ES2199959T3 - Procedimiento mejorado para el replegamiento de proteinas. - Google Patents

Procedimiento mejorado para el replegamiento de proteinas.

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ES2199959T3
ES2199959T3 ES94906891T ES94906891T ES2199959T3 ES 2199959 T3 ES2199959 T3 ES 2199959T3 ES 94906891 T ES94906891 T ES 94906891T ES 94906891 T ES94906891 T ES 94906891T ES 2199959 T3 ES2199959 T3 ES 2199959T3
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Hans Christian Thogersen
Thor Las Holtet
Michael Etzerodt
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Abstract

UN NUEVO METODO, GENERALMENTE APLICABLE PARA PRODUCIR CORRECTAMENTE PROTEINAS PLEGADAS A PARTIR DE UNA MEZCLA DE PROTEINAS DESPLEGADAS, POR EJEMPLO, AGREGADOS DE INCLUSION CORPORAL BACTERIAL. UN NUEVO ASPECTO PRINCIPAL DEL METODO EN QUE TODA LA EFICACIA ES REALIZADA AL SOMETER PROTEINAS A UNA SECUENCIA TEMPORAL DE CICLOS DE DESNATURALIZACIONRENATURALIZACION MULTIPLE, DANDO COMO RESULTADO LA ACUMULACION GRADUAL DE LA PROTEINA CORRECTAMENTE DOBLADA. EL METODO HA DEMOSTRADO EFICACIA PARA UNA VARIEDAD DE PROTEINAS RECOMBINANTES. ADEMAS SE PROPORCIONAN NUEVOS EMPLAZAMIENTOS DE RECONOCIMIENTO ENCRIPTADOS PARA EL FACTOR X{SUB, A} DE COAGULACION BOVINA. LOS EMPLAZAMIENTOS DE RECONOCIMIENTO ENCRIPTADOS DESCRITOS PUEDEN ACTIVARSE IN VITRO MEDIANTE OXIDACION CONTROLADA O MEDIANTE DERIVACION REVERSIBLE DE RESIDUOS DE CISTEINA Y GENERAR ASI NUEVOS EMPLAZAMIENTOS DE DISOCIACION PARA EL FACTOR X{SUB, A}. TAMBIEN SE PROPORCIONAN DOS NUEVAS PROTEASAS DE SERINA RECOMBINANTE QUE MUESTRAN ESTRECHA ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO PARA EMPLAZAMIENTOS DE RECONOCIMIENTO DEL FACTOR X{SUB, A}. PUEDEN REEMPLAZAR EL FACTOR X{SUB, A} DE COAGULACION NATURAL PARA DISOCIACION DE PROTEINAS QUIMERICAS.

Description

Procedimiento mejorado para el replegamiento de proteínas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a la tecnología del ADN recombinante y, en particular, a las tecnologías de diseño de proteínas para la producción de proteínas correctamente plegadas mediante la expresión de genes o fragmentos de genes en un organismo huésped, heterólogo u homólogo, como productos de proteína recombinante. La invención proporciona principios y procedimientos generales novedosos para el eficiente plegamiento de nuevo in vitro de proteínas mal plegadas y/o insolubles, incluyendo proteínas que contienen enlaces disulfuro. Esta invención se refiere además al plegamiento de nuevo de polipéptidos desplegados y/o mal plegados de cualquier otro origen. También se ilustran dos análogos del factor X_{a} de coagulación bovina, apropiado para aplicaciones tecnológicas, a pequeña, media y gran escala, que implican el corte específico de proteínas quiméricas en sitios diseñados para su corte por el factor X_{a}. La invención podría utilizar reactivos bloqueadores reversibles de disulfuros, útiles como compuestos auxiliares para el plegamiento de nuevo de proteínas que contienen cisteínas. También se ilustra un procedimiento de ensayo general mediante el cual pueden evaluarse tales reactivos de intercambio con disulfuros para este propósito específico.
Antecedentes generales de la invención
Las tecnologías para la producción de virtualmente cualquier polipéptido mediante la introducción, a través de procedimientos de ADN recombinante, de un fragmento de ADN natural o sintético que codifica este polipéptido particular, en un huésped apropiado ha estado bajo intenso desarrollo durante los últimos quince años, y son actualmente herramientas esenciales para la investigación bioquímica y para un cierto número de procesos industriales para la producción de productos proteicos de calidad elevada para uso biomédico y otros usos industriales.
Cuatro propiedades fundamentales de los sistemas biológicos hacen posible la producción de proteínas heterólogas:
(i)
Las propiedades funcionales de una proteína están enteramente especificadas por su estructura tridimensional, y, debido al entorno molecular en la estructura, se manifiestan mediante propiedades químicas exhibidas por partes específicas de esta estructura.
(ii)
La estructura tridimensional de una proteína está especificada, a su vez, por la información de secuencia representada por la ordenación secuencial específica de los residuos de aminoácidos en la(s) cadena(s) polipeptídica(s) lineal(es). La información de la estructura encastrada en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido es por sí misma suficiente, en condiciones apropiadas, para dirigir el proceso de plegamiento, el producto final del cual es la proteína completa y correctamente plegada.
(iii)
La secuencia lineal de residuos de aminoácidos en la cadena polipeptídica está especificada por la secuencia de nucleótidos en la región codificante del material genético que dirige el ensamblaje de la cadena polipeptídica por parte de la maquinaria celular. La tabla de traducción que gobierna la traducción de la información de la secuencia de ácido nucleico en la secuencia de aminoácidos es conocida, y es casi universal entre los organismos conocidos, y, por tanto, permite que segmentos de ácido nucleico que codifican cualquier segmento polipeptídico dirijan el ensamblaje del producto polipeptídico virtualmente a través de cualquier barrera entre especies.
(iv)
Cada tipo de organismo cuenta con su propio conjunto característico de elementos genéticos, presentes en sus propios genes, para interaccionar con la maquinaria molecular de la célula, la cual, en respuesta a factores intracelulares y extracelulares específicos, regula la expresión de un gen determinado en términos de transcripción y traducción.
Por tanto, con objeto de explotar la maquinaria de síntesis de proteínas de una célula u organismo huésped, para conseguir la producción sustancial de un producto de proteína recombinante deseado, es necesario presentar el fragmento de ADN que codifica el producto deseado, a la célula, unido a secuencias de control reconocidas por el sistema de control genético de la célula.
El destino inmediato de un polipéptido expresado en un huésped está influenciado por la naturaleza del polipéptido, la naturaleza del huésped, y los posibles estados de estrés del organismo huésped invocados durante la producción de un determinado polipéptido. Un producto de gen expresado en un nivel moderado, y similar o idéntico a una proteína normalmente presente en la célula huésped, a menudo experimentará un procesamiento normal, y su acumulación en el compartimento celular apropiado o su secreción, cualesquiera que sea el destino natural de este producto de gen endógeno. Por contra, un producto de gen recombinante que es ajeno a la célula o que se produce a niveles elevados, a menudo activa mecanismos de defensa de la célula similares a los activados por el choque térmico o la exposición a análogos tóxicos de aminoácidos, vías que han sido diseñadas por la naturaleza para ayudar a la célula a eliminar el material polipeptídico "incorrecto" mediante proteolisis intracelular controlada o mediante segregación del material polipeptídico no deseado en partículas de almacenamiento ("cuerpos de inclusión"). La proteína recombinante en estas partículas de almacenamiento a menudo se deposita en un estado agregado o de plegamiento incorrecto, en cuyo caso es necesario disolver el producto en condiciones desnaturalizantes y reductoras, y a continuación plegar el polipéptido recombinante mediante procedimientos in vitro para obtener un producto proteico útil.
La expresión de genes eucariotas en células eucariotas a menudo permite el aislamiento directo del producto del gen correctamente plegado y procesado a partir de los fluidos del cultivo celular o a partir de material recombinante. Esta estrategia se usa a menudo para obtener cantidades relativamente pequeñas de una proteína para estudios bioquímicos, y actualmente también se explota industrialmente para la producción de un cierto número de productos biomédicos. No obstante, la tecnología de expresión eucariota es cara en términos de complejidad tecnológica, costes laborales y materiales. Más aún, la escala de tiempo para la fase de desarrollo requerida para establecer un sistema de expresión es al menos de varios meses, incluso para la producción a escala de laboratorio. La naturaleza y el alcance de la modificación posterior a la traducción del producto recombinante a menudo difiere de la del producto natural porque tales modificaciones están bajo control genético indirecto en las célula huésped. Las secuencias señalizadoras que invocan una modificación posterior a la síntesis son a menudo reconocidas mutuamente entre los eucariotas, pero la disponibilidad del conjunto apropiado de enzimas de modificación está determinado por la naturaleza y el estado de la célula huésped.
Se han desarrollado una variedad de estrategias para la expresión de productos de genes en huéspedes procariotas, ventajosos respecto los huéspedes eucariotas en términos de requisitos de capital, laborales y materiales. A menudo se prefieren cepas de la eubacteria Escherichia coli como células huéspedes puesto que E. coli está mucho mejor caracterizada genéticamente que cualquier otro organismo, también a nivel molecular.
Las células huésped procariotas no poseen la maquinaria enzimática requerida para llevar a cabo la modificación posterior a la traducción, y, por tanto, un producto de gen eucariota necesariamente será producido en su forma no modificada. Más aún, el producto debe sintetizarse con una extensión N-terminal, al menos un residuo metionina adicional que surge del codón de inicio de la traducción requerido, más a menudo también incluye un segmento N-terminal correspondiente al de una proteína del huésped altamente expresada. Se han descrito procedimientos generales para suprimir tales extensiones N-terminales mediante proteolisis específica para la secuencia, en segmentos de engarce insertados en la unión entre la extensión N-terminal y el producto polipeptídico deseado. ("Enterokinase-cleavable linker sequence": EP-035.384, The Regents of the University of California; "Factor X_{a}-cleavable linker sequence": EP-161.937, Nagai & Thoegersen, Assignee: Celltech Ltd.).
A lo largo de los años, se ha dirigido un esfuerzo considerable al desarrollo de estrategias de expresión heteróloga en procariotas para generar productos proteicos recombinantes en una forma soluble, o construcciones de proteína de fusión que permitan la secreción desde la célula en una forma activa, posiblemente una forma procesada de forma N-terminal, un esfuerzo que ha resultado en sólo un éxito limitado, a pesar de los desarrollos recientes en el campo de las chaperoninas. Típicamente, se requiere mucho tiempo y esfuerzo para desarrollar y modificar un sistema de expresión antes de que pueda aislarse incluso una pequeña cantidad de producto de proteína de fusión correctamente plegada y soluble. Más a menudo, la totalidad del producto polipeptídico se deposita dentro de la célula huésped en un estado de plegamiento incorrecto en "cuerpos de inclusión". Esto es particularmente cierto cuando se expresan proteínas eucariotas que contienen puentes disulfuro.
Todos los procedimientos disponibles para el plegamiento de nuevo in vitro de proteínas describen procesos en los que la proteína en solución o adsorbida no específicamente sobre resinas de intercambio iónico, etc., se expone a un solvente, la composición del cual se cambia gradualmente, en un único paso, a lo largo del tiempo desde fuertemente desnaturalizante (y posiblemente reductor) hasta no desnaturalizante. Esto se lleva a cabo a menudo diluyendo una solución concentrada de proteína que contiene hidrocloruro de guanidina 6-8 M o urea en un volumen sustancial de agente no desnaturalizante, o mediante diálisis de un solución diluida de la proteína en el tampón desnaturalizante frente al agente no desnaturalizante. Se han descrito numerosas variante de este procedimiento básico, incluyendo la adición de ligandos específicos o cofactores de la proteína activa, y la incorporación de sustancias poliméricas como el óxido de polietileno (polietilenglicol), que se cree estabilizan la estructura plegada.
Aunque se han hallado variantes eficientes del procedimiento de plegado de nuevo in vitro estándar para un cierto número de productos proteicos específicos, incluyendo proteínas que contienen uno o más puentes de disulfuro, los rendimientos del plegamiento son muy a menudo pobres, y el escalado hacia arriba no es practicable y es caro debido a la baja solubilidad de las proteínas más incompletamente plegadas, lo que implica el uso de volúmenes excesivos de solvente.
La característica común de todos los protocolos de plegamiento de nuevo in vitro es que el plegamiento inducido por la reducción repentina o gradual del desnaturalizante se realiza como una operación de un único paso, el rendimiento de la cual se considera a continuación como el mejor que puede obtenerse para la proteína en cuestión.
El campo general del plegamiento de proteínas ha sido resumido en un reciente libro de texto editado por Thomas W. Creighton ("Protein Folding", editor Creighton, T.E., Freeman, 1992), y una revisión más específica de procedimientos prácticos para el plegamiento de nuevo de proteínas fue publicada en 1989 por Rainer Jaenicke y Rainer Rudolph (p. 191-223 en "Protein Structure, A Practical Approach", editor T.E. Creighton, IRL Press, 1989). Entre las numerosas publicaciones más detalladas, podrían consultare revisiones del estado de la técnica como los de Schein (Schein, C.H., 1990, Bio/Technology 8:308-317) o Buchner y Rudolph (Buchner, J. y Rudolph, R., 1991, Bio/Technology 9:157-162).
En conclusión, hay una necesidad definitiva de procedimientos de rendimiento elevado, aplicables de forma general, para el plegamiento de nuevo de proteínas no plegadas o plegadas incorrectamente derivadas de varias fuentes, tales como sistemas de expresión en procariotas o síntesis de péptidos.
Resumen de la invención
Los inventores han hallado que los rendimientos del plegamiento de nuevo pueden incrementarse enormemente tomando en consideración que el proceso de plegamiento de una proteína es un proceso controlado cinéticamente, y que la interconversión entre los confórmeros plegado, desplegado y plegado incorrectamente de la proteína está sometido a fenómenos de histéresis y dependientes del tiempo que pueden explotarse para diseñar un proceso de desnaturalización-renaturalización cíclico, en el cual el producto proteico plegado de nuevo se acumula de forma creciente en cada ciclo a expensas de los confórmeros desplegado y plegado incorrectamente, para generar un nuevo proceso de plegado de nuevo con un potencial mucho mayor que el de la estrategia básica tradicional.
Con el término "proteína plegada" se indica un polipéptido en (a) estado(s) conformacional(es) correspondien-
te(s) al o a los que ocurren en la proteína en su forma biológicamente activa, o intermediarios estables únicos que en pasos subsiguientes podrían convertirse para generar las especies biológicamente activas. La estructura covalente de la proteína plegada en términos de entrecruzamiento entre pares de residuos cisteína en el polipéptido es idéntica a la de la proteína en su forma biológicamente activa.
En consecuencia, el término "proteína desplegada" se refiere a un polipéptido en estados conformacionales menos compactos y menos bien definidos que aquél o aquéllos correspondientes a la proteína en su forma biológicamente activa, por tanto, plegada. La estructura covalente de las proteína desplegada en términos de entrecruzamiento entre pares de residuos cisteína en el polipéptido podría ser o no idéntica a la de la proteína en su forma biológicamente activa. Estrechamente relacionada con una proteína desplegada, existe una proteína "plegada incorrectamente", la cual es un polipéptido en un estado conformacional que es virtualmente termodinámicamente estable, a veces incluso más que el estado o los estados correspondientes a la proteína en su forma plegada, pero que no presenta el mismo grado, si es que presenta alguno, de actividad biológica que la proteína plegada. Como es el caso para la proteína desplegada, la estructura covalente en términos de entrecruzamiento entre pares de residuos de residuos cisteína en el polipéptido podría ser o no la misma que la de la proteína plegada.
Con el término "proteína plegada de nuevo" se quiere indicar un polipéptido que ha sido convertido desde un estado desplegado hasta conseguir su conformación biológicamente activa y su estructura covalente en términos de entrecruzamiento entre pares correctos de residuos de residuos cisteína en el polipéptido
La nueva estrategia de plegamiento de nuevo de proteínas generalmente aplicable ha sido diseñada en base a las siguientes propiedades generales de la estructura de la proteína.
(a)
La baja solubilidad de las proteínas desplegadas expuestas a solventes no desnaturalizantes refleja una fuerza directora principal que induce al polipéptido bien a formar la estructura compacta correctamente plegada de nuevo, bien a generar agregados o precipitados de punto final, los cuales son incapaces de plegarse de nuevo y generar la estructura correctamente plegada de nuevo bajo condiciones no desnaturalizantes en una cantidad de tiempo razonable.
(b)
Un agregado de punto final recién formado se "desnaturaliza" más fácilmente, esto es, se convierte en una forma desplegada, que la proteína plegada de nuevo, puesto que la estructura del agregado de punto final está más desordenada. Probablemente, el plegamiento incorrecto es también en general un proceso controlado cinéticamente.
(c)
Una proteína desplegada a menudo no es capaz (o sólo muy lentamente) de plegarse de nuevo en la forma plegada correctamente a partir de los niveles de desnaturalizante requeridos para desnaturalizar los agregados de punto final en un período de tiempo razonable.
(d)
El conjunto de evidencias disponibles para apoyar (b) incluye estudios detallados de vías de plegamiento y de desplegado, y de intermediarios de varias proteínas modelo. Es también ilustrativa la observación, realizada en muchas proteínas unidas por disulfuro, de que la estabilidad de los puentes de disulfuro, frente a la reducción a concentraciones limitantes de agentes reductores y desnaturalizantes, es a menudo significativamente diferente para cada puente disulfuro en una proteína determinada, y de que los puentes de disulfuro en la proteína plegada son a menudo mucho menos proclives a la reducción o intercambio de disulfuro que los puentes de disulfuro "no nativos" en una proteína desnaturalizada o en un agregado proteico.
La nueva estrategia para un procedimiento de plegamiento de nuevo se ilustra mucho más fácilmente por medio del siguiente ejemplo teórico:
Consideremos una proteína hipotética -plegada establemente en un tampón "A" no desnaturalizante y establemente desplegada en un tampón "B" fuertemente desnaturalizante (siendo, por ejemplo, un tampón que contiene guanidina-HCl 6 M)- expuesta al tampón A o al tampón B, y sometida a continuación a la incubación con niveles intermedios de desnaturalización en mezclas de A y B.
Los niveles entre, por ejemplo, el 100-75% de B conducen a la conversión de ambas, la proteína plegada y la proteína agregada de punto final, a la forma desplegada en un período de tiempo corto.
Los niveles entre, por ejemplo, el 75-50% de B conducen a la conversión del agregado de punto final recién formado a la forma desplegada, mientras que casi toda la proteína plegada de nuevo permanece en una estructura similar a la nativa, estable al menos durante un período de tiempo de horas, a partir de la cual podría saltar hacia la forma plegada de nuevo a partir de la supresión del desnaturalizante.
Los niveles superiores al 10% de B impiden la formación rápida de la forma plegada de nuevo a partir de la forma desplegada.
Una paso de composición de solvente desde el 100% de B hasta el 0% de B convierte la proteína desplegada en un agregado de punto final (rendimiento del 75%) y en proteína plegada de nuevo (rendimiento de 25%).
Sometamos ahora una muestra de esta proteína, inicialmente en su forma desnaturalizada en 100% de B, a una serie temporal programada de ciclos de desnaturalización-renaturalización tal como se ilustra en la Figura 1, consistente cada uno en un fase de renaturalización (F_{n}) (< 10%B) y una fase de desnaturalización (D_{n}). Al final de la fase de renaturalización del ciclo (i) el contenido de desnaturalizante se cambia a un nivel, k_{i} % inferior que el nivel de desnaturalizante en el ciclo previo. A continuación de una breve incubación, se retira de nuevo el desnaturalizante, y se entra en la siguiente fase de renaturalización F_{i+1}. Asumiendo que el nivel de desnaturalización empieza con un 100% de B, y k_{i} para cada ciclo se fija en un 4%, esta receta generará una serie atenuada de "pasos de desnaturalización" que finalizará transcurridos 25 ciclos.
A través de los 25 ciclos, tal como se ha detallado más arriba, la acumulación de proteína plegada de nuevo progresa tal como sigue:
En los ciclos 1 a 5 la totalidad de la proteína, plegada así como plegada incorrectamente, pasará a estar desplegada en cada una de las fases de desnaturalización D_{n}.
En los ciclos 7 a 12: los agregados de punto final se convertirán en proteína desplegada en cada paso, mientras que la proteína recuperable como producto plegado de nuevo se acumulará, ciclo a ciclo, en las cantidades siguientes: 25%, 44%, 58%, 68%, 76% y 82%.
No habrá más conversiones a lo largo de los ciclos 13 a 25.
El proceso de plegamiento de nuevo cíclico produciría por tanto un rendimiento de plegamiento de nuevo de más del 80%, mientras que la renaturalización en un paso tradicional obtendría en el mejor de los casos un rendimiento del 25%.
Se apreciará que se han hecho un número elevado de aproximaciones que simplifican, en términos de graduación o todo o nada de cada característica de los diversos estados conformacionales de la proteína hipotética. El principio de trabajo básico, no obstante, permanece similar si se incorporan en el modelo un conjunto más complicado de suposiciones.
La preparación de unas condiciones para establecer un proceso de plegamiento de nuevo de desnaturalización/rena-
turalización cíclica de proteínas puede concebirse de muchas maneras.
La proteína en solución podría, por ejemplo, mantenerse en un aparato de ultrafiltración, mantenerse en un aparato de diálisis, o estar confinada en una de las fases de un sistema de dos fases acuoso apropiado, la totalidad de los cuales permitiría que la concentración de solutos químicos de bajo peso molecular en la solución de proteína fuera controlada por aparatos apropiados.
Alternativamente, la proteína podría estar adsorbida sobre una superficie apropiada y en contacto con una fase líquida, la composición de la cual podría controlarse según fuera necesario. Una superficie apropiada podría ser, por ejemplo, un aparato de filtración, un aparato de fibra hueca, o un medio de cromatografía en forma de cuentas. La adsorción de la proteína sobre la superficie podría estar mediada por interacciones no específicas, por ejemplo, tal como se describe en WO-86/05.809 (Thomas Edwin Creighton), mediante enlaces covalentes, compatibles con el plegamiento, entre la superficie y la proteína, o a través de diseños específicos de asas de afinidad en un derivado recombinante de la proteína que presenta una afinidad específica y resistente a la desnaturalización por una superficie convenientemente derivada.
La implementación específica del proceso, de plegamiento de nuevo de la proteína mediante desnaturalización/re-
naturalización cíclica, establecido para investigar el potencial del procedimiento general se basó en un diseño de proteínas híbridas que podían cortarse (EP-161.937, Nagai & Thoegersen, asignada a Celltech, Ltd.), y que contenían un módulo asa afín a metales (EP-0.282.042 (Heing Döbeli, Bernhard Eggirmann, Reiner Gentz, Erich Hochuli; Hoffmann-La Roche)) insertado de forma N-terminal respecto al sitio de corte del factor X_{a} diseñado. Las proteínas recombinantes con este diseño general, adsorbidas sobre cuentas de agarosa quelantes de níquel, podrían someterse a continuación al proceso actual de plegamiento de nuevo cíclico en un "reactor de plegamiento de nuevo" de columna cromatográfica, perfundidas con una mezcla de tampones desnaturalizantes y no desnaturalizantes apropiados, suministrados mediante un conjunto de bombas calibradas, cuyas velocidades de flujo se programó temporalmente a través de un control computarizado.
Un esquema general de plegamiento de nuevo en estado sólido implica reciclar la proteína inmovilizada tal como se ha detallado más arriba, o mediante cualesquiera otros medios e implementaciones, entre las condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes, de una manera progresiva, en la que la concentración del agentes desnaturalizante se reduce gradualmente, desde valores iniciales elevados hasta cero, a lo largo de un tren de muchos ciclos de desnaturalización-renaturalización. Usando esta estrategia no es necesario determinar precisamente que concentración desnaturalizante limitante se requiere para obtener un enriquecimiento del rendimiento del plegamiento en el curso del ciclo de la proteína específica, puesto que el tren progresivo de ciclos transcurrirá a través de (hasta) tres fases, una fase temprana en la que el producto plegada presente al final del ciclo (i) está completamente desnaturalizado en el paso de desnaturalización del ciclo (i+1), una fase productiva intermedia durante la cual la proteína plegada de nuevo se acumula en cantidad creciente, y una fase tardía durante la cual la concentración de desnaturalizante es demasiado baja como para perturbar la proteína plegada de nuevo o cualesquiera estructuras mal plegadas restantes. Someter la proteína a una serie progresiva de ciclos de desnaturalización-renaturalización tal como se ha detallado incluirá, por tanto, varios ciclos productivos.
Para la proteínas que contienen disulfuros, el ciclo de desnaturalización-renaturalización progresivo podría mejorarse usando equipamiento similar al equipamiento de cromatografía avanzada, con accesorios en línea para monitorizar las composiciones del tampón del eluyente del reactor de plegamiento. La información sobre la composición del eluyente con respecto al perfil de concentración de reactivo reductor y de desplazamiento del disulfuro, revelaría el ciclo productivo, y podría usarse por tanto como entrada para una unidad de procesamiento inteligente, que a su vez regularía la progresión de la concentración del desnaturalizante en un bucle de retroalimentación, para asegurar que la mayor parte del esfuerzo de los ciclo se invierte en la fase productiva del tren de ciclos de desnaturalización-renaturalización. Tal auto-optimización de las condiciones de ciclo sería posible porque el sistema analítico se usaría para medir el alcance y la dirección de los cambios en el equilibrio redox en la corriente de tampón, mediciones que reflejan directamente la valoración de los grupos tiol/equivalentes de disulfuro en la muestra de proteína inmovilizada, y es por tanto directamente traducible en un número promedio de puentes de disulfuro rotos o formados durante las diversas fases del ciclo.
Otras entradas posibles, para el procesador inteligente que controla la progresión de los ciclos, incluyen las mediciones de unión de ligando, la conversión de sustrato, la capacidad de unión de anticuerpos, y, además, cualquier otro agente soluble que interaccione de distinta forma con la proteína plegada incorrectamente o la proteína plegada, el cual, en la etapa de verificación de la medición del plegamiento podría hacerse circular a través del reactor de plegamiento de nuevo, y a continuación monitorizarse en línea en el eluyente mediante aparatos analíticos apropiados.
Además, un sistema de control y monitorización inteligente podría usar la información disponible para dirigir porciones utilizables de eluyente del reactor hacia subsistemas de salvamento/reciclado, minimizando por tanto los gastos de las operaciones a gran escala.
Después de la ejecución del procedimiento de plegamiento de nuevo, el producto final podría, eluirse desde la matriz de afinidad en una forma concentrada, procesarse para liberar la proteína auténtica madura mediante corte en el sitio de corte con proteasas diseñado, y someterse a continuación a su preparación final usando técnicas estándares de purificación y manipulación de proteínas, bien conocidas dentro del campo de la química de proteínas.
Descubrimiento detallado de la invención
Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para generar un conjunto procesado de moléculas polipeptídicas, conjunto procesado en el que los estados conformacionales representados contienen una fracción sustancial de moléculas polipeptídicas en una particular conformación de plegamiento, a partir de un conjunto inicial de moléculas polipeptídicas que tienen la misma secuencia de aminoácidos que el conjunto procesado de moléculas polipeptídicas, conjunto inicial en el que los estados conformacionales representados contienen una fracción sustancial de moléculas polipeptídicas en conformaciones desplegadas o plegadas incorrectamente, comprendiendo el procedimiento someter el conjunto inicial de moléculas polipeptídicas a una serie de al menos tres ciclos sucesivos, cada uno de los cuales comprende una secuencia de:
1)
al menos un paso desnaturalizante que comprende condiciones que ejercen una influencia desnaturalizante y/o de desplegado sobre las moléculas polipeptídicas del conjunto, para así desnaturalizar y/o desplegar una fracción de los polipéptidos en el conjunto, seguido por
2)
al menos un paso de renaturalización que comprende condiciones que tienen una influencia renaturalizante sobre las moléculas polipeptídicas que tienen conformaciones resultantes del paso precedente, para así renaturalizar una fracción de los polipéptidos desnaturalizados y/o desplegados en el conjunto,
estando adaptada la serie, de los al menos tres ciclos sucesivos, de forma que las condiciones en al menos un paso desnaturalizante conducen a la desnaturalización y/o desplegado de una proporción menor de los polipéptidos en el conjunto que en un paso anterior en la serie, y que el conjunto procesado de las moléculas polipeptídicas tiene una fracción más elevada de moléculas polipeptídicas en la conformación plegada particular que,
a) el conjunto inicial, y
b) un conjunto inicial correspondiente que haya sido sometido sólo a uno de los ciclos.
