ES2199992T3 - Nuevos inhibidores de elastasa. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A COMPUESTOS QUE SON INHIBIDORES DE LA ELASTASA, EN PARTICULAR DE LA ELASTASA DE NEUTROFILOS HUMANOS. LOS INHIBIDORES SON PEPTIDOS CORTOS SINTETICOS EN DONDE LA UNIDAD P{SUB,2} ES SUSTITUIDA CON VARIOS GRUPOS HETEROCICLICOS QUE CONTIENEN NITROGENO. COMO INHIBIDORES DE LA ELASTASA DE NEUTROFILOS HUMANOS, LOS COMPUESTOS SON UTILES EN EL TRATAMIENTO DE UN PACIENTE AFECTADO CON UNA ENFERMEDAD INFLAMATORIA ASOCIADA A LOS NEUTROFILOS.
Description
Nuevos inhibidores de elastasa.
Esta invención se refiere a compuestos que son
inhibidores de la elastasa, particularmente de la elastasa
neutrófila humana, útiles para una variedad de aplicaciones
fisiológicas y de uso final.
La elastasa neutrófila humana se ha implicado
como un agente que contribuye a la destrucción de tejido asociada
con varias enfermedades inflamatorias como bronquitis crónica,
fibrosis quística, y artritis reumatoide. J.L. Malech y J.I. Gallin,
New Engl. J. Med., 317(11), 687 (1987). La elastasa
posee un amplio intervalo de actividad proteolítica contra varias
macromoléculas de tejidos conectivos que incluyen elastina,
fibronectina, colágeno, y proteoglicano. La presencia de la enzima
elastasa puede contribuir a la patología de estas enfermedades. En
el documento EP 0 189 305 A2, se describen derivados di-, tri- y
tetra-péptido trifluorometil cetona sustituidos de
fórmula Ia, Ib y Ic que son inhibidores de la elastasa de leucocito
humana. En el documento WO 92/12140 se describen compuestos de
fórmula
M_{1}-AA-NH-CHR_{2}-CO-CO-NR_{3}R_{4}
y su uso para inhibir serin proteasas y cistein proteasas. El
documento EP 0 529 568 A1 se refiere a la morfolinourea y derivados
de péptidos pentafluoroetilo relacionados, que son inhibidores por
vía oral de la elastasa activa. Reemplazar la Pro por ácido
L-pipecólico convirtió el nanopéptido
H-Val-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Glu-NH_{2}
en un inhibidor eficaz de las proteinasas VIH-1 y
VIH-2 (BBRC 169(1), 310-314
(1990)).
El plasma normal contiene grandes cantidades de
inhibidores de proteasa que controlan una variedad de enzimas
implicadas en el movimiento e inflamación del tejido conectivo. Por
ejemplo, el inhibidor proteinasa \alpha-1
(\alpha-1-PI) es un inhibidor de
serin proteasa que bloquea la actividad de la elastasa. El
\alpha-1-PI ha recibido
considerable interés porque la reducción en los niveles de plasma a
menos del 15% de lo normal se asocia con el desarrollo temprano de
enfisema. Además de los inhibidores de proteasa derivados del
plasma, los fluidos secretores, que incluyen mucus bronquial,
nasal, cervical, y fluido seminal contienen un inhibidor de la
proteasa endógeno denominado inhibidor de leucoproteasa secretora
(SLPI) que puede inactivar la elastasa y se cree que juega un
importante papel en mantener la integridad del epitelio en presencia
de proteasas de células inflamatorias. En ciertos estados
patológicos, la \alpha-1-PI y la
SLPI se inactivan por mecanismos oxidativos neutrófilos permitiendo
a las proteasas neutrófilas funcionar en un medio esencialmente
libre de inhibidores. Por ejemplo, se ha descubierto que los
fluidos de lavado bronquial de pacientes con síndrome de dificultad
respiratoria adulto (SDRA) contienen elastasa activa y
\alpha-1-PI que se había
inactivado por oxidación.
Además de los mecanismos oxidativos, los
neutrófilos poseen mecanismos no oxidativos para eludir la
inhibición por antiproteasas. Los neutrófilos de pacientes con
enfermedad granulomatosa crónica son capaces de degradar las
matrices celulares endoteliales en presencia de exceso de
\alpha-1-PI. Existe evidencia
considerable in vitro de que los neutrófilos estimulados
pueden unirse firmemente a sus sustratos de forma que las
antiproteasas del suero se excluyen eficazmente del micromedio de
contacto firme célula-sustrato. La afluencia de gran
número de neutrófilos a un lugar de inflamación puede resultar en un
daño considerable de tejido debido a la proteolisis que tiene lugar
en esta región.
Los solicitantes han determinado que la elastasa
es una de las principales proteasas neutrófilas responsables de la
degeneración de la matriz del cartílago como se midió por la
capacidad del lisado neutrófilo, elastasa purificada y neutrófilos
estimulados para degradar el proteoglicano de la matriz del
cartílago. Adicionalmente, los solicitantes han descubierto
anteriormente derivados de péptido útiles como inhibidores de
elastasa, ejerciendo actividades farmacológicas valiosas. Por
ejemplo, derivados de péptido útiles como inhibidores de elastasa
en los que el grupo carboxilo terminal se ha reemplazado por un
grupo pentafluoroetilcarbonilo (-C(O)C_{2}F_{5}) y
en los que el aminoácido N-terminal está protegido
por varios grupos que contienen heterociclos como un grupo
4-morfolincarbonilo se revelan en la Solicitud de
Patente Europea OPI Nº 0529568, inventores Peet y col., con una
fecha de publicación del 3 de marzo de 1993. Los solicitantes han
descubierto recientemente inhibidores de peptidil elastasa en los
que el radical P_{2} se sustituye con diversos grupos
heterocíclicos que contienen nitrógeno.
