ES2199939T3 - Dimero de variantes moleculares de apolipoproteina y procedimientos para su produccion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS DIMEROS SUSTANCIALMENTE PUROS DE APOLIPOPOTEINA AL-MILANO (APO AL-M/APO AL-M) QUE PARA LA PRIMERA VEZ HA SIDO AISLADO Y CARACTERIZADO A PARTIR DE PLASMA. TAMBIEN SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICA QUE COMPRENDEN APO AL-M/APO AL-M. EL DIMERO DE APOLIPOPROTEINA ALM HA SIDO PRODUCIDO EN UN SISTEMA DE ESCHERICHIA COLI RECOMBINANTE O RECOGIDO A PARTIR DE PLASMA DE PORTADORES DE APOLIPROPROTEINA AL-MILANO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL METODO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE ARTERIOSCLEROSIS Y CARDIOVASCULARES Y EL USO DEL DIMERO EN LA PREPARACION DE UN MEDICAMENTO. EL MEDICAMENTO QUE CONTIENE EL DIMERO PUEDE SER USADO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DE ARTERIOSCLEROSIS Y CARDIOVASCULARES Y EN LA PREVENCION DE TROMBOSIS EN DIFERENTES CIRCUNSTANCIAS CLINICAS, TANTO A NIVEL ARTERIAL COMO VENAL. EL DIMERO PUEDE TAMBIEN ACTUAR COMO UNA PRODROGA PARA EL MONOMERO.

Description

Dímeros de una variante molecular de apolipoproteína y procedimientos para su producción.

La presente invención trata del dímero sustancialmente puro de la apolipoproteína AI-Milano (Apo AI-M/Apo AI-M) y de composiciones farmacéuticas que contienen este dímero. También trata del procedimiento para la preparación mediante técnica recombinante, así como mediante aislamiento del plasma. El producto puede usarse para el tratamiento de la arteriosclerosis y de enfermedades cardiovasculares y como una formulación retardada de la Apo AI- M.

Antecedentes

La clara correlación entre los elevados niveles de colesterol sérico y el desarrollo de la enfermedad coronaria cardiaca (ECC) se ha confirmado repetidamente, basándose en los estudios epidemiológicos y longitudinales. Sin embargo, la definición de complejos mecanismos del transporte del colesterol en plasma ha permitido el reconocimiento de una función selectiva de las lipoproteínas circulantes en la determinación del riesgo de ECC.

De hecho, hay cuatro lipoproteínas circulantes principales: quilomicrones (QM), lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Mientras que los QM constituyen un producto de vida corta de la absorción intestinal de grasa, las VLDL y, particularmente, las LDL son las responsables del transporte del colesterol a los tejidos, incluyendo, por ejemplo, a las paredes arteriales. En contraste, las HDL están directamente involucradas en la eliminación del colesterol de los tejidos periféricos, llevándolo de regreso o bien al hígado o bien a otras lipoproteínas, mediante un mecanismo conocido como "transporte inverso del colesterol" (TIC).

El papel "protector" de las HDL se ha confirmado en numerosos estudios (por ejemplo, Miller y col. Lancet, 1977: 965-968 y Whaine y col. Atherosclerosis 1981; 39: 411-419). En estos, los elevados niveles de LDL, menos así los de VLDL, parecen estar claramente asociados con un riesgo cardiovascular elevado, mientras que los altos niveles de HDL parecen conferir una protección cardiovascular. El papel protector de las HDL ha sido fuertemente apoyado también por los estudios in vivo, que muestran que las perfusiones con HDL a conejos pueden retrasar el desarrollo de lesiones arteriales inducidas por el colesterol (Badimon y col., Lab. Invest. 60, 455-61, 1989) y/o inducir la regresión de las mismas (Badimon y col., J Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990).

El reciente interés en el estudio de los mecanismos protectores de las HDL se ha enfocado sobre la apolipoproteína AI (Apo AI), el componente principal de las HDL. Los altos niveles plasmáticos de Apo AI están asociados con la reducción del riesgo de ECC y de la presencia de lesiones coronarias (Maciejko y col., N. Engl J Med. 1983; 309: 385-389, Sedlis y col., Circulation 1986; 73: 978-984).

La Apo AI plasmática es un polipéptido de cadena simple de 243 aminoácidos, del que se conoce su secuencia primaria (Brewer y col., Biochem Biophys Res Commun 1978; 80: 623-630). La Apo AI se sintetiza en la célula como un precursor de 267 aminoácidos. Esta preproapolipoproteína se procesa por corte del extremo N-terminal primero intracelularmente donde se pierden 18 aminoácidos, y después por un posterior corte de 6 aminoácidos en el plasma o en la linfa mediante la actividad de proteasas específicas.

El requisito estructural principal de la molécula Apo AI se cree que reside en la presencia de unidades repetidas de 11 ó 22 aminoácidos, que presuntamente existen en una conformación helicoidal anfipática (Segrest y col., FEBS Lett 1974; 38: 247-253). Esta estructura permite las principales actividades biológicas de la Apo AI, es decir, la unión a lípidos y la activación de la lecitin colesterol acil transferasa (LCAT). Otra propiedad recientemente descrita de Apo AI es su actividad antiviral. Esta se ha descrito a partir de estudios in vitro y se ejerce tanto contra cepas de virus Herpes (Srinivas R V y col., Virology, 1756. 48-57, 1990) como también contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), (Owe y col., J Clin Invest, 86, 1142-50, 1990). Esta actividad parece ejercerse mediante una interacción entre los fragmentos de hélice anfipática de la Apo AI y las glicoproteínas de la cápside de los virus.

Los estudios in vitro indican que los complejos de Apo AI y lecitina pueden promover el flujo de colesterol libre desde células de músculo liso arterial en cultivo (Stein y col., Ciochem Biophys Acta 1975, 380: 106-118). Mediante este mecanismo las HDL pueden reducir también la proliferación de estas células (Yoshida y col., Exp Mol Pathol 1984; 41: 258-266).

Más recientemente, la perfusión de Apo AI o de HDL en animales de experimentación ha mostrado que ejerce unos cambios bioquímicos significativos, así como una reducción del alcance y la gravedad de las lesiones arteroscleróticas. Después un informe inicial de Maciejko y Mao (Arteriosclerosis 1982; 2: 407a), Badimon y col., (véanse los dos estudios citados anteriormente), descubrieron que podían reducir significativamente el alcance de las lesiones arteroscleróticas (-45%) y su contenido en éster de colesterol (-58,5%) en conejos alimentados con colesterol, mediante la perfusión de HDL (d=1,063-1,325 g/ml). Descubrieron también que las perfusiones de HDL condujeron a cerca de un 50% de regresión de las lesiones establecidas. Además, se pudo demostrar (Esper y col., Arteriosclerosis 1987; 7: 523a) que las perfusiones de HDL pueden cambiar notablemente la composición de lipoproteínas del plasma de conejos Watanabe con hipercolesterolemia congénita, que desarrollan lesiones arteriales tempranas. En éstos, las perfusiones de HDL pueden más que doblar la proporción entre las HDL protectoras y las LDL aterogénicas.

El potencial de las HDL para prevenir las enfermedades arteriales en modelos animales se ha visto estimulado tras observar que Apo AI puede ejercer una actividad fibrinolítica in vitro (Saku y col., Thromb Res 1985; 39: 1-8). Ronneberger (Décimo Congreso Internacional de Farmacología, Sydney 1987, pág. 990) demostró que la Apo AI extraída puede aumentar la fibrinolisis en perros Beagle y en monos Cynomologous. Se puede apreciar una actividad similar in vitro sobre plasma humano. Este autor fue capaz de confirmar una reducción de la deposición lipídica y de la formación de placa arterial en animales tratados con Apo AI.

La Apolipoproteína AI-Milano (Apo AI-M) es la primera variante molecular descrita de la Apo AI humana (Franceschini y col., J Clin Invest 1980; 66: 892-900). Se caracteriza por la sustitución de la Arg 173 por Cys (Weisgraber y col., J Biol. Chem 1983; 258: 2.508-2.513). La apoproteína mutante se transmite como un carácter autosómico dominante, y se han identificado 8 generaciones de vehículos (Gualandri y col., Am J Hum Genet 1984; 37: 1083- 1097).

El estado del individuo portador de Apo AI-M se caracteriza por una notable reducción de los niveles de colesterol HDL. A pesar de esto, los sujetos afectados no muestran aparentemente un elevado riesgo de enfermedad arterial; de hecho, mediante el examen del árbol genealógico parece que estos sujetos están "protegidos" frente a la arteriosclerosis.

El mecanismo del posible efecto protector de la Apo AI-M en los portadores parece estar ligado a la modificación de la estructura de la apolipoproteína mutante, con la pérdida de una hélice alfa y una exposición aumentada de los residuos hidrófobos (Franchechini y col., J Biol. Chem 1985; 260: 1632-1635). La pérdida de la estructura rígida de las múltiples hélices alfa conduce a una flexibilidad aumentada de la molécula, que se asocia más fácilmente con los lípidos, en comparación con la AI normal. Por otra parte, los complejos apolipoproteína/lípido son más susceptibles de desnaturalizarse, lo que sugiere que la liberación de los lípidos está mejorada también en el caso de la mutante.

El uso terapéutico de la apolipoproteína AI-M está actualmente limitado por la falta de un procedimiento que permita la preparación de dichas apolipoproteínas en una cantidad suficiente y en una forma adecuada.

Otra característica muy específica de la Apo AI-M es su capacidad para formar dímeros consigo misma y complejos con Apo AII, en ambos casos debido a la presencia del residuo Cys. A partir de los estudios de fracciones sanguíneas que contienen una mezcla de Apolipoproteínas, hubo indicios que mostraron que la presencia de dímeros y complejos en la circulación podían ser los responsables de la vida media de eliminación aumentada estos en los portadores, recientemente descritos en estudios clínicos (Gregg y col., NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotipic Expression, Limone SG, 1988).

Los dímeros de Apo AI-M (Apo AI-M/Apo AI-M) actúan como factores de inhibición sobre la conversión entre partículas de HDL in vitro (Franceschini y col., J Biol. Chem 1990; 265: 12224-12231).

