PL172544B1 - Sposób wytwarzania dimeru apolipoproteiny Al-Milano PL PL PL - Google Patents
Sposób wytwarzania dimeru apolipoproteiny Al-Milano PL PL PLInfo
- Publication number
- PL172544B1 PL172544B1 PL92314894A PL31489492A PL172544B1 PL 172544 B1 PL172544 B1 PL 172544B1 PL 92314894 A PL92314894 A PL 92314894A PL 31489492 A PL31489492 A PL 31489492A PL 172544 B1 PL172544 B1 PL 172544B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- apo
- dimer
- apoal
- monomer
- plasminogen
- Prior art date
Links
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims abstract description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 17
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 17
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 13
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 9
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 30
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 30
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 25
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 20
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 15
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 15
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 14
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 14
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 12
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 7
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 7
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 7
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 4
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 4
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 200000000007 Arterial disease Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000014190 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010011964 Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 239000003524 antilipemic agent Substances 0.000 description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 239000002634 heparin fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000004141 reverse cholesterol transport Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 2
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- CAJXYXPLLJDEOB-SLFFLAALSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-n-(4-nitrophenyl)hexanamide Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 CAJXYXPLLJDEOB-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- ZEFNOZRLAWVAQF-UHFFFAOYSA-N Dinitolmide Chemical compound CC1=C(C(N)=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O ZEFNOZRLAWVAQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014476 Elevated cholesterol Diseases 0.000 description 1
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710100170 Unknown protein Proteins 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 102000003801 alpha-2-Antiplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108090000183 alpha-2-Antiplasmin Proteins 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002565 heparin fraction Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004576 lipid-binding Effects 0.000 description 1
- 230000008604 lipoprotein metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013557 residual solvent Substances 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M sodium cholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 NRHMKIHPTBHXPF-TUJRSCDTSA-M 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Ink Jet (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano o czystosci co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 98%, znamienny tym, ze komórki E. coli transformuje sie ukladem ekspresyjnym obejmujacym gen kodujacy Apolipoproteine Al-Milano, prowa- dzi sie hodowle stransformowanych E. coli, podczas której wytworzony monomer i dimer Apolipoproteiny Al-Milano sa wydzielane do podloza hodowlanego, po czym monomer obecny w otrzymanej mieszaninie, skladajacej sie glównie z dimeru i niewielkich ilosci monomeru przeprowadza sie w dimer i nastepnie oczyszcza sie dimer konwencjonalnymi metodami. P L 172544 B 1 PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czystego dimeru apolipoproteiny Al-Milano (Apo Al-M/Apo Al-M). Produkt można stosować do leczenia miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, również jako środek zawierający Apo Al-M o opóźnionym działaniu.
Wyraźna zależność pomiędzy podwyższonym poziomem cholesterolu i rozwojem choroby wieńcowej serca (CHD) była wielokrotnie potwierdzona w oparciu o badania epidemiologiczne i przekrojowe. Jednak określenie złożonych mechanizmów transportu cholesterolu w osoczu pozwoliło na rozpoznanie selektywnej funkcji cyrkulujących lipoprotein w określeniu ryzyka zachorowania na CHD.
Są cztery główne cyrkulujące lipoproteiny: chylomikrony (CM), lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL), lipoproteiny o małej gęstości (LDL) i lipoproteiny o dużej gęstości (HDL). Podczas gdy CM są krótkotrwałym produktem jelitowej absorpcji tłuszczu, VLDL, a zwłaszcza LDL są odpowiedzialne za transport cholesterolu do tkanek, w tym np. do ścianek tętnic. Przeciwnie HDL są włączone bezpośrednio w usuwanie cholesterolu z tkanek obwodowych i przenoszenie go z powrotem do wątroby albo do innych lipoprotein poprzez mechanizm znany jako odwrotny transport cholesterolu (RCT).
Ochronna rola HDL została potwierdzona w kilku badaniach (np. Miller i in., Lancet, 1977, 965-968 i Whayne i in. Atherosclerosis, 1981, 39, 411-419). Na podstawie tych badań wy daje się, że podwyższone poziomy LDL w mniejszym stopniu niż VLDL są wyraźnie związane ze zwiększonym ryzykiem zagrożenia chorobą sercowo-naczyniową, natomiast wysoki poziom HDL chroni przed tymi chorobami. Ochronna rola HDL została mocno poparta badaniami in vivo, wykazującymi, że infuzja HDL królikom może hamować rozwój uszkodzeń tętnic wywołanych cholesterolem (Badimon i in., Lab. Invest. 60, 455-61, 1989) i lub wywoływać ich regresję (Badimon i in., J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990).
172 544
Ostatnie zainteresowania w badaniu mechanizmu(ów) ochronnych HDL skupiły się na apolipoproteinie Al (Apo Al), głównym składniku HDL. Wysoki poziom Apo Al w osoczu jest związany z obniżonym ryzykiem CHD i obecnością uszkodzeń wieńcowych (Maciejko i in., N. Engl. J. Med. 1983; 309:385-389; Sedlis i in., Circulation, 1986; 73 i 978-981).
Apo Al w osoczu jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym o 243 aminokwasach, których główna sekwencja jest znana (Brower i in., Biochem Biophys Res. Commun., 1978; 80:623-630). Apo Al jest syntetyzowana w komórce jako prekursor o 267 aminokwasach. Pre-pro-apolipoproteina najpierw podlega N-końcowemu rozszczepieniu wewnątrzkomórkowo, gdzie traci 18 aminokwasów, a następnie dalszemu odszczepieniu 6 aminokwasów, w osoczu lub limfie dzięki aktywności specyficznych proteaz.
Uważa się, że główną strukturalną cechą cząsteczki Apo Al jest obecność powtarzalnych jednostek 11 lub 22 aminokwasów, które, przypuszcza się, że występują w amfipatycznej konformacji helisy (Segrest i in. FEBS Lett. 1974; 38:247-253). Ta struktura stanowi o głównych aktywnościach biologicznych Apo Al, tj. wiązaniu lipidów i aktywowaniu acylotransferazy lecytynocholesterolowej (LCAT).
Inną, ostatnio opisaną właściwością Apo Al jest jej czynność przeciwwirusowa. Wynika to z badań in vitro, a czynność jest skierowana zarówno wobec szczepów wirusa Herpes (R. V. Srinivas i in, Virology, 1756, 48-57, 1990) jak i wobec ludzkiego wirusa upośledzenia odporności, HIV, (Owe i in., J.Clin. Invest. 86, 1142-50, 1990). Wydaje się, że taka czynność działa przez interakcję między amfipatycznymi helikalnymi częściami Apo Al i glikoproteinami otoczkami wirusów.
Badania in vitro wskazują, że kompleksy Apo Al i lecytyny mogą pobudzać wypływ wolnego cholesterolu z hodowanych komórek mięśni gładkich tętnicy (Stein i in., Biochem. Biophys. Acta, 1975; 380:106-118). Według tego mechanizmu HDL mogą także zmniejszać proliferację tych komórek (Yoshida i in., Exp. Mol. Pathol. 1984; 41:258-266).
Ostatnio wykazano, że infuzje Apo Al lub HDL robione zwierzętom doświadczalnym wywołują istotne zmiany biochemiczne, jak również zmniejszają zasięg i powagę uszkodzeń miażdżycowych w tętnicach. Po początkowym doniesieniu Maciejki i Mao (Arteriosclerosis, 1982; 2:407a) Badimon i in. (patrz dwa cytowane powyżej badania) stwierdzili, że można znacznie zmniejszyć zakres uszkodzeń miażdżycowych (-45%) i zawartość estru cholesterolu (-58,5%) u karmionych cholesterolem królików, przez infuzję HDL (d = 1,063 - 1,325 g/ml). Stwierdzili także, że infuzje HDL prowadzą do prawie 50% regresji istniejących uszkodzeń.
Wykazano także (Esper i in., Arteriosclerosis, 1987; 7:523a), że infuzje HDL mogą znacznie zmieniać skład lipoprotein w osoczu u królików Watenabe z dziedziną hipercholesterolemią, która powoduje wczesne uszkodzenia tętnic. W tym przypadku infuzje HDL mogą więcej niż podwoić stosunek między ochronnymi HDL i miażdżycorodnymi LDL.
Potencjalne działanie HDL w zapobieganiu chorobie tętnic u zwierząt modelowych potwierdzono jeszcze przez obserwację, że Apo Al może mieć aktywność fibrynolityczną in vitro (Saku i in., Thromb Res. 1985; 39:1-8). Ronneberger (X Międzynarodowy Kongres Farmakol., Sidney 1987, str. 990) wykazał, że ekstrakcyjna Apo Al może zwiększać fibrynolizę u psów gończych i małp. Cynomologous. Podobną aktywność można zauważyć in vitro na ludzkim osoczu. Autor ten mógł potwierdzić zmniejszenie osadzania się lipidów i tworzenia się płytek tętniczych u zwierząt, którym podaje się Apo Al.
Apolipoproteina Al-Milano (Apo Al-M) j'est pierwszym opisanym molekularnym wariantem ludzkiej Apo Al (Franceschini i in. J. Clin. Invest. 1980; 66:892-900). Charakteryzuje się tym, że Arg 173 jest zastąpiona Cys (Weisgraber i in., J. Biol. Chem., 1983; 258:2508-2513). Zmutowana apoproteina jest przenoszona jako autosomalna cecha dominująca i zidentyfikowano 8 pokoleń nosicieli (Gualandri i in. Am. J. Hum. Genet. 1984; 37:1083-1097).
Stan osobnika nosiciela Apo Al-M charakteryzuje znaczne obniżenie poziomu cholesterolu-HDL. Mimo tego, badani osobnicy najwyraźniej nie wykazują zwiększonego ryzyka choroby tętnic; faktycznie, z badania drzewa genealogicznego wynika, że osobnicy d są zabezpieczeni przed miażdżycą tętnic.
Wydaje się, że mechanizm możliwego ochronnego działania Apo Al-M u nosicieli jest związany z modyfikacją w strukturze zmutowanej apolipoproteiny polegającą na utracie jednego alfa-heliksu i zwiększonej ekspozycji reszt hydrofobowych (Francheschini i in., J. Biol. Chem. 1985; 260:1632-1635). Utrata sztywnej struktury kilku alfa-heliksów prowadzi do zwiększonej elastyczności cząsteczki, która łatwiej łączy się z lipidami, w porównaniu z normalną Al. Ponadto, kompleksy apolipoproteina/lipid są bardziej podatne na denaturację, co sugeruje, że w przypadku mutanta poprawione jest także dostarczanie lipidów.
