ES2199974T3 - Peptidos que forman quelatos metalicos y su uso. - Google Patents

Peptidos que forman quelatos metalicos y su uso.

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ES2199974T3 ES95309302T ES95309302T ES2199974T3 ES 2199974 T3 ES2199974 T3 ES 2199974T3 ES 95309302 T ES95309302 T ES 95309302T ES 95309302 T ES95309302 T ES 95309302T ES 2199974 T3 ES2199974 T3 ES 2199974T3
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Koichi Hanaoka
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Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA UN PEPTIDO QUE FORMA QUELATOS DE METAL QUE TIENE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDO DE TRES RESIDUOS DE AMINOACIDO REPRESENTADOS POR: X1-X2-CYS, EN DONDE X1 REPRESENTA UN RESIDUO DE AMINOACIDO DIFERENTE AL RESIDUO CYS; X2 REPRESENTA UN RESIDUO DE AMINOACIDO DIFERENTE DEL RESIDUO CYS Y DEL RESIDUO PRO; LOS GRUPOS FUNCIONALES EN EL TERMINAL N, EL TERMINAL C Y LA CADENA LATERAL PUEDEN ESTAR SUSTITUIDOS CON GRUPOS PROTECTORES; Y CADA UNO DE LOS RESIDUOS DE AMINOACIDO PUEDEN SER BIEN DE FORMA D O BIEN DE FORMA L. ADEMAS, LA INVENCION SUMINISTRA UN COMPLEJO DEL PEPTIDO CON UN PEPTIDO FISIOLOGICAMENTE ACTIVO, UNA PROTEINA U OTRA SUBSTANCIA; UN REACTIVO MARCADO OBTENIDO MEDIANTE LA MARCACION DEL PEPTIDO O DEL COMPLEJO CON UN RADIONUCLIDO DE METAL; Y UNA COMPOSICION DE RADIODIAGNOSTICO O RADIOTERAPEUTICA QUE COMPRENDE EL REACTIVO MARCADO CON EL RADIONUCLIDO DE METAL.

Description

Péptidos que forman quelatos metálicos y su uso.
Fundamentos de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a un péptido que forma un quelato metálico y su utilización. Más particularmente, la presente invención se refiere a un péptido que forma un quelato metálico estable que puede proporcionar un péptido fisiológicamente activo marcado con un radionucleido metálico, utilizable como un agente radiodiagnóstico y/o radioterapéutico. El péptido que forma un quelato metálico puede estar unido a un péptido fisiológicamente activo, tal como un péptido que tenga afinidad por un sitio concreto en el cuerpo de un mamífero, para formar un complejo que puede utilizarse como un agente radiodiagnóstico y/o radioterapéutico.
Descripción de la técnica afín
Como secuencias de aminoácidos capaces de formar quelatos con radionucleidos metálicos se conocen Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala (Linda C. Knight, J. Nucl. Med., 35 (2), 282-288, Feb. 1994) y Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm) (DEAN, Richard, T., WO 92/13572) y similares.
Lys-Cys-Thr-Cys-Cys-Ala contiene muchos restos de Cys que tienen un grupo mercapto en su molécula, y por lo tanto tiende a formar fácilmente enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares. Por consiguiente, el péptido requiere un manejo muy cuidadoso cuando se utiliza para radiodiagnóstico o radioterapia.
Cys(Acm)-Gly-Cys(Acm) está mejorado para evitar la formación de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares entre restos de Cys que contienen un grupo mercapto, debido a la protección del grupo mercapto con un grupo acetamidometilo (Acm). Por otra parte, la protección de tales grupos funcionales, sin embargo, induce a una reactividad reprimida de los restos de Cys, y a su vez necesita un tratamiento de calentamiento adicional para marcar el péptido con un radionucleido metálico tal como Tc-99m. Además, estos péptidos encuentran el problema de que los péptidos marcados con un radionucleido metálico tienden a causar acumulación inespecífica en el riñón dentro del cuerpo de un mamífero.
Otras secuencias de aminoácidos que se han publicado también como secuencias capaces de formar un complejo quelado con un radionucleido metálico son Gly-Gly-Cys (S. J. Mather et al., Eur. J. Nucl. Med. (1994) 21, Suppl. S46) y Cys-Gly-His, Asp-Gly-Cys, Glu-Gly-Cys, Gly-Asp-Cys, Gly-Glu-Cys, etc. (DUNN, T. Jeffrey, WO 94/26295). Estas secuencias de aminoácidos se diseñan para tener Asp y Gly adyacentes uno con otro, Gly y Gly adyacentes uno con otro, o Glu y Gly adyacentes uno con otro.
El documento EP-A-0700930 (publicado el 13 de marzo de 1996) describe un péptido que tiene afinidad por un tumor, que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene hasta 20 restos de aminoácido y que se describe como X^{1}-YCAREPPT-X^{2} (en la que A, C, E, P, R, T e Y representan restos de aminoácido expresados mediante los símbolos estándar de una letra), X^{1} representa un compuesto orgánico básico que tiene entre 1 y 3 grupos amino, y X^{2} representa cualquier secuencia dada de aminoácidos. El péptido puede marcarse con un metal radioactivo y utilizarse como un agente radiactivo diagnóstico o terapéutico. Los péptidos descritos, que incluyen KYCAREPPTRTFAYWGQG, se preparan utilizando un sintetizador de péptidos.
En vista del estado precedente de la técnica, la presente invención proporciona un péptido que forma un quelato metálico que es capaz de marcar fácilmente un péptido fisiológicamente activo sin ningún tratamiento especial, tal como calentar, para formar de manera estable un reactivo marcado tanto in vitro como in vivo, que no causa acumulación inespecífica en la distribución in vivo, cuando se administra a un mamífero. La presente invención proporciona también la utilización de tal péptido que forma un quelato metálico en radiodiagnóstico y radioterapia.
Compendio de la invención
Los presentes inventores han realizado extensos estudios en la propiedad de una secuencia de aminoácidos que se requiere para el ligando metálico de un radionucleido, y encontraron que una secuencia de aminoácidos específica que contenga un resto de Cys puede unirse fácilmente a un metal sin ningún tratamiento en particular, tal como calentar, para formar un complejo marcado de manera estable.
Conforme a la presente invención, se proporciona un péptido que forma un quelato metálico representado por:
X1-X2-Cys
en el que X1 representa un resto de aminoácido N-terminal que es un resto de Asp, Lys o Tyr, y X2 representa un resto de aminoácido distinto de un resto de Cys, Pro o Gly; y cada uno de los restos de aminoácido puede estar tanto en forma D como en forma L.
La presente invención proporciona también un complejo del péptido que forma un quelato metálico conforme a la invención, con la condición adicional de que cuando X1 represente un resto de Lys, X2 no represente un resto de Tyr, en el que un péptido fisiológicamente activo se une a través de un resto peptídico al resto de Cys del péptido que forma un quelato metálico.
La presente invención proporciona además un complejo del péptido que forma un quelato metálico conforme a la invención en el que un péptido fisiológicamente activo, distinto de AREPPT-X_{2} (en el que A, E, P, R y T representan restos de aminoácido expresados mediante los símbolos estándar de una letra y X_{2} representa cualquier resto de aminoácido de tal forma que el complejo contenga hasta 20 restos de aminoácido), se une a través de un resto peptídico al resto de Cys del péptido que forma un quelato metálico.
La presente invención proporciona además un reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que el radionucleido metálico está coordinado al péptido que forma un quelato metálico o al complejo anterior.
La presente invención proporciona además una composición radiodiagnóstica, que comprende como ingrediente activo un reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67 está coordinado al péptido que forma un quelato metálico o al complejo anterior.