La presente invención se refiere a compuestos que
tienen la siguiente fórmula I
(I)(SEC ID Nº 1)
o un hidrato, o una sal farmacéuticamente
aceptable de la misma en la que
P_{4} es Ala, bAla, Leu, Ile, Val, Nva, bVal,
Nle o un enlace;
P_{3} es Ala, bAla, Leu, Ile, Val, Nva, bVal,
Nle, o Lys sustituida en su grupo amino epsilon con un grupo
B-morfolino;
P_{2} es
Pro(4-OBzl);
R_{1} es una cadena lateral de Ala, Leu, Ile,
Val, Nva, o bVal;
K es
o
en la que Z es N o CH, y B es un grupo de las
fórmulas
(siendo la línea ondulada
\tbla unión al resto de la molécula, es decir, no a Z). y en la que R' es hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-6}; útiles como inhibidores de elastasa. Los compuestos de fórmula I presentan un efecto antiinflamatorio útil en el tratamiento de gota, artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias, como síndrome de dificultad respiratoria adulto, septicemia, bronquitis crónica, enfermedad inflamatoria del intestino, coagulación intravascular diseminada, fibrosis quística, y en el tratamiento de enfisema.
Se toma un grupo alquilo
C_{1-6} para incluir grupos alquilo lineales,
ramificados o cíclicos, por ejemplo, metilo, etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo,
isopentilo, sec-pentilo, ciclopentilo, hexilo, isohexilo,
ciclohexilo y ciclopentilmetilo.
Los compuestos de fórmula I pueden formar sales
farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido no tóxico,
orgánico o inorgánico. Los ácidos inorgánicos ilustrativos que
forman sales adecuadas incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico,
sulfúrico y fosfórico y sales de metales ácidas como ortofosfato
monohidrógeno de sodio y sulfato de hidrógeno potasio. Los ácidos
orgánicos ilustrativos que forman sales adecuadas incluyen los
ácidos mono, di y tricarboxílicos. Son ilustrativos de tales ácidos
por ejemplo, el acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico,
succínico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico,
maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético,
cinámico, salicílico, 2-fenoxibenzoico, y ácidos
sulfónicos como ácido metano sulfónico y ácido
2-hidroxietano sulfónico.
Se espera que los compuestos de esta invención
estén en la forma hidratada bajo condiciones fisiológicas
normales.
Cada \alpha-aminoácido tiene un
"grupo R" característico, el grupo R que es la cadena lateral,
o residuo, unido al átomo de carbono \alpha del
\alpha-aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral
grupo R para la glicina es el hidrógeno, para la alanina es el
metilo, para la valina es el isopropilo. (Así, a lo largo de toda
esta descripción, el radical R_{1} es el grupo R para cada
\alpha-aminoácido indicado). Para los grupos R
específicos o cadenas laterales de los
\alpha-aminoácidos es útil la referencia al texto
sobre Bioquímica de A. L. Lehninger (véase particularmente el
capítulo 4).
Los aminoácidos naturales con excepción de la
glicina, contienen un átomo de carbono quiral. A no ser que se
indique de otra manera específicamente, los compuestos preferidos
son los aminoácidos ópticamente activos de configuración L; sin
embargo, los solicitantes consideran que los aminoácidos de los
compuestos de fórmula I pueden ser o bien de configuraciones D- o
L- o pueden ser mezclas de los isómeros D- y L-, incluyendo mezclas
racémicas. Las abreviaturas reconocidas para los
\alpha-aminoácidos se establecen en la Tabla
I.
| Aminoácido | Símbolo |
| Alanina | Ala |
| Isoleucina | Ile |
| Leucina | Leu |
| Lisina | Lys |
| Prolina | Pro |
| Valina | Val |
| Norvalina | Nva |
| Norleucina | Nle |
| 1-Naftilalanina | Nal(1) |
| Ácido 2-indolincarboxílico | Ind |
| beta-Alanina | bAla |
| beta-Valina | bVal |
| Metionina | Met |
| Ácido 1,2,3,4,-Tetrahidro | Tic |
| -3-isoquinolincarboxílico |
| Aminoácido | Símbolo |
| Ácido Tiazolidin-4-carboxílico | Tca |
| Ornitina | Orn |
| Ácido pipecolínico | Pip |
| Ácido azetidincarboxílico | Aze |
| 4-Hidroxiprolina | Pro(4-OH) |
| 4-Acetoxiprolina | Pro(4-OAc) |
| 4-benziloxiprolina | Pro(4-OBzl) |
Como con cualquier grupo de compuestos
relacionados estructuralmente que posee una utilidad genérica
particular, se prefieren ciertos grupos y configuraciones para
compuestos de fórmula I en su aplicación de uso final.
Respecto al sustituyente P_{4}, se prefieren
los compuestos de fórmula I en la que P_{4} es Ala o un enlace.
Se prefieren particularmente los compuestos de fórmula I en la que
P_{4} es un enlace.
Respecto al sustituyente P_{3}, se prefieren
compuestos de fórmula I en la que P_{3} es Ile, Val, o Ala. Se
prefieren particularmente compuestos de fórmula I en la que P_{3}
es Val.
