, estos agentes se denominan a continuación, oligonucleótidos cerrados u oligonucleótidos circulares, en la medida en que este tipo de compuesto presenta preferentemente una mayoría de nucleótidos con respecto a las estructuras no nucleótidas.

La definición del término oligonucleótido se dio anteriormente e incorpora tanto la serie ribo- como la desoxiribo- natural, del mismo modo que las modificaciones de estas bases que se denominarán globalmente, a continuación, no naturales y que igualmente han sido evocadas anteriormente.

El enlace covalente puede ser una estructura covalente no nucleótida proteica, lipídica, osídica y/o una estructura mixta, tal como se aclarará a continuación. Se prefiere, no obstante, utilizar una estructura covalente nucleótida, es decir, un enlace fosfodiéster.

La invención se refiere a oligonucleótidos cerrados, circulares por ejemplo, que no tienen extremos libres, pero compuestos por una serie de bases nucleótidas unidas entre sí por cualquier tipo de enlaces, y preferentemente por enlaces de tipo fosfodiéster. Estas bases podrán ser asociadas entre sí por enlaces de tal manera que la distancia entre estas bases será aproximadamente de 3 A a 4 A, lo que es la distancia que se encuentra en las moléculas naturales de ADN o ARN cuando los enlaces internuc1eótidos están garantizados por grupos fosfodiésteres. Los oligonucleótidos cerrados, circulares, por ejemplo, serán compuestos ventajosamente por nucleótidos naturales unidos preferentemente entre sí por enlaces fosfodiésteres no modificados, pero podrán igualmente incluir nucleótidos modificados y/o enlaces modificados que respetan las distancias entre bases y que permiten las rotaciones axiales helicales características de las conformaciones de los ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos cerrados están, por lo tanto, compuestos ventajosamente por bases A, T, G, C, o U, bajo sus formas desoxi- o ribonucleótidos. Los oligonucleótidos cerrados podrán, por lo tanto, ser bien sea oligodesoxiribonucleótidos, bien oligoribonucleótidos, o bien moléculas mixtas que incluyen desoxiribonucleótidos y ribonucleótidos.

Por lo tanto, están comprendidas en la invención, cualquier molécula de ADN, o de ARN, -o mixta ADN/ARN-, monocatenaria, cerrada, circular o que posee una parte circular, obtenida de manera biológica, química, o por procedimientos que asocian las técnicas de la química de síntesis con las de la biología y las de la bioquímica, que presentan una resistencia a las exonucleasas superior a la de un oligonucleótido con la misma secuencia pero completamente lineal, que no presenta estructura cerrada.

En las Figuras 1A a 1C se presentan algunos ejemplos de oligonucleotidos cerrados.

La Figura 1A presenta ejemplos de estructura de los oligonucleótidos antisentido cerrados. La Figura 1B presenta ejemplos de estructura de los oligonucleótidos sentido cerrados. La Figura 1C presenta una molécula mixta que puede ejercer un efecto sentido y antisentido.

El número de nucleótidos unitarios que componen los oligonucleótidos cerrados puede variar en amplias proporciones, especialmente, entre 10 y 200, pero este número estará ventajosamente comprendido, con carácter orientativo, entre una veintena y una cincuentena de nucleótidos, según la estructura de cierre (circular, estructura en lazo, esférica, estructura bicatenaria, etc... ver más adelante las descripciones de las distintas estructuras), las utilizaciones (molécula de antisentido anti-ARN, molécula de antisentido anti-ADN, molécula sentido antiproteica), el tipo del oligonucleótido - desoxi o ribonucleótido - (antisentido simple o antisentido ribozímico, etc...) y las dianas consideradas (ARN mensajero, ARN premensajero, estructura secundaria particular, etc..).

Los oligonucleótidos cerrados que constituyen el objeto de la presente invención son preferentemente compuestos por una secuencia de bases que incluyen adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), de fórmulas generales presentadas en la Figura 1D.

Igualmente, los oligonucleótidos cerrados podrán incluir nucleótidos raros (Inosina, I, o rI por ejemplo) o nucleótidos modificados, bien sea en serie desoxiribo- o bien en serie ribo-.

Los oligonucleótidos cerrados podrán incluir nucleótidos modificados a nivel del enlace fosfodiéster, por ejemplo, según algunas fórmulas presentadas en la Figura 2. Por ejemplo, los oligonucleótidos cerrados podrán incluir unos o varios grupos bien conocidos que son los fosforotioatos, metilfosfonatos, fosforoditioatos, fosfoselonatos,
fosforoamidatos y alquil-fosfotriésteres. Sin embargo, se aprecia que los oligonucleótidos antisentido cerrados incluirán preferentemente nucleótidos naturales, unidos entre sí por enlaces fosfodiésteres no modificados.

Los oligonucleótidos cerrados podrán incluir nucleótidos reactivos, capaces de establecer enlaces con la secuencia de la molécula diana complementaria al oligonucleótido.

Así, los oligonucleótidos cerrados podrán llevar grupos reactivos injertados sobre los nucleótidos, como por ejemplo grupos psoralenos, u otros agentes que forman enlaces de puentes o agentes que intercalando pueden reaccionar con la secuencia de la molécula diana complementaria al oligonucleótido (véase algunos ejemplos no exhaustivos presentados en la Figura 2).

Igualmente, los oligonucleótidos antisentido cerrados podrán incluir, entre los nucleótidos que forman parte de la estructura cerrada, una secuencia de ARN que presenta una actividad catalítica. Estos oligonucleótidos circulares serán así ribozimas circulares, que incluyen, en los extremos juntados, además de la secuencia catalítica que puede ser cualquier secuencia de ARN capaz de provocar un corte o una modificación en una secuencia de ARN diana, una secuencia de tipo antisentido, complementaria a la secuencia que actúa como diana, y que puede estar constituida bien sea de ARN, bien de ADN o bien de una mezcla ADN/ARN (Figura 3).

Igualmente, forman parte de la invención los oligonucleótidos cerrados acoplados a moléculas que permiten aumentar su penetración intracelular, y en particular los grupos lipófilos, polipéptidos o proteínas.

Los oligonucleótidos cerrados presentan la característica principal de no ofrecer substrato a las exonucleasas 3' y 5'. Para adquirir esta propiedad, la estructura más simple es un oligonucleótido circular, formado de una sucesión de nucleótidos unidos entre sí por enlaces de fosfodiésteres tal como se esquematiza más arriba, y que presenta o no apareamientos intercatenarios (Figuras 1A a 1C y Figura 4).

Otras estructuras de moléculas cerradas por un enlace no fosfodiéster 3'-5' igualmente pueden ser sintetizadas y presentar una resistencia parcial o total a las exonucleasas.

Igualmente, forman parte de la invención moléculas en lazo compuestas de residuos desoxi o ribonucleótidos y cerrados bien sea por un enlace que hace intervenir bien sea el extremo 3', o bien el extremo 5' de la molécula (Figuras 1A a 1C y Figura 4B). En estas moléculas en lazo, la parte lineal puede no incluir más que un solo residuo nucleótido, o bien puede incluir una cadena lateral nucleótida, de varios residuos. En estas estructuras, uno de los nucleótidos terminales del oligonucleótido se acoplan a un nucleótido interno, por un enlace que se puede efectuar con la base o con el azúcar, o con el grupo fosfodiéster. Dichos oligonucleótidos presentan un extremo libre y un extremo bloqueado. La resistencia a las exonucleasas será por lo tanto parcial, pudiendo el extremo libre ser objeto de una degradación nucleolítica. Los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos no son sensibles de manera equivalente a la degradación, siendo el extremo 3' el más sensible. Un oligonucleótido circular en lazo, que no presenta más que el extremo 5' libre se protege en gran parte contra la degradación. Además, las exonucleasas que pueden degradar la parte lineal del lazo serán detenidas a nivel del punto de ramificación. En esta etapa, el oligonucleótido se hace de nuevo completamente resistente a las exonucleasas 3' y 5', cualquiera que sea el extremo libre o ramificado inicialmente. Dichas moléculas en lazo pueden incluir residuos nucleótidos naturales o modificados tal como se anuncia más arriba en el párrafo anterior. La estructura general de las moléculas en lazo se presenta en la Figura 1A y la Figura 4B.

Igualmente, forman parte de la invención oligonucleótidos cerrados esféricos, tal como se describe en la Figura 1A, la Figura 1B y la Figura 4C. Estos oligonucleótidos se cierran por un enlace químico que corresponde a un enlace de puente intercatenario realizados entre dos nucleótidos internos. Este enlace de puente puede ser efectuado por el sesgo de un nucleótido reactivo -fotoactivable por ejemplo- o bien utilizando unos reactivos exógenos que establecen un enlace entre dos regiones apareadas del oligonucleótido. Dicho oligonucleótido esférico no presenta más que un número limitado, o no limitado, de sitios substratos para exonucleasas. Incluso si el o los enlaces de puentes que cierran la molécula oligonucleótida no se efectúan a nivel de los nucleótidos terminales, solamente serán accesibles a las exonucleasas algunos nucleótidos localizados en una parte y otra del punto de enlace de puente, en los extremos de la molécula. Las exonucleasas podrán escindir los enlaces fosfodiésteres que unen los nucleótidos de los extremos no acoplados, pero serán detenidos a partir del sitio de enlace de puente. Los nucleótidos acoplados al enlace de puente son resistentes a las exonucleasas, completamente o parcialmente, y protegen así el oligonucleótido contra la continuación de la degradación nucleolítica.

Igualmente, forman parte de la invención otra familia de los oligonucleótidos circulares cerrados de nuevo sobre sí mismos mediante una molécula no nucleótida. Estos oligonucleótidos cerrados poseen una parte de sus estructuras moleculares correspondiente a una secuencia de ADN o de ARN en la cual las bases son no modificadas, y cuya primera unidad nucleosídica se une a la última por un enlace que hace intervenir una estructura de molécula cualquiera. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido pueden ser circularizados mediante un acoplamiento entre los nucleótidos terminales por una estructura proteica o polipeptídica que serán unidos a las unidades nucleosídicas terminales mediante cualquier tipo de acoplamiento (Figura 4). Igualmente, forman parte, por lo tanto, de la invención oligonucleótidos circulares que incluyen una parte nucleótida y una parte proteica. La inserción de esta parte proteica se puede efectuar mediante distintos procedimientos de acoplamiento. La fracción proteica puede ser concebida para aumentar la eficacia de la molécula nucleótida por distintos mecanismos. La parte proteica podrá, por ejemplo, favorecer la internalización del oligonucleótido en células, permitir que algunas células actúen como dianas eventualmente eligiendo un determinante proteico utilizado. Los componentes proteicos o peptídicos utilizados en los oligonucleótidos circulares de este tipo podrán, igualmente, ser moléculas de señalización, que permiten una actuación como diana intracelular de los oligonucleótidos. Por ejemplo, se podrán utilizar péptidos de direccionamiento nuclear procedentes de proteínas naturales celulares o virales. Este aspecto de la invención consiste, por lo tanto, en proponer oligonucleótidos, de nueva estructura, y que incluyen compuestos susceptibles de reaccionar específicamente con receptores particulares de la superficie membranal de la célula, ser internalizados por dichas células, y ejercer su actividad biológica en el interior de la célula.