Los estudios preliminares de las mezclas que contienen el dímero se han basado en Apo AI-M aisladas de sangre natural de personas con Apo AI-M, por lo que sólo se ha podido obtener en pequeñas cantidades.

La dificultad de producir Apo AI y particularmente Apo AI-M a partir del fraccionamiento plasmático es bastante considerable (Franceschini y col., J Biol. Chem 1985; 260: 16321-16325). El aislamiento y la producción no puede realizarse a gran escala, ya que sólo se dispone de una pequeña cantidad de materia prima. Por otro lado, hay muchos riesgos asociados con los productos del fraccionamiento plasmático, como la contaminación con agentes infecciosos. Es esencial que esto se evite.

Se han realizado varios intentos para producir Apo AI humana mediante la tecnología del ADN recombinante. En la publicación de patente europea Nº 0267703 se describe la preparación de Apo AI a partir de E. coli. El procedimiento describe un polipéptido quimérica en el que el radical Apo AI se fusiona a los residuos del extremo amino N-terminal de la beta-galactosidasa, o a uno o más dominios de unión a IgG de la Proteína A, o a la prosecuencia de la Apo AI humana.

La expresión de Apo AI y Apo AI-M en cepas de levadura y el uso de los componentes producidos en el tratamiento de la arteriosclerosis y de enfermedades cardiovasculares se describe en el documento WO90/12879. Los genes que codifican la Apo AI y la Apo AI-M se proporcionaron con secuencias de ADN que codifican para señales de secreción y procesamiento reconocibles por las levaduras fusionadas corriente arriba del gen de las proteínas maduras. Se usó una secuencia líder MF-alfa-1 modificada en la que los últimos residuos eran HisGlySerLeuAspLysArg.

La presente invención

Ahora hemos descubierto sorprendentemente que el dímero purificado de Apo AI-M/Apo AI-M tiene una larga vida media plasmática en comparación con el monómero Apo AI-M, además tiene una notable propiedad estimuladora de la fibrinolisis mejorada en comparación con la Apo AI-M normal, por ejemplo, su capacidad de activar directamente el plasminógeno (lo que no hace la Apo AI-M normal), una observación que puede ser de importancia biológica, y además la posibilidad de actuar como un promedicamento para Apo AI-M. Además, forma partículas de HDL reconstituidas (lipoproteína de alta densidad) de un tamaño único que no se encuentra en las partículas de HDL recombinantes que contienen Apo AI-M o Apo AI.

La presente invención trata de dímeros sustancialmente puros de la apolipoproteína AI-Milano, denominada en lo sucesivo Apo AI-M/Apo AI-M, con una pureza de al menos un 90%, preferiblemente de al menos un 98%, que por primera vez se ha aislado y caracterizado a partir de plasma y que además se ha producido por procedimientos recombinantes. Además, trata de composiciones farmacéuticas que comprenden la Apo AI-M/Apo AI-M, opcionalmente junto con un agente estabilizante, por ejemplo, compuestos lipídicos estabilizantes como fosfolípidos y/o un vehículo. Las composiciones farmacéuticas pueden contener además un agente que disminuye los lípidos y/o otros medicamentos ya conocidos en el tratamiento de la arteriosclerosis y de las enfermedades cardiovasculares, como heparina, fracciones de heparina, y fragmentos de heparina o agentes para la disminución de lípidos.

La apolipoproteína Apo AI-M puede producirse mediante:

a) la producción de la apolipoproteína Apo AI-Milano mediante tecnología recombinante como una proteína de fusión intracelular en E. coli, escindiendo la apolipoproteína Apo AI-M con ácido fórmico, y después convirtiendo cualquier monómero presente en el dímero o

b) la producción de la apolipoproteína Apo AI-M por tecnología recombinante, en la que la apolipoproteína Apo AI-M, en forma monomérica o dimérica, se secreta al medio de cultivo bacteriano en un sistema de expresión en E. Coli, y cualquier monómero presente se convierte después en el dímero.

y purificación del dímero hasta conseguir una forma sustancialmente pura.

Según a), la Apo AI-M se produce como una proteína de fusión intracelular en la bacteria. El compañero de fusión es un dominio de unión a IgG modificado para la proteína A, y se diseña un sitio de corte para el ácido fórmico entre el compañero de fusión y la Apo AI-M. Después de la lisis de la bacteria, la proteína de fusión se purificó en una IgG fijada, y se escindió con ácido fórmico. La presencia de Apo AI-M y del dímero se demostró por técnicas de transferencia tipo Western en una electroforesis en un gel SDS. En el ejemplo 3 se muestra que la Apo AI-M procesada podría producirse en E. coli recombinante y que se forman dímeros. Sin embargo, el uso de ácido fórmico da lugar a productos truncados con dos aminoácidos en su extremo N-terminal. No se supone que este truncamiento altere la actividad de la molécula de Apo AI-M.

El sistema según b) se muestra en el ejemplo 4, en el que se forma la molécula completamente correcta.

Se puede obtener también el dímero reivindicado de Apo AI-M

c) mediante recogida del plasma de los portadores de la Apolipoproteína AI-Milano, aislando las apolipoproteínas HDL, separando el dímero mediante el uso de cromatografía, por ejemplo por cromatografía en Sephacryl, en varias etapas o

d) mediante la recogida del plasma de los portadores de la Apolipoproteína AI-M, purificando el monómero y después hasta conseguir convertirlo en dímero, y purificando el dímero en una forma sustancialmente pura.

Es importante que la separación según c) se efectúe en varias etapas y preferiblemente sobre una columna larga, como de 300 cm. Si el monómero está presente, debería siempre convertirse en la forma dimérica, como se muestra en los siguientes ejemplos.

La invención incluye un procedimiento para el tratamiento de la arteriosclerosis y de las enfermedades cardiovasculares y el uso del dímero para la preparación de un medicamento. El dímero puede también actuar como un promedicamento para el monómero para el tratamiento de la arteriosclerosis y de las enfermedades cardiovasculares.

Este medicamento puede usarse para el tratamiento de la arteriosclerosis y de las enfermedades cardiovasculares y para la prevención y el tratamiento de las principales enfermedades cardiocirculatorias como el infarto de miocardio, angina inestable, oclusiones vasculares periféricas agudas y restenosis después de una angioplastia coronaria. Cuando se tratan los estados arteriales crónicos, se tratan tanto las arterias coronarias como las periféricas, que se caracterizan por una placa oclusiva. Los dímeros se usarán por perfusión per se con el objetivo de inducir la eliminación de la grasa de las placas u opcionalmente asociados a tratamientos estabilizadores de la arteriosclerosis y de las enfermedades cardiovasculares, como el uso de heparina, fracciones de heparina, y fragmentos de heparina y/o medicamentos que reduzcan los niveles circulatorios de lipoproteínas aterogénicas.

El medicamento que contiene el dímero puede usarse para la prevención y para el tratamiento de la trombosis en diferentes situaciones clínicas y puede usarse en la estimulación de la fibrinolisis.

Las estructuras anfipáticas están presentes en una gran extensión de los dímeros de Apo AI y se supone que el dímero tiene un efecto antiviral.

Ahora, por primera vez, mediante el uso de la presente invención, ha sido posible producir la dimerización en una forma esencialmente pura, más del 90% y tanto como más del 98% y también demostrar que este producto tiene un efecto sorprendentemente mejor sobre los sistemas biológicos en comparación con la Apo AI, que se ha mostrado en nuestros ejemplos 7-10 a continuación.

Se adjuntan las siguientes figuras:

Las figuras 1 y 2 ilustran la dependencia del rendimiento en % sobre la concentración de proteína, Ejemplo 2 b)

La figura 3 ilustra la cinética de la formación de Apo AI-M/Apo AI-M durante 24 horas, Ejemplo 1 b2)

La figura 4 ilustra el ligando sintético, Ejemplo 3a)

La figura 5 ilustra el plásmido, Ejemplo 3a)

La figura 6 ilustra el análisis tipo Western después de la escisión de la proteína de fusión, Ejemplo 3d)

La figura 7 ilustra el espectro UV de Apo AI-M/Apo AI-M, Ejemplo 5.

Las figuras 8-10 ilustran las segundas derivadas de los espectros UV, Ejemplo 5.

La figura 11 ilustra la espectroscopía de fluorescencia, Ejemplo 5.

La Figura 12 ilustra la espectroscopía DC, Ejemplo 5.

La figura 13 ilustra el HDL_{r} que contiene Apo AI, Apo AI-M y Apo AI-M/Apo AI-M, Ejemplo 6.

Parte experimental Ejemplo 1 Aislamiento del dímero desde el plasma a) Preparación de las apolipoproteínas

Las muestras de sangre en ayunas se recogieron en EDTA-Na_{2} (1 mg/ml) de diferentes portadores de apolipoproteína Apo AI-M, y el plasma se preparó por centrifugación a baja velocidad a 4ºC. Las lipoproteínas de alta densidad del plasma (HDL, d=1,063- 1,21 g/ml) se aislaron por ultracentrifugación secuencial (Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH., The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest 1955; 34: 1.345-1.354) en una ultracentrífuga Beckman L5-50B equipada con un rotor 50,2 Ti. Después de 48 h de ultracentrifugación a 40.000 rpm a 4ºC, la fracción superior que contiene las HDL se diluyó 1:1 con NaCl 0,15 M, EDTA-Na_{2} al 0,01%, una disolución de Kbr (pH 7,4, d=1,21 g/ml) y se recentrifugó otra vez a 40.000 rpm, a 4ºC durante 48 h. Las HDL se dializaron exhaustivamente con NH_{4}HCO_{3} 5 mM, EDTA-Na_{2} al 0,01%, a pH 7,4, se liofilizaron y se eliminaron los lípidos con dietiléter/EtOH (3:1 v/v). La concentración de proteínas se midió tanto por análisis de aminoácidos como por el método de Lowry y col (Lowry OH, Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Medida de proteínas con el reactivo de folin fenol. J Biol. Chem 1951; 193: 265-275).

b) Aislamiento de Apo AI-M/Apo AI-M

Para aislar la Apo AI-M/Apo AI-M, las apolipoproteínas HDL del Ejemplo 1a se disolvieron en Tris- HCL 0,1M, EDTA-Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Guanidina HCl 6M (Gdn- HCl). Las apolipoproteínas se pasaron por una columna de Sephacryl S-300 HR (2,6 x 300 cm) equilibrada con Tris-HCL 0,1M, EDTA-Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 4M. Las apolipoproteínas se eluyeron con el mismo tampón, con una tasa de flujo de 1,5 ml/min; se recogieron las fracciones de 10 ml. El conjunto de las fracciones que contienen la Apo AI-M/Apo AI-M se concentraron a vacío y se pasaron de nuevo por la misma columna. Las fracciones que contienen la Apo AI-M/Apo AI-M se mezclaron, se dializaron frente a NH_{4}HCO_{3} 5 mM, Na_{2}-EDTA al 0,04%, a pH 7,4, se liofilizaron y se almacenaron a -20ºC en Tris-HCL 0,1M, EDTA- Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 3 M. Las preparaciones de Apo AI-M/Apo AI-M eran >98% puras, como se comprobó por cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución (HPSEC) y electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras. Mediante este procedimiento se aislaron dímeros puros de Apo AI-M del plasma de los portadores.