En cuanto al sustituyente R_{1}, se prefieren
compuestos de fórmula I en la que R_{1} es
-CH(CH_{3})_{2} o -CH_{2}CH_{2}CH_{3}, que son los
"grupos R" característicos de los aminoácidos Val y Nva,
respectivamente. Se prefieren particularmente compuestos de fórmula
I en la que R_{1} es -CH(CH_{3})_{2}.
Respecto al sustituyente X, se prefieren los
compuestos de fórmula I en la que X es -CF_{2}CF_{3}.
Respecto al sustituyente K, se prefieren
compuestos de fórmula I en la que K es
en la que Z es N y B es un grupo de las
fórmulas
y en las que R' es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6}. Se prefieren particularmente los
compuestos de fórmula I en la que K
es
y en la que Z es N y B es un grupo de las
fórmulas
y en las que R' es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6}.
Ejemplos específicos de compuestos preferidos
incluyen:
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-trans-4-benziloxiprolinamida.
En general, los compuestos de fórmula I se pueden
preparar usando la reacción química estándar análogamente conocida
en la materia y como se representa en el Esquema A.
\newpage
Esquema
A
(I)(SEC ID Nº 1)
El Esquema A proporciona un esquema sintético
general para preparar los compuestos de fórmula I.
Los grupos P_{2}, P_{3} y
K-P_{4} se pueden unir al grupo amino libre del
derivado de aminoácido de estructura (1). Fíjese en que la
estructura (1) representa el radical P_{1} en el que el grupo
ácido carboxílico libre se ha sustituido con un radical "X"
como se define anteriormente. El P_{2}, el P_{3} y el
K-P_{4} se pueden unir al compuesto no protegido,
amino libre (P_{1}-X) por técnicas de acoplamiento
de péptido bien conocidas. Adicionalmente, los grupos P_{1},
P_{2}, P_{3} y K-P_{4} pueden unirse entre
ellos en cualquier orden siempre que el compuesto final sea
K-P_{4}-P_{3}-P_{2}-P_{1}-X.
Por ejemplo, el K-P_{4} se puede unir al P_{3}
para dar K-P_{4}-P_{3} que se
une a P_{2}-P_{1}-X; o
K-P_{4} unirse a P_{3}-P_{2}
entonces unirse a un P_{1} de C-terminal protegido
apropiadamente y el grupo protector de C-terminal
convertirse en X.
Generalmente, los péptidos se alargan
desprotegiendo el \alpha-amino del residuo
N-terminal y acoplando el siguiente aminoácido de
N-protegido adecuadamente a través de una conexión
de péptidos que usa los procedimientos descritos. Este
procedimiento de desprotección y acoplamiento se repite hasta que se
obtiene la secuencia deseada. Este acoplamiento se puede llevar a
cabo con los aminoácidos constituyentes en modo por etapas, como se
describe en el Esquema A, o por condensación de fragmentos (2 a
varios aminoácidos), o combinación de ambos procedimientos, o por
síntesis de péptidos en fase sólida según el procedimiento
originalmente descrito por Merrifield, J. Am. Chem.Soc.,
1963, 85, 2149-2154, revelación del cual incorpora
por referencia la presente invención. Cuando se emplea una
aproximación sintética de fase sólida, el ácido carboxílico
C-terminal se une a un vehículo insoluble
(normalmente poliestireno). Estos vehículos insolubles contienen un
grupo que reaccionará con el grupo aldehído para formar un enlace
que es estable para las condiciones de elongación pero se parte
fácilmente después. Ejemplos de los cuales son: resina de cloro- o
bromometilo, resina de hidroximetilo, y resina de aminometilo.
Muchas de estas resinas son accesibles comercialmente con el
aminoácido C-terminal deseado ya incorporado. Para
compuestos de fórmula I en la que X es H, se puede usar también un
compuesto conector en la reacción del Esquema A para unir una resina
a la funcionalidad aldehído del derivado de aminoácido de
estructura (I) en el que X es H. Ejemplos de compuestos conectores
adecuados son
\newpage
Alternativamente, se pueden sintetizar compuestos
de la invención usando equipamiento de síntesis de péptidos
automatizado. Además de lo anterior, la síntesis de péptidos se
describe en Stewart y Young, "Solid Phase Peptide Synthesis",
2ª ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984); Gross,
Meienhofer, Udenfriend, Eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis,
Biology", Vol 1, 2, 3, 5 y 9, Academic Press, New York,
1980-1987; Bodanzsky, "Peptide Chemistry: A
Practical Textbook", Springer-Verlag, New York
(1988); y Bodanzsky, y col. "The practice of Peptide Synthesis"
Springer-Verlag, Nueva York (1984), cuya descripción
se incorpora por referencia en la presente invención.
El acoplamiento entre dos aminoácidos, un
aminoácido y un péptido, o dos fragmentos de péptido se puede llevar
a cabo usando procedimientos de acoplamiento estándar como el
método azida, el método de anhídrido de ácido
carbónico-carboxílico mezclado (cloroformato de
isobutilo), el método carbodiimida (diciclohexilcarbodiimida,
diisopropilcarbodiimida, o carbodiimida soluble en agua), el método
éster activo (éster p-nitrofenil, éster imido
N-hidroxi-succínico), el método de
reactivo K de Woodward, el método de carbonildiimidazol, reactivos
de fósforo como BOP-Cl, o métodos de
oxidación-reducción. Algunos de estos métodos
(especialmente el método de carbodiimida) se pueden potenciar
añadiendo 1-hidroxibenzotriazol. Estas reacciones
de acoplamiento se pueden llevar a cabo en cualquier solución (fase
líquida) o fase sólida.