En la presente especificación y reivindicaciones, el término "conjunto" se usa en el sentido que ha adquirido en la técnica, esto es, designa una colección de moléculas que tienen características comunes esenciales. Inicialmente ("un conjunto inicial"), tienen al menos su secuencia de aminoácidos en común (y por supuesto, retienen esta característica común). Cuando el conjunto de moléculas polipeptídicas ha sido tratado en el procedimiento de la invención (para resultar en "un conjunto procesado"), los estados conformacionales representados en el conjunto contendrán una fracción sustancial de moléculas polipeptídicas con una conformación determinada. Tal como se comprenderá a partir de la discusión que sigue, la fracción sustancial de moléculas polipeptídicas con una conformación particular en el conjunto procesado podría variar dependiendo de los parámetros de tratamiento por el procedimiento de la invención, el tamaño de la proteína en la conformación particular, la longitud e identidad de la secuencia de aminoácidos de las moléculas, etc. En los ejemplos descritos en ésta, en los que los parámetros del proceso de se han optimizado todavía, la fracción de moléculas con una determinada conformación varió entre el 15% y el 100% del conjunto, lo que en todos los casos está por encima de lo que podía obtenerse antes de la presente invención. En el Ejemplo 13 se demuestra además que la purificación de las moléculas de polipéptido antes de someterlas al procedimiento de la invención incrementa la fracción de moléculas de polipéptido con una conformación particular.
"Paso desnaturalizante" se refiere a la exposición de un conjunto de moléculas polipeptídicas durante un intervalo de tiempo a circunstancias químicas y/o físicas que someten el conjunto de moléculas de polipéptido a condiciones caracterizadas por un poder desnaturalizante más intenso que aquéllos que caracterizan las condiciones inmediatamente previas al paso de desnaturalización.
En consecuencia, el término "pasos de renaturalización" se refiere a la exposición de un conjunto de moléculas de polipéptido durante un intervalo de tiempo a circunstancias físicas y/o químicas que someten el conjunto de moléculas de polipéptido a condiciones caracterizadas por un poder desnaturalizante menos intenso que aquéllos que caracterizan las condiciones inmediatamente previas al paso de desnaturalización.
Se entenderá que la "fracción sustancial" mencionada más arriba dependerá en su magnitud del conjunto de moléculas polipeptídicas que son sometidas al procedimiento de la invención. Si el conjunto procesado de polipéptidos consiste en proteínas monoméricas de longitudes relativamente cortas y sin puentes disulfuro intramoleculares, el procedimiento resultará de forma general en rendimientos muy elevados, mientras que moléculas más complicadas (tales como proteínas poliméricas que una complicada topología de puentes disulfuro) podría resultar en rendimientos más bajos, incluso si las condiciones del procedimiento de la invención están totalmente optimizadas.
Un aspecto interesante de la invención se refiere a un procedimiento, descrito más arriba, en el cual el conjunto procesado comprende una fracción sustancial de moléculas de polipéptido en un estado conformacional, constituyendo la fracción sustancial al menos el 1% (p/p) del conjunto inicial de moléculas polipeptídicas. Se prefieren los rendimientos más elevados, tales como al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, y al menos el 25% del conjunto inicial de moléculas de polipéptido. Son más preferidos los rendimientos de al menos el 30%, tales como al menos el 40%, 50%, 60%, 70%, y al menos el 80%. Son especialmente preferidos los rendimientos de la menos el 85%, tales como el 90%, 95%, 97%, e incluso del 99%. A veces se observan rendimientos cercanos al 100%.
Cuando las moléculas polipeptídicas del conjunto contienen cisteína, el conjunto procesado comprenderá una fracción sustancial de moléculas del polipéptido en una conformación uniforme particular, la cual además tendrá una topología de puentes de disulfuro sustancialmente idéntica.
En la mayoría de los casos, las moléculas de polipéptido sometidas al procedimiento de la invención serán moléculas que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido auténtico, o moléculas que comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un polipéptido auténtico unido a uno o dos segmentos polipeptídicos adicionales.
Mediante el término "polipéptido o proteína auténtico" se quiere indicar un polipéptido con una estructura primaria, incluyendo las estructuras N- y C-terminales, idénticas a las de la correspondiente proteína natural. El término también describe un polipéptido que tiene una estructura primaria conocida, la cual no es necesariamente idéntica a la de una proteína natural, cuyo polipéptido es el producto final deseado de una síntesis proteica.
Mediante el término "proteína natural" se quiere indicar una proteína tal como se aísla en su forma biológicamente activa a partir de un organismo, en el cual está presente no como consecuencia de una manipulación genética.
Por contra, el término "proteína o polipéptido artificial", tal como se usa en la presente especificación y reivindicaciones, se pretende que se refiera a una proteína/polipéptido que no está disponible en fuente natural alguna, es decir, no que puede aislarse y purificarse a partir de una fuente natural. Por tanto, una proteína/polipéptido natural es el resultado de la intervención humana, y podría, por ejemplo, ser un producto de la manipulación de ADN recombinante o una forma de síntesis peptídica in vitro. De acuerdo con las definiciones anteriores, una proteína artificial tal podría ser una proteína auténtica, pero no una proteína natural.
Por tanto, la invención también se refiere a un procedimiento en donde las proteínas naturales, así como las proteínas artificiales, ser someten a los procesos de plegamiento de nuevo descritos en ésta.
Tal como se explicará con más detalle más abajo, podría ser ventajoso, por varias razones, que el polipéptido auténtico se uniera a segmentos polipeptídicos que tuvieran funciones auxiliares durante el ciclo y otros procesamientos previos o subsiguientes, por ejemplo, como "asas" para unir el polipéptido a un portador, como modificadores de la solubilidad, como amplificadores de la expresión, los cuales habrán ejercido su función beneficiosa durante la traducción del ARN mensajero, etc. Tal segmento polipeptídico auxiliar se unirá preferiblemente a un polipéptido a través de una unión cortable, y cuando dos de tales segmentos polipeptídicos auxiliares estén unidos al polipéptido auténtico, esto podría conseguirse mediante uniones cortables similares, las cuales normalmente se cortarán de forma simultánea, o a través de uniones cortables distintas, las cuales podrían cortarse en cualquier secuencia temporal.
De acuerdo con lo que se explica más arriba, se cree que una característica novedosa principal de la presente invención es que el ciclado (el cual, tal como se ha explicado más arriba, comprende al menos dos ciclos sucesivos) dará lugar al menos a un suceso en el que un paso de renaturalización está seguido por un paso desnaturalizante, en donde al menos una fracción sustancial de los polipéptidos plegados de nuevo se desnaturalizarán otra vez.
En la mayoría de los casos, el procesamiento comprenderá al menos 5 ciclos, y más a menudo al menos 8 ciclos, tales como al menos 10 ciclos y, en algunos casos, al menos 25 ciclos. Por otra parte, las series de ciclos normalmente no excederán de 2000 ciclos, y a menudo comprenderán como mucho 1000 ciclos, y más a menudo como mucho 500 ciclos. El número de ciclos usado dependerá, en parte, de las posibilidades puestas a disposición por el equipamiento en el que se realiza el ciclado.
Por tanto, si el tratamiento de ciclado se realiza con las moléculas de polipéptido inmovilizadas sobre una columna de portador, tal como se explicará con mayor detalle más abajo, la velocidad con que puede intercambiarse la fase líquida en contacto con la columna constituirá un límite de lo que puede conseguirse de forma realista. Por otra parte, el equipamiento de cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC) permitirá un intercambio muy rápido del entorno líquido, y hará que sean realistas números de ciclos en el rango de cientos o miles.
Otras consideraciones para determinar el número deseable de ciclos son, por ejemplo, los parámetros cinéticos inherentes tales como la interconversión entre isómeros cis y trans en residuos de prolina, los cuales tienden a complicar la redistribución a lo largo de los estados parcialmente plegados, y, por tanto, requerirá una consideración de los tiempos. Otra característica crítica para el tiempo reside en la cinética de reordenación de disulfuro (consultar la discusión de más abajo sobre los sistemas de reordenación de puentes disulfuro).
Con la debida consideración a lo anterior, las series de ciclado comprenden a menudo 200 ciclos como mucho, más a menudo 100 ciclos como mucho, y todavía más a menudo 50 ciclos como mucho.
De acuerdo con lo que se afirma más arriba, la duración de cada paso desnaturalizante podría ser una duración que, bajo las condiciones particulares en cuestión, es al menos de un milisegundo, y como mucho de una hora, y la duración de cada paso de renaturalización podría ser una duración que, bajo las condiciones en cuestión, es de al menos 1 segundo, y como mucho de 12 horas.
En la mayoría de las realizaciones, las condiciones desnaturalizantes de cada paso desnaturalizante individual se mantienen sustancialmente constantes durante un cierto período de tiempo, y las condiciones renaturalizantes de cada paso de renaturalización individual se mantienen sustancialmente constantes durante un cierto período de tiempo, estando separados los períodos de tiempo durante los cuales la condiciones se mantienen prácticamente constantes por períodos de transición durante los cuales se cambian las condiciones. El período de transición entre pasos en los las condiciones se mantienen sustancialmente constantes podrían tener una duración variable a lo largo de un amplio rango, tal como entre 0,1 segundos y 12 horas, y normalmente estará estrechamente adaptado a las duraciones de los pasos apropiados de desnaturalización y renaturalización.
Teniendo esto presente, el período de tiempo durante el cual las condiciones desnaturalizantes de un paso desnaturalizante se mantienen sustancialmente constantes podría, por ejemplo, tener una duración de al menos un milisegundo y como mucho de una hora, a menudo como mucho 30 minutos, y el período de tiempo para el cual las condiciones de renaturalización de un paso de renaturalización se mantienen sustancialmente constantes tiene una duración de al menos 1 segundo y como mucho 12 horas, y a menudo como mucho 2 horas.
En la práctica, el período de tiempo durante el cual las condiciones desnaturalizantes de un paso de desnaturalización se mantienen constantes tendrá a menudo una duración de entre 1 y 10 minutos, y el período de tiempo durante el cual las condiciones de renaturalización de un paso de renaturalización se mantienen constantes tendrá a menudo una duración de entre 1 y 45 minutos.
A partir de lo anterior se comprenderá que deberían hacerse ajustes a los intervalos indicados más arriba, tomando en consideración el cambio de cinéticas resultante del cambio en las condiciones físicas a las que están sometidos los polipéptidos. Por ejemplo, la presión podría ser muy elevada (hasta 5000 bares) cuando se usa un sistema de HPLC al realizar el procedimiento de la invención, y bajo tales circunstancias podrían conseguirse y/o ser necesarios pasos muy rápidos. Además, como puede observarse a partir de los ejemplos, el parámetro temperatura es importante, puesto que ciertas proteínas sólo se pliegan de nuevo correctamente a temperaturas lejanas del rango fisiológico. Por supuesto, tanto la temperatura como la presión tienen un efecto sobre las cinéticas del proceso de plegamiento de nuevo de la invención, y, por tanto, los intervalos de tiempo arriba indicados para los pasos de renaturalización y desnaturalización son límites realistas para las muchas posibles realizaciones de la invención.
Para una utilización determinada del procedimiento de la invención, la persona formada será capaz de determinar condiciones apropiadas basándose en, por ejemplo, experimentos preliminares.
Tal como se ha indicado más arriba, las moléculas de polipéptido normalmente están en contacto con una fase líquida durante los pasos de desnaturalización y renaturalización, siendo normalmente la fase líquida una fase acuosa. Esto quiere decir que cualesquier reactivos o sustancias auxiliares usadas en el procedimiento normalmente se disolverán en la fase líquida, normalmente en la fase acuosa. No obstante, si conviene, la fase líquida podría estar constituida por uno o más solventes orgánicos.
En conexión con la renaturalización de proteínas, es bien conocido el uso de las denominadas "chaperoninas" o "complejos de chaperoninas". Las chaperoninas son un grupo de proteínas recientemente descrito que presentan la característica común de tener la capacidad de mejorar el plegamiento de nuevo de proteínas desplegadas o parcialmente desplegadas. A menudo, la chaperoninas son complejos multimoleculares. Muchas de estas chaperoninas son proteínas de choque térmico, lo que significa que in vivo están sirviendo como factores que realizan la "reparación" post-traumática de proteínas que han sido desestabilizadas por el trauma. Para ser capaces de cumplir esta función, las chaperoninas tienden a ser más estables a los sucesos traumáticos que muchas otras proteínas y complejos de proteínas. Aunque el procedimiento de la invención no depende del uso de una molécula chaperonina o de un complejo de molécula chaperonina, es, por supuesto, posible tener una molécula chaperonina o complejo molecular de chaperonina presente durante al menos un paso de renaturalización, y podría ser preferible tener una molécula de chaperonina o un complejo molecular de chaperonina presente durante sustancialmente todos los ciclos.
Tal como se ha mencionado más arriba, las moléculas de polipéptidos están preferiblemente sustancialmente confinadas a un entorno que permite cambiar o intercambiar la fase líquida sustancialmente sin arrastrar las moléculas de polipéptido. Esto puede conseguirse de cierto número de formas. Por ejemplo, las moléculas de polipéptido podrían estar contenidas en un aparato de diálisis, o podrían confinarse a una de las fases de un sistema apropiado con dos fases líquidas. Tal sistema apropiado con dos fases acuosas podría, por ejemplo, contener un polímero seleccionado a partir del grupo formado por óxido de polietileno (polietilenglicol), acetato de polivinilo, dextrano y sulfato de dextrano. En una preparación interesante, una fase contiene óxido de polietileno (polietilenglicol) y la otra fase contiene dextrano, de modo que las moléculas de polipéptido estarán confinadas en la fase que contiene dextrano.
Otra forma de evitar arrastrar el polipéptido es tener las moléculas de polipéptido unidas a un soporte sólido o un portador semisólido, tal como la superficie de un filtro, una fibra hueca, o un medio de cromatografía en cuentas, por ejemplo, una gel de agarosa o poliacrilamida, una matriz de celulosa fibrosa, o una matriz de HPLC o FPLC (cromatografía líquida de prestaciones rápidas). Como otra medida, el portador podría ser una sustancia que tiene moléculas de un tamaño tal que las moléculas con las moléculas de polipéptido unidas sobre sí, cuando se disuelven o dispersan en una fase líquida, pueden ser retenidas por medio de un filtro, o el portador podría ser una sustancia capaz de formar micelas, o de participar en la formación de micelas, que permita que la fase líquida sea cambiada o sustancialmente cambiada sin arrastrar las micelas. En los casos en los que los componentes formadores de micelas tiendan a escapar del sistema como monómeros, por ejemplo, cuando fueran capaces, hasta cierto punto, de atravesar un ultrafiltro usado para confinar el sistema, esto podría compensarse rellenando con monómero formador de micelas adicional.
El portador también podría es un polímero soluble en agua que tuviera moléculas con un tamaño que no será capaz sustancialmente de pasar a través de los poros de un filtro u otros medios de confinar el sistema.
Las moléculas de polipéptido son adsorbidas convenientemente de forma no apropiada sobre el portador a través de una porción que tiene afinidad por un componente del portador. Tal porción podría, por ejemplo, ser un grupo biotina o un análogo del mismo unido a una porción aminoácido del polipéptido, teniendo el portador avidina, estreptoavidina, o análogos de las mismas, unida sobre sí para establecer un sistema con una intensa afinidad entre las moléculas de polipéptido así modificadas y el portador así modificado. Se comprenderá que la afinidad entre el polipéptido modificado y el portador modificado debería ser suficientemente estable, de forma que la adsorción no se viera afectada sustancialmente por las condiciones desnaturalizantes; la supresión de las moléculas de polipéptido del portador después del ciclo debería realizarse usando corte específico, tal como se explica a continuación.
La lisina es un ejemplo de residuo aminoácido apropiado al cual puede unirse un grupo biotinilo.
Una forma interesante de introducir un aminoácido portador de una porción que tiene afinidad por el portador es la síntesis CPY. La CPY (carboxipeptidasa Y) es conocida por ser capaz de añadir cualquier amida de aminoácido con independencia de la naturaleza de la cadena lateral de esa amida de aminoácido.
En una realización interesante, la porción que tiene afinidad por el portador es el segmento polipeptídico SEC. N° ID: 47, en cuyo caso el portador comprende convenientemente un derivado del ácido nitriloacético (NTA) cargado con iones Ni^{++}, por ejemplo, una matriz de NTA-agarosa que haya sido bañada en una solución que comprenda Ni^{++}.
Un aspecto importante de la invención se refiere a la presencia de medios apropiados en la molécula de polipéptido que preparen la molécula para su posterior corte en dos o más segmentos, en donde un segmento es un polipéptido auténtico tal como se ha definido más arriba. Tales moléculas de polipéptido combinadas (moléculas polipeptídicas de fusión) podrían comprender, para este propósito, un segmento de polipéptido que es capaz de dirigir el corte preferente por parte de un agente de corte en un enlace peptídico específico. El segmento polipeptídico en cuestión podría ser uno que dirige el corte a resultas de la conformación del segmento que sirve como sitio de reconocimiento para el agente de corte.
El segmento polipeptídico director del corte podría ser capaz, por ejemplo, de dirigir el corte preferente en un enlace peptídico específico por parte de un agente de corte seleccionado de entre el grupo formado por bromuro de cianógeno, hidroxilamina, ácido iodosobenzóico, y N-bromosuccinimida.
El segmento polipeptídico director del corte podría se uno que fuera capaz de dirigir el corte preferente en un enlace peptídico específico por parte de un agente que es un enzima, y uno de tales enzimas posibles es la enteroquinasa bovina o un análogo y/u homólogo de la misma.
En un aspecto importante de la invención, el agente de corte es el enzima factor X_{a} de la coagulación bovino, o un análogo y/u homólogo del mismo (tales análogos se discutirán en mayor detalle más abajo), y el segmento polipeptídico que dirige el corte preferente es una secuencia que es reconocida sustancialmente de forma selectiva por el factor X_{a} de la coagulación bovino o un análogo y/u homólogo del mismo. Son segmentos importantes los segmentos de polipéptido que tienen una secuencia seleccionada de entre el grupo formado por: SEC. N° ID.: 38, SEC. N° ID.: 39, SEC. N° ID.: 40, SEC. N° ID.: 41 y SEC. N° ID.: 42.
Una característica interesante de la invención es la posibilidad de enmascarar o desenmascarar segmentos de polipéptido con respecto a su capacidad de dirigir el corte en un enlace peptídico específico, con lo que se obtiene que diferentes segmentos del polipéptido pueden cortarse en diferentes etapas de los ciclos.
Por tanto, cuando las moléculas de polipéptido comprenden un segmento de polipéptido, que es convertible in vitro en un segmento de polipéptido derivado capaz de dirigir el corte preferente por parte de un agente de corte en un enlace peptídico específico, pasa a estar disponible un efecto enmascarador/desenmascarador. Una versión especialmente interesante de esta estrategia es cuando el segmento polipeptídico convertible in vitro puede convertirse en un segmento polipeptídico derivado, el cual es reconocido de forma sustancialmente selectiva por parte del factor X_{a} de la coagulación bovino, o un análogo y/u homólogo del mismo.
Se contempla que ambos, los residuos de cisteína y metionina, pueden ser convertidos en residuos modificados, residuos modificados que convierten los segmentos que tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas de entre el grupo consistente en las SEC. N° ID.: 43, SEC. N° ID.: 44, SEC. N° ID.: 45, y SEC. N° ID.: 46 convertibles in vitro, en segmentos reconocidos por el factor X_{a} de la coagulación bovina, o un análogo y/u homólogo del mismo.
De acuerdo con la invención, un posible solución que implica el residuo cisteína es que un segmento polipeptídico con la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID: 43 o SEC. N° ID.: 44 se convierta en un polipéptido derivado, que es reconocido de forma sustancialmente selectiva por parte del factor X_{a} de la coagulación bovino, haciendo reaccionar el residuo cisteína con N-(2-mercaptoetil)morfolil-2-triopiridil)disulfuro o disulfuro de mercaptotioacetato-2-tiopiridilo.
Una posible estrategia de acuerdo con la invención que implica la metionina es que un segmento polipeptídico con la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 45 o SEC. N° ID.: 46 se convierta en un polipéptido derivado, que es reconocido de forma sustancialmente selectiva por parte del factor X_{a} de la coagulación bovino, mediante la oxidación de la porción tioéter en el grupo lateral de la metionina con un derivado sulfóxido o sulfona.
Las realizaciones preferidas del procedimiento acorde con la invención son aquéllas en las que los segmentos directores del corte con la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 38, SEC. N° ID.: 49, SEC. N° ID.: 41, o SEC. N° ID.: 42, o los segmentos directores de corte enmascarados con las secuencias de aminoácidos SEC. N° ID.: 43, SEC. N° ID.: 44, SEC. N° ID.: 45, y SEC. N° ID.: 46 están unidos de forma N-terminal al polipéptido auténtico, puesto que entonces no es necesario ningún procesamiento ulterior, aparte del corte selectivo, para obtener el polipéptido auténtico en solución. Por otra parte, una posible razón para unir las secuencias directoras de cortes al extremo C-terminal del polipéptido auténtico sería que el plegamiento correcto de las moléculas polipeptídicas depende de un N-terminal libre en las moléculas de polipéptido. En tal caso, la parte de la secuencia directora de corte que permanece después del corte puede retirarse mediante el uso apropiado de las carboxipeptidasas A y B.
El cambio de las condiciones durante el período de transición entre los pasos podría, de acuerdo con la invención, conseguirse cambiando la composición química de la fase líquida con la que están en contacto las moléculas de polipéptido. Por tanto, la desnaturalización de las moléculas de polipéptido podría conseguirse poniendo en contacto las moléculas de polipéptido con una fase líquida en la que está disuelto al menos un agente desnaturalizante, y la renaturalización de las moléculas de polipéptido se consigue poniendo en contacto las moléculas de polipéptido con una fase líquida que, o bien contiene disuelto al menos un compuesto desnaturalizante en una concentración tal que el contacto con la fase líquida tenderá a renaturalizar, en vez de desnaturalizar, el conjunto de moléculas de polipéptido en sus respectivos estados conformacionales que resulten del paso precedente, o sustancialmente no contiene compuesto desnaturalizante.
La expresión "compuesto desnaturalizante" se refiere a un compuesto que, cuando está presente como uno de los solutos en una fase líquida que comprende moléculas de polipéptido, podría desestabilizar los estados plegados de las moléculas de polipéptido, conduciendo al desplegado parcial o total de las cadenas polipeptídicas. El efecto desnaturalizante ejercido por un compuesto desnaturalizante incrementar con concentraciones crecientes del compuesto desnaturalizante en la solución, pero podría además potenciarse o moderarse debido a la presencia de otros solutos en la solución, o mediante cambios en los parámetros físicos, por ejemplo, temperatura o presión.
Como ejemplos de compuestos desnaturalizantes, a usar en los procedimientos acordes con la invención, podrían mencionarse la urea, la guanidina-HCl, las di-C_{1-6}-alquilformamidas tales como dimetilformamida, y las di-C_{1-6}-alquilsulfonas.
La fase líquida usada en al menos uno de los pasos de desnaturalización y/o en la menos uno de los pasos de renaturalización, podría, de acuerdo con la invención, contener al menos un sistema de reordenación de disulfuros.
Los "sistemas de reordenación de disulfuros" son sistemas redox que contienen mezclas de agentes reductores y oxidantes, la presencia de los cuales facilita la rotura y construcción de puentes de disulfuro en un polipéptido o entre polipéptidos. En consecuencia, los "agentes de reordenación de disulfuro" o "compuestos de reordenación de disulfuro" son tales agentes reductores y oxidantes que facilitan la rotura y construcción de puentes de disulfuro en un polipéptido o entre polipéptidos. En un aspecto importante de la invención, el sistema de reordenación de disulfuro, contenido en la fase acuosa que está en contacto con las proteínas, comprende como sistema de reordenación de disulfuros una mezcla de mercaptano y su correspondiente compuesto de disulfuro.
Como un ejemplo, todos los residuos cisteína en las moléculas de polipéptido podrían haberse convertido en productos de disulfuro mezclados, tanto de glutatión, tiocolina, mercaptoetanol, o ácido mercaptoacético, durante al menos uno de los ciclos de desnaturalización/renaturalización. Tal polipéptido convertido se denomina "polipéptido o proteína con disulfuros completamente bloqueados", y este término se refiere así a un polipéptido o proteína en el que los residuos cisteína se han convertido en un disulfuro mixto, en el que cada residuo cisteína está unido mediante disulfuro a un mercaptano, por ejemplo, glutatión. La conversión de los residuos cisteína a productos disulfuro mixtos podría conseguirse haciendo reaccionar un conjunto de moléculas de polipéptido completamente desnaturalizadas y completamente reducidas, con un exceso de un reactivo que es un compuesto disulfuro mezclado de elevada energía, tal como compuestos disulfuro alifáticos-aromáticos, por ejemplo, 2-tiopiridil glutationil disulfuro, o mediante cualquier otro procedimiento apropiado.
Como ejemplo de disulfuros mixtos de energía elevada, esto es, disulfuros mixtos que tienen un enlace S-S relativamente inestable, podrían mencionarse los disulfuros mixtos que tienen la fórmula general:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \hskip-3mm R _{2} \cr  \+
 \hskip-2,5mm |\cr  R _{1} --S--S-- \+
 \hskip-3mm C--R _{3} \cr  \+
 \hskip-2,5mm |\cr  \+
 \hskip-3mm R _{4} \cr}
en donde R_{1} es 2-piridil, y cada uno de R_{2}, R_{3} y R_{4} es hidrógeno o un grupo hidrocarburo aromático o alifático inferior opcionalmente sustituido. Los ejemplos de tales disulfuros mixtos son el glutationil-2-tiopiridilo disulfuro, el 2-tiocolil-2-tiopiridil disulfuro, el 2-mercaptoetanol-2-tiopiridil disulfuro, y el mercaptoacetato-2-tiopiridil disulfuro.
En realizaciones interesantes, el sistema de reordenación de disulfuro contiene glutatión, 2-mercaptoetanol o tiocolina, cada uno de ellos en mezcla con su correspondiente disulfuro simétrico.
La conveniencia de una mezcla de tioles determinada para su uso como sistema selectivo reductor y/o de reordenación de disulfuro en un procedimiento de plegado de nuevo/oxidación de nuevo cíclico para un producto de proteína específico con un conjunto de mezclas de tioles en diferentes concentraciones de desnaturalizante ejerciendo efectos desnaturalizantes débiles, intermedios o fuertes sobre la proteína. A continuación de la incubación, la topología de disulfuros en cada muestra se bloquea mediante reacción con un exceso de reactivo bloqueador de tioles (por ejemplo, iodoacetamida) antes de someter cada conjunto de muestras a PAGE-SDS bajo condiciones no reductoras. El material con puentes de disulfuro correctos y el material en estados topológicos covalentes no deseados aparecerá en bandas separadas y permitirá por tanto la verificación cuantitativa del estado de plegamiento de la proteína en el momento del bloqueo de tioles, puesto que sólo el topoisómero con puentes disulfuro únicamente correcto podría corresponder a la proteína plegada correctamente presente al final de la incubación con tiol/disulfuro y agentes desnaturalizantes. Este conjunto de experimentos permite la identificación del rango de niveles desnaturalizantes en el que un determinado reactivo tiol/disulfuro podría usarse ventajosamente como agente de reordenación de disulfuros, tal como se revela a través de la reducción preferente y del desplazamiento de los enlaces disulfuro equivocados, y la baja tendencia a reducir enlaces en la proteína completamente plegada. Este procedimiento de ensayo de reactivos podría usarse como un procedimiento general para seleccionar reactivos reductores y/o de reordenación de disulfuro ventajosos. El Ejemplo 12 demuestra a aplicación de este procedimiento analítico para verificar la conveniencia de la reducción selectiva de formas plegadas erróneamente de una proteína modelo para 5 reactivos de tiol, y demuestra de ese modo que el procedimiento anterior es operable.