Ejemplo 2 Purificación del monómero del plasma y conversión posterior al dímero a) Purificación de Apo AI-M.

Para purificar el monómero Apo AI-M, las apolipoproteínas HDL del Ejemplo 1a) se disolvieron en Tris-HCL 0,1M, Na_{2}-EDTA al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 6M y 2- mercaptoetanol al 1%. Después de 4 h de incubación a 37ºC, las Apo-HDL reducidas se pasaron por una columna Sephacryl S-200 (2,6 x 150 cm) equilibrada con Tris-HCL 0,1M, EDTA-Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 4M y 2-mercaptoetanol al 0,1%. Las apolipoproteínas se eluyeron con el mismo tampón, con una tasa de flujo de 1 ml/min; se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones agrupadas de apo AI + apo AI-M se dializaron frente a NH_{4}HCO_{3} 5 mM, EDTA-Na_{2} al 0,01%, a pH 7,4, y se liofilizaron. Las apolipoproteínas se disolvieron en Tris-HCL 0,1M, EDTA- Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 6M y 2-mercaptoetanol al 1%. Después de 4h de incubación a 25ºC, se eliminó el 2-mercaptoetanol por cromatografía Sephadex G25 e inmediatamente se pasaron las apolipoproteínas por una columna de Tiopropil-Sepharosa (1 x 10 cm) equilibrada con Tris-HCL 0,1M, EDTA-Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 4M. Después de circular durante la noche a una tasa de flujo baja (0,15 ml/min), la Apo AI normal se eluyó con Tris-HCL 0,1M, EDTA-Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 4M. La Apo AI-M se eluyó después con el mismo tampón que contiene Gdn-HCl 4M y 2-mercaptoetanol al 1%. Las fracciones que contienen la Apo AI-M se agruparon, y se dializaron frente a NH_{4}HCO_{3} 5 mM, EDTA- Na_{2} al 0,01%, a pH 7,4, se liofilizaron y se almacenaron a -20ºC en Tris-HCL 0,1M, EDTA- Na_{2} al 0,04%, NaN_{3} al 0,01%, a pH 7,4 que contiene Gdn-HCl 3M y 2-mercaptoetanol al 0,1%. Las preparaciones con Apo AI-M fueron >98% puras, como se comprobó mediante HPSEC, SDS-PAGE e isoelectroenfoque.

b) Síntesis de Apo AI-M/Apo AI-M

Las disoluciones de Apo AI-M se dializaron frente a un tampón Tris-HCL 25 mM, a pH 9,0. La Apo AI-M reducida se eluyó a la concentración final deseada (3,6-53,6 \muM) con un tampón Tris-HCl 25 mM que contiene glutatión reducido (GSH) (1-5 nM) y se preincubó a 25ºC durante 5 min. La oxidación se inició mediante la adición de glutatión oxidado (GSSG) (0,1-10,0 mM) y tuvo lugar en tubos bien cerrados a la misma temperatura durante 24 h. La oxidación se monitorizó mediante SDS-PAGE (véase anteriormente). Después del teñido y desteñido, los geles se examinaron con un densitómetro láser LKB Ultroscan XL, y la distribución en porcentaje de bandas individuales de proteínas se calculó con el programa LKB 2400 Gelscan XL. La cinética de oxidación se monitorizó mediante HPSEC.

Para optimizar las síntesis de dímeros se llevaron a cabo experimentos de oxidación adicional en presencia de GSH/GSSG + Gdn-HCl y GSH/GSSG + tíorredoxina. (Pigiet VP y col., Proc Nat. Acad. Sci., Estados Unidos, 1986; 83: 7.643-7.647).

La oxidación de Apo AI-M se llevó a cabo en tubos cerrados, en presencia de concentraciones variables de glutatión reducido/oxidado (GSH/GSSG). La reacción de producción del dímero fue dependiente tanto de la concentración de proteína (Fig. 1, Tabla 1) como de la proporción de concentración GSH/GSSSG (Fig. 2, Tabla 1). Mediante el aumento de la concentración de proteína desde 8,9 \muM hasta 53,6 \muM, el porcentaje de Apo AI-M/Apo AI-M se incrementó en un 26-51% (Fig. 1, Tabla 1). Una disminución en la proporción molar GSH/GSSG de 1/2 a 1/16 tiene como resultado una reducción en el rendimiento de un 43%; por otro lado el aumento en la concentración de GSH/GSSG, con una proporción molar GSH/GSSG constante, se asoció con un aumento de más del 42% en la formación de Apo AI-M/Apo AI-M (Fig. 2, Tabla 1). Tanto la temperatura de la reacción como la presencia de una proteína desnaturalizante (Gdn-HCl) no afectó al grado de generación de Apo AI-M/Apo AI-M. Se mejoró una formación significativa de Apo AI-M/Apo AI-M también mediante la incubación de Apo AI-M con GSH/GSSG en presencia de 0,2 mM de tíorredoxina (Tabla 1).

Las cinéticas de la reacción de oxidación se monitorizaron mediante HPSEC analítica. La apo AI-M dimérica y monomérica dio distintos picos con tiempos de retención de 10,8 y 12,7 min, respectivamente. La síntesis de AI-M/AI-M (GSH/GSSG 2 mM/4 mM, concentración de AI-M 8,9 \muM) se completó aproximadamente después de 3 h; una prolongación del tiempo de incubación de hasta 24 h no aumentó adicionalmente la formación de Ai-M/AI-M (Fig. 3).

TABLA 1 Oxidación de Apo AI-M

Proteína \mu	GSH mM	GSSG mM	Rendimiento %	Notas
3,6	1,0	0,1	34,8	Tíorredoxina
				0,2 mM
8,9	1,0	2,0	9,1
8,9	1,0	2,0	9,9	4ºC
8,9	1,0	4,0	7,2
8,9	1,0	4,0	7,7	4ºC
8,9	1,0	8,0	6,6
8,9	1,0	16,0	5,2
8,9	2,0	4,0	19,6
8,9	4,0	8,0	18,7
8,9	5,0	10,0	23,9
8,9	1,0	2,0	9,8	Gdn-HCl 4

TABLA 1 (continuación)

Proteína \mu	GSH mM	GSSG mM	Rendimiento %	Notas
17,9	2,0	4,0	23,3	mM
17,9	4,0	8,0	25,5
17,9	5,0	10,0	27,5
35,7	2,0	4,0	25,9
35,7	4,0	8,0	27,7
35,7	5,0	10,0	27,9
53,6	2,0	4,0	25,4
53,6	4,0	8,0	30,4
53,6	5,0	10,0	36,1
Condiciones de la reacción:
	Tampón: Tris-HCl 25 mM, a pH 9,0
	Temperatura: 25ºC
	Tiempo: 24 h

Ejemplo 3 Producción recombinante de Apo AI-M/Apo AI-M a) Construcción del Vector de Expresión pKP644

La Forma Replicativa del Bacteriófago M13mp18 que contiene el ADN_{c} que codifica para la Apolipoproteína AI-M (Sharpe C R y col., Nucleic Acids Research, Vol 12, Nº 9, pág. 3.917, 1984, y Cheung M C y col., Biochem Biophys Acta 960, págs. 73-82, 1988) se digirió con el enzima de restricción BamHI y se purificó por electroforesis en gel de agarosa de baja temperatura de solidificación (BTS). El fragmento de 822 pb que corresponde al gen de la Apo AI-M se cortó y se ligó en el plásmido pUC19, previamente digerido con BamHI y tratado con la Fosfodiesterasa de intestino de Ternera. La mezcla de la ligación se usó para transformar una E. coli JM83 competente y se picaron cuatro colonias blancas de las placas de agar que contienen Ampicilina, X-Gal e IPTG. Se preparó y purificó el ADN plasmídico en columnas QuiaGene, (QuiaGene Inc. 9259 Eton ave., Chatswoth, Cal. 91311, Estados Unidos.) de acuerdo con las recomendaciones de preparación. El plásmido derivado, denominado pUC/Apo AI-M se digirió con EcoRI y NcoI. Se analizó una alícuota de la mezcla de la digestión por electroforesis en gel de agarosa para confirmar la orientación correcta. Otra alícuota se usó para ligar el ligando sintético "\DeltaApoAI-Eco" (Fig. 4) al extremo 5' del gen de la Apo AI para generar el gen \DeltaApoAI, que está constituido por 724 pb. La secuencia de \DeltaApo AI-M genera un sitio Asp-Pro en el extremo N-terminal de la proteína codificada que facilita el corte por ácido fórmico. La E. coli JM83 competente se transformó con la mezcla de la ligación y el plásmido derivado (denominado pUC/\DeltaApo AI-M) se aisló por columnas de QuiaGene como anteriormente.

