ES2199985T3

ES2199985T3 - Anticuerpos recombinantes humanizados anti-lewis y.

Info

Publication number: ES2199985T3
Application number: ES95912894T
Authority: ES
Inventors: Francis J. Carr; Lloyd J. Old; Elisabeth Stockert; Sydney Welt; Kunio Kitamura; Pilar Garin-Chesa; Dr. Kathryn Armour
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1994-03-08
Filing date: 1995-03-08
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2015-03-08
Also published as: AU1990795A; EP0749482A1; PT749482E; WO1995024484A1; US6310185B1; US6518415B1; DK0749482T3; ATE242326T1; CA2185114A1; CA2185114C; US5874060A; AU696286B2; DE69530975T2; DE69530975D1; EP0749482B1

Abstract

LA INVENCION SUMINISTRA LA PRODUCCION VARIOS ANTICUERPOS DE MURINO HUMANIZADOS ESPECIFICOS PARA EL ANTIGENO LEWIS Y, QUE ES RECONOCIDO POR EL ANTICUERPO LEWIS Y. EL ANTIGENO LEWIS Y SE EXPRESA EN TEJIDOS NORMALES PERO EL NIVEL DE EXPRESION ES SUPERIOR EN CIERTOS TIPOS DE TUMORES DE MANERA QUE EL ANTIGENO PUEDE SER USADO COMO UN MARCADOR PARA CELULAS DE ALGUNOS CARCINOMAS DE LA MAMA, DEL COLON, GASTRICOS, ESOFAGICOS, PANCREATICOS, DUODENALES, PULMONARES, DE VEJIGA Y RENALES Y TUMORES NEUROENDOCRINOS CELULARES GASTRICOS Y DE ISLOTE . LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA NUMEROSOS POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS ANTICUERPOS ESPECIFICOS DEL LEWIS Y HUMANIZADO, LOS VECTORES DE EXPRESION PARA PRODUCIR ANTICUERPOS ESPECIFICOS DEL LEWIS Y HUMANIZADOS, Y CELULAS HUESPED PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE LOS ANTICUERPOS HUMANIZADOS. LA INVENCION TAMBIEN SUMINISTRA METODOS PARA DETECTAR CELULAS CANCEROSAS (IN VITRO) Y (IN VIVO) USANDO ANTICUERPOS ESPECIFICOS DEL LEWIS Y HUMANIZADOS. ADICIONALMENTE, LA INVENCION SUMINISTRA METODOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER USANDO ANTICUERPOS ESPECIFICOS LEWIS Y HUMANIZADOS.

Description

Anticuerpos recombinantes humanizados anti-Lewis Y.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia al campo de la biología molecular y más particularmente a los anticuerpos humanizados.

Antecedentes

La presente invención hace referencia a la generación, mediante procedimientos del DNA recombinante, de inmunoglobulinas nuevas y específicas para el antígeno Lewis Y, utilizando como punto de partida un anticuerpo monoclonal murino contra el mismo antígeno.

La transformación de una célula normal a una célula maligna se acompaña a menudo por un cambio en la expresión de los antígenos de superficie celular. Estos fenotipos diferentes pueden detectarse utilizando anticuerpos monoclonales específicos para dichos antígenos. De este modo, se pueden detectar y caracterizar células cancerosas distintas (Lloyd, K.O. (1983) "Human Tumour Antigens: Detection and Characterization with Monoclonal Antibodies" en R.B. Herberman, ed., Basic and Clinical Tumour Immunology, pp. 159-214, Martinus Nijhoff, Boston). El antígeno Lewis Y es un carbohidrato antigénico con la siguiente estructura:

Fuc\alphal \rightarrow 2Gal\beta1 \rightarrow 4[Fuc\alpha \rightarrow 3]GlcNac\beta1 \rightarrow 3R (Abe y col., (1983) J. Biol. Chem. 258:11793-11797). El antígeno Lewis Y se expresa en tejidos normales, pero el nivel de expresión es superior en algunos tipos de tumores, de modo que el antígeno puede utilizarse como un marcador de células de carcinoma de mama, colon, estómago, esófago, páncreas, duodeno, pulmón, bazo, riñón, tumores gástricos y tumores neuroendocrinos de células de los islotes pancreáticos. Su presencia, en algunas células tumorales, no se acompaña por un incremento en los niveles séricos, por lo que el anticuerpo administrado específico para Lewis Y no se une significativamente a un antígeno soluble.

Aunque un anticuerpo monoclonal murino reactivo contra el antígeno Lewis Y tiene una utilidad potencial en el diagnóstico por la imagen y el tratamiento de ciertos tumores en el hombre, este potencial puede hallar dificultades para su realización debido a la naturaleza xenogénica del anticuerpo. Los problemas asociados con ello son de dos tipos. En primer lugar, los anticuerpos xenogénicos administrados son probablemente inmunogénicos (Bruggemann y col., (1989) J. Exp. Med. 170:2153-2157). En este caso, esto causaría una respuesta de anticuerpos humano anti-ratón (HAMA) (Schroff, R. y col., (1985) Cancer Res. 45, 879-885), dando como resultado un aclaramiento rápido del anticuerpo en la circulación. En segundo lugar, dependiendo de los isotipos implicados, un anticuerpo murino puede ser menos eficaz que su homólogo humano en la estimulación del complemento humano o la citotoxicidad mediada por células.

Para asegurar la ventaja de un anticuerpo humano, aprovechando las propiedades de unión al antígeno de un anticuerpo generado en una especie distinta, los investigadores han utilizado las técnicas del DNA recombinante. Las patentes europeas EP120694 (Celltech) y EP125023 (Genentech) describen el desarrollo de anticuerpos "quiméricos" que comprenden las regiones variables de un anticuerpo de otra especie y las regiones constantes de un anticuerpo humano. Dichos anticuerpos quiméricos tienen la ventaja de retener la especificidad del anticuerpo murino, pero también pueden estimular la fijación del complemento humano dependiente de Fc y la citotoxicidad mediada por células. Sin embargo, las regiones variables murinas pueden provocar una respuesta HAMA (Bruggemann y col., (1989) J. Exp. Med. 170, 2153-2157), limitando así el valor de los anticuerpos quiméricos como agentes diagnósticos y terapéuticos.

La Solicitud de patente británica GB2188638A (Winter) describe el proceso de humanización en donde únicamente se transfieren los bucles de unión antigénicos a un molde de anticuerpo humano (por ejemplo en Riechmann y col., Nature, 332:323-327; Tempest y col., (1991) Bio/Technology 9:266-271). Estos bucles, conocidos como regiones determinantes de complementariedad (CDRs), se montan en un armazón - las regiones de entramado. Todo este conjunto genera los dominios variables. Cada sitio de unión se forma, en la mayoría de los casos, a partir de tres CDRs de cadenas pesadas y tres CDRs de cadenas ligeras, aunque los residuos de entramado pueden interactuar con el antígeno, directa o indirectamente, alterando la conformación de la CDR. Los anticuerpos "regenerados" o "humanizados" por el proceso de injerto de CDR retienen las regiones constantes humanas para la estimulación de funciones efectoras Fc-dependientes y tienen menos contenido murino que los anticuerpos quiméricos. En consecuencia, los anticuerpos humanizados provocan con menor probabilidad una respuesta HAMA cuando se administran a los humanos, su vida media en la circulación se aproximaría a la de los anticuerpos humanos naturales, por lo que se incrementa su valor diagnóstico y terapéutico.