Se entenderá que el procedimiento indicado más arriba para seleccionar sistemas de reordenación de disulfuro apropiados podría emplearse también para seleccionar otras composiciones que las mezclas de tioles. Cualquier mezcla que contenga agentes reductores/oxidantes apropiados podría evaluarse de acuerdo con el procedimiento indicado más arriba, y la composición de elección en el procedimiento de la invención será una que muestra la mayor capacidad de reducir preferentemente puentes disulfuro incorrectamente formados.
Por tanto, un aspecto importante de la invención es un procedimiento para el plegamiento de nuevo de la proteína tal como se describe en ésta, en donde al menos un sistema de reordenación de disulfuro contenido en la fase líquida, en al menos un paso de renaturalización y/o desnaturalización, es uno que es capaz de reducir y/o desplazar los puentes disulfuro formados incorrectamente bajo condiciones, con respecto a la concentración de agente desnaturalizante, en las que las proteínas desplegadas y/o mal plegadas se desnaturalizan, y en las que no hay sustancialmente reducción y/o desplazamiento de puentes disulfuro correctamente formados.
Una realización interesante de la invención es un procedimiento tal como se ha descrito más arriba, en donde se usa un sistema de reordenación de disulfuro en al menos un paso de desnaturalización/renaturalización, y resulta en una proporción entre la cantidad relativa de puentes disulfuro, incorrectamente formados inicialmente, reducidos/desplazados, y la cantidad relativa de puentes disulfuro, correctamente formados inicialmente, reducidos/desplazados, de al menos el 1,05. La proporción será preferiblemente superior, proporciones tales como 1,1, 1,5, 2,0, 3,0, 5,0, 10, 100, 1000, e incluso superiores son realistas, y por tanto son especialmente preferidas de acuerdo con la invención.
Con los términos "inicialmente incorrectamente/correctamente" con respecto a la forma de puentes disulfuro se indica la topología de puentes disulfuro justo antes de que el sistema de reordenación de disulfuro ejerza sus efectos.
Se entenderá que la proporción ha de ser superior a 1 con objeto de permitir la formación neta de puentes disulfuro correctamente plegados en una muestra de proteína. Normalmente la proporción debería ser tan alta como fuera posible, pero incluso las proporciones que son marginalmente superiores a 1 permitirán la formación neta de puentes disulfuro formados correctamente en el procedimiento de la invención, siendo el número de ciclos desnaturalizantes/renaturalizantes el parámetro importante para asegurar un rendimiento elevado. Las proporciones justo por encima de uno requieren que se completen muchos ciclos antes de conseguirse un rendimiento sustancial de puentes disulfuro correctamente formados, mientras que las proporciones elevadas sólo requieren un número limitado de ciclos.
En los casos en los que sólo se va a emplear un sistema de reordenación de disulfuro, tal sistema de reordenación de disulfuro podría seleccionarse, de acuerdo con la invención, mediante
1)
incubación de las muestras de proteína plegada y plegada incorrectamente, de la misma secuencia de aminoácidos que la proteína a procesar mediante el procedimiento de la invención, con un conjunto de sistemas de reordenación de disulfuro a varias concentraciones diferentes de un agente desnaturalizante escogido,
2)
verificar, en cada una de las concentraciones diferentes de agente desnaturalizante, la capacidad de cada uno de los sistemas de reordenación de disulfuro para reducir y/o desplazar puentes disulfuro formados inicialmente incorrectamente sin reducir y/o desplazar sustancialmente puentes disulfuro formados inicialmente correctamente, tal como se verifica calculando la proporción entre la cantidad relativa de puentes disulfuro formados inicialmente incorrectamente reducidos/desplazados, y la cantidad relativa de puentes disulfuro formados inicialmente correctamente reducidos/desplazados, y
3)
seleccionar como el sistema X de reordenación de disulfuro, el sistema de reordenación de disulfuro que presenta la capacidad de reducir puentes disulfuro formados incorrectamente inicialmente, sin reducir y/o desplazar sustancialmente puentes disulfuro formados correctamente inicialmente, en el rango de concentraciones más amplio del agente desnaturalizante escogido.
Alternativamente, podría emplearse más de un sistema de reordenación de disulfuro, por ejemplo, en ciclos diferentes del procedimiento cíclico de plegado de nuevo de la invención, pero también simultáneamente en los mismos ciclos. Este será el caso, por ejemplo, cuando es probable, o ha sido establecido mediante, por ejemplo, el procedimiento descrito más arriba, que el rendimiento conjunto de proteína plegada correctamente con topología de puentes de disulfuro correcta será superior si se usan diferentes sistemas de disulfuro en el procedimiento de la invención.
Con objeto de calcular la proporción más arriba indicada entre la cantidad relativa de puentes disulfuro formados incorrectamente inicialmente y reducidos/desplazados, y la cantidad relativa de puentes disulfuro formados correctamente inicialmente, podría emplearse el procedimiento siguiente: a la mezcla inicial de reactivos en el PASO 1) se le añade una cantidad de proteína plegada correctamente y marcada radiactivamente. Cuando las cantidades de proteína plegada correcta e incorrectamente se verifican en el PASO 2) (por ejemplo, mediante SDS-PAGE no reductora), también se determina el contenido de radiactividad en la fracción de proteína correctamente plegada. De este modo, puede determinarse un ensayo de la proteína ahora incorrectamente plegada (pero inicialmente plegada correctamente) en paralelo con la determinación de la distribución total de proteína plegada correctamente/incorrectamente. La proporción antes mencionada puede calcularse entonces como,
R = \frac{C_{2} - \frac{A_{2}}{A_{1}} \cdot C_{1}}{U_{1} \cdot \frac{A_{2}}{A_{1}}}
en donde C_{1} y C_{2} son respectivamente las cantidades inicial y final de proteínas correctamente plegadas; U1 es la cantidad de proteína plegada incorrectamente inicialmente, y A_{1} y A_{2} son respectivamente la radiactividad en la fracción inicial de proteína correctamente plegada y en la fracción final de proteína correctamente plegada.
Además de los medios desnaturalizantes mencionados más arriba, la desnaturalización también podría conseguirse o potenciarse mediante un pH decreciente de la fase líquida, o mediante un pH creciente de la fase líquida.
La polaridad de la fase líquida usada en la renaturalización podría, de acuerdo con la invención, haberse modificado mediante la adición de una sal, un polímero y/o un compuesto hidrofluorado tal como el trifluoroetanol.
De acuerdo con la invención, la desnaturalización y renaturalización de las moléculas de polipéptido podría conseguirse también mediante cambios directos en parámetros físicos a los que se exponen las moléculas de polipéptido, tales como la temperatura o presión, o estas medidas podrían utilizarse para potenciar o moderar la desnaturalización o renaturalización que resultan de otras medidas mencionadas más arriba.
No obstante, se entenderá que una realización práctica más importante del procedimiento se realiza consiguiendo cambios químicos en la fase líquida cambiando entre la solución desnaturalizante B y la solución renaturalizante A. En este caso, la concentración de uno o más compuestos desnaturalizantes en B se ajustará a menudo después de cada ciclo, y como un ejemplo importante, la concentración de uno o más compuestos desnaturalizantes en B disminuirá después de cada ciclo, pero en otra realización importante, la concentración de uno o más compuestos desnaturalizantes en el medio B se mantiene constante en cada ciclo.
Esta realización de la invención, en donde la concentración de compuesto(s) desnaturalizante(s) en el medio B se mantiene constante, es especialmente interesante cuando la fase más productiva del proceso de cíclico (con respecto a la proteína correctamente plegada) ha sido identificada, y se desea la producción a gran escala de proteína correctamente plegada. Tal como se comprenderá, la(s) concentración(es) preferidas de compuesto(s) desnaturalizan-
te(s) del medio B en esta realización es(son) la(s) concentración(es) que se ha(n) establecido para asegurar la máxima productividad en el proceso cíclico acorde con la invención.
Las moléculas de polipéptido del conjunto que se somete al procedimiento de la invención normalmente tienen una longitud de al menos 25 residuos aminoácidos, tal como al menos 30 residuos aminoácidos, o al menos 50 residuos aminoácidos. Por otra parte, las moléculas de polipéptido del conjunto normalmente tienen una longitud de como mucho 5000 residuos aminoácidos, tal como mucho 2000 residuos aminoácidos, o como mucho 1000 u 800 residuos aminoácidos.
Como puede observarse a partir del Ejemplo 10, el procedimiento de la invención ha hecho posible la producción de moléculas diacuerpo correctamente plegadas (los diacuerpos se describen en Holliger et al., 1993).
Por tanto, un aspecto importante de la invención se refiere a un procedimiento para producir moléculas de diacuerpo correctamente plegadas, en donde un conjunto inicial de moléculas de polipéptido, que comprende polipéptidos desplegados y/o mal plegados que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de aminoácidos de fragmentos monoméricos de moléculas de diacuerpos, se somete a una serie de al menos dos ciclos sucesivos, cada uno de los cuales comprende una secuencia de,
1)
al menos un paso desnaturalizante que comprende condiciones que ejercen una influencia desnaturalizante y/o de desplegado sobre las moléculas de polipéptido del conjunto, como para desnaturalizar y/o desplegar una fracción de los polipéptidos en el conjunto, seguido por
2)
al menos un paso renaturalizante que comprende condiciones que tienen una influencia renaturalizante sobre las moléculas de polipéptidos que tienen conformaciones que resultan del paso precedente, como para renaturalizar una fracción de los polipéptidos desnaturalizados y/o desplegados del conjunto
estando adaptadas las series de ciclos de tal modo que una fracción sustancial del conjunto inicial de las moléculas de polipéptido se convierten en una fracción de moléculas de diacuerpo correctamente plegadas.
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Un procedimiento tal para el plegamiento correcto de diacuerpos puede concebirse en cualquiera de los escenarios y aspectos antes mencionados del procedimiento de plegamiento de la invención, esto es, con respecto a la elección de condiciones físicas/químicas así como con los planes de ciclos. No obstante, un aspecto importante del procedimiento para el plegado correcto de diacuerpos es un procedimiento tal como el identificado más arriba, en donde las moléculas polipeptídicas están en contacto con una fase líquida que contiene al menos un sistema de reordenación de disulfuro, en al menos un paso de desnaturalización o renaturalización. El agente de desnaturalización preferido para su uso en una fase líquida tal es la urea, y el sistema de reordenación de disulfuro preferido comprende glutatión como el principal agente reductor.
Un aspecto particular de la invención se refiere al uso, en los procedimientos antes descritos, de un polipéptido que es un proenzima de una proteasa de serina, pero que es diferente de cualquier proteasa de serina que ocurra de forma natural y, en particular, tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la del factor X de coagulación bovino (Protein Identification Resource (PIR), National Biomedical Research Foundation, Georgetown University, Medical Center, U.S.A., registro de entrada: P1; EXBO), y que puede activarse proteolíticamente, para generar la proteasa de serina activa, mediante incubación de una solución del polipéptido en un tampón no desnaturalizante con una sustancia que corte el polipéptido para liberar un residuo N-terminal nuevo, siendo la especificidad de la proteasa de serina idéntica o mejor que la del factor X_{a} de coagulación bovino, tal como se verifica con cada una de las proporciones k(I)/k(V) y k(III)/k(V) entre la velocidad de corte para cada uno de los sustratos I y III:
I. Benzoil-Val-Gly-Arg-paranitroanilida,
III. Tosil-Gly-Pro-Arg-paranitroanilida,
respecto la del sustrato V
V. Benzoil-Ile-Glu-Gly-Arg-paranitroanilina
a 20°C, pH = 8 en un tampón consistente en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, siendo idénticas a, o inferiores que las proporciones correspondientes determinadas para el factor X_{a} de coagulación bovino, el cual está sustancialmente libre de proteasas contaminantes.
La caracterización de los polipéptidos identificados más arriba como proteasas de serina está de acuerdo con el uso de la nomenclatura normal del término proteasas de serina. Como es bien conocido en la técnica, las proteasas de serina son enzimas que se cree tienen un sistema catalítico consistente en una serina del sitio activo que está alineada con un residuo histidina, y se cree que la activación de los enzimas a partir de los proenzimas correspondientes se basa en la liberación de un nuevo residuo N-terminal, el grupo \alpha-amino del cual es capaz de reposicionarse dentro de la estructura polipeptídica para formar un puente salino con un residuo de ácido aspártico que precede un residuo serina del sitio activo, formando de ese modo el sitio activo característico de las proteasas de serina.
Las proteasas de serina "artificiales" definidas más arriba son herramientas de corte de polipéptidos extremadamente valiosas para su uso en el procedimiento de la invención y en otros procedimientos en los que es decisivo tener una herramienta de corte que cortará proteínas selectivamente, incluso grandes proteínas plegadas. De forma análoga al factor X_{a} de coagulación bovino, las proteasas de serina artificiales definidas más arriba son capaces, en su forma activada, de reconocer selectivamente el segmento polipeptídico director de cortes de la SEC. N° ID.: 38, pero en contraste con el factor X_{a} de coagulación bovino, pueden establecerse con tales secuencias de aminoácidos que pueden ser fácilmente producidas usando técnicas de ADN recombinante. Por tanto, las proteasas de serina artificiales preferidas son unas que tienen secuencias de aminoácidos que permiten su síntesis mediante técnicas de ADN recombinante, en particular en células procariotas tales como E. coli. Tal como aparecerá a partir de la discusión siguiente y de los ejemplos, a las proteasas de serina artificiales, cuando se producen en un procariota, se les puede dotar de una conformación enzimáticamente activa, en la cual los dominios activos catalíticamente están apropiadamente expuestos, realizando ciclos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención.
El ensayo cuantitativo de la selectividad de las proteasas de serina artificiales implica la determinación de la velocidad de corte, k, determinada como la pendiente inicial de una curva de absorción de luz a 405 nm (máximo de absorción de la paranitroanilina libre) respecto el tiempo, a 20°C.
Expresada cuantitativamente, la selectividad de las proteasas de serina artificiales debería caracterizarse por que el valor de k(I)/k(V) fuera como mucho de 0, 06, y el valor de k(III)/k(V) fuera como mucho de 0,5. Se prefiere que
k(I)/k(V) sea como mucho de 0,05, y que k(III)/k(V) sea como mucho de 0,4, y más preferible que k(I)/k(V) sea como mucho de 0,04, y que k(III)/k(V) sea como mucho de 0,15.
Una caracterización de la especificidad más comprehensiva implica otros modelos de sustratos: por tanto, la especificidad de sustrato podría verificarse que fuera idéntica o mejor que la del factor X_{a} de coagulación bovina para cada una de las proporciones (k(I)/k(V), k(II)/k(V), k(III)/k(V) y k(IV)/k(V)) entre la velocidad de corte para cada uno de los sustratos I-IV:
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I. Benzoil-Val-Gly-Arg-paranitroanilida,
II. Tosil-Gly-Pro-Lys-paranitroanilida,
III. Tosil-Gly-Pro-Arg-paranitroanilida,
IV. (d,1)Val-Leu-Arg-paranitroanilida,
respecto la del sustrato V
V. Benzoil-Ile-Glu-Gly-Arg-paranitroanilina
a 20°C, pH = 8 en un tampón consistente en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM, siendo idénticas a, o inferiores que las proporciones correspondientes determinadas para el factor X_{a} de coagulación bovino, el cual está sustancialmente libre de proteasas contaminantes.
En esta caracterización, k(I)/k(V) debería ser como mucho 0,06, k(II)/k(V) debería ser como mucho 0,03,
k(III)/k(V) debería ser como mucho 0,5, y k(IV)/k(V) debería ser como mucho 0,01, y es preferible que k(I)/k(V) sea como mucho 0,05, k(II)/k(V) sea como mucho 0,025, k(III)/k(V) sea como mucho 0,4, y k(IV)/k(V) sea como mucho 0,008, y es más preferible que k(I)/k(V) sea como mucho 0,04, k(II)/k(V) sea como mucho 0,015, k(III)/k(V) sea como mucho 0,15, y k(IV)/k(V) sea como mucho 0,005.
El polipéptido del tipo proteasa de serina tal como se ha definido más arriba normalmente tendrá un peso molecular, M_{r}, de como mucho 70.000 y al menos de 15.000.
Uno de tales polipéptidos tiene la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 2, o es un análogo y/u homólogo de la misma. Otras importantes realizaciones del polipéptido de la invención tienen una secuencia de aminoácidos que es una subsecuencia de la SEC. N° ID.: 2, o un análogo y/u homólogo de una subsecuencia tal.
Mediante el uso del término "un análogo de un polipéptido codificado por la secuencia de ADN" o "un análogo de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos" se quiere indicar un polipéptido que es capaz de funcionar como factor X_{a} de coagulación bovino en los ensayos mencionados más arriba. Por tanto, también se incluyen los polipéptidos procedentes de diferentes fuentes, tales como diferentes mamíferos o vertebrados, que varían, por ejemplo hasta cierto punto en la composición de aminoácidos, o en las modificaciones posteriores a su traducción, por ejemplo, glicosilación o fosforilación, en comparación con la proteasa de serina artificial descrita en los ejemplos.
El término "análogo" se usa por tanto en el contexto actual para indicar una proteína o polipéptido con una composición o secuencia de aminoácidos similar a la secuencia de aminoácidos característica de la SEC. N° ID.: 2, derivada de una proteasa de serina artificial tal como se describe en el Ejemplo 5, permitiendo variaciones menores que alteran la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, supresiones, mutaciones dirigidas a un sitio, inserciones de aminoácidos extra, o combinaciones de las mismas, para generar análogos de la proteasa de serina artificial.
Por tanto, en la presente descripción y reivindicaciones, un análogo (de un polipéptido) designa una variación del polipéptido en la que podrían haberse suprimido o intercambiado uno o varios aminoácidos, y/o podrían haberse introducido aminoácidos, a condición de que se mantenga la actividad enzimática de la especificidad antes definida, tal como puede verificarse como se ha descrito más arriba.
Con respecto a la homología, un análogo de un polipéptido acorde con la invención podría tener una homología de secuencia a nivel de polipéptido de al menos un 60% de identidad en comparación con la secuencia de un fragmento de la SEC. N° ID.: 2, permitiéndose las supresiones y/o inserciones de como mucho 50 residuos aminoácidos.
Tales secuencias polipeptídicas, o análogos de las mismas que tienen una homología de al menos un 60% con el polipéptido mostrado en la SEC. N° ID.: 2, codificado por la secuencia de ADN de la invención SEC. N° ID.: 1 o por análogos y/u homólogos de la misma, constituyen una realización importante de esta invención.
Mediante el término "homología de secuencia" se quiere indicar la identidad en la secuencia, o de los aminoácidos en segmentos de dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos, o de nucleótidos en segmentos de dos o más nucleótidos en una secuencia de nucleótidos. Con respecto a los polipéptidos, los términos se pretende que indiquen una homología entre los aminoácidos en cuestión entre los que ha de establecerse la homología, en el emparejamiento con respecto a la identidad y posición de los aminoácidos en los polipéptidos.
El término "homólogo" se usa por tanto en ésta para ilustrar el grado de identidad entre la secuencia de aminoácidos de un polipéptido determinado y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. N° ID.: 2. La secuencia de aminoácidos a comparar con la secuencia de aminoácidos en la SEC. N° ID.: 2 podría deducirse a partir de una secuencia de nucleótidos, tal como una secuencia de ADN o ARN, por ejemplo, obtenida mediante hibridación tal como se describe más adelante, o podría obtenerse mediante procedimientos convencionales de secuenciación de aminoácidos.
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Otra realización se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la cual se obtiene una cadena de 20 aminoácidos que es homóloga, hasta un grado del 40%, con una cadena de aminoácidos de la misma longitud seleccionada procedente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. N° ID.: 2.
Un polipéptido de proteasa de serina tiene la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 2, residuos 82-484, o es un análogo y/u homólogo de la misma. Otro polipéptido de proteasa de serina acorde con la invención tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. N° ID.: 2, residuos 166-484, o es un análogo y/u homólogo de la misma.
Un cierto número de modificaciones de las secuencias mostradas en ésta son particularmente interesantes: La inserción de la secuencias directoras de corte SEC. N° ID.: 38 o 40-42 en vez de los residuos 230-233 en la SEC. N° ID.: 2, combinados con el intercambio del residuo cisteína 245 preferiblemente por Gly, Ser o Arg en la SEC. N° ID.: 2. De forma bastante general, en cualquiera de las proteasas de serina artificiales definidas más arriba, el recambio de la secuencia de corte correspondiente a los residuos 230-233 en la SEC. N° ID.: 2 con una de las secuencias directoras de corte definidas más arriba, dará lugar a enzimas de corte extremadamente útiles para su uso en el procedimiento acorde con la invención, ya que éstas pueden ser cortadas selectiva y muy eficientemente por enzimas que tienen la actividad enzimática específica del factor X_{a} de la coagulación bovino, y por tanto mediante proteasas de serina artificiales tal como se han definido más arriba, incluyendo por parte de moléculas idénticas a ellas mismas. Este último hecho significa que las proteasas de serina, modificadas mediante tal inserción de las secuencias directoras de corte específica, pueden ser activadas de forma extremadamente efectiva, puesto que las primeras moléculas cortadas y activadas serán capaces de cortar otras moléculas, iniciándose por tanto una reacción en cadena.
Tal como se ha mencionado más arriba, que las proteasas de serina artificiales puedas producirse mediante técnicas de ADN recombinante es una característica de lo más importante. Tales técnicas usan un fragmento de ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido de acuerdo a como se ha definido más arriba. Un fragmento de ADN tal es la secuencia de nucleótido mostrada en la secuencia de ADN SEC. N° ID.: 1, o un análogo de la misma que tiene una homología de al menos el 60% con cualquiera de las secuencias de ADN mostradas en la SEC. N° ID.: 1, y/o que codifica un polipéptido, la secuencia de aminoácidos del cual es al menos un 60% homóloga con las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC. N° ID.: 2.
Generalmente, sólo se usan las regiones codificantes cuando se comparan secuencias de nucleótidos con objeto de determinar su homología interna.
El término "análogo", en relación a los fragmentos de ADN de la invención, se pretende que indique una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido idéntico o sustancialmente idéntico al polipéptido codificado por un fragmento de ADN de la invención. Es bien sabido que el mismo aminoácido podría codificarse mediante varios codones, estando relacionado el uso de codones, entre otros, a la preferencia del organismo en cuestión que expresa la secuencia de nucleótidos. Por tanto, uno o más nucleótidos o codones del fragmento de ADN de la invención podrían cambiarse con otros que, cuando se expresan, resultan en un polipéptido idéntico o sustancialmente idéntico al polipéptido codificado por el fragmento de ADN en cuestión.
Más aún, el término "análogo" se pretende que permita variaciones en las secuencia tales como sustituciones, inserciones (incluyendo intrones), adiciones o reordenaciones de uno o más nucleótidos, variaciones que no tienen sustancialmente efecto alguno sobre el polipéptido codificado por el fragmento de ADN, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos modificada que difiere de la secuencia de ADN mostrada en la SEC. N° ID.: 1 en que al menos un nucleótido ha sido sustituido, añadido, insertado, suprimido y/o reordenado.
El término "sustitución" se pretende que indique el recambio de uno o más nucleótidos en la secuencia completa de nucleótidos con uno o más nucleótidos diferentes, "adición" se entiende que significa la adición de uno o más nucleótidos en uno cualquiera de los extremos de la secuencia de nucleótidos completa, "inserción" se pretende que signifique la introducción de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos completa, "supresión" se pretende que indique que uno o más nucleótidos han sido suprimidos de la secuencia de nucleótidos completa, tanto en uno cualquiera de los extremos de la secuencia o en cualquier punto apropiado dentro de ésta, y "reordenación" se pretende que indique que dos o más residuos nucleótidos han sido intercambiados respectivamente dentro de la secuencia de ADN o de la secuenciación polipeptídica. El fragmento de ADN podría, no obstante, modificarse también mediante mutagénesis, bien antes o después de insertarlo en el organismo. La secuencia de ADN o proteica de la invención podría modificarse de tal forma que no pierda ninguna de sus propiedades biofísicas, bioquímicas o biológicas, o parte de tales propiedades (uno y/o todas), o la totalidad de tales propiedades (una y/o todas).
Un ejemplo de un análogo específico es una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN mostrada en la SEC. N° ID.: 1, y particularmente adaptado para su expresión en E. coli. Esta secuencia de ADN es una que, cuando se inserta en E. coli, junto con secuencias reguladoras apropiadas, resulta en la expresión de un polipéptido que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. N° ID.: 2. Por tanto, esta secuencia de ADN comprende codones específicos reconocidos por E. coli.
Los términos "fragmento", "secuencia", "homólogo" y "análogo", tal como se usan en la presente especificación y reivindicaciones con respecto a los fragmentos, secuencias, homólogos y análogos acordes con la invención, debería entenderse, por supuesto, que no incluyen estos fenómenos en su entorno natural, sino, en cambio, por ejemplo, en su forma aislada, purificada, in vitro, o recombinante.
Un fragmento de ácido nucleico tal es un fragmento de ácido nucleico tal como se ha definido más arriba, en el que al menos el 60% de los tripletes codificantes codifican los mismos aminoácidos que un fragmento de ácido nucleico que codifica el factor X de la coagulación bovino, permitiéndose inserciones y/o supresiones de como mucho 150 nucleótidos. Un ejemplo de un fragmento de ácido nucleico tal es la SEC. N° ID.: 1, nucleótidos 76-1527 y análogos y/u homólogos de la misma. Otro ejemplo es la SEC. N° ID.: 1, nucleótidos 319-1527 y análogos y/u homólogos de la misma. Todavía otro ejemplo es la SEC. N° ID.: 1, nucleótidos 517-1527 y análogos y/u homólogos de la misma.
El fragmento de ADN descrito más arriba podría obtenerse directamente a partir del ADN genómico, o aislando el mARN y convirtiéndolo en la secuencia de ADN correspondiente mediante el uso de la transcriptasa inversa, produciéndose por tanto cADN. Cuando se obtiene el fragmento de ADN a partir del ADN genómico, éste se deriva directamente examinando las secuencias genómicas como es bien sabido por la persona formada en la técnica. Esto puede conseguirse mediante hibridación de un sonda de ADN, diseñada a partir de la base de conocimiento de las secuencias descritas en ésta, o de la información de la secuencia obtenida mediante secuenciación de aminoácidos de una proteasa de serina purificada. Cuando el ADN tiene su origen en ADN complementario (cADN), este podría obtenerse preparando una biblioteca de cADN con mARN procedente de células que contienen una proteasa de serina artificial. La hibridación puede conseguirse mediante una sonda de ADN diseñada sobre la base del conocimiento de la secuencia de cADN, o de la información de la secuencia obtenida mediante secuenciación de aminoácidos de una proteasa de serina purificada.
El fragmento de ADN, o un análogo y/u homólogo del mismo, puede replicarse fusionándolo con un vector e insertando el complejo en un microorganismo apropiado o en una línea celular de mamífero. Alternativamente, el fragmento de ADN puede construirse usando síntesis química. También pueden sintetizarse cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC. N° ID.: 1. Estos cebadores pueden usarse para amplificar la totalidad o parte de una secuencia que codifica un polipéptido de proteasa de serina artificial.
Pueden producirse polipéptidos apropiados para su uso en la invención usando tecnología de ADN recombinante. Más específicamente, los polipéptidos podrían producirse mediante un procedimiento que comprende cultivar o hacer crecer un organismo portador de la secuencia de ADN mostrada en la SEC. N° ID.: 1, o un análogo y/u homólogo de la misma, de la invención, en condiciones que conducen a la expresión de dicho fragmento de ADN, y recuperando subsiguientemente el polipéptido expresado a partir de dicho organismo.
El organismo que se usa para la producción del polipéptido podría ser un organismo superior, por ejemplo, un animal, o un organismo inferior, por ejemplo, un microorganismo. Con independencia del tipo de organismo usado, el fragmento de ADN de la invención (descrito más arriba) debería introducirse en el organismo, bien directamente o con la ayuda de un vector apropiado. Alternativamente, los polipéptidos podrían producirse en las líneas celulares de mamíferos introduciendo el fragmento de ADN, o un análogo y/u homólogo del mismo, de la invención, bien directamente o con la ayuda de un vector de expresión.