El plásmido pUC/\DeltaApo AI-M y el vector de expresión pEZZ se digirieron con EcoRI y BamHI, y se purificaron por electroforesis en gel de agarosa BTS y el fragmento de 799 pb de pUC/\DeltaApo AI-M se ligó al fragmento de 2763 pb de pEZZ. La mezcla de la ligación se usó para transformar las E. coli RV308 competentes y el ADN plasmídico se preparó como anteriormente.

Para los procedimientos experimentales, véanse Sambrook J., Fritsch E. F. y Maniatis T. (1989) Molecular Clonings; A laboratory Manual, 2ª edición. Laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N. Y. El plásmido derivado se denominó pKP644. (Fig. 5)

b) Expresión de la proteína de fusión ZZ-\DeltaApo AI-M

Se inocularon 40 ml de un cultivo de E. coli RV308/pKP644 que creció durante toda la noche, a 30ºC en LB con 50 mg/ml de Kanamicina, en 2 x 500 ml de un medio mínimo A (Curr. Meth. in Mol. Biol.) con adición de 0,2 g/l de casaminoácidos, MgSO_{4} 1 mM, glucosa al 0,25% y 50 mg/ml de kanamicina. El cultivo se incubó a 37ºC durante 24 horas con agitación vigorosa.

c) Purificación inicial de Apo AI-M

Se centrifugó 1,0 l de un cultivo de E. coli (RV308/pKP644) que contiene el plásmido descrito, y las células sedimentadas se resuspendieron en 30 ml de TS 1X (Tris-HCl 25 mM, NaCl 0,2 M, EDTA 1mM) y Gdn-HCl 6M y se homogeneizó mediante un paso único a través de una Prensa de French (SLM Instruments Inc.) a una presión de trabajo de 1.000 psi. La suspensión resultante se incubó a temperatura ambiente con una agitación ligera durante 1 hora y se centrifugó. El sobrenadante se diluyó a una concentración final de Gdn-HCl 1M (es decir, seis veces) y se cargó en una columna de Sepharosa FastFlow IgG equilibrada con TS 1X. Después de cargarla, la columna se lavó con cinco volúmenes respecto a la columna de TS 1X seguido de acetato de amonio 20 mM a pH 5,4 hasta que el pH del eluído alcanzó 5,4. El material fijado se eluyó con 25 ml AcH 0,2 M y se monitorizó la absorbancia a 280 nm (A_{280}). El rendimiento de 1 l de cultivo fue de 1,9 mg, basándose en el valor de A_{280}.

d) Escisión de la proteína de fusión

Se alicuotó el eluído, se liofilizó y se resuspendió en ácido fórmico al 75%, 50% y 25% respectivamente. Las disoluciones se incubaron a 37ºC durante 28 h y después se liofilizaron para eliminar el ácido fórmico. Los productos de la escisión se ensayaron usando SDS-PAGE seguida de un análisis tipo Western. Se cargaron aproximadamente 5 mg de proteína total en el gel SDS-PAGE a un gradiente de 8-25% bajo condiciones no reductoras. Las muestras se realizaron por duplicado. Un gel se tiño con Coomasie y el otro se usó para el análisis tipo Western. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Uno de los productos de escisión migra apareado con la Apo AI nativa purificada y da lugar a una señal en el análisis tipo Western. El análisis de transferencia tipo Western se llevó a cabo usando anticuerpos policlonales conjugados con peroxidasa de rábano (The Binding site Ltd; Cambridge, Inglaterra) y se visualizó usando los procedimientos habituales.

La figura 6 muestra el análisis de las proteínas resultantes después de la escisión de la proteína de fusión. Dibujo A; SDS-PAGE teñido con Coomasie (8-25%). Calle 1: ácido fórmico al 25%; calle 2: ácido fórmico al 50%; calle 3: ácido fórmico al 75%; calle 4: Apo AI nativa purificada (Sigma) y calle 5: Marcadores LMW (Pharmacia). Dibujo B: Análisis de transferencia tipo Western del gel por duplicado. Calle 1: Apo AI nativa purificada (Sigma); calle 2: ácido fórmico al 75%; calle 3: ácido fórmico al 50%; calle 4: ácido fórmico al 25%. La presencia de una banda de dos veces el peso molecular de Apo AI-M en el análisis tipo Western mostró que estaban presentes los dímeros de Apo AI-M.

Ejemplo 4 Producción de Apo AI-M en biorreactores Construcción de vectores para la secreción directa de Apo AI-M al espacio periplásmico y a los medios de crecimiento

Cepas y Vectores. Las cepas de E. coli K12 usadas eran HB101 F^{-}, hsd S20 (rB^{-}, mB^{-}) supE44. HB101 F^{-}, hsd S20 (rB^{-}, mB^{-}) supE44, ara14, I^{-}, galK2, lacY1, pro A2, rspL20, xyl-5, mtl-1, recA13, rB^{-}, mcrA(+), mcrB(-), (Boyer y col., 1969, J Mol Biol 41: 459-472), DH5a F^{-}, F80DlacZDM15, D(lacZYA-argF)U169, recAI, endAI, gyrAI, I^{-}, thr-I, hsdR17, (r_{k}^{-}, m_{k}^{-}), supE44, relAI, (BRL Estados Unidos.). RV308 DlacX74, galOP::IS2(galOP308), strA, I^{-}. (Maurer y col., 1980, J. Mol. Biol. 139: 147-161) y BC50 xyl-7, ara-14,T4-R, I^{-}. Las cepas HB101 y DH5a se usaron para la Subclonación de los fragmentos de ADN. El plásmido pUC9 (Vieira y col., 1982, Gene 19: 259-68) se usó para la subclonación de un fragmento BamHI de 821 pb de un ADN_{c} copia de una Apo AI humana obtenido de S. Sidoli (Milán). La secuencia de nucleótidos del ADN_{c} de Apo AI humano puede obtenerse de GenBank con el número de acceso X02162, (Seilhammer y col., 1984, DNA 3: 309-317). Este vector se denominó pKP575. Además un fragmento EcoRI-PstI de 856 pb de ADN de Apo AI-M humano, (ADN_{c} copia obtenido de S. Sidoli), se subclonó en un plásmido pUC9. Este derivado se denominó pKP576. Los plásmidos pKP683 y pKP764 son derivados de los plásmidos pTro 99 (Amann y col., 1988. Gene. 69: 301-15) y un derivado de pUC con el transposón (Tn903) con el marcador de resistencia derivado del pUCC4-K (Vierira y col., 1982. Gene 19: 259-268 y Oka y col., 1981. J Mol Biol. 147: 217) y los terminadores de la transcripción (T1, T2) del bacteriófago fd, de PUEX2, (Bressan y col., 1987. Nucleic Acid. Res. 15: 10056).

Procedimientos empleados. Las cepas bacterianas se crecieron en un medio Luria Bertani (LB) o un medio de triptona de levadura (TL 2X) con ampicilina (Ap) 50 \mug/ml o kanamicina (Km) 70 \mug/ml para la preparación del ADN plasmídico y para el análisis de la expresión a pequeña escala (Sambrook y col., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se usó una base de agar sangre con triptosa (Difco, Estados Unidos) suplementada con Ap 50 \mug/ml o Km 70 \mug/ml, para el crecimiento de las células en placas de agar. Las técnicas de ADN Recombinante se realizaron según (Sambrook y col., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Las endonucleasas de restricción y la ADN ligasa T4 se obtuvieron de Boehringer Mannheim (Alemania), New England Biolabs (Berverly, Estados Unidos) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). El Isopropil-b-D-galactosidasa (IPTG) se obtuvo de Sigma (Estados Unidos). Para aislar los fragmentos de ADN se usó una agarosa de baja temperatura de solidificación y de fusión (NuSieve GTG, FMC Bioproducts, Estados Unidos). Las amplificaciones por RCP se realizaron usando un termociclador de ADN y una Taq polimerasa de Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, Estados Unidos). Los ligandos de oligonucleótidos y los cebadores se sinterizaron en un Pharmacia-LKB Gene Assembler Plus de Pharmacia (Uppsala, Suecia) usando el procedimiento del fosfotriéster en fase sólida. La determinación de la secuencia de nucleótidos se realizó en un secuenciador de ADN Applied Biosystem 373A, usando el Kit Taq DyeDeoxy™ Terminator Cycle Sequencing de Applied Biosystem (Estados Unidos).

\newpage

Programas informáticos de ADN usados. El programa de Macintosh PlasmidARTIST (versión 1,2) (Clontech, Estados Unidos) se usó para diseñar los mapas de los plásmidos y el GCG Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, Inc., Madison Wisconsin, Estados Unidos) se usó para manejar las secuencias de ADN en ordenadores Digital VAX.

Construcción, Expresión y Secreción de Apo AI-M en Bacterias. El objeto de las construcciones en los vectores era obtener un sistema de producción y secreción de Apo AI-M en E. coli con un alto nivel de Apo AI-M secretada en el medio de crecimiento.

Los dos oligonucleótidos se sintetizaron para fusionar los ADN_{c} de Apo AI y Apo AI-M a fragmentos de ADN que codifican para secuencias de señalización bacterianas. El fragmento EcoRI y NcoI de 14 pb y el fragmento NcoI de 40 pb del pKP575 se reemplazaron por un fragmento EcoRI y NcoI sintético de 37 pb en un plásmido denominado pKP580. El sitio de corte BbsI en este fragmento de ADN sintético da lugar al mismo sitio de corte que MluI, lo que facilita la clonación de diferentes fragmentos que codifican para secuencias de señalización bacterianas. El plásmido pKP631 se construyó remplazando un fragmento NcoI-DraIII de 702 pb del pKP576 (Apo AI-M). A partir del plásmido pKP631 se aisló un fragmento BbsI-HindIII de 820 pb y se insertó en el sitio MluI y HindIII del vector plasmídico que se denominó pKP682. Este vector contiene un promotor tac (Ptac), un derivado de una secuencia de señalización ompA, dos terminadores de la transcripción y un marcador de resistencia a la kanamicina. Se aisló un fragmento NruI-NruI de 1501 pb del pKP682 y se insertó en un vector similar pero con el Ptac reemplazado por el promotor Ptrc. Este vector de expresión se denominó pKP683 El plásmido pKP684 se construyó con un fragmento de ADN sintético de 14 pb, que contiene terminadores de la traducción más potentes y que destruyen el sitio DraIII mediante la introducción de una A antes del sitio DraIII que flanquea el extremo 3'. La transformación de cepas de E. coli se realizó como se describe en (Sambrook y col., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Las construcciones plasmídicas que se usaron para los experimentos de expresión y para la producción de Apo AI-M se analizaron realizando mapas por cortes con enzimas de restricción y se confirmó el gen estructural Apo AI-M por la determinación de la secuencia nucleotídica. Las cepas de E. coli con los plásmidos apropiados usadas para el crecimiento en biorreactores se prepararon como se describe a continuación. Las células se crecieron toda la noche en LB o YT 2X suplementados con Km en matraces de agitación a 30ºC. Después de centrifugar las células se resuspendieron en 1/2 volumen de medio de almacenamiento congelado según Gergen y col., 1979. Nucleic Acid Res 7: 2115. Se repartieron las alícuotas en viales de criogenización de 1 ml y se almacenaron a -75ºC hasta su uso.