La presente invención proporciona además una composición radioterapéutica, que comprende como ingrediente activo un reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que cualquiera entre Y-90, Re-186 y Re-188 está coordinado al péptido que forma un quelato metálico o al complejo anterior.
Más aún, la presente invención proporciona el reactivo anterior marcado con un radionucleido metálico en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67, para su utilización en diagnóstico.
También, la invención proporciona la utilización del reactivo anterior marcado con un radionucleido metálico en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67, en la fabricación de una composición para utilizar en diagnóstico.
Además, la presente invención proporciona la utilización del péptido que forma un quelato metálico para marcar un péptido fisiológicamente activo con un radionucleido metálico.
Además, la presente invención proporciona un método para preparar el péptido que forma un quelato metálico, que comprende los pasos de:
unir cisteína o un derivado protegido de la misma a un aminoácido X2 o un derivado protegido del mismo para formar un dipéptido X2-Cys; y
unir al dipéptido así formado un aminoácido X1 o un derivado protegido del mismo.
Además, la presente invención proporciona un método para preparar el complejo, que comprende el paso de unir un péptido fisiológicamente activo al péptido que forma un quelato metálico.
También, la presente invención proporciona un método para preparar el reactivo marcado con un radionucleido metálico, que comprende el paso de coordinar un radionucleido metálico al péptido que forma un quelato metálico o al complejo anterior.
Además, la presente invención proporciona un método para preparar una composición radiodiagnóstica, que comprende el paso de mezclar el reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Más aún, la presente invención proporciona un método para preparar una composición radioterapéutica, que comprende el paso de mezclar un reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que está coordinado cualquiera entre Y-90, Re-186 y Re-188, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Durante toda la memoria descriptiva, los aminoácidos se expresan bien mediante la abreviatura de una letra o mediante las abreviaturas de tres letras. En una secuencia de aminoácidos, el extremo N-terminal se muestra al lado izquierdo, y el extremo C-terminal al lado derecho. Una abreviatura entre paréntesis después de la abreviatura de un aminoácido significa un grupo protector de la cadena lateral, a menos que se indique otra cosa. En la memoria descriptiva, el resto de D-aminoácido se utiliza para referirse a un resto de aminoácido en forma D.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un perfil de radiactividad tras HPLC (del inglés "high performance liquid chromatography") de Ac-KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2} marcado con Tc-99m.
La Fig. 2 es un perfil de radiactividad tras HPLC de KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2} marcado con Tc-99m.
La Fig. 3 es un perfil de radiactividad tras HPLC de Tc-99m- KYCAREPPTRTFAYWGQG mezclado con DTPA en una cantidad 1000 veces mayor.
La Fig. 4 es una fotografía mostrando una escintigrafía de todo el cuerpo de un ratón modelo con un tumor, tomada 5 minutos después de la administración de Tc-99m-KYCAREPPTRTNAYWGQG al ratón.
La Fig. 5 es una fotografía mostrando una escintigrafía de todo el cuerpo de un ratón modelo con un tumor, tomada 20 minutos después de la administración de Tc-99m-KYCAREPPTRTNAYWGQG al ratón.
La Fig. 6 es una fotografía mostrando una escintigrafía de todo el cuerpo de una rata modelo con una inflamación, tomada 30 minutos después de la administración de Tc-99m-KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2} a la rata.
La Fig. 7 es una fotografía mostrando una escintigrafía de todo el cuerpo de una rata modelo con una inflamación, tomada 120 minutos después de la administración de Tc-99m-KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2} a la rata.
Descripción detallada de la invención
El péptido que forma un quelato metálico de la presente invención comprende tres restos de aminoácido que tienen la secuencia de aminoácidos: X1-X2-Cys, en la que X1 representa un resto de aminoácido N-terminal que es un resto de Asp, Lys o Tyr; y X2 representa un resto de aminoácido distinto de un resto de Cys, Pro o Gly; y cada uno de los restos de aminoácido puede estar tanto en forma D como en forma L.
En el péptido que forma un quelato metálico, el resto de Cys no es adecuado para el resto X1 o X2, puesto que el resto de Cys no es estable debido a la tendencia del grupo mercapto que contiene para formar fácilmente enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares. Cuando X2 es un resto de Pro, la capacidad del péptido para formar un quelato queda impedida, de tal forma que la eficiencia de marcaje del péptido con un radionucleido metálico se reduce indeseablemente. Con la excepción de los restos de Cys, Pro y Gly, todos los demás restos de aminoácido, incluyendo las formas D y L, restos de aminoácido hidrófobos, restos de aminoácido polares y restos de aminoácido cargados (tanto ácidos como básicos), pueden emplearse como restos de aminoácido para X2.
El resto de aminoácido X1 es un resto de aminoácido que tiene un grupo amino libre en su posición \alpha. Debido a la presencia del grupo amino libre en la posición \alpha de X1 pueden mejorarse más las capacidades para formar un quelato metálico del péptido que forma un quelato metálico y del complejo del péptido con un péptido fisiológicamente activo. Una realización particularmente preferida es un resto de aminoácido X1 que tiene un grupo amino primario (-NH_{2}) como grupo amino libre en su posición \alpha.
Conforme a la presente invención, ejemplos preferidos del péptido que forma un quelato metálico: X1-X2-Cys son péptidos que tienen las siguientes combinaciones de secuencia X1 y X2: restos de Asp y Tyr, restos de Asp y Lys, restos de Tyr y Tyr, restos de Tyr y Lys, restos de Lys y Tyr, y restos de Lys y Lys.
Se prefiere elegir los restos de aminoácido para X2 entre restos de aminoácido hidrófobos tales como Ala, Ile, Leu, Met, Phe y Val; restos de aminoácido polares tales como Asn, Gln, His, Ser, Thr, Trp y Tyr; aminoácidos cargados (tanto ácidos como básicos) tales como Arg, Asp, Glu y Lys. Eligiendo adecuadamente los restos de aminoácido para X1 y X2, la ruta principal para el metabolito formado por el reactivo marcado con un radionucleido metálico, que se prepara mediante la unión del péptido que forma un quelato metálico a un péptido fisiológicamente activo seguido de la coordinación con un radionucleido metálico, puede controlarse para localizarla bien en el riñón o en el tracto gastrointestinal (tracto GI), cuando el reactivo se administra a un mamífero. Particularmente, cuando se elige apropiadamente un resto de aminoácido específico para X1, el metabolito se excreta selectivamente por un órgano deseado. Por ejemplo, cuando se elige un resto de Asp o Lys como resto de aminoácido para X1, la ruta principal de excreción del metabolito formado por el reactivo marcado con un radionucleido metálico obtenido finalmente, puede controlarse selectivamente para estar localizada en el riñón. Cuando se elige el resto de Tyr como resto de aminoácido para X1, la ruta principal de excreción del metabolito puede controlarse para estar localizada en el tracto GI.
El péptido que forma un quelato metálico de la presente invención se une a un péptido fisiológicamente activo para formar un complejo. Cuando se forma el complejo, el péptido que forma un quelato metálico puede unirse al péptido fisiológicamente activo en el extremo N-terminal. Cuando se une el péptido que forma un quelato metálico al péptido fisiológicamente activo, ambos pueden enlazarse mutuamente a través de un espaciador de uno o más restos de aminoácido, grupo(s) funcional(es) o un agente de reticulación.
Ejemplos típicos de péptidos fisiológicamente activos son interferón, citoquinas tales como factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés "tumor necrosis factor"); varias hormonas y anticuerpos peptídicos, complementos, moléculas de adhesión Y enzimas. El péptido fisiológicamente activo incluye también péptidos correspondientes a secuencias del centro activo, que se seleccionan de las secuencias en anticuerpos o moléculas de adhesión.