Igualmente, forman parte de la invención oligonucleótidos circulares cerrados de nuevo sobre sí mismos por grupos lipófilos o cadenas que incluyen radicales lipófilos y que favorecen la internalización celular de estas moléculas.

Igualmente, forman parte de la invención oligonucleótidos cerrados asociados por acoplamientos covalentes o no covalentes a estructuras de encapsidación de tipo liposómicas o cualquier otra estructura lipoproteica o lipo-polisacárida.

Igualmente, forman parte de la invención oligonucleótidos circulares cerrados de nuevo sobre sí mismos por un enlace fosfodiéster, pero que incluyen más de uno o varios enlaces internos producidos por agentes reactivos que pertenecen a la estructura de las propias moléculas o aportados de manera exógena.

Estas moléculas poseerán la característica de resistencia a las exonucleasas de los oligonucleótidos circulares y ofrecen además conformaciones secundarias particulares, que pueden ser adaptadas al reconocimiento de sitios particulares sobre dianas que presentan, ellos mismos, conformaciones secundarias o terciarias particulares, que estas dianas sean ácidos nucleicos o cualquier otra estructura celular o viral susceptible de presentar una afinidad electiva y selectiva frente a un polinucleótido de estructura primaria y secundaria particular.

Igualmente, forman parte de la invención oligonucleótidos antisentido circulares o cerrados susceptibles de formar una triple hélice con el ARN diana. La formación de una triple hélice permite estabilizar la interacción ADN/ARN entre el antisentido y la secuencia diana.

De manera general, se puede igualmente decir que un antisentido circular es un compuesto "fármaco" con respecto a un oligonucleótido antisentido lineal. El corte de uno oligonucleótido circular dará lugar a un oligonucleótido lineal que podrá ejercer un efecto antisentido clásico, con retraso.

Aunque bastante a menudo los compuestos según la invención incluirán secuencias nucleótidas no susceptibles de auto-aparearse forman igualmente parte de la invención oligonucleótidos cerrados que incluyen regiones auto-apareadas que forman una estructura bicatenaria de longitud variable (véase Figura 5). Esta estructura bicatenaria podrá tener varias funciones, por ejemplo, la de estabilizar la molécula para permitir su circularización, durante la síntesis de las moléculas circulares (véase más adelante los procedimientos de preparación). Igualmente, esta estructura bicatenaria podrá tener una función activa, como por ejemplo la de interactuar con proteínas que presentan una afinidad para esta secuencia. La estructura bicatenaria podría corresponder a una secuencia de fijación para factores proteicos. En particular, un aspecto de la invención es proporcionar moléculas oligonucleótidas naturales estables que pueden fijar factores proteicos celulares o virales y, por lo tanto, interferir en los procesos biológicos que ponen en juego estos factores.

Un ejemplo de la utilización de los oligonucleótidos cerrados que incluyen una región auto-apareada -oligonucleó-tidos destinados a dicha aplicación serán ventajosamente circulares simplemente- es la competencia intra-celular con factores de transcripción. En este caso, la parte bicatenaria del oligonucleótido cerrado llevará la secuencia de fijación del factor de transcripción, del regulador, del receptor nuclear hormonal que se desea atrapar. La interacción entre el oligonucleótido circular bicatenario y un factor de transcripción va a conseguir la reducción de la disponibilidad intracelular de este factor, y por lo tanto, va a modificar los equilibrios de regulación en los cuales este factor interviene. Si se trata de un factor de transcripción positivo, que ejerce un efecto de estimulación, el bloqueo de este factor conseguirá una inhibición de los genes considerados; si se trata de un factor negativo, que inhibe la expresión de genes después de la interacción con el ADN celular, entonces se estimulará la expresión de estos genes. De manera general, los oligonucleótidos cerrados, de tipo circular, de serie desoxiribo- y que incluyen una parte bicatenaria podrán interactuar con fines terapéuticos con cualquier factor proteico que presenta la afinidad para el ADN y del que se desea reducir o alterar los efectos en una situación patológica dada.

Igualmente, está previsto utilizar oligonucleótidos cerrados, ventajosamente circulares, para combinar aproximaciones antisentido y sentido con el fin de alcanzar mayor eficacia. Este procedimiento consiste en utilizar simultáneamente un oligonucleótido antisentido cerrado dirigido contra el ARN mensajero de un factor de transcripción, y un oligonucleótido "sentido" cerrado que incluye una estructura bicatenaria de secuencia que corresponde al sitio de fijación sobre el ADN de este factor de transcripción. Por lo tanto, dos niveles de acción, actúan como diana simultáneamente, en sinergia, sobre la misma molécula diana, el antisentido que disminuye la síntesis de este factor y la molécula sentido que ejerce un efecto de captador sobre moléculas residuales que pueden subsistir. Las aproximaciones combinadas de sentido y antisentido podrán ser utilizadas bien sea para hacer que la propia proteína actúe como diana, en dos niveles de expresión y de funcionalidades diferentes, o bien para atacar dos proteínas diferentes, con el fin de buscar la mayor eficacia del procedimiento.

Esta aproximación doble puede recurrir a la utilización simultánea de dos moléculas diferentes, una de sentido y la otra de antisentido, o bien a una sola molécula oligonucleótida cerrada como la descrita en la Figura 1C.

Otro ejemplo de la utilización de los oligonucleótidos cerrados es la competencia intracelular con factores de afinidad para algunas secuencias de ARN bicatenaria. Este es el caso de algunas proteínas de regulación que interactúan con los ARN mensajeros, en particular con los ARN mensajeros virales. Se puede citar por ejemplo el caso del producto del gen tat de HIV que se fija sobre una región bicatenaria en el extremo 5' del ARN mensajero viral. Para ser utilizados como agentes que interactúan con tat, en el caso de este ejemplo, los oligonucleótidos cerrados -circulares por ejemplo- comprenderían una parte bicatenaria en serie ribo-, siendo el resto del oligonucleótido compuesto de nucleótidos bien sea en serie ribo- o bien en serie desoxiribo-.

De manera general, los oligonucleótidos cerrados que constituyen el objeto de la invención podrán ser utilizados como moléculas estabilizadas para el atrapamiento de factores proteicos que presentan una afinidad para los ácidos nucleicos, ADN o ARN, monocatenario o bicaternario, mimando a la vez la estructura primaria (secuencia) de los sitios de afinidad y las estructuras secundarias eventuales (estructuras en U y estructuras cruciformes por ejemplo).

Dichos oligonucleótidos cerrados, ventajosamente circulares, que incluyen una secuencia nucleótida reconocida por factores proteicos podrán igualmente llevar grupos reactivos capaces de efectuar enlaces de puentes, espontáneos o fotoactivables, con las proteínas que interactúan con ellos.

Un aspecto de la invención, tal como de describe de manera detallada en el párrafo anterior, es por lo tanto proporcionar nuevos oligonucleótidos naturales estables capaces de ser internalizados en las células y de interactuar a continuación con factores celulares o virales que presentan una afinidad para secuencias específicas de ácidos nucleicos.

Igualmente, forman parte de la invención oligonucleótidos circulares asociados, de dos en dos, gracias a las complementariedades de sus secuencias, para formar una estructura circular bicatenaria completa o parcial (pudiendo presentar no apareamientos, dicho de otra manera "desequilibrio (mismatches)"), y resistente a las exonucleasas. Estos oligonucleótidos bicatenarios circulares podrán estar compuestos de nucleótidos naturales, raros, artificiales, o modificados, en serie desoxiribo- o en serie ribo-. Estos oligonucleótidos circulares bicatenarios podrían estar compuestos de ADN en forma de I o de ADN en forma de V, es decir, que incluyen estructuras compuestas de tipo B y Z. El ADN en forma de I es el ADN circular súper-enrollado, cuyos dos filamentos presentan un entrelazamiento. El ADN en forma de V es un ADN cuyos filamentos complementarios no se entrelazan, es decir, un ADN formado por dos filamentos complementarios, uno al lado del otro. El ADN bicatenario puede adoptar conformaciones diferentes, A, B o Z. La forma más natural y más corriente del ADN es una hélice derecha del tipo B, mientras que la forma Z, menos frecuente, es una hélice izquierda, más alargada que la forma B. Una estructura circular como la descrita anteriormente, que incluye dos filamentos complementarios no entrelazados incluirá a la vez hélices izquierdas y hélices derechas. Dicho oligonucleótido circular bicatenario podrá ser utilizado como agente de tipo sentido, para interactuar con proteínas que presentan afinidad para una secuencia particular que estará presente en el oligonucleótido considerado. Dicho oligonucleótido bicatenaria circular, en serie ribo en particular, podrá igualmente ser utilizado como inmunoestimulante de manera general, y más particularmente como agente de inducción de interferones. Hay que apuntar que esta función de inmunoestimulación potencial que presenta algunos ARNs podrá igualmente ser explotada utilizando oligonucleótidos circulares monocatenarios que presentan las estructuras bicatenarias auto-apareadas gracias a las complementariedades internas de secuencia y sacando partido a la ventaja que confiere la resistencia a las exonucleasas de una estructura circular.

III. Preparación de los oligonucleótidos cerrados

Los oligonucleótidos cerrados que constituyen el objeto de la invención se pueden obtener por vía química, biológica, o por aproximaciones recurriendo a combinaciones de las técnicas de la química de síntesis y de la biología molecular.

Por lo tanto, los oligonucleótidos cerrados se pueden preparar bien sea a partir de los oligonucleótidos lineales, cerrados de nuevo a continuación por técnicas químicas o biológicas, o bien directamente como oligonucleótidos por vía química, que utilizan reacciones que consiguen la ciclización de la molécula. Estas dos aproximaciones se consideran sucesivamente a continuación.