Medios de cultivo para el crecimiento de las células en biorreactores. Medio A: 16 g/l de triptona (Difco, Estados Unidos), 8 g/l de extracto de levadura (Difco, Estados Unidos), 5 g/l de NaCl, y 0,05 g/l de kanamicina. Medio B: 2,5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 2 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,5 g/l de citrato-Na3, 5 g/l de extracto de levadura (Difco, Estados Unidos). Después de esterilizar el medio se suplementó con 10 g/l de glucosa inicial, 0,05 g/l de kanamicina, 1 g/l de MgSO_{4} x7H_{2}O y 0,07 g/l de hidrocloruro de tiamina. Se añadieron una disolución de elementos traza (1 ml/l) y una disolución de vitaminas (0,65 ml/l). La disolución de elementos traza contenía: 27 g/l de FeCl_{3} x 6H_{2}O, 4 g/l de ZnSO_{4} x 7H_{2}O, 7 g/l de CoCl_{2} x 6H_{2}O, 7 g/l de Na_{2}MoO_{4} x 2H_{2}O, 8 g/l de CuSO_{4} x 5H_{2}O, 2 g/l de H_{3}BO_{3}, 5 g/l de MnSO_{4}, 11 g/l de CaCl_{2} x 2H_{2}O y 50 ml/l de HCl. La disolución de vitaminas contenía: 0,5 g/l de pantotenato de calcio, 0,5 g/l de cloruro de colina, 0,5 g/l de ácido fólico, 1 g/l de inositol, 0,5 g/l de nicotinamida, 0,5 g/l de clorhidruro de piridoxina, 0,05 g/l de riboflavina y 0,5 g/l de clorhidruro de tiamina. Se usó adecanol (0,2 ml/l) como antiespumante. Cuando fue necesario, se realizaron otras adiciones posteriores de antiespumantes durante el cultivo.

Cultivo de RV308/pKP683 en un biorreactor de 3,5 litros. Los cultivos almacenados congelados se usaron para inocular 500 ml de medio A y se cultivaron previamente en 2 ml en matraces Erlenmeyer con deflectores a 30ºC durante 8-10 horas. Se transfirió al biorreactor un volumen de inóculo que corresponda al 10% del volumen efectivo del reactor. El cultivo se realizó en un biorreactor de 3,5 litros (Belach AB, Suecia) con un volumen efectivo de 2,5 litros. La temperatura fue de 30ºC durante la fase de crecimiento antes de la inducción y después se elevó a los 37ºC. El pH se mantuvo a 7,0 con una disolución de amoniaco al 25%. La tasa de aireación se estabilizó en 1 vvm y la tensión de oxígeno disuelto (T.O.D) se mantuvo al 30% ajustando la velocidad de aireación. Después de que se consumió la glucosa inicial, se inició un aporte nutricional de glucosa, manteniendo el sistema en condiciones de glucosa limitante mediante el suministro de una disolución de glucosa al 60%. La tasa inicial de suministro, 0,04 g/min se mantuvo durante 3 horas y se aumentó después gradualmente hasta 0,4 g/min durante 3 horas. El crecimiento celular se monitorizó siguiendo su densidad óptica (DO). La concentración de Apo AI-M en el sobrenadante se determinó por radioinmunoensayo (kit Apolipoproteína AI RIA 100, art. Nº 109152-01. Kabi Pharmacia, Suecia). Después de 16 horas de cultivo, a una DO de 58, la síntesis de proteína se indujo mediante la adición de IPTG 0,5 mM y la temperatura se incrementó a 37ºC. Cuatro horas después de la inducción la concentración de Apo AI-M fue 2,3 g/l y después de 2 horas adicionales la concentración fue de 2,5 g/l.

Cultivo de BC50/pKP764 en un biorreactor de 3,5 litros. El cultivo se llevó a cabo como se describe anteriormente, salvo que no se añadió kanamicina al medio del biorreactor. Después de 15 horas, a una DO de 60, se añadió el IPTG y se elevó la temperatura. 10 horas después la concentración de Apo AI-M en el sobrenadante fue de 3,7 g/l a 22 horas después de la inducción, la concentración fue de 4,4 g/l.

Cultivo de BC50/pKP764 en un biorreactor de 300 litros. Se usó un biorreactor de 300 litros (Chemoferm AB, Suecia) con un volumen de trabajo de 180 litros. El inóculo se preparó como se describe anteriormente para el crecimiento de RV308/pKP683 en un biorreactor de 3,5 litros, salvo que el tiempo de cultivo previo en matraces en agitación fue de 14 horas. El inóculo se transfirió a 50 litros de un biorreactor de siembra de un volumen de trabajo de 18 litros. El medio usado en los matraces en agitación así como el del biorreactor, fue medio A. El medio del biorreactor de siembra se suplementó con 5 g/l de glucosa y la temperatura fue de 30ºC. El pH y la aireación se describieron anteriormente para el crecimiento de RV308/pKP683 en un biorreactor de 3,5 litros y la T.O.D. nunca fue inferior al 30%. Cuando el cultivo alcanzó la DO de 4, el contenido del biorreactor de siembra se transfirió al biorreactor de 300 litros. En este biorreactor la temperatura, el pH y la aireación del medio se describieron anteriormente para el crecimiento de RV308/pKP683 en un biorreactor de 3,5 litros. Antes de la inducción la T.O.D se mantuvo al 30% o por encima aumentando la velocidad de aireación al máximo y después aumentando la presión de aire. Después de la inducción la presión de aire se incrementó a 2 bar dando por resultado una T.O.D. del 15-20%. Después de 16 horas de cultivo en el biorreactor cuando el cultivo tenía una DO de 51, se añadió el IPTG y la temperatura se elevó a 37ºC.

La concentración de Apo AI-M como monómero y como dímero fue de 1,3 g/l, 5 horas después de la inducción y durante la siguiente hora, mientras se enfriaba el biorreactor, la concentración de Apo AI-M se incremento hasta 1,5 g/l.

Cualquier monómero presente se convirtió en dímero y se purificó según los procedimientos convencionales.

Ejemplo 5 Caracterización de la Apo AI-M/Apo AI-M del plasma

La Apo AI-M/Apo AI-M purificada del Ejemplo 1 dio una sola banda en los geles de la electroforesis en geles SDS-PAGE no reducidos, sobrecargados. En una SDS-PAGE analítica, el peso molecular aparente de la proteína fue, como cabía esperar, de 56 kD. La Apo AI- M/Apo AI-M mostró un patrón de isoforma complejo, caracterizado por la presencia de al menos 6 bandas de proteínas diferentes, en el intervalo de punto isoeléctrico de 5,3-5,6, en geles IEF no reducidos, desnaturalizados.

El espectro UV de la Apo AI-M/Apo AI-M (1,1 mg/ml) mostró un máximo de absorbancia típico a los 280 nm, con un pico a 290,2 nm (Fig. 7). La proteína E calculada (1 cm, 1%) a 280 nm fue de 16,9. Para evaluar la exposición de residuos de tirosina en la Apo AI-M/Apo AI-M, se llevó a cabo un análisis de segunda derivada del espectro UV como se describe por Rangone R y col.. Determinación de la exposición de tirosinas por espectroscopía de segunda derivada. Biochemstry 1984; 23: 1.871-1.875. El espectro UV de segunda derivada mostró típicamente dos mínimos centrados alrededor de 283 y 290,5 nm y dos máximos alrededor de los 287 y 295 nm (Figs. 8-10). Los grados relativos de exposición de tirosina (alfa) calculados para la Apo AI-M/Apo AI-M nativa y para la Apo AI-M/Apo AI-M + DMFC fueron 0,75 y 0,49, respectivamente (Tabla 2).

TABLA 2 Características de la proteína Apo AI-M/Apo AI-M

Apo AI-M/Apo AI-M	Apo AI-M/Apo AI-M + DMFC
Peso molecular (kD)	56,0
Punto isoeléctrico	5,3-5,6^{1}
Espectroscopía UV:
E (1cm, 1%)	16,9^{2}
Exposición de
tirosinas (alfa)	0,75^{2}	0,49^{2}
Espectroscopia de
fluorescencia:
Máximo de longitud
de onda Exc (nm)	280	280
Máximo de longitud
de onda Exc (nm)	344	338
Espectroscopia DC
% de hélices alfa	52,2^{3}	66,1^{3}
	57,8^{4}
^{1} al menos 6 isoformas en geles desnaturalizados IEF
^{2} un valor alto indica un aumento en la exposición de tirosina
^{3} concentración de proteína: 0,1 mg/ml
^{4} concentración de proteína: 1,1 mg/ml

Se registró tanto la excitación como la emisión de fluorescencia de Apo AI-M/Apo AI-M (0,1 mg/ml). El máximo de longitud de onda de excitación de los residuos triptofanilo en Apo AI-M/Apo AI-M fue de 280 nm, y no cambió con la asociación siguiente con DMFC. El espectro de emisión (excitación a 280 nm) mostró un máximo a una longitud de onda de 344 nm (Fig. 11); la asociación con DMFC indujo un cambio de este máximo hacia el azul (338 nm), asociado con un aumento del 24% en intensidad de fluorescencia al máximo (Fig. 11).