Los grupos funcionales de los aminoácidos
constituyentes se deben proteger generalmente durante las reacciones
de acoplamiento para evitar la formación de enlaces indeseados. Los
grupos protectores que se pueden usar se enumeran en Greene,
"Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley &
Sons, New York (1981) y "The Peptides: Analysis, Synthesis,
Biology", Vol. 3, Academic Press, New York (1981), la revelación
de los cuales se incorpora por referencia por la presente
invención.
El grupo \alpha-carboxilo del
residuo C-terminal se protege normalmente por un
éster que puede partirse para dar el ácido carboxílico. Los grupos
protectores que se pueden usar incluyen: 1) ésteres alquilo como
metilo y t-butilo, 2)ésteres arilo como bencilo y
bencilo sustituido, o 3) ésteres que pueden partirse por tratamiento
con base suave o medios de reducción suaves como ésteres
tricloroetilo y fenacilo.
El grupo \alpha-amino de cada
aminoácido que se va a acoplar a la cadena de péptido que crece se
debe proteger. Se puede usar cualquier grupo protector conocido en
la materia. Ejemplos de los cuales incluyen: 1)tipos acilo
como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo, y
p-toluensulfonilo; 2)tipos carbamato
aromático como benciloxicarbonilo (Cbz o Z) y benziloxicarbonilos
sustituidos,
1-(p-bifenil)-1-metiletoxi-carbonilo,
y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) tipos
carbamato alifáticos como terc-butiloxicarbonilo
(Boc), etoxicarbonilo, diisopropil-metoxicarbonilo,
y aliloxicarbonilo; 4) tipos carbamato alquil cíclicos como
ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicarbonilo; 5) tipos alquilo
como trifenilmetilo y bencilo; 6) trialquilsilano como
trimetilsilano; y 7) tipos que contienen tiol como
feniltiocarbonilo y ditiasuccinoilo. El grupo protector
\alpha-amino preferido es o bien Boc o Fmoc,
preferiblemente Boc. Muchos derivados de aminoácido adecuadamente
protegidos para la síntesis de péptidos son accesibles
comercialmente.
El grupo protector del grupo
\alpha-amino del recién añadido residuo de
aminoácido se parte antes del acoplamiento del siguiente aminoácido.
Cuando se usa el grupo Boc, los métodos de elección son el ácido
trifluoroacético, solo o en diclorometano, o HCl en dioxano o
acetato de etilo. La sal de amonio resultante se neutraliza entonces
o bien antes del acoplamiento o in situ con soluciones
básicas como tampones acuosos, o aminas terciarias en diclorometano
o dimetilformamida. Cuando se usa el grupo Fmoc, los reactivos de
elección son piperidina o piperidina sustituida en
dimetilformamida, pero se pueden usar cualquier amina secundaria o
soluciones básicas acuosas. La desprotección se lleva a cabo a una
temperatura entre 0ºC y temperatura ambiente.
Cualquiera de los aminoácidos que soporta
funcionalidades de cadena lateral se debe proteger durante la
preparación del péptido usando cualquiera de los grupos descritos
anteriormente. Aquellos expertos en la materia apreciarán que la
selección y uso de grupos de protección apropiados para estas
funcionalidades de cadena lateral dependen del aminoácido y de la
presencia de otros grupos protectores en el péptido. La selección
de tales grupos protectores es importante en cuanto a que no se debe
retirar durante la desprotección y acoplamiento del grupo
\alpha-amino.
Por ejemplo, cuando se usa Boc como el grupo
protector \alpha-amino, son adecuados los
siguientes grupos protectores de cadena lateral: se pueden usar
radicales p-toluensulfonilo (tosilo) para proteger
las cadenas laterales amino de aminoácidos como Lys y Arg; se
pueden usar radicales p-metilbencilo,
acetamidometilo, bencilo (Bzl), o t-butilsulfonilo
para proteger el sulfuro que contienen las cadenas laterales de
aminoácidos como cisteína y bencilo (Bzl) se puede usar éter para
proteger el hidroxi que contienen las cadenas laterales de
aminoácidos como Ser o Thr.
Cuando se elige Fmoc para la protección de
\alpha-amino, normalmente son aceptables grupos
protectores basados en Terc-butilo. Por ejemplo, se
puede usar Boc para lisina, éter de terc-butilo
para serina y treonina y éster de terc-butilo para
ácido glutámico.
Una vez que se termina la elongación del péptido
se retiran todos los grupos protectores. Cuando se usa una síntesis
de fase líquida, los grupos protectores se retiran de la manera que
se imponga por la elección de los grupos protectores. Estos
procedimientos son bien conocidos para aquellos expertos en la
materia.
Cuando se usa una fase sólida, el péptido se
separa de la resina normalmente simultáneamente con la retirada del
grupo protector. Cuando se usa en la síntesis el esquema de
protección Boc, el método preferido para separar el péptido de la
resina, es el tratamiento con HF anhidro que contiene aditivos como
sulfuro de dimetilo, anisol, tioanisol, o p-cresol
a 0ºC. La división del péptido puede llevarse a cabo también por
otros reactivos ácidos como mezclas de ácido
trifluorometanosulfónico/ácido trifluoroacético. Si se usa el
esquema de protección de Fmoc el grupo Fmoc
N-terminal se divide con reactivos descritos
anteriormente. Los otros grupos protectores y el péptido se separan
de la resina usando solución de ácido trifluoroacético y diversos
aditivos como anisol, etc.