1- Preparación de los oligonocléotides circulares a partir de los oligonucleótidos lineales por las técnicas de ligación

Se desarrollaron diversos métodos de síntesis química de oligonucleótidos naturales y estos son muy conocidos por los especialistas que trabajaban en las reglas de la técnica. Por ejemplo, un método consiste en utilizar un soporte sólido denominado CPG (acrónimo de la expresión inglesa Controlled Pore Glass) en el cual el primer nucleósido es fijado mediante enlace covalente por un brazo de acoplamiento, por su extremo 3'OH. El extremo 5'OH del nucleósido está protegido por un grupo di-p-metoxitritil ácido lábil. Esta aproximación, que utiliza la química de los fosfitos triésteres, y en la cual se utilizan algunos desoxinucleótidos 3' fosforamiditas como sintones se denomina el método de los fosforamiditas (Caruthers, 1985). Esta aproximación es la más utilizada actualmente y presenta la ventaja de ser íntegramente automática. La síntesis de un oligonucleótido a partir de una primera unidad fijada sobre un CPG comienza por una etapa de desprotección en el curso de la cual se elimina el grupo tritil, luego se añade una unidad nucleósida activada sobre su grupo 5', los productos no reactivos se bloquean, luego se reinicia un nuevo ciclo de desprotección/activación/acoplamiento. Típicamente, la adición de un desoxinucleótido se efectúa según las cuatro etapas siguientes i) desprotección y eliminación de un grupo protector dimetoxitritil por el ácido, ii) condensación del producto resultante con un desoxinucleótido 3'-fosforamidita, dando un desoxidinucleósido fosfito triéster, iii) acilación, es decir bloqueo de los grupos 5'-hidroxil que no han reaccionado y iv) oxidación del fosfito triéster en fosfato triéster. La repetición de dichos ciclos conduce a la síntesis de oligonucleótidos que pueden alcanzar más de 200 unidades.

Para citar un segundo ejemplo, otra aproximación utilizada para la síntesis de oligonucleótidos es la de la química de los fosfonatos (Froehler et al, 1986). Esta aproximación comienza por la condensación de un desoxinucleósido 3'-H-fosfonato con un desoxinucleósido acoplado a un soporte de vidrio de sílice. Los ciclos de condensación sucesivos conducen a la síntesis de oligonucleótidos H-fosfonatos. Estos oligonucleótidos se oxidan en una etapa para dar los fosfodiésteres.

Al utilizar una o otra de estas técnicas, o cualquier otro procedimiento secuencial que permite la síntesis química de cadenas polinucleótidas de secuencia determinada de antemano, se obtienen oligonucleótidos lineales que es posible circularizar por vía biológica, utilizando enzimas de ligación. Para poder utilizar ligasas para cerrar de nuevo los oligonucleótidos sobre sí mismos, los oligonucleótidos deben incluir un grupo terminal 5'P, que la fosforilación del 5' terminal haya efectuado por vía química, o bien por vía biológica utilizando una quinasa (preferentemente la polinucleótido-quinasa) y el ATP o cualquier otro donador de fosfato.

Se describen a continuación distintos procedimientos que convienen para efectuar ventajosamente la circularización de oligonucleótidos lineales.

1-1- Un oligonucleótido lineal puede ser circularizado estableciendo una estructura parcialmente bicatenaria apareada para permitir el funcionamiento de una ligasa, tal como la T4 ligasa, mediante un segundo oligonucleótido más corto que el precedente, y secuencias complementarias en los dos extremos del primero oligonucleótido. En este caso, ilustrado en la Figura 6, el segundo pequeño oligonucleótido hace las veces de adaptador y permite la puesta, uno detrás del otro, de los dos nucleótidos terminales del oligonucleótido a circularizar. La acción de la T4 ligasa, o de cualquier otra enzima de ligación capaz de ejercer su acción sobre el ADN permite entonces la circularización formando un enlace fosfodiéster entre estos dos nucleótidos. Esta ligación puede hacerse en solución, estando los dos oligonucleótidos mezclados en un medio que permite la hibridación y la ligación en las condiciones de concentración y temperatura convenientes para favorecer la circularización intercatenaria y desfavorecer las ligaciones inter-oligonucleótidas que pueden disminuir el rendimiento de la reacción de circularización propiamente dicha.

1-2- Una variante del procedimiento descrito en (1) consiste en efectuar la circularización del oligonucleótido siempre gracias a un adaptador, pero utilizando un oligonucleótido fijado sobre un soporte que puede ser, por ejemplo, la nitrocelulosa o un derivado, una membrana de nilón, un soporte de vidrio, una estructura polisacárida, o cualquier otro soporte que permite fijar de manera covalente o no covalente un fragmento de ácido nucleico y que permite posteriormente la hibridación entre este fragmento y un oligonucleótido y compatible con la acción de una ligasa. Este procedimiento consiste, por lo tanto, en fijar el oligonucleótido adaptador sobre un soporte, bien sea mediante un enlace covalente, o bien mediante enlaces no covalentes. Se utilizará de manera ventajosa los enlaces covalentes que permiten efectuar un gran número de ciclos de hibridación/ligación con el oligonucleótido a circularizar. El oligonucleótido adaptador se podrá fijar a su soporte bien sea a nivel de un nucleótido terminal, directamente o mediante un agente de acoplamiento, o bien mediante un nucleótido situado en posición interna y que lleva un grupo reactivo. El esquema de principio de dicho método se ilustra en la Figura 6. El interés de fijar el oligonucleótido adaptador es doble: por una parte, esta fijación efectuada en condiciones físicas controladas (numero de moléculas fijadas por unidad de superficie) permite reducir la incidencia de la formación de concatemeros durante la reacción de hibridación, a continuación del enlace inter-oligonucleótido y, por otra parte, facilita la realización de reactores de ligación que utilizan un gran número de veces los oligonucleótidos adaptadores para múltiples ciclos de circularización.

1-3- Los oligonucleótidos podrán ser circularizados sacando partido a las estructuras secundarias deliberadamente introducidas previendo secuencias capaces de replegar sobre sí mismas formando estructuras bicatenarias parciales. Por ejemplo, la Figura 6 ilustra el caso del oligonucleótido "en haltera", que incluye una parte lineal que forma un bucle y que incluye la secuencia de tipo antisentido, una región bicatenaria larga de 9 pares de bases, y una secuencia de cierre compuesta de T_{5}. Esta estructura es capaz de efectuar auto-apareamientos dando así una molécula susceptible de ser utilizada como substrato por una enzima de ligación como la T4 ligasa. En estos casos, el rendimiento de la ligación depende entre otras cosas de la estabilidad del apareamiento a nivel de la estructura bicatenaria. Varias secuencias de apareamiento fueron objeto de estudios comparativos y una de las secuencias que permiten un rendimiento de circularización ventajoso (del orden de 75%) se indica en la Figura 6. Aunque no importa cual de los nucleótidos puede ser utilizado para realizar un bucle de cierre de longitud variable, se utilizará preferentemente de 4 a 8 residuos, y principalmente bien sea A o bien T.

La región bicatenaria de apareamiento podrá incluir bien sea una secuencia utilizada solamente para la formación de la estructura en "haltera", o bien una secuencia que corresponde en parte a la región diana y potencialmente desplazable por una hibridación intermolecular.

Las condiciones experimentales que permiten la circularización eficaz del oligonucleótido cuya secuencia se da en la Figura 6 están indicadas precisamente más adelante en la parte experimental (véase "Propiedades y Ventajas de los Oligonucleótidos Cerrados"). En el caso de esta secuencia, el rendimiento de circularización es del orden de 75%.

Esta técnica ha sido utilizada para preparar los oligonucleótidos circulares de los cuales se trata en la parte experimental.

1-4- Los oligonucleótidos circulares podrán igualmente ser formados por una estructura bicatenaria cerrada de nuevo sobre sí misma en cada extremo por un corto bucle de nucleótidos de unión. Estos oligonucleótidos podrán ser utilizados para aproximaciones de tipo "sentido" tales como las descritas más arriba. En la Figura 6 se ilustra un ejemplo típico de un oligonucleótido sentido. Este oligonucleótido incluye una secuencia apareada de 24 nucleótidos y dos bucles de unión formados por T_{5}. En el ejemplo aquí dado, este oligonucleótido circular incluye una estructura bicatenaria que corresponde a la secuencia de reconocimiento del factor de transcripción hepatocitario HNF-1. Dicho oligonucleótido se puede circularizar simplemente sacando partido a la estructura secundaria bicatenaria formada por las secuencias complementarias. El punto de cierre (es decir, los extremos) del oligonucleótido será elegido de tal manera a permitir la mejor eficacia de circularización por repliegue intramolecular. Este punto podrá ser centrado o más o menos distal con respecto a la mediana de la estructura secundaria central. Igualmente, conviene tener en cuenta que dichos oligonucleótidos pueden ser sintetizado no a partir de una reacción intramolecular, sino mediante una reacción intermolecular, utilizando dos oligonucleótidos lineales replegados sobre sí mismos, que presentan una estructura bicatenaria parcial y que generan extremos cohesivos, que pueden aparearse entre sí (véase el esquema en la Figura 6).

1-5- Se podrá utilizar para ciclizar los oligonucleótidos que deben incluir una región central bicatenaria, una técnica que consiste en preparar dos oligonucleótidos complementarios, uno largo y el otro corto, hibridando el segundo con la parte central del primero. Por la acción de la ligasa de T4, es posible juntar los dos extremos de los oligonucleótidos largos con los extremos del oligonucleótido apareado, incluso si no hay homologías de secuencia que permiten la formación de un autoapareamiento a nivel de las secuencias distales 3' y 5'. Dicho mecanismo consigue la formación de una estructura oligonucleótida circular cerrada que incluye una parte bicatenaria central.

1-6- Para la preparación de los oligonucleótidos circulares en serie ribo- (oligoribonucleótidos) a partir de los oligoribonucleótidos lineales, las técnicas utilizables son del mismo orden que las descritas anteriormente. Sin embargo, es igualmente posible utilizar una enzima, la RNA ligasa de T4 que es capaz de efectuar espontáneamente circularización de oligonucleótidos en serie ribo- o desoxiribo-. Esta enzima permite, en presencia de ATP, cerrar oligonucleótidos lineales y convertirlos en oligonucleótidos circulares. Por lo tanto, es posible, sin matriz particular, y en ausencia de cualquier oligonucleótido adaptador, circularizar así oligoribonucleótidos. Esta enzima permite igualmente circularizar oligodesoxiribonucleótidos, pero con una eficacia mucho menos elevada que cuando se trata de oligoribonucleótidos. La RNA T4 ligasa se empleará ventajosamente para circularizar los oligonucleótidos antisentido que incluyen una actividad ribozímica, o bien para circularizar ARN "sentido", como, por ejemplo, las secuencias de interacción con transactivadores de tipo tat de HIV.

1-7- Los procedimientos descritos anteriormente hacen que intervengan todas las enzimas de ligación para formar enlaces fosfodiésteres y cerrar las moléculas lineales. Podrán ser utilizados para circularizar los oligonucleótidos con el fin de hacerlos resistentes a la acción de las nucleasas, en el espíritu de la invención aquí descrita, cualquier enzima que permite la formación de un enlace fosfodiéster entre dos residuos nucleótidos, que se trata de DNA ligasas o de RNA ligasas. En particular, podrán ser utilizadas ventajosamente enzimas termoestables, procedente de organismos termoresistentes, que permiten efectuar ciclos sucesivos de ligación/desnaturación/hibridación. Podrán ser utilizados para preparar moléculas circulares que constituyen el objeto de la invención, bien sean enzimas de ligación en solución, o bien enzimas fijadas sobre un soporte con el fin de aumentar el rendimiento de la reacción y/o disminuir el coste.