En la práctica, para la generación de anticuerpos humanizados eficaces que retengan la especificidad del anticuerpo murino original, en general, no es simplemente suficiente sustituir las CDRs. Existe un requisito para la inclusión de un número pequeño de residuos de anticuerpos murinos críticos en las regiones de entramado variables humanas. La identidad de estos residuos depende de la estructura del anticuerpo murino original y del anticuerpo humano aceptor.

La presente invención proporciona el nuevo anticuerpo monoclonal humanizado 35193 HuVHT/HuVKF específico para el antígeno Lewis Y. Ello se puede lograr mediante generación de un anticuerpo monoclonal murino reactivo con el antígeno Lewis Y, seguido de la utilización de sus estructuras de dominio variable en el diseño de los anticuerpos recombinantes. Antes del trabajo de los inventores, no se sabía que el 3S193, o ningún otro anticuerpo no-humano, específico para el antígeno Lewis Y pudiera ser humanizado a fin de retener la provechosa especificidad de unión.

Descripción resumida de las figuras

Las Figuras 1 y 2 muestran las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas de las regiones variables de la cadena pesada (figura 1) y de kappa (ligera) (figura 2) del 3S193 murino. Las CDRs están encuadradas y los residuos escogidos para los cebadores de la PCR están subrayados.

Las figuras 3 (cadena pesada) y 4 (cadena ligera) proporcionan las secuencias nucleotídicas de los fragmentos de DNA que codifican las regiones variables humanizadas básicas y sus productos polipeptídicos. Las CDRs están encuadradas.

3. Resumen de la invención

Un aspecto de la invención es proporcionar los anticuerpos humanizados específicos para el antígeno Lewis Y.

Otro aspecto de la invención es proporcionar los polinucleótidos que codifican para los anticuerpos humanizados específicos para el antígeno Lewis Y. También se proporcionan diversos vectores de expresión que comprenden polinucleótidos unidos a las secuencias promotoras. De modo similar, otro aspecto de la invención hace referencia a las células huésped transformadas con los vectores de expresión para la expresión de anticuerpos humanizados específicos para Lewis Y.

Otro aspecto de la invención es proporcionar anticuerpos humanizados específicos para Lewis Y que estén marcados con un marcaje detectable o una marcaje terapéutico.

Otro aspecto de la invención es la utilización del anticuerpo humanizado específico para Lewis Y en la preparación de una composición para el tratamiento y/o el diagnóstico del cáncer mediante la administración de una composición que comprende un anticuerpo humanizado específico para Lewis Y. Un procedimiento para detectar las células cancerosas implica la etapa de administración de un anticuerpo marcado (marcaje detectable) a un paciente y la etapa consiguiente de detección del lugar en el cuerpo donde se ha unido el anticuerpo marcado.

4. Descripción detallada de las realizaciones específicas

Tal como se utiliza aquí, el término anticuerpo "humanizado" hace referencia a una molécula que tiene sus CDRs (regiones determinantes de la complementariedad) derivadas de una inmunoglobulina de una especie no-humana y el resto de la molécula de anticuerpos se deriva principalmente de una inmunoglobulina humana. El término "anticuerpo" tal como se utiliza aquí, salvo que se indique lo contrario, se utiliza ampliamente para referirse a moléculas de anticuerpo y a una variedad de moléculas derivadas de anticuerpos. Dichas moléculas derivadas de anticuerpos comprenden por lo menos una región variable (una región variable de cadena ligera o pesada) e incluyen moléculas como los fragmentos Fab, fragmentos F(ab')_{2}, anticuerpos Sc (anticuerpos de cadena sencilla), diacuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpos y otras moléculas y similares.

El término "procedimientos convencionales de biología molecular" hace referencia a las técnicas para la manipulación de polinucleótidos que son bien conocidas por los expertos en biología molecular. Ejemplos de dichas técnicas bien conocidas se pueden hallar en Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2º edición, Sambrook y col., Cold Spring Harbor, NY (1989). Ejemplos de técnicas convencionales de biología molecular incluyen, pero no se limitan a, la ligación in vitro, la digestión con endonucleasas de restricción, la transformación celular por PCR, la hibridación, la electroforesis, la secuenciación del DNA y similares.

El término "región variable", tal como se utiliza aquí, hace referencia a moléculas de inmunoglobulina tal como se las denomina comúnmente por los expertos en inmunología. Tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras de anticuerpos pueden dividirse en "regiones variables" y "regiones constantes". El punto de división entre una región variable y una región constante puede determinarse fácilmente por un técnico en la materia gracias a las referencias de textos estándares que describen la estructura del anticuerpo, p.ej., Kabat y col., "Sequences of Proteins of Immunological interest: 5^{a} edición" U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991).

La presente invención proporciona moléculas de anticuerpos humanizados específicas para el antígeno Lewis Y, en las que por lo menos parte de las CDRs de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo (el anticuerpo del receptor) se han sustituido por las porciones análogas de CDRs de un anticuerpo monoclonal murino y así el anticuerpo humanizado puede unirse específicamente al mismo antígeno como el anticuerpo de Lewis Y. En una realización preferida de la presente invención, las regiones CDR del anticuerpo humanizado específico de Lewis Y se derivan del anticuerpo 3S193 murino. Los anticuerpos humanizados descritos aquí contienen algunas alteraciones del anticuerpo del aceptor, es decir, las regiones de entramado del dominio variable de cadena pesada y/o ligera que son necesarias para retener la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donante. En otras palabras, la región de entramado de algunas realizaciones de los anticuerpos humanizados descritos aquí no consisten necesariamente de la secuencia aminoacídica precisa de la región de entramado de una región variable de un anticuerpo humano de origen natural, sino que contiene diversas sustituciones que mejoran las propiedades de unión de una región de anticuerpo humanizado, que es específico para la misma diana que el anticuerpo 3S193. Se realizaron un número mínimo de sustituciones en la región de entramado con el fin de evitar la introducción a gran escala de residuos de entramado no-humanos y para asegurar una inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado. El anticuerpo monoclonal del donante preferido de la presente invención es el anticuerpo murino 3S193, específico del antígeno cancerígeno humano Lewis Y. Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden producirse mediante una diversidad de procedimientos útiles para la producción de polipéptidos, p.ej., la síntesis in vitro, la producción de DNA recombinante y similares. Preferentemente, los anticuerpos humanizados se producen mediante la tecnología del DNA recombinante. La presente invención también hace referencia a la secuencia del DNA y de la proteína codificante para dichos anticuerpos recombinantes. La invención también proporciona los vectores para la producción de los anticuerpos recombinantes en las células huésped de mamífero.

Además de proporcionar los anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y, la presente invención proporciona los polinucleótidos que codifican los anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y. Dichos polinucleótidos pueden tener una gran variedad de secuencias debido a la degeneración del código genético. Un experto en la materia puede cambiar fácilmente una secuencia polinucleotídica dada que codifique para un anticuerpo humanizado de Lewis Y por una secuencia polinucleotídica distinta que codifique para el mismo anticuerpo específico de Lewis Y. La secuencia polinucleotídica que codifica para el anticuerpo se puede variar teniendo en cuenta los factores que afecten la expresión como la frecuencia codificante, la estructura secundaria del RNA y similares.