El fragmento de ADN puede clonarse también en un vector de expresión estable apropiado, y a continuación introducirse en una línea celular apropiada. Las células que expresan el polipéptido deseado se seleccionan a continuación usando las condiciones apropiadas para el vector y la línea celular usada. Las células seleccionadas se hacen crecer entonces aún más y forman un fuente muy importante y continua de los polipéptidos deseados.
Por tanto, también se ilustra en ésta un sistema de expresión que comprende un fragmento de ácido nucleico tal como se ha definido más arriba, y que codifica un polipéptido de proteasa de serina artificial tal como se ha definido más arriba, comprendiendo el sistema una secuencia flanqueante en 5' capaz de mediar la expresión de dicho fragmento de ácido nucleico. El sistema de expresión podría ser un vector de expresión replicable portador del fragmento de ácido nucleico, vector que es capaz de replicarse en un organismo huésped o en una línea celular; el vector podría, por ejemplo, ser un plásmido, fago, cósmido, minicromosoma o virus; el vector podría ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped.
Aún más ilustrado en ésta, hay un organismo que porta y es capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico tal como se ha definido más arriba. El organismo podría ser un microorganismo tal como una bacteria, una levadura, un protozoo, o una célula derivada de un organismo multicelular tal como un hongo, una célula de insecto, una célula vegetal, una célula de mamífero, o una línea celular. Son organismos huéspedes particularmente interesantes los microorganismo tales como una bacteria del género Escherichia, Bacillus o Salmonella.
Una polipéptido de proteasa de serina artificial tal como se ha descrito más arriba podría producirse mediante un procedimiento que comprendiera los pasos siguientes:
1.
insertar un fragmento de ácido nucleico, tal como se ha definido más arriba, en un vector de expresión,
2.
transformar un organismo huésped, tal como se ha definido más arriba, con el vector producido en el paso #1,
3.
cultivar el organismo huésped producido en el paso #2 para expresar el polipéptido,
4.
recolectar el polipéptido,
5.
opcionalmente, someter el polipéptido a modificación posterior a su traducción,
6.
si es necesario, someter el polipéptido a un procedimiento cíclico de desnaturalización/renaturalización acorde con la presente invención, y
7.
opcionalmente, someter el polipéptido modificación ulterior para obtener un polipéptido auténtico tal como se ha definido más arriba.
Otras modificaciones del polipéptido podrían, por ejemplo, conseguirse sometiendo las moléculas de polipéptido a la carboxipeptidasa A o B, en donde podrían suprimirse residuos aminoácidos seleccionados del extremo C-terminal de las moléculas de polipéptido. Esto es deseable en aquellas circunstancias en las que el plegamiento óptimo de las moléculas de polipéptido auténtico sólo se consigue cuando el extremo N-terminal está libre, y el polipéptido director del corte (tal como la SEC. N° ID.: 37) está ubicado de forma C-terminal respecto el polipéptido auténtico. Como es bien sabido, la carboxipeptidasa B corta secuencialmente a partir del extremo C-terminal, y sólo elimina aminoácidos básicos, mientras que la carboxipeptidasa A elimina aminoácidos no básicos. Diseñando cuidadosamente qué residuo se une al extremo C-terminal del polipéptido auténtico, es posible asegurar que todo, excepto el polipéptido auténtico, es cortado por las carboxipeptidasas. Si el extremo C-terminal del polipéptido auténtico es un residuo aminoácido básico, uno debería asegurarse de que el residuo engarzado de forma C-terminal que debe retirarse no es básico, y viceversa. Si se conoce la secuencia de los residuos aminoácidos C-terminales del extremo C-terminal de un polipéptido auténtico es posible alternar entre tratamientos con las dos carboxipeptidasas hasta que sólo queda el polipéptido auténtico desnudo. Una realización práctica sería usar carboxipeptidasas inmovilizadas.
El polipéptido producido podría aislarse mediante un procedimiento que comprendiera uno o más pasos como la cromatografía de afinidad usando polipéptidos o anticuerpos inmovilizados que reaccionen con dicho polipéptido, y/u otros procedimientos cromatográficos y electroforéticos.
También, se entenderá que un polipéptido para su uso en la invención podría prepararse, mediante los procedimientos bien conocidos de la síntesis de péptidos en fase líquida o sólida, utilizando el acoplamiento sucesivo de los aminoácidos individuales de la secuencia del polipéptido. Alternativamente, el polipéptido puede sintetizarse mediante el acoplamiento de aminoácidos individuales que forman fragmentos de la secuencia polipeptídica, los cuales se acoplan más tarde para resultar en el polipéptido deseado. Estos procedimientos constituyen por tanto otro aspecto interesante de la invención.
La invención se refiere también al uso de un polipéptido de proteasa de serina artificial, tal como se ha definido más arriba, para polipéptidos cortadores en el sitio de corte para el factor X de coagulación bovino, teniendo el sitio de corte la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en la SEC. N° ID.: 38, SEC. N° ID.: 40, SEC. N° ID.: 41 y SEC. N° ID.: 42, y para el uso de un polipéptido de proteasa de serina artificial, tal como se ha definido más arriba, para polipéptidos cortadores en el sitio de corte del factor X_{a} de coagulación bovino, teniendo el sitio de corte una versión modificada de la secuencia de aminoácidos 3 seleccionada de entre el grupo de la EC. N° ID.: 43, SEC. N° ID.: 44, SEC. N° ID.: 45 y SEC. N° ID.: 46, la cual se ha convertido ha una forma que se puede cortar tal como se describe más arriba.
Leyendas de las figuras Figura 1 Representación esquemática del segmento de un programa temporal cíclico de desnaturalización/renaturalización
La composición del solvente se expresa en términos de una mezcla binaria de "tampón A" no desnaturalizante, y un "tampón B" desnaturalizante, en términos de contenido relativo de tampón B. Se representan tres ciclos consecutivos, consistente cada uno de ellos en una fase de renaturalización "F" y una fase de desnaturalización "D". Los cambios en los niveles de potencia desnaturalizante de la mezcla de solventes durante las fases de desnaturalización en ciclos consecutivos se denota "k".
Figura 2 Construcción de los plásmidos de expresión pT_{7}H_{6}FX-h\beta_{2}-microglobulina y pT_{7}H_{6}FX-m\beta_{2}-microglobulina
Los fragmentos de ADN amplificados que contenían las pautas de lectura de la \beta_{2}-microglobulina humana y de ratón de los residuos aminoácidos Iles a Met_{99} se fusionaron al extremo 5' de las secuencias de nucleótidos que codificaban el sitio de corte de FX_{a} (SEC. N° ID.: 37), se cortaron con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligaron con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pT_{7}H_{6} cortado con BamHI e HindIII usando procedimientos estándar.
Figura 3 Secuencias de aminoácidos de la \beta_{2}-microglobulina humana y de ratón
A: Secuencia de aminoácidos predicha de la longitud completa de la pauta de lectura de la \beta_{2}-microglobulina humana (SEC. N° ID.: 49). Se indica el residuo aminoácido uno (Ile) en la proteína madura procesada. B: Secuencia de aminoácidos predicha de la longitud completa de la pauta de lectura de la \beta_{2}-microglobulina de ratón (SEC. N° ID.: 49). Se indica el residuo aminoácido uno (Ile) en la proteína madura procesada.
Figura 4 Construcción del plásmido de expresión pT_{7}H_{6}FX-hGH
El fragmento de ADN amplificado que contenía la pauta de lectura de la Hormona del Crecimiento humana entre los residuos aminoácidos Phel y Phe191 se fusionó al extremo 5' de la secuencia de nucleótido que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindlIl (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pT_{7}H_{6} cortado con BamHI e HindIII usando procedimientos estándar.
Figura 5 Secuencia de aminoácidos de la Hormona del Crecimiento humana (somatotropina)
Secuencia de aminoácidos predicha de la totalidad de la longitud de la pauta de lectura de la Hormona del Crecimiento humana (SEC. N° ID.: 51). Se indica el residuo aminoácido uno (Phe) en la proteína madura procesada.
Figura 6 Construcción de los plásmidos de expresión pT_{7}H_{6}FX-#1, #2 y #3 que expresan los residuos aminoácidos n° 20 (Ala) a 109 (Arg), los residuos aminoácidos n° 20 (Ala) a 190 (Ala), y los residuos aminoácidos n° 20 (Ala) a 521 (Lys) de la proteína del Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina (a2MR) (SEC. N° ID.: 52).
Los fragmentos de ADN amplificados derivados de la pauta de lectura de la \alpha_{2}MR desde #1: residuo aminoácido n° 20 (Ala) a 109 (Arg), #2: residuo aminoácido n° 20 (Ala) a 190 (Ala), #3: residuo aminoácido n° 20 (Ala) a 521 (Lys), se fusionaron al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortaron con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligaron con la ligasa de ADN de T4 (adquirida a Boehringer, Germany) en pT7H6 cortado con BamHI e HindIII usando procedimientos estándar.
Figura 7 Construcción de los plásmidos de expresión pLcIIMLCH_{6}FX-#4, #5 y #6 que expresan los residuos aminoácidos n° 803 (Gly) a 1265 (Asp), los residuos aminoácidos n° 849 (Val) a 1184 (Gln), y los residuos aminoácidos n° 1184 (Gln) a 1582 (Lys) de la proteína del Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina (\alpha_{2}MR) (SEC. N° ID.: 52).
Los fragmentos de ADN amplificados derivados de la pauta de lectura de la \alpha_{2}MR desde #4: residuo aminoácido n° 803 (Gly) a 1265 (Asp), #5: residuo aminoácido n° 849 (Val) a 1184 (Gln), #6: residuo aminoácido n° 1184 (Gln) a 1582 (Lys), se fusionaron al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortaron con las endonucleasas de restricción BamHI o BCI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligaron usando procedimientos estándar con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pLcIIMLCH_{6}FX cortado con BamHI e HindIII.
Figura 8 Construcción de los plásmidos de expresión pLcIIMLCH_{6}FX-#7, #8 y #9 que expresan los residuos aminoácidos n° 803 (Gly) a 1582 (Lys), los residuos aminoácidos n° 2519 (Ala) a 2941 (Ile), y los residuos aminoácidos n° 3331 (Val) a 3778 (Ile) de la proteína del Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina (\alpha_{2}MR) (SEC. N° ID.: 52).
Los fragmentos de ADN amplificados derivados de la pauta de lectura de la a2MR desde #7: residuo aminoácido n° 803 (Gly) a 1582 (Lys), #8: residuo aminoácido n° 2519 (Ala) a 2941 (Ile), #9: residuo aminoácido n° 331 (Val) a 3778 (Ile), se fusionaron al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortaron con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligaron usando procedimientos estándar con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pLcIIMLCH_{6}FX cortado con BamHI e HindIII.
Figura 9 Secuencia de aminoácidos de la proteína del Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana (\alpha_{2}MR) (SEC. N° ID.: 52).
Secuencia de aminoácidos predicha de la totalidad de la longitud de la pauta de lectura de la proteína del Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana (SEC. N° ID.: 52). Los residuos aminoácidos presentes in las proteínas recombinantes como residuos N- o C-terminales se identifican por sus números por encima de la secuencia de la \alpha_{2}MR.
Figura 10 Construcción del plásmido de expresión pLcIIMLCH_{6}FX\Delta\gamma
El fragmento de ADN amplificado que contiene la pauta de lectura del Factor X de coagulación de la sangre bovino, desde el residuo aminoácido Ser_{82} hasta el Trp_{484} (FX\Delta\gamma), se fusionó al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pLcIIMLCH_{6}FX, cortado con BamHI e HindIII, usando procedimientos estándar.
Figura 11 Secuencia de aminoácidos del factor X de coagulación de la sangre bovino (FX)
Secuencia de aminoácidos predicha de la totalidad de la longitud de la pauta de lectura que codifica el FX bovino (SEC. N° ID.: 53). Se identifican el residuo N-terminal Ser_{82} y el residuo Trp_{484} C-terminal en la construcción FX\Delta\gamma.
Figura 12 Construcción del plásmido de expresión pLcIIMLCH_{6}FX-K1
El fragmento de ADN amplificado que contiene la pauta de lectura del kringle 1 del plasminógeno humano (K1), desde el residuo aminoácido Ser_{82} hasta el Glu_{162} (numerados como en el "Glu"-plasminógeno), fusionado al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pLcIIMLCH_{6}FX, cortado con BamHI e HindIII, usando procedimientos estándar.
Figura 13 Construcción del plásmido de expresión pLcIIMLCH_{6}FX-K4
El fragmento de ADN amplificado que contiene la pauta de lectura del kringle 4 del plasminógeno humano (K4), desde el residuo aminoácido Val_{354} hasta el Ala_{439} (numerados como en el "Glu"-plasminógeno), fusionado al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pLcIIMLCH_{6}FX, cortado con BamHI e HindIII, usando procedimientos estándar.
Figura 14 Secuencia de aminoácidos de "Glu"-plasminógeno humano (SEC. N° ID.: 54)
Los residuos aminoácidos N- y C-terminales en las construcciones K1 y K4 se identifican por sus números en la secuencia.
Figura 15 Análisis mediante SDS-PAGE de la producción y plegamiento in vitro de \beta_{2}-microglobulina humana.
Carril 1: Extracto crudo de proteína antes de su aplicación a una columna de Ni^{2+}NTA-agarosa (muestra reducida).
Carril 2: Flujo a través de la columna durante la aplicación del extracto crudo de proteína sobre la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa (muestra reducida).
Carril 3: \beta_{2}-microglobulina humana eluída de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa después del procedimiento cíclico de plegamiento por parte del tampón de elución no desnaturalizante (muestra reducida).
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Carril 4: Marcadores proteicos (Pharmacia, Suecia): desde la parte superior del gel; 96 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, y 14,4 kDa (muestra reducida).
Carril 5: Igual que el carril 3 (muestra no reducida)
Carril 6: \beta_{2}-microglobulina humana después de su corte con FX_{a} y purificación final (muestra no reducida).
Figura 16 Análisis mediante SDS-PAGE del plegamiento in vitro de la Hormona del Crecimiento humana; hGH (Somatotropina)
Carril 1: Marcadores proteicos (Pharmacia, Suecia): desde la parte superior del gel; 96 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, y 14,4 kDa (muestra reducida).
Carril 2: hGH humana eluída de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa después del procedimiento cíclico de plegamiento por parte del tampón de elución no desnaturalizante (muestra no reducida).
Carril 3: hGH humana eluída de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa después del procedimiento cíclico de plegamiento por parte del tampón de elución desnaturalizante B a partir del procedimiento de plegado (muestra no reducida).
Carriles 4-18: Fracciones recolectadas durante la separación de hGH monomérica-proteína de fusión, procedente de proteínas de fusión diméricas y multiméricas, después del procedimiento cíclico de plegamiento mediante cromatografía de intercambio jónico en una Q-Sepharose (Pharmacia, Suecia). La proteína monomérica se eluyó en un pico bien separado a partir del pico que contenía las proteínas diméricas y multiméricas (muestras no reducidas).
Figura 17 Análisis mediante SDS-PAGE del plegamiento in vitro de los kringle 1 y 4 recombinantes procedentes de plasminógeno humano y la proteína de fusión #4 recombinante derivada de la Proteína Receptora de \alpha_{2}-Macroglobulina (\alpha_{2}MR)
Carril 1: Marcadores proteicos (Pharmacia, Suecia): desde la parte superior del gel; 96 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, y 14,4 kDa (muestra reducida).
Carril 2: Extracto crudo de proteína de fusión-K1 antes de su aplicación a una columna de Ni^{2+}NTA-agarosa (muestra reducida).
Carril 3: K1-proteína de fusión eluída de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa después del procedimiento cíclico de plegamiento por parte del tampón de elución no desnaturalizante (muestra reducida).
Carril 4: Igual que el carril 3 (muestra no reducida).
Carril 5: Flujo a través de la columna de lisina-agarosa (muestra no reducida).
Carril 6: K1-proteína de fusión eluída de la columna de lisina-agarosa (muestra no reducida).
Carril 7: K4-proteína de fusión eluída de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa después del procedimiento cíclico de plegamiento por parte del tampón de elución no desnaturalizante (muestra reducida).
Carril 8: Igual que el carril 7 (muestra no reducida).
Carril 9: \alpha_{2}MR#4-proteína de fusión eluida de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa después del procedimiento cíclico de plegamiento por parte del tampón de elución no desnaturalizante (muestra reducida).
Carril 10: Igual que el carril 9 (muestra no reducida).
Figura 18 Construcción del plásmido de expresión pT_{7}H_{6}FX-\alpha_{2}MRBDv
El fragmento de ADN amplificado que contiene la pauta de lectura de la \alpha_{2}-Macroglobulina, desde el residuo aminoácido Val_{1299} hasta el Ala_{1451}, fusionado al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pT_{7}H_{6}, cortado con BamHI e HindIII, usando procedimientos estándar.
Figura 19
Secuencia de aminoácidos del dominio de unión del receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana (desde el residuo Val_{1200} hasta el Ala_{1451}) (SEC. N° ID.: 55).
Figura 20 Construcción del plásmido de expresión pT_{7}H_{6}FX-TETN.
El fragmento de ADN amplificado que contiene la pauta de lectura de la Tetranectina humana monomérica madura, desde el residuo aminoácido Glul hasta el Val_{181}, fusionado al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pT_{7}H_{6}, cortado con BamHI e HindIII, usando procedimientos estándar.
Figura 21 Secuencia de aminoácidos de la Tetranectina monomérica humana
Secuencia de aminoácidos predicha de la pauta de lectura de longitud completa que codifica la Tetranectina humana (SEC. N° ID.: 56). Se indica el primer residuo aminoácido en la proteína madura procesada (Glu_{1}).
Figura 22 Construcción del plásmido de expresión pT_{7}H_{6}FX-DB32.
El fragmento de ADN amplificado que contiene la pauta de lectura del diacuerpo artificial DB32, desde el residuo aminoácido G1n1 hasta el Asn_{246}, fusionado al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codificaba el sitio de corte de FX_{a} IEGR (SEC. N° ID.: 38), se cortó con las endonucleasas de restricción BamHI e HindIII (compradas a Boehringer, Germany), y se ligó con la ligasa de ADN de T_{4} (adquirida a Boehringer, Germany) en pT_{7}H_{6}, cortado con BamHI e HindIII, usando procedimientos estándar.
Figura 23
Secuencia de aminoácidos del diacuerpo artificial DB32 (SEC. N° ID.: 57)
Figura 24 El plásmido de expresión pT_{7}H_{6}FX-PS.4
La construcción de pT_{7}H_{6}FX-PS.4 expresando la psoriasina humana, desde el residuo aminoácido Ser_{2} hasta el Gln_{101}, ha sido descrita previamente (Hoffman, 1994).
Figura 25 Secuencia de aminoácidos de la psoriasina humana
La secuencia de aminoácidos predicha de la pauta de lectura de longitud completa que codifica la psoriasina humana (SEC. N° ID.: 58).
Figura 26 Análisis mediante SDS-PAGE de la purificación y corte con FX_{a} del diacuerpo recombinante Mab 32. a. Diferentes etapas de la purificación
Carriles 1 y 2: Producto crudo del plegamiento.
Carril 3: Producto final purificado de la proteína de fusión del diacuerpo Mab 32.
Carril 4: Sobrenadante del producto de plegamiento crudo después de concentrarlo 50 veces y centrifugarlo.
Carril 5: Precipitado procedente del producto de plegamiento crudo después de concentrarlo 50 veces y centrifugarlo.
\newpage
b. Corte con FX_{a} de la proteína de fusión del diacuerpo Mab 32
Carriles 1 y 5: Proteína de fusión del diacuerpo Mab 32 purificada final.
Carril 2: Proporción molar 1:5 FX_{a}:proteína de fusión del diacuerpo Mab 32, a 37°C durante 20 horas.
Carril 3: Proporción molar 1:2 FX_{a}:proteína de fusión del diacuerpo Mab 32, a 37°C durante 20 horas.
Carril 4: Proporción molar 1:1 FX_{a}:proteína de fusión del diacuerpo Mab 32, a 37°C durante 20 horas.
Figura 27 Conveniencia del glutatión como agente reductor en el plegamiento cíclico de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglo- bulina humana.
Carril 1: Muestra reducida del ensayo n° 1.
Carril 2: Muestra no reducida del ensayo n° 1.
Carril 3: Muestra no reducida del ensayo n° 2.
Carril 4: Muestra no reducida del ensayo n° 3.
Carril 5: Muestra no reducida del ensayo n° 4.
Carril 6: Muestra no reducida del ensayo n° 5.
Carril 7: Muestra no reducida del ensayo n° 6.
Carril 8: Muestra no reducida del ensayo n° 7.
Carril 9: Muestra no reducida del ensayo n° 8.
Carril 10: Muestra no reducida del ensayo n° 9.
Carril 11: Muestra no reducida del ensayo n° 10.
Carril 12: Muestra no reducida del ensayo n° 11.
Figura 28 Conveniencia de la L-cisteína como agente reductor en el plegamiento cíclico de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana
Carril 1: Muestra reducida del ensayo n° 1.
Carril 2: Muestra no reducida del ensayo n° 1.
Carril 3: Muestra no reducida del ensayo n° 2.
Carril 4: Muestra no reducida del ensayo n° 3.
Carril 5: Muestra no reducida del ensayo n° 4.
Carril 6: Muestra no reducida del ensayo n° 5.
Carril 7: Muestra no reducida del ensayo n° 6.
Carril 8: Muestra no reducida del ensayo n° 7.
Carril 9: Muestra no reducida del ensayo n° 8.
Carril 10: Muestra no reducida del ensayo n° 9.
Figura 29 Conveniencia del 2-mercaptoetanol como agente reductor en el plegamiento cíclico de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana
Carril 1: Muestra reducida del ensayo n° 1.
Carril 2: Muestra no reducida del ensayo n° 1.
Carril 3: Muestra no reducida del ensayo n° 2.
Carril 4: Muestra no reducida del ensayo n° 3.
Carril 5: Muestra no reducida del ensayo n° 4.
Carril 6: Muestra no reducida del ensayo n° 5.
Carril 7: Muestra no reducida del ensayo n° 6.
Carril 8: Muestra no reducida del ensayo n° 7.
Carril 9: Muestra no reducida del ensayo n° 8.
Carril 10: Muestra no reducida del ensayo n° 9.
Figura 30 Conveniencia del ácido mercaptosuccínico como agente reductor en el plegamiento cíclico de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana
Carril 1: Muestra no reducida del ensayo n° 1.
Carril 2: Muestra no reducida del ensayo n° 2.
Carril 3: Muestra no reducida del ensayo n° 3.
Carril 4: Muestra no reducida del ensayo n° 4.
Carril 5: Muestra no reducida del ensayo n° 5.
Carril 6: Muestra no reducida del ensayo n° 6.
Carril 7: Muestra no reducida del ensayo n° 7.
Carril 8: Muestra no reducida del ensayo n° 8.
Carril 9: Muestra no reducida del ensayo n° 9.
Figura 31 Conveniencia del N-acetil-L-cisteína como agente reductor en el plegamiento cíclico de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana
Carril 1: Muestra reducida del ensayo n° 1.
Carril 2: Muestra no reducida del ensayo n° 1.
Carril 3: Muestra no reducida del ensayo n° 2.
Carril 4: Muestra no reducida del ensayo n° 3.
Carril 5: Muestra no reducida del ensayo n° 4.
Carril 6: Muestra no reducida del ensayo n° 5.
Carril 7: Muestra no reducida del ensayo n° 6.
Carril 8: Muestra no reducida del ensayo n° 7.
Carril 9: Muestra no reducida del ensayo n° 8.
Carril 10: Muestra no reducida del ensayo n° 9.
Figura 32 Análisis mediante SDS-PAGE del plegamiento cíclico de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana
Carril 1: Extracto crudo de proteína antes de su aplicación a la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa (muestra reducida).
Carril 2: 8 \mul de muestra de la fracción soluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo tal como se describe en el Ejemplo 1.
Carril 3: 4 \mul de muestra de la fracción soluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo tal como se describe en el Ejemplo 1.
Carril 4: 2 \mul de muestra de la fracción soluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo tal como se describe en el Ejemplo 1.
Carril 5: 8 \mul de muestra de la fracción insoluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo tal como se describe en el Ejemplo 1.
Carriles 6 y 7: producto fina de la h\beta_{2}-microglobulina después de su purificación mediante cromatografía de intercambio iónico.
Carril 8 y 9: h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo después de la optimización del protocolo de plegamiento de nuevo tal como se describe en el Ejemplo 13.
Figura 33 Análisis mediante SDS-PAGE del plegamiento de nuevo de la proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana mediante pasos de tampón y gradiente lineal.
Carril 1: Muestra procedente de la fracción soluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo, plegada mediante el protocolo de pasos de tampón tal como se describe en el Ejemplo 13.
Carriles 2 y 3: Muestra procedente de la fracción insoluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo, plegada mediante el protocolo de pasos de tampón tal como se describe en el Ejemplo 13.
Carril 4: Marcadores proteicos (Pharmacia, Suecia): desde la parte superior del gel; 96 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa, y 14,4 kDa (muestra reducida).
Carril 5: Muestra procedente de la fracción soluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo, plegada mediante el protocolo de gradiente lineal tal como se describe en el Ejemplo 13.
Carriles 6 y 7: Muestra procedente de la fracción insoluble de h\beta_{2}-microglobulina plegada de nuevo, plegada mediante el protocolo de gradiente lineal tal como se describe en el Ejemplo 13.
Figura 34 Esquema general del diseño de las proteínas de fusión descritas en los ejemplos
En el extremo N-terminal de la proteína de fusión se inserta opcionalmente un "segmento intensificador" que potencia el nivel de expresión de la proteína de fusión en la célula que expresa el ADN que codifica la proteína de fusión. En posición C-terminal respecto éste, el "6H" indica los 6 residuos histidina que constituyen un sitio quelante de iones usado como "asa de afinidad" durante la purificación y plegamiento de nuevo de las proteínas de fusión. El "FX" en el extremo C-terminal del sitio de 6 histidinas es el sitio de corte por FX_{a}. Finalmente, la parte de la proteína de fusión etiquetada como "proteína" representa la proteína que se va a plegar de nuevo de acuerdo con el procedimiento de la invención.
Ejemplos
Los Ejemplos 1 a 11 de esta sección, los cuales se usan para ejemplificar el "procedimiento de plegamiento cíclico", describen todos ellos el proceso de plegamiento de una proteína híbrida que se puede cortar recombinante (proteína de fusión) producida en E. coli, purificada a partir de un extracto proteico crudo, y sometida a plegamiento sin purificación ulterior mediante un procedimiento general.
\newpage
La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante, que va a producirse, está fusionada, en su extremo 5', a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que especifica un sitio de corte para FX_{a} (FX), a su vez enlazado de forma N-terminal a un segmento que contiene seis residuos histidina (SEC. N° ID.: 47). El engarce del sitio de corte para FX_{a} se consigue normalmente durante una Reacción en Cadena de la Polimerasa, en donde el cebador 5'-terminal comprende nucleótidos que codifican esta secuencia. El engarce de los seis residuos histidina se obtiene normalmente empleando un vector que comprende un fragmento de nucleótido que codifica la SEC. N° ID.: 47. Los seis residuos de histidina constituyen un sitio quelante de iones metálicos, el cual se utiliza como asa de afinidad durante la purificación de la proteína de fusión, y subsiguientemente como el punto de contacto con la matriz sólida durante el proceso de plegamiento cíclico. Ocasionalmente, se insertan "segmentos potenciadores" (por ejemplo, un segmento derivado del extremo N-terminal de la proteína \lambdacII, el algunos casos seguido por un segmento derivado de la cadena ligera de miosina), de forma N-terminal respecto el asa de afinidad, con objeto de mejorar el nivel de expresión de la proteína de fusión en E. coli.
Las proteínas de fusión se diseñaron todas ellas e acuerdo con el mismo esquema general (cf. Figura 34). La presencia de segmentos potenciadores, el asa de afinidad, y el sitio de corte FX, podrían complicar el plegamiento de nuevo de la proteína de fusión. Esto significa que el material de proteína de fusión que ha sido parcialmente degradado por el huésped E. coli es retenido sobre la matriz de afinidad, además de la columna de proteína de fusión de longitud completa. Esta proteína de fusión degradada bien pudiera interferir gravemente con el plegamiento de la proteína de fusión de longitud completa, reduciendo, por tanto, la eficiencia aparente del proceso. Por tanto, los resultados de eficiencia de plegamiento informados en los Ejemplos 1 a 11 no pueden compararse directamente con la eficiencia del proceso de plegamiento de la proteína de fusión purificada.