Lecznicze zastosowanie mutanta apolipoproteiny Apo Al-M jest obecnie ograniczone przez brak metody pozwalającej na wytwarzanie tych apolipoprotein w wystarczającej ilości i w odpowiedniej postaci.
Inną bardzo specyficzną cechą Apo Al-M jest zdolność do tworzenia dimerów ze sobą i kompleksów z Apo Al, w obu przypadkach, dzięki obecności reszty Cys. Z badań frakcji krwi zawierających mieszaninę Apolipoprotein wynikały wskazania, że obecność dimerów i kompleksów w obiegu może być odpowiedzialna za zwiększony okres ich połowicznego wydalania u przenosicieli, ostatnio opisanych w badaniach klinicznych (Gregg i in., NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Strukturę to Phenotypie Expression, Limone SG, 1988).
Dimery Apo Al-M (Apo Al-M/Apo Al-M) działają jako czynnik hamujący w interkonwersji cząstek HDL in vitro (Franceschini i in. J. Biol. Chem. 1990; 265: 1224-12231).
Wcześniejsze badania mieszanin zawierających dimer są oparte na Apo Al-M wydzielonym z naturalnej krwi od osób z Apo AI-M, którą można było otrzymać tylko w małej ilości.
Trudności w wyprodukowaniu Apo Al, a zwłaszcza Apo Al-M z frakcji osocza są bardzo poważne (Franceschini i in., J. Biol. Chem. 1985; 260:16321-16325). Wydzielenia i produkcji nie można przeprowadzić na dużą skalę, ponieważ dostępna jest tylko mała ilość surowca. Ponadto, z produktami frakcjonowania osocza związane jest ryzyko, między innymi takie, jak zanieczyszczenie czynnikami zakaźnymi. To jest główny powód ich unikania.
Usiłowano wyprodukować ludzką Apo Al na drodze rekombinacji DNA. W publikacji europejskiego patentu nr 0 267 703 jest opisany sposób otrzymywania Apo Al w E. coli. Jest tam opisany chimeryczny polipeptyd, w którym reszta Apo Al jest połączona z N-końcowymi resztami aminokwasowymi beta-galaktozydazy lub z jedną lub więcej domenami wiążącymi IgG. Proteiny A lub z pro-sekwencją ludzkiej Apo Al.
Ekspresja Apo Al i Apo AI-M w szczepach drożdży i zastosowanie wytworzonych składników w leczeniu chorób miażdżycowych tętnic i chorób sercowo-naczyniowych są ujawnione w W09O/12879. Geny kodujące Apo Al i Apo Al-M są połączone z sekwencjami DNA kodującymi sygnały sekrecyjne i obróbki białka rozpoznawalne przez drożdże i podłączonymi przed genem kodującym dojrzałe białko. Stosowano modyfikowaną sekwencję MF-alfa-1-lidera, w której ostatnimi resztami były HisGlySerLeuAspLysArg.
Niniejszy wynalazek. Stwierdziliśmy nieoczekiwanie, że oczyszczony dimer Apo Al-M/Apo Al-M ma przedłużony półokres trwania w porównaniu z monomerem Apo Al-M, poza tym, że ma wyraźnie lepszą właściwość stymulowania fibrynolizy w porównaniu z normalną Apo Al, np. zdolność do bezpośredniego aktywowania plazminogenu (którego normalna Apo Al nie aktywuje) oraz, że może być biologicznie ważny i może działać jako pro-lek dla Apo Al-M. Tworzy także rekonstytuowane cząstki HDL (lipoproteiny o dużej gęstości) o wyjątkowej wielkości, jakich nie znalaziono w rekombinacyjnych cząstkach HDL zawierających Apo Al-M lub Apo Al.
Sposobem według wynalazku wytwarza się zasadniczo czyste dimery apolipoproteiny Al-Milano, dalej określane jako Apo Al-M/Apo Al-M, o czystości co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 98%.
Sposób według wynalazku polega na tym, że komórki E. coli transformuje się układem ekspresyjnym obejmującym gen kodujący Apolipoproteinę Al-Milano, prowadzi się hodowlę stransformowanych E. coli, podczas której wytworzony monomer i dimer Apolipoproteiny Al-Milano są wydzielane do podłoża hodowlanego, po czym monomer obecny w otrzymanej mieszaninie, składającej się głównie z dimeru i niewielkich ilości monomeru przeprowadza się w dimer i następnie oczyszcza się dimer konwencjonalnymi metodami.
Korzystnie układ ekspresyjny obejmuje indukowalny promotor wybrany spośród promotorów tac i trc.
Korzystnie, układ ekspresyjny obejmuje wektor ekspresyjny wybrany spośród pKP576, pKP682, pKP683 i pKP764.
Korzystnie monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie za pomocą glutationu lub tioredoksyny, zwłaszcza za pomocą utlenionego glutationu, który szczególnie korzystnie stosuje się w stężeniu od 0,1 do 10,0 mM.
Kompozyqe farmaceutyczne mogą także zawierać czynnik obniżający poziom lipidów i/lub inny lek, już znany w leczeniu miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych, taki jak heparyna i fragmenty heparyny lub czynniki obniżające lipidy.
Środki te można stosować do leczenia miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych i do zapobiegania i leczenia głównych schorzeń sercowo-krążeniowych, takich jak zawał serca, dusznica bolesna niestabilna, ostre zamknięcie naczyń obwodowych i nawrót zwężenia po plastyce naczyń wieńcowych.
Gdy leczy się przewlekłe choroby tętnic, wówczas leczy się zarówno tętnice wieńcowe, jak i obwodowe, które charakteryzują się obecnością płytki okluzyjnej. Dimery będą stosowane do infuzji jako takie w celu wywołania usuwania tłuszczu z płytek lub ewentualnie razem z tradycyjnym leczeniem miażdżycy tętnic i chorób sercowonaczyniowych, takim jak za pomocą heparyny, frakcji heparyny i fragmentów heparyny i/lub leków zmniejszających poziom miażdżycorodnych lipoprotein w obiegu.
Lek zawierający dimer można stosować do zapobiegania lub leczenia trombozy w różnych klinicznych warunkach i można go stosować do stymulacji fibrynolizy.
Dimer może także działać jako pro-lek dla monomeru w leczeniu miażdżycy tętnic i chorób sercowo-naczyniowych.
W dimerze Apo Al-M występują w szerokim zakresie struktury amfipatyczne i dimer przypuszczalnie ma działanie przeciwwirusowe.
Teraz, po raz pierwszy, przez wykorzystanie niniejszego wynalazku, możliwe jest wytworzenie dimeru w zasadniczo czystej postaci, więcej niż 90% i nawet powyżej 98% i możliwe jest także wykazanie, że produkt ten ma zadziwiająco lepszy wpływ na układy biologiczne w porównaniu z Apo Al, co przedstawiono w przykładach poniżej.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady.
Przykład I. Wytwarzanie Apo Al-M w bioreaktorach
Konstrukcja wektorów do bezpośredniej sekrecji Apo Al-M do przestrzeni periplazmatycznej i podłoża wzrostowego Szczepy i wektory. Stosowano szczepy Escherichia coli K12: HB101 F, hsd S20(rB- mB ) supE44. HB101 F, hsd S20(rB', mB), supE44, aral4, I', galK2, lacYl, proA2, rspL20, xyl-5, mtl-1, recA13, rh, mB, mci^.A(+) (Boyer i in. J. Mol. Biol. 41:459-472), DH5a F, F80DlacZDM15, D(lacZYA-argF)U169, recAl, endAl, gyrA, I', thi-I, hsdR17, (rk-, mk+), supE44, relAl, (BRL USA). RB308 DlacX74, galOP::IS2(galOP308), strA, I- (Maurer i in. 1980, J. Mol. Biol. 139:147-161) i BC50 xyl-7, ara-14, T4-R, Γ. Szczepy HB101 i DH5a stosowano do subklonowania fragmentów DNA Do subklonowania fragmentu o długości 821 par zasad kopii cDNA ludzkiej
172 544
Apo Al otrzymanej z S. Sidoli (Mediolan), uzyskanego przez przecięcie za pomocą BamHI, stosowano plazmid pUC9 (Vieira in., 1982, Gene 19;259-68). Sekwencję nukleotydową cDNA ludzkiej Apo Al można otrzymać z GenBanku, gdzie znajduje się pod numerem depozytu Χ02162 (Seilhammer i in. 1984, DNA 3:309-317). Wektor ten oznaczono pK575. Również fragment EcoRI-Pstl o długości 856 par zasad DNA ludzkiej Apo Al-M (kopię cDNA otrzymano z S. Sidoli) subklonowano do plazmidu pUC9. Tę pochodną oznaczono pKP576. Plazmidy pKp683 i pKP764 są pochodnymi plazmidów pTrc99 (Amann i in. 1988, Gene, 69: 301-15) i pochodnej pUC z markerem oporności na kanamycynę, pochodzącym z transpozonu (Tn 903) z pUC4-K (Vieira i in. 1982, Gene 19: 259-268 i Oka i in. J. Mol. Biol. 147:217) i z terminatorami transkrypcji (T1T2) bakteriofaga fd z pUEX2 (Bressan i in. 1987, Nucleic Acid. Res. 15:10056).
Stosowane metody. Szczepy bakteryjne hodowano w pożywce Luria Bertani (LB) lub w tryptonie drożdżowym ( 2 x YT) z ampicyliną (Ap) 50 /zg/ml lub kanamycyną (Km) 70 /zg/ml w celu wytworzenia DNA plazmidowego i analizy ekspresji w małej skali (Sambrook i in., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Do hodowania komórek na płytkach agarowych stosowano podłoże agarowe z krwią i tryptozą, wzbogacone Ap 50 /zg/ml lub Km 70 /zg/ml. Technikę rekombinancji DNA przeprowadzono zgodnie z publikacją Sambrook i in., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Endonukleazy restrykcyjne i ligazę DNA T4 otrzymano z firmy Boehringer Mannheim (Niemcy), New England Biolabs (Beverly, USA) lub Pharmacia (Uppsala, Szwecja). Izopropylo-b-Dgalaktozyd (IPTG) otrzymano z Sigma (USA). Agarozę o niskiej temperaturze żelowania i topnienia (NuSieve GTG, Bioproducts, USA) stosowano do izolowania fragmentów DNA. Apmlifikację PCR przeprowadzono stosując termiczny cykler DNA i polimerazę DNA Taq z Perkin-Elmer/Cetus Instruments (Norwalk, USA). Linkery oligonukleotydowe i primery zsyntetyzowano w Pharmacia-LKB Gene Assembler Plus z Pharmacia (Uppsala, Szwecja), stosując metodę triestu fosforynowego na fazie stałej. Sekwencję nukleotydów określono w sekwensorze DNA Applied Biosystem 373A, stosując zestaw do sekwencjonowania Taq DyeDeoxy™ z Applied Biosystem (USA).