Los anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y los recombinantes de la invención pueden producirse mediante el proceso siguiente u otros procedimientos de expresión de proteínas recombinantes:

a. Construcción, mediante procedimientos convencionales de biología molecular, de un vector de expresión que comprende un operón que codifica para una cadena pesada de anticuerpo, en donde se requiere que las CDRs y una porción mínima de la región de entramado variable, necesarias para retener la especificidad de unión del anticuerpo, deriven de una inmunoglobulina no-humana, como el anticuerpo monoclonal murino de Lewis Y, y la porción restante del anticuerpo derive de una inmunoglobulina humana, con lo que se produce un vector para la expresión de una cadena pesada de anticuerpo humanizado.

b. Construcción, mediante procedimientos convencionales de biología molecular, de un vector de expresión que comprende un operón que codifica para una cadena ligera de anticuerpo, en donde se requiere que las CDRs y una porción mínima de la región de entramado variable, necesarias para retener la especificidad de unión del anticuerpo donante, deriven de una inmunoglobulina no-humana, como el anticuerpo monoclonal murino de Lewis Y, y la porción restante del anticuerpo derive de una inmunoglobulina humana, con lo que se produce un vector de expresión para la cadena ligera del anticuerpo humanizado.

c. Transferencia de los vectores de expresión a una célula huésped mediante procedimientos convencionales de biología molecular para producir una célula huésped transfectada para la expresión de anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y.

d. Cultivo de la célula transfectada mediante procedimientos convencionales de biología molecular para producir anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y.

Las células huésped pueden cotransfectarse con dos vectores de expresión de la presente invención. El primer vector contiene un operón que codifica para un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector contiene un operón que codifica para un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables distintos aunque, a excepción de las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera, son preferentemente idénticos. Este procedimiento proporciona una expresión similar para los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede utilizarse un solo vector que codifique para polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender un cDNA o un DNA genómico, o ambos.

Los anticuerpos específicos de Lewis Y humanizados de la presente invención pueden producirse utilizando la tecnología de expresión de inmunoglobulinas recombinantes.

La producción recombinante de moléculas de inmunoglobulina, incluyendo los anticuerpos humanizados se describe en la patente americana U.S. 4.816.397 (Boss y col.), patente americana U.S. 4.816.567 (Cabilly y col.) patente británica GB 2.188.638 (Winter y col.) y la patente británica GB 2.209.757. Las técnicas para la expresión recombinante de inmunoglobulinas, incluyendo inmunoglobulinas humanizadas, también pueden hallarse entre otras referencias en Goeddel y col., Gene Expression Technology Methods in Enzymology, vol. 185 Academic Press (1991) y Borreback, Antibody Engineering, W.H. Freeman (1992). Información adicional concerniente a la generación, diseño y expresión de anticuerpos recombinantes puede hallarse en Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993).

La célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo recombinante de la presente invención puede ser una célula bacteriana como Escherichia coli, o preferentemente una célula eucariota. Preferentemente se utilizan células de mamífero, como por ejemplo células de ovario de hámster chino o las células de mieloma. La elección del vector de expresión depende de la elección de la célula huésped y se selecciona a fin de tener la expresión y las características reguladoras deseadas en la célula huésped seleccionada.

Los procedimientos generales para la construcción del vector de la presente invención, la transfección de células para producir la célula huésped y el cultivo de células para producir el anticuerpo de la presente invención son todos procedimientos convencionales de biología molecular. Asimismo, una vez producidos, los anticuerpos recombinantes de la presente invención se pueden purificar mediante procedimientos estándares en la materia, incluyendo la filtración de flujo transversal, la precipitación con sulfato de amonio, la cromatografía en columnas de afinidad, la electroforesis en gel y similares.

Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tenga cadenas completas pesadas y ligeras, o cualquier fragmento de lo mismo, como los fragmentos Fab o (Fab')_{2}, un dímero de cadena pesada y cadena ligera, o cualquier fragmento mínimo como un Fv, un SCA (anticuerpo de cadena sencilla) y similar, específico para la molécula del antígeno Lewis Y.

Los anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y de la presente invención pueden utilizarse junto con, o unidos a otros anticuerpos (o partes de lo mismo) como anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Estos otros anticuerpos pueden reaccionar con otros marcadores (epitopos) característicos para la enfermedad contra la cual están dirigidos los anticuerpos de la presente invención, o pueden haberse elegido especificidades distintas, por ejemplo, para reclutar moléculas o células del sistema inmune humano contra las células enfermas. Los anticuerpos de la presente invención (o partes de lo mismo), pueden administrarse con dichos anticuerpos (o partes de lo mismo) como composiciones administradas separadamente, o como una composición única con dos agentes unidos mediante procedimientos químicos o mediante procedimientos convencionales de biología molecular. Adicionalmente, puede aumentarse el valor diagnóstico y terapéutico de los anticuerpos de la presente invención marcando los anticuerpos humanizados con marcajes que produzcan una señal detectable (in vitro o in vivo), o con un marcaje que tenga una propiedad terapéutica. Algunos marcajes, p.ej., los radionucleótidos, pueden producir una señal detectable y tener propiedades terapéuticas. Ejemplos de marcajes de radionucleidos incluyen el I^{125}, I^{131}, C^{14}. Ejemplos de otros marcajes detectables incluyen un cromóforo fluorescente como la fluoresceína, la ficobiliproteína o la tetraetil rodamina para la microscopía de fluorescencia, una enzima que produce un producto fluorescente o coloreado para la detección mediante fluorescencia, absorbancia, aparición de color o aglutinación, lo que genera un producto denso en electrones para microscopía electrónica; o una molécula densa en electrones como la ferritina, la peroxidas o las bolas de oro para la visualización directa o indirecta por microscopía electrónica. Los marcajes que tienen propiedades terapéuticas incluyen los fármacos para el tratamiento del cáncer, como el metotrexato y similares.

La presente invención también proporciona la utilización del anticuerpo humanizado específico de Lewis Y en la preparación de una composición para el tratamiento y/o la detección de células cancerosas, mediante la administración de anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y, marcados o no marcados, a un paciente. Un procedimiento para la detección de células cancerosas en un humano implica la etapa de administración de un anticuerpo humanizado específico de Lewis Y y marcado (con un marcaje detectable) a un humano y la consiguiente detección del anticuerpo marcado y unido gracias a la presencia del marcaje.

Los anticuerpos recombinantes de la presente invención pueden también utilizarse para la selección y/o el aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos y del diseño y síntesis de compuestos peptídicos o no-peptídicos (miméticos) que podrían ser de utilidad para el diagnóstico y aplicaciones terapéuticas como los anticuerpos (p.ej., Sragovi y col., (1991) Science 253:792-795).

Cuando se utilizan los anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y de la presente invención, los anticuerpos se administran de forma característica en una composición que comprende un vehículo farmacéutico. Dicho vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia no-tóxica, compatible y adecuada para la liberación de los anticuerpos monoclonales al paciente. Se pueden incluir como vehículos: el agua estéril, los alcoholes, las grasas, las ceras y los sólidos inertes. También, se pueden incorporar en la composición farmacéutica los adyuvantes aceptados farmacéuticamente (agentes tamponantes, agentes dispersantes).