Como péptidos fisiológicamente activos hay también péptidos preferidos que tienen afinidad por un sitio concreto en el cuerpo de un mamífero, por ejemplo, un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un tumor, un péptido que tenga afinidad por un sitio con inflamación y/o infección, un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un trombo, y un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un desorden cerebral. Como péptido que tiene afinidad por un sitio concreto pueden emplearse péptidos conocidos tal como son, sin modificación alguna.
Un ejemplo de péptido que tiene afinidad por un sitio donde existe un tumor incluye un péptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
A R E P P T R T F A Y W G Q G
En el péptido anterior, la afinidad por el sitio donde existe un tumor se atribuye principalmente a la secuencias de aminoácidos EPPT. Por tanto, siempre que se mantenga la secuencia EPPT, cualquier péptido modificado por sustitución, deleción o adición de resto(s) de aminoácido puede también utilizarse preferiblemente como péptido que tiene afinidad por un sitio donde existe un tumor.
Un ejemplo representativo de péptido que tiene afinidad por un sitio donde existe una inflamación y/o infección es un péptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
K T K P R E Q Q Y N S T Y R V V
Este péptido puede modificarse por sustitución, deleción o adición de resto(s) de aminoácido de tal forma que no se debilite su afinidad por un sitio donde existe una inflamación y/o infección.
El péptido que forma un quelato metálico: X1-X2-Cys se une al péptido fisiológicamente activo anteriormente mencionado, y el complejo resultante forma a continuación un complejo quelado con un radionucleido metálico. El complejo quelado se utiliza ventajosamente como agente activo en una composición diagnóstica o terapéutica.
En el caso del complejo del péptido que forma un quelato metálico con el péptido fisiológicamente activo, el complejo puede sintetizarse fácilmente según el método Boc o el método Fmoc, bien conocidos, utilizando un sintetizador de péptidos automatizado, por ejemplo, el Sintetizador de Péptidos Automático de Applied Biosystems Inc. Una vez que se ha producido el complejo sobre una resina sólida en el sintetizador, se retira el grupo protector del complejo y, al mismo tiempo, el complejo se escinde de la resina sólida. El complejo puede purificarse subsiguientemente por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en una columna de fase inversa. El complejo puede prepararse también mediante síntesis peptídica en fase líquida, o puede recogerse de varias fuentes animales.
El péptido que forma un quelato metálico propiamente dicho de la presente invención, que comprende los tres restos de aminoácido, puede sintetizarse también por el mismo método descrito anteriormente. Por ejemplo, el péptido puede producirse uniendo cisteína o un derivado protegido de la misma a una resina en fase sólida, uniendo a ella el aminoácido X2 o un derivado protegido del mismo y a continuación el aminoácido X1 o un derivado protegido del mismo, y escindiendo finalmente el péptido así preparado: X1-X2-Cys de la resina. De esta forma, el péptido que forma un quelato metálico puede prepararse de manera sencilla.
Como se ha dicho anteriormente en la presente, el péptido que forma un quelato metálico de la presente invención, que es un componente del complejo, se coloca en el complejo en el extremo N-terminal, y el grupo \alpha-amino en el resto de aminoácido del extremo N-terminal del péptido que forma un quelato metálico en el complejo debe quedar libre. Tal complejo tiene una alta capacidad para formar un quelato. El complejo que tiene una capacidad mayor para formar un quelato puede obtenerse de forma estable.
El reactivo marcado con un radionucleido metálico, que se obtiene mediante la coordinación de un radionucleido metálico al péptido que forma un quelato metálico de la presente invención o al complejo del péptido con el péptido fisiológicamente activo, preferiblemente al complejo, puede utilizarse como un agente radiodiagnóstico o radioterapéutico. El reactivo marcado con un radionucleido metálico puede prepararse de manera estable in vitro, disolviendo el péptido que forma un quelato metálico o el complejo en solución salina fisiológica o en un tampón acuoso y haciendo reaccionar a continuación el péptido o el complejo con un radionucleido metálico.
Para su uso en radiodiagnóstico, el péptido que forma un quelato metálico o el complejo, preferiblemente el complejo, se une a un radionucleido metálico tal como Tc-99m, In-111 o Ga-67, y el reactivo marcado con un radionucleido metálico resultante se emplea de manera ventajosa como un agente diagnóstico.
Para su uso en radioterapia, el péptido que forma un quelato metálico o el complejo, preferiblemente el complejo, se une a un radionucleido metálico tal como Y-90, Re-186 y Re-188, y el reactivo marcado con un radionucleido metálico resultante se emplea de manera deseada como un agente radioterapéutico.
Cuando el marcaje se hace con un radionucleido metálico tal como Tc-99m, Re-186 o Re-188, el reactivo marcado puede prepararse de manera convencional disolviendo el péptido que forma un quelato metálico o el complejo del péptido con el péptido fisiológicamente activo en solución salina fisiológica o en un tampón acuoso, añadiendo a la solución un agente reductor, tal como cloruro estannoso, que tenga un potencial de reducción adecuado, y mezclando la mezcla resultante con una solución de pertecnectato (Tc-99m) sódico o una solución de perrenato (Re-186 y Re-188) sódico. En el caso del marcaje con In-111, el reactivo marcado puede prepararse mezclando el péptido o el complejo con una solución acuosa débilmente ácida que contenga iones In-111. En el caso del marcaje con Ga-67 o Y-90, el reactivo marcado puede prepararse añadiendo el péptido o el complejo a una solución acuosa débilmente ácida o débilmente alcalina que contenga ion Ga-67 o ion Y-90.
Cuando el reactivo marcado con un radionucleido metálico se proporciona para su uso en una composición radiodiagnóstica o radioterapéutica, el reactivo marcado preparado como se describe anteriormente, puede purificarse por HPLC para retirar las impurezas y los iones pertecnectato, iones perrenato, iones In-111, iones Ga-67 e iones Y-90 que no han reaccionado, y a continuación se proporciona para su uso en la composición.
El reactivo marcado de la presente invención puede mezclarse con vehículos farmacéuticamente aceptables para proporcionar una composición radiodiagnóstica o una composición radioterapéutica. Ejemplos típicos de vehículos incluyen un estabilizador tal como ácido ascórbico y ácido p-aminobenzoico; un agente controlador del pH tal como un tampón acuoso; un excipiente tal como D-manitol; un potenciador de la pureza radioquímica tal como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido malónico, gluconato sódico o glucoheptonato sódico. La composición radiodiagnóstica o radioterapéutica de la presente invención puede proporcionarse también de manera conveniente en forma de estuche ("kit") listo para utilizar, junto con estos vehículos.
La composición radiodiagnóstica o radioterapéutica de la presente invención, que comprende preferiblemente el reactivo marcado con un radionucleido metálico obtenido marcando con un radionucleido metálico el complejo del péptido que forma un quelato metálico con el péptido fisiológicamente activo, puede administrarse a través de una vía parenteral convencional, por ejemplo, mediante inyección intravenosa. La dosis puede variar dependiendo de varias condiciones, tales como el peso corporal, la edad y las condiciones de la enfermedad del paciente, el dispositivo para la adquisición de imágenes radiactivas utilizado, y similares. Teniendo en cuenta estas condiciones, se determina la dosis radiactiva que se considera apropiada para la adquisición de imágenes y el tratamiento.
Cuando se administra a un humano, la dosis de la composición radiodiagnóstica que comprende el reactivo marcado con Tc-99m está en el intervalo de 37MBq a 1110 MBq, preferiblemente de 185 MBq a 1110 MBq, referido a la radiactividad del Tc-99m. En el caso de la composición radioterapéutica que comprende el reactivo marcado con Re-186 o Re-188, la dosis está en el intervalo de 37 MBq a 18500 MBq, preferiblemente de 370 MBq a 7400 MBq, referido a la radiactividad. Cuando se administra la composición terapéutica que comprende el reactivo marcado con Y-90, la dosis está en el intervalo de 37 MBq a 3700 MBq, preferiblemente de 37 MBq a 1110 MBq, referido a la radiactividad.