Igualmente, podrán ser utilizados para preparar las moléculas circulares que constituyen el objeto de la invención cualquier reactivo químico que permite una ligación química. Por ejemplo, y de manera no limitativa, podrían ser utilizados reactivos tales como carbodiimida o bromuro de cianógeno.

2 Otras vías químicas de preparación de los oligonucleótidos circulares y/o cerrados

La preparación de los oligonucleótidos cerrados con fines de aplicaciones farmacológicas, tanto para experimentaciones sobre animales como para la preparación de compuestos farmacéuticos utilizará ventajosamente métodos químicos que permiten la preparación de cantidades importantes requeridas.

Podrán ser utilizadas, varias vías, en particular, se podrá bien sea sintetizar oligonucleótidos lineales por las vías usuales que se cerrarán a continuación por ligación química o por un enlace que hará intervenir nucleótidos terminales, o bien sintetizar oligonucleótidos que pueden ser objeto de una ciclización directamente en la última etapa de la síntesis química.

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2-1- Síntesis química de los oligonucleótidos cíclicos

Se describieron varios procedimientos de preparación de oligonucleótidos cíclicos (Barbato et al, 1989, de Vroom et al, 1988). Estas aproximaciones, en fase líquida o sobre soporte, permiten obtener oligonucleótidos cortos cíclicos. Por ejemplo, se puede utilizar una técnica que consiste en fijar un primer residuo nucleótido mediante grupo amina exocíclica. A partir de dicho soporte, el ensamblado del oligonucleótido puede efectuarse a partir de los dos extremos 3' y 5' que están protegidos y disponibles. La ciclización se efectúa, una vez concluida la síntesis, utilizando por ejemplo MSNT, después del desbloqueo de los grupos protectoras de los dos extremos.

Podrán ser utilizados para sintetizar oligonucleótidos cíclicos con el fin de fabricar moléculas de antisentido o sentido resistentes a las exonucleasas, permitiendo cualquier procedimiento de síntesis el alargamiento de una cadena polinucleótida a partir de los dos extremos 3' y 5', y la reunión de estos dos extremos después de la conclusión del alargamiento de la séquente elegida. Podrán ser utilizados cualesquiera de los procedimientos que permiten la reunión química de dos oligonucleótidos lineales sintetizados independientemente y reasociados a continuación para formar una estructura cerrada mediante una reacción química específica de los extremos.

2-2- Cierre y ciclización de oligonucleótidos lineales

Podrán ser utilizados distintos procedimientos para cerrar oligonucleótidos lineales con el fin de formar estructuras cerradas que constituyen el objeto de la invención. En estas estructuras, uno, u otro, o los dos nucleótidos terminales se introducen en un enlace de acoplamiento. Aparte de las estructuras estrictamente circulares descritas más arriba, y que se podrá obtener bien sea por ligación o bien por cualquier otra reacción química, diversas estructuras cerradas ya tratadas se podrán obtener por acoplamiento químico.

Este es el caso en particular de las estructuras en lazo donde uno de los nucleótidos terminales -ventajosamente el nucleótido 3' terminal- se acopla a uno de los nucleótidos de la parte 5' del oligonucleótido. Dichas estructuras se podrán obtener utilizando nucleótidos modificados capaces de establecer enlaces de puentes con otras partes de la molécula. Igualmente, este es el caso de las estructuras esféricas, en las cuales un enlace de puente fue establecido mediante cualquier agente entre dos o más de dos nucleótidos situados en las regiones terminales del oligonucleótido, estando estas regiones apareadas sobre un reducido número de nucleótidos, preferentemente sobre 4 a 10 nucleótidos.

Igualmente, este es el caso de los oligonucleótidos que serán cerrados mediante cualquier grupo, cualquier molécula o macromolécula que permite un acoplamiento de los nucleótidos terminales entre sí, o entre un nucleótido terminal y un nucleótido interno, y que pueden aumentar la eficacia del compuesto en término de su acción intracelular antisentido o sentido. Como ejemplo, se podrá utilizar para ciclizar los oligonucleótidos de los polipéptidos largos por ejemplo de 5 a 100 aminoácidos, el encadenamiento polipeptídico antes de tener una masa suficiente para ser reconocido por receptores celulares y permitir una mejor internalización o un mejor direccionamiento.

IV. Ejemplos de aplicación

Los oligonucleótidos cerrados, en particular circulares, que constituyen el objeto de la invención aquí descrita podrán ser utilizados en cualquiera caso o será ventajoso disponer de un oligonucleótido que presenta una resistente creciente a las exonucleasas con respecto a un oligonucleótido lineal.

Los oligonucleótidos cerrados, podrán, en particular, ser utilizados como agentes antisentido o sentido para actuar de manera específica sobre la transcripción o la traducción de proteína(s) de la que se desea modular el nivel de expresión para fines de investigación o terapéuticos.

Algunas aplicaciones posibles que se dan a continuación no son más que ejemplos no exhaustivos y en ningún caso limitativos de situaciones en las cuales una aproximación de tipo antisentido, o sentido, podría ser factible, y donde la utilización de oligonucleótidos naturales resistentes a las exonucleasas y que presentan una toxicidad más reducida ofrecería una ventaja.

Más particularmente, los compuestos según la invención son utilizables como agente terapéutico, especialmente, como agente antiviral o anti-cancerígeno, en particular en composiciones farmacéuticas para uso tópico externo, o para uso sistémico.

Pero pueden igualmente ser inductores de inmuno- moduladores naturales tales como el interferón. Igualmente, es posible utilizarlos en diagnóstico in vitro o in vivo.

De manera general, los oligonucleótidos cerrados, naturales y circulares en particulares, encontrarán terrenos de aplicaciones particularmente adaptados en el ámbito de la dermatología debido a la accesibilidad de las dianas a tratar, y de la toxicidad menor o inexistente de estos compuestos. Todas las afecciones dermatológicas, se pueden relevar por un mecanismo de disfuncionamiento genético para las cuales se podrá identificar un factor etiológico, conocer la secuencia del gen, y/o del ARN mensajero permitirá prever potencialmente una aproximación antisentido, -o m incluso una aproximación "sentido" en algunos casos favorables-.

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La utilización de los oligonucleótidos naturales, por lo tanto, que presentan la toxicidad más reducida, permite prever la posibilidad de este tipo de aproximación para afecciones graves o menores, e incluso eventualmente para utilizaciones de tipo cosmetológico, es decir, sobre piel sana, y en un ámbito de aplicación donde las toxicidades de los productos deben ser las más bajas posibles.

A parte de dianas virales que se definen más adelante, numerosas enfermedades dermatológicas podrían ser tratadas por oligonucleótidos naturales circulares o cerrados resistentes a las exonucleasas. Entre las dianas potenciales de dichas aproximaciones, se pueden apuntar las enfermedades inflamatorias tales como dermatitis atópicas o lupus eritematoso, las enfermedades de la queratinización como la ictiosis y la psoriasis, y las enfermedades tumorales como el melanoma o la linfoma T cutánea. Así por ejemplo, oligonucleótidos antisentido circulares aplicados la dermatología podrían ser dirigidos contra ARN mensajeros de mediadores de la inflamación como interleuquinas, contra RNA mensajeros de proteínas implicadas en los trastornos de la proliferación de las células epidérmicas, o bien contra de ARN mensajeros codificadores de proteínas implicadas eventualmente en el envejecimiento cutáneo fenotípico, como por ejemplo la colagenasa, elastasa y las transglutaminasas.

De manera más general, los oligonucleótidos cerrados, naturales y circulares principalmente, podrían por ejemplo ser utilizados como agentes antivíricos, antisentido, o sentido, tanto para indicaciones tópicas (dermatológicos) como para indicaciones sistémicas. Por ejemplo, dichos oligonucleótidos podrían ser utilizados como agentes antiherpéticos (HSV 1 y HSV 2, CMV, EBV), como agentes antipapillomavirus (HPV cutáneos, genitales, laríngeo u otros), como agentes antihepatitis (HBV, HCV, HDV), como agentes anti HIV (HIV-1 e HIV-2), como agente anti HTLV (HTLV-1 o HTLV-2), etc..

Estos oligonucleótidos circulares, podrían igualmente ser utilizados como agentes de represión de la expresión de algunas proteínas celulares directamente responsables o implicadas en la etiología de enfermedades de la proliferación y de la diferenciación celular. Por ejemplo, estos oligonucleótidos circulares podrían ser dirigidos contra la expresión de oncogenes celulares hiperexpresados o expresados de manera incontrolada en tipos celulares tumorales (RAS, ERB, NEU, SIS, MYC, MYB, etc...).

En particular, estos oligonucleótidos circulares naturales resistentes a las exonucleasas séricas podrían ser utilizados como agente antisentido dirigidos contra ARN mensajeros de oncogenes expresados en células leucémicas e implicados en su proliferación, o bien como agentes "sentido" dirigidos contra proteínas con afinidad para algunas secuencias del ADN y expresadas a niveles patológicos en algunas de estas enfermedades proliferativas. En el marco del tratamiento de algunas leucemias, para injertos de médula, los oligonucleótidos cerrados, circulares, podrán ser utilizados en el marco de aplicaciones "ex-vivo".

Para estas numerosas indicaciones, formulaciones galénicas adecuadas se podrán establecer con el fin de optimizar la liberación de estas moléculas de sus células diana. Así, por ejemplo, oligonucleótidos cerrados, circulares en particular, podrán ser encapsulados en liposomas, nanopartículas, partículas LDL, o en cualquier otro tipo de microesfera que permite una conservación adecuada, y que favorece la actuación como diana. Las moléculas oligonucleótidas cerradas, circulares por ejemplo, podrían igualmente ser asociadas a agentes surfactantes catiónicos. Está bien claro que estos ejemplos no son ni exhaustivos ni limitativos.

Los oligonucleótidos cerrados, circulares en particular, que constituyen el objeto de la invención aquí descrita, son, por lo tanto, susceptible de ser incluidos en cualquier clase de preparaciones farmacéuticas, con concentraciones variables según las indicaciones.

En particular, las aplicaciones dermatológicas evocadas más arriba exigirán la preparación de cremas, soluciones, emulsiones, geles, pulverizaciones, polvos, aerosoles, etc.., preparados asociando el oligonucleótido circular -o cerrado- de secuencia elegida, con los componentes farmacéuticos usuales que entran en la composición de estos productos. Por ejemplo, para preparaciones destinadas a aplicaciones tópicas en dermatología, los oligonucleótidos circulares, o cerrados, podrán ser asociados a cualquiera clase de agentes de conservación, como el hidroxibenzoato de metilo o de propilo, cloruro de benzalkonio por ejemplo, y a otros agentes de estabilización, de emulsificación, de dispersión, de suspensión, de solubilización, de coloración, de espesamiento, de fragancias, etc...