Las composiciones de anticuerpos humanizados de la presente invención pueden administrarse a un paciente por diversas vías. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse parenteralmente, es decir, por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa. Así, esta invención proporciona composiciones para la administración parenteral, comprendiendo dicha composición una solución del anticuerpo monoclonal humano o un cóctel de lo mismo disuelto en un vehículo aceptable, preferentemente en un vehículo acuoso. Pueden utilizarse una gran variedad de vehículos acuosos, p.ej., agua, agua tamponada, solución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de material formado de partículas. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de convencionales esterilización bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente, según se requiera, a unas condiciones fisiológicas aproximadas de pH, con agentes reguladores y tamponantes, de toxicidad, con agentes reguladores y similares, por ejemplo el acetato sódico, el cloruro sódico, el cloruro potásico, el cloruro cálcico, el lactato sódico, etc. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente, p.ej., desde aproximadamente menos del 0,5% y generalmente igual o inferior al 1%, hasta como mucho un 15-20% en peso, seleccionándose en primer lugar de acuerdo con los volúmenes de flujo, viscosidades, etc., y según el modo determinado de administración seleccionado.

Los procedimientos actuales para la preparación parenteral de composiciones administrables y de los ajustes necesarios para su administración a los individuos serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980), que se ha incorporado aquí mediante referencias.

La presente invención proporciona numerosos anticuerpos humanizados específicos para el antígeno Lewis Y, basándose en el descubrimiento de que las regiones CDR del anticuerpo monoclonal murino podrían sufrir un corte y empalme en una región de entramado del anticuerpo aceptor humano con el fin de producir un anticuerpo recombinante humanizado para el antígeno Lewis Y. Los anticuerpos humanizados específicos de Lewis Y preferidos contienen un cambio adicional en la región de entramado (o en las otras regiones) para incrementar la unión al antígeno de Lewis Y. En particular, las realizaciones preferidas de la invención son ejemplos de moléculas de anticuerpos humanizados que tienen propiedades superiores de unión al antígeno.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ejemplo de la invención.

Ejemplos

Excepto si se indica lo contrario, toda la metodología del DNA recombinante general se realizó tal como se describe en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (1989) Eds. J. Sambrook y col., publicado por Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York y las enzimas obtuvieron de Life Technologies (Paisley, United Kingdom).

En los siguientes ejemplos se pueden utilizar estas abreviaciones:

dCTP	desoxicitidina trifosfato
dATP	desoxiadenosina trifosfato
dGTP	desoxiguanosina trifosfato
dTTP	desoxitimidina trifosfato
DTT	ditiotreitol
C	citosina
A	adenina
G	guanina
T	timina
PBS	solución salina tamponada con fosfato
PBST	solución salina tamponada con fosfato y Tween-20 al 0,05% (v/v)

Ejemplo 1

El aislamiento de las secuencias de DNA que codifican para las regiones variables de 3S193, se produjo utilizando técnicas estándares después de la inmunización de ratones BALB/c con las células tumorales que presentan el antígeno Lewis Y.

Las secuencias de regiones variables se determinaron a partir de los cDNAs de cadena pesada y ligera sintetizados a partir del mRNA citoplasmático, esencialmente tal como se describió por Tempest y col., loc. cit.

1. Aislamiento de RNA

Aproximadamente, se aislaron 300 \mug de RNA citoplasmático a partir de 1,5 x 10^{7} células de hibridomas productoras de 3S193 mediante el procedimiento de Favarola y col., (1980) Meth. Enzymol, 65, 718-749. El sobrenadante obtenido del cultivo de estas células se analizó para conocer la presencia del anticuerpo mediante ELISA de fase sólida utilizando un equipo de isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón de Inno-Lia (Innogenetics, Amberes, Bélgica). Mediante este procedimiento, se confirmó que el anticuerpo era una IgG3/k.

2. Síntesis del cDNA

La transcripción inversa del RNA de 3S193 se inició a partir de cebadores basados en el extremo 5' de la IgG3 murina (CG3EOR 5'TTAAGCTTAGACAGATGGGGCTGTTGTTGT3')(SEC ID. Nº:1) o de la kappa murina (CK2FOR5' GGAAGCTTGAAGATGGATACAGTTGGTGGTGACAGC3') (SEC ID Nº:2) de los genes de regiones constantes. Las reacciones consistieron de 5 \mug de RNA, CG3FOR 0,5 \muM, 250 \muM de cada dATP, dcTP, dGTP y dTTP, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, KCl 75 mM, DTT 10 mM, MgCl_{2} 3 mM, 30 unidades de inhibidor de RNasa (Pharmacia Milton keynes, United Kingdom) en un volumen total de 50 \mul. Las muestras se calentaron a 70ºC durante 10 min y luego se enfriaron a 37ºC durante 30 min. Se añadieron 100 unidades de transcriptasa inversa M-MLV (Life-Technologies, Paisley, U.K.) dejándose reaccionar a 37ºC durante 1 h.

3. Amplificación y clonaje del cDNA de VH y VK

Los cDNAs de la región variables murina se amplificaron mediante PCR (Saiki y col., 81988) Science, 239, 498-491), utilizando cebadores de regiones variables, incluyendo los descritos por Orland y col., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837 y cebadores de secuencias señal, derivados de los cebadores de Jones y Bendig (1991) Bio/Technology, 9, 88-89, así como los cebadores de regiones constantes que estaban implicados en la síntesis de la primera cadena de cDNA. Diversas combinaciones de cebadores generaron productos de amplificación del tamaño deseado. Los cebadores adicionales utilizados en las amplificaciones de PCR con éxito estaban basados en regiones conservadas en el extremo 5' de los genes murinos VH (VH1BACK 5'AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3') (SEC ID Nº:3) o VK (VK1 BACK 5'GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA3')(SEC ID Nº:4) o se diseñaron a partir de un grupo de genes de secuencia señal de cadenas pesadas murinas (SH2BACK 5'TGGATTTCATGRACTTCDGGYTCAACTKRRTTT3')(SEC ID Nº:5). Para la amplificación por PCR de VH, la reacción contenía 5 \mug del híbrido RNA/cDNA, CG2FOR 0,5 \muM y VH1BACK o SHA2BACK 0,5 \muM. Para VK, se amplificaron 5 \mul del híbrido RNA/cDNA con 0,5 \muM de cada uno de los cebadores CK2FOR y VK1BACK. Además, cada reacción contenía 250 \muM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, Tris-HCl 10 mM pH 8,o, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01% (p/v), Tween-20 al 0,01% (v/v), NP-40 al 0,01% (v/v) y 3 unidades de AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus, Beaconsfield, UK). La amplificación se produjo durante 25 ciclos de 94ºC, 30s; 50 o 55ºC, 30s; 72ºC, 45s más 5 min a 72ºC para finalizar. Los tamaños del producto de VH fueron de aproximadamente 400 pb (CG3FOR, VH1BACK) y 440 pb (VH1FOR, SH2BACK) tal como se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos VK fueron de 370 pb. Los DNAs purificados sobre matriz de Prep-A-Gen (Bio Rad, Hemel Hempstead, UK) después de recortarlos del gel de agarosa.

Para VH, se clonaron los productos de PCR obtenidos con CG3FOR, VH1BACK y CG2FOR, SH2BACK en M13mp 18 y M13mp 19 (Pharmacia Milton Keynes, United Kingdom) utilizando las dianas de restricción incorporadas en los cebadores de PCR, y para el producto obtenido de la PCR con CGFOR, SH2BACK, se utilizó la diana PstI interna del fragmento de VH. Los clones se secuenciaron mediante el procedimiento de los didesoxinucleótidos (Sanger y col., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) utilizando la polimerasa T7 DNA (Pharmacia, Milton Keynes, UK).