Como se ha dicho anteriormente en la presente, el resto de aminoácido X2 en el péptido que forma un quelato metálico, X1-X2-Cys, de la presente invención, se elige de manera ventajosa entre restos de aminoácido hidrófobos tales como Ala, Ile, Leu, Met, Phe y Val; restos de aminoácido polares tales como Asn, Gln, His, Ser, Thr, Trp y Tyr; aminoácidos cargados (tanto ácidos como básicos) tales como Arg, Asp, Glu y Lys. Eligiendo apropiadamente los restos de aminoácido X1 y X2, puede controlarse la ruta principal para los metabolitos formados por el reactivo marcado con un radionucleido metálico para localizarla bien en el riñón o en el tracto GI. Esto es, la ruta principal de excreción del metabolito puede controlarse para localizarla en el riñón, seleccionando un resto de Asp o Lys para X1, y en el tracto GI, seleccionando un resto de Tyr para X1. Esta localización selectiva da como resultado una excreción rápida de metabolitos innecesarios en el lugar de diagnóstico, de tal forma que puede minimizarse la posible exposición superflua del paciente y, al mismo tiempo, la localización selectiva puede eliminar ruido de fondo en la adquisición de la imagen, para conseguir una rápida adquisición de la imagen del sitio para diagnóstico. El péptido que forma un quelato metálico de la presente invención que comprende los tres restos de aminoácido no es fisiológicamente activo. Por tanto, cuando se forma el complejo, el péptido propiamente dicho no debilita la actividad que el péptido farmacéuticamente aceptable posee de manera inherente en el complejo. Esta propiedad característica es adecuada para su utilización en una composición radiodiagnóstica o radioterapéutica.
De aquí en adelante, la presente invención se describe más específicamente con referencia a los siguientes ejemplos, pero no se interpreta que esté limitada a ellos. En los Ejemplos 1 a 8, el complejo descrito en el documento PCT/WO 9218534-A: KYCAREPPTRTFAYWGQG, que se obtuvo uniendo un péptido que contenía la secuencia EPPT, que tiene afinidad por un sitio donde existe un tumor, al péptido que forma un quelato metálico (KYC) en su extremo C-terminal, se empleó como secuencia básica. En la secuencia, los dos restos de aminoácido situados en el sitio N-terminal se reemplazaron por varios restos de aminoácido, y se determinaron las tasas de marcaje con Tc-99m de los complejos resultantes, para utilizarlas como un índice de la capacidad para formar un quelato metálico de cada uno de los péptidos que forman un quelato metálico.
Ejemplo 1 Síntesis del péptido que contiene KYC, D-KYC, DYC o YYC
Se sintetizó un péptido que contenía KYC, D-KYC, DYC o YYC en el sitio N-terminal sobre una resina pre-cargada conforme al método Fmoc, utilizando un Sintetizador de Péptidos Modelo 431A (Applied Biosystems Inc.). El péptido así sintetizado se escindió de la resina pre-cargada y se desprotegió mediante tratamientos que comprendían los pasos de enfriar en hielo una mezcla de 9,5 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,5 ml de etanoditiol (EDT), 1,0 ml de tioanisol, 0,75 g de fenol y 1,0 ml de agua pura, añadir 10 ml de la mezcla a 0,1-0,2 g del péptido sintetizado y hacerlos reaccionar a temperatura ambiente durante 1,5 horas. El péptido obtenido se purificó a continuación por HPLC en las siguientes condiciones:
Columna: YMC-Pack R & S-ODS-5-ST, 20 x 150 mm
Velocidad de elución: 8 ml/min
Longitud de onda de detección: 230 nm
Eluyente A: TFA al 0,1% en agua pura
Eluyente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo
Gradiente de concentración: 0 min (10% de Eluyente B) \rightarrow 15 min (10% de Eluyente B) \rightarrow 75 min (50% de Eluyente B)
Las fracciones correspondientes al pico principal así obtenido se liofilizaron y las fracciones que tenían una pureza de aproximadamente el 95%, determinada por HPLC, se sometieron a análisis de aminoácidos para determinar la composición de aminoácidos.
La pureza se determinó por HPLC en las siguientes condiciones:
Columna: YMC-Pack ODS-A, 4,6 x 150 mm
Velocidad de elución: 1 ml/min
Longitud de onda de detección: 215 nm
Eluyente A: TFA al 0,1% en agua pura
Eluyente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo
Gradiente de concentración: 0 min (5% de Eluyente B) \rightarrow 30 min (40% de Eluyente B)
El análisis de aminoácidos se realizó utilizando una Estación de Trabajo PICO/TAG-TM (Waters Inc.). Resultó imposible medir con precisión los restos de Trp y Cys, ya que el resto de Trp se degrada por descomposición con HCl y el grupo mercapto en el resto de Cys forma un enlace disulfuro. Los datos analíticos obtenidos sobre las composiciones de aminoácidos de los péptidos se expresaron como el número de un resto de aminoácido por molécula de péptido, y los resultados se muestran a continuación. En los resultados, la cifra entre paréntesis indica el valor teórico del número de un resto de aminoácido por molécula de péptido.
KYCAREPPTRTFAYWGQG* = Glx: 2,0 (2), Gly: 2,4 (2), Arg: 2,0 (2), Thr: 2,3 (2), Ala: 1,9 (2), Pro: 2,2 (2), Tyr: 2,1 (2), Phe: 0,9 (1), Lys: 0,9 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
D-KYCAREPPTRTFAYWG-D-QG* = Glx: 2,0 (2), Gly: 2,2 (2), Arg: 1,9 (2), Thr: 2,0 (2), Ala: 2,1 (2), Pro: 2,1 (2), Tyr: 1,8 (2), Phe: 1,1 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: -(1).
DYCAREPPTRTFAYWGQG = Asp: 1,0 (1), Glx: 2,0 (2), Gly: 2,1 (2), Arg: 2,0 (2), Thr: 1,9 (2), Ala: 2,0 (2), Pro: 2,0 (2), Tyr: 2,1 (2), Phe: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: -(1).
YYCAREPPTRTFAYWGQG = Glx: 2,0 (2), Gly: 2,1 (2), Arg: 2,0 (2), Thr: 1,9 (2), Ala: 2,0 (2), Pro: 2,1 (2), Tyr: 2,9 (3), Phe: 1,1 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: -(1).
* ejemplos de referencia.
Ejemplo 2 Radiomarcaje del péptido que contiene KYC, D-KYC, DYC o YYC con Tc-99m
En un vial liofilizado cargado con una mezcla de 40,3 \mumol / 300 \mul de glucoheptonato y 130 nmol / 50 \mul de solución de cloruro estannoso, se añadieron entre 1,1 y 1,5 GBq de solución de pertecnectato (Tc-99m) sódico para hacer un volumen total de 1,0 ml. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos volteando el vial ocasionalmente. Se sometió una alícuota de la mezcla de reacción a electroforesis en membrana de acetato de celulosa para confirmar si el radiomarcaje de glucoheptonato con Tc-99m había alcanzado el 95% o más. A continuación, se diluyeron los cuatro péptidos obtenidos en el Ejemplo 1 para tener varias concentraciones en el intervalo de 0,25 a 12,5 nmol / 200 \mul. Cada una de esas diluciones se mezcló con 200 \mul de la solución de glucoheptonato marcada con Tc-99m para hacerlas reaccionar a temperatura ambiente durante 60 minutos. La mezcla de reacción se dejó enfriar. Se examinó la tasa de radiomarcaje con Tc-99m de una alícuota de la mezcla de reacción por HPLC en las siguientes condiciones.