Użyte programy komputerowe DNA.
Do rysowania map plazmidów użyto programu Plasmid ARTIST (wersja 1.2) na komputer typu Macintosh (Clontech, USA), a do manipulowania sekwencjami DNA użyto pakietu oprogramowania do analizy sekwencji GCG-GCG Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wisconsin, USA) na komputery Digital VAX.
Konstrukcja, ekspresja i sekrecja Apo AI-M w bakteriach
Celem konstrukcji wektorów było otrzymanie układu produkcji i sekrecji Apo AL-M w E. coli z bardzo wysokim poziomem Apo Al-M wydzielonej do podłoża hodowlanego.
Zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy w celu sfuzowania kopii cDNA Apo Al i Apo Al-M z fragmentami DNA kodującymi bakteryjne sekwencje sygnałowe. Fragment EcoRI i Nco I o 40 parach zasad z pKP575 zastąpiono fragmentem syntetycznym EcoRI Nco I o długości 37 par zasad i otrzymano plazmid oznaczony pKP580. Miejsce rozszczepienia Bbs I w tym syntetycznym fragmencie DNA daje takie same miejsce rozszczepienia jak Mlu I, co ułatwia klonowanie różnych fragmentów kodujących bakteryjne sekwencje sygnałowe. Plazmid pKP631 skonstruowano przez zastąpienie fragmentu Nco I - Dra III o długości 702 par zasad z pKP575 (Apo Al) fragmentem pKP575 (Apo AL-M) o długości 702 par zasad otrzymanym przez przecięcie Ncol-Dralll. Z plazmidu pKP631 wydzielono fragment BbsI-HindHI o długości 820 par zasad i wstawiono w miejscu rozpoznawanym przez Mlu I i Hind ΙΠ wektora plazmidowego, który był oznaczony pKP682. Wektor ten zawiera promotor tac (Ptac), pochodną sekwencji sygnałowej ompA, dwa terminatory transkrypcji i jako znacznik oporność na kanamycynę.
172 544
Fragment Nru I - Nru I o długości 1501 par zasad wyizolowano z pKP682 i wstawiono do podobnego wektora, ale Ptac zastąpiono promotorem trc (Ptrc). Ten wektor ekspresji oznaczono pKP683. Plazmid pKP764 skonstruowano przez zastąpienie fragmentu o długości 88 par zasad Dra III - Hind III z pKP683 syntetycznym fragmentem DNA o długości 14 par zasad, zawierającym silniejsze terminatory translacji i zniszczenie miejsca rozpoznawanego przez Dra III przez wprowadzenie A przy końcu Dra III zwisającym z 3’ końca. Transformację szczepów E. coli przeprowadzono jak opisał Sambrook i in., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Konstrukcje plazmidowe stosowano w doświadczeniach na ekspresję i do produkcji Apo Al-M analizowano stosując mapowanie za pomocą enzymów restrykcyjnych a gen strukturalny kodujący Apo Al-M potwierdzono przez określenie sekwencji nukleotydów. Szczepy E. coli z odpowiednimi plazmidami stosowane do hodowli w bioreaktorach wytworzono w następujący sposób. Komórki hodowano przez noc w LB lub 2xYT uzupełnionej Km w wytrząsanych kolbach w 30°C. Po odwirowaniu komórki ponownie zawieszono w 1/2 objętości głęboko zamrożonego podłoża do przechowywania, według Gargena i in. 1979, Nucleic Acid Res. 7:2115. Próbki odmierzono do 1 ml kriofiolek i przechowywano w -75°C aż do czasu stosowania. Pożywki hodowlane do hodowania komórek w bioreaktorach. Pożywka A: 16 g/l tryptonu (Difco, USA), 8 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco, USA), 5 g/l NaCl i 0,05 g/l kanamycyny. Pożywka B: 2,5 g/l (NH4)2SO4, 3 g/l KH2PO4, 2 g/l K2HPO4, 0,5 g/l Na3-cytrynianu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco, USA). Po wyjałowieniu pożywkę uzuepłniono: 10 g/l początkowej glukozy, 0,05 g/l kanamycyny, 1 g/l MgSO4 x 7H2O i 0,07 g/l chlorowodorku tiaminy. Dodano roztwór pierwiastków śladowych (1 ml/l) i roztwór witamin (0,65 ml/l). Roztwór pierwiastków śladowych zawierał 27 g/l FeCls x 6 H2O, 4 g/l ZnSO4 x 7 H2O, 7 g/l CoCE x 6 H2O. 7 g/l Na2MoO4 x 2 H2O, 8 g/l CuSO4 x 5 H2O, 2 g/l H3BO3, 5 g/l MnSO4 x 4 H2O 11 g/l CaCb x 2 H2O i 50 ml/l HCl. Roztwór witamin zawierał: 0,5 g/l pantotenianu wapnia, 0,5 g/l chlorku choliny, 0,5 g/l kwasu foliowego, 1 g/l inozytolu, 0,5 g/l nikotynamidu, 0,5 g/l chlorowodorku pirodoksyny, 0,05 g/l ryboflawiny i 0,5 g/l chlorowodorku tiaminy. Jako środek przeciwpieniący stosowano Adecanol (0,2 ml/l). W razie potrzeby podczas prowadzenia hodowli dodatkowo wprowadzano jeszcze środek przeciwpieniący.
Prowadzenie hodowli RB308/pKP683 w bioreaktorze o pojemności 3,5 litra.
500 ml pożywki A zaszczepiono głęboko zamrożoną kulturą podstawową i hodowlano wstępnie w 2 l kolbach Erlenmeyera z przegrodą w 30°C przez 8-10 godzin. Objętość inokulum odpowiadającą 10% objętości roboczej bioreaktora przeniesiono do bioreaktora. Hodowlę prowadzono w bioreaktorze o pojemności 3,5 l (Belach AB, Szwecja) z objętością roboczą 2,5 1. Temperatura podczas fazy wzrostu przed indukcją wynosiła 30°C, po czym wzrosła do 37°C. pH utrzymywano na poziomie 7,0 za pomocą 25% roztworu amoniaku. Szybkość napowietrzania utrzymywano na poziomie i vvm a napięcie rozpuszczonego tlenu (D.O.T.) utrzymywano przy 30% przez nastawienie szybkości wirnika. Po zużyciu początkowej porcji glukozy zapoczątkowano podawanie glukozy utrzymując układ w stanie ograniczenia glukozy przez zasilanie 60% roztworem glukozy. Początkową szybkość podawania, 0,04 g/min., utrzymywano przez 3 godziny, po czym stopniowo zwiększano do 0,4 g/min, w ciągu 3 godzin. Wzrost komórek monitorowano śledząc gęstość optyczną (OD). Stężenie Apo Al-M w supernatancie określono za pomocą próby radioimmunologicznej (zestaw Apolipoproteina Al RIA 100 art. nr 109152-0.1. Kabi Pharmacia, Szwecja). Po 16 godzinach prowadzenia hodowli, przy OD = 58, indukowano syntezę białka przez dodanie 0,5 mM IPTG i podniesiono temperaturę do 37°C. Po 4 godzinach po indukcji stężenie Apo Al-M wynosiło 2,3 g/l, a po dalszych 2 godzinach - 2,5 g/j.
Prowadzenie hodowli BC50/pKP764 w bioreaktorze 3,5-litrowym
Hodowlę prowadzono jak opisano powyżej, z tą różnicą ze do pożywki w bioreaktorze nie dodano kanamycyny. Po 15 godzinach, przy OD = 60, dodano IFTG
172 544 i podniesiono temperaturę. 10 godzin później stężenie Apo Al-M w supernatancie wynosiło 3,7 g/l, 22 godziny po indukcji stężenie wynosiło 4,4 g/l.
Prowadzenie hodowli BC50/pKP764 w bioreaktorze 300-litrowym
Stosowano bioreaktor 300-litrowy (Chemoferm AB, Szwecja) z objętością roboczą 180 l. Inokulum przygotowano jak opisano powyżej dla hodowli RV308/pKP683 w bioreaktorze, 3,5-litrowym, z tą różnicą, że czas prowadzenia wstępnej hodowli w wytrząsanych kolbach wynosił 14 godzin. Inokulum przeniesiono do 50-litrowego bioreaktora do zaszczepiania z objętością roboczą 18 l. Zarówno w kolbach, jak i w bioreaktorze stosowano pożywkę A. Pożywka w bioreaktorze do zaszczepiania była uzupełniona 5 g/l glukozy, a temperatura wynosiła 30°C. pH i napowietrzanie było takie, jak opisano powyżej dla hodowli RV308/pKP683 w bioreaktorze 3,5-litrowym a D.O.T. nie spadało nigdy poniżej 30%. Gdy hodowla osiągnęła OD = 4, zawartość bioreaktora do zaszczepiania przeniesiono do bioreaktora 300-litrowego. W tym bioreaktorze temperatura, pH i napowietrzanie pożywki, były takie jak opisano powyżej dla hodowli RV308/pKP683 w bioreaktorze 3,5-litrowym. Przed indukcją D.O.T. utrzymywano na poziomie 30% lub powyżej przez zwiększanie szybkości wirnika napędowego do maksimum i następnie zwększanie ciśnienia powietrza. Po indukcji ciśnienie powietrza zwiększono do 2· 102 kPa dając w rezultacie D.O.T. = 15-20%. Po 16 godzinach hodowli w bioreaktorze, gdy hodowla osiągnęła OD = 51, dodano IPTG i podniesiono temperaturę do 37°C.
Stężenie Apo Al-M jako monomeru i dimeru .wynosiło 1,3 g/l, 5 g po indukcji i w następnej godzinie, podczas chłodzenia bioreaktora, stężenie Apo Al-M wzrosło do 1,5 g/l.
Obecny monomer był przeprowadzony w dimer i oczyszczony konwencjonalnymi metodami.
Synteza Apo Al-M/Apo Al-M
Roztwory Apo Al-M dializowano do 25 mM buforu Tris-HCl, pH 9,0. Zredukowaną Apo Al-M rozcieńczono do żądanego stężenia końcowego (3,6 - 53,6 ^M) 25 mM buforem Tris-HCl zawierającym zredukowany glutation (GSH) (1-5 mM) i inkubowano wstępnie w 25°C przez 5 min. Utlenianie zapoczątkowano dodatkiem utlenionego glutationu (GSSG) (0,1 - 10,0 mM) i prowadzono je dalej w szczelnie zamkniętych probówkach w tej samej temperaturze przez 24 godziny. Utlenianie monitorowano za pomocą SDSPAGE (patrz powyżej). Po wybarwieniu i odbarwieniu żele przeszukiwano densytometrem laserowym LKB Ultroscan XL i obliczono procentowy rozdział pasm poszczególnych białek stosując program LKB 2400 Gelscan XL. Kinetykę utleniania śledzono za pomocą HPSEC.