Los ejemplos 1 a 11 describen el procedimiento de plegamiento de nuevo de 21 proteínas diferentes, dominios de proteínas, o agrupaciones de proteínas, que oscilan desde un tamaña de 82 aminoácidos (K1, Ejemplo 6) hasta 780 aminoácidos (\alpha_{2}MR#7, Ejemplo 4), y el número de puentes disulfuro en las proteínas oscila desde cero (\alpha_{2}MRAP, Ejemplo 3) hasta 33 (\alpha_{2}MR#4, Ejemplo 4) y 36 (\alpha_{2}MR#7, Ejemplo 4).
La eficiencia del plegamiento de nuevo de las proteínas oscila desde el 15 hasta el 95%, y el rendimiento de proteína activa es del orden de 10-100 mg para el plegamiento de nuevo en una columna de 40 ml de Ni+NTA-agarosa (NTA indica un ácido nitriloacético sustituido).
Las TABLAS 1-5 siguientes demuestran los perfiles de gradientes usados en los ejemplos. El "tiempo" se indica en minutos y el "flujo" en ml/min.
TABLA 1
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
1 0 2 100 0 61 900 2 100 0
2 45 2 100 0 62 945 2 100 0
3 46 2 0 100 63 946 2 60 40
4 52 2 0 100 64 952 2 60 40
5 60 2 100 0 65 960 2 100 0
6 105 2 100 0 66 1005 2 100 0
7 106 2 4 96 67 1006 2 62 38
8 113 2 4 96 68 1012 2 62 38
9 120 2 100 0 69 1020 2 100 0
10 165 2 100 0 70 1065 2 100 0
11 166 2 8 92 71 1066 2 64 36
12 172 2 8 92 72 1072 2 64 36
13 180 2 100 0 73 1080 2 100 0
14 225 2 100 0 74 1125 2 100 0
TABLA 1 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
15 226 2 12 88 75 1126 2 66 34
16 232 2 12 88 76 1132 2 66 34
17 240 2 100 0 77 1140 2 100 0
18 285 2 100 0 78 1185 2 100 0
19 286 2 16 84 79 1186 2 68 32
20 292 2 16 84 80 1192 2 68 32
21 300 2 100 0 81 1200 2 100 0
22 345 2 100 0 82 1245 2 100 0
23 346 2 20 80 83 1246 2 70 30
24 352 2 20 80 84 1252 2 70 30
25 350 2 100 0 85 1260 2 100 0
26 405 2 100 0 86 1305 2 100 0
27 406 2 24 76 87 1306 2 72 28
28 412 2 24 76 88 1312 2 72 28
29 420 2 100 0 89 1319 2 100 0
30 465 2 100 0 90 1364 2 100 0
31 466 2 28 72 91 1365 2 74 26
32 472 2 28 72 92 1371 2 74 26
33 480 2 100 0 93 1378 2 100 0
34 525 2 100 0 94 1423 2 100 0
35 526 2 32 68 95 1424 2 76 24
36 532 2 32 68 96 1430 2 76 24
37 540 2 100 0 97 1437 2 100 0
38 582 2 100 0 98 1482 2 100 0
39 586 2 36 64 99 1483 2 78 22
40 592 2 36 64 100 1489 2 78 22
41 600 2 100 0 101 1496 2 100 0
42 645 2 100 0 102 1541 2 100 0
43 646 2 40 60 103 1542 2 80 20
44 652 2 40 60 104 1548 2 80 20
45 660 2 100 0 105 1555 2 100 0
TABLA 1 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
46 705 2 100 0 106 1556 2 82 18
47 706 2 44 56 107 1562 2 82 18
48 713 2 44 56 108 1569 2 100 0
49 720 2 100 0 109 1614 2 100 0
50 765 2 100 0 110 1615 2 84 16
51 766 2 48 52 111 1621 2 84 16
52 772 2 48 52 112 1628 2 84 16
53 780 2 100 0 113 1673 2 100 0
54 825 2 100 0 114 1674 2 88 12
55 826 2 52 48 115 1732 2 88 12
56 832 2 52 48 116 1733 2 100 0
57 840 2 100 0 117 1778 2 100 0
58 885 2 100 0 2
59 886 2 56 44 2
60 892 2 56 44 2
TABLA 2
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
1 0 2 100 0 49 720 2 100 0
2 45 2 100 0 50 765 2 100 0
3 46 2 0 100 51 766 2 74 26
4 52 2 0 100 52 772 2 74 26
5 60 2 100 0 53 780 2 100 0
6 105 2 100 0 54 825 2 100 0
7 106 2 8 92 55 826 2 76 24
8 113 2 8 92 56 832 2 76 24
9 120 2 100 0 57 840 2 100 0
10 165 2 100 0 58 885 2 100 0
11 166 2 20 80 59 886 2 78 22
12 172 2 20 80 60 892 2 78 22
13 180 2 100 0 61 900 2 100 0
TABLA 2 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
14 225 2 100 0 62 945 2 100 0
15 226 2 28 72 63 946 2 80 20
16 232 2 28 72 64 952 2 80 20
17 240 2 100 0 65 960 2 100 0
18 285 2 100 0 66 1005 2 100 0
19 286 2 34 66 67 1006 2 82 18
20 292 2 34 66 68 1012 2 82 18
21 300 2 100 0 69 1020 2 100 0
22 345 2 100 0 70 1065 2 100 0
23 346 2 42 58 71 1066 2 84 16
24 352 2 42 58 72 1072 2 84 16
25 360 2 100 0 73 1080 2 100 0
26 405 2 100 0 74 1125 2 100 0
27 406 2 50 50 75 1126 2 86 14
28 412 2 50 50 76 1132 2 86 14
29 420 2 100 0 77 1140 2 100 0
30 465 2 100 0 78 1185 2 100 0
31 466 2 54 46 79 1186 2 88 12
32 472 2 54 48 80 1192 2 88 72
33 480 2 100 0 81 1200 2 100 0
34 525 2 100 0 82 1245 2 100 0
35 526 2 58 42 83 1246 2 90 10
36 532 2 58 42 84 1252 2 90 10
37 540 2 100 0 85 1260 2 100 0
38 585 2 100 0 86 1305 2 100 0
39 586 2 62 38 87 1306 2 95 5
40 592 2 62 38 88 1312 2 95 5
41 600 2 100 0 89 1319 2 100 0
42 645 2 100 0 90 1364 2 100 0
43 646 2 66 34
44 652 2 66 34
TABLA 2 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
45 660 2 100 0
46 705 2 100 0
47 706 2 70 30
48 713 2 70 30
TABLA 3
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
1 0,0 1,0 0,0 100,0 25,0 420,5 1,0 60,0 40,0
2 10,0 1,0 0,0 100,0 26,0 430,0 1,0 60,0 40,0
3 40,0 1,0 100,0 0,0 27,0 460,0 1,0 100,0 0,0
4 70,0 1,0 100,0 0,0 28,0 490,0 1,0 100,0 0,0
5 70,5 1,0 10,0 90,0 29,0 490,5 1,0 70,0 30,0
6 80,0 1,0 10,0 90,0 30,0 500,0 1,0 70,0 30,0
7 110,0 1,0 100,0 0,0 31,0 530,0 1,0 100,0 0,0
8 140,0 1,0 100,0 0,0 32,0 560,0 1,0 100,0 0,0
9 140,5 1,0 20,0 80,0 33,0 560,5 1,0 80,0 20,0
10 150,0 1,0 20,0 80,0 34,0 570,0 1,0 80,0 20,0
11 180,0 1,0 100,0 0,0 35,0 600,0 1,0 100,0 0,0
12 210,0 1,0 100,0 0,0 36,0 630,0 1,0 100,0 0,0
13 210,5 1,0 30,0 70,0 37,0 630,5 1,0 85,0 15,0
14 220,0 1,0 30,0 70,0 38,0 640,0 1,0 85,0 15,0
15 250,0 1,0 100,0 0,0 39,0 670,0 1,0 100,0 0,0
16 280,0 1,0 100,0 0,0 40,0 700,0 1,0 100,0 0,0
17 280,5 1,0 40,0 60,0 41,0 700,5 1,0 88,0 12,0
18 290,0 1,0 40,0 60,0 42,0 710,0 1,0 88,0 12,0
19 320,0 1,0 100,0 0,0 43,0 740,0 1,0 100,0 0,0
20 350,0 1,0 100,0 0,0 44,0 770,0 1,0 100,0 0,0
21 350,5 1,0 50,0 50,0 45,0 770,5 1,0 90,0 10,0
22 360,0 1,0 50,0 50,0 46,0 780,0 1,0 90,0 10,0
23 390,0 1,0 100,0 0,0 47,0 810,0 1,0 100,0 0,0
24 520,0 1,0 100,0 0,0 48,0 850,0 1,0 100,0 0,0
TABLA 4
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
1 0 2 100 0 49 720 2 100 0
2 45 2 100 0 50 765 2 100 0
3 46 2 0 100 51 766 2 48 52
4 52 2 0 100 52 772 2 48 52
5 60 2 100 0 53 780 2 100 0
6 105 2 100 0 54 825 2 100 0
7 106 2 4 96 55 826 2 52 48
8 113 2 4 96 56 832 2 52 48
9 120 2 100 0 57 840 2 100 0
10 165 2 100 0 58 885 2 100 0
11 166 2 8 92 59 886 2 56 44
12 172 2 8 92 60 892 2 56 44
13 180 2 100 0 61 900 2 100 0
14 225 2 100 0 62 945 2 100 0
15 226 2 12 88 63 946 2 60 40
16 232 2 12 88 64 952 2 60 40
17 240 2 100 0 65 960 2 100 0
18 285 2 100 0 66 1005 2 100 0
19 286 2 16 84 67 1006 2 64 36
20 292 2 16 84 68 1012 2 64 36
21 300 2 100 0 69 1020 2 100 0
22 345 2 100 0 70 1065 2 100 0
23 346 2 20 80 71 1066 2 68 32
24 352 2 20 80 72 1072 2 68 32
25 360 2 100 0 73 1080 2 100 0
26 405 2 100 0 74 1125 2 100 0
27 406 2 24 76 75 1126 2 70 30
28 412 2 24 76 76 1132 2 70 30
29 420 2 100 0 77 1140 2 100 0
30 465 2 100 0 78 1185 2 100 0
31 466 2 28 72 79 1186 2 72 28
TABLA 4 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
32 472 2 28 72 80 1192 2 72 28
33 480 2 100 0 81 1200 2 100 0
34 525 2 100 0 82 1245 2 100 0
35 526 2 32 68 83 1246 2 75 25
36 532 2 32 68 84 1252 2 75 25
37 540 2 100 0 85 1260 2 100 0
38 585 2 100 0 86 1305 2 100 0
39 586 2 36 64 87 1306 2 80 20
40 592 2 36 64 88 1312 2 80 20
41 600 2 100 0 89 1319 2 100 0
42 645 2 100 0 90 1364 2 100 0
43 646 2 40 60 91 1365 2 85 15
44 652 2 40 60 92 1371 2 85 15
45 660 2 100 0 93 1378 2 100 0
46 705 2 100 0 94 1423 2 100 0
47 706 2 44 56
48 713 2 44 56
TABLA 5
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
1 0 2 100 0 49 720 2 100 0
2 45 2 100 0 50 765 2 100 0
3 46 2 0 100 51 766 2 52 48
4 52 2 0 100 52 772 2 52 48
5 60 2 100 0 53 780 2 100 0
6 105 2 100 0 54 825 2 100 0
7 106 2 13 87 55 826 2 54 46
8 113 2 13 87 56 832 2 54 46
9 120 2 100 0 57 840 2 100 0
10 165 2 100 0 58 885 2 100 0
11 166 2 25 75 59 886 2 56 44
TABLA 5 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
12 172 2 25 75 60 892 2 56 44
13 180 2 100 0 61 900 2 100 0
14 225 2 100 0 62 945 2 100 0
15 226 2 29 71 63 946 2 58 42
16 232 2 29 71 64 952 2 58 42
17 240 2 100 0 65 960 2 100 0
18 285 2 100 0 66 1005 2 100 0
19 286 2 34 66 67 1006 2 60 40
20 292 2 34 66 68 1012 2 60 40
21 300 2 100 0 69 1020 2 100 0
22 345 2 100 0 70 1065 2 100 0
23 346 2 38 62 71 1066 2 62 38
24 352 2 38 62 72 1072 2 62 38
25 360 2 100 0 73 1080 2 100 0
26 405 2 100 0 74 1125 2 100 0
27 406 2 40 60 75 1126 2 66 34
28 412 2 40 60 76 1132 2 66 34
29 420 2 100 0 77 1140 2 100 0
30 465 2 100 0 78 1185 2 100 0
31 466 2 42 58 79 1186 2 70 30
32 472 2 42 58 80 1192 2 70 30
33 480 2 100 0 81 1200 2 100 0
34 525 2 100 0 82 1245, 2 100 0
35 526 2 44 56 83 1246 2 74 26
36 532 2 44 56 84 1252 2 74 26
37 540 2 100 0 85 1260 2 100 0
38 585 2 100 0 86 1305 2 100 0
39 586 2 46 54 87 1306 2 78 22
40 592 2 46 54 88 1312 2 78 22
41 600 2 100 0 89 1319 2 100 0
42 645 2 100 0 90 1364 2 100 0
TABLA 5 (continuación)
Paso Tiempo Flujo %A %B Paso Tiempo Flujo %A %B
43 646 2 48 52 91 1365 2 82 18
44 652 2 48 52 92 1371 2 82 18
45 660 2 100 0 93 1378 2 100 0
46 705 2 100 0 94 1423 2 100 0
47 706 2 50 50
48 713 2 50 50
Ejemplo 1 Producción y plegamiento de la \beta_{2}-microglobulina humana y de ratón
Este ejemplo describe la producción en E. coli de ambas, la \beta_{2}-microglobulina humana y la \beta_{2}-microglobulina de ratón, como proteínas de fusión que pueden cortarse con FX_{a}, y la purificación de las \beta_{2}-microglobulinas recombinantes humana y de ratón después de su corte con FX_{a}.
Los clones de plásmidos contienen los cADN de longitud completa que codifican las proteínas \beta_{2}-microglobulina (generosamente proporcionadas por el Dr. David N. Garboczi al Dr. Soeren Buus) se usaron como plantillas en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988) diseñada para producir fragmentos de cADN correspondientes a las proteínas \beta_{2}-microglobulina humana madura (correspondiente a los residuos aminoácidos Ile_{1} a Met_{99}) y de ratón madura (correspondiente a los residuos aminoácidos Ilel a Met99), mediante el uso de los cebadores de las SEC. N° ID.: 3 y SEC. N° ID.: 4 (para la \beta_{2}-microglobulina humana) y las SEC. N° ID.: 5 y SEC. N° ID.: 6 (para la \beta_{2}-microglobulina de ratón). Los marcos de lectura codificantes ampliados se unieron en los extremos 5', a través de la reacción PCR, con secuencias de nucleótidos, incluidas en las SEC. N° ID.: 3 y 5, que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, 1987). Los fragmentos de ADN amplificados se subclonaron en el vector de expresión pT_{7}H_{6} de E. coli (Christensen et al., 1991). La construcción de los plásmidos pT_{7}H_{6}FX-h\beta_{2}-microglobulina resultantes (que expresan la \beta_{2}-microglobulina humana) y del pT_{7}H_{6}FX-m\beta_{2}-microglobulina resultantes (que expresan la \beta_{2}-microglobulina de ratón) se representa en la Figura 2, y en la Figura 3 se muestran las secuencias de aminoácidos de las proteínas expresadas (en las SEC. N° ID.: 49 (humana) y SEC. N° ID.: 50 (de ratón) se muestran las secuencias de aminoácidos codificadas por los marcos de lectura de longitud completa).
La \beta_{2}-microglobulina humana y de ratón se produjeron haciendo crecer y expresando los plásmidos pT_{7}H_{6}FX-h\beta_{2}-microglobulina y \beta_{2}-microglobulina en células de E. coli en una escala intermedia (2 x 1 litro), tal como fue descrito por Studier y Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986). Los cultivos creciendo exponencial a 37°C se infectaron a una OD_{600} de 0,8 con el bacteriófago \lambdaCE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C durante otras tres horas antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base). La proteína se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, 2-mercaptoetanol 10 mM y metionina 3 mM, la preparación cruda de proteína se aplicó a columnas de NTA-agarosa activadas con Ni^{2+} para la purificación (Hochuli et al., 1988) de las proteínas de fusión, MGSHHHHHHGSIEGR-\beta_{2}-microglobulina humana y de ratón (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) respectivamente, y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o uso.
La matriz de NTA-agarosa activada por Ni^{2+} (Ni^{2+}NTA-agarosa) está disponible comercialmente en Diagen GmbH, Alemania. No obstante, durante el curso de este trabajo, se halló que este producto comercial no funcionaba tan bien como se esperaba. Nuestras observaciones fueron que las matriz de NTA-agarosa se bloqueaba fácilmente cuando se aplicaba el extracto de proteína total desnaturalizado y reducido, que la capacidad de proteína de fusión era inferior a la esperada, y que la matriz podía regenerarse exitosamente sólo unas pocas veces.
Con objeto de mejorar las prestaciones de la Ni^{2+}-NTA-agarosa, se decidió realizar un acoplamientocarbodiimida con el ligando N-(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético ácido metal (ruta de síntesis tal como describen Döbeli & Hochuli (EPO 0.253.303) a una matriz más rígida (por ejemplo, Sepharose CL-6B, Pharmacia, Suecia).
Se ajustaron 8 g de ácido N-(5-amino-1-carboxipentil)iminodiacético procedentes del procedimiento de síntesis en 50 ml se ajustaron a pH 10 mediante la adición de 29 g de Na_{2}CO_{3} (10 H_{2}O), y se añadieron a una suspensión agitada de Sepharose CL-6B activada en Na_{2}CO_{3} 1 M. Se dejó la reacción durante la noche.
La Sepharose CL-6B (inicialmente 100 ml de suspensión) se activo después de la supresión de agua mediante acetona con 7 g de 1,1-carbonilidimidazol, bajo agitación, durante 15 a 30 minutos. A partir de su activación, la Sephadex CL-6B se lavó con acetona seguida por Na_{2}CO_{3} 1 M. La matriz de NTA-agarosa se cargó en una columna y se "cargó" con Ni2+ haciendo pasar lentamente 5 volúmenes de columna de una solución de NiSO_{4} al 10%. La cantidad de Ni^{2+} en la matriz de NTA-agarosa preparada mediante este procedimiento ha sido determinada en 104 \mumoles por ml de matriz. La matriz de Ni^{2+}NTA-agarosa se empaquetó en una columna de clase estándar para cromatografía líquida (diámetro interno: 2,6 cm) para un volumen de 40 ml. Después de cargar la Ni^{+}NTA agarosa, se lavó la columna con dos volúmenes de columna de agua, un volumen de columna de Tris-HCl 1 M, y dos volúmenes de columnas de agua, un volumen de columna de Tris-HCl 1 M pH 8, y dos volúmenes de columna de tampón de carga, antes de la aplicación del extracto crudo de proteína.
A partir de la aplicación de los extractos crudos de proteína sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, las proteínas de fusión, MGSHHHHHHGSIEGR-h\beta_{2}m y de ratón y MGSHHHHHHGSIEGR-m\beta_{2}m (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) respectivamente, se purificaron de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con una columna del tampón de carga, seguido por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM Tris-HCl, 2-mercaptoetanol 10 mM, y metionina 3 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm de los eluidos de la columna fue estable.
Las proteínas de fusión se plegaron de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 1 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y glutatión reducido/oxidado
1,2 mM/0,4 mM como tampón A, y urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, metionina 3 mM, y glutatión reducido 6 mM como tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, las proteínas de fusión h\beta_{2}-microglobulina y m\beta_{2}-microglobulina se eluyeron de las columnas de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM pH 8.
Las proteínas que se habían agregado y precipitado en las columnas de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyeron en tampón B. Aproximadamente el 75% del material de proteína de fusión se eluyó mediante tampón de elución no desnaturalizante (ver Figura 16, carriles 2 y 3).
Tal como se juzgó mediante análisis con SDS-PAGE no reductor, aproximadamente el 70% del material de proteína de fusión h\beta_{2}-microglobulina soluble (correspondiente a 40 mg de proteína de fusión h\beta_{2}-microglobulina) aparecía como monomérico (ver Figura 15, carriles 5 y 3), mientras que el 25% de la proteína de fusión m\beta_{2}-microglobulina aparecía como monomérica (correspondiente a 20 mg de la proteína de fusión m\beta_{2}-microglobulina). La eficiencia conjunta del procedimiento de plegado es por tanto de aproximadamente el 50% para la proteína de fusión h\beta_{2}-microglobulina y de menos del 20% para la proteína de fusión m\beta_{2}-microglobulina.
Las proteínas de fusión monoméricas h\beta_{2}-microglobulina y m\beta_{2}-microglobulina se purificaron a partir de dímeros y multímeros de orden superior mediante cromatografía de intercambio iónico con S-Sepharose (Pharmacia, Suecia). Las proteínas de fusión eluidas por el tampón de elución no desnaturalizante (aproximadamente el 70% del material de proteína de fusión) se filtraron en gel, en un tampón que contenía NaCl 5 mM y Tris-HCl 5 mM pH 8, en Sephadex
G-25, y se diluyeron 1:1 con agua antes de aplicarlas sobre columnas de intercambio iónico S-Sepharose. Las proteínas de fusión se eluyeron a lo largo de 5 volúmenes de columna con un gradiente lineal, desde NaCl 2,5 mM, Tris-HCl
2,5 mM pH 8, hasta NaCl 100 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8. Las proteínas de fusión monoméricas h\beta_{2}-microglobulina, así como la m\beta_{2}-microglobulina, se eluyeron muy al inicio del gradiente, mientras que los dímeros y multímeros de orden superior eluyeron más tarde. Las fracciones que contenían las proteínas de fusión monoméricas se diluyeron con agua y se cargaron de nuevo en las columnas de S-Sepharose, y se eluyeron en un único paso en NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8.
Las proteínas de fusión monoméricas se cortaron con la proteasa de restricción FX_{a} a lo largo de la noche, a temperatura ambiente, en una proporción peso a peso de aproximadamente 200 a uno.
Después del corte, las proteínas h\beta_{2}-microglobulina y m\beta_{2}-microglobulina recombinantes se purificaron de la cola de fusión N-terminal, liberada de la proteína de fusión cortada, y del FX_{a} mediante cromatografía de intercambio iónico en columnas Q-Sepharose (Pharmacia, Suecia). A partir de la filtración en gel con Sephadex G-25 en NaCl
5 mM, Tris-HCl 5 mM pH 8, y de la dilución 1:1 con agua, las h\beta_{2}-microglobulina y m\beta_{2}-microglobulina se eluyeron en un gradiente lineal (a lo largo de 5 volúmenes de columna) desde NaCl 2,5 M, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, hasta NaCl
100 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8. Las fracciones que contenían las proteínas recombinantes cortadas se diluyeron con agua y se cargaron de nuevo sobre las columnas de Q-Sepharose, y se eluyeron en un único paso en NaCl 1 M, Tris-HCl
50 mM pH 8. Las proteínas h\beta_{2}-microglobulina y m\beta_{2}-microglobulina se filtraron en gel y se prepararon inmediatamente en NH_{4}HCO_{3} 20 mM, y se liofilizaron dos veces.
El análisis mediante SDS-PAGE de la producción de \beta_{2}-microglobulina humana recombinante se presenta en la Figura 15.
El rendimiento de \beta_{2}-microglobulina humana recombinante producida mediante este procedimiento fue de 30 mg.
El rendimiento de \beta_{2}-microglobulina de ratón recombinante producida mediante este procedimiento fue de 10 mg.
La comparación de la humana recombinante con \beta_{2}-microglobulina humana natural purificada fue realizado amablemente por el Dr. Soeren Buus en dos ensayos diferentes:
1.
Se halló que la \beta_{2}-microglobulina humana recombinante y la \beta_{2}-microglobulina humana natural reaccionaban con ambos, un anticuerpo monoclonal y uno monoespecífico, con idéntica afinidad.
2.
En un experimento de inhibición de la unión usando ligandos marcados radiactivamente, se halló que la \beta_{2}-microglobulina humana recombinante y la \beta_{2}-microglobulina humana natural unían moléculas Kd de la clase I de cadena pesada, purificadas mediante afinidad, con una afinidad idéntica.
Se halló que la \beta_{2}-microglobulina recombinante de ratón unía moléculas de cadena pesada naturales de la clase I con una afinidad 5 veces inferior a la de la \beta_{2}-microglobulina humana. Este resultado está en concordancia con resultados previos, procedentes de la literatura, que usan material natural.
Ejemplo 2 Producción y plegamiento de la Hormona del Crecimiento Humana (Somatotropina)
Este ejemplo describe la producción en E. coli de hormona del crecimiento humana (hGH) como una proteína de fusión que puede cortarse con FX_{a}, y la purificación de la hGH recombinante después de su corte con FX_{a}.
Un clon plasmídico, que contenía el cADN que codificaba la hGH (generosamente proporcionadas por el Dr. Henrik Dalboege (Dalboege \etal, 1987)) se usó como plantilla en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988), usando los cebadores de las SEC. N° ID.: 7 y SEC. N° ID.: 8, diseñados para producir un fragmento de cADN correspondiente a la proteína hGH madura (correspondiente a los residuos aminoácidos Phe_{1} a Phe_{191}). El marco de lectura codificante ampliado estaba unido en el extremo 5', a través de la reacción PCR, a una secuencia nucleotídica, incluida en la SEC. N° ID.: 7, que codificaba la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, 1987). El fragmento de ADN amplificado se subclonó en el vector de expresión pT_{7}H_{6} de E. coli (Christensen et al., 1991). La construcción del plásmido pT_{7}H_{6}FX-hGH resultante (que expresa la Hormona del Crecimiento humana) se representa en la Figura 4, y en la Figura 5 se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada (en la SEC. N° ID.: 51 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura de longitud completa).
La Hormona del Crecimiento humana se produjo haciendo crecer y expresando el plásmido pT_{7}H_{6}FX-hHG en células E. coli en una escala intermedia (2 x 1 litro), tal como fue descrito por Studier y Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986). Los cultivos creciendo exponencialmente a 37°C se infectaron a una OD_{600} de 0,8 con el bacteriófago \lambdaCE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C durante otras tres horas antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base). La proteína se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, 2-mercaptoetanol 10 mM y metionina 3 mM, la preparación cruda de proteína se aplicó a columnas de NTA-agarosa activadas con Ni^{2+} (Ni^{2+}NTA-agarosa) para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión, MGSHHHHHHGSIEGR-hGH (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48), y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
La preparación y carga de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
A partir de la aplicación del extracto crudo de proteína sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-hGH (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se purificó de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con una columna del tampón de carga, seguida por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM Tris-HCl, 2-mercaptoetanol 10 mM, y metionina 3 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm de los eluidos de la columna fue estable.
La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 2 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y glutatión reducido/oxidado 1,0 mM/0,1 mM como tampón A, y urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, metionina 1 mM, y glutatión reducido 5 mM como tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión hGH se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM pH 8. La proteína de fusión que se había agregado y precipitado en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyó en tampón B.
Aproximadamente el 80% del material de proteína de fusión se eluyó mediante el tampón de elución no desnaturalizante (ver Figura 16, carriles 2 y 3). Tal como se juzgó mediante análisis con SDS-PAGE no reductor, aproximadamente el 90% del material de proteína de fusión hGH soluble (correspondiente a aproximadamente 70 mg de proteína de fusión) aparecía como monomérico (ver Figura 16, carril 2), rindiendo una eficiencia conjunta del procedimiento de plegado de aproximadamente el 70%.