\newpage
Columna: C18 de 5 \mum con puresil de Millipore, 4,6 x 150 mm
Velocidad de elución: 1 ml/min
Longitud de onda de detección: 220 nm
Detector de radiactividad: analizador de monocanal de NaI
Eluyente A: TFA al 0,1% en agua pura
Eluyente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo
Gradiente de concentración: 0 min (10% de Eluyente B) \rightarrow 5 min (10% de Eluyente B) \rightarrow 35 min (50% de Eluyente B) \rightarrow 45 min (75% de Eluyente B)
Las tasas de radiomarcaje obtenidas de los cuatro péptidos marcados con Tc-99m se muestran en la Tabla 1. Los resultados en la Tabla 1 demuestran que se alcanzó un 90% o más de radiomarcaje con Tc-99m incluso cuando los péptidos que tenían una baja concentración de 25 \mug/ml se radiomarcaron a temperatura ambiente.
TABLA 1 Tasa de radiomarcaje (%) de los péptidos que contienen KYC, D-KYC, DYC e YYC con Tc-99m (n = 3, media \pm desviación estándar)
Péptido que forma un quelato metálico Concentración de la muestra
100 \mug/ml 50 \mug/ml 25 \mug/ml 10 \mug/ml 5 \mug/ml
KYC* 97,8\pm0,69 96,4\pm0,32 92,2\pm1,39 79,6\pm6,62 39,1\pm1,59
D-KYC* 99,8\pm0,11 - 97,7\pm0,33 - 10,5\pm0,43
DYC 100\pm0,00 98,1\pm0,45 90,6\pm1,95 88,9\pm2,82 28,7\pm6,34
YYC 99,4\pm0,39 97,9\pm0,57 93,4\pm2,51 79,4\pm1,71 29,2\pm17,2
* ejemplos de referencia
Ejemplo 3 (ejemplo de referencia)
Capacidad para formar un quelato metálico de Ac-KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2} y KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2}
Se evaluó la capacidad para formar un quelato metálico de los siguientes dos péptidos:
Ac-KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2}
en el que el grupo \alpha-amino del resto de lisina (K) del extremo N-terminal estaba acetilado, y el grupo carboxilo terminal estaba amidado (NH_{2}).
KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2}
en el que el grupo \alpha-amino del resto de lisina (K) del extremo N-terminal estaba libre, y el grupo carboxilo terminal estaba amidado (NH_{2}).
Se examinó la capacidad para formar un quelato metálico de los dos péptidoscon un radionucleido metálico. Esto es, se compararon las capacidades para formar un quelato metálico en los dos péptidos, un péptido en el que el grupo \alpha-amino en el resto de aminoácido del extremo N-terminal permanece libre (no protegido), y otro péptido en el que el grupo \alpha-amino está acetilado.
El radiomarcaje con Tc-99m y la purificación de los péptidos se llevó a cabo de manera similar al Ejemplo 2, excepto que se utilizó una resina amidada (resina PAL, Millipore), en lugar de la resina pre-cargada.
Los datos analíticos obtenidos sobre las composiciones de aminoácidos de los péptidos se expresaron como el número de un resto de aminoácido por molécula de péptido, y los resultados se muestran a continuación. En los resultados, la cifra entre paréntesis indica el valor teórico del número de un resto de aminoácido por molécula de péptido.
Ac-KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2} = Glx: 2,1 (2), Gly: 2,5 (2), Arg: 2,0 (2), Thr: 1,5 (2), Ala: 1,8 (2), Pro: 2,1 (2), Tyr: 1,9 (2), Phe: 1,2 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
KYCAREPPTRTFAYWGQG-NH_{2} = Glx: 2,1 (2), Gly: 2,2 (2), Arg: 2,1 (2), Thr: 1,6 (2), Ala: 1,9 (2), Pro: 2,1 (2), Tyr: 1,7 (2), Phe: 1,3 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
Los resultados de los péptidos marcados mediante análisis por HPLC se muestran en las Figs. 1 y 2. El péptido que retenía en el extremo N-terminal el resto de aminoácido con el grupo \alpha-amino libre no acetilado, mostró un único pico de radiactividad (tiempo de retención: 17,08 min, como se muestra en la Fig. 2). Por su parte, el otro péptido que contenía en el extremo N-terminal el resto de aminoácido con el grupo \alpha-amino acetilado, mostró dos picos de radiactividad (tiempos de retención: 17,19 min y 18,01 min, como se muestra en la Fig. 1). Se demostró la capacidad para formar un quelato metálico de los dos péptidos con un radionucleido metálico tal como Tc-99m.
Sin embargo, el péptido que contenía en el extremo N-terminal el resto de aminoácido con el grupo \alpha-amino acetilado no se consideró como excelente en su estabilidad estructural y pureza de marcaje, porque el perfil de radiactividad mostró los dos picos de radiactividad. En cambio, el otro péptido mostró un único pico de radiactividad, sugiriendo que un péptido que contiene el resto de aminoácido del extremo N-terminal con un grupo amino libre y primario como grupo \alpha-amino es realmente excelente tanto en estabilidad estructural como en pureza de marcaje.
Ejemplo 4 Síntesis del péptido que contiene KGC, KPC, D-KPC o YKC
El péptido que contenía KGC, KPC, D-KPC o YKC se sintetizó y purificó de manera similar al Ejemplo 1. Los datos analíticos obtenidos sobre las composiciones de aminoácidos de los péptidos se expresaron como el número de un resto de aminoácido por molécula de péptido, y los resultados se muestran a continuación. En los resultados, la cifra entre paréntesis indica el valor teórico del número de un resto de aminoácido por molécula de péptido.
KGCAREPPTRTFAYWGQG = Glx: 2,0 (2), Gly: 3,2 (3), Arg: 2,1 (2), Thr: 1,8 (2), Ala: 1,8 (2), Pro: 2,0 (2), Tyr: 1,0 (1), Phe: 1,1 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
KPCAREPPTRTFAYWGQG = Glx: 2,0 (2), Gly: 2,1 (2), Arg: 2,0 (2), Thr: 2,0 (2), Ala: 1,9 (2), Pro: 3,1 (3), Tyr: 1,0 (1), Phe: 1,0 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
D-KPCAREPPTRTFAYWGQG = Glx: 1,9 (2), Gly: 2,3 (2), Arg: 1,9 (2), Thr: 1,8 (2), Ala: 1,9 (2), Pro: 3,4 (3), Tyr: 1,0 (1), Phe: 1,1 (1), Lys: 0,7 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
YKCAREPPTRTFAYWGQG = Glx: 2,0 (2), Gly: 2,2 (2), Arg: 2,1 (2), Thr: 1,8 (2), Ala: 1,8 (2), Pro: 2,0 (2), Tyr: 2,0 (2), Phe: 1,1 (1), Lys: 1,0 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
Ejemplo 5 Radiomarcaje del péptido que contiene KGC, YKC, KPC o D-KPC con Tc-99m
Los cuatro péptidos obtenidos en el Ejemplo 4 se marcaron con Tc-99m de manera similar al Ejemplo 2. Las tasas de radiomarcaje de los péptidos marcados con Tc-99m resultantes se muestran en la Tabla 2, junto con la del péptido que contiene KYC marcado con Tc-99m obtenido en el Ejemplo 2. Comparando las muestras con una concentración de 100 \mug/ml, los resultados en la Tabla 2 revelan que el péptido que tiene un resto de Tyr, un resto de Gly o un resto de Lys como X2 alcanzó una tasa de radiomarcaje del 98% o más, mientras que el péptido que tenía un resto de Pro como X2 apenas alcanzó una tasa de radiomarcaje del 50 al 70%.