Alternativamente, los compuestos de fórmula I
pueden prepararse usando la reacción química estándar análogamente
conocida en la materia como se representa en el Esquema B.
Esquema
B
El Esquema B proporciona un esquema sintético
general alternativo para preparar los compuestos de fórmula I.
Los grupos P_{2}, P_{3} y
K-P_{4} pueden unirse al grupo amino libre del
derivado de amino alcohol de estructura (2) como se describe
anteriormente en el Esquema A para dar el péptido alcohol de
estructura (3).
La funcionalidad alcohol del péptido alcohol de
estructura (3) es entonces oxidarse por técnicas y procedimientos
bien conocidos y comprendidos por uno de experiencia habitual en la
materia, como una Oxidación Swern usando clorato de oxalilo y
dimetilsulfóxido, para dar los compuestos de fórmula I.
Los materiales de partida para uso en los
Esquemas A y B son accesibles fácilmente para uno de experiencia
habitual en la materia. Por ejemplo, los aminoácidos P_{2},
P_{3}, y K-P_{4} en los que K es hidrógeno son
accesibles comercialmente y el compuesto de unión de estructura
(L1) se describe en J. Am. Chem. Soc., 114,
3157-59 (1992). Además, los aminoácidos
K-P_{4} sustituidos en los que K es acetilo,
succinilo, benzoilo, t-butiloxicarbonilo,
carbobenciloxi, tosilo, dansilo, isovalerilo, metoxisuccinilo,
1-adamantanosulfonilo,
1-adamantanoacetilo,
2-carboxibenzoilo, fenilacetilo,
t-butilacetilo,
bis[(1-naftil)-metil]acetilo
o -A-Rz en el que
A es
-
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}-,
-N-\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}-,
-O-\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}- o
-\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}-;
y
Rz es un grupo arilo que contiene 6, 10 ó 12
carbonos adecuadamente sustituidos por 1 a 3 miembros seleccionados
independientemente del grupo que consiste en flúor, cloro, bromo,
yodo, trifluorometilo, hidroxi, alquilo que contiene de 1 a 6
carbonos, alcoxi que contiene de 1 a 6 carbonos, carboxi,
alquilcarbonilamino en el que el grupo alquilo contiene 1 a 6
carbonos, 5-tetrazoilo, y acilsulfonamido (es decir,
acilaminosulfonilo y sulfonilaminocarbonilo) que contiene de 1 a 15
carbonos, a condición de que cuando el acilsulfonamido contenga un
arilo el arilo pueda sustituirse además por un miembro seleccionado
de flúor, cloro, bromo, yodo y nitro; y otros grupos protectores
amino terminal semejantes que son funcionalmente equivalentes a los
mismos se describen en la Solicitud de Patente Europea OPI Nº 0
363284, 11 de abril de 1990.
Los compuestos amino de partida de estructura (1)
son fácilmente accesibles para uno de experiencia habitual en la
materia. Por ejemplo, ciertos compuestos amino protegidos de
estructura (1) en la que X es H son bien conocidos en la
bibliografía y se describen también en la Solicitud de Patente
Europea OPI Nº 0275101 del 20 de julio de 1988 y en la Solicitud de
Patente Europea OPI Nº 0363284, del 11 de abril de 1990. Además,
los compuestos amino de estructura (1) en la que X es -CF_{3},
-CF_{2}(CH_{2})tCH_{3},
-CF_{2}(CH_{2})tCOOR_{4},
-CF_{2}(CH_{2})CONHR_{4},
-CF_{2}(CH_{2})tCH_{2}OR_{4},
-CF_{2}CF_{3}, y -CF_{2}(CH_{2})tCH=CH_{2}
se describen en la Solicitud de Patente Europea OPI. Nº 0503203 del
16 de septiembre de 1992. Los compuestos amino de estructura (1) en
la que X es -CF_{3}, -CF_{2}H, -C(=O)-Y,
-CF_{2}CH(R_{1'})-C(=O)P_{2'}-Y
y -C(=O)-P_{2'}-Y se describen en
la Solicitud de Patente Europea OPI Nº 0195212 del 24 de septiembre
de 1986. Los compuestos amino de estructura (1) en la que X es
-CF_{2}CH(R_{1'})NHC(=O)R_{3} se
describen en OPI Nº 0275101 del 20 de julio de 1988 y los
compuestos amino de estructura (1) en la que X es
-CHFCH(R_{1'})NHC(=O)R_{3} se pueden
preparar por procedimientos análogos usando ácido
bromo-fluoroacético, éster de etilo en lugar de
ácido de bromo-difluoroacético, éster de etilo. Los
compuestos amino de estructura (1) en la que X es -CFH_{2} se
describen en Biochem. J. (1987), 241, 871-5,
Biochem. J. (1986), 239, 633-40 y en la
Patente de Estados Unidos Nº 4,518,528 del 21 de mayo de 1985. Los
compuestos amino de estructura (1) en la que X es -CO_{2}R_{3},
-C(=O)-R_{3} y
-CH(R_{1})-C(=O)P_{2'}-Y
se describen en la Solicitud de Patente Europea OPI Nº 0363284, del
11 de abril de 1990. Los compuestos amino de estructura (1) en la
que X es
-CF_{2}CH(R_{1'})NHC(=O)-R_{3}
se describen en la Solicitud de Patente Europea OPI Nº 0275101 del
20 de julio de 1988. Además, los compuestos amino de estructura (15)
en la que X es -CF_{2}CF_{3} se describen en la Solicitud de
Patente Europea OPI Nº 0410411 del 30 de enero de 1991. El compuesto
de unión ácido
trans-4-(aminometil)-ciclohexanocarboxílico,
éster de bencilo usado en la síntesis de compuestos de fórmula I
en la que X es H se prepara a partir del ácido correspondiente como
se describe en J. Am. Chem. Soc. 1992, 114,
3156-3157.