La proteína de fusión monomérica hGH se purificó a partir de dímeros y multímeros de orden superior mediante cromatografía de intercambio iónico con Q-Sepharose (Pharmacia, Suecia). Después de su filtración en gel en un tampón que contenía NaCl 25 mM y Tris-HCl 25 mM pH 8, en Sephadex G-25, el material de proteína de fusión, eluido por el tampón no desnaturalizante, se aplicó sobre una columna de intercambio iónico Q-Sepharose. La proteína de fusión se eluyó a lo largo de 5 volúmenes de columna con un gradiente lineal, desde NaCl 25 mM, Tris-HCl
25 mM pH 8, hasta NaCl 200 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8. La proteína de fusión monomérica hGH se eluyó muy al inicio del gradiente, mientras que los dímeros y multímeros de orden superior eluyeron más tarde. A las fracciones que contenían la proteína de fusión monomérica pura se les adicionó NiSO_{4} y ácido iminoadiacéito (IDA, ajustado a pH 8 con NaOH) hasta 1 mM, y se cortaron con la proteasa de restricción FX_{a} durante 5 horas a 37°C, en una proporción peso a peso de aproximadamente 100 a uno. FX-a es inhibido después del corte mediante la adición de benzamidina hidrocloruro hasta 1 mM.
Después del corte, la proteína hGH recombinante se aisló de la proteína de fusión no cortada y de la cola de fusión liberada, a partir de la filtración en gel con Sephadex G-25 en urea 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8, para suprimir el Ni^{2+}IDA y la benzamidina, mediante pasaje a través de una pequeña columna de Ni^{2+}NTA-agarosa seguida en línea por una pequeña columna de Nd^{3+}NTA-agarosa, y subsiguientemente por un columna de NTA-agarosa no activada con Ni^{2+}, para asegurar respectivamente la total supresión del Fx_{a} y de Ni^{2+} y Nd^{3+}. La hGH se purificó a partir de una fracción menor del producto de corte recombinante mediante cromatografía de intercambio iónico sobre una
Q-Sepharose: hGH se eluyó en un gradiente lineal (a lo largo de 5 volúmenes de columna) desde urea 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8, hasta urea 8 M, NaCl 250 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8. Las fracciones que contenían la proteína recombinante cortada purificada se filtraron en gel en NH_{4}HCO_{3} 20 mM recién preparado, y se liofilizaron dos veces.
El análisis mediante SDS-PAGE de la producción de y plegamiento de la hormona del crecimiento humana recombinante se presenta en la Figura 16.
El rendimiento de hormona del crecimiento humana recombinante producida mediante este procedimiento fue de 10 mg.
La hormona del crecimiento humana recombinante producida mediante este procedimiento co-migraba, tanto en SDS-PAGE reductor y no reductor, como en análisis PAGE no desnaturalizante, con hormona del crecimiento humana biológicamente activa, generosamente proporcionada por Novo-Nordisk A/S.
Ejemplo 3 Producción y plegamiento de la \alpha_{2}MRAP humana
El plásmido usado para la expresión en células BL21 de E. coli de la Proteína Asociada al Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana (\alpha_{2}MRAP), pT7H6FX-\alpha_{2}MRAP, y las condiciones usadas para la producción de la proteína de fusión han sido previamente descritas por nosotros en Nykjaer et al., J. Biol. Chem. 267:14543-14546, 1992. Los cebadores de la SEC. N° ID.: 9 y SEC. N° ID.: 10 se usaron en la PCR empleada para multiplicar el ADN que codificaba la \alpha_{2}MRAP.
El extracto crudo de proteína precipitado a partir de la fase fenol de la extracción de células procedentes de 2 litros de cultivo de células BL21 de BL21 de E. colique expresaban la MGSHHHHHHGSIEGR-\alpha_{2}MRAP (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se disolvieron en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y metionina 1 mM, la preparación cruda de proteína se aplicó a una matriz de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} (Ni^{2+}NTA-agarosa) para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión, MGSHHHHHHGSIEGR-\alpha_{2}MRAP (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48), y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
La preparación y carga de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
A partir de la aplicación del extracto crudo de proteína sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-\alpha_{2}MRAP (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se purificó de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con un volumen de columna del tampón de carga, seguido por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM Tris.HCl, y metionina 1 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm del eluyente fue estable.
La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 3 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, y 2-mercaptoetanol 2 mM como tampón A, y cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, y 2-mercaptoetanol 2 mM como
tampón B.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión \alpha_{2}MRAP se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM pH 8.
Prácticamente no se halló proteína de fusión que estuviera agregada o precipitada en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa. El rendimiento estimado de proteína de fusión a_MRAP fue de 60 mg, y la eficiencia del procedimiento de plegamiento fue cercana al 95%.
La proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-a2MRAP (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se cortó con la proteasa de restricción FX_{a} durante toda la noche, a temperatura ambiente, en una proporción peso a peso de aproximadamente 200 a uno en el tampón de elución. A partir de su filtración en gel con Sephadex G-25 en NaCl 100 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8, la solución de proteína se pasó a través de una columna de Ni^{2+}NTA-agarosa, suprimiendo de ese modo proteína de fusión no cortada y la cola N-terminal de fusión liberada originaria de las proteínas de fusión cortadas. Finalmente, la solución de proteína se diluyó 1:4 con agua, y la proteína \alpha_{2}MRAP se purificó del FX_{a} mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q-Sepharose (Pharmacia, Suecia). La columna de Q-Sepharose se eluyó con un gradiente lineal, a lo largo de 6 volúmenes de columna, desde NaCl 25 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8, hasta NaCl 250 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8. La \alpha_{2}MRAP eluyó muy al inicio del gradiente lineal, mientras que el FX_{a} eluyó más tarde.
El rendimiento de proteína \alpha_{2}MRAP producida mediante este procedimiento fue de 40 mg.
De acuerdo con el Dr Nykjaer, se ha hallado que las características de unión de ligando (es decir, unión al Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina e interferencia con el complejo Activador del Plasminógeno de Uroquinasa humana-Inhibidor del tipo I del Activador del Plasminógeno al Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina) son idénticas a las características de unión del ligando de la proteína natural purificada.
Ejemplo 4 Producción y plegamiento de dominios y agrupaciones de dominios del Receptor \alpha_{2}-M
La Proteína Relacionada con el Receptor de Lipoproteínas de Baja Densidad/Receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina (\alpha_{2}MR) es un receptor de membrana endocítico de 600 kDa. La \alpha_{2}MR se sintetiza como una proteína precursora con una única cadena de 4524 aminoácidos. El precursor es procesado en un cadena \beta transmembrana de 85 kDa, y una cadena \alpha de 500 kDa unida no covalentemente al domino extracelular de la cadena \beta. La \alpha_{2}MR es conocida por unir el Ca^{2+} de manera dependiente de la estructura (por ejemplo, la proteína reducida no une el Ca^{2+}) y se cree que es multifuncional en el sentido de que la \alpha_{2}MR une ligandos de diferentes clases.
La secuencia completa de aminoácidos de la cadena-\alpha puede representarse mediante agrupaciones de tres tipos de repeticiones también halladas en otros receptores unidos a membrana y en varias proteínas plasmáticas:
A:
Este tipo de repetición abarca aproximadamente 40 residuos aminoácidos, y se caracteriza por la aparición secuencial de los seis residuos cisteína contenidos en la repetición. Algunos autores han denominado a esta repetición dominio del tipo complemento.
B:
Este tipo de repetición también abarca aproximadamente 40 residuos aminoácidos, y se caracteriza por la aparición secuencial de los seis residuos cisteína contenidos en la repetición. En la literatura se ha denominado a esta repetición dominio del tipo EGF.
C:
Este tipo de repetición abarca aproximadamente 55 residuos aminoácidos, y se caracteriza por la presencia de la secuencia consenso de la SEC. N° ID.: 39.
Este ejemplo describe la producción en E. coli de un cierto número de dominios y agrupaciones de dominios derivados de la proteína \alpha_{2}-MR como proteínas de fusión que pueden cortarse, y la purificación, plegamiento in vitro, y el corte con FX_{a} y procesamiento de estas proteínas recombinantes.
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Un clon plasmídico, que contenía el cADN de longitud completa que codificaba la proteína \alpha_{2}-MR humana (generosamente proporcionadas por el Dr. Joachim Herz, Herz et al., EMBO J. 7:4119-4127, 1988) se usó como plantilla en una serie de Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) diseñadas para producir fragmentos de cADN correspondientes a un cierto número de polipéptidos que representan dominios y agrupaciones de dominios derivados de la proteína \alpha_{2}-MR:
#1:
Contiene dos dominios del tipo A, corresponde a los residuos aminoácidos 20 a 109 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 11 y SEC. N° ID.: 12.
#2:
Contiene dos dominios del tipo A seguidos por dos dominios del tipo B, corresponde a los residuos aminoácidos 20 a 190 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 11 y SEC. N° ID.: 13.
#3:
Idéntico a #2 seguido por una región que contiene repeticiones YWTD, corresponde a los residuos aminoácidos 20 a 521. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 11 y SEC. N° ID.: 14.
#4:
Contiene un dominio del tipo B, seguido por 8 dominios del tipo-A, y finalmente dos dominios del tipo B, corresponde a los residuos aminoácidos 803 a 1265 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 15 y SEC. N° ID.: 16.
#5:
Contiene sólo 8 dominios del tipo A también presentes en #4, corresponde a los residuos aminoácidos 849 a 1184 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC.N° ID.: 17 y SEC. N° ID.: 18.
#6:
Contiene los dos dominios del tipo B C-terminales de #4, seguidos por 8 repeticiones YWTD y un dominio del tipo B, corresponde a los residuos aminoácidos 1184 a 1582 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 19 y SEC. N° ID.: 20.
#7:
Contiene la región completa incluida en las construcciones #4 a #6, corresponde a los residuos aminoácidos 803 a 1582 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 15 y SEC. N° ID.: 20.
#8:
Contiene 10 dominios del tipo A, corresponde a los residuos aminoácidos 2520 a 2941 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 21 y SEC. N° ID.: 22.
#9:
Contiene 11 dominios del tipo A, corresponde a los residuos aminoácidos 3331 a 3778 en la proteína \alpha_{2}-MR. En la PCR se usaron los cebadores de las SEC. N° ID.: 23 y SEC. N° ID.: 24.
Las secuencias de nucleótidos amplificadas que codificaban los dominios y agrupaciones de dominios estaban unidas en su extremo 5', a través de la reacción PCR, a secuencias nucleotídicas (incluidas en las SEC. N° ID.: 11, 15, 17, 19, 21 y 23) que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, Methods in Enzymology 152:461-481, 1987). Los fragmentos de ADN amplificados se subclonaron en el vector de expresión pT_{7}H_{6} de E. coli (Christensen et al., 1991) o en el plásmido de expresión pLcIIMLCH_{6}, el cual se modifica a partir de pLcIIMLC (Nagai et al., Nature 332:284-286, 1988) mediante la inserción de un oligonucleótido que codifica seis residuos histidina C-terminales del fragmento de cadena ligera de la miosina. La construcción de los plásmidos resultantes pT_{7}H_{6}FX-#1 a #3 y pLcIIMLCH_{6}FX-#4 a #9 se representa en las Figura 6-8, y en la Figura 9 se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada (en la SEC. N° ID.: 52 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura de longitud completa).
Los dominios y agrupaciones de dominios subclonados en la serie pT_{7}H_{6}FX se cultivaron y expresaron en células BL21 de E. coli en una escala intermedia (2 x 1 litro), tal como fue descrito por Studier y Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986). Los cultivos creciendo exponencialmente a 37°C se infectaron a una OD_{600} de 0,8 con el bacteriófago \lambdaCE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C durante otras tres horas antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base).
Los dominios y agrupaciones de dominios subclonados en la serie pLcIIMLCH_{6} se cultivaron y expresaron en células QY13 de E. coli tal como fue descrito por Nagai y Thoegersen, Methods in Enzymology 152: 461-481 (1987). Los cultivos creciendo exponencialmente (4 litros) a 30°C a una OD_{600} de 1,0 se transfirieron a 42°C durante 15 minutos. Este choque térmico induce la síntesis de las proteínas de fusión. Los cultivos se incubaron a 37°C durante 3 horas adicionales antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base).
La proteína cruda se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, 2-mercaptoetanol 10 mM y metionina 2 mM, las preparaciones de proteína cruda se aplicaron a columnas de NTA-agarosa activadas con Ni^{2+} para la purificación (Hochuli et al., 1988) de las proteínas de fusión, y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
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Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
La preparación y carga de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
A partir de la aplicación de los extractos crudos de proteínas sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, las proteínas de fusión se purificaron de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con un volumen de columna del tampón de carga, seguida por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM Tris.HCl, 2-mercaptoetanol 10 mM, y metionina 2 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm de los eluidos de la columna fue estable.
Cada una de las proteínas de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 4 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, metionina
0,33 mM, y glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM como tampón A, y urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, metionina 2 mM, y glutatión reducido 3 mM como tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, las proteínas de fusión representando dominios y agrupaciones de dominios derivados de la proteína \alpha_{2}-MR se eluyeron de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM pH 8. Las proteínas de fusión que se habían agregado y precipitado en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyeron en tampón B.
Aproximadamente el 75% del material de proteína de fusión expresado a partir de los plásmidos pT_{7}H_{6}FX-#1 y #2, que representan los dos y cuatro dominios N-terminales ricos en cisteínas de la proteína \alpha_{2}-MR, se eluyeron de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa mediante el tampón no desnaturalizante. La mayoría de este material de proteína de fusión aparecía como monomérico tal como se juzgó mediante análisis con SDS-PAGE no reductor. El rendimiento de proteína de fusión monomérica #1 y #2 se estimó en aproximadamente 50 mg.
Aproximadamente el 50% del material de proteína de fusión expresado a partir de todos los otros plásmidos de expresión, que representan agrupaciones de dominios derivadas de la proteína \alpha_{2}-MR, se eluyeron de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa mediante el tampón no desnaturalizante. Entre el 30% (proteínas de fusión #5 y #7) y el 65% (proteína de fusión #4) de estas proteínas de fusión aparecían como monoméricas, tal como se juzgó mediante análisis con no reductor (ver Figura 17, carriles #9 y #10).
Cada proteína de fusión eluída por el tampón de elución no desnaturalizante se cortó con la proteasa de restricción FX_{a}, durante toda la noche, a temperatura ambiente, en una proporción peso a peso de aproximadamente 100 a uno.
A partir de su filtración en gel con Sephadex G-25 en NaCl 100 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 8, la solución de proteína se pasó a través de una columna de Ni^{2+}NTA-agarosa, suprimiendo de ese modo la proteína de fusión no cortada y la cola N-terminal de fusión liberada originaria de las proteínas de fusión cortadas. El FX_{a} se suprimió de la solución haciendo pasar las soluciones de proteína recombinante a través de una pequeña columna de SBTI-agarosa (Inhibidor de la tripsina del haba de soja inmovilizado sobre Sepharose CL-65 (Pharmacia, Suecia)).
El análisis mediante SDS-PAGE del producto plegado de nuevo de la proteína de fusión soluble #4 se presenta e en la Figura 17, carriles 9 y 10, mostrando respectivamente muestras reducidas y no reducidas. El incremento de movilidad observado para la muestra no reducida refleja la compacidad del polipéptido debido a la presencia de 33 puentes disulfuro.
Se halló que cada una de las proteínas recombinantes unía el Ca^{2+} de manera dependiente de la estructura.
El Dr. Soeren Moestrup halló que un anticuerpo monoclonal, el A2MR\alpha-5, derivado de la \alpha_{2}-MR humana natural, unía las proteínas recombinantes expresadas por las construcciones #4, #6 y #7, mientras que el anticuerpo monoespecífico A2MR\alpha-3, derivado también de la \alpha_{2}-MR natural, unía la proteína recombinante expresadas por la construcción #8. La unión específica de ambos anticuerpos depende de la estructura (es decir, los anticuerpos no reacción ni con la \alpha_{2}-MR reducida ni con la proteína recombinante reducida).
Ejemplo 5 Producción y plegamiento del Factor X_{a} de la coagulación bovino (FX_{a})
Este ejemplo describe la producción en E. coli de un fragmento derivado del FX_{a} bovino como una proteína de fusión que pueden cortarse con FX_{a}, y la purificación, plegamiento in vitro, y el procesamiento de la proteína recombinante.
El cADN que codificaba el FX bovino se clonó mediante amplificación específica en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de las secuencias de nucleótidos que codifican el FX bovino desde el residuo aminoácido Ser_{82} hasta el Trp_{484} (SEC. N° ID.: 2, residuos 82-484) (FX\delta\gamma, la numeración de los aminoácidos se refiere al marco de lectura codificante completo), usando cADN de la 1ª hebra cebado con oligo-dT, sintetizado a partir de ARN de hígado bovino total, como plantilla. Los cebadores usados en la PCR fueron la SEC. N° ID.: 25 y la SEC. N° ID.: 26. La extracción del ARN y la síntesis del cADN se realizaron usando procedimientos estándares.
El marco de lectura amplificado que codificaba el FX\delta\gamma se unió en su extremo 5', a través de la reacción PCR, a secuencias nucleotídicas que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, Methods in Enzymology 152:461-481, 1987). Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron en el vector de expresión pLcIIMLCH_{6}, el cual se modifica a partir de pLcIIMLC (Nagai et al., Nature 332:284-286, 1988) mediante la inserción de un oligonucleótido que codifica seis residuos histidina C-terminales del fragmento de cadena ligera de la miosina. La construcción del plásmido resultante pLcIIMLCH_{6}FX-FX\Delta\gamma se representa en la Figura 10, y en la Figura 11 se muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada (en la SEC. N° ID.: 53 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura de longitud completa).
El plásmido pLcIIMLCH_{6}-FX\Delta\gamma se cultivó y expresó en células QY13 de E. coli tal como se describe en Nagai y Thoegersen, Methods in Enzymology 152: 461-481 (1987). Los cultivos creciendo exponencialmente a 30°C se incubaron a una OD_{600} de 1,0 a 42°C durante 15 minutos. Este choque térmico induce la síntesis de las proteínas de fusión. Los cultivos se incubaron a 37°C durante tres a cuatro horas adicionales antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base).
La proteína cruda se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM, la preparación de proteína cruda se aplicó a una matriz de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión FX\Delta\gamma, y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
La preparación y carga de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
A partir de la aplicación de los extractos crudos de proteínas sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, las proteínas de fusión se purificaron de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con un volumen de columna del tampón de carga, seguido por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM, y 2-mercaptoetanol 10 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm del eluyente de la columna fue estable.
La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}·NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 5 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, y glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM como tampón A, y urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, y glutatión reducido 3 mM como tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 100 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión FX\Delta\gamma se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM pH 8. La proteína de fusión que se había agregado y precipitado en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyeron en tampón B.
Aproximadamente el 33% del material de proteína de fusión FX\Delta\gamma fue eluido de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa mediante el tampón no desnaturalizante. La cantidad de proteína de fusión FX\Delta\gamma se estimó en aproximadamente 15 mg. Sólo aproximadamente un tercio de este material de proteína de fusión aparecía como monomérico, según se juzga mediante análisis SDS-PAGE no reductor, correspondiente a una eficiencia global del procedimiento de plegamiento del 10%.
La proteína de fusión FX\Delta\gamma en agente no desnaturalizante se activó haciendo pasar la solución de proteína recombinante a través de una pequeña columna de tripsina-agarosa (tripsina inmovilizada sobre Sepharose CL-6B (Pharmacia, Suecia)).
La proteína de fusión FX\Delta\gamma recombinante activada se ensayó por su actividad proteolítica y perfil de especificidad de sustrato usando procedimientos estándares y sustratos cromogénicos. La actividad y el perfil de especificidad de sustrato fue indistinguible del obtenido para el FX_{a} bovino natural.
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Ejemplo 6 Producción y plegamiento de dominios kringle 1 y 4 procedentes del plasminógeno humano
Este ejemplo describe la producción en E. coli de los dominios kringle 1 y 4 unidores de lisina procedentes del plasminógeno humano (K1 y K4, respectivamente) como proteínas de fusión que pueden cortarse con FX_{a} y la purificación y plegamiento in vitro de las proteínas de fusión de K1 y K4.
Un clon de plásmido que contenía el cADN de longitud completa que codifica el plasminógeno humano clonado en el vector de clonación general pUC18 (generosamente proporcionado por el Dr. Earl Davie, Seattle, USA) se usó como plantilla en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) diseñada para producir fragmentos de cADN correspondientes a K1 (correspondiente a los residuos aminoácidos Ser_{81} a Glu_{162} en el denominado Glu-plasminógeno) y K4 (correspondiente a los residuos aminoácidos Val_{354} a Ala_{939} en el denominado Glu-plasminógeno). Los cebadores SEC. N° ID.: 27 y SEC. N° ID.: 28 se usaron en la PCR que producía K1, y los cebadores SEC. N° ID.: 29 y SEC. N° ID.: 30 se usaron en la PCR que producía K4.
Los marcos de lectura amplificados que codificaban el K1 y K4 se unieron en su extremo 5', a través de la reacción PCR, a secuencias nucleotídicas, incluidas en las SEC. N° ID.: 27 y SEC. N° ID.: 29, que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, Methods in Enzymology 152:461-481, 1987). El fragmento de ADN amplificado de K1 se clonó en el vector de expresión pLcIIMLCH_{6} de E. coli, el cual se modifica a partir de pLcIIMLC (Nagai et al., Nature 332:284-286, 1988) mediante la inserción de un oligonucleótido que codifica seis residuos histidina C-terminales del fragmento de cadena ligera de la miosina. La construcción del plásmido resultante pLcIIMLCH_{6}FX-K1 se representa en la Figura 12. El fragmento de ADN amplificado de K4 se clonó en el vector de expresión pLcIIH_{6} de E. coli, el cual se modifica a partir de pLcII (Nagai y Thoegersen, Methods in Enzymology 152:461-481, 1987) mediante la inserción de un oligonucleótido que codifica seis residuos histidina C- terminales del fragmento cII. La construcción del plásmido resultante pLcIIH_{6}FX-K4 se representa en la Figura 13, y en la Figura 14 se muestra la secuencia de aminoácidos del "Glu"-plasminógeno humano (SEC. N° ID.: 54).
Tanto el plásmido pLcIIMLCH_{6}-K1 como el plásmido pLcIIH_{6}FX-K4 se cultivaron y expresaron en células QY13 de E. coli tal como se describe en Nagai y Thoegersen, Methods in Enzymology 152: 461-481 (1987). Los cultivos creciendo exponencialmente a 30°C se transfirieron a una OD_{600} de 1,0 a 42°C durante 15 minutos. Este choque térmico induce la síntesis de las proteínas de fusión. Los cultivos se incubaron a 37°C durante tres a cuatro horas adicionales antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base).
La proteína cruda se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, 2-mercaptoetanol 10 mM, y metionina 2 mM, la preparación de proteína cruda se aplicó a una matriz de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} para la purificación (Hochuli et al., 1988) de las proteínas de fusión de K1 y K4, y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
La preparación y carga de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
A partir de la aplicación de los extractos crudos de proteínas sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, las proteínas de fusión se purificaron de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con un volumen de columna del tampón de carga, seguido por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM, y metionina 2 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm del eluyente de la columna fue estable.
La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 4 con NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, ácido aminohexanoico 10 mM (ácido
\varepsilon-aminocaprónico, \varepsilon-ACA), metionina 0,33 mM, y glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM como tampón A, y urea 4 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, \varepsilon-ACA 10 mM, metionina 2 mM, y glutatión reducido 3 mM como tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 100 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, cada una de las proteínas de fusión de K1 y K4 se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 5 mM pH 8. Las proteínas de fusión que se habían agregado y precipitado en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyeron en tampón B.
Virtualmente todo el material de proteínas de fusión de K1 y K4 se eluyó de las columnas de Ni^{2+}NTA-agarosa con el tampón desnaturalizante. El rendimiento estimado de la proteína de fusión de K1 y de la proteína de fusión de K4 fue de 60 mg. Virtualmente la totalidad de la proteína de fusión de K1, así como de la proteína de fusión de K4, apareció como monomérica, según se juzgó mediante análisis de SDS-PAGE, correspondiente a una eficiencia del procedimiento de plegado superior al 90%.
El análisis mediante SDS-PAGE de la producción de kringles 1 y 4 recombinantes de plasminógeno se presenta en la Figura 17.
La proteína de fusión de K1 y la proteína de fusión de K4 se purificaron aún más mediante cromatografía de afinidad con lisina-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Suecia). Las proteínas de fusión se eluyeron de las columnas de afinidad mediante un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, \varepsilon-ACA 10 mM.
La unión a lisina-Sepharose se acepta normalmente como indicación del correcto plegamiento de los dominios kringle unidores de lisina.
La estructura tridimensional de los dominios proteicos K1 y K4, producidos mediante este procedimiento de plegamiento cíclico, y que se habían procesado completamente mediante su liberación de la cola de fusión N-terminal y subsiguientemente purificado mediante cromatografía de intercambio fónico, ha sido confirmada mediante difracción de rayos X (realizada por el Dr. Robert Huber) y análisis bidimensional de RMN (realizado por el estudiante de doctorado Peter Reinholdt y el Dr. Flemming Poulsen).
El rendimiento general de dominios proteicos K1 y K4 completamente procesados mediante este procedimiento es de 5 mg/litro de cultivo.
Ejemplo 7 Producción en E. coli y plegamiento de fragmentos recombinantes derivados de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana y de la Ovostatina del pollo
Este ejemplo describe la producción en E. coli del dominio receptor de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana (\alpha_{2}-MRBDv) como proteína de fusión que puede cortarse con FX_{a}, y la purificación de la \alpha_{2}-MRBDv recombinante después de su corte con FX_{a}.
El fragmento de ADN de 462 p.b. que codifica el marco de lectura de la \alpha_{2}-Macroglobulina desde el residuo aminoácido Val_{1299} hasta el Ala_{1451} (\alpha_{2}-MRDv) se amplificó en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), siguiendo esencialmente el protocolo de Saiki et al. (1988). El pA2M (generosamente proporcionado por el Dr. T. Kristensen), que contiene el cADN de longitud completa de la \alpha_{2}-Macroglobulina humana, se usó como plantilla, y los oligonucleótidos SEC. N° ID.: 31 y SEC. N° ID.: 32 como cebadores. El marco de lectura amplificado se unió por su extremo 5', a través de la reacción de PCR, a una secuencia nucleotídica, incluida en la SEC. N° ID.: 7, que codificaba la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, 1987). El fragmento de ADN amplificado se subclonó en el vector de expresión pT_{7}H_{6} de E. coli (Christensen et al., 1991). La construcción del plásmido resultante pT_{7}H_{6}FX-\alpha_{2}MRDv (expresando la \alpha_{2}-MRDv humana) se representa en la Figura 18, y la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada se muestra en la Figura 19 (SEC. N° ID.: 55).
La \alpha_{2}MRDv humana recombinante se produjo mediante el cultivo y expresión del plásmido pT_{7}H_{6}FX-\alpha_{2}MRDv en células BL12 de E. coli a media escala (2 x 1 litro) tal como se describe en Studier y Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986). Los cultivos creciendo exponencialmente a 37°C se infectaron a una OD_{600} de 0,8 con el bacteriófago \lambdaCE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se dejaron crecer a 37°C durante otras tres horas antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se lisaron las células mediante choque osmótico y sonicación, y se extrajo la proteína total en fenol (ajustado a pH 8 con Trisma base). La proteína cruda se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación. El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM, la preparación de proteína cruda se aplicó a una columna de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} (Ni^{2+}NTA-agarosa) para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-\alpha_{2}MRDv (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48), y subsiguientemente para experimentar el procedimiento de plegamiento cíclico.
La preparación y carga de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
A partir de la aplicación de los extractos crudos de proteínas sobre la columna de Ni^{2+}-NTA-agarosa, la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-\alpha_{2}MRDv (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se purificó de la mayoría de proteínas de E. coli y del fago \lambda mediante lavado con un volumen de columna del tampón de carga, seguido por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM, y 2-mercaptoetanol 10 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm del eluyente de la columna fue estable.
La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 4 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM como tampón A, y urea 8 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y glutatión reducido 5 mM como tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión de \alpha_{2}MRDv se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM pH 8. La proteína de fusión que estaba agregada y precipitada en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyó en tampón B.
Aproximadamente el 50% del material de proteína de fusión se eluyó en el tampón de elución acuoso. La mitad de este material de proteína de fusión apareció monomérico y plegado, según se juzgó mediante análisis de SDS-PAGE no reductor.