TABLA 2 Tasa de radiomarcaje (%) de los péptidos que contienen KYC, KGC, YKC, KPC y D-KPC con Tc-99m (n = 3, media \pm desviación estándar)
Péptido que forma un quelato metálico Concentración de la muestra
100 \mug/ml 50 \mug/ml 25 \mug/ml
KYC** 97,8\pm0,69 96,4\pm0,32 92,2\pm1,39
KGC 98,2\pm0,11 93,2\pm1,77 91,9\pm4,73
YKC* 98,1 97,6 96,9
KPC 53,6\pm0,81 51,0\pm0,13 -
D-KPC 69,1\pm1,86 67,1\pm0,06 -
*n = 1
** ejemplo de referencia
Ejemplo 6 (ejemplo de referencia)
Estabilidad de KYCAREPPTRTFAYWGQG marcado con Tc-99m
KYCAREPPTRTFAYWGQG marcado con Tc-99m se preparó conforme a los métodos de los Ejemplos 1 y 2. El péptido marcado se mezcló con una solución de DTPA (del inglés "diethylenetriaminepentaacetic acid") en una cantidad molar 1000 veces mayor, y la mezcla se dejó durante una hora a temperatura ambiente. Se examinó la estabilidad del quelato del péptido marcado en términos de velocidad de transquelación de Tc-99m con DTPA. La velocidad de transquelación se midió por HPLC como se describe en el Ejemplo 1, y los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 3. Como se muestra en la Fig. 3, se confirmó que incluso cuando se añadía DTPA en una cantidad molar 1000 veces mayor, no se observaba ningún pico de radiactividad distinto del pico único (tiempo de retención: 17,08 min), y Tc-99m-KYC se mantenía por tanto de manera estable en el péptido marcado.
Ejemplo 7 Biodistribución del péptido que contiene KYC, DYC o YYC marcado con Tc-99m
Se anestesiaron ratas de la cepa SD (Sprague-Dawley) que pesaban entre 140 y 200 g con tiopentobarbital sódico. Los tres péptidos marcados con Tc-99m, Tc-99m-KYCAREPPTRTFAYWGQG*, Tc-99m-DYCAREPPTRTFAYWGQG y Tc-99m- YYCAREPPTRTFAYWGQG obtenidos en el Ejemplo 2, se administraron por vía intravenosa a las ratas en la vena de la cola en una dosis de 3,0 a 3,7 MBq. Después de 5, 30, 60 y 180 minutos, las ratas se sacrificaron y se sometieron a un análisis de distribución de la radiactividad en cada órgano utilizando un analizador de monocanal de NaI. Los resultados se muestran en las Tablas 3, 4 y 5.
*ejemplo de referencia
TABLA 3 Biodistribución del péptido Tc-99m-DYC (valor superior: % Dl/órgano, valor inferior: % Dl/g) (n = 3, media \pm desviación estándar)
Órgano Después Después Después Después
de 5 min de 30 min de 60 min de 180 min
Hígado 2,31\pm0,06 1,20\pm0,11 0,56\pm0,17 0,16\pm0,02
0,33\pm0,05 0,19\pm0,01 0,10\pm0,03 0,03\pm0,00
Intestino delgado 2,42\pm0,18 2,83\pm0,53 4,18\pm1,35 4,54\pm0,59
0,33\pm0,03 0,44\pm0,10 0,66\pm0,14 0,85\pm0,12
Intestino grueso 1,53\pm0,21 0,58\pm0,16 0,28\pm0,06 0,26\pm0,03
0,21\pm0,02 0,09\pm0,03 0,04\pm0,01 0,03\pm0,01
TABLA 3 (continuación)
Órgano Después Después Después Después
de 5 min de 30 min de 60 min de 180 min
Estómago 0,83\pm0,06 0,71\pm0,09 0,67\pm0,07 0,60\pm0,20
0,20\pm0,03 0,16\pm0,01 0,13\pm0,01 0,16\pm0,06
Bazo 0,15\pm0,00 0,05\pm0,01 0,02\pm0,01 0,01\pm0,00
0,32\pm0,03 0,14\pm0,03 0,07\pm0,02 0,02\pm0,00
Pulmón 1,14\pm0,12 0,47\pm0,03 0,22\pm0,03 0,07\pm0,01
1,16\pm0,04 0,52\pm0,01 0,28\pm0,02 0,09\pm0,02
Corazón 0,33\pm0,03 0,10\pm0,01 0,04\pm0,01 0,00\pm0,00
0,53\pm0,06 0,17\pm0,02 0,07\pm0,01 0,01\pm0,00
Riñón 7,60\pm0,90 3,93\pm0,07 2,09\pm0,53 0,69\pm0,29
5,28\pm0,35 2,87\pm0,03 1,67\pm0,48 0,58\pm0,25
Sangre entera 16,55\pm0,89 4,78\pm0,56 2,29\pm1,01 0,29\pm0,18
1,51\pm0,08 0,46\pm0,06 0,24\pm0,12 0,03\pm0,02
Resto del cadáver 54,28\pm3,30 22,95\pm2,87 8,24\pm2,44 3,18\pm2,67
0,43\pm0,03 0,19\pm0,02 0,07\pm0,02 0,03\pm0,02
Orina 19,15\pm2,74 64,22\pm3,06 82,35\pm4,19 90,32\pm3,59
TABLA 4 Biodistribución del péptido Tc-99m-KYC (valor superior: % Dl/órgano, valor inferior: % Dl/g)(n = 3, media \pm desviación estándar)
Órgano Después Después Después Después
de 5 min de 30 min de 60 min de 180 min
Hígado 3,63\pm1,75 2,88\pm0,56 1,77\pm0,68 0,99\pm0,50
0,58\pm0,28 0,43\pm0,05 0,27\pm0,12 0,15\pm0,07
Intestino delgado 2,75\pm0,78 3,14\pm0,65 3,69\pm0,16 2,09\pm0,48
0,40\pm0,09 0,48\pm0,12 0,53\pm0,02 0,29\pm0,09
Intestino grueso 1,63\pm0,38 0,56\pm0,08 0,24\pm0,01 3,55\pm1,22
0,23\pm0,03 0,10\pm0,03 0,04\pm0,00 0,51\pm0,16
Estómago 0,65\pm0,22 0,45\pm0,14 0,36\pm0,23 0,06\pm0,04
0,27\pm0,06 0,16\pm0,05 0,13\pm0,08 0,02\pm0,01
Bazo 0,33\pm0,20 0,14\pm0,06 0,09\pm0,05 0,06\pm0,04
0,82\pm0,51 0,34\pm0,15 0,20\pm0,12 0,16\pm0,10
Pulmón 1,09\pm0,52 0,45\pm0,09 0,19\pm0,08 0,07\pm0,04
1,10\pm0,45 0,48\pm0,07 0,22\pm0,10 0,08\pm0,04
Corazón 0,29\pm0,08 0,12\pm0,01 0,04\pm0,01 0,01\pm0,00
0,49\pm0,11 0,20\pm0,02 0,06\pm0,01 0,01\pm0,00
Riñón 9,65\pm1,99 6,80\pm0,84 5,22\pm0,93 4,75\pm1,08
8,06\pm2,66 5,36\pm0,31 3,97\pm0,64 3,69\pm0,54
TABLA 4 (continuación)
Órgano Después Después Después Después
de 5 min de 30 min de 60 min de 180 min
Sangre entera 17,38\pm1,58 6,85\pm1,68 2,06\pm0,33 0,37\pm0,14
1,56\pm0,07 0,62\pm0,14 0,18\pm0,03 0,03\pm0,01
Resto del cadáver 50,31\pm2,82 25,57\pm2,55 8,39\pm1,12 2,20\pm1,51
0,39\pm0,03 0,20\pm0,03 0,18\pm0,03 0,02\pm0,01
Orina 19,46\pm8,85 55,55\pm4,91 78,81\pm0,99 86,01\pm3,07
TABLA 5 Biodistribución del péptido Tc-99m-YYC (valor superior: % Dl/órgano, valor inferior: % Dl/g)(n = 3, media \pm desviación estándar)
Órgano Después Después Después Después
de 5 min de 30 min de 60 min de 180 min
Hígado 7,46\pm0,52 3,97\pm0,23 1,99\pm0,37 0,59\pm0,06
1,05\pm0,08 0,56\pm0,03 0,28\pm0,06 0,09\pm0,01