Se determinó si los clones contenían los insertos de VH comparándolos con secuencias de VH conocidas. Los insertos de VH correspondieron a un sólo VH y representaron ambas orientaciones de los fragmentos. La secuencia completa de nucleótidos de VH y las secuencias aminoacídicas derivadas de la traducción de la información de las secuencias se muestran en la figura 1. La extensión de las CDRs, tal como se indica por los cuadrado, se determinó tal como se define por Kabat y col., (1991). Las secuencias de proteínas de interés inmunológico (5ª edición), U.S. Department of Health and Human Services. El sistema de numeración de los residuos aminoaciacídicos de Kabat y col., ibid, se utilizó para indicar los residuos aminoacídicos específicos en las regiones variables murinas y humanas en esta solicitud.

Para VK, el producto de la PCR con CK2FOR y VK1BACk se clonó de modo similar y, a partir de los clones secuenciados, se hallaron dos insertos que correspondían con un VK idéntico. Los insertos restantes fueron no idénticos a VK. Se generaron dos cebadores de amplificación adicionales con el fin de obtener clones VK. La secuencia de entramado 4 de los insertos ya obtenidos se utilizó para diseñar el oligonucleótido VKFOR (5'TTAAGCTTTATTTCCAACTTTGTCCC3') (SEC ID Nº:6). La secuencia de los insertos 3S193 VK fue altamente homóloga a la del cDNA de VK que se había obtenido previamente en nuestro laboratorio y por ello se utilizó el cDNA de VK en el diseño de VK10BACK (5'TTGAATTCCAGTGATGTTTTGATGACCCA3')(SEC ID Nº:7) como una alternativa a VK1BACK. Se utilizaron VK4FORy VK10BACK en la amplificación de la primera cadena del cDNA con el cebador CK2FOR en las condiciones descritas anteriormente. Esto conduce al aislamiento de algunos insertos que representan el 3S193 VK en ambas orientaciones del fragmento. La secuencia nucleotídica 3S193VK y su traducción aminoacídica se muestran en la Figura 2. Las CDRs están encuadradas. La secuencia en el extremo 3' es la secuencia 3S193 tal como se obtuvo a partir del producto de amplificación con CK1FOR y VK1BACK, en donde los residuos del extremo 5' están dictados por la secuencia del cebador VK10BACK y se muestran subrayados.

Ejemplo 2 Producción de un anticuerpo 3S193 quimérico

Para el proceso de humanización, no es necesario producir un anticuerpo quimérico que consista de regiones variables murinas y constantes humanas, pero sí puede ser útil su capacidad para unirse al antígeno, ya que con ello se puede indicar si se ha clonado el VH y VK correctos a partir del cDNA del hibridoma, y el anticuerpo se puede utilizar como un control en ensayos para valorar la eficacia de los anticuerpos humanizados.

En la primera etapa de la transferencia del vector de expresión, el inserto de VH de un clon M13 (ejemplo 1) se amplificó utilizando VH1FOR y VH1BACK para introducir las dianas de restricción requeridas. La mezcla de reacción de 50 \mul contenía aproximadamente 100 ng de ssDNA de M13, 0,5 \muM de cada cebador, 250\muM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tween-20 al 0,01% (v/v), gelatina al 0,01% (v/v), NP-40 al 0,01% (v/v) y 2 unidades de Termalasa DNA polimerasa (IBI Limited, Cambridge, UK). La muestra se sometió a 15 ciclos termales de 94ºC, 30s; 50ºC, 30s; 72ºC, 1 min seguido de 5 min adicionales a 72ºC. El producto se digirió con PstI y BstEII y se clonó en M13VHPCR1 (Orlandi y col., loc. cit.).

Mientras se llevaba a cabo la etapa de clonaje equivalente para el VK, se delecionó la diana BglII interna mediante el procedimiento de extensión de solapamiento (Ho y col., (1989), Gene 77:51-59). Se utilizaron los oligonucleótidos complementarios, que abarcaban la mutación requerida, en la amplificación con VK1FOR o VK1BACK y con un clon M13 de VK como molde. Las mezclas de reacción que contenían aproximadamente 100 ng de M13 ssDNA, 0,5 \muM de cada cebador, 250 \muM de cada dATPm dCTP,dGTP y dTTP, Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, SO_{4}Mg 2 mM, Triton-X-100 al 0,01% (v/v) y una unidad de Vent DNA polimerasa en 50 \mul de volumen final. La amplificación se realizó durante 15 ciclos a 94ºC, 30s; 50ºC, 30s; 75ºC, 1 min y 5 min a 75ºC para finalizar. Una alícuota de cada producto se añadió a un tercer tubo que contenía 0,5 \muM de cada cebador VK1FOR y VK1BACK, uniéndose los DNAs por extensión de solapamiento y amplificación con la Vent DNA polimerasa en las condiciones descritas anteriormente. El producto final se digirió con PvuII y BglII y se clonó en el armazón de PvuII-BcII de M13VKPCR1 (Orlandi y col., loc. cit.).

Estas manipulaciones sirvieron para colocar las regiones variables detrás del promotor y secuencias génicas del péptido señal en el contexto correcto para la expresión. En el caso de VH, esto produjo algunos cambios en los residuos terminales: E1\rightarrowQ, K3\rightarrowQ, V5\rightarrowQ, L108\rightarrowT, A113\rightarrowS. Los residuos N-terminales genuinos de VK no se habían determinado y por ello se desconocía la naturaleza de cualquier cambio introducido. No hubo alteraciones en el extremo C-terminal de VK.

Estas cajas de expresión se secuenciaron completamente para confirmar la ausencia de falsas mutaciones y a continuación se excisaron del DNA RF de M13 como fragmentos HindIII-BamHI. Los fragmentos VH se clonaron en un derivado de pSVgpt (Orlandi y col., loc. cit.) que contiene un gen de región constante IgG1 (Takahashi y col., (1992); Cell29:671-679).

El fragmento de VK se clonó en pSVhyg (Orlandi y col., loc. cit.), que contiene el gen de la región constante de kappa humana (Hieter y col., (1982), Cell 22:197-207).

Los vectores se cotransfectaron en el mieloma de rata YB2/0 (Kilmartin y col., (1982), J. Cell biol 93:576-582, y en el mieloma de ratón Sp2/0-Ag 14 (Schulman y col., (1978) Nature 276, 269-270), disponibles a partir del American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA tal como se describió anteriormente (Tempest y col., loc. cit.). Los clones resistentes al ácido micofenólico se cribaron mediante un ELISA para conocer la secreción del anticuerpo IgG/kappa. Los clones ELISA positivos se amplificaron y se purificó el anticuerpo del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad con proteína A.

Ejemplo 3 Generación de anticuerpos 3S193 humanizados

Los dominios variables humanizados se crearon para transferir los bucles de unión al antígeno del anticuerpo parental a las regiones de entramado variables. Las regiones de entramado utilizadas en el caso de 3S193 fueron las de KOL VH (Marquat y col., (1980) J. Mol. Biol. 141, 513-524) y REI VK (Epp y col., (1974) Eur. J. Biochem. 45, 513-524).

Para la cadena pesada humanizada HuVH derivada de 3S193 (Figura 3), esto implicó la transferencia de las CDRs murinas, tal como se definieron por Kabat y col., loc. cit. y de un residuo de las regiones de entramado murinas. Este residuo, Thr28, es parte del bucle H1 descrito por Chothia y Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196, 901-917. Las versiones alternativas de HuVH contenían combinaciones de los residuos murinos Thr24, Ala74, Ser76 y Tyr79, con la cadena denominada HuVH seguido de las letras correspondientes al código de aminoácidos, por ejemplo 3S193HuVHASY.