Hay que apuntar que algunas de estas composiciones, en particular las composiciones destinadas a aplicaciones tópicas para indicaciones en dermatología, podrán asociarse a la vez oligonucleótidos circulares -o cerrados- con otros principios activos como, por ejemplo, agentes bacterioestáticos o antisépticos, o antimicrobianos, o antibióticos, o analgésicas, o antipuríticos, etc...

Todos estos ejemplos sólo se dan para ilustrar el propósito y no son ni exhaustivos ni limitativos.

V. Propriedades y ventajas de los oligonucleotides cerrados

Los ejemplos experimentales se dan a continuación para ilustrar las ventajas de un oligonucleótido cerrado sobre un oligonucleótido "abierto", lineal, de igual secuencia. Estos ejemplos se toman de experimentos realizados con oligonucleótidos circularizados según el procedimiento indicado en la parte "obtención de los oligonucleótidos cerrados", párrafo 1-3. Los oligonucleótidos cerrados de lo que se trata aquí son por lo tanto oligonucleótidos circulares, compuestos de nucleótidos naturales, unidos entre sí mediante enlaces fosfodiéster no modificados.

La descripción y los ejemplos hacen referencia a las Figuras adjuntas a las cuales se refieren las leyendas siguientes:

Figura 1

A-: Ejemplos de estructuras de los oligonucleótidos antisentido cerrados.

B-: Ejemplos de estructuras de los oligonucleótidos sentido cerrados.

C-: Molécula mixta que puede ejercer un efecto sentido y antisentido.

D-: Estructura de las bases que componen los oligonucleótidos y estructura del enlace fosfodiéster que enlazan los nucleótidos naturales entre sí.

Figura 2

A-: Representación esquemática de algunas modificaciones que pueden ser utilizadas para aumentar la estabilidad del enlace fosfodiéster y en particular su resistencia a las endonucleasas.

B-: Representación de algunos agentes reactivos de tipo intercalantes que pueden ser acoplados a los oligonucleótidos antisentido.

Figura 3

A-: Ejemplo de una ribozima circular que incluye el sitio catalítico denominado "en T" y un bucle de ARN que puede ser complementario de una secuencia diana.

Figura 4

A-: Representación esquemática de un oligonucleótido circular compuesto de nucleótidos naturales unidos entre sí por enlaces fosfodiésteres no modificados.

B-: Representación esquemática de un nucleótido cerrado en lazo con el extremo 5' libre y el extremo 3' bloqueado en el enlace de puente intercatenario.

C-: Representación esquemática de un oligonucleótido cerrado esférico, con un enlace intercatenario establecido entre los penúltimos nucleótidos terminales 5' y 3'. Este tipo de estructura puede incluir uno o varios enlaces intercatenarios entre uno cualquiera de los pares de nucleótidos apareados que forman la cola de la esfera.

D-: Representación esquemática de un oligonucleótido cerrado con un péptido (oligopéptido).

E-: Representación esquemática de un oligonucleótido circular que incluye una extensión peptídica lateral.

Figura 5

A-: Representación esquemática de un oligonucleótido cerrado, circular, que incluye una región bicatenaria autoapareada parcial.

B-: Representación esquemática de un oligonucleótido cerrado, circular, compuesto de una larga secuencia bicatenaria autoapareada (secuencia de reconocimiento de un factor de transcripción por ejemplo) y de dos bucles de unión poli (T).

Figura 6

A-: Circularización de un oligonucleótido lineal utilizando un oligonucleótido parcialmente complementario como guía y la ligasa de T4.

B-: Circularización de un oligonucleótido lineal utilizando un oligonucleótido parcialmente complementario como guía fijado sobre un soporte y la ligasa de T4.

C-: Circularización de un oligonucleótido que incluye una región de autoapareamiento mediante la ligasa de T4.

D-: Ejemplo de reacción bimolecular entre dos oligonucleótidos autoapareados y que presentan extremos cohesivos, que permite generar un oligonucleótido que lleva una larga región bicatenaria y dos bucles de adaptación.

Figura 7

A-: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida sobre el cual se hicieron emigrar distintos oligonucleótidos (circulares y lineales) después del tratamiento por distintas enzimas exonucleótidas.

La secuencia del oligonucleótido c7 es la descrita en la Figura 6C; los oligonucleótidos c6 y c8 están compuestos de secuencias diferentes pero que pueden adoptar el mismo tipo de estructura que c7, es decir, una estructura cerrada con parte bicatenaria central.

Las condiciones de ligación de los oligonucleótidos c6, c7 y c8 son las descritas en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados –1". Se analizó 1 \mug de oligonucleótido radioactivo procedente de la reacción de ligación (pistas 5 a 8) ó 1 \mug de oligonucleótido lineal correspondiente (pistas 1 a 4) sobre gel de poliacrilamida a 15%/7M de urea sin tratamiento posterior (pistas 4 y 5), o después de la incubación con la fosfatasa alcalina (pistas 3 y 6), con la exonucleasa VII (pistas 2 y 7) o con la fosfodiésterasa I (pistas 1 y 8) en las condiciones descritas en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados -2".

L indica la posición de emigración de los oligonucleótidos lineales; F indica la posición de emigración de los oligonucleótidos cerrados.

B-: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida sobre el cual se hicieron emigrar oligonucleótidos lineales o circulares después de la incubación en presencia de suero.

Se preparó 1 \mug del oligonucleótido radioactivo c7 (cuya secuencia se da en la Figura 6C) lineal (L) o cerrado (F), y se purificó tal como se describe en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados –1". Después de la incubación a 37ºC durante el tiempo indicado en presencia de DMEM que contiene 10% de suero de feto de ternera, se analizaron los productos sobre gel de poliacrilamida a 15%/7M de urea en las condiciones detalladas en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados –3".

C-: Representación gráfica de la degradación (medida por análisis sobre gel tal como se describe anteriormente) de los oligonucleótidos c7L (lineales) y c7F (circulares) después de la incubación en 10% de suero de feto de ternera, tal como se describe anteriormente, desde el tiempo t = 0 hasta el tiempo t = 96 horas. Para obtener una cuantificación, se recortaron los fragmentos de gel que corresponde a la localización de las bandas, observadas por autorradiografía, y se midió su radiactividad por recuento en un contador de centelleo. Los resultados se expresan en porcentaje de degradación con respecto a la radiactividad del tiempo t = 0.

Figura 8

A-: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante sobre el cual se hicieron emigrar oligonucleótidos lineales o circulares después de la hibridación con oligonucleótidos que incluían secuencias complementarias, en serie desoxiribo- o ribo-.

Se incubaron 300 ng de oligonucleótido radioactivo c7 cerrado (F) ó 160 ng de oligonucleótido c7 lineal (L) con cantidades crecientes de un oligonucleótido no complementario (pistas a a g) o un oligonucleótido 42-mer (12; pistas h a n) complementario de 21 nucleótidos del gran bucle de c7 (Figura 6C). La cantidad de oligonucleótido frío añadida es 0 (pistas a a h), 30 ng (b e i), 60 ng (c y j), 150 ng (d y k), 300 ng (e y l), 750 ng (f y m) ó 1500 ng (g y n). Después de la hibridación en las condiciones descritas en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados -4-1", se analizaron los productos sobre gel no desnaturalizante de poliacrilamida a 20%.

Las flechas indican las posiciones de los oligonucleótidos c7 cerrado (F), lineal (L) y de los híbridos c7L/12 y c7F/12.

B-: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida que desnaturalizante sobre el cual se hicieron emigrar oligonucleótidos lineales o circulares hibridados o no hibridados con oligoribonucleótidos que incluyen una región complementaria luego tratados con la nucleasa S1.

Se incubaron 300 ng del oligonucleótido c7 cerrado (F) o lineal (L), sintetizados y purificados tal como se describe en la Figura 8A, ó 300 ng de un oligonucleótido frío 42-mer (12) con 1 ng de un ARN largo de 43 nucleótidos transcrito in vitro y marcado con ^{32}P de alta actividad específica ("Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados -4-2"). El ARN 43-mer incluye 27 bases complementarias de los 21 nucleótidos del gran bucle más 6 nucleótidos de la región autoapareada de c7F (Figura 6C); es también complementario de 37 bases del oligonucleótido 42-mer 12. Después de la hibridación, se analizaron los productos sobre gel de poliacrilamida a 20%/7M de urea directamente (pista 1) o después de la incubación durante 3 minutos (pista 3) o durante 30 minutos (pista 4) en presencia de la nucleasa S1 o durante 30 minutos en ausencia de la nucleasa S1 (pista 2) en las condiciones descritas en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados -4-2". la parte izquierda de la Figura (-) muestra los resultados obtenidos con el ARN 43-mer incubado solo.

Pista 5: ARN 43-mer que no se somete a ningún tratamiento posterior a la transcripción.

Las flechas indican las posiciones de los oligonucleótidos ARN 43-mer, c7 cerrado (F), c7 lineal (L) así como las de los ARN protegidos (RNA 37, 27 y 21).

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C-: Autorradiografía de un gel de poliacrilamida desnaturalizante sobre el cual se hicieron emigrar oligonucleótidos lineales o circular hibridados o no hibridados con oligoribonucleótidos que incluyen una región complementaria y que a continuación se trataron con RNasa H.

Los oligonucleótidos ensayados (RNA 43, c7F, C7L y 12), así como las condiciones de hibridación, son las mismas que los descritos en la Figura 8B. Después de la hibridación, se incubaron los productos de la reacción en ausencia (-) o presencia (+) de RNasa H y se analizaron sobre gel de poliacrilamida a 20%/7M de urea en las condiciones descritas en "Propiedades y ventajas de los oligonucleótidos cerrados –5". Las flechas indican las posiciones del ARN 43-mer, c7 cerrado (F) o c7 lineal (L).

Figura 9

Análisis de los efectos de oligonucleótidos lineales o circulares sobre el crecimiento celular.

Figura 10

Estudio de los efectos inhibidores de oligonucleótidos antisentido lineales o circulares sobre la multiplicación del virus HSV-l.

Figura 11

Gel de retraso que ilustra la fijación del factor de transcripción HNF-1 por oligonucleótidos de tipo sentido, lineales bicatenarios o cerrados en circularización. Las abreviaturas utilizadas en esta leyenda se refieren a la nomenclatura utilizada en el ejemplo 7.