La proteína \alpha_{2}MRDv recombinante se liberó de la cola de fusión N-terminal mediante corte con la proteasa de restricción FX_{a}, a temperatura ambiente, en una proporción de peso a peso de aproximadamente 50 a uno, durante 4 horas. Después del corte, se aisló la proteína \alpha_{2}MRDv de la proteína de fusión no cortada, de la cola de fusión liberada, y del FX_{a}, mediante filtración en gel con Sephadex-G25 en NaCl 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8, seguida por cromatografía de intercambio iónico con Q-Sepharose: la \alpha_{2}MRDv se eluyó en un gradiente lineal (a lo largo de 10 volúmenes de columna), desde NaCl 10mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8, hasta NaCl 500 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8. La proteína \alpha_{2}MRDv eluyó a 150 mM de NaCl.
El dominio de \alpha_{2}MRDv recombinante se une al receptor \alpha_{2}M con una afinidad similar para el receptor que la exhibida por la molécula \alpha_{2}-Macroglobulina (refiriéndose a la K_{D} estimada en una unión un ligando-un receptor (Moestrup y Gliemann, 1991)). El análisis de unión fue realizado por el Dr. Soeren K. Moestrup y el estudiante de doctorado Kaere Lehmann).
Ejemplo 8 Producción en E. coli y plegamiento de fragmentos recombinantes derivados de la glicoproteina G de la cubierta del virus VHS de trucha
La expresión y plegamiento in vitro de fragmentos recombinantes derivados de la glicoproteína G de la cubierta del virus VHS de trucha en E. coli como proteínas de fusión que se pueden cortar con FX_{a} se realizó usando estrategias generales y procedimientos análogos a los descritos en la descripción general del "procedimiento de plegamiento de nuevo cíclico" y dados en los Ejemplos 1 a 6.
Ejemplo 9 Producción en E. coli y plegamiento de la Tetranectina humana recombinante y fragmentos recombinantes derivados de la Tetranectina humana
La tetranectina es una proteína tetramérica humana consistente en cuatro subunidades idénticas y unidas no covalentemente de cadena única de 181 residuos aminoácidos (17 kDa). Cada subunidad contiene tres puentes disulfuro y une Ca^{2+}. La tetranectina se halla en el plasma y asociada con la matriz extracelular. La tetranectina se une específicamente al kringle 4 del plasminógeno. Esta unión puede valorarse específicamente mediante lisina u \omega-aminoácidos.
El cADN que codifica el marco de lectura correspondiente a la subunidad de cadena sencilla de la tetranectina madura se clonó en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Saiki et al. (1988)) de las secuencias nucleotídicas desde del residuo aminoácido Glul hasta el Val_{181} usando como plantilla la 1ª hebra del cADN cebado con oligo-dT sintetizado a partir de ARN placentario total humano. Los cebadores usados en la PCR fueron las SEC. N° ID.: 33 y SEC. N° ID.: 34. La extracción de ADN y la síntesis de cADN se realizó usando procedimientos estándares.
El marco de lectura amplificado que codificaba la subunidad monomérica de la tetranectina estaba unido en su extremo 5', a través de la reacción de PCR, a secuencias nucleotídicas que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, 1987). Debido al diseño específico del cebador 5' de la PCR (SEC. N° ID.: 33), se insertó un residuo glicina entre el residuo arginina C-terminal del sitio de corte del FX_{a} (SEC. N° ID.: 37) y el residuo Glul de la tetranectina. El fragmento de ADN amplificado se subclonó en el vector de expresión pT_{7}H_{6} de E. coli (Christensen et al., 1991). La construcción del plásmido resultante pT_{7}H_{6}FX-TETN (expresando el monómero de tetranectina) se representa en la Figura 20, y la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada se muestra en la Figura 21 (SEC. N° ID.: 56).
Para preparar el monómero de tetranectina, se cultivó el plásmido pT_{7}H_{6}FX-\alpha_{2}MRDv a media escala (4 x 1 litro; Mmedio 2xTY, MgSO_{4} 5 mM, y 100 \mug de ampicilina) en células BL12 de E. coli, tal como se describe en Studier y Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986). Los cultivos creciendo exponencialmente a 37°C se infectaron a una OD_{600} de 0,8 con el bacteriófago \lambdaCE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Los cultivos se dejaron crecer a 37°C durante otras tres horas antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se resuspendieron las células en
150 ml de NaCl 0,5 M,, Tris-HCl 10 mM pH 8, y EDTA 1 mM pH 8. Se añadió fenol (100 ml, ajustados a pH 8) a la mezcla sonicada para extraer la proteína total.
La proteína se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación.
El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM, la preparación de proteína cruda se aplicó a una columna de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} (Ni2+NTA-agarosa, lavada previamente con 75 ml de urea 8 M, NaCl
1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM) para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-\alpha_{2}MRDv (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48). La preparación y "carga" de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
Se lavó la columna con 200 ml de urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM (Tampón 1), y 100 ml de cloruro de guanidinio 6M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM (Tampón II). La proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-TETN se eluyó con Tampón II que contenía EDTA 10 mM pH 8, y el eluyente de la columna se filtró con Sephadex-G25 usando el Tampón I.
La proteína eluída se plegó a continuación. La proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-TETN (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se mezcló con 100 ml de Ni^{2+}NTA-agarosa. La resina conteniendo proteína unida se empaquetó en una columna de 5 cm de diámetro, y se lavó con Tampón I suplementado con CaCl_{2} hasta 2 mM. La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa, a 11-12°C, usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 4 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, y glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM como Tampón A, y urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM, y glutatión reducido 3 mM como Tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada-de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al Tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión de tetranectina se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM pH 8. La proteína de fusión de tetranectina se cortó con FX_{a}, a 4°C, durante la noche, en una proporción molar de 1:300. Después del corte con FX_{a}, la proteína de fusión cortada se concentró 10 veces mediante ultrafiltración sobre una membrana YM10 (Amicon). La tetranectina recombinada, después de diluir 10 veces la muestra de proteína con CaCl_{2} 2 mM, se aisló mediante cromatografía de intercambio iónico sobre Q-Sepharose (Pharmacia, Suecia) en un gradiente lineal, a lo largo de 10 volúmenes de columna, desde Tris-HCl 10 mM, pH 8, CaCl_{2} 2 mM, hasta Tris-HCl 10 mM, pH 8, CalCl_{2} 2 mM, y NaCl 0,5 M.
La tetranectina recombinante producida mediante este procedimiento fue analizada por el Dr. Inge Clemmensen, Rigshospitale, Copenague. El Dr. Clemmensen halló que la tetranectina recombinante se comportaba, respecto a la unión al kringle 4 de plasminógeno y a la expresión de sitios antigénicos, idénticamente a la tetranectina humana aislada naturalmente.
Los experimentos preliminares que comparaban la eficiencia de plegamiento de nuevo, usando el "procedimiento cíclico de plegamiento de nuevo", de la proteína de fusión recombinante de Tetranectina undia a la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa respecto de la Tetranectina recombinante contenida en un saco de diálisis, indicó un rendimiento mejorado significativo del monómero soluble procedente de la estrategia de plegamiento en solución. No obstante, si cualquier producto de los procedimientos cíclicos se somete a reordenación de disulfuros en solución en presencia de CaCl_{2}, virtualmente todo el material polipeptídico se convierte en el tetrámero de Tetranectina correctamente plegado.
La Tetranectina auténtica recombinante desnaturalizada y reducida contenida en un saco de diálisis, se plegó de nuevo a lo largo de 15 exposiciones cíclicas a Tampón B (urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, glutatión reducido/oxidado 2 mM/0,2 mM, CaCl_{2} 2 mM, y metionina 0,5 mM) y Tampón B (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8, glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM, CaCl_{2} 2 mM, y metionina 0,5 mM).
Ejemplo 10 Producción y plegamiento de un diacuerpo expresado intracelularmente en E. coli: el diacuerpo MaB 32 dirigido contra el factor de necrosis tumoral
Los diacuerpos (descritos en Hollinger et al., 1993) son fragmentos de anticuerpos bivalentes y biespecíficos artificiales.
Este ejemplo describe la producción en E. coli de un diacuerpo dirigido contra el factor alfa de la necrosis tumoral (TNF-\alpha), derivado del anticuerpo monoclonal Mab 32 de ratón (Rathjen et al., 1991, Solicitud de Patente Australiana 7.576; EP-A-486.526).
Un clon de fagémido, el pCANTAB5-myc-Mab32-5, que contenía el Mab32 codificado en el formato diacuerpo (PCT/GB93/02492), fue proporcionado generosamente por el Dr. G. Winter, Cambridge Antibody Technology (CAT) Ltd., Cambridge, Reino Unido. El ADN del pCANTAB5-myc-Mab32-5 se usó como plantilla en una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988), usando los cebadores SEC. N° ID.: 35 y SEC. N° ID.: 36, diseñados para producir un fragmento de cADN correspondiente al diacuerpo artificial completo. El marco de lectura codificante amplificado estaba unido en su extremo 5', a través de la reacción de PCR, a una secuencia nucleotídica, incluida en la SEC. N° ID.: 35, que codificaban la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 37, la cual constituye un sitio de corte para la proteasa de restricción bovina FX_{a} (Nagai y Thoegerson, 1987). El fragmento de ADN amplificado se subclonó en el vector de expresión pT_{7}H_{6} de E. coli (Christensen et al., 1991). La construcción del plásmido resultante pT_{7}H_{6}FX-DB32 (expresando el diacuerpo de Mab32) se representa en la Figura 22, y la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada se muestra en la Figura 23 (en la SEC. N° ID.: 57 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura completo).
Para preparar el fragmento de diacuerpo, se cultivó el plásmido pT_{7}H_{6}FX-DB32 a media escala (4 x 1 litro; medio 2xTY, MgSO_{4} 5 mM, y 100 \mug de ampicilina) en células BL12 de E. coli, tal como se describe en Studier y Moffat, J. Mol. Biol. 189: 113-130 (1986). Los cultivos creciendo exponencialmente a 37°C se infectaron a una OD_{600} de 0,8 con el bacteriófago \lambdaCE6 con una multiplicidad de aproximadamente 5. Cuarenta minutos después de la infección, se añadió rifampicina (0,2 g en 2 ml de metanol por litro de medio). Los cultivos se dejaron crecer a 37°C durante otras tres horas antes de recolectar las células mediante centrifugación. Se resuspendieron las células en 150 ml de NaCl 0,5 M, Tris-HCl 10 mM pH 8, y EDTA 1 mM pH 8. Se añadió fenol (100 ml, ajustados a pH 8) y se sonicó la mezcla para extraer la proteína total. La proteína se precipitó de la fase fenol mediante la adición de 2,5 volúmenes de etanol y centrifugación.
El precipitado de proteína se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol 0,1 M. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM, se aplicó la preparación de proteína cruda a una columna de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} (Ni^{2+}NTA-agarosa, lavada previamente con 75 ml urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM) para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48).
La preparación y "carga" de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
Se lavó la columna con 200 ml de urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM (Tampón 1), y 100 ml de cloruro de guanidinio 6M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM (Tampón II). La proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 se eluyó con Tampón II que contenía EDTA 10 mM pH 8, y el eluyente de la columna se filtró con Sephadex-G25 usando el Tampón I.
La proteína eluída se plegó a continuación. La proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-DB32 (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se mezcló con 100 ml de Ni^{2+}NTA-agarosa. La resina conteniendo proteína unida se empaquetó en una columna de 5 cm de diámetro, y se lavó con Tampón I. La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa, a 11-12°C, usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 4 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y glutatión reducido/oxidado 2,0 mM/0,2 mM como Tampón A, y urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y glutatión reducido 3 mM como Tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al Tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión de DB32 se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM pH 8, y se ajustó hasta GSH 5 mM, GSSG 0,5 mM, y se incubó durante de 12 a 15 horas a 20°C. La proteína de fusión se concentró 50 veces mediante ultrafiltración usando membranas YM10 (Amicon) y se clarificó mediante centrifugación.
El dímero de proteína de fusión de DB32 se purificó mediante filtración en gel usando una columna Superose 12 (Pharmacia, Suecia) con PBS como eluyente.
El rendimiento conjunto de proteína fusión de DB32 correctamente plegada a partir de este procedimiento fue de 4 mg por litro.
En la Figura 26 se muestra un análisis mediante SDS-PAGE no reductor de diferentes etapas de la purificación.
El péptido de fusión N-terminal MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48 se separó de la proteína DB32 mediante corte con la proteasa de restricción FX_{a} (proporción molar 1:5 FX_{a}:proteína de fusión de DB32), a 37°C durante 20 horas. Esto se muestra como la aparición de una banda de peso molecular inferior justo por debajo de la proteína de fusión no cortada en la Figura 26.
\newpage
La proteína DB32 plegada de nuevo fue analizada por Cambridge Antibody Technology Ltd. (CAT). Se halló que el DB32 se unía específicamente al TNF-\alpha y que competía con el anticuerpo Mab32 completo por la unión al TNF-\alpha. Más aún, tanto el DB32 como el Mab32 competían por la unión al TNF-\alpha con el antisuero anti-301 de oveja, el cual se había generado inmunizando ovejas con un péptido que codificaba los primeros 18 aminoácidos del TNF-\alpha humano, y que comprenden la parte final del epítopo reconocido por el Mab32 de ratón.
Ejemplo 11 Producción y plegamiento de nuevo de la psoriasina humana en E. coli
La psoriasina es una proteína unidora de Ca^{2+} de dominio único de 100 residuos aminoácidos (11,5 kDa). La psoriasina contiene un único puente disulfuro. La proteína, que se cree que es un miembro de la familia de la Proteína S100, es regulada en la piel psoriática y en queratinocitos humanos primarios que presenten diferenciación anormal.
El plásmido pT_{7}H_{6}FX-PS.4 (amablemente proporcionado por el Dr. P. Madsen, Institute of Medical Biochemistry, University of Aarhus, Dinamarca) ha sido descrito previamente por Hoffmann et al. (1994). La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína psoriasina desde Ser2 hasta Glnl0l está unida en su extremo 5' a la secuencia de aminoácidos MGSHHHHHHGSIEGR (SEC. N° ID.: 48). En la Figura 24 se indica un mapa de pT_{7}H_{6}FX-PS.4, y la secuencia de aminoácidos de la psoriasina humana se lista en la Figura 25 (en la SEC. N° ID.: 58 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura completo).
La psoriasina humana se hizo crecer y se expresó a partir del plásmido pT_{7}H_{6}FX-FS.4 en células BL12 de E. coli, y la proteína celular total se extrajo como se ha descrito (Hoffman et al., 1994). La proteína total precipitada con etanol se disolvió en un tampón que contenía cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y ditioeritriol
50 mM. A continuación de su filtración en gel sobre Sephadex G-25 (Pharmacia, LKB, Suecia) en urea 8 M, NaCl
0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 5 mM, se aplicó la preparación de proteína cruda a una columna de NTA-agarosa activada con Ni^{2+} (Ni^{2+}NTA-agarosa) para la purificación (Hochuli et al., 1988) de la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-psoriasina (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48), y subsiguientemente para experimentar el procedimiento cíclico de plegado.
La preparación y "carga" de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se describe en el Ejemplo 1.
Todos los tampones preparados para cromatografía líquida se degasaron con vacío antes de la adición del reductor y/o de su uso.
A partir de la aplicación del extracto de proteína crudo sobre la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa, la proteína de fusión MGSHHHHHHGSIEGR-psoriasina (en donde MGSHHHHHHGSIEGR es la SEC. N° ID.: 48) se purificó de la mayoría de las proteínas de E. coli y del fago \lambda lavándola con un volumen de columna del tampón de carga, seguido por cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 5 mM, hasta que la densidad óptica (OD) a 280 nm del eluido fue estable.
La proteína de fusión se plegó de nuevo en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa, a 11-12°C, usando un gestor de gradientes con el perfil descrito en la TABLA 4 y NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM y glutatión reducido/oxidado 1,0 mM/0,1 mM como Tampón A, y urea 8 M, NaCl 1 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, CaCl_{2} 2 mM y glutatión reducido 5 mM como Tampón B. La solución de glutatión reducido/oxidado se preparó inmediatamente como una solución de reserva 200 veces más concentrada, mediante la adición de H_{2}O_{2} 9,9 M a una solución agitada de glutatión reducido 0,2 M antes de su adición al Tampón A.
Una vez completado el procedimiento de plegamiento cíclico, la proteína de fusión de psoriasina se eluyó de la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa con un tampón que contenía NaCl 0,5 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM pH 8. La proteína de fusión que estaba agregada o precipitada en la columna de Ni^{2+}NTA-agarosa se eluyó en tampón B.
Aproximadamente el 95% del material de proteína de fusión fue eluido por el tampón de elución no desnaturalizante. Según se juzgó mediante análisis SDS-PAGE no reductor, el 75% del material de proteína de fusión soluble aparecía como monomérico, rindiendo una eficiencia global del procedimiento de plegamiento de aproximadamente el 70%. La eficiencia del procedimiento de plegamiento de nuevo previamente descrito para la producción de psoriasina humana recombinante (Hoffman et al., 1994) se estimó que era inferior al 25%.
La proteína de fusión de psoriasina se cortó con FX_{a} en una proporción molar de 100:1 durante 48 horas a temperatura ambiente. Después de su filtración en gel, en un tampón que contenía Na-acetato 20 mM, pH 5 y NaCl
20 mM, en una columna Sephadex G-25, la muestra de proteína se aplicó sobre una columna de intercambio fónico de S-Sepharose (Pharmacia). La psoriasina recombinante monomérica se eluyó a lo largo de 5 volúmenes de columna con un gradiente lineal desde Na-acetato 20 mM, pH 5, NaCl 20 mM hasta NaCl 0,5 M. La proteína de fusión monomérica eluyó más tarde en el gradiente. Las fracciones que contenían la proteína recombinante purificada cortada se filtraron en gel sobre Sephadex G-25, en un tampón que contenía NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, y se almacenó
a 4°C.
Ejemplo 12 Procedimiento de evaluación para ensayar la conveniencia de compuestos de tiol para su uso como agentes reductores en el plegamiento de nuevo cíclico, y para la determinación de los niveles óptimos de agentes desnaturalizantes y de reordenación para la optimización de los procedimientos de plegamiento de nuevo cíclicos
Con objeto de mejorar el rendimiento obtenible de proteína correctamente plegada a partir del plegamiento de nuevo cíclico, debería maximizarse el número de ciclos productivos (ver Resumen de la invención). Los ciclos productivos se caracterizan por pasos de desnaturalización en los que la proteína plegada incorrectamente, en vía hacia estados conformacionales agregados de punto final, se salva en estados conformacionales desplegados, mientras que la mayoría de la proteína que ya está plegada correctamente permanece en estados conformacionales capaces de saltar de vuelta al estado plegado de nuevo durante el paso de plegamiento de nuevo del ciclo.
Un cierto número de proteínas que contienen puentes disulfuro, como la \beta_{2}-microglobulina, son conocidas por plegarse de nuevo con una elevada eficiencias (> 95%) cuando se someten a niveles elevados de agentes desnaturalizantes, con tal que sus puentes disulfuro permanezcan intactos.
Este ejemplo describe como evaluar la conveniencia de un compuesto tiol, para su uso en el plegamiento de nuevo cíclico, en base a su capacidad para discriminar los puentes disulfuro correctos de los incorrectos, y como optimizar los niveles de agentes desnaturalizante y/o agente reductor a usar en los pasos desnaturalizantes para maximizar el número de ciclos productivos. Como sistema modelo escogemos las formas mono-, di- y multiméricas de la \beta_{2}-microglobulina humana recombinante purificada. Nuestro objetivo específico fue analizar la estabilidad de diferentes formas topológicas de la \beta_{2}-microglobulina humana frente a la reducción por parte de cinco agentes reductores diferentes a cinco concentraciones de agente desnaturalizante.
La \beta_{2}-microglobulina humana (producida tal como se descubre en el Ejemplo 13), en cloruro de guanidinio 6 M, Tris-HCl 50 mM y 2-mercaptoetanol 10 mM pH 8, se filtró en tampón no desnaturalizante (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5 M, pH 8). Sólo una fracción de la proteína en la muestra era soluble en el tampón no desnaturalizante. Después de 48 horas de exposición al aire, la solución de proteína no aparecía clara. El análisis mediante SDS-PAGE no reductor demostró que la mayoría de la proteína se había oxidado en formas multiméricas, y que sólo una pequeña fracción estaba oxidada y era monomérica (Figura 27, carril 1).
La solución de proteína se repartió en alícuotas en un cierto número de tubos, y se añadieron cantidades variables de urea mientras que se mantenía la concentración de proteína y sal a un nivel constante.
El agente reductor, glutatión, etiléster de cisteína, N-acetil-L-cisteína, ácido mercaptosuccínico, o 2-mercaptoetanol, se añadió al conjunto de muestras de proteína con concentraciones variables de urea. Cada agente reductor se añadió a una concentración final de 4 mM. Las muestras de proteína se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, y entonces de bloquearon los grupos tiol mediante la adición de ácido iodoacético a una concentración final de 12 mM. Finalmente, las muestras de proteína se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor (Figuras 27-32). Las composiciones finales de las muestras de ensayo usadas en el SDS-PAGE no reductor, así como los resultados, se indican más abajo en las tablas siguientes; en las filas que indican la capacidad del agente reductor escogido para reducir puentes disulfuro la marca "+++" indica una buena capacidad, "++" indica una capacidad intermedia; "+" indica una capacidad débil, mientras que ninguna marca indica que no pudo observarse efecto medible alguno.
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 27
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
\mul solución proteica 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36 36
\mul tampón A 160 160 140 120 100 80 70 60 50 40 20
\mu tampón B 0 0 20 140 60 80 90 100 110 120 140
\mul GSH 0 4 4 4 40 4 4 4 4 4 4
M urea 0 0 1 2 3 4 4.5 5 5.5 6 7
Capacidad para + + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro erróneos
(Continuación)
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 27
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Capacidad para + +++
reducir puentes
disulfuro correctos
Tampón A : 50 mM Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
Tampón B : 10 M urea, 50 mM tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
GSH: Glutatión 0,2 M
Solución proteica: 2mg/ml h\beta_{2}m, 50 mM, Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl 
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 28
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
\mul solución proteica 36 36 36 36 36 36 36 36 36
\mul tampón A 160 160 140 120 100 80 60 40 20
\mul tampón B 0 0 20 140 60 80 100 120 140
\mul CE 0 4 4 4 40 4 4 4 4
M urea 0 0 1 2 3 4 5 6 7
Capacidad para ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro erróneos
Capacidad para ++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro correctos
Tampón A: 50 mM Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
Tampón B: 10 M urea, 50 mM tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
CE: éster etílico de cisteína 0,2 M
Solución proteica: 2mg/ml h\beta_{2}m, 50 mM, Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl 
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 29
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
\mul solución proteica 36 36 36 36 36 36 36 36 36
\mul tampón A 160 160 140 120 100 80 60 40 20
\mul tampón B 0 0 20 140 60 80 100 120 140
\mul ME 0 4 4 4 40 4 4 4 4
M urea 0 0 1 2 3 4 5 6 7
Capacidad para ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro erróneos
(Continuación)
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 29
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Capacidad para + ++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro correctos
Tampón A: 50 mM Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
Tampón B: 10 M urea, 50 mM tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
ME: 2-mercaptoetanol 0,2 M 
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 30
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
\mul solución proteica 36 36 36 36 36 36 36 36 36
\mul tampón A 160 160 140 120 100 80 60 40 20
\mul tampón B 0 0 20 140 60 80 100 120 140
\mul MSA 0 4 4 4 40 4 4 4 4
M urea 0 0 1 2 3 4 5 6 7
Capacidad para ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro erróneos
Capacidad para ++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro correctos
Tampón A: 50 mM Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
Tampón B: 10 M urea, 50 mM tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
MSA: ácido mercaptosuccinico 0,2 M
Solución proteica: 2mg/ml h\beta_{2}m, 50 mM, Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl 
\vskip1.000000\baselineskip
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 31
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
\mul solución proteica 36 36 36 36 36 36 36 36 36
\mul tampón A 160 160 140 120 100 80 60 40 20
\mul tampón B 0 0 20 140 60 80 100 120 140
\mul AC 0 4 4 4 40 4 4 4 4
M urea 0 0 1 2 3 4 5 6 7
Capacidad para + ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro erróneos
(Continuación)
Composición de las muestras usadas en SDS-PAGE de la Figura 31
Test no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Capacidad para + ++ +++ +++ +++
reducir puentes
disulfuro correctos
Tampón A: 50 mM Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
Tampón B: 10 M urea, 50 mM tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
MSA: N-Acetil-L-cisteina 0,2 M
Solución proteica: 2 mg/ml h\beta_{2}m, 50 mM, Tris.HCl pH 8, 0,5 M NaCl
Las diferentes formas topológicas de la \beta_{2}-m podrían separarse mediante electroforesis en gel SDS-PAGE no reductor. Las bandas que migran más rápidamente representan la forma monomérica oxidada. Esta banda es seguida inmediatamente por la \beta_{2}-m reducida, con una velocidad de migración algo más lenta, mientras que las formas multiméricas de la proteína migran mucho más lentamente en el gel.
Es este análisis estamos ensayando la capacidad de cada uno de los cinco agentes reductores ensayados para reducir los puentes disulfuro de las formas multiméricas de la \beta_{2}-microglobulina sin reducir significativamente los puentes disulfuro correctamente formados de la forma oxidada monomérica.
Los resultados de los análisis (Figuras 27-32) son, en resumen, como sigue: la N-acetil-L-cisteína y el ácido mercaptosuccínico son, bajo las condiciones usadas, esencialmente incapaces de discriminar puentes disulfuro correctos e incorrectos. El glutatión, el etiléster de cisteína y el 2-mercaptoetanol son todos ellos capaces -dentro de los 10 minutos y dentro de las características individuales de concentración de urea- de reducir los puentes disulfuro incorrectos de las formas multiméricas, mientras que la mayoría de la \beta_{2}-microglobulina monomérica oxidada permanecía en la forma oxidada. El glutatión tiene claramente la capacidad de reducir selectivamente los puentes disulfuro en las concentraciones de urea más elevadas en comparación con el etiléster de cisteína y el 2-mercaptoetanol, y por tanto, el glutatión sería, entre la selección de tioles ensayados, el agente reductor escogido para el plegamiento de nuevo cíclico de la \beta_{2}-microglobulina. A consecuencia de estos experimentos, la concentración de urea en el tampón B reductor para el procedimiento de plegamiento de nuevo del Ejemplo 13 se disminuyó desde 8 M (Ejemplo 1) hasta 6 M, lo que condujo a una mejora del rendimiento general del plegamiento de nuevo de la \beta_{2}-microglobulina humana, desde el 53% hasta el 87%.
Ejemplo 5 Plegamiento de nuevo de \beta_{2}-microglobulina humana: Análisis comparativo de tres procedimientos de plegamiento de nuevo
El siguiente conjunto de experimentos se realizó para obtener datos cuantitativos comparables para evaluar la importancia de los ciclos para el rendimiento del plegamiento de nuevo en comparación con los procedimientos de plegamiento de nuevo sencillos que implican una transición paso a paso o gradual de un paso desde condiciones fuertemente desnaturalizantes y condiciones reductoras a condiciones no desnaturalizantes y no reductoras.
La proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana recombinante plegada de nuevo y purificada, obtenida tal como se describe en el Ejemplo 1, se redujo y desnaturalizó para obtener materiales de partida carentes de impurezas, tales como productos de rotura proteolítica o fracciones menores de la proteína de fusión dañadas por su oxidación irreversible u otra derivación química.
En un primer paso se usó el procedimiento de optimización descrito en el Ejemplo 1 para modificar las condiciones de plegamiento de nuevo cíclico descrito en el Ejemplo 1, como fueron los tampones y otros parámetros experimentales, excepto que el Tampón B en los presentes experimentos era urea 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M, glutatión 4 mM.