Intestino delgado 4,23\pm0,63 25,03\pm5,42 37,35\pm3,38 23,28\pm4,42
0,50\pm0,05 3,00\pm0,88 4,81\pm0,70 3,00\pm0,41
Intestino grueso 1,70\pm0,25 0,49\pm0,18 0,19\pm0,05 20,66\pm6,82
0,22-\pm0,02 0,07\pm0,01 0,03\pm0,01 2,12\pm0,72
Estómago 0,87\pm0,02 0,61\pm0,67 0,18\pm0,08 0,04\pm0,00
0,13\pm0,01 0,09\pm0,09 0,03\pm0,02 0,10\pm0,00
Bazo 0,30\pm0,04 0,15\pm0,01 0,11\pm0,02 0,03\pm0,01
0,70\pm0,00 0,36\pm0,07 0,25\pm0,06 0,06\pm0,01
Pulmón 2,82\pm0,27 1,34\pm0,10 0,99\pm0,21 0,36\pm0,06
3,20\pm0,37 1,48\pm0,31 1,02\pm0,18 0,37\pm0,07
Corazón 0,33\pm0,02 0,09\pm0,02 0,04\pm0,01 0,00\pm0,00
0,59\pm0,05 0,15\pm0,03 0,06\pm0,03 0,01\pm0,00
Riñón 5,76\pm0,64 2,38\pm0,51 1,86\pm0,79 0,87\pm0,73
4,94\pm0,79 1,87\pm0,27 1,40\pm0,60 0,68\pm0,62
Sangre entera 17,63\pm2,89 4,65\pm1,30 1,61\pm0,95 0,10\pm0,04
1,63\pm0,33 0,41\pm0,09 0,14\pm0,08 0,01\pm0,00
Resto del cadáver 54,57\pm2,67 22,78\pm4,44 8,46\pm2,68 2,08\pm1,87
0,44\pm0,03 0,17\pm0,03 0,06\pm0,02 0,02\pm0,01
Orina 11,63\pm3,99 40,29\pm1,70 47,88\pm1,42 52,01\pm3,89
Los resultados de las Tablas 3, 4 y 5 demuestran que la distribución in vivo de los péptidos marcados con Tc-99m en ratas normales cambió extraordinariamente sólo con la diferencia en el resto de aminoácido X1 entre los péptidos marcados. Especialmente cuando el péptido marcado tenía un resto de Asp o un resto de Lys como X1, el péptido se excretaba rápidamente desde el riñón, y se excretó a orina con un 82% de radiactividad incluso 60 minutos después de la administración. Por el contrario, cuando el péptido tenía un resto de Tyr como X1, el péptido se acumuló con un 37% de radiactividad en el intestino delgado 60 minutos después de la administración. A partir de ese momento, el péptido se excretó a heces a través del tracto GI.
Ejemplo 8 (ejemplo de referencia)
Adquisición de imágenes de un tumor utilizando Tc-99m-KYCAREPPTRTNAYWGQG
Un péptido que contenía KYC en el extremo N-terminal, KYCAREPPTRTNAYWGQG, se sintetizó y purificó conforme al método del Ejemplo 1. El radiomarcaje con Tc-99m se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 2, seguido de análisis por HPLC. Los datos analíticos obtenidos sobre la composición de aminoácidos del péptido: KYCAREPPTRTNAYWGQG se expresaron como el número de un resto de aminoácido por molécula de péptido, y los resultados se muestran a continuación. En los resultados, la cifra entre paréntesis indica el valor teórico del número de un resto de aminoácido por molécula de péptido.
KYCAREPPTRTNAYWGQG = Asn: 1,1 (1), Glx: 2,0 (2), Gly: 2,1 (2), Arg: 1,9 (2), Thr: 2,0 (2), Ala: 1,9 (2), Pro: 2,1 (2), Tyr: 2,0 (2), Lys: 0,9 (1), Cys: - (1), Trp: - (1).
Se resuspendieron células tumorales HEp2 (5 x 10^{6} células, Carcinoma Epidermoide Humano; ATCC Nº CCL 23) en 1,0 ml de medio (medio mínimo esencial (de Eagle) con BSS (del inglés "balanced salt solution") de Earle al 90%, suero bovino fetal al 10%), y se inyectaron 100 \mul de la suspensión por vía subcutánea a un ratón sin sistema inmune BALB/C (6 semanas de edad) en el cuerpo. Dos semanas después de la inyección, el ratón en el que el tumor implantado había crecido hasta aproximadamente un tamaño de 0,3 g se anestesió con tiopentobarbital sódico, y se inyectó el péptido marcado con Tc-99m en la vena de la cola en una dosis de 35 a 40 MBq. 5 y 20 minutos después de la inyección, se adquirieron imágenes del animal con una cámara gamma. Los resultados obtenidos se muestran en las Figs. 4 y 5.
Inmediatamente después de la adquisición de las imágenes, el animal se sacrificó y se examinó la distribución de radiactividad en cada órgano utilizando un analizador de monocanal de NaI para determinar una relación entre la radiactividad en el sitio del tumor y la radiactividad en el sitio muscular (relación T/B). Veinte minutos después de la administración del péptido marcado con Tc-99m, la relación T/B mostró un valor de 4,50 \pm 0,71 (n = 3, media \pm desviación estándar), y el sitio con el tumor se visualizó claramente en la imagen. Tales resultados demuestran que el péptido que forma un quelato metálico KYC de la presente invención es útil para radiomarcar de manera estable con Tc-99m el péptido que tiene afinidad por el sitio donde existe un tumor: AREPPTRTFAYWGQG (PCT/WO 9218534-A), de tal forma que se mantuvo la actividad farmacológica del péptido.
Ejemplo 9 (ejemplo de referencia)
Preparación de Tc-99m-KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2}
El péptido KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2} se sintetizó y purificó de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se utilizó resina amidada (resina PAL, Millipore) en lugar de la resina pre-cargada. A continuación, el péptido sintetizado se marcó con Tc-99m y se analizó por HPLC de la misma manera que en el Ejemplo 2. Los datos analíticos obtenidos sobre las composiciones de aminoácidos de los péptidos se expresaron como el número de un resto de aminoácido por molécula de péptido, y los resultados se muestran a continuación. En los resultados, la cifra entre paréntesis indica el valor teórico del número de un resto de aminoácido por molécula de péptido.
KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2} = Asp: 1,1 (1), Glx: 3,0 (3), Ser: 0,9 (1), Gly: 2,1 (2), Arg: 2,0 (2), Thr: 2,2 (2), Pro: 1,0 (1), Tyr: 3,2 (3), Val: 1,5 (2), Lys: 3,0 (3), Cys: - (1).