La cadena Kappa humanizada derivada de 3S193 (Figura 4) contenía únicamente las CDRs de su homólogo murino. Una variante, HuVKF, incluía adicionalmente la Phe71 (numeración según Kabat).

Los genes de la región variable humanizada de 3S193 se generaron a partir de los DNAs del fago M13 que contenían una región variable de Kappa pesada o ligera y que comprendía las regiones de entramado humanas necesarias y las CDRs irrelevantes mediante mutagénesis dirigida. El fago M13 se creció en E. coli RZ1032 ("dut ung" mutagénesis) para proporcionar DNA molde de cadena sencilla que contenga uracilo en lugar de timidina. Se mezclaron 0,5 \mug de DNA molde con 1 pmol de cebador universal de sentido transcripción 5' de M13 y 1 pmol de cada uno de los oligonucleótidos mutagénicos fosforilados en 20 \mul con Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 20 mM, NaCl 50 mM. Los oligonucleótidos se hibridaron al molde calentando a 80ºC durante 5 min y enfriando lentamente a temperatura ambiente.

\newpage

Para el VH, los oligonucleótidos mutagénicos fueron:

CDR 1 5'	TACATGTAATAGTCACTGAAAGTGAAGCCAGA 3'
(SEC ID Nº 8)

CDR2 5'	CCCCTTCACAGTGTCTGGATAGTCGGTGATAGCACCAACA
	TTACTCATGTATGCAACCCACTC 3'
(SEC ID Nº 9)

CDR3 5'	TTGGCCCCAGTAAGCAAACCACGAGCCATCACGGGTGCCTC
	TTGCACA 3'
(SEC ID Nº 10)

El molde utilizado para la mutagénesis de la región variable de la cadena kappa codificaba realmente para las regiones de entramado relacionadas, pero no idénticas, con REI. La reacción de mutagénesis eliminó dichas discrepancias (utilizando oligonucleótidos no descritos) así como también introduciendo las CDRs 3A193. La única discrepancia a discutir específicamente aquí está en la posición 71 del molde, que codifica para un residuo fenilalanina no presente en la secuencia REI. Este residuo se retuvo en 3S193 HuVKF pero no se cambió al residuo REI en 3S193HuKK en la Figura utilizando el oligonucleótido REI Y71:

5' ATGGTGAAGGTGTAGTCGGTACCGC3' (SEC ID Nº:11)

Para ambas regiones variables de cadena Kappa HuVK y HuVKF, las CDR3 3S193 murinas y las CDR3 de molde humanizadas fueron idénticas, por lo que no se necesitó alterar las CDR3. Las diferencias limitadas entre las CDRs murinas y las de molde humanizadas 1 y 2 requirieron la alteración de las CDRs humanizadas 1 y 2 de molde. Los oligonucleótidos utilizados en la mutagénesis fueron:

CDR1 5'TTCTAAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGCGCTGACTAGATCT3' (SEC ID Nº:12)

CDR2 5' ACCAGAAAATCGGTTGGAAACTTTGT 3' (SEC ID Nº:13)

Una vez hibridados, los oligonucleótidos con el molde, se añadió: dATP, dCTP, dTTP y dGTP a 250 \muM de concentración final, DTT 7mM, ATP 1 mM y 0,5 unidades de T7 DNA polimerasa (United States Biochemical, Cleveland, OH, USA) y 0,5 unidades de T4 DNA ligasa (Life Technologies, Paisley, UK) en el mismo tampón. La reacción de 30 \mul se incubó a temperatura ambiente durante 1 h y luego se precipitó el DNA con etanol. Con el fin de realizar cortes en la cadena parental, el DNA se disolvió en 50 \mul de Tris-HCl 60 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, DTT 1mM, BSA a 0,1 mg/ml y 1 unidad de uracilo DNA glicosilasa (Boehringer Mannheim, Lewis, Sussex, UK) y se incubó a 37ºC durante 1 h, a continuación se añadió NaOH 0,2 M y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. El DNA precipitado con etanol se disolvió en 20 \mul de TE junto con el fragmento del inserto amplificado por PCR. La mezcla de reacción que contenía 2 \mul de DNA mutante, 0,5\muM de cada uno de los cebadores de sentido 5' y de sentido 3' de M13, 250 \muM de cada nucleótido dATP, dCTP, dGTP y dTTP, Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tween-20 al 0,01%, gelatina al 0,01%, NP-40 al 0,01% y 2 unidades de Thermalasa (IBI, Cambridge, UK) en 50 \mul. La amplificación se realizó durante 15 ciclos de 94ºC, 30s; 50ºC, 30 s; 72ºC, 1 min; finalizando a 72ºC durante 5 min. Los DNAs del producto se clonaron en M13 como fragmentos HindIII-BamHI y se secuenciaron los clones representativos. Se excisaron los fragmentos HindIII-BamHI del RF DNA de los clones mutados adecuadamente y se transfirieron a los vectores de expresión pSVgpt y pSVhyg, tal como se describe en el Ejemplo 2.

La mutagénesis adicional a 3S193 HuVH, para introducir los residuos murinos Thr24 y Ala74+/-, Ser76+/-, Tyr79, se llevó a cabo mediante extensión de solapamiento (Ho y col., loc. cit.; ver ejemplo 2) utilizando el gen de la región variable humanizada clonado en un sistema de M13, 3S153HuVH, como molde. Dos oligonucleótidos complementarios que abarcaban las mutaciones se utilizaron cada uno en una reacción de amplificación con el cebador universal de pUC/M13. Los oligonucleótidos mutagénicos fueron:

For Thr24 (cadena codificante)

5' CTGTCCTGCTCCACGTCTGGCTTCA 3'(SEC ID Nº:14)

(cadena complementaria)5' TGAAGCCAGACGTGGAGCAGGACAG 3'(SEC ID Nº:15)

Para Ala74 Ser76 Tyr79 (cadena codificante)

5' TCGAGAGACCAACGCCAAGAGCACATTGTACCTGCAAATGGA 3'(SEC ID Nº:16)

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Para Ala74+/- Ser76 (cadena complementaria).

5'- TCCATTTGCAGGAACAATGTG(T/C)TCTTGGCGTTGTCTCTCGA 3'(SEC ID Nº:17)

La pareja inicial de mezclas de reacción contenían: 100 ng de DNA de M13 de cadena sencillo, cebador mutagénico 0,5 \muM, cebador pUC/M13 universal 0,5 \muM. Estas reacciones y las siguientes de unión se llevaron a cabo utilizando la Vent DNA polimerasa, tal como se describe en el Ejemplo 2. Los fragmentos HindIII-BamHI se clonaron, se secuenciaron y se reclonaron para expresar tal como se describió.

La transfección de células de mieloma y de su selección y expansión se llevó a cabo como en el Ejemplo 2. Así como las transfecciones para generar anticuerpos humanizados (como HuVH/HuVK y HuVH/HuVKF). Se cotransfectaron vectores de expresión de cadenas de anticuerpos quiméricas y humanizadas para generar anticuerpos mezclados, permitiéndose así examinar eficazmente las cadenas humanizadas de forma individual. Los DNAs de HuVHT, HuVHA, HuVHAS y HuVHASY se transfectaron con el vector HuVHF. La combinación de HuVHT/HuVKF se transfectó en células de mieloma de ratón NSO (Galfe y Milstein, (1981) Methods in Enzymology, volumen 73B, pp. 3-75, Academic Press: disponible por el European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK) además de las células YB20/0).