01	HNF-1 LB sin extracto nuclear
02	HNF-1 LB + 1 \mug extracto nuclear de hígado
03	HNF-1 C1 sin extracto nuclear
04	HNF-1 C1 + 1 \mug extracto nuclear de hígado
05	HNF-1 C1 no ligado sin extracto nuclear
06	HNF-1 C1 no ligado + 1 \mug de extracto nuclear de hígado
07	HNF-1 C2 sin extracto nuclear
08	HNF-1 C2 + 1 \mug de extracto nuclear de hígado
09	HNF-1 C2 no ligado sin extracto nuclear
10	HNF-1 C2 no ligado + 1 \mug de extracto nuclear de hígado
11	HNF-1 C3 sin extracto nuclear
12	HNF-1 C3 + 1 \mug extracto nuclear de hígado
13	HNF-1 C3 no ligado sin extracto nuclear
14	HNF-1 C3 no ligado + 1 \mug de extracto nuclear de hígado

HNF-1C1, C2, C3 representan 3 preparaciones diferentes del oligonucleótido sentido HNF-1 C.

Ejemplo 1 Obtención de los oligonucleótidos cerrados que incluyen una región de autoapareamiento mediante ADN ligasa de T4

Las condiciones experimentales que permiten el cierre/ligación eficaz de los oligonucleótidos cuyas secuencias se dan en la Figura 7A son las siguientes:

11 \muM de oligonucleótido lineal marcado en 5' con g ^{32}P de ATP (150 \mug; actividad específica = 2-3 x 10^{5} cpm/\mug), 50 mM de Tris-HCl a pH 7,8, 10 mM de MgCl_{2}, 20 mM de DTT, 1 mM de BSA sobre M ATP y 10.000 unidades del ADN ligasa de T4 (2.000 u/\mul; New England Biolabs) en un volumen total de 1 ml. Después de la incubación durante 48 horas a 4ºC, las mezclas de reacción se extraen con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, se precipitan con etanol absoluto, se lavan con etanol a 80% y se secan. A continuación, los productos de ligación se separan del oligonucleótido no ligado por electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida a 20%/7 M de urea. Las posiciones de los oligonucleótidos se pueden observar directamente por interferencia de fluorescencia irradiando a 212 nm el gel colocado sobre una placa que contiene un cromóforo fluorescente a rayos ultravioletas, o bien por autorradiografía. El oligonucleótido monomérico ligado se caracteriza por una emigración ralentizada con respecto a su homólogo no ligado (Figura 7A y B). Se escinden del gel las bandas correspondientes al oligonucleótido monomérico cerrado y a su homólogo lineal no ligado, y el ADN se aisla mediante las técnicas clásicas de extracción de geles de poliacrilamida. En el caso de las secuencias consideradas, el rendimiento de formación del oligonucleótido monomérico cerrado es del orden de 65 a 75%.

Alternativamente, los productos de la reacción de ligación pueden ser analizados sin purificación previa, directamente después de la inactivación de la ADN ligasa calentando el medio de ligación durante 2 minutos 90ºC.

Ejemplo 2 Resistencia de los oligonucleótidos circulares en serie desoxiribo- a las nucleasas y a las fosfatasas

Se comparó la resistencia de los oligonucleótidos circulares y lineales a la acción de la fosfatasa alcalina (fosfomonoésterasa que hidroliza los fosfatos 3' y 5' del ADN y del ARN), de la exonucleasa VII (exodesoxiribonucleasa que digiere el ADN monocatenario después de los dos extremos 3' y 5'), y de la fosfodiésterasa I (exonucleasa que digiere el ADN o el ARN a partir del 3' OH).

Para este experimento, se prepararon los oligonucleótidos 5' ^{32}P cuyas secuencias se indican en la Figura 7A en la Figura 7A tal como se describe anteriormente (párrafo 1). Después de la ligación, se calentaron las mezclas de reacción durante 2 minutos a 90ºC con el fin de inactivar la ADN ligasa.

Se incubó 1 \mug de oligonucleótido procedente de la reacción de ligación ó 1 \mug de oligonucleótido lineal homólogo, no circularizado y utilizado como testigo, a 37ºC en un volumen de 10 \mul, de 50 mM Tris HCl a pH 7,5, 10 mM de MgCl_{2} y 20 mM de DTT en presencia de 1 unidad de fosfatasa intestinal de ternera (CIP) o de 1 unidad de exonucleasa VII de E. coli durante 1 hora, o de 5 x 10^{-5} unidades de fosfodiésterasa I de Crotalus durissus durante 10 minutos. Después de la incubación, se analizaron los productos de la reacción sobre gel de poliacrilamida a 15% en condiciones desnaturalizantes. El resultado del gel se presenta en la Figura 7A. Se observó sobre la autorradiografía de esta gel que:

-: los oligonucleótidos cerrados circulares son resistente la fosfatasa mientras que los oligonucleótidos lineales son sensibles a la misma;

-: los oligonucleótidos cerrados circulares son resistentes a la acción de la exonucleasa VII mientras que los oligonucleótidos son sensibles a la misma;

-: los oligonucleótidos cerrados circulares son resistentes a la acción de la fosfodiésterasa I mientras que los oligonucleótidos son sensibles a la misma.

Este experimento pone de manifiesto que los oligonucleótidos preparados tal como se indica más arriba son muchas moléculas circulares cerradas de manera covalente, y que estas moléculas presentan una resistencia total a las enzimas exonucleótidas.

Ejemplo 3 Resistencia de los nucleótidos circulares cerrados a las nucleasas séricas

Los oligonucleótidos cerrados circulares que presentan una resistencia a la degradación nucleótida superior a la de los oligonucleótidos lineales cuando se incuban en presencia de suero.

Se incubaron 1 \mug de oligonucleótido cerrado y 1 \mug de oligonucleótido lineal correspondiente, preparados y purificados después de la ligación tal como se describe en el párrafo 1, a 37ºC en 10 \mul del medio DMEM que contiene 10% de suero de feto de ternera. La cinética de la reacción se sigue hasta 96 horas, y las tomas de muestras se efectúan en función del tiempo analizado sobre gel de poliacrilamida a 15% en condiciones desnaturalizantes. Se presenta en la Figura 7B la autorradiografía de un gel de análisis de la degradación durante 24 horas.

La Figura 7-C es la representación gráfica de un estudio de 96 horas de la degradación de un oligonucleótido lineal (c7L) en comparación con la degradación de un oligonucleótido circular (c7F) en las condiciones descritas anteriormente. Este gráfico pone de manifiesto las diferencias considerables de estabilidad entre estos dos tipos de oliginucleótidos.

Estos experimentos permiten sacar las conclusiones siguientes:

-: los oligonucleótidos lineales se degradan rápidamente por las nucleasas del suero. La degradación se produce desde los primeros minutos de la incubación, y se completa a cabo de unas horas;

-: el tiempo de semivida de un oligonucleótido lineal normal, no modificado, es muy inferior a 1 hora, pudiendo esta duración variar ligeramente de más o de menos según los sueros utilizados;

-: la degradación de los oligonucleótidos lineales es progresiva, y se observa la aparición de productos de degradación de longitud decreciente, que se hacen cada vez más cortos en función del tiempo, lo que indica que la degradación es principalmente cosa de las exonucleasas, y en particular de 3'. exo;

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-: en cambio, los oligonucleótidos cerrados son resistentes a la nucleolisis por las enzimas séricas, y menos de 60% de conversión en productos de degradación se observa incluso después de 96 horas (4 días) de incubación a 37ºC.

-: el tiempo de semivida de un oligonucleótido circular cerrado en el suero es muy superior a 24 horas.

Estos resultados confirman que la degradación de los oligonucleótidos antisentido en el suero es principalmente cosa de las exonucleasas y no de las endonucleasas y ponen de manifiesto la resistencia a la degradación de los oligonucleótidos cerrados.

Los oligonucleótidos cerrados naturales, que no llevan modificaciones químicas particulares, presentan una resistencia a las nucleasas séricas similar a la resistencia descrita para derivados modificados. Por lo tanto, este experimento muestra que en las condiciones estándares de incubación de oligonucleótidos en presencia de suero, los oligonucleótidos cerrados que constituyen el objeto de está patente presentan una ventaja notable sobre los oligonucleótidos lineales.

Ejemplo 4 Hibridación de los oligonucleótidos cerrados en serie desoxiribo- con ADN y ARN

Para presentar un efecto antisentido, los oligonucleótidos antisentido deben poder hibridar con su diana en condiciones de estabilidad satisfactorias. Se analizó la hibridación entre oligonucleótidos cerrados y polinucleótidos que llevan secuencias complementarias, bien sea en serie ribo- o bien en serie desoxiribo-.

Ejemplo 4-1 Puesta de manifiesto de la hibridación entre un oligonucleótido cerrado y un ADN lineal

Se incubaron 300 ng de oligonucleótido circular cerrado, preparado y purificado tal como se describe anteriormente, -ó 160 ng de oligonucleótido homólogo lineal como testigo- con un oligómero frío largo de 42 nucleótidos que incluye una secuencia de 21 nucleótidos complementarios a las 21 bases que forman el gran bucle en la estructura cerrada (véase la secuencia de la Figura 6C). Las relaciones molares entre el oliginucleótido marcado y el oligonucleótido complementario frío varían de 10:1 a 1:5. La hibridación se hace durante 1 hora a 37ºC en IX SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de Na_{3}, a pH 7.0). Después de la incubación, se analizan los productos sobre gel con 20% de poliacrilamida no desnaturalizante. Los resultados de la autorradiografía del gel se presentan en la Figura 8A.

Se observa sobre este gel que las cinéticas de desplazamiento de las bandas entre las posiciones monocatenaria y bicatenaria son idénticas para los oligonucleótidos lineales y los oligonucleótidos cerrados. Este resultado significa que las eficacias de hibridación entre un oligonucleótido cerrado y un ADN complementario son idénticas a las de un oligonucleótido lineal con una secuencia complementaria.

Ejemplo 4-2 Cartografía de la hibridación entre un oligonucleótido cerrado y un ARN lineal

El experimento siguiente consiste en analizar mediante la técnica de protección con nucleasa S1 la posición de las regiones bicatenarias durante la hibridación entre un desoxiribonucleótido cerrado y un oligoribonucleótido que incluye una secuencia que es complementaria a la región en bucle del oligonucleótido cerrado. La nucleasa S1 es una endonucleasa específica de los ácidos nucleicos de filamento simple, que sólo digiere las secuencias no apareadas. Esta es una enzima que permite cartografiar las regiones que están en forma bicatenaria y diferenciarlas de las regiones monocatenarios.

Se incuba un oligonucleótido cerrado, sintetizado y purificado tal como se describe más arriba, con un ARN lineal largo de 43 nucleótidos, que incluye una secuencia de 27 bases complementarias a los 21 nucleótidos del bucle del oligonucleótido cerrado y a 6 de los nucleótidos acoplados a la región autoapareada (véase la secuencia de la Figura 6C). Este ARN fue transcrito por la ARN polimerasa de T7 a partir de una matriz sintética y se marcó con ^{32}P de ATP con una elevada actividad específica (2,3 x 10^{8} cpm/\mug). Después de la transcripción el ARN transcrito se purificó por electroforesis sobre gel de poliacrilamida a 15%/7 M de urea, se eluyó del gel y se precipitó con etanol y luego se suspendió en agua.