Además, se pueden preparar otros materiales de
partida para uso en los Esquemas A y B por los siguientes
procedimientos sintéticos que son bien conocidos y apreciados por
uno de experiencia habitual en la materia. Los aminoácidos
K-P_{4} sustituidos de estructura en la que K
es
en la que Z es N o CH,
y
B es un grupo de las fórmulas
\newpage
en las que R' es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6} se preparan usando reacciones químicas
estándar análogamente conocidas en la materia.
El procedimiento para preparar los aminoácidos
K-P_{4} sustituidos en los que K es
en la
que
B es un -C(=O)- se resume en el Esquema C en el
que P_{4} y Z son como se define anteriormente o son los
equivalentes funcionales de estos grupos.
Esquema
C
Específicamente los aminoácidos
K-P_{4} en los que K es
en la
que
B es un -C(=O)- se preparan por acoplamiento del
aminoácido K-P_{4} en el que K es hidrógeno con
un cloruro de ácido de estructura (4) en presencia de de uno a
cuatro equivalentes molares de una amina adecuada que puede actuar
como un aceptor haluro de hidrógeno. Las aminas adecuadas para uso
como aceptores haluro de hidrógeno son aminas orgánicas terciarias
como tri(alquilo inferior) aminas, por ejemplo,
trietilamina, o aminas aromáticas como picolinas, colidinas, y
piridina. Cuando se emplean piridinas, picolinas o colidinas, se
pueden usar en exceso elevado y actúan por tanto también como
solvente de la reacción. La N-metilmorfolina
("NMM") es particularmente adecuada para la reacción. La
reacción de acoplamiento se puede llevar a cabo añadiendo un
exceso, como de 1-5, preferiblemente aproximadamente
un exceso molar de 4 veces de la amina y después el cloruro de
ácido de estructura (4), a una solución del aminoácido
K-P_{4} en el que K es hidrógeno. El solvente
puede ser cualquier solvente adecuado, por ejemplo, éteres de
petróleo, un hidrocarburo clorado como tetracloruro de carbono,
cloruro de etileno, cloruro de metileno, o cloroformo; un aromático
clorado como 1,2,4-triclorobenceno, o
o-diclorobenceno; disulfuro de carbono; un solvente
etéreo como dietiléter, tetrahidrofurano, o
1,4-dioxano, o un solvente aromático como benceno,
tolueno, o xileno. El cloruro de metileno es el solvente preferido
para esta reacción de acoplamiento. La reacción se deja continuar
durante desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 6
horas, dependiendo de los reactivos, el solvente, las
concentraciones, y otros factores, como la temperatura que puede ser
desde aproximadamente 0ºC hasta aproximadamente 60ºC,
convenientemente hasta aproximadamente temperatura ambiente, es
decir, 25ºC. Los aminoácidos K-P_{4}
N-protegidos en los que K es
en la
que
B es un -C(=O)- pueden aislarse de la mezcla de
reacción por cualquier técnica apropiada como por cromatografía en
gel de sílice.
Los aminoácidos K-P_{4}
sustituidos en los que K es
en la
que
B es diferente de un -C(=O)- se pueden preparar
análogamente, simplemente sustituyendo el intermedio adecuado
en el
que
B es diferente de un -C(=O)- y A es Cl u OH (el
ácido correspondiente, cloruro de ácido o cloruro de sulfonilo)
para el compuesto de estructura (5) en el Esquema C.
El cloruro de ácido de estructura (4) y el
intermedio adecuado de fórmula
en la
que
B es diferente de un -C(=O)- y A es Cl u OH (el
ácido correspondiente, cloruro de ácido o cloruro de
sulfonilo)son accesibles comercialmente o pueden prepararse
fácilmente por técnicas y procedimientos bien conocidos y apreciados
por uno de experiencia habitual en la materia.
En el Esquema H se muestran rutas alternativas
para la preparación de compuestos de estructura (1) en la que
X=-CF_{2}CF_{3}.
El material de partida requerido definido por el
compuesto (31) es accesible fácilmente o bien comercialmente o
aplicando principios y técnicas de la técnica anterior conocida. El
término "Pg" se refiere a un grupo protector adecuado como se
define anteriormente más completamente.
En la etapa a del Esquema H, el aminoácido
protegido (31) se transforma en el hidroxamato (32). Esta amidación
se puede llevar a cabo utilizando una reacción de acoplamiento como
entre dos aminoácidos usando el aminoácido protegido (31) y la
N-alquil O-alquilhidroxilamina. La
reacción de acoplamiento estándar se puede llevar a cabo usando
procedimientos de acoplamiento patrones como se describe
anteriormente para el acoplamiento entre dos aminoácidos para
proporcionar el hidroxamato (32).