Se plegaron tres lotes de proteína de fusión pura mientras estaban unidos a NTA-agarosa cargada con Ni^{++} tal como se describe en el Ejemplo 1, usando la composición actual de Tampón B. Un lote se sometió a ciclado de tampón tal como se describe en el Ejemplo 1, para el lote dos y tres el ciclado se remplazó respectivamente por un gradiente lineal monótono de tampón (100% de B hasta 0% de B a lo largo de 24 horas) y por un gradiente de paso (100% de B a 0% de b, en un paso, seguido por 0% de B durante 24 horas). En cada experimento de plegamiento de nuevo, todo el material de polipéptido se recuperó, tal como se describe en el Ejemplo 1, como una fracción soluble que se podía eluir en condiciones no desnaturalizantes, y como una fracción insoluble restante que se podía eluir sólo en condiciones desnaturalizantes y/o condiciones reductoras. Los rendimientos de proteína de fusión correctamente plegada se midieron mediante análisis densitométrico cuantitativo (Escáner Óptico HW y paquete SW de Análisis Densitométrico GS-370, procedente de Hoeffer Scientific, CA, EE.UU.) de geles de SDS-PAGE teñidos con azúl de Coomassie, en los que se habían separado alícuotas medidas y convenientemente diluidas de fracciones solubles e insolubles, en condiciones reductoras y no reductoras, según se precisara para permitir la separación de monómeros con puentes disulfuros correctos de los polímeros solubles en las fracciones solubles. Cuando fue necesario obtener datos densitométricos fiables tanto para bandas intensas como débiles en un carril del gel, se escanearon y analizaron varias diluciones de muestras para obtener conjuntos de datos escalados.
Detalles y resultados experimentales Proteína de fusión desnaturalizada y reducida purificada
Un lote de proteína de fusión de la \beta_{2}-microglobulina humana se plegó de nuevo tal como se describe en el Ejemplo 1. El 96% de la proteína de fusión se recuperó en la fracción soluble (Figura 32, carriles 2-5). El 55% de esta fracción soluble estaba en la forma monomérica con puentes de disulfuro. Por tanto, el rendimiento conjunto de la eficiencia de plegamiento de nuevo obtenido fue del 53%. La proteína de fusión monomérica se purificó de multímeros mediante cromatografía de intercambio iónico en S-Sepharose (Pharmacia, Suecia). La fracción soluble obtenida después del plegamiento se filtró mediante gel con Sephadex G-25 (Pharmacia, Suecia) en un tampón que contenía NaCl 5 mM y Tris-HCl 5 mM pH 8, se diluyó hasta doblar su volumen y entonces se aplicó a la columna de S-Sepharose, la cual se eluyó a continuación usando un gradiente (5 volúmenes de columna, desde Tris-HCl 2,5 mM pH 8, NaCl 2,5 mM, hasta Tris-HCl 25 mM pH 8, NaCl 100 mM). La proteína de fusión correctamente monomérica y purificada hasta > 95% (Figura 32, carriles 5 y 7) se preparó a continuación en guanidinio hidrocloruro 6 M y DTE 0,1 M, se filtró mediante gel en un tampón que contenía urea 8 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 1 M y 2-mercaptoetanol 10 mM, y a continuación se dividió en alícuotas para se usada como material de partida para los experimentos de plegamiento de nuevo descritos más abajo.
Plegamiento de nuevo cíclico de proteína de fusión purificada
Se aplicó una alícuota de proteína de fusión reducida y desnaturalizada a una columna de NTA cargada con Ni^{++}, la cual se lavó con un volumen de columna de un tampón que contenía guanidinio hidrocloruro 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM.
La proteína de fusión se sometió a continuación a ciclos de tampón de acuerdo con el esquema mostrado en la TABLA 1, usando el Tampón A: Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M y glutatión reducido/oxidado 3,2 mM/0,4 mM, y el Tampón B: Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M, urea 6 M, y glutatión reducido 4 mM. Una vez completado el ciclo de tampones, la proteína de fusión se recuperó cuantitativamente en una forma soluble mediante elución de la columna con un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M y EDTA 20 mM. El 87% se obtuvo en la forma monomérica con puentes disulfuro correcta (Figura 32, carriles 8 y 9).
Plegamiento de nuevo de proteína de fusión mediante gradiente lineal
Se aplicó una alícuota de proteína de fusión reducida y desnaturalizada a una columna de NTA cargada con Ni^{++}, la cual se lavó con un volumen de columna de un tampón que contenía guanidinio hidrocloruro 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8 y 2-mercaptoetanol 10 mM, seguido por 1 volumen de columna de un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M, urea 6 M y glutatión reducido 4 mM.
A continuación se aplicó un gradiente lineal de 23 horas desde 100% de B hasta 100% de A, a 2 ml/min, usando el Tampón A: Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M y glutatión reducido/oxidado 3,2 mM/0,4 mM, y el Tampón B: Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M, urea 6 M, y glutatión reducido 4 mM. Una vez completado el ciclo de tampones, la proteína de fusión se eluyó en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M y EDTA 20 mM. La fracción insoluble restante se extrajo de la columna en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 1 M, urea 8 M, 2-mercaptoetanol 10 mM, y EDTA 20 mM.
El 48% de la proteína de fusión se recuperó en la fracción soluble, y el 60% de la fracción soluble se recuperó en la forma de puentes disulfuro y monomérica correcta. La eficiencia global de plegamiento obtenida fue por tanto del 29% (Figura 33, carriles 5-7).
Plegamiento de nuevo de proteína de fusión mediante paso de tampón
Se aplicó una alícuota de proteína de fusión reducida y desnaturalizada a una columna de NTA cargada con Ni^{++}, la cual se lavó con un volumen de columna de un tampón que contenía guanidinio hidrocloruro 6 M, Tris-HCl 50 mM pH 8, y 2-mercaptoetanol 10 mM.
A continuación se aplicó un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M y glutatión reducido/oxidado 3,2 mM/0,4 mM a la columna a 2 ml/min durante 24 horas antes de recuperar la fracción soluble de la proteína de fusión en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 0,5 M y EDTA 20 mM. La fracción insoluble restante se extrajo de la columna en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 1 M, urea 8 M, 2-mercaptoetanol
10 mM, y EDTA 20 mM.
El 34% de la proteína de fusión se recuperó en la fracción soluble, y el 28% de la fracción soluble se recuperó en la forma de puentes disulfuro y monomérica correcta. La eficiencia global de plegamiento obtenida fue por tanto del 9,5% (Figura 33, carriles 1-3).
Conclusiones
En resumen, usando la \beta_{2}-microglobulina humana como una proteína modelo, podría concluirse que (a) una optimización sencilla del tampón y una purificación mejorada de la proteína de fusión antes del plegamiento de nuevo cíclico, incrementaron significativamente el rendimiento del plegamiento de nuevo (desde el 53% hasta el 87%) y (b) el ciclado de desnaturalización-renaturalización progresivo es superior al paso único de plegamiento de nuevo, en condiciones experimentales de otro modo comparables, en gran medida (rendimiento del 87% frente al 29% ó 9,5%).
Referencias
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N-terminal three finger fragment of Xenopus transcription factor IIIA to the internal control region of a 5S RNA gene. FEES Letters, 295: 181-184.
Dalboge, H., Dahl, H.-H, M., Pedersen, J., Hansen, J., W., and T., Kristensen (1987). A Novel Enzymatic Production of Authentic hGH From an Escherichia coli Produced. Biol Technology, 5: 161-164.
Datar, R., V., Cartwright, T., and C.-G., Rosen (1993) Process Economics of Animal Cell and Bacterial Fermentations: A Case Study Analysis of Tissue Plasminologen Activator. Biol Technology, 11: 349-357.
Herz, J., Hanmann, U., Rogne, S., Myklebost, O., Gausepohl, H., and Stanley, K.K. (1988). Surface location and high affinity for calcium of a 500 kd liver membrane protein closely related to the LDL-receptor suggest a physiological role as lipoprotein receptor. EMBO J., 7: 4119-4127.
Hoffmann, H.J., Olsen, E., Etzerodt, M., Madsen, P., Thogersen, H.C., Kruse, T., and Celis J.E. (1994). Psoriasis Binds Calcium and Is Differentially Regulated With Respect to Other Members of the 5100 Protein Family. J. Dermatol. Invest. In press.
Hochuli, E., W., Bannwarth, H. Döbeli, R. Gentz, and D. Stüber. 1988. Genetic Approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate absorvent. Biol Technology, 6: 1321-1325.
Hollinger, P., Prospero, T., and G. Winter (1993). "Diabodis": Small bivalent and bispecific antibody fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448.
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Nagai, K., and H.C. Thogersen. 1987. Synthesis and Sequence-Specific Proteolysis of Hybrid Proteins Produced in Escherichia Coli. Methods in Enzimology, 152: 461-481.
Nagai, K., Nakaseko, Y., Nasmyth, K., and Rhodes, D. (1988). Zinc-finger motifs expressed in E. coli and folded in vitro direct specific binding to DNA. Nature, 332: 284-286.
Nykjaer, A., Petersen, C.M., Moller, B., Jensen, P.H., Moestrup, S.K., Holtet, T.L., Etzerodt, M., Thogersen, H.C., Munch, M., Andreasen, P.A., and Gliemann, J. (1992) Purified \alpha_{2}-Macroglobulin Receptor/LDL Receptor-related Protein Binds Urokinase-Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 Complex. J. Biol. Chem. 267: 14543-14546.
Rathjen, D., et al. (1991), Mol. Immunol. 28, p29.
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487-491.
Studier, F.W., and Moffat, B.A. 1986. Use of Bacteriophage T7 RNA Polymerase to Direct Selective High-level Expression of Cloned Genes. J. Mol. Biol., 189: 113-130.
The Regents of the University of California. Entrerokinase-cleavage linker sequence. EP 035384.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Denzyme ApS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: Gustav Wieds Vej 10
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Aarhus C
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAIS: Dinamarca
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 8000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento mejorado para el plegamiento de nuevo de proteínas.
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 47
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: Compatible con PC de IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1554 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: SÍ
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 76..1551
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1
100
2
200
201
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 492 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
400 
\vskip1.000000\baselineskip
5
500 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGAATCCAG CGTACTCCAA AG 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCGAAGCTTG ATCACATGTC TCG 
\hfill
23 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGAATCCAG AAAACCCCTC AAAT 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCGAAGCTTA CATGTCTCGA TC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GTTCCCAACC ATTCCCTTAT 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGAAGCTTA GAAGCCACAG CTGCCC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGTACTCG CGGGAGAAG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTCAGAGTTC GTTGTG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGCTATC GACGCCCCTA AG 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTATCGGCAG TGGGGCCCCT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTAGGCCTTG CAGGAGCGG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTACTTCTTG CATGACTTCC CG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGGCACC AACAAATGCC GG 
\hfill
42 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTAGTCCAGG CTGCGGCAG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGTGCCT CCACCCCAGT G 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTACTGGTCG CAGAGCTCG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCTTGATCAA TCGAGGGTAG GGGTGGTCAG GGGTGGTCAG TGCTCTCTGA ATAACG 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGCAAGCTTA CTTAAACTCA TAGCAGGTG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGCGGTG AATTCCTCCTT GCCG 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTAGATGTGG CAGCCACGCT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 23:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGTGTCC AACTGCACGG CT 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 24:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTAGATGCTG CAGTCCTCCT 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 25:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGTCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGAGTAAA TACAAAGATG TACAAAGATG GAGACCA 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 26:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTACCAGGTG GCAGGGGCTT 
\hfill
30 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 27:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGAAAGTG TATCTCTCAT 
\hfill
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CAGAGTGCAA GACTGGGAAT GG 
\hfill
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 28:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTATTCACAC TCAAGAATGT CGC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 29:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CTGCCTGGAT CCATCGAGGG TAGGGTCCAG GACTGCTACC AT 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 30:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CGACCGAAGC TTACGCTTCT GTTCCTGAGC A 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 31:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GGTCTACCTC CAGACATCCT 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 32:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGAAGCCTTC AAGCATTTCC AAGATC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 33:
\vskip0.666000\baselineskip
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCTGGATCCA TCGAGGGTAG GGGCGAGCCA CCAACCCAG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 34:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGAAGCTTA CACGATCCCG AACTG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 35:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCGAGATCTA TCGAGGGTSG GCAGGTTCAAA CTGCAGCA 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 36:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GCCAAGCTTA ATTCAGATCC TCTTCTGAG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 37:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Ile Glu Glu Arg}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 38:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Glu Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 39:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Trp Thr Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 40:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gln Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 41:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Glu Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 42:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gln Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 43:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Cys Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 44:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Cys Gly Arg}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 45:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Met Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 46:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Met Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 47:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His His His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 48:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Ser His His His His His His Gly}
\sac{Ser Ile Glu Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 49:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 50:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 51:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 217 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
8
800 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 52:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 4544 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
9
900
10
11
110 
\vskip1.000000\baselineskip
12
120 
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
131
130 
\vskip1.000000\baselineskip
14
140 
\vskip1.000000\baselineskip
15
150 
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
160
161
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
19
190 
\vskip1.000000\baselineskip
20
2000 
\vskip1.000000\baselineskip
21
210 
\vskip1.000000\baselineskip
22
220 
\vskip1.000000\baselineskip
23
230 
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 53:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 487 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
26
260 
\vskip1.000000\baselineskip
27
270 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 54:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 790 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
29
290 
\vskip1.000000\baselineskip
30
300 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 55:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 153 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
31
310 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 56:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 202 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
32
320 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 57:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 246 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
33
330 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. N° ID: 58:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. N° ID: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
34

Claims (48)

1. Procedimiento para generar un conjunto procesado de moléculas de polipéptido, conjunto procesado en el cual los estados conformacionales representados contienen una fracción sustancial de moléculas de polipéptido en una conformación de plegamiento determinada, a partir de un conjunto inicial de moléculas de polipéptido que tienen la misma secuencia de aminoácidos que el conjunto procesado de moléculas de polipéptido, conjunto inicial en el cual los estados conformacionales representados contienen una fracción sustancial de moléculas de polipéptido en conformaciones desplegadas o plegadas incorrectamente, comprendiendo el procedimiento el someter el conjunto inicial de moléculas de polipéptido a una serie de al menos tres ciclos sucesivos, cada uno de los cuales comprende una secuencia de
1)
al menos una etapa de desnaturalización que comprende condiciones que ejercen una influencia desnaturalizante y/o de desplegado sobre las moléculas de polipéptido del conjunto, para desnaturalizar y/o desplegar una fracción de los polipéptidos en el conjunto, seguido de
2)
al menos una etapa de renaturalización que comprende condiciones que ejercen una influencia renaturalizante sobre las moléculas de polipéptido, que tienen conformaciones que resultan de la etapa precedente, para renaturalizar una fracción de los polipéptidos desnaturalizados y/o desplegados en el conjunto, estando adaptadas las series de al menos tres ciclos sucesivos de tal manera que las condiciones en al menos una etapa de desnaturalización conducen a la desnaturalización y/o desplegado de una proporción menor de los polipéptidos en el conjunto que las condiciones de desnaturalización en una etapa de desnaturalización anterior en la serie, y que el conjunto procesado de moléculas de polipéptido tiene una fracción más elevada de moléculas de polipéptido en la conformación plegada concreta que
a) el conjunto inicial, y
b) un conjunto inicial correspondiente que sólo ha sido sometido a uno de los ciclos.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde una fracción sustancial de las moléculas de polipéptido en una conformación concreta de plegamiento en el conjunto procesado constituye al menos el 5% (p/p) del conjunto inicial de moléculas de polipéptido.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde las moléculas de polipéptido del conjunto procesado comprenden moléculas que contienen cisterna, y el conjunto procesado comprende una fracción sustancial de moléculas de polipéptido en una conformación concreta de plegamiento que, además, tiene una topología de puentes disulfuro idéntica.
4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde las moléculas de polipéptido son moléculas que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido auténtico, o son moléculas que comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un polipéptido auténtico unida a uno o dos segmentos polipeptídicos adicionales.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un polipéptido auténtico está unida al segmento o segmentos polipeptídicos adicionales a través de una unión que se puede cortar o uniones similares o diferentes que se pueden cortar.
6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la serie comprende al menos 5 ciclos, tal como al menos 8 ciclos, al menos 10, y al menos 25 ciclos, y como mucho 2000 ciclos, tales como, como mucho 1000 ciclos, como mucho 500, como mucho 200 ciclos, como mucho 100, y como mucho 50 ciclos.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la duración de cada etapa de desnaturalización es de al menos 1 milisegundo y como mucho de 1 hora, y la duración de cada etapa de renaturalización es de al menos 1 segundo y como mucho de 12 horas.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en donde las condiciones de desnaturalización de cada etapa desnaturalizante individual se mantienen constantes durante un período de tiempo, y las condiciones de renaturalización de cada etapa de renaturalización individual se mantienen constantes durante un período de tiempo, estando separados los períodos de tiempo durante los cuales las condiciones se mantienen constantes por períodos de transición durante los cuales se cambian las condiciones.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el período de transición, entre etapas para los cuales se mantienen constantes las condiciones, tiene una duración entre 0,1 segundos y 12 horas.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el período de tiempo durante el cual las condiciones de desnaturalización de la etapa de desnaturalización se mantienen constantes tiene una duración de entre 1 y 10 minutos, y el período de tiempo durante el cual las condiciones de renaturalización de is etapa de renaturalización se mantienen constantes tiene una duración de entre 1 y 45 minutos.
11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las moléculas de polipéptido están en contacto con una fase líquida durante las etapas de desnaturalización y renaturalización, siendo la fase líquida una fase acuosa o una fase orgánica.
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en donde las moléculas de polipéptido están confinadas en un entorno que permite cambiar o intercambiar la fase líquida sin extraviar las moléculas de polipéptido.
13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde los polipéptidos están confinados en un aparato de diálisis o en un sistema líquido de dos fases.
14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde las moléculas de polipéptido están unidas a un soporte sólido o semisólido, tal como una superficie de filtro, una fibra hueca, o un medio de cromatografía en un lecho, por ejemplo, un gel de agarosa o poliacrilamida, una matriz de celulosa fibrosa, una matriz de HPLC o FPLC, una sustancia que tiene moléculas de un tamaño tal que las moléculas con el polipéptido unido a ellas, cuando se disuelven o dispersan en una fase líquida, pueden ser retenidas por medio de un filtro, una sustancia capaz de formar micelas o participar en la formación de micelas que permite que una fase líquida sea cambiada o intercambiada sin extraviar las micelas, o un polímero soluble en agua.
15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las moléculas de polipéptido están adsorbidas no covalentemente sobre el portador a través de una porción que tiene afinidad por un componente del portador, tal como un grupo biotina, o un análogo del mismo, unido a una porción aminoácido del polipéptido, teniendo el portador avidina, estreptavidina, o análogos de las mismas unidos sobre sí.
16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la porción tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC. N° ID.: 47, comprendiendo el portador un derivado del ácido nitrilotriacético (NTA) cargado con iones Ni^{++}.
17. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las moléculas de polipéptido comprenden un segmento de polipéptido que es capaz de dirigir el corte preferente por parte de un agente que corta en un enlace peptídico específico.
18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el segmento polipeptídico que dirige el corte es uno que es capaz de dirigir el corte preferente en un enlace peptídico específico por parte de un agente cortador seleccionado de entre el grupo que consiste en bromuro de cianógeno, hidroxilamina, ácido yodosobenzóico, N-bromosuccinimida, y enzimas tales como el factor de coagulación X_{a} bovino o un análogo y/u homólogo del mismo, y la enteroquinasa bovina o un análogo y/u homólogo de la misma.
19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en donde el segmento polipeptídico que dirige el corte preferente es una secuencia que es reconocida selectivamente por el factor de coagulación X_{a} bovino o un análogo y/u homólogo del mismo, tal como un segmento polipeptídico que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo consistente en las SEC. N° ID.: 38, SEC. N° ID.: 40, SEC. N° ID.: 41, y SEC. N° ID.: 42.
20. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las moléculas de polipéptido comprenden un segmento de polipéptido que es convertible in vitro en un segmento de polipéptido derivado capaz de dirigir el corte preferente, por parte de un agente cortador, en un enlace peptídico especifico.
21. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el segmento polipeptídico convertible in vitro es convertible en un segmento polipeptídico derivado que es reconocido selectivamente por el factor de coagulación X_{a} bovino o un análogo y/u homólogo del mismo.
22. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el segmento polipeptídico convertible in vitro tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC. N° ID.: 43, SEC. N° ID.: 44, SEC. N° ID.: 45, y SEC. N° ID.: 46.
23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en donde las moléculas de polipéptido comprenden un segmento polipeptídico bien,
con la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 43 ó SEC. N° ID.: 44, el cual es convertido en un polipéptido derivado, el cual es reconocido selectivamente por el factor de coagulación X_{a} bovino, o un análogo y/u homólogo del mismo, haciendo reaccionar el residuo cisteína con disulfuro de N-(2-mercaptoetil)morfolil-2-tiopiridil o disulfuro de mercaptotioacetato-2-tiopiridil, o,
con la secuencia de aminoácidos SEC. N° ID.: 45 ó SEC. N° ID.: 46, el cual es convertido en un polipéptido derivado, que se reconoce selectivamente mediante el factor de coagulación X_{a} bovino, mediante oxidación de la porción tioéter en el grupo lateral de metionina a un derivado disulfuro o sulfona.
\newpage
24. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19, 22 ó 23, en donde el segmento polipeptídico selecciona de entre el grupo que consiste en las SEC. N° ID.: 38, SEC. N° ID.: 40, SEC. N° ID.: 41, y SEC. N° ID.: 42, o seleccionados de entre el grupo y que consiste en las SEC. N° ID.: 43, SEC. N° ID.: 44, SEC. N° ID.: 45, y SEC. N° ID.: 46, está unido N-terminalmente al polipéptido auténtico.
25. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-24, en donde el cambio de condiciones durante el período de transición se consigue cambiando la composición química de la fase líquida con la que están en contacto las moléculas de polipéptido.
26. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la desnaturalización de las moléculas de polipéptido se consigue poniendo en contacto las moléculas de polipéptido con una fase líquida en la que se ha disuelto al menos un compuesto desnaturalizante; y en donde la renaturalización de las moléculas de polipéptido se consigue poniendo en contacto las moléculas de polipéptido con una fase líquida que contiene disuelto al menos un compuesto desnaturalizante en una concentración tal, que el contacto con la fase líquida tenderá a renaturalizar, en vez de desnaturalizar, el conjunto de moléculas de polipéptido en sus estados conformacionales respectivos resultantes de la etapa precedente, o bien no contiene compuesto desnaturalizante alguno.
27. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la desnaturalización de las moléculas de polipéptido se consigue o potencia disminuyendo o aumentando el pH de la fase líquida.
28. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27, en donde el compuesto desnaturalizante se selecciona de entre urea, guanidina-HCl, y di-C_{1-6}alquilformamida, tal como la dimetilformamida, y la di-C_{1-6}alquilsulfona.
29. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-28, en donde la fase líquida utilizada en al menos una de las etapas de desnaturalización, y/o en al menos una de las etapas de renaturalización, contiene al menos un sistema de reordenación de disulfuro.
30. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en donde al menos un sistema de reordenación de disulfuro es uno capaz de reducir y/o reordenar los puentes disulfuro, incorrectamente formados en moléculas de polipéptido desplegadas y/o plegadas incorrectamente, con mayor eficiencia con la que reduce y/o reordena puentes disulfuro correctamente formados en moléculas de polipéptido desplegadas y/o plegadas incorrectamente, en condiciones, con respecto a la concentración del agente desnaturalizante, en las que las proteínas están desplegadas y/o plegadas incorrectamente.
31. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 30, en donde la presencia del sistema de reordenación de disulfuro, en al menos una etapa, resulta en una proporción entre la cantidad relativa de puentes disulfuro incorrectamente formados inicialmente que son reducidos/reordenados, y la cantidad relativa de puentes disulfuro correctamente formados inicialmente que son reducidos/reordenados, de al menos 1,05.
32. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29-31, en donde el sistema de reordenación de disulfuro contiene glutatión, 2-mercaptoetanol o tiocolina, cada uno de los cuales está en mezcla con su correspondiente disulfuro simétrico.
33. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-32, en donde todos los residuos de cisteína en las moléculas de polipéptido han sido convertidos en productos disulfuro mixtos de uno de glutatión, tiocolina, mercaptoetanol, o ácido mercaptoacético, durante al menos una etapa de los ciclos de desnaturalización/renaturalización.
34. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la conversión de los residuos cisteína a productos disulfuro mixtos se consigue mediante la reacción del conjunto totalmente desnaturalizado y completamente reducidos de moléculas de polipéptido con un exceso de un reactivo que es un compuesto disulfuro mezcla de elevada energía.
35. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34, en donde el compuesto disulfuro mezcla de elevada energía es alifático-aromático.
36. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35, en donde el compuesto disulfuro mezcla de elevada energía tiene la fórmula general:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \hskip-3mm R _{2} \cr  \+
 \hskip-2,5mm |\cr  R _{1} --S--S-- \+
 \hskip-3mm C--R _{3} \cr  \+
 \hskip-2,5mm |\cr  \+
 \hskip-3mm R _{4} \cr}
en donde R_{1} es 2-piridil, R_{2}, R_{3} y R_{4} son hidrógeno o un grupo hidrocarburo aromático o alifático inferior opcionalmente sustituido.
37. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34-36, en donde el compuesto disulfuro mezcla de elevada energía se selecciona de entre el grupo que consiste en disulfuro de glutationil-2-tiopiridilo, disulfuro de 2-tiocolil-2-tiopiridilo, disulfuro de 2-mercaptoetanol-2-tiopiridilo y disulfuro de mercaptoacetato-2-tiopiridilo.
38. Procedimiento de acuercdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-37, en donde la polaridad de la fase líquida utilizada en la renaturalización de las moléculas de polipéptido ha sido modificada mediante la adición de una sal, un polímero, y/o un compuesto hidrofluoro, tal como el trifluoroetanol.
39. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-24 ó 29-38, en donde la desnaturalización y renaturalización de las moléculas de polipéptido se consigue mediante cambios directos en parámetros físicos a los que están expuestos las moléculas de polipéptido, tales como temperatura o presión, o mediante cambios en parámetros físicos que potencian o moderan las condiciones de desnaturalización o renaturalización, tales como la temperatura o la presión.
40. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, 1 en donde los cambios químicos en la fase líquida se consiguen mediante el cambio entre una solución desnaturalizante B y una solución renaturalizante A.
41. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 40, en donde la concentración de uno o más compuestos desnaturalizantes en B se ajusta después de cada ciclo.
42. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 41, en donde la concentración de uno o más compuestos desnaturalizantes en B se disminuye después de cada ciclo.
43. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 40, en donde la concentración de uno o más compuestos desnaturalizantes en B se mantiene constante después de cada ciclo.
44. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual las moléculas de polipéptido del conjunto tienen una longitud de al menos 25 residuos aminoácidos y como mucho de 5000 residuos aminoácidos.
45. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los polipéptidos del conjunto inicial son polipéptidos artificiales producidos en células procariotas mediante técnicas de ADN recombinante.
46. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45, en donde la muestra inicial de moléculas de polipéptidos son moléculas de diacuerpos (fragmentos de anticuerpos bivalentes y biespecíficos artificiales) desplegados o plegados incorrectamente, o fragmentos monoméricos de moléculas de diacuerpos.
47. Procedimiento para producir moléculas de diacuerpos correctamente plegadas, en donde un conjunto inicial de moléculas de polipéptidos, que comprenden polipéptidos desplegados y/o plegados incorrectamente que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a fragmentos monoméricos de moléculas de diacuerpos, se someten a una serie de al menos dos ciclos consecutivos, cada uno de los cuales comprende una secuencia de,
1)
al menos una etapa de desnaturalización que comprende condiciones que ejercen una influencia desnaturalizante y/o de desplegado sobre las moléculas de polipéptido del conjunto, como para desnaturalizar una fracción de los polipéptidos en el conjunto, seguido de
2)
al menos una etapa de renaturalización que comprende condiciones que ejercen una influencia renaturalizante sobre las moléculas de polipéptido, que tienen conformaciones que resultan de la etapa precedente, como para renaturalizar una fracción de los polipéptidos desnaturalizados y/o desplegados en el conjunto,
estando adaptadas las series de ciclos de manera que una fracción sustancial de las moléculas de polipéptido del conjunto inicial se convierte en una fracción de moléculas de diacuerpo correctamente plegadas.
48. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47, en donde las moléculas de polipéptido están en contacto con una fase líquida que contiene al menos un sistema de reordenación de disulfuro en al menos un ciclo de desnaturalización/renaturalización.
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