En un vial liofilizado cargado con una mezcla de 40,3 \mumol / 300 \mul de glucoheptonato y 130 nmol / 50 \mul de solución de cloruro estannoso, se añadieron entre 1,5 y 1,8 GBq de solución de pertecnectato (Tc-99m) sódico para hacer un volumen total de 1,0 ml. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos volteando el vial ocasionalmente. Se sometió una alícuota de la mezcla de reacción a electroforesis en membrana de acetato de celulosa para confirmar si el radiomarcaje de glucoheptonato con Tc-99m había alcanzado el 95% o más. A continuación, se mezclaron 40 nmol / 500 \mul del péptido con 500 \mul de la solución de glucoheptonato marcado con Tc-99m. La reacción se llevó a cabo durante 20 minutos en un baño de agua hirviendo. La mezcla de reacción se dejó entonces enfriar. Se sometió una alícuota de la mezcla de reacción a TLC (del inglés "thin layer chromatography") (placa de TLC: ODS, disolvente de revelado: TFA al 0,1% / acetonitrilo al 60% / agua pura) para determinar la tasa de radiomarcaje con Tc-99m. Como resultado, la tasa de radiomarcaje del péptido fue del 90%.
Ejemplo 10 (ejemplo de referencia)
Adquisición de imágenes de una inflamación utilizando Tc-99m-KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2}
Se resuspendieron 10^{8} células de Staphylococcus aureus en 1 ml de solución salina fisiológica, y se administraron 100 \mul de la suspensión por vía intramuscular a ratas SD que pesaban aproximadamente 220 g en la pantorrilla derecha. Después de 24 horas, la rata en la que la inflamación se observaba claramente se anestesió con tiopentobarbital sódico y se inyectó el péptido marcado con Tc-99m: KYCGGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2} obtenido en el Ejemplo 9 en la cola de la vena, en una dosis de 37 a 74 MBq. 30 y 120 minutos después de la inyección del péptido, se adquirieron imágenes del animal con una cámara gamma. Los resultados obtenidos se muestran en las Figs. 6 y 7. Se seleccionaron las regiones de interés de la imagen obtenida para determinar la relación T/B entre la radiactividad en el sitio de la inflamación (T) y la radiactividad en sitio normal (B). La relación T/B mostró un valor de 3,26 \pm 0,18 (n = 6, media \pm desviación estándar), y el sitio con la inflamación se visualizó claramente en la imagen. Los resultados obtenidos demuestran que el péptido Tc-99m-KYC de la presente invención es útil para radiomarcar de manera estable con Tc-99m el péptido que tiene afinidad por una inflamación: GGKTKPREQQYNSTYRVV-NH_{2}, de tal forma que se mantuvo la actividad fisiológica del péptido.
Como se ha descrito con detalle en lo que antecede, el péptido que forma un quelato metálico de la presente invención que comprende los tres aminoácidos específicos X1-X2-Cys resulta ventajoso en la medida en que el péptido permite un manejo sencillo sin ninguna consideración en particular sobre la formación indeseada de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares que ocurre en técnicas anteriores; el péptido puede unirse a un péptido fisiológicamente activo para formar un complejo, sin dañar la actividad del péptido fisiológicamente activo; el péptido permite la formación estable de un complejo quelado radiactivo con un radionucleido metálico tal como Tc-99m, tanto in vitro como in vivo; y el péptido puede proporcionar radiactividad que no causa acumulación inespecífica en la distribución in vivo del reactivo marcado producido finalmente, permitiendo diseñar una ruta metabólica para la excreción del reactivo marcado según sea necesario, o dependiendo del propósito.

Claims (26)

1. Un péptido que forma un quelato metálico representado por:
X1-X2-Cys
en el que X1 representa un resto de aminoácido N-terminal que es un resto de Asp, Lys o Tyr; y X2 representa un resto de aminoácido distinto de un resto de Cys, Pro o Gly; y cada uno de los restos de aminoácido puede estar en forma D o en forma L.
2. Un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, en el que X1 es un resto de Asp, y X2 es un resto de Tyr.
3. Un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, en el que X1 es un resto de Asp, y X2 es un resto de Lys.
4. Un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, en el que X1 es un resto de Tyr, y X2 es un resto de Tyr.
5. Un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, en el que X1 es un resto de Tyr, y X2 es un resto de Lys.
6. Un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, en el que X1 es un resto de Lys, y X2 es un resto de Tyr.
7. Un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, en el que X1 es un resto de Lys, y X2 es un resto de Lys.
8. Un complejo de un péptido que forma un quelato metálico conforme a la reivindicación 1, con la condición adicional de que cuando X1 represente un resto de Lys, X2 no represente un resto de Tyr, en el que un péptido fisiológicamente activo se une a través de un enlace peptídico al resto de Cys del péptido que forma un quelato metálico.
9. Un complejo conforme a la reivindicación 8, en el que el péptido que forma un quelato metálico es como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 y 7.
10. Un complejo de un péptido que forma un quelato metálico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que un péptido fisiológicamente activo, distinto de AREPPT-X_{2} (en el que A, E, P, R y T representan restos de aminoácido expresados mediante los símbolos estándar de una letra y X_{2} representa cualquier resto de aminoácido de tal forma que el complejo contenga hasta 20 restos de aminoácido), se une a través de un enlace peptídico al resto de Cys del péptido que forma un quelato metálico.
11. Un complejo conforme a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el péptido se selecciona entre un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un tumor, un péptido que tenga afinidad por un sitio con inflamación y/o infección, un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un trombo, y un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un desorden cerebral.
12. Un reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que un radionucleido metálico se coordina a un péptido que forma un quelato metálico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. Un reactivo marcado con un radionucleido metálico, en el que un radionucleido metálico se coordina a un complejo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
14. Un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 12 o 13, en el que el radionucleido metálico es Tc-99m, In-111, Ga-67, Y-90, Re-186 o Re-188.
15. Una composición radiodiagnóstica, que comprende como ingrediente activo un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 14, en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y
Ga-67.
16. Una composición radioterapéutica, que comprende como ingrediente activo un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 14, en el que está coordinado cualquiera entre Y-90, Re-186 y Re-188.
17. Un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 14, en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67, para utilizar en diagnóstico.
18. La utilización de un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 14, en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67, en la fabricación de una composición para utilizar en diagnóstico.
19. La utilización de un péptido que forma un quelato metálico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para marcar un péptido fisiológicamente activo con un radionucleido metálico.
20. La utilización conforme a la reivindicación 19 para marcar un péptido que tiene afinidad por un sitio concreto en el cuerpo de un mamífero.
21. La utilización conforme a la reivindicación 20, en la que el péptido se selecciona entre un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un tumor, un péptido que tenga afinidad por un sitio con inflamación y/o infección, un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un trombo, y un péptido que tenga afinidad por un sitio donde existe un desorden cerebral.
22. Un método para preparar un péptido que forma un quelato metálico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende los pasos de:
unir cisteína o un derivado protegido de la misma a un aminoácido X2 o un derivado protegido del mismo para formar un dipéptido X2-Cys; y
unir al dipéptido así formado un aminoácido X1 o un derivado protegido del mismo.
23. Un método para preparar un complejo de un péptido que forma un quelato metálico, cuyo procedimiento comprende el paso de unir un péptido fisiológicamente activo a un péptido que forma un quelato metálico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
24. Un método para preparar un reactivo marcado con un radionucleido metálico que comprende el paso de coordinar un radionucleido metálico a un péptido que forma un quelato metálico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o a un complejo conforme a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
25. Un método para preparar una composición radiodiagnóstica conforme a la reivindicación 15, que comprende el paso de mezclar un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 14, en el que está coordinado cualquiera entre Tc-99m, In-111 y Ga-67, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
26. Un método para preparar una composición radioterapéutica conforme a la reivindicación 16, que comprende el paso de mezclar un reactivo marcado con un radionucleido metálico conforme a la reivindicación 14, en el que está coordinado cualquiera entre Y-90, Re-186 y Re-188, con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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