Después de la incubación durante 1 hora a 37ºC de 300 ng de oligonucleótido cerrado o de su homólogo lineal con 1 ng de ARN en 0,15 M de NaCl, 0,1 M de Hepes a pH 7,9 y 0,3 mM de EDTA, se diluyó la mezcla de reacción 10 veces en 50 mM de NaCl, 33 mM de acetato de sodio a pH 4,4 y 30 \muM de ZnSO_{4} y se añadió 4 unidades de nucleasa S1. Se toman muestras de alícuotas después de 3 minutos y 30 minutos de digestión a 37ºC y se analizaron los productos obtenidos sobre gel de poliacrilamida a 20% en condiciones desnaturalizantes. Como medida de control, se incubó, igualmente, en condiciones idénticas el ARN radioactivo en presencia de un oligonucleótido lineal complementario al ARN sobre 37 nucleótidos.

Los resultados de este experimento se presentan en la Figura 8B.

Se observaron sobre este gel que:

- El ARN incubado en ausencia de oligonucleótido complementario o en presencia de un oligonucleótido no complementario, está efectivamente no hibridado y completamente digerido por la nucleasa S1;

- el ARN incubado con un oligonucleótido lineal se protege de la digestión en una longitud de 37 nucleótidos, lo que corresponde a la longitud de las secuencias complementarias; después de 30 minutos de incubación el perfil de protección se desplaza hacia bandas centradas en torno a dos bandas mayoritarias de 35 y 34 nucleótidos, respectivamente lo que puede corresponder a una "respiración" de la molécula bicatenaria;

- el ARN incubado con el oligonucleótido cerrado presenta un perfil de protección característico, con varias bandas repartidas según una distribución centradas en torno a una banda de longitud de 27 nucleótidos que corresponde a la banda mayoritaria; después de 30 minutos de incubación las bandas protegidas mayoritarias se sitúan a nivel de 20 y 21 nucleótidos;

- el perfil de protección observado durante la incubación del ARN con un oligonucleótido de la misma secuencia que el oligonucleótido circularizado, pero lineal es idéntico al del oligonucleótido circularizado;

- el esquema de protección del ARN por el oligonucleótido cerrado muestra, por lo tanto, que la hibridación entre el ARN y el bucle circular del oligonucleótido se efectúa sobre una longitud óptima de 21 nucleótidos, incluyendo así la totalidad del bucle. El ARN complementario puede incluso desplazar los nucleótidos apareados en la parte bicatenaria del oligonucleótido para hibridarse.

Este experimento demuestra que la hibridación entre un oligonucleótido cerrado y un ARN que incluye una región complementaria al bucle puede realizarse en condiciones de temperatura y de fuerza iónica estándar y que el híbrido así formado presenta las características normales de una molécula bicatenaria resistente a la nucleasa S1.

Ejemplo 5 Activación de la actividad RNasa H por un híbrido formado entre un oligonucleótido circularizado cerrado y un ARN lineal

Se sabe que los efectos antisentido de los oligonucleótidos complementarios a un ARN mensajero son, en numerosos casos, el resultado de una acción de la RNasa H celular sobre el substrato así formado. La RNasa H es una actividad enzimática que degrada el ARN cuando se encuentra en forma de un híbrido ARN/ADN. Por lo tanto, se comprobó que la hibridación entre un oligonucleótido antisentido cerrado y un ARN lineal creaba bien un substrato para la RNasa H.

La estructura del ARN lineal utilizado para este experimento así como su preparación ya han sido descritos en el párrafo anterior.

La hibridación de 300 ng de oligonucleótido cerrado o de su homólogo lineal con 1 ng de ARN radioactivo (2,3 x 10^{8} cpm/\mug) que incluye una región complementaria a la parte en bucle del oligonucleótido antisentido se realiza en las condiciones descritas en el párrafo 4-2. Estas condiciones garantizan una hibridación de la totalidad del ARN con ADN complementario. Se dirá que la reacción de hibridación está "conducida" por el ADN. Después de la incubación, se diluyó 10 veces el volumen, ajustando el tampón de incubación a 20mM de Tris HCl a pH 7,5, 100 mM KCl, 10 mM MgCl_{2}, 0,1 mM de DTT, y se añadieron 2 unidades de RNasa H. Se incubaron a 37ºC durante 20 minutos y se analizó los productos de la reacción como anteriormente. Los resultados del gel se presentan en la Figura 8C.

Se observa sobre este gel que:

- el ARN marcado no hibridado con una secuencia de ADN complementaria es completamente resistente a la acción de la RNasa H;

- el ARN marcado, largo de 43 nucleótidos, hibridado con un oligonucleótido lineal de control complementario a 37 bases del ARN se hace parcialmente sensible a la acción de la RNasa H, y da productos de degradación;

- el ARN marcado hibridado con un oligonucleótido cerrado, cuyo bucle es complementario a 21 nucleótidos de este ARN, se hace muy sensible a la acción de la RNasa H y da una serie de productos de degradación cuyas longitudes son compatibles con los análisis de protecciones a la S1 descritos en el párrafo anterior.

En realidad, el experimento de inducción de substrato para la RNasa H es la imagen en espejo del experimento de protección a la S1 y los resultados obtenidos en los dos casos son completamente coherentes, indicando a la vez posiciones de hibridaciones similares y mostrando que un substrato para la RNasa H puede ser creado por hibridación entre un ARN lineal y un oligodesoxiribonucleótido circular.

Por lo tanto, este experimento muestra que un ARN lineal hibridado parcialmente con un oligodesoxiribonucleótido cerrado se convierte en un substrato para la RNasa H, lo que implica que un ADN circular hibridado con un ARN mensajero diana puede ejercer un efecto antisentido por el sesgo de la acción de esta enzima sobre un substrato así generado. Además, este experimento muestra igualmente que, en condiciones experimentales de concentración idénticas, el substrato ARN/ADN circular da lugar a una degradación más importante por la RNasa H que el substrato ARN/ADN lineal. En condiciones idénticas, siendo cualquier cosa igual, por lo demás, los oligodesoxiribonucleótidos antisentido circulares presentan, por lo tanto, una ventaja suplementaria sobre los oligonucleótidos antisentido lineales.

Ejemplo 6 Inhibición de la multiplicación del virus Herpes Simplex tipo 1 (HSV-1) por oligonucleótidos antisentido circulares

El oligonucleótido GT, cuya secuencia se da a continuación se sintetizó, se circularizó o no circularizó, y se utilizó en los experimentos descritos aquí, bien sea en forma lineal, o bien en forma circular.

1- Protocolos experimentales Secuencia y circularización del oligonucleótido GT

Secuencia de GT: 5' GTG GGA CGT TCC TCC TGC GGG AAG CGG C 3'

Para permitir una circularización química eficaz, se sintetizó el oligonucleótido GT en forma de 3'P, y se circulizó posicionando los extremos 5' y 3'P por hibridación con el oligonucleótido de secuencia parcialmente complementaria siguiente:

5' CCA CGC CG 3'

Las condiciones de ligación utilizadas son las siguientes:

para 100 \mug de oligonucleótido GT: 100 \mug de oligonucleótido complementario

: 0,25 M MES, a pH 7,4

: 20 mM MgCl_{2}

: 0,2 M CnBr

Volumen de la reacción: 500 \mul

Incubación a 4ºC durante 30 minutos. La reacción se detiene por adición de 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto, los oligonucleótidos precipitados y purificados sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante.

Infección de las células en presencia o en ausencia de los oligonucleótidos antisentido

Las células (células Vero ATCC - paso 121- cultivadas en medio (Gibco) MEM complementado de 5 ó 10% de SVF, de L-glutamina, de aminoácidos no esenciales y de penistrepto) se pican de nuevo la víspera de la infección a una densidad de 5.10^{4} células por pocillo de 2 cm^{2}. Después de 16 a 24 horas, las células se infectan con HSVlF a una multiplicidad de infección de 3 pfu/célula en presencia o en ausencia de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos se diluyen en el medio de cultivo sin suero en concentración 2X con respecto a la concentración final deseada para ser añadidos bajo un volumen de 50 \mul. Igualmente, el virus se añade bajo uno volumen de 50 \mul, 5 minutos después se añaden los oligonucleótidos. Por lo tanto, las células se tratan bajo un volumen de 100 \mul (50 \mul oligonucleótidos + 50 \mul virus) durante una hora a 37ºC con agitación suave durante los 15 minutos. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden ser añadidos varias horas antes de la infección.

Después de 1 hora de incubación, el medio se aspira y completamente y se añaden 500 \mul del medio completo sobre las células. La incubación se persigue durante 24 horas antes de ser detenida por congelación de las placas en nitrógeno líquido.

Todas las medidas de inhibición se efectúan por duplicado o por triplicado.

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Titulación del virus

Los virus se recuperan directamente en el medio de cultivo después de 3 ciclos rápidos de congelación con nitrógeno líquido/descongelación a 37ºC. A continuación, se diluyen en medio sin suero para efectuar la titulación propiamente dicha.

Las células indicadoras se pican de nuevo la víspera en medio completo a razón de 10^{5} células/pocillo de 2 cm^{2}.

El día siguiente, se aspira el medio y se depositan 100 \mul de los diferentes diluciones/pocillos. Después de una incubación de una hora a 37ºC con agitación durante los 15 minutos, el medio se aspira y las células se recubren con el medio completo que contiene 1,2% de metil- celulosa (concentración final de suero 2,5%) durante 3 días a 37ºC.

Después de 3 días, se elimina el medio, se fijan las células con PBS-10% de formol (solución a 37%) durante 20 minutos luego se colorean al cristal púrpura a 2% (en PBS-20% de etanol) durante 20 minutos. A continuación, se aclaran las placas y los halos son contados por transparencia sobre el negatoscopio.

Las titulaciones se efectúan en doble para cada punto. Los cálculos de inhibiciones se efectúan con respecto a los títulos virales observados en ausencia de oligonucleótido.

2- Resultados - Análisis de los efectos de los oligonucleótidos circulares sobre el crecimiento celular

La Figura 9 presenta los resultados de medida de crecimiento celular (células Vero) en presencia de oligonucleótidos diversos, lineales o circulares, en comparación con el crecimiento normal de las células solas. En este experimento, los oligonucleótidos se utilizan en una concentración de 20 \muM.

Los resultados muestran que las curvas de crecimiento están superpuestas. Los oligonucleótidos lineales o circulares no parecen presentar ningún efecto tóxico sobre el crecimiento celular.