El espectro DC de Apo AI-M/Apo AI-M se caracterizó por un mínimo típico de 208 nm y 222 nm y un máximo de alrededor de 195 nm (Fig. 12). El contenido en hélices alfa aumentó significativamente con el aumento de las concentraciones de proteína de 0,1 mg/ml a 1,1 mg/ml (Fig. 12, Tabla 2). La asociación de Apo AI-M/Apo AI-M (0,1 mg/ml) con DMFC indujo un aumento adicional en la estructura en hélice alfa de proteína (Fig. 12, Tabla 2).

Procedimientos para la caracterización del producto Incubación con fosfolípidos

Se disolvieron cantidades medidas de dimiristoilfosfatidilcolina (DMFC) en etanol y el disolvente se evaporó bajo N_{2}; Cualquier remanente de disolvente se eliminó a vacío durante 2 h. Se mezclaron las dispersiones de DMFC en un tampón fosfato 20 mM, a pH 7,4 con Apo AI-M/Apo AI-M (0,1 mg/ml final) en una proporción molar de 100:1 DMFC/Apo AI-M/Apo AI-M.

Espectroscopía

Las disoluciones de Apo AI-M/Apo AI-M se dializaron frente a tampón fosfato 20 mM, a pH 7,4 y se diluyeron con el mismo tampón a la concentración de proteína deseada.

Los espectros UV normal y de segunda derivada de las disoluciones de Apo AI-M/Apo AI-M y Apo AI-M/Apo AI-M + DMFC registraron con espectrofotómetros Jasco Uvidec-610 y Perkin Elmer Lambda-2 a 25ºC, usando una célula de cuarzo de 1 cm. La localización topográfica de los residuos de tirosina se investigó según la ecuación de Ragone y col., (Ragone R, Colonia G, Balestrieri C, Servillo L, Trace G. Determination of tyrosine exposure in proteins by second- derivative spectroscopy. Biochemistry 1984; 23: 1871-1875):

alfa= (r_{n}-r_{a})/(r_{u}-r_{a})

en la que alfa es el grado de exposición de tirosina al disolvente, r_{n} y r_{u} son las relaciones entre los picos derivados (a/b) para la Apo AI-M/Apo AI-M nativa y la disuelta (en Gdn- HCl 6M), respectivamente, y r_{a} es la relación entre picos derivados de una disolución que contiene tirosina libre y triptófano mezclado en la misma proporción molar que la de Apo AI-M/Apo AI-M.

El espectro de fluorescencia intrínseco de las disoluciones de Apo AI-M/Apo AI-M y Apo AI-M/Apo AI-M + DMFC se registró en un espectrofluorómetro Jasco FP-550 a 25ºC.

El espectro de dicroísmo circular (DC) de las disoluciones de Apo AI-M/Apo AI-M y Apo AI-M/Apo AI-M + DMFC se registraron en un espectropolarímetro Jasco J500A a 25ºC. Los valores de elipticidad de los residuos principales [THEYA] se expresaron en grados x cm^{2} x dmol^{-1} y se calcularon mediante la ecuación:

[THEYA]= ([THEYA] x 106)/(10 x l x c)

en la que [THEYA] es la elipticidad observada en grados, 106 el peso molecular del residuo principal de la proteína, l es la longitud de la trayectoria en cm, y c la concentración de proteína en g/ml. El porcentaje de hélices alfa se calculó usando la siguiente ecuación:

% de hélices alfa= ([THEYA]_{280 nm}^{-}4.000)/(33.000-4.000)

(Greenfield N, Fasman GD. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 1969; 8: 4.108-4.116)

Electroforesis

El isoelectroenfoque analítico y la SDS-PAGE se llevaron a cabo como se describe anteriormente (Franceschini G, Sirtori M, Gianfranceschi G, Sirtori CR. Relation between the HDL lipoproteins and AI isoproteins in subjects with the AI-M abnormality. Metabolism 1981; 30: 502-509).

El isoelectroenfoque se llevó a cabo en geles de acrilamida al 10%, que contenían urea 6M y anfolinas al 4% (pH 4-6). Después de enfocar toda la noche, los geles se fijaron con Azul Brillante de Coomassie R-250 en ácido acético/alcohol isopropílico. El punto isoeléctrico (pI) de cualquier banda de proteína desconocida se calculó tranfiriendo el pI de bandas de proteínas conocidas (estándares de Bio-Rad y apo-HDL) frente a la distancia de migración respectiva.

Para las SPS-PAGE se usaron geles de acrilamida al 14% que contenían un 0,1% de SDS. Los geles se trataron como se describe, y el peso molecular de las proteínas desconocidas se calculó a partir del logPM de las bandas de las proteínas control (KABI-Pharmacia) frente a la distancia de migración.

Cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución

Las separaciones de CPGAR analíticas se llevaron a cabo usando un cromatógrafo de líquido Jasco equipado con una columna TSK-G3000 SW de 10 \mum (7,5 x 300 mm). La columna de CPGAR se equilibró con un eluído con un tampón fosfato 0,1M, NaCl 0,1M, a pH 7,2, que contiene urea 8M. Las proteínas se eluyeron a una baja tasa de flujo de 0,5 ml/min, y las lecturas se hicieron a 280 nm. Las áreas de los pico se integraron usando un integrador HP-3390.

Ejemplo 6 Fabricación de partículas de HDL_{r} que contienen Apo AI-, Apo AI-M o Apo AI-M/Apo AI-M.

Las partículas reconstituidas de lipoproteínas de alta densidad (HDL_{r}) se fabricaron usando la técnica presentada por Nichols A V y col., Biochim. Biophys Acta 750: 353-364 (1983) y Matz CE y col., J. Biol. Chem. 257: 4535-4541 (1982).

El dímero recombinante Apo AI-M (del Ejemplo 4) y la Apo AI normal purificada de plasma humano, se disolvieron en Tris-HCl 10mM, NaCl 0,15M, EDTA al 0,01%, NaH_{3} al 0,006%, a pH 8,0 (tampón A), que contiene Gdn-HCL 4M en una concentración de 6 mg/ml. Para la comparación, se redujo el puente disulfuro en algunas de las Apo AI/Apo AI-M mediante la adición de DDT 20 mM al tampón A + Gdn-HCl. Las proteínas se dializaron extensivamente frente al tampón A, y se diluyeron a 5,2 mg/ml con el mismo tampón.

Los fosfolípidos, bien fosfatidilcolina de huevo (FCH) o bien palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POFC) se disolvieron en CHCl_{3}, se secaron bajo N_{2} y se mantuvieron a vacío toda la noche. Se añadió el colato de sodio en una proporción colato/FC de 0,55 (p/p); la mezcla se agitó vigorosamente durante 3 min a temperatura ambiente, se incubó a 4ºC durante 2 h. La proteína se añadió después en una proporción en peso FC/proteína de 2,17 (POFC) o 2,47 (FCH), y la mezcla se agitó durante 3 min a temperatura ambiente y se incubó a 4ºC toda la noche. Después de la diálisis frente a tampón A durante 5 días, la mezcla se centrifugó a 11.000 rpm durante 5 min en una Beckman Microfuge y se recogió el sobrenadante.

Los HDL_{r} se separaron mediante una electroforesis en gel con gradiente de poliacrilamina en condiciones no desnaturalizantes (EGG), y el tamaño de las partículas se determinó como se describió previamente por Nichols A V y col. en Meth. Enzimol. 128: 417-431 (1986).

Todas las apolipoproteínas ensayadas estaban casi por completo asociadas con lípidos después del procedimiento descrito, como se demostró por el mucho menor pico de las apolipoproteínas sin lípidos en los geles EGG. La recuperación de la proteína en HDL_{r} varió entre un 68% hasta un 100% en 10 preparaciones diferentes.

Los perfiles de EGG de las partículas de HDL reconstituidas se muestran en la figura 13. Las HDL reconstituidas con Apo AI y FCH dieron un pico mayor en EGG, con un diámetro de 9,6 nm; se detectaron también los componentes minoritarios, tanto los de mayor como los de menor tamaño. Las HDL_{r} que contenían FCH y las Apo AI-M/Apo AI-M estaban constituidas por dos componentes mayoritarios (diámetro: 8,6 y 12,9 nm) y dos componentes minoritarios (diámetro 7,9 y 10,8 nm) (Fig. 13); se obtuvo también el mismo tamaño de partículas cuando Apo AI-M Apo AI-M se reconstituyó con POFC.

Las tres apolipoproteínas se incorporaron casi por completo a complejos lípido-proteína estables con diferentes tamaños de partículas de HDL_{r}, diferente distribución y composición. Particularmente, las HDL_{r} realizadas con la Apo AI-M/ Apo AI-M recombinante constituida por dos componentes mayoritarios, el mayor era uno único entre la familia de HDL_{r} que contienen Apo AI.

Evaluación biológica de Apo AI-M/Apo AI-M Ejemplo 7 Cinética del comportamiento de los dímeros Apo AI-M frente a los monómeros Apo AI-M en receptores normales

Los dímeros muestran una permanencia prolongada en la circulación que se ha demostrado en los siguientes estudios de cinética en humanos.

Los voluntarios sanos recibieron Apo AI-M o Apo AI-M/Apo AI-M marcada con ^{125}I por vía IV. Como se muestra en la Tabla 3, el \betat1/2 plasmático (h), calculado de acuerdo con los dos modelos diferentes, así como con la tasa catabólica fraccional (TCF). Ambos confirman una marcada reducción del catabolismo del dímero, frente al monómero. El metabolismo tan lento de los Apo AI- M/Apo AI-M indica que estas moléculas pueden perjudicar la conversión de lipoproteínas y que posiblemente actúen como un efectivo precursor para Apo AI-M, de este modo, mediante la inyección de Apo AI-M/Apo AI-M, se puede predecir que el dímero permanece en el plasma durante un prolongado periodo de tiempo, interaccionando así directamente con el metabolismo de las lipoproteínas y con el sistema fibrinolítico.