En la etapa b, el hidroxamato protegido (32) se
transforma en la pentafluorocetona protegida (34) [o (35)]. Esta
reacción se puede llevar a cabo utilizando una reacción del tipo
descrito en la siguiente referencia M.R. Angelastro, J.P
Esquema
H
(35) (SEC ID Nº 4)
Burkhart, P. Bey, N.P. Peet, Tetrahedron
Letters, 33 (1992), 3265-3268.
En la etapa c, el hidroxamato (32) se desprotege
bajo condiciones bien conocidas en la técnica como describe T. H.
Green "Protection groups in Organic Synthesis", John Wiley e
hijos, 1981, Capítulo 7, para proporcionar el hidroxamato
desprotegido. El hidroxamato desprotegido se alarga acoplando el
siguiente aminoácido protegido adecuadamente a través de una unión
de péptido usando los métodos descritos anteriormente, o por
condensación de fragmentos, o combinación de ambos procedimientos
para proporcionar el péptido alargado (33).
\newpage
En la etapa d, la cetona (34) se desprotege bajo
condiciones como las descritas anteriormente. La cetona
desprotegida (34) se alarga acoplando el siguiente aminoácido
protegido adecuadamente a través de una unión de péptido usando los
métodos descritos anteriormente, o por condensación de fragmentos,
o combinación de ambos procedimientos para proporcionar la cetona
(35) alargada.
Alternativamente, el correspondiente éster del
aminoácido N-protegido de (31) [es decir,
PgNH-CH(R_{1})C(=O)OR_{2},
(32a), en el que R_{2} y Pg son como se define anteriormente] se
puede sustituir por el hidroxamato (32). Los correspondientes
ésteres de aminoácido protegido de (31) son accesibles
comercialmente o fácilmente sintetizados a partir de (31) por
procedimientos bien conocidos por uno de experiencia habitual en la
materia. En la etapa b, el éster de aminoácido (32a), se transforma
en la pentafluorocetona N-protegida (34) [o (35)] de
una forma directamente análoga a la usada para el hidroxamato
correspondiente. Las etapas c y d serían las mismas que las
empleadas cuando se utiliza el hidroxamato (32).
Por ejemplo, el éster del aminoácido (32a) puede
reaccionar con un reactivo de perfluoración adecuado, como, de
4-8 equivalentes de yoduro de perfluoroetilo o
bromuro de perfluoroetilo. Dicha reacción se lleva a cabo en
presencia de una base de metal alcalino adecuada, por ejemplo de
4-8 equivalentes de MeLi/LiBr en un solvente
anhidro adecuado (o solventes mezclados), como éter, THF, o tolueno.
Otros ejemplos de bases de metales alcalinos adecuadas incluyen
t-BuLi, EtMgBr, PhMgBr, n-BuLi, y
similares. La reacción se lleva a cabo a una temperatura reducida de
desde 100ºC a 0ºC, preferiblemente desde -30ºC a -80ºC, para
proporcionar la amino cetona de perfluoropropilo protegida y la
amino cetona de perfluorobutilo protegida, respectivamente. Las
etapas c y d serían las mismas que las empleadas cuando se utiliza
el hidroxamato (32).
Alternativamente, el éster del aminoácido
N-protegido (32a) podría primero desprotegerse y
acoplarse con un péptido N-protegido adecuadamente
en presencia de un agente acoplante adecuado y en presencia de un
solvente acoplante apropiado. El éster de péptido
N-protegido formado posteriormente
[KP_{4}P_{3}P_{2}NH-CH(R_{1})C(=O)OR_{2},
(33a)] se perfluoraría entonces de una forma directamente análoga a
la usada para el correspondiente hidroxamato. Las etapas c y d
serían las mismas que las empleadas cuando se utiliza el
hidroxamato (33).
Todos los aminoácidos empleados en la síntesis de
la Fórmula 1 son o bien accesibles comercialmente o se sintetizan
fácilmente por uno experto en la materia pertinente. Por ejemplo,
el derivado de aminoácido Pro (4-Ac) definido en
P_{2} puede hacerse esterificando un residuo de Pro utilizando
técnicas bien conocidas por uno de experiencia habitual en la
materia.
Los siguientes ejemplos presentan síntesis
típicas como se describe en los Esquemas A a H. Estos ejemplos se
entiende que son solo ilustrativos y no se tiene intención de que
limiten el alcance de la presente invención en ningún caso. Como se
usa en la presente invención, los siguientes términos tienen los
significados indicados: "g" se refiere a gramos; "mmol"
se refiere a milimoles; "mL" se refiere a mililitros;
"bp" se refiere a punto de ebullición; "ºC" se refiere a
grados Celsius; "mm Hg" se refiere a milímetros de mercurio;
"\muL" se refiere a microlitros; "\mug" se refiere a
microgramos; y "\muM" se refiere a micromolar; "DME" se
refiere a 1,2-dimetoxietano; "DCC" se refiere
a diciclohexilcarbodiimida; "h" se refiere a hora; "DMF"
se refiere a N,N'-dimetilformamida; "conc" se
refiere a concentrado; "NMM" se refiere a
N-metilmorfolina, "in vacuo" se refiere
a la retirada del solvente bajo presión reducida.