W celu zoptymalizowania syntezy dimeru przeprowadzono dodatkowe doświadczenia na utlenianie w obecności GSH/GSSG + Gdn-HCl i GSH/GSSG + tioredoxin (V.P. Pigiet i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986; 83:7643-7647).
Utlenianie Apo Al-M prowadzono w zamkniętych probówkach, w obecności różnych stężeń glutationu zredukowanego) utlenionego (GSH/GSSG). Wydajność reakcji wytwarzania dimeru była zależna zarówno od stężenia białka (fig. 1, tabela 1), jak i stosunku stężeń GSH/GSSG (fig. 2). Przez zwiększenie stężenia białka z 8,9 ^M do
53,6 μΙΜ ilość Apo ^-MApo AhMwzzosła o 22%-51% (fig. 1, tabela 1). Zmmejszenie stosunku molowego GSH/GSSG z 1/2 do 1/16 prowadzi do 43% zmniejszenia wydajności: z drugiej strony wzrost stężenia GSH/GSSG przy stałym stosunku molowym GSH/GSSG był związany z do 42% wzrostem ilości warzonego Apo Al-M/Apo Al-M (fig. 2, tabela 1). Ani temperatura reakcji, ani obecność czynnika denaturującego białko (Gdn-HCl) nie wpłynęły na stopień tworzenia się Apo Al-M/Apo Al-M. Wytworzono znaczną ilość Apo Al-M/Apo Al-M przez inkubację Apo Al-M z GSH/GSSG w obecności 0,2 mM tioredoxinu (tabela 1).
172 544
Kinetykę reakcji utleniania śledzono za pomocą analitycznej HPSEC. Dimeryczna i monomeryczna apo Al-M dawała wyraźne piki z czasami retencji 10,8 i 12,7 min., odpowiednio. Synteza Al-M/Al-M (GSH/GSSG) 2 mM/4 mM, stężenie Al-M 8,9 mM) byty prawie całkowite po 3 godzinach; przedłużenie inkubacji do 24 godzin nie zwiększyło już tworzenia się Al-M/Al-M (fig. 3).
Tabela 1
Utlenianie Apo Al-M
| Białko ^M | GSHmM | GSSG mM | Wydajność % | Uwagi |
| 3,6 | 1,0 | 0,1 | 34,8 | tioredoxin 0,2 mM |
| 8,9 | 1,0 | 2,0 | 9,1 | |
| 8,9 | 1,0 | 2,0 | 9,9 | 4°C |
| 8,9 | 1,0 | 4,0 | 7,2 | |
| 8,9 | 1,0 | 4,0 | 7,7 | 4°C |
| 8,9 | 1,0 | 8,0 | 6,6 | |
| 8,9 | 1,0 | 16,0 | 5,2 | |
| 8,9 | 2,0 | 4,0 | 19,6 | |
| 8,9 | 4,0 | 8,0 | 18,7 | |
| 8,9 | 5,0 | 10,0 | 23,9 | |
| 8,9 | 1,0 | 2,0 | 9,8 | Gdn-HCl 4 M |
| 17,9 | 2,0 | 4,0 | 23,3 | |
| 17,9 | 4,0 | 8,0 | 25,5 | |
| 17,9 | 5,0 | 10,0 | 27,5 | |
| 35,7 | 2,0 | 4,0 | 25,9 | |
| 35,7 | 4,0 | 8,0 | 27,7 | |
| 35,7 | 5,0 | 10,0 | 27,9 | |
| 53,6 | 2,0 | 4,0 | 25,4 | |
| 53,6 | 4,0 | 8,0 | 30,5 | |
| 53,6 | 8,0 | 10,0 | 36,1 |
Warunki reakcji: Bufor: Tris-HCl 25 mM, pH 9,0 Temperatura: 25°C Czas: 24 godziny
Metody charakteryzowania produktu Inkubacja z fosfolipidami
Odważone ilości dimirystoilofosfatydylocholiny (DMPC) rozpuszczono w etanolu i odparowano rozpuszczalnik pod N2; pozostały rozpuszczalnik usunięto pod próżnią w ciągu 2 godzin. Dyspersje DMPC w 20 mM buforu fosforanowego pH 7,4, zmieszano Apo Al-M/Apo Al-M (0,1 mg/ml - stężenie końcowe) w stosunku molowym DMPC/Apo Al-M/Apo Al-M 100:1.
Spektroskopia
Roztwory Apo Al-M/Apo-Al-M dializowano do 20 mM buforu fosforanowego, pH 7,4, i rozcieńcz.ono tym samym buforem do żądanego stężenia białka.
Normalne widma UV i drugie pochodne widm roztworów Apo Al-M/Apo Al-M i Apo Al-M/Apo Al-M + DMPC otrzymano za pomocą spektrometrów Jasco Uvidec-610 i Perkin Elmer Lambda-2 w 25°C, stosując 1 cm pryzmat kwarcowy. Topograficzne umiejscowienie reszt tyrozyny badano zgodnie z równaniem Ragone i in. (R.
172 544
Ragone, G. Colonna, C. Balestrieri, L. Servillo, G. Irace,. Determination of tyrosine exposure in proteins by second-derivative spectroscopy. Biochemistry, 1984, 23: 1871-1875):
alfa = (rn - ra)/(ru - ra)
W którym alfa oznacza stopień ekspozycji tyrozyny na rozpuszczalnik, rn i ru oznaczają stosunki pików pochodnej (a/b) dla natywnego i nierozcieńczonego (w 6M GdnHCl) Apo Al-M/Apo Al-M, odpowiednio, a ra oznacza stosunek pików drugiej pochodnej roztworu zawierającego wolną tyrozynę i tryptofan zmieszane w takim samym stosunku molowym jak w Apo Al-M/Apo Al-M.
Wewnętrzne widma fluorescencyjne roztworów Apo Al-M/Apo Al-M i Apo AlM/Apo Al-M + DMPC otrzymano na spektrofluorometrze Jasco FP-550 w 25°C.
Widma dichroizmu kołowego (CD) roztworów Apo AL-M/Apo Al-M i Apo AlM/ApoAAl-M + DMPC otrzymano na spektropolarymetrze Jasco J500A w 25°C. Średnie wartości eliptyczności reszty [THEYA] wyrażono w stopniach x cm2 x dmol4 i obliczono z równania:
[THEYA] = [THEYA]xlO6
10xIxc
W którym [THEYA] oznacza zaobserwowaną eliptyczność w stopniach, 106 jest średnim resztkowym ciężarem cząsteczkowym białka, I oznacza długość ścieżki w cm, a c oznacza stężenie białka w g/ml. Procent struktury alfa-helisy obliczono z równania:
% alfa-helisy = [THEYA] 208 nm - 4000 33 000 - 4 000 (N. Greenfields, G. D. Fasman. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 1969; 8:4108-4114).
Elektroforeza
Analityczne izoelektryczne ogniskowanie i SDS-PAGE prowadzono jak uprzednio opisano (G. Franceschini, M. Sirtori, G. Gianfranceschi, C. R. Sirtori. Relation between the HDL apoproteins and Al isoproteins in subject with the Al-M abnormality. Metabolism 1981; 30:502-509).
Izoelektryczne ogniskowanie prowadzono w 10% żelach akrylamidowych, zawierających 6 M mocznika i 4% amfoliny (pH 4-6). Po całonocnym ogniskowaniu żele utrwalano i barwiono błękitem Coomassie Brilliant Blue R-250 w mieszaninie kwasu octowego i alkoholu izopropylowego. Punkt izoelektryczny (pl) pasm nieznanego białka obliczono przez wykreślenie pl znanych białek (wzorce z Bio-Rad i apo-HDL) w funkcji odpowiedniej odległości migracji.
Do SDS-PAGE stosowano 14% żele akryloamidowe zawierające 0,1% SDS. Żele traktowano jak opisano, a ciężar cząsteczkowy nieznanych białek obliczono z wykresu 10 g MW wzorcowych białek (KABI-Pharmacia) w funkcji odległości migracji.
172 544
Wysokosprawna chromatografia ekskluzyjna
Rozdzielanie metodą analitycznej HPSEC prowadzono stosując ciekły chromatograf Jasco wyposażony w 10 ^m kolumnę TSK-G3000 SW (7,5 x 300 mm). Kolumnę HPSEC zrównoważono i eluowano 0,1 M buforem fosforanowym, 0,1 M NaCl, pH 7,2, zawierającym 8 M mocznik. Białka eluowano przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. i robiono odczyty przy 220 nm. Powierzchnie pików były scałkowane za pomocą urządzenia całkującego HP-3390.
Przykład II. Wytwarzanie cząstek rHDL zawierających Apo Al,
Apo Al-M lub Apo Al-M/Apo Al-M
Rekonstytuowane cząstki lipoprotein o wysokiej gęstości (rHDL) wytworzono stosując technikę przedstawioną przez A. V. Nicholsa i in. Biochem. Biophys Acta 750: 353-364 (1983) i C. E. Matza i in. J. Biol. Chem. 257:4535-4541 (1982).
Rekombinantowy dimer Apo Al-M (z przykładu I) i normalną Apo Al, oczyszczoną z ludzkiego osocza, rozpuszczono w 10 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,01% EDTA, 0,006% NaN3, pH 8,0 (bufor A), zawierającym 4 M Gdn-HCl do stężenia 6 mg/ml. Dla porównania, wiązanie disiarczkowe w części Apo Al-M/Apo Al-M zredukowano dodatkiem 20 mM DTT do buforu A + Gdn-HCl. Białka poddano ekstensywnej dializie do buforu A i rozcieńczono do 5,2 mg/ml tym samym buforem.
Fosfolipidy, fosfatydylocholinę z jaj (EPC) lub palmitoilooleilolfosfatydylocholinę (POPC), rozpuszczono w CHCI3, wysuszono pod N2 i utrzymywano pod próżnią przez całą noc. Dodano cholanu sodu w stosunku cholan/PC = 0,55 (wag./wag.); mieszaninę energicznie mieszano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i inkubowano w 4°C przez 2 godziny. Następnie dodano białko w stosunku wagowym PC/białko 2,17 (POPC) lub 2,47 (EPC) i mieszaninę mieszano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i inkubowano w 4°C przez noc. Po dializie do buforu A przez 5 dni mieszaninę wirowano z szybkością 11 000 obr./minutę przez 5 minut w Beckman Microfuge i zebrano supematant.