TABLA 3 Comportamiento cinético de Apo AI-M/Apo AI-M frente al monómero Apo AI en receptores normales (n= 2)

		Apo AI-M	Apo AI-M/Apo AI-M
Modo	\betat1/2(h)	16,07	52,04
monoexponencial	MRT(h)	23,19	75,09
Modo	\betat1/2(h)	22,61	70,29
biexponencial	MRT(h)	28,97	89,16
	TFC(h)	2,3% por hora	1,1% por hora

Efecto de Apo AI-M/ Apo AI-M sobre el sistema fibrinolítico

Introducción

El sistema fibrinolítico es la mayor defensa contra la deposición de fibrina sobre las paredes de los vaso y además juega un importante papel entre los mecanismos que previenen la trombosis.

La enzima responsable de la lisis de la fibrina es la plasmina. La plasmina se forma a partir del precursor inactivo plasminógeno mediante la acción de activadores específicos (activador tisular del plasminógeno, AP-t y uroquinasa, APu). Tanto el proceso de activación como la acción de la plasmina están regulados por inhibidores específicos inhibidor de activador del plasminógeno (IAP) y alfa 2-antiplasmina, respectivamente. El esquema del sistema fibrinolítico se representa a continuación.

14

PDF = producto de degradación de la fibrina

El objeto de la presente investigación en los ejemplos 7-9 fue averiguar como el dímero de Apo AI-M afecta al sistema fibrinolítico humano. Tanto la autoactivación del plasminógeno como su activación con APu y AP-t se estudiaron en presencia y ausencia de Apo AI-M/ Apo AI-M. La Apo AI humana aislada del plasma se usó como control (producto de Sigma nr A 9284).

La activación del sistema fibrinolítico se midió con la ayuda de sustratos cromogénicos. Estos sustratos contienen un grupo cromóforo de paranitroanilina, que al escindirse de la molécula sustrato mediante la acción de la plasmina, puede seguirse fácilmente a una longitud de onda de 405 nm. La cantidad de p-NA liberada es directamente proporcional a la cantidad de actividad enzimática generada.

Todas las medidas se obtuvieron usando microplacas de lectura THERMOmax controlado por el programa SOFTmax™ versión 2,01 de Molecular Devices, Menlo Park, CA, Estados Unidos.

Los lotes usados en estos estudios se produjeron recombinantemente según el Ejemplo 4. La purificación incluyó intercambio iónico, interacciones hidrófobas, y cromatografías de filtración en gel seguidas de ultrafiltración y secado en frío, todos procedimientos bioquímicos convencionales. Todos los lotes investigados contenían \geq 90% de las formas diméricas, como se indica mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) en fase inversa. La concentración se determinó usando el ensayo Kabi Pharmacia apolipoprotein AI RIA 100. Se investigaron las preparaciones A, B y C.

Ejemplo 8 Autoactivación del plasminógeno en presencia de Apo AI-M/Apo AI-M y Apo AI

El plasminógeno-Glu (concentración final 94 \mug/ml) se incubó durante tres horas a 37ºC en tampón Tris 0,1 mol/l a pH 7,6. La generación de plasmina se siguió con el sustrato cromogénico S- 2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA), obtenido de Chromogenix AB, Mölndal, Suecia. Se usó a una concentración final de 0,6 mmol/l. Los plasminógenos aplicados en estos ensayos se obtuvieron de Chromogenix AB o de IMCO Inc. Estocolmo, Suecia.

Se ensayaron en este ensayo los lotes de Apo AI-M/Apo AI-M (concentración final de 3,9-75 \mug/ml) y las cantidades de plasmina generada en su presencia en comparación con las cantidades de plasmina generada en presencia de Apo AI (concentración final 125 \mug/ml) y con la cantidad de plasmina generada en ausencia de aditivos (control) (Tabla 4).

Se descubrió sorprendentemente que Apo AI-M/Apo AI-M puede potenciar la activación de plasminógeno en ausencia de activadores de plasminógeno. La Apo AI derivada del plasma no afectó en ningún modo a la molécula de plasminógeno.

TABLA 4 Generación espontánea de actividad de plasmina en plasminógeno. Efecto de Apo AI-M/Apo AI-M y Apo AI. Actividad de plasmina expresada como DO a 405 nm

Muestra	Conc. final de Apo, \mug/ml	DO 405 nm
Control	0	0,052
+ Apo AI	125	0,049
+ Apo AI-M/ApoA AI-M
A	75	0,288
B	31,3	0,325
B	15,6	0,153
B	7,8	0,104
B	3,9	0,067

La actividad observada puede atribuirse a Apo AI-M/ApoA AI-M. Sin embargo, en la base de estos datos, no puede excluirse que Apo AI-M/ApoA AI-M estuviera contaminado por con algunos enzimas proteolíticos, que podrían activar el plasminógeno. Se realizaron experimentos con objeto de excluir esta posibilidad.

Todas las preparaciones con Apo AI-M/ApoA AI-M usadas en los ensayos fibrinolíticos se ensayaron con el sustrato cromogénico S-2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA), sensible a la actividad similar a plasmina y con S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), sensible a las proteasas específicas de Arg. Los sustratos se obtuvieron de Chromogenix AB. La concentración final de Apo AI-M/ApoA AI-M en los ensayos fue idéntica a la usada en los ensayos fibrinolíticos, y esto podría variar entre lotes diferentes.

Ensayo

25 \mul de Apo AI-M/ApoA AI-M a una concentración final de 60-70 \mug/ml

150 \mul de tampón Tris 0,1 mol/l a pH 7,8

50 \mul de S-2251 0,6 mmol/l o S-2288 1,0 mmol/l

La muestra que contenía sólo tampón y sustrato se usó como control para la hidrólisis inespecífica del sustrato. Todas las muestras se ensayaron por duplicado.

Las placas de microvaloración se incubaron a 37ºC y la absorbancia se leyó a intervalos de una hora.

TABLA 5 Actividad amidolítica de dos lotes de Apo AI-M/ApoA AI-M (A y B)

\hbox{después de 4 horas de incubación a 37ºC (DO a 405
nm)}

		Apo AI-M/	Sustrato
		ApoA AI-M
S-2251	A	0,023	0,022
	B	0,022
S-2288	A	0,037	0,034
	B	0,037

En otra serie de experimentos se trató a Apo AI-M/ApoA AI-M con un inhibidor irreversible de las proteasas de serina, diisopropilfluorofosfato, DFF (Producto de Sigma nr D 0789). La concentración final de Apo AI-M/ApoA AI-M en tampón KHCO_{3} 0,2 mol/l a pH 7,6 fue aproximadamente de 75 \mug/ml. El DFF, a una concentración final de 123 mmol/l, se añadió a esta disolución. Después de 4 horas, la muestra de la incubación se dializó toda la noche frente a dos cambios de tampón carbonato.

La determinación de la actividad, usando las mismas condiciones que se describen anteriormente, se realizó sobre Apo AI-M/ApoA AI-M tratadas con DFF y sobre Apo AI-M/ApoA AI-M sin tratar. Después de tres horas de incubación con plasminógeno y S-2251, la DO a 405 nm fue de 0,209 para las muestras que contenían Apo AI-M/ApoA AI-M tratadas con DFF, 0,234 para las muestras que contenían Apo AI-M/ApoA AI-M sin tratar y 0,030 para las muestras con sólo plasminógeno.

Así, puede concluirse, que el efecto de activación de plasminógeno está directamente relacionado con la presencia de Apo AI-M/ApoA AI-M y no es debido a ningún contaminante proteolítico potencial.

Ejemplo 9 Efecto de Apo AI-M/ApoA AI-M sobre la activación del plasminógeno con activadores del plasminógeno AP-t y APu

Tanto la uroquinasa (APu) como el activador tisular del plasminógeno (AP-t) convierten el plasminógeno en plasmina por corte proteolítico de un enlace peptídico simple Arg 560-Val 561 en la molécula de plasminógeno. Mientras que la uroquinasa de doble cadena puede activar el plasminógeno directamente, el AP-t requiere la presencia de fibrina para la activación óptima del plasminógeno. La presencia de cantidades catalíticas de fibrinas, que junto con el AP-t y el plasminógeno forman un complejo ternario, aumentarán la eficiencia enzimática del AP-t aproximadamente 600 veces.

La activación del plasminógeno con AP-t se estudió usando el kit comercialmente disponible Spectrolyse® (fibrina) AP-t/API de Biopool AB, Ume\ring{a}, Suecia.

En este ensayo, el plasminógeno se incuba con AP-t en presencia de un sustrato cromogénico D-But- CHT-Lys-pNA y de fibrinógeno desAA (monómero de fibrinógeno), que actúa como un simulador de la activación. Los plasmina generada corta al sustrato, liberando el pNA libre.

Se añadió a este sistema el Apo-AIM/Apo AI-M y se comparó con la preparación de ApoAI de Sigma. El efecto de ambas apolipoproteínas se ensayó en el sistema tanto en presencia como en ausencia de fibrina.

Ejemplo del sistema del ensayo

25 \mul de tampón Spectrolyse

25 \mul de tampón o preparación Apo

20 \mul de AP-t (= concentración final 1,7 UI/ml)

150 \mul de reactivo Spectrolyse PAR (mezcla de plasminógeno y sustrato)

10 \mul de fib. Desa (monómero de fibrina) o 10 \mul de tampón

Las muestras se incubaron en placas de microvaloración a 37ºC durante tres horas.

TABLA 6 Efecto de Apo-AIM/Apo-AIM y ApoAI sobre la activación del plasminógeno por AP-t en presencia y ausencia de fibrina. Los resultados se expresan como DO, a 405 nm, después de tres horas de incubación a 37ºC.

Muestra	Conc. final de	DO a 405 nm	DO a 405 nm
	Apo, \mug/ml	+ fibrina	- fibrina
Ap-t control	0	0,656	0,048
+ Apo AI	54	1,050	0,066
+ Apo AI-M/
Apo AI-M
A	65	1,665	0,446
B	54	2,366	0,225

Se observó una significante estimulación de la activación del plasminógeno con Apo AI-M/Apo AI-M, tanto en presencia como en ausencia de fibrina. La ApoAI estimuló la activación en menor grado en presencia de fibrina. En ausencia de fibrina la estimulación de Apo AI-M/Apo AI-M fue muy pronunciada en comparación con la poca estimulación por Apo AI.