- Análisis de los efectos de los oligonucleótidos circulares sobre la multiplicación de HSV-1

En este experimento, se compararon los efectos de los oligonucleótidos antisentido GT (cuya secuencia se da anteriormente) bajo forma lineal, o bajo forma circular. Se compararon dos condiciones diferentes de inhibición. En A, se añaden los antisentido en el momento de la infección, mientras que en B, se introducen en el medio 4 horas antes de la infección. Los resultados presentados en Figura 10 muestran que los oligonucleótidos antisentido circulares inhiben la multiplicación viral. La inhibición es del 30% a 2 \muM, y alcanza 65% a 5 \muM. A estas bajas concentraciones, los oligonucleótidos circulares presentan un efecto de inhibición superior al del oligonucleótido lineal.

Ejemplo 7 Propiedades de los oligonucleótidos de tipo "sentido" 1- Obtención de los oligonucleótidos de tipo sentido

Las condiciones experimentales que permiten la ligación eficaz del oligonucleótido cuya secuencia se da en la Figura 5-B son similares a las descritas en el ejemplo 1.

A continuación, los productos de ligación se analizan, por electroforesis desnaturalizante sobre gel de poliacrilamida de 12%/7M de urea.

Para la preparación de los oligonucleótidos sentido cerrados marcados que sirven para los ensayos de gel de retraso, las condiciones son las siguientes:

Se marcan 22 n moles de oligonucleótido en 5' con gamma 32 ATP (actividad específica 2-5 x 10^{8} cpm/\mug), 50 mM de Tris HC1 a pH 7,8, 10 mM de MgCl_{2}, 20 mM de DTT, 1 mM de ATP, 1mM de bSA y 400 unidades de la ADN ligasa de T4 en un volumen de 10 \mul. La incubación se hace durante 2 horas a 16ºC. Los productos de ligación se purifican por electroforesis desnaturalizante sobre gel de poliacrilamida de 12%/7M de urea, se detectan las bandas correspondientes al oligonucleótido cerrado por autorradiografía escindidas del gel y se aisla el ADN por las técnicas clásicas de extracción de geles de poliacrilamida.

Alternativamente, los productos de la reacción de la ligación se utilizan sin purificación previa, después de la inactivación de la ADN ligasa por calentamiento del medio de ligación durante 2 minutos a 90ºC, extracción con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, precipitación con alcohol absoluto en presencia de 20 \mug de glicógeno como transportador y lavado con alcohol a 80%.

2- Resistencia de los oligonucleótidos de tipo sentido a las nucleasas séricas

los oligonucleótidos "sentido" presentan una resistencia a la degradación nucleótida cuando se incuban en presencia de suero. Las comparaciones efectuadas entre la resistencia de los oligonucleótidos circularizados y oligonucleótidos bicatenarios lineales dan los mismos resultados que los presentados en la Figura 7-C. En cualquier caso, los oligonucleótidos cerrados presentan una resistencia superior a la de los oligonucleótidos no cerrados. El tiempo de semivida de los oligonucleótidos sentido cerrados es superior al menos en un factor 10 al de los oligonucleótidos lineales bicatenarios no cerrados, que presentan extremos 3' y 5' libres.

3- Puesta en manifiesto de la fijación del factor de transcripción HNF-1 por un oligonucleótido circular de tipo sentido que incluye la secuencia de reconocimiento bajo forma autoapareada.

Los experimentos siguientes se realizaron con los oligonucleótidos cuya secuencia figura a continuación:

HNF-1 NO LIGADO:

17

HNF1-CIRCULAR (HNFI-C):

18

HNF1-LINEAL BICATENARIO (HNF1-LB):

-G-T-G-T-G-G-T-T-A-A-T-G-A-T-C-T-A-C-A-G-T-T-A-C-A-C-A-C-C-A-A-T-T-A-C-T-A-G-A- T-G-T-C-A-A-T-

Se compara la eficacia de fijación del factor de transcripción HNF1 (obtenido a partir de extractos nucleares de hígado) sobre oligonucleótidos lineales de doble filamento, oligonucleótidos en U, oligonucleótidos circulares, no ligados o cerrados de nuevo por la acción de la ligasa de T4 (la secuencia de oligonucleótido circular utilizada se da en la Figura 5-B).

Se incubaron 3 f moles de cada oligonucleótido (actividad específica 7000 cpm/f moles para el oligonucleótido lineal de doble filamento y 3500 cpm/f moles para los otros oligonucleótidos) en un volumen final de 14 \mul con l \mug de un extracto proteico nuclear de hígado en 10 mM de Hepes a pH 7,9, 50 mM de KC1, 10% de glicerol, 0,1 mM de EDTA, 0,5 mM de DTT, 0,5 mM de PMSF, 6 mM de MgCl_{2}, 6 mM de espermina en presencia de 1,5 \mug de poli dI.dC-poli dI.dC y 250 ng de ADN de esperma de salmón tratado con ultrasonido como competidores no específicos. Después de 10 minutos a 4ºC, las mezclas de la reacción, así como los controles en las cuales se ha omitido la adición de proteínas, se depositan sobre un gel natural de poliacrilamida a 6%/0,25 x TBE. Al final de la emigración, el gel se fija en una solución de 10% de ácido acética y 10% de metanol, se transfiere sobre papel 3MM, se seca y se autorradiografía. El resultado de este experimento se presenta en la Figura 11.

Se observa que:

1.: La afinidad de fijación del factor de transcripción, para el oligonucleótido circular cerrado es similar a la fijación observada sobre oligonucleótidos lineales de doble filamento (o en U, resultados no presentados aquí). Por lo tanto, dichas estructuras se pueden utilizar como agente para fijar factores de transcripción, de transactivadores, o cualquier otra proteína fijándose sobre una secuencia de ADN específica.

2.: La fijación del factor de transcripción HNF1 sobre el oligonucleótido circular no ligado es de 5 a 10 veces inferior a la observada sobre el oligonucleótido circularizado por acción de la ligasa. El sitio de ligación en el oligonucleótido sentido se centra en la porción bicatenaria y corresponde al eje del pseudopalíndromo que constituye el sitio de fijación del Dimer de HNF1. Por lo tanto, la presencia de una "mella (nick)" desestabiliza el enlace ADN/proteína. Este resultado confirma la naturaleza cerrada del oligonucleótido circular "sentido" tratado por la ligasa de T4.

3. Referencias bibliográficas citadas en el texto

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Claims

1. Agentes del tipo oligonucleótido constituido de una o varias secuencia(s) de oligonucleótidos monocatenarios, cuyos extremos se unen entre sí por enlaces covalentes para formar al menos parcialmente una estructura monocatenaria cerrada, siendo dicho agente caracterizado porque está constituido de al menos una secuencia seleccionada entre las secuencias siguientes:

: a) un oligonucleótido antisentido;

: b) un oligonucleótido sentido, reconocido específicamente por una proteína natural,

2. Agente según la reivindicación 1, caracterizado porque está constituido de un oligonucleótido antisentido.

3. Agente según la reivindicación 2 caracterizado porque está constituido por una secuencia oligonucleótida monocatenaria de la que los extremos 5' y 3' se unen mediante una estructura covalente no nucleótida.

4. Agente según la reivindicación 2 caracterizado porque está constituido por una secuencia oligonucleótido monocatenaria de la que los extremos 5' y 3' se unen entre sí por un enlace nucleótido.

5. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque las secuencias de oligonucleótidos no incluyen ningún extremo 5' ó 3' libre.

6. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 constituido de un oligonucleótido antisentido, caracterizado porque la o las secuencia(s) nucleótida(s) del compuesto no incluyen fragmentos susceptibles de auto-aparearse.

7. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque al menos una secuencia de oligonucleótidos es la secuencia complementaria de una región de ARN mensajero o de un fragmento de ADN natural.

8. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque incluye una parte poliribonucleótida capaz de ejercer una actividad de escisión en trans sobre un ARN.

9. Agente según la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias de oligonucleótido que incluyen fragmentos susceptibles de aparearse pueden formar auto-apareamientos bicatenarios.

10. Agente según la reivindicación 9, caracterizado porque los fragmentos susceptibles de aparearse pueden ser separados por fragmentos que no pueden aparearse.

11. Agente según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha proteína natural es un factor de transcripción.

12. Agente según la reivindicación 11, caracterizado porque el factor de transcripción es HNF-1.

13. Agente según la reivindicación 12, caracterizado porque los fragmentos susceptibles de aparearse pueden ser separados por fragmentos que no pueden aparearse.

14. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, caracterizado porque la o las secuencia(s) de oligonucleótidos pueden incluir nucleótidos en serie desoxiribo- o en serie ribo- natural o no natural.

15. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 caracterizado porque se injerta un componente que tiene una actividad biológica sobre la estructura monocatenaria cerrada.

16. Agente según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho componente se injerta sobre la estructura covalente no nucleótida.

17. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 16, caracterizado porque la estructura covalente no nucleótida es una estructura peptídica.

18. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 17, caracterizado porque la estructura covalente no nucleótida es una estructura al menos parcialmente lipídica.

19. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 18, caracterizado porque la secuencia de oligonucleótidos está únicamente en serie desoxiribo- o en serie ribo- natural o no naturales.

20. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 19, caracterizado porque las secuencias nucleótidas mismas le permiten adaptar una estructura bicatenaria, que hace intervenir apareamientos anti-paralelos y/o paralelos en una conformación de tipo Moebius.

21. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 20, caracterizado porque las secuencias de oligonucleótidos incluyen entre 10 y 200 nucleótidos.

22. Procedimiento de preparación de un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque se efectúa la síntesis química parcial o total de la cadena monocatenaria del compuesto antes de ciclizarla.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque la secuencia de oligonucleótidos se obtiene por un método bioquímico.

24. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 21 para la fabricación de un medicamento.

25. Utilización de un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 21 para la fabricación de un medicamento antiviral o anticanceroso.

26. Agente según la reivindicación 24, caracterizado porque el medicamento es inductor de inmuno-moduladores naturales.

27. Agente según la reivindicación 24, caracterizado porque el medicamento es inductor de interferones.

28. Agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 21, caracterizado porque un medicamento destinado a actuar de manera específica sobre la transcripción o la traducción de proteínas de las que se desea modular el nivel de expresión.

29. Agente según la reivindicación 28 como agente de represión de la expresión de proteínas directamente implicadas en las enfermedades de la proliferación y de la diferenciación.

30. Utilización de un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 21 para la fabricación de un agente de diagnóstico.

31. Utilización según la reivindicación 30, caracterizada porque el agente está marcado.

32. Utilización de un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 21, en cosmética.

33. Composición farmacéutica caracterizada porque incluye como principio activo al menos un agente según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 a 21.

34. Composición según la reivindicación 33, caracterizada porque la composición farmacéutica está en forma administrable por vía tópica externa.

35. Composición según la reivindicación 34, caracterizada porque se trata de una composición antiviral.