Wydzielono r-HDL przez niedenaturującą elektroforezę w gradiencie żelu poliakryloaminowego (GGE), a wielkość cząstek określono jak uprzednio opisał A. V. Nichols w Meth. Enzymol. 128: 417-431 (1986).
Wszystkie badane apolipoproteiny prawie całkowicie wiązały się z lipidami po opisanej procedurze, co demonstrował bardzo mały pik apolipoproteiny wolnej od lipidów w żelach GGE. Odzysk białka w rHDL zmieniał się w granicach 68% do 100% w 10 różnych preparatach.
Profile gGe rekonstytuowanych cząstek HDL są przedstawione na fig. 4. HDL rekonstytuowane za pomocą Apo Al i EPC dawały ogólny pik w GGE ze średnicą
9,6 nm; wylaywalne były także drugorzędne składniki, zarówno o większych jak i mniejszych rozmiarach. rHDL zawierające EPC i Apo Al-M/Apo Al-M składały się z dwóch głównych składników (średnica: 8,6 i 12,9 nm) i dwóch drugorzędnych składników (średnica 7,9 i 10,8 nm); cząstki o takich samych rozmiarach otrzymano gdy Apo Al-M/Apo Al-M rekonstytuowano za pomocą POPC.
Wszystkie trzy apolipoproteiny były prawie całkowicie włączone do trwałych kompleksów lipidy-białko z cząstkami rHDL o różnej wielkości, rozkładzie i składzie. Zwłaszcza rHDL wytworzone z rekombinantowego Apo Al-M/Apo Al-M składają się z dwóch głównych składników, z których większy jest unikalny w rodzinie rHDL zawierających Apo-Al.
BIOLOGICZNA OCENA Apo Al-M/Apo Al-M
Przykład III. Zachowanie kinetyczne dimeru Apo Al-M w porównaniu z monomerem Apo Al u normalnych biorców.
172 544
Dimery wykazują przedłużoną trwałość obiegu, co zostało przedstawione poniżej w badaniach kinetycznych na ludziach.
Zdrowi ochotnicy otrzymali dożylnie Apo Al-M lub Apo Al-M/Apo Al-M znakowane 125j. Jak przedstawiono w tabeli 2 βΡ/2 (h) osocza oraz frakcyjną szybkość kataboliczną (FCR) obliczano według dwóch różnych modeli. Obydwa potwierdzają wyraźnie zmniejszony katabolizm dimeru w porównaniu z monomerem.
Bardzo powolny katabolizm Apo Al-M/Apo Al-M wskazuje, że te cząsteczki mogą szkodzić konwersji lipoprotein i prawdopodobnie działają jako skuteczny prekursor Apo Al-M. W ten sposób, przez iniekcję Apo Al-M/Apo A-M, przypuszczalnie dimer może pozostać w osoczu przez przedłużony okres, oddziaływując bezpośrednio na metabolizm lipoprotein i układ fibrynolityczny.
Tabela 2
Zachowanie kinetyczne Apo Al-M/Apo Al-M w porównaniu z monomerem Apo Al u normalnych biorców (n = 2)
| Apo Al-M | Apo Al-M/Apo Al-M | |
| Sposób jednowykładniczy | ||
| β t1/2 (h) | 16,07 | 52,04 |
| MRT(h) | 23,19 | 75,09 |
| Sposób dwuwykładniczy | ||
| β t1/2 (h) | 22,61 | 70,29 |
| MRT (h) | 28,97 | 89,16 |
| FCR | 23 % na godzinę | 1,1% na godzinę |
MRT - oznacza średni czas pozostawania leku w organizmie
Wpływ Apo Al-M/Apo Al-M na układ fibrynolityczny Wprowadzenie
Układ fibrynolityczny stanowi główną obronę przed osadzaniem fibryny na ściankach naczyń i jako taki odgrywa ważną rolę w mechanizmach, które zapobiegają zakrzepicy.
Enzymem odpowiedzialnym za lizę fibryny jest plazmina. Plazmina tworzy się z nieaktywnego poekuosora-plazmlnogenu przez działanie specyficznych aktywatorów (tkankowy aktywator plazminogenu, t-PA i urokinaza, uPA). Zarówno proces aktywacji, jak i działanie plazminy regulują specyficzne inhibitory-inhibitor aktywatora plazminogenu 1 (PAI) i alfa-2-antyplazmina, odpowiednio. Schemat układu fibrynolitycznego jest przedstawiony poniżej.
PLAZMINOGEN
PLAZMINOGEN
AKTYWATORY
---pAI
-Ϋ PLAZMINA tFIBRYNA
ANTYPLAZMINA ^FDP
FDP = Produkt degradacji fibryny
172 544
Celem badania w przykładach III-IV było stwierdzenie jak dimer Apo Al-M działa na ludzki układ fibrynolityczny. Autoaktywację plazminogenu i jego aktywację za pomocą uPA i t-PA badano w obecności i nieobecności Apo Al-M/Apo Al-M. Ludzką Apo Al wyizolowaną z osocza stosowano jako materiał kontrolny (produkt Sigmy nr A 9284).
Aktywację układu fibrynolitycznego mierzono stosując substraty chromogeniczne. Te substraty zawierają chromoforowe grupy p-nitroaniliny, które mogą być odszczepione z cząsteczki substratu przez działanie plazminy. Wolna p-NA ma intensywny żółty kolor, który można łatwo śledzić przy długości fali 405 nm. Dość uwolnionej p-NA jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonej aktywności enzymatycznej.
Wszystkie pomiary przeprowadzono stosując czytnik mikropłytkowy THERMOmax kontrolowany przez program SOFTmax™ wersja 2,01 firmy Molecular Devices, Menlo Par, CA, USA.
Materiały stosowane w tych badaniach były wytworzone metodą rekombinancji według przykładu I. Oczyszczanie obejmowało wymianę jonową, interakcję hydrofobową i chromatografię żelową i następnie ultrafiltrację i odparowywanie ze stanu zamrożenia - wszystkie konwencjonalne metody biochemiczne.
Wszystkie badane materiały zawierały 90% formy dimerycznej, jak wykazała HPLC z odwróconymi fazami., Stężenie oznaczano w próbie Kabi Pharmacia apolipoproteina Al RIA 100. Badano trzy preparaty, A, B i C.
Przykład IV. Autoaktywacja plazminogenu w obecności Apo Al-M/Apo Al-M i Apo AL
Glu-Plazminogen (94 ^g/ml - stężenie końcowe) inkubowano przez 3 godziny w 37°C w 0,1 mol/l buforze Tris, pH 7,6. Tworzenie się plazminy śledzono obserwując chromogeniczny substrat S-2251 (H-D-Val-L-Leu-Lys-pNA), z firmy Chromogenix AB, Molndal, Szwecja. Stosowano go w końcowym stężeniu 0,6 nmo/1. Plazminogeny otrzymane w tych próbach pochodziły z firmy Chromogenix AB lub IMCO Inc. Sztokholm, Szwecja.
W próbach tych badano partie Apo Al-M/Apo Al-M (stężenie końcowe 3,9 75 ^g/ml) i porównywano ilość plazminy wytworzonej w ich obecności z ilością plazminy wytworzonej w obecności Apo Al (stężenie końcowe 125 )g/ml) oraz z ilością plazminy wytworzonej w nieobecności tych dodatków (kontrolna) (tabela 3).
Nieoczekiwanie okazało się, że Apo Al-M/Apo Al-M może zwiększyć aktywację plazminogenu w nieobecności aktywatorów plazminogenu. Apo Al pochodząca z osocza nie działała na cząsteczkę plazminogenu.
Tabela 3
Samorzutne powstawanie aktywności plazminy w plazminogenie. Wpływ Apo Al-m/Apo Al-M i Apo Al. Aktywność plazminy wyrażona jako OD przy 405 nm
| Próbka | Stężenie końcowe Apo ^g/ml | OD 405 nm |
| Kontrolna | 0 | 0,052 |
| + ApoAl | 125 | 0,049 |
| + ApoAl-M/ApoAl-M | ||
| A | 75 | 0,288 |
| B | 313 | 0325 |
| B | 15,6 | 0,153 |
| B | 7,8 | 0,104 |
| B | 3,9 | 0,067 |
172 544
Obserwowaną aktywność można przypisać Apo Al-M/Apo Al-M. Jednak na podstawie tych danych nie można wykluczyć, że Apo Al-M/Apo Al-M był zanieczyszczony jakimś enzymem (enzymami) proteolitycznym, który mógł aktywować plazminogen. Przeprowadzono doświadczenia w celu wykluczenia takiej możliwości.
Wszystkie preparaty Apo Al-M/Apo Al-M stosowane w próbach fibrynolitycznych były badane z substratami chromogenicznymi: S-2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-pNA), wrażliwym na aktywność podobną do plazminy i S-2288 (H-D-He-Pro-Arg-pNA), wrażliwym na Arg-specyficzne proteazy (tabela 4). Substraty pochodziły z firmy Chromagemx AB. Stężenie końcowe Apo Al-M/Apo Al-M w próbach było takie samo jak stężenie stosowane w próbach fibrynolitycznych, mogło zatem być różne w różnych partiach.
Próba: 25 μ Apo Al-M/Apo Al-M, stężenie końcowe 60 - 70 ©ml
150 μ1 0,1 mol/l buforu Tris pH 7,8 50 μ S-2251, 0,6 mmol/l lub S-2288 1,0 mmol/l.
Próbki zawierające tylko bufor i substrat stosowano jako kontrolne dla niespecyficznej hydrolizy substratu. Wszystkie próbki badano podwójnie. Płytkę do mikromianowania inkubowano w 37°C i co godzinę odczytywano absorbancję.
Tabela 4
Amidolityczna aktywność dwóch partii Apo AL-M/Apo Al-M (A i B) po 4 godzinach inkubacji w 37°C (OD przy 405 nm)
| Apo Al-M/Apo Al-M | Substrat | |
| S-2251 A | 0,023 | 0,022 |
| B | 0,022 | |
| S-2288A | 0,037 | 0,034 |
| B | 0,037 |
W innej serii doświadczeń Apo Al-M/Apo Al-M traktowano nieodwracalnym inhibitorem proteazy seryny - fluorofosforanem diizopropylu, DEP (produkt Sigma nr D 0789). Stężenie końcowe Apo Al-M/Apo Al-M w 0,2 mol/l buforu KHCO3, pH 7,6, wynosiło około 75 ^g/ml. Do tego roztworu dodano DEP do końcowego stężenia 123 mmole1. Po 4 godzinach próbkę do inkubacji dializowano przez noc do dwóch zmian buforu węglanowego.