Ejemplo 4 Valoración de las propiedades de anticuerpos humanizados

Los anticuerpos recombinantes se analizaron mediante diversos procedimientos.

ELISAs contra antígenos sintéticos

Placas de Terasaki se recubrieron con 10 \mul/pocillo de antígeno sintético (tal como se muestra en la tabla 1, obtenido de Chembiomed, Edmonton, Canadá o BioCarb AB Lund, Suecia) a 1 \mug/ml en agua, dejándolo secar durante toda la noche a temperatura ambiente. A continuación, se bloquearon las placas durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS/BSA 3% y se lavaron tres veces con PBS. Se aplicaron diluciones seriadas de los anticuerpos a analizar en PBS/BSA 3% a los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora. Luego se lavaron al igual que antes. Se diluyeron los anticuerpos adecuados anti-murino o anti-humano conjugados con fosfatasa alcalina en PBS/BSA3% y se incubaron en los pocillos durante 1,5h. Después del lavado, se reveló el color utilizando dietanolamina y p-nitrofenil fosfato a 37ºC durante aproximadamente 20 min y se cuantificaron las absorbancias a 405 nm.

Los resultados de la utilización de estos anticuerpos en los ELISAs se muestran en la tabla 1, donde se proporcionan las concentraciones mínimas de los anticuerpos a analizar necesarias para proporcionar una señal por encima del fondo. Se puede observar que todos los anticuerpos recombinantes son capaces de unirse al antígeno Lewis Y y que presentan cantidades diversas de reactividad hacia los antígenos relacionados. Algunos anticuerpos, por ejemplo HuVH/HuVK y HuVHT/HuVKF, retienen la especificidad del 3S193 murino.

Ensayos serológicos contra el antígeno Lewis Y nativo

Se analizaron anticuerpos recombinantes en ensayos mezclados de roseta y hemo-adsorción (Rettig y col., (1987) J. Immunol 138, 4484-4489; Rettig y col. , (1985) Cancer Res. 45:815-821) para conocer su capacidad de unirse a las células diana MCF-7 (línea de mama humana) y al control negativo de células de melanoma de Effron. Las células se crecieron en placas de Terasaki de 60 pocillos para formar monocapas confluentes. Las células se lavaron dos veces con PBS/BSA 0,5% y se añadieron 10 \mul de anticuerpo a las células (anticuerpos diluidos seriadamente en DMEM sin suero fetal de ternera). La incubación con el anticuerpo a analizar se continuó a temperatura ambiente durante 1 hora, luego las células se lavaron con PBS/BSA 0,5% y se incubaron con eritrocitos (tipo O+) conjugados con proteína A (Pierce Illinois, USA) diluido en PBS/BSA 0,5%. La incubación con las células indicadoras se continuó a temperatura ambiente durante 30 min después de lo cual los eritrocitos-proteína A no unidos se eliminaron lavando dos veces con PBS/BSA 0,5%. Se determinó el porcentaje de formación de rosetas para cada dilución de anticuerpo y la concentración mínima de anticuerpo que proporcionaba el 50% o superior de formación de roseta calculada. Ninguno de los anticuerpos reaccionó con las líneas control negativo. Los valores de formación de rosetas del 50% para las células MCF-7 se proporcionan en la tabla 2.

Con el fin de cuantificar la citotoxicidad contra las células MCF-7, se plaquearon las células a aproximadamente 100 células/pocillo en medio de cultivo, dejándose crecer durante toda la noche. Se vaciaron los pocillos del medio y se añadió una dilución con medio del anticuerpo a analizar. Las placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 45 minutos y luego se añadieron 10 \mul de suero humano/medio (1:3) a cada pocillo. Al cabo de 4 horas, se lavaron las placas dos veces con metanol absoluto, se fijaron con metanol durante 10 minutos, se lavaron con agua destilada, se tiñeron con Giemsa al 2% en PBS durante 25 min y se lavaron de nuevo con agua destilada. Las placas se analizaron al microscopio óptico y se calculó el porcentaje de citotoxicidad de una dilución de anticuerpo dada de la manera siguiente:

\frac{(1 \ - \ N^{o} \ células \ por \ pocillo \ tratadas \ con \ anticuerpos \ & \ complemento)}{N^{o} \ de \ células \ por \ pocillo \ tratadas \ únicamente \ con \ medio \ de \ cultivo} x 100(%)

La concentración mínima de anticuerpo que proporcionó un 50% o más de lisis se muestra en la tabla 3. No se observó citotoxicidad cuando las células de Effron se utilizaron como dianas.

Estos resultados apoyan los resultados del ELISa contra el antígeno sintético Lewis Y, al demostrar que los anticuerpos recombinantes son capaces de unirse a los determinantes Le^{Y} naturales en la superficie de la célula. Algunas de las diferencias observadas entre los anticuerpos humanizados más efectivos (por ejemplo, HuVHT/HuVKF y HuVHASY/HuVKF) y el murino 3S193, que variaron de acuerdo con el ensayo utilizado, se pueden explicar por la capacidad de los anticuerpos IgG3 murinos (como el 3S193) de participar en la unión cooperativa con el antígeno (Greenspan y Cooper (1992) Immunology Today 13, 164-168).

Algunos de los anticuerpos recombinantes mostraron reactividad cruzada con los antígenos relacionados con el Lewis Y. Para comprobar si ello podría ser causa de hemólisis, los anticuerpos se incubaron con eritrocitos marcados con Cr^{51} en presencia de suero humano (Nayayarna y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 3486). Ninguno de los anticuerpos recombinantes causó una lisis celular detectable por encima del fondo de células incubadas con PBS. Esto sugiere que la reactividad cruzada del anticuerpo administrado terapéutica o diagnósticamente no causaría por ella misma un problema, aunque sería preferible utilizar un anticuerpo específico para el antígeno Lewis Y, con el fin de asegurar que la cantidad máxima de anticuerpo esté disponible para la unión con las células diana.

Estos resultados demuestran la idoneidad de los anticuerpos como el 3S193 HuVH/HuVK o el 3S319 HuVHT/
HuVKF para utilizar en el diagnóstico y tratamiento de los cánceres que expresan el antígeno Lewis Y.

La tabla 4 proporciona las secuencias aminoacídicas de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de 3S193. Además, la tabla 4 proporciona las secuencias aminoacídicas de las regiones variables de las cadenas de anticuerpos humanizados derivados de 3S193.