La Apo AI-M/Apo AI-M tuvo también un significante efecto potenciador cuando se activó el plasminógeno con APu. La uroquinasa usada en estos ensayos era una preparación de un alto peso molecular obtenida de Calbiochem.

La uroquinasa (concentración final de 2,5 UI/ml) se mezcló con el plasminógeno (concentración final de 94 \mug/ml) y un sustrato cromogénico S-2251 (concentración final de 0,6 mmol/l). A esta muestra se añadió Apo AI-M/Apo AI-M a una concentración final de 75 ó 62 \mug/ml. La reacción se realizó en tampón Tris 0,1 mol/l, a pH 7,6.

De manera similar a AP-t, se observó una potente estimulación de la generación de plasmina por uroquinasa, cuando se añadió Apo AI-M/Apo AI-M al ensayo (Tabla 7).

TABLA 7 Efecto de Apo AI-M/Apo AI-M sobre la activación del plasminógeno por APu. Los resultados se expresan como DO a 405 nm después de 4 horas de incubación a 37ºC

Apo AI-M/Apo AI-M
Muestra	Conc. final \mug/ml	DO a 405 nm
Control Apu	0	0,325
+ Apo AI-M/Apo AI-M
A	75	1,263
B	62	1,868

Este efecto potenciador sobre la fibrinolisis también persiste cuando se prepara Apo AI-M/Apo AI-M en una composición farmacéutica junto con un vehículo. Se emplearon liposomas constituidos por fosfatidilcolina, FC, (12 mg/ml) como un vehículo potencial. La concentración de Apo AI-M/Apo AI-M (lote C) en los liposomas fue de 3,6 mg/ml.

La activación del plasminógeno (conc. final de 94 \mug/ml) con APu (conc. final 2,5 UI/ml) se ensayó en presencia de liposomas llenos de Apo AI-M/Apo AI-M y en comparación con la activación realizada en presencia de liposomas sin proteínas. Las muestras se incubaron durante cuatro horas a 37ºC con S-2251 y se siguió continuamente la generación de plasmina.

TABLA 8 Activación del plasminógeno por APu. Efecto de las Apo AI-M/Apo AI-M, lote C, en liposomas. Los resultados se expresan como DO a 405 nm

Muestra	DO a 405 nm
APu + plasminógeno	0,221
+ liposomas libres de
proteínas, 250 \mug/ml FC	0,499
+ Apo AI-M/Apo AI-M,
75 \mug/ml en liposomas,
250 \mug/ml FC	1,084

La presencia de los liposomas solos estimuló la activación del plasminógeno en aproximadamente dos veces. La adición de Apo AI-M/Apo AI-M a los liposomas aumentó este efecto en cinco veces, en comparación con la muestra que contenía sólo activador uroquinasa.

Ejemplo 10 Efecto de la Apo AI-M/Apo AI-M sobre la conversión de uroquinasa de cadena simple a uroquinasa de cadena doble.

La uroquinasa de cadena simple (APucs) es un precursor de la uroquinasa de cadena doble (APu). En contraste con APu, APucs tiene sólo muy baja actividad amidolítica frente a los sustratos sintéticos pequeños. La actividad amidolítica es casi el 0,4% de la actividad de APu. Sin embargo, APucs, a pesar de se ser un proenzima, tiene la capacidad de activar el plasminógeno a plasmina. En las mezclas de plasminógeno y APucs se ha propuesto una secuencia de tres reacciones para implicarla en la activación de plasminógeno en plasmina:

1) APucs + plasminógeno \rightarrow APucs + plasmina

2) plasmina + APucs \rightarrow plasmina + APu

3) APu + plasminógeno \rightarrow APu + plasmina

Estudiamos la secuencia de reacciones que conducen a la conversión de APucs a APu en presencia de plasminógeno. La actividad uroquinasa se detectó con la ayuda del sustrato cromogénico S-2444 específico de uroquinasa (piro-Glu-Gly-Arg-pNA, Chromogenix AB). Los grupos Apo AI-M/Apo AI-M se añadieron al sistema y la cantidad generada de actividad APu se comparó con la actividad obtenida en las muestras sin la adición de apolipoproteína. La uroquinasa de cadena sencilla usada en estos ensayos era un producto recombinante obtenido de Grünenthal GmbH, Aachen, Alemania (lot nr 0088808).

25 \mul de Apo o de tampón

75 \mul de Tris 0,05 mmol/l a pH 7,6, que contenía NaCl 0,1 mmol/l y Tween 80 al 0,02%

25 \mul de APucs, concentración final de 454 pmol/l

50 \mul de S-2444, concentración final de 1 mmol/l

25 \mul de plasminógeno, concentración final de 52,1 mmol/l

Las muestras se incubaron a 37ºC durante 90 minutos. El aumento en la densidad óptica, que mide la cantidad de APu generada, se registró continuamente durante los últimos 30 minutos de incubación.

TABLA 9 Efecto de Apo AI-M/Apo AI-M sobre la conversión de APucs en APu.

\hbox{Los resultados se expresan como  mDO/min a 405
nm}

Muestra	Conc. final de	mDO/min
	Apo, \mug/ml
APucs	0	0,073
+ plasminógeno	0	13,2
+ Apo AI	62	11,8
+ Apo AI-M/
Apo AI-M
B	62	20,0
A	75	24,0

La conversión de APucs en APu en presencia de plasminógeno se estimuló por Apo AI-M/Apo AI-M, mientras que la ApoAI aislada del plasma no tuvo ningún efecto significativo en este sistema.

Los efectos observados de Apo AI-M/Apo AI-M en los ensayos fibrinolíticos usados en estos estudios se potenciaron en comparación con los efectos vistos con la ApoAI aislada del plasma. Las Apo AI- M/Apo AI-M tienen un capacidad potente de estimular la actividad fibrinolítica que es superior a la de ApoAI. Es probable que este efecto potenciado de Apo AI-M/Apo AI-M respecto Apo AI se encuentre también in vivo.

Claims (26)

1. Una preparación de dímeros sustancialmente pura de Apolipoproteína AI-Milano que puede estimular la actividad fibrinolítica, con una pureza de dímeros de al menos el 90%.

2. La preparación de dímeros sustancialmente pura de Apolipoproteína AI-Milano, según la reivindicación 1, con una pureza de dímeros de al menos el 98%.

3. La preparación de dímeros sustancialmente pura de Apolipoproteína AI-Milano según la reivindicación 1 ó 2, que se ha producido recombinantemente.

4. Una composición farmacológica que comprende una preparación de dímeros según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, junto con un vehículo.

5. La composición farmacológica según la reivindicación 4, en la que el vehículo es un liposoma.

6. La composición farmacológica según la reivindicación 5, en la que el liposoma contiene fosfatidilcolina (FC).

7. La composición farmacológica que comprende una preparación de dímeros según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, junto con un agente estabilizante.

8. La composición farmacológica según las reivindicaciones 4 ó 7, junto con un agente que disminuye los lípidos.

9. La composición farmacológica según la reivindicación 4, que comprende el dímero junto con un compuesto estabilizante de lípidos.

10. La composición farmacológica según la reivindicación 4, junto con un fosfolípido.

11. La composición farmacológica según la reivindicación 10, en la que el fosfolípido se selecciona del grupo constituido por fosfatidilcolina de huevo (FCH), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POFC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMFC), y mezclas de los mismos.

12. Procedimiento para preparar una preparación de dímeros según la reivindicación 1, mediante la producción de Apolipoproteína AI-Milano por tecnología recombinante como una proteína de fusión intracelular en E. coli, caracterizado porque la Apolipoproteína AI-Milano se escinde con ácido fórmico, convirtiendo después cualquier monómero presente en dímero, y purificando subsiguientemente el dímero hasta al menos un 90% de pureza de dímeros, preferiblemente al menos un 98% de pureza de dímeros.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque la proteína de fusión se escinde entre un residuo de asparragina y un residuo de prolina.

14. Procedimiento para preparar una preparación de dímeros según la reivindicación 1, mediante la producción de Apolipoproteína AI-Milano por tecnología recombinante, mediante la secreción de la Apolipoproteína AI-Milano, como monómero o como dímero, en el medio de cultivo bacteriano en un sistema de expresión en E. coli, caracterizado porque cualquier monómero presente se convierte en dímero, y purificando subsiguientemente la preparación de dímeros hasta al menos un 90% de pureza de dímeros, preferiblemente al menos un 98% de pureza de dímeros.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque el dímero se purifica en al menos una etapa seleccionada del grupo constituido por cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacciones hidrófobas.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el dímero se purifica en una secuencia de etapas que comprenden cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacciones hidrófobas, preferiblemente seguidas de ultrafiltración.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque el monómero se convierte en dímero por oxidación con glutatión o tíorredoxina.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque el monómero se convierte en dímero por oxidación con glutatión oxidado.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la concentración de glutatión oxidado está en el intervalo de 0,1 a 10,0 mM.

20. Uso de una preparación de dímeros según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento que comprende la preparación de dímeros para el tratamiento de la arteriosclerosis y de enfermedades cardiovasculares.

21. Uso de una preparación de dímeros según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento que comprende el dímero, que actúa como un promedicamento para el monómero, para el tratamiento de la arteriosclerosis y de enfermedades cardiovasculares.

22. Uso según las reivindicaciones 21 ó 22 para la prevención y el tratamiento de las principales enfermedades cardiovasculares, como infarto de miocardio, angina inestable, oclusiones periféricas vasculares agudas y restenosis después de una angioplastia coronaria.

23. Uso según las reivindicaciones 21 ó 22 para el tratamiento de estados arteriales crónicos.

24. Uso según las reivindicaciones 21 ó 22 para la prevención y el tratamiento de la trombosis.

25. Uso según la reivindicación 24 para la estimulación de la fibrinolisis.

26. El uso según las reivindicaciones 21 ó 22, en el que el medicamento contiene además agentes que disminuyen los lípidos.