Oznaczenie aktywności, w warunkach takich samych, jak opisane wcześniej, prowadzono na Apo Al-M/Apo Al-M traktowanym DFP i Apo Al-M/Apo Al-M nietraktowanym. Po 3 godzinach inkubacji z plazminogenem i S-2251, OD przy 405 nm wynosiło 0,209 dla próbek zawierających ApoAl-M/ApoAl-M traktowanych DFP, 0,234 dla próbek zawierających nietraktowany ApoAl-M/ApoAl-M i 0,030 dla próbek tylko z plazminogenem.
Można zatem wyciągnąć wniosek, że obserwowane aktywowanie plazminogenu jest bezpośrednio związane z obecnością ApoAl-M/ApoAl-M, a nie z potencjalnymi zanieczyszczeniami proteolitycznymi.
Przykład V. Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na aktywację plazminogenu aktywatorami plazminogenu t-Pa i uPA.
Zarówno urokinaza (uPA) jak i tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) przekształcają plazminogen w plazminę przez proteolityczne rozszczepienie jednego wiązania peptydowego Arg 560-Val 561 w cząsteczce plazminogenu. Podczas gdy dwułańcuchowa urokinaza może aktywować plazminogen bezpośrednio, t-PA wymaga obecności fibryny dla optymalnej aktywacji plazminogenu. Obecność katalitycznych ilości fibryny, która
172 544 razem z t-PA i plazminogenem, tworzy trzeciorzędowy kompleks, zwiększa wydajność enzymatyczną t-PA około 600-krotnie.
Aktywację plazminogenu przez t-PA badano stosując handlowo dostępny zestaw Spectrolyse (fibryna) t-PA/PAI firmy Biopool, Umea, Szwecja.
W tej próbie plazminogen inkubuje się z t-PA w obecności substratu chromatograficznego D-But-CHT-Lys-pNA i desAA fibrynogenu (monomer fibryny), który działa jako stymulator aktywacji. Wytworzona plazmina rozszczepia substrat uwalniając pNA
Do tego układu dodano ApoAl-M/ApoAl-M i porównano z preparatem ApoAl firmy Sigma. Badano działanie obu apolipoprotein w układzie zarówno w obecności jak i nieobecności fibryny (tabela 5).
Przykład układu do próby: 25 μ-l buforu Spectrolyse μl preparatu Apo lub buforu μΐ t-PA (= 1,7 IU/ml - stężenie końcowe)
150 μ l odczynnika Spectrolyse PAR (= mieszanina plazminogenu i substratu) μΐ Desa fib (= monomer fibryny) lub 10 μ l buforu. Próbki inkubowano na płytkach do mikromianowania w 37°C przez 3 godziny.
Tabela 5
Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M i Apo Al na aktywację plazminogenu przez t-PA w obecności i nieobecności fibryny.
Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm po 3 godzinach inkubaqi w 37°C
| Próbka | Apo, stężenie końcowe μ©^ | OD 405 nm + fibryna | OD 405 nm - fibryna |
| t-PA kontrolna | 0 | 0,656 | 0,048 |
| + ApoAl | 54 | 1,050 | 0,066 |
| + ApoAl-M/ApoAl-M | |||
| A | 65 | 1,665 | 0,446 |
| B | 54 | 2,366 | 0,225 |
Z ApoAl-M/ApoAl-M obserwowano znaczną stymulację aktywności plazminogenu, zarówno w obecności jak i nieobecności fibryny. Apo AI-M stymulowała aktywację w mniejszym stopniu w obecności fibryny. W nieobecności fibryny stymulacja przez Apo AI-M/Apo AI-M była bardzo wyraźna w porównaniu z bardzo małą stymulacją przez Apo AI.
Apo AI-M/Apo AI-M wywierał także znacznie wzmagające działanie, gdy plazminogen był aktywowany przez uPA. Stosowana w tych próbach urokinaza była preparatem o wysokim ciężarze cząsteczkowym firmy Calbiochem.
Urokinazę (stężenie końcowe 2,5 IU/ml) mieszano z plazminogenem (stężenie końcowe 94 μg/ml) i Substratem chromogenicznym S-2251 (stężenie końcowe 0,6 mmola/l). Do tej próbki dodano ApoAl-M/ApoAl-M do końcowego stężenia 75 lub 62 μg/ml. Reakcję prowadzono w 0,1 mol/l buforze Tris, pH 7,6. Podobnie do t-PA, obserwowano silną stymulację tworzenia plazminy przez urokinazę, gdy do próby dodano ApoAl-M/ApoAl-M (tabela 6).
172 544
Tabela 6
Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na aktywację plazminogenu przez uPA Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm, po 4 godzinach inkubacji w 37°C
| Próba | ApoAl-M/ApoAl-M stężenie końcowe ^g/ml | OD 405 nm |
| uPA kontrolna | 0 | 0325 |
| + ApoAl-M/ApoAl-M | ||
| A | 75 | 1,263 |
| B | 62 | 1,868 |
Takie zwiększone oddziaływanie na fibrynolizę występuje także, gdy ApoAlM/ApoAl-M przygotowano w postaci kompozycji farmaceutycznej razem z nośnikiem. Jako potencjalny nośnik stosowano liposomy składające się z fosfatydylocholiny, PC (12 mg/ml). Stężenie ApoAl-M/ApoAl-M (partia C) w liposomach wynosiło
3,6 mg/ml.
Aktywację plazminogenu (stężenie końcowe 94 ^g/ml) przez uPA (stężenie końcowe 2,5 IU/ml) badano w obecności liposomów wypełnionych ApoAl-M/ApoAl-M i porównywano z aktywacją w obecności liposomów wolnych od białek (tabela 7). Próbki inkubowano przez 4 godziny w 37°C z S-2251 i śledzono w sposób ciągły tworzenie się plazminy.
Tabela 7
Aktywaqa plazminogenu przez uPA. Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M, seria C, w liposomach. Wyniki są wyrażone jako OD przy 405 nm
| Próbka | OD 405 nm |
| uPA + plazminogen | 0,221 |
| + liposomy wolne od białka 250^g/ml PC | 0,499 |
| + ApoAl-M/ApoAl-M 75 ^g/ml w liposomach, 250 Fg/ml PC | 1,084 |
Obecność samych liposomów stymulowała aktywację plazminogenu około dwukrotnie. Dodatek do liposomów ApoAl-M/ApoAl-M zwiększał ten efekt pięciokrotnie w porównaniu z próbką zawierającą tylko urokinazę jako aktywator.
Przykład VI. Wpływ ApoAl-M/ApoAl-M na konwersję jednołańcuchowej urokinazy w dwułańcuchową urokinazę
Jednołańcuchowa urokinaza (scuPA) jest prekursorem urokinazy dwułańcuchowej (uPA). W przeciwieństwie do uPA scuPA ma tylko bardzo niską aktywność amidolityczną wobec małych syntetycznych substratów. Aktywność amidolityczna stanowi najwyżej 0,4% aktywności uPA. Jednak scuPA, mimo iż jest proenzymem, ma zdolność aktywowania plazminogenu do plazminy. Proponowano sekwencję trzech reakcji w mieszaninach plazminogenu i scuPA, które zachodzą w aktywowaniu plazminogenu do plazminy:
1) scuPA = plazminogen - scuPA + plazmina
2) plazmina + scuPA - plazmina + uPA
3) uPA + plazminogen - uPA + plazmina
Badaliśmy sekwencję reakcji prowadzących do konwersji scuPA do uPA w obecności plazminogenu. Aktywność urokinazy wykryto za pomocą chromogenicznego substratu specyficznego wobec urokinazy S-2444 (piro-Glu-Gly-Arg-pNA, Chromogenix AB). Do układu dodawano partie ApoAl-M/ApoAl-M i ApoAl i porównywano ilość wytworzonej aktywności uPA z aktywnością otrzymaną w próbkach bez dodatku apolipoproteiny.
172 544
Stosowana w tych próbach jednołańcuchowa urokinaza była produktem firmy Grunenthal GmbH, Aachen, Niemcy (partia nr 0088808).
fil Apo lub bufor 75 ul 0,05 mola/l Tris, pH 7,6, zawierającego 0,1 mola/l NaCl i 0,02% Tween 80 μ l scuPA, 454 pmoli/l - stężenie końcowe μ l S-2444, 1 mmol/l - stężenie końcowe μ l plazminogenu, 52,1 nmoli/l - stężenie końcowe
Próbki inkubowano w 37°C przez 90 minut. Przez ostatnie 30 minut inkubacji notowano w sposób ciągły wzrost gęstości optycznej mierząc ilości wytworzonej uPA. Wyniki powyższych badań przedstawiono w tabeli 8.
Tabela 8
Wpływ ApoAl-ApoAl-M na konwersję scuPA do uPA. Wyniki są wyrażone jako mOD/min. przy 405 nm
| Próbka | Apo, stężenie końcowe μg/ml | mOD/min |
| scuPA | 0 | 0,073 |
| + plazminogen | 0 | 13,2 |
| + ApoAl | 62 | 11,8 |
| + ApoAl-M/ApoAl-M | ||
| B | 62 | 20,0 |
| A | 75 | 24,0 |
ApoAl-M/ApoAl-M stymulował konwersję scuPA do uPA w obecności plazminogenu, natomiast ApoAl wydzielona z osocza nie miała znaczącego działania w tym układzie.
Zaobserwowane działanie ApoAl-M/ApoAl-M na układ fibrynolityczny w tych badaniach było większe niż działanie ApoAl wyizolowanej z osocza. ApoAl-M/ApoAl-M ma duża zdolność do stymulowania aktywności fibrynolitycznej, przewyższającą taką właściwość ApoAl.
Podobnie stwierdzono, też zwiększony wpływ ApoAl-M/ApoAl-M w stosunku do ApoAl in vivo.
172 544
GSH / GSSG (mM / mM)
F8G. 2
172 544
FIG. 3
172 544
- A-l + EPC
-------A1M-A!M + EPC
........... AIm-SH + EPC
FIG. 4
172 544
Stężenie białka (μΜ)
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano o czystości co najmniej 90%, korzystnie co najmniej 98%, znamienny tym, że komórki E. coli transformuje się układem ekspresyjnym obejmującym gen kodujący Apolipoproteinę Al-Milano, prowadzi się hodowlę stransformowanych E. coli, podczas której wytworzony monomer i dimer Apolipoproteiny Al-Milano są wydzielane do podłoża hodowlanego, po czym monomer obecny w otrzymanej mieszaninie, składającej się głównie z dimeru i niewielkich ilości monomeru przeprowadza się w dimer i następnie oczyszcza się dimer konwencjonalnymi metodami.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że układ ekspresyjny obejmuje indukowalny promotor wybrany spośród promotorów tac i trc.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że układ ekspresyjny obejmuje wektor ekspresyjny wybrany spośród pKP576, pKP682, pKP683 i pKP764.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie za pomocą glutationu i tioreokssyny.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że monomer przeprowadza się w dimer przez utlenianie za pomocą utlenionego glutationu.