TABLA 1 ELISAs contra antígenos sintéticos de Lewis Y y antígenos relacionados

Antígeno	Le-Y-HSA	Le-Y-KLII	Le-X	Hype2	Y-	Le-b	Lea-	HypeI	HSA
Anticuerpo
murino	0,10	0,025	100	+/-	-/+		-/+	-/+	-
MuVH/MuVK	0,10	0,10	100	50	-		-	-	-
MuVH/HuVK	0,025	0,025	25	6,25	100	+/-	+/-	100	+/-
MuVH/HuVKF	0,025	0,05	6,25	1,56	50	100	50	25	100
HuVH/HuVK	0,39	0,39	+/-	-/+	-/+		+/-	-/+	-
HuVH/HuVKF	0,39	0,39	50	50	100	+/-	+/-	+/-	+/-
HuVHT/HuVK	0,39	0,39	+/-	25	+/-	+/-	+/-	100	-/+
HuVHT/HuVKF	0,10	0,39	+/-	+/-	-/+	-/+	-/+	-/+	-/+

MuVH/HuVK	0,025	0,025	25	6,25	+/-	+/-	+/-	+/-	-
HuVHT/HuVKF	0,10	0,10	+/-	+/-	-	-	-	-	-
HuVHA/HuVKF	0,10	0,10	+/-	+/-	-	-	-	-	-
HuVHAS/HuVKF	0,10	0,10	+/-	+/-	-	-	-	-	-
HuVHASY/HuVKF	0,10	0,10	100	50	+/-	+/-	-	-	-

Los valores son concentraciones mínimas de anticuerpo (\mug/ml) que son positivas, negativas, -/+, trazas;
+/-, débilmente positivas, a las mayores concentraciones analizadas (100 \mug/ml)

TABLA 2

Ensayo de roseta
Anticuerpo	Experimento A	Experimento B
murino	0,0016	n.t.
MuVH/MuVK	0,0031	n.t.
MuVH/HuVK	0,0016	0,0031
MuVH/HuVKF	0,0031	n.t.
HuVH/HuVK	0,0063	n.t.
HuVH/HuVKF	0,0063	n.t.
HuVHT/HuVK	0,0125	n.t.
HuVHT/HuVKF	0,0063	0,0125
HuVHA/HuVKF	n.t.	0,0125
HuVHAS/HuVKF	n.t.	0,0125
HuVHASY/HuVKF	n.t.	0,063
HuVHASY/HuVKF	n.t.	0,063

Los valores son las concentraciones mínimas de anticuerpos (\mug/ml) que muestran por lo menos el 50% de formación de rosetas utilizando la línea celular MCF-7 como control.

TABLA 3

Ensayo de citotoxicidad
Anticuerpo	Experimento A	Experimento B
murino	0,10	n.t.
MuVH/MuVK	0,39	n.t.
MuVH/MuVK	0,39	0,39
MuVH/HuVKF	0,20	n.t.
HuVH/HuVK	3,13	n.t.
HuVH/HuVKF	1,56	n.t.
HuVHT/HuVK	1,56	n.t.
HuVHT/HuVKF	0,78	1,56
HuVHA/HuVKP	n.t.	6,25
HuVHAS/HuVKF	n.t.	3,13
HuVHASY/HuVKF	n.t.	1,56

Los valores son las concentraciones mínimas de anticuerpos (\mug/ml) que muestran por lo menos el 50% de lisis utilizando la línea celular MCF-7 como control.

(Tabla pasa a la página siguiente)

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TABLA 4

Región variable de cadena pesada murina de 3S193 - - 3S319 MuVH

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAYMSNV
GAITDYPDTVKGRFTISRDNAKSTLYLQMSRLRSEDTAMYYCARGTRDGSWFAY
WGQGTLVTVSA (SEC ID Nº:18)

Región variable de cadena ligera murina de 3S193 - - 3S319 MuVk

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQRIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY
KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTK
LEIK (SEC ID Nº:19)

Región variable de cadena pesada de 3S193 humanizado - - 3S319 HuVH

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYMSNV
GAITDYPDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARGTRDGSWFAY
WGQGTPVTVSS (SEC ID Nº:20)

Región variable de cadena pesada de 3S193 humanizado - - 3S319 HuVHT

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSTSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYMSNV
GAITDYPDTVKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARGTRDGSWFAY
WGQGTPVTVSS (SEC ID Nº:21)

Región variable de cadena pesada de 3S193 humanizado - - 3S319HuVHA

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYMSNV
GAITDYPDTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARGTRDGSWFAY
WGQGTPVTVSS (SEC ID Nº:22)

Región variable de cadena pesada de 3S193 humanizado - - 3S319HuVHAS

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYMSNV
GAITDYPDTVKGRFTISRDNAKSTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARGTRDGSWFAY
WGQGTPVTVSS (SEC ID Nº:23)

Región variable de cadena pesada de 3S193 humanizado - - 3S319HuVHASY

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSDYYMYWVRQAPGKGLEWVAYMSNV
GAITDYPDTVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRPEDTGVYFCARGTRDGSWFAY
WGQGTPVTVSS (SEC ID Nº:24)

Región variable de cadena ligera de 3S193 humanizado - - 3S319HuVK

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIVHSNGNTYLEWYQQTPGKAPKLLIY
KVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCFQGSHVPFTFGQGTK
LQIT (SEC ID Nº:25)

Región variable de cadena ligera de 3S193 humanizado - - 3S319HuVKF

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIVHSNGNTYLEWYQQTPGKAPKLLIY
KVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQGSHVPFTFGQGTK
LQIT (SEC ID Nº:26)

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Depósitos biológicos

El 11 de marzo de 1994, los solicitantes depositaron en el American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) unas líneas celulares NSO productoras del anticuerpo 3S193 HuVHT/HuVKF con el número de acceso de ATCC: CRL 11573. Este depósito se efectuó de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos de procedimientos de patentes y su regulación (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El organismo estará disponible por ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest y estará sujeto a un acuerdo entre los solicitantes y el ATCC, asegurando la disponibilidad sin restricciones sobre la emisión de la patente americana pertinente. La disponibilidad de las cepas depositadas no constituye una licencia para practicar la invención, lo que sería una violación de los derechos garantizados por la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.

MICROORGANISMOS

Hoja opcional relacionada con el microorganismo referido en la página 35, líneas 1-30 de la descripción.

A. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO

Los depósitos adicionales están identificados en una hoja aparte.

Nombre la institución depositaria

American Type Culture Collection

Dirección de la institución depositaria (incluyendo el código postal y el estado)

12301 Parklawn Drive

Rockville, MD 20852

US

Fecha de depósito: 11 de marzo de 1994. Número de acceso: CRL 11573

B. INDICACIONES ADICIONALES (dejar en blanco si no procede). La información prosigue en una hoja

anexada aparte.

C. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE REALIZARON INDICACIONES

D. PROPORCIONAR LAS INDICACIONES SEPARADAMENTE (dejar en blanco si no procede)

Las indicaciones enumeradas se someterán a la Oficina Internacional posteriormente. Especificar la naturaleza

general de las indicaciones, por ejemplo., Número de acceso del depósito.

E. Esta hoja se recibió al rellenar la solicitud internacional (a confirmar por la oficina de registro de llegadas)

(Funcionario autorizado)

Fecha de recepción (de la solicitud) por el Despacho Internacional

(Funcionario autorizado)

Formulario PCT/RO/134 (Enero de 1981)

Claims

1. Anticuerpo humanizado que se une específicamente al antígeno Lewis Y que comprende una región variable de cadena pesada que es la SEC ID Nº 21 (3S193HuVHT) y una región variable de cadena ligera que es la SEC ID Nº 26 (3S193HuVKF).

2. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región de entramado de la región variable de cadena pesada deriva de una región de entramado KOL.

3. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la región de entramado de la región variable de cadena ligera deriva de una región de entramado REI.

4. Polinucleótido que codifica para un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Vector de expresión que comprende la secuencia polinucleotídica de la reivindicación 4, en combinación con una secuencia promotora.

6. Célula hospedadora transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 5.

7. Molécula de inmunoglobulina marcada que comprende una molécula de inmunoglobulina de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 y un marcaje detectable.

8. Utilización de un anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 7 para la fabricación de una composición para el diagnóstico del cáncer, en donde dicha composición se administra a un paciente y se detecta el anticuerpo marcado que se ha unido mediante la presencia del marcaje.