- 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się utleniony glutation w stężeniu od 0,1 do 10,0 mM.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9103701A SE9103701D0 (sv) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Apolipoprotein |
| PCT/SE1992/000858 WO1993012143A1 (en) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Dimer of molecular variant of apolipoprotein and processes for the production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL172544B1 true PL172544B1 (pl) | 1997-10-31 |
Family
ID=20384608
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92314896A PL172168B1 (pl) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano PL PL PL |
| PL92314894A PL172544B1 (pl) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Sposób wytwarzania dimeru apolipoproteiny Al-Milano PL PL PL |
| PL92300262A PL171907B1 (pl) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny AL-Milano PL PL PL |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92314896A PL172168B1 (pl) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny Al-Milano PL PL PL |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92300262A PL171907B1 (pl) | 1991-12-13 | 1992-12-11 | Sposób wytwarzania dimeru Apolipoproteiny AL-Milano PL PL PL |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5876968A (pl) |
| EP (1) | EP0571602B1 (pl) |
| JP (1) | JPH07502892A (pl) |
| AT (1) | ATE242269T1 (pl) |
| AU (2) | AU3175593A (pl) |
| BG (1) | BG61451B1 (pl) |
| BR (1) | BR9205640A (pl) |
| CA (1) | CA2103996C (pl) |
| CZ (1) | CZ289879B6 (pl) |
| DE (1) | DE69233092T2 (pl) |
| DK (1) | DK0571602T3 (pl) |
| EE (1) | EE03058B1 (pl) |
| ES (1) | ES2199939T3 (pl) |
| FI (1) | FI115771B (pl) |
| HU (2) | HU217203B (pl) |
| IL (1) | IL103956A (pl) |
| MX (1) | MX9207224A (pl) |
| NO (1) | NO315076B1 (pl) |
| NZ (2) | NZ246223A (pl) |
| PL (3) | PL172168B1 (pl) |
| PT (1) | PT571602E (pl) |
| RO (1) | RO115636B1 (pl) |
| RU (1) | RU2134696C1 (pl) |
| SE (1) | SE9103701D0 (pl) |
| SG (1) | SG47453A1 (pl) |
| SK (1) | SK86893A3 (pl) |
| WO (1) | WO1993012143A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA928989B (pl) |
Families Citing this family (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9103701D0 (sv) * | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Kabi Pharmacia Ab | Apolipoprotein |
| SE9203753D0 (sv) * | 1992-12-11 | 1992-12-11 | Kabi Pharmacia Ab | Expression system for producing apolipoprotein ai-m |
| SE9500778D0 (sv) * | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
| US6258596B1 (en) | 1995-05-22 | 2001-07-10 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc. | Variants of apolipoprotein A-I |
| FR2734568B1 (fr) * | 1995-05-22 | 1997-06-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux variants de l'apolipoproteine |
| SE9603068D0 (sv) * | 1996-08-23 | 1996-08-23 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| SE9603304D0 (sv) * | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a compound |
| SE9603303D0 (sv) | 1996-09-11 | 1996-09-11 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for purifying a protein |
| US6306433B1 (en) | 1997-08-12 | 2001-10-23 | Pharmacia Ab | Method of preparing pharmaceutical compositions |
| US20020064820A1 (en) * | 2000-03-13 | 2002-05-30 | Jean-Michel Dayer | Apo-A-I regulation of T-cell signaling |
| US6743778B2 (en) | 2000-04-21 | 2004-06-01 | Amgen Inc. | Apo-AI/AII peptide derivatives |
| BRPI0003386B8 (pt) * | 2000-08-08 | 2021-05-25 | Cristalia Produtos Quim Farmaceuticos Ltda | pró-droga homo ou heterodiméricas úteis no tratamento de doenças ou disfunções mediadas por fosfodiesterases; composições farmacêuticas contendo a pró-droga ou seus sais farmacêuticos aceitáveis; processo de obtenção destas pró-drogas |
| US8568766B2 (en) | 2000-08-24 | 2013-10-29 | Gattadahalli M. Anantharamaiah | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies associated with eye disease |
| US6664230B1 (en) * | 2000-08-24 | 2003-12-16 | The Regents Of The University Of California | Orally administered peptides to ameliorate atherosclerosis |
| EP1335938B1 (en) * | 2000-11-10 | 2010-09-22 | F. Hoffmann-La Roche Ltd. | Apolipoprotein construct |
| US7217785B2 (en) * | 2001-05-09 | 2007-05-15 | The Regents Of The University Of California | Cysteine-containing peptides having antioxidant properties |
| WO2003026492A2 (en) * | 2001-09-28 | 2003-04-03 | Esperion Therapeutics Inc. | Prevention and treatment of restenosis by local administration of drug |
| US20030229062A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-12-11 | The Regents Of The University Of California | Treatments for age-related macular degeneration (AMD) |
| JP2005511713A (ja) * | 2001-12-07 | 2005-04-28 | ザ・リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア | 加齢性黄斑変性についての処置 |
| US7470659B2 (en) * | 2001-12-07 | 2008-12-30 | The Regents Of The University Of California | Methods to increase reverse cholesterol transport in the retinal pigment epithelium (RPE) and Bruch's membrane (BM) |
| US7223726B2 (en) * | 2002-01-14 | 2007-05-29 | The Regents Of The University Of California | Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same |
| US20100204103A1 (en) * | 2002-05-08 | 2010-08-12 | The Regents Of The University Of California | Helical synthetic peptides that stimulate cellular cholesterol efflux |
| AU2003239489A1 (en) | 2002-05-17 | 2003-12-02 | Esperion Therapeutics, Inc. | Method of treating dyslipidemic disorders |
| PL374126A1 (pl) * | 2002-05-17 | 2005-10-03 | Esperion Therapeutics, Inc. | Sposoby i kompozycje do leczenia reperfuzji niedokrwiennej |
| SE0302312D0 (sv) * | 2002-10-04 | 2003-08-27 | Forskarpatent I Syd Ab | Peptide-based passive immunization therapy for treatment of atherosclerosis |
| DE10324447A1 (de) | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
| PE20050438A1 (es) * | 2003-10-20 | 2005-06-14 | Esperion Therapeutics Inc | Formulas farmaceuticas, metodos y regimenes de dosificacion para el tratamiento y la prevencion de sindromes coronarios agudos |
| WO2005051413A2 (en) * | 2003-11-26 | 2005-06-09 | Novartis Ag | Disease associated genes |
| EP1706131A4 (en) * | 2003-12-15 | 2009-08-12 | Univ California | THE CELLULAR CHOLESTEROL EFFLUX STIMULATING HELICULAR SYNTHETIC PEPTIDES |
| US8926958B2 (en) | 2004-04-06 | 2015-01-06 | Cedars-Sinai Medical Center | Prevention and treatment of vascular disease with recombinant adeno-associated virus vectors encoding apolipoprotein A-I and apolipoprotein A-I milano |
| KR100560102B1 (ko) * | 2004-06-25 | 2006-03-13 | 한국생명공학연구원 | 프로아포리포단백질 ａ－ⅰ 변이체와, 이를 포함하는고지혈증 또는 동맥경화증 예방 및 치료제 |
| US9487575B2 (en) * | 2004-07-14 | 2016-11-08 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treatment of gynecologic cancers |
| US8206750B2 (en) | 2005-03-24 | 2012-06-26 | Cerenis Therapeutics Holding S.A. | Charged lipoprotein complexes and their uses |
| SG173373A1 (en) | 2005-04-29 | 2011-08-29 | The University Of California | Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response |
| WO2007000924A1 (ja) * | 2005-06-28 | 2007-01-04 | Osaka University | プログラニュリン活性を抑制または促進する物質を含む医薬組成物、およびプログラニュリン活性を抑制または促進する物質のスクリーニング方法 |
| KR100719389B1 (ko) | 2005-10-18 | 2007-05-17 | 주식회사 녹십자 | 인간혈장으로부터 아포리포단백질 ａ-ｉ을 분리 정제하는방법 |
| US20070254832A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-11-01 | Pressler Milton L | Methods for the treatment of macular degeneration and related eye conditions |
| CA2659655A1 (en) | 2006-08-08 | 2008-02-21 | Alan M. Fogelman | Salicylanilides enhance oral delivery of therapeutic peptides |
| EP2057270A1 (en) * | 2006-08-10 | 2009-05-13 | Plantechno SRL | In-plant production of dimeric and/or oligomeric (comprising three or more units) forms of human apo a-1 protein muteins |
| US8541236B2 (en) * | 2006-12-08 | 2013-09-24 | University Of Washington | Mutant apolipoprotein A-1 polypeptide with increased resistance to oxidation and reactive carbonyls |
| JP2010538005A (ja) | 2007-08-28 | 2010-12-09 | ユーエービー リサーチ ファウンデーション | 合成アポリポ蛋白質ｅ模倣ポリペプチドおよび使用方法 |
| CA2697957A1 (en) | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Uab Research Foundation | Synthetic apolipoprotein e mimicking polypeptides and methods of use |
| US20100212030A1 (en) * | 2007-10-19 | 2010-08-19 | Pronota N.V. | Use of n-terminal and c-terminal proteomics technology to enhance protein therapeutics and diagnostics |
| JP5600065B2 (ja) | 2007-10-23 | 2014-10-01 | ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション | オキシダント耐性アポリポ蛋白質ａ−１および類似ペプチド |
| US8241861B1 (en) | 2008-07-08 | 2012-08-14 | Insilicos, Llc | Methods and compositions for diagnosis or prognosis of cardiovascular disease |
| CA3029724A1 (en) | 2008-11-10 | 2010-05-14 | Muthiah Manoharan | Lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
| EP2391343B1 (en) | 2009-01-29 | 2017-03-01 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids |
| EP2406376A1 (en) | 2009-03-12 | 2012-01-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF Eg5 AND VEGF GENES |
| CA3151387A1 (en) | 2009-05-05 | 2010-11-11 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents |
| NZ712719A (en) | 2009-06-10 | 2017-03-31 | Arbutus Biopharma Corp | Improved lipid formulation |
| AP3574A (en) | 2009-08-14 | 2016-02-08 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
| US12419839B2 (en) | 2009-10-09 | 2025-09-23 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted delivery of protein fragments |
| US10894098B2 (en) | 2012-04-09 | 2021-01-19 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted imaging |
| WO2011044545A2 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Sigalov Alexander B | Methods and compositions for targeted imaging |
| AU2010328336B2 (en) | 2009-12-07 | 2017-03-02 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
| CN102753569A (zh) * | 2009-12-14 | 2012-10-24 | 塞尔蛋白质股份有限公司 | 对纤维连接蛋白额外结构域b具有特异结合活性的修饰的泛素蛋白 |
| EP2512449B1 (en) | 2009-12-18 | 2019-08-07 | The University of British Columbia | Methods and compositions for delivery of nucleic acids |
| WO2011139911A2 (en) | 2010-04-29 | 2011-11-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated single stranded rna |
| WO2011143362A1 (en) * | 2010-05-11 | 2011-11-17 | Esperion Therapeutics, Inc. | Dimeric oxidation-resistant apolipoprotein a1 variants |
| NZ605079A (en) | 2010-06-03 | 2015-08-28 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | Biodegradable lipids for the delivery of active agents |
| WO2012016184A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| US20130202652A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-08-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
| US20130142760A1 (en) | 2010-08-18 | 2013-06-06 | Cedars-Sinai Medical Center | Atherosclerosis inhibition via modulation of monocyte-macrophage phenotype using apo a-i milano gene transfer |
| WO2012064824A1 (en) | 2010-11-09 | 2012-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of eg5 and vegf genes |
| JP5902197B2 (ja) | 2011-01-11 | 2016-04-13 | アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | Ｐｅｇ化脂質および薬剤送達のためのそれらの使用 |
| DK2673296T3 (en) * | 2011-02-07 | 2019-02-18 | Cerenis Therapeutics Holding Sa | LIPOPROTEIN COMPLEXES AND PREPARATION AND APPLICATIONS THEREOF |
| US9492572B2 (en) | 2011-06-15 | 2016-11-15 | Scil Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
| MX2014001920A (es) | 2011-08-25 | 2014-04-14 | Hoffmann La Roche | Proteina de fusion acortada de tetranectina-apolipoproteina a-i, una particula lipidica que la contiene, y usos de la misma. |
| JP6250543B2 (ja) | 2011-09-27 | 2017-12-20 | アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質 |
| US9610324B2 (en) | 2012-07-11 | 2017-04-04 | Esperion Therapeutics, Inc. | Apolipoprotein mixtures |
| EP2853259A1 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-01 | Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) | Reconstituted high density lipoproteins composition and uses thereof |
| CA2947127A1 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-19 | Cerenis Therapeutics Holding Sa | Hdl therapy markers |
| AU2015298263B2 (en) | 2014-07-31 | 2020-05-14 | Anji Pharmaceuticals, Inc. | ApoE mimetic peptides and higher potency to clear plasma cholesterol |
| JP6738340B2 (ja) | 2015-02-06 | 2020-08-12 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＮａｖｉｇｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ | 新規なｅｇｆｒ結合タンパク質 |
| ES2916101T3 (es) | 2015-07-16 | 2022-06-28 | Navigo Proteins Gmbh | Nuevas proteínas de unión a inmunoglobulina y su uso en la purificación por afinidad |
| US10584152B2 (en) | 2015-07-20 | 2020-03-10 | Navigo Proteins Gmbh | Binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation |
| CN109310780A (zh) | 2016-05-04 | 2019-02-05 | 纳维格蛋白质有限公司 | 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物 |
| EP3497117B1 (en) | 2016-08-11 | 2024-01-24 | Navigo Proteins GmbH | Novel alkaline stable immunoglobulin-binding proteins |
| WO2019030575A1 (en) | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Cerenis Therapeutics Holding | APOMÈRES |
| WO2019030574A1 (en) | 2017-08-10 | 2019-02-14 | Cerenis Therapeutics Holding | Cargomers |
| WO2019091918A1 (en) | 2017-11-07 | 2019-05-16 | Navigo Proteins Gmbh | Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
| SG11202105029WA (en) | 2018-12-18 | 2021-06-29 | Navigo Proteins Gmbh | Novel folr1 specific binding proteins for cancer diagnosis and treatment |
| AU2021256086A1 (en) | 2020-04-16 | 2022-12-15 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating acute conditions using lipid binding protein- based complexes |
| WO2022069942A2 (en) | 2020-10-01 | 2022-04-07 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes |
| WO2022219413A1 (en) | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Abionyx Pharma Sa | Use of lipid binding protein-based complexes in organ preservation solutions |
| WO2023194797A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating eye diseases using lipid binding protein-based complexes |
| KR20240171131A (ko) | 2022-04-06 | 2024-12-06 | 아비오닉스 파마 에스에이 | 지질 결합 단백질-기반 복합체를 사용하여 백혈구증가증, 내피 기능장애 및 심장염을 치료하는 방법 |
| JP2025519606A (ja) | 2022-06-10 | 2025-06-26 | アビオニクス ファーマ エスエー | 脂質結合タンパク質に基づく複合体を使用して急性状態を処置するための方法 |
| IL317448A (en) | 2022-06-10 | 2025-02-01 | Abionyx Pharma Sa | Methods for treating hyperinflammatory conditions using complexes based on lipid-binding proteins |
| CN121219001A (zh) | 2023-01-13 | 2025-12-26 | 阿比奥尼克斯制药公司 | 脂质结合蛋白分子疗法 |
| WO2025093929A1 (en) | 2023-10-31 | 2025-05-08 | Abionyx Pharma Sa | Lipid binding protein molecule therapy |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8625435D0 (en) * | 1986-10-23 | 1986-11-26 | Erba Farmitalia | Human apolipoprotein ai |
| IT1229996B (it) * | 1989-04-20 | 1991-09-20 | Cesare Sirtori | Espressione di apolipoproteina ai e apolipoproteina ai-milano in lievito e composizioni farmaceutiche che contengono dette apolipoproteine. |
| SE9103701D0 (sv) * | 1991-12-13 | 1991-12-13 | Kabi Pharmacia Ab | Apolipoprotein |
-
1991
- 1991-12-13 SE SE9103701A patent/SE9103701D0/xx unknown
-
1992
- 1992-11-20 ZA ZA928989A patent/ZA928989B/xx unknown
- 1992-12-03 IL IL10395692A patent/IL103956A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 WO PCT/SE1992/000858 patent/WO1993012143A1/en not_active Ceased
- 1992-12-11 CA CA002103996A patent/CA2103996C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-11 RU RU93054168A patent/RU2134696C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 PL PL92314896A patent/PL172168B1/pl unknown
- 1992-12-11 PL PL92314894A patent/PL172544B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 US US08/104,063 patent/US5876968A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 AU AU31755/93A patent/AU3175593A/en not_active Abandoned
- 1992-12-11 SG SG1996001800A patent/SG47453A1/en unknown
- 1992-12-11 SK SK868-93A patent/SK86893A3/sk unknown
- 1992-12-11 NZ NZ246223A patent/NZ246223A/en unknown
- 1992-12-11 AT AT93900484T patent/ATE242269T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 NZ NZ280516A patent/NZ280516A/en unknown
- 1992-12-11 DK DK93900484T patent/DK0571602T3/da active
- 1992-12-11 EP EP93900484A patent/EP0571602B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 BR BR9205640A patent/BR9205640A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-12-11 RO RO93-01116A patent/RO115636B1/ro unknown
- 1992-12-11 PL PL92300262A patent/PL171907B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 CZ CZ19931589A patent/CZ289879B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 MX MX9207224A patent/MX9207224A/es unknown
- 1992-12-11 PT PT93900484T patent/PT571602E/pt unknown
- 1992-12-11 DE DE69233092T patent/DE69233092T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-11 HU HU9302344A patent/HU217203B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-12-11 JP JP5510842A patent/JPH07502892A/ja active Pending
- 1992-12-11 ES ES93900484T patent/ES2199939T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-11 BG BG98036A patent/BG61451B1/bg unknown
- 1993-08-12 FI FI933557A patent/FI115771B/fi not_active IP Right Cessation
- 1993-08-12 NO NO19932866A patent/NO315076B1/no not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-11-16 EE EE9400375A patent/EE03058B1/xx unknown
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00630P patent/HU211667A9/hu unknown
-
1996
- 1996-07-12 AU AU59473/96A patent/AU703283B2/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-03-01 US US09/259,434 patent/US6617134B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL172544B1 (pl) | Sposób wytwarzania dimeru apolipoproteiny Al-Milano PL PL PL | |
| JP3440097B2 (ja) | ヒト／ブタハイブリッド第ｖｉｉｉ因子 | |
| Morrow et al. | Functional characterization of apolipoprotein E isoforms overexpressed in Escherichia coli | |
| Catapano et al. | Lipolysis of apoC-II deficient very low density lipoproteins: enhancement of lipoprotein lipase action by synthetic fragments of apoC-II | |
| US7223726B2 (en) | Apolipoprotein A-I mutant proteins having cysteine substitutions and polynucleotides encoding same | |
| Burbaum et al. | Assembly of a class I tRNA synthetase from products of an artificially split gene | |
| JP2000509993A (ja) | アポリポタンパク質ｂ―１００由来の抗凝血性ペプチド断片 | |
| US6432400B1 (en) | Specific pancreatic lipase inhibitors and their applications | |
| Tremblay et al. | Limited proteolysis of rat phosphatidylinositol transfer protein by trypsin cleaves the C terminus, enhances binding to lipid vesicles, and reduces phospholipid transfer activity | |
| JP3439490B2 (ja) | 蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法 | |
| Greagg et al. | Expression and kinetic characterization of barley chymotrypsin inhibitors 1a and 1b | |
| JPH07102137B2 (ja) | 修飾ヒトｐｓｔｉ | |
| JPH07126181A (ja) | 骨折の予防および治療剤 | |
| Kim et al. | Two methods for large-scale purification of recombinant human choline acetyltransferase | |
| Ahmad et al. | Human lysosomal sphingomyelinase: substrate efficacy of apolipoprotein/sphingomyelin complexes | |
| JP6207507B2 (ja) | 短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインａ−ｉ融合タンパク質、それを含む脂質粒子、及びその使用 | |
| Gaur et al. | Role of aspartic acid 121 in human pancreatic ribonuclease catalysis | |
| Lee et al. | Intermolecular ionic interaction in aggregates of a lipoprotein of the Escherichia coli outer membrane | |
| Jedlicki et al. | A protein inhibitor of calmodulin-regulated cyclic nucleotide phosphodiesterase in amphibian ovaries | |
| JP2012509670A (ja) | 血液凝固促進剤としてのヘビ第五因子及び使用方法 | |
| Ji | Structural and functional studies of the C-terminal domain of human apolipoprotein AI: Limited proteolysis and deletion mutagenesis | |
| JP2000262293A (ja) | 活性化蛋白質の製造法 | |
| JPH07309777A (ja) | 骨折の予防および治療剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20091211 |