\newpage
Se añadió DCC (4,75 g, 0,023 moles) a una
solución agitada enfriada (en baño de hielo) de
BOC-L-valina (4,56 g, 0,021 moles),
y N-hidroxisuccinimida (2,41 g, 0,021 moles) en DME
(50 ml). La reacción se agitó durante 6 h a 5ºC y después se dejó
estar en el frigorífico durante toda la noche. La reacción se filtró
entonces en frío, se lavó con Et_{2}O, y se concentró para
producir un sólido que se cristalizó en EtOAc/hexano para dar el
producto deseado como un sólido cristalino blanco (4,59 g, 69,5%):
pf 123-124ºC; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 5,00-4,95 (d, 1H, J=9,3 Hz), 4,62 (dd, 1H,
J=4,97 Hz), 2,85 (s, 4H), 2,75-2,44 (m, 1H), 1,45
(s, 9H), 1,25-0,90 (m, 6H); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}) \delta 168,6, 167,9, 155,1, 155,0, 80,4, 77,4, 77,2,
77,0, 76,6, 76,5, 57,0, 31,6, 31,1, 28,2, 28,1, 28,0, 27,99, 27,93,
25,5, 18,6, 17,3; MS (Cl/CH_{4}) m/z 315 (MH+), 299, 287, 259,
241, 215 (pico base), 173, 172, 145, 144, 116, 100, 72. Anal. Calcd.
Para C_{14}H_{22}N_{2}O_{6}: C, 53,49; H, 7,05; N, 8,91.
Encontrado: C, 53,67; H, 7,06; N, 8,81.
El producto de la parte (a)(2,8 g, 9,0 mmol) se
añadió a una solución agitada de ácido carboxílico
(S)-(-)-2-acetidina (1,0 g, 10 mmol)
y Et_{3}N (1,5 mL, 11 mmol) en DMF (30 mL) y la reacción se
calentó hasta 120ºC durante 2,5 h. Sobre enfriamiento, la reacción
se concentró in vacuo y el residuo aceitoso se disolvió en
EtOAc y se lavó con HCl 1N (2 x 30 mL), se secó (MgSO4) y se
concentró para dar el producto deseado como una espuma blanca (1,88
g, 65%); RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,15 (s a, 1H),
5,09 (d, 1H, J= 8,8 Hz, NH), 5,00 (dd, 1H, J=9,2, 7,2 Hz,
\alpha-CH de Val), 4,43 (dd, 1H, J=7,0, 1,49 Hz),
4,17 (m, 1H), 3,94 (t app, 1H, J=8Hz), 2,62 (m, 3H), 1,44 (s, 9H,
tBu), 0,97 (d, 6H, J=6,7 Hz, 2 x CH_{3}).
Se añadió isobutilcloroformato en gotas (0,79 mL,
6,0 mmol)a una solución agitada del producto de la parte (b)
(1,80 g, 6,0 mmol) y NMM (0,66 mL, 6,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2}
seco (50 mL) a -20ºC bajo nitrógeno. Después de 20 min, se añadió
clorhidrato de
4-amino-1,1,1,2,2,-pentafluoro-5-metil-3-hexanona
(1,54 g, 6,0 mmol) (de la Solicitud de Patente Europea OPI Nº
0410411, publ. 30 de enero de 1991), inmediatamente seguido por otro
equivalente de NMM (0,66 mL, 6,0 mmol). La mezcla de reacción se
agitó a -20ºC durante 1 h, se vertió entonces en HCl diluido frío y
se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. El extracto orgánico se lavó con
agua, NaHCO_{3} acuoso diluido, salmuera, y se secó (MgSO_{4}).
La concentración in vacuo dio el compuesto deseado como un
aceite incoloro (2,20 g, 73%); RMN _{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 8,4 (m, 1H, NH), 5,12-4,90 (m, 2H), 4,38
(m, 1H), 4,11 (m, 1H), 4,00 (m, 1H), 2,73 (m, 1H), 2,42 (2m, 2H),
1,92 (m, 2H), 1,45 (s, 9H, t-Bu),
1,11-0,85 (m, 12H, 4 x CH_{3}); RMN ^{19}F
\delta -82,14 (s, CF_{3}), -120,99 y -123,09, -121,23 y -122,84
(cuartetos 2AB, J=296 Hz, CF_{2}).
Se burbujeó gas HCl en una solución agitada del
producto de la parte (c) (2,0 g, 3,98 mmol) en EtOAc (40 mL) a
temperatura de baño de hielo durante 4 min. La reacción se agitó
entonces a temperatura ambiente durante 2 h, se concentró in
vacuo y se azeotropó con EtOAc para dar el producto deseado
(1,63 g, 96%) como una espuma blanca; IR (film) 3196, 2972, 2937,
2883, 2636, 1755, 1655, 1523, 1471, 1398, 1373, 1350, 1222, 1201,
1159, 1116, 1093, 1066, 1014, 979, 922, 835, 815, 734, 646, 588;
RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,09 (d, 1H, J=8,2 Hz,
NH), 8,02 (d, 1H, J=8,5 Hz, NH), 5,15 (m, 1H), 5,00 (m, 1H), 4,55
(m, 1H), 4,13 (m, 1H), 3,90 (m, 1H), 2,56 (m, 2H), 2,30 (m, 3H),
1,12-0,84 (m, 12H, 4 x CH_{3}); RMN ^{13}C
(CDCl_{3}) \delta 193,2, 170,7, 170,4, 170,3, 169,9, 62,2,
61,5, 59,7, 59,5, 55,1, 55,0, 50,1, 30,0, 29,9, 28,9, 28,7, 19,8,
19,7, 18,8, 18,5, 18,2, 18,1, 17,8, 16,6, 16,3; RMN ^{19}F
\delta -82,06 y -82,14 (2s, CF_{3}), -121,16 y -122,76, -121,33
y -122,88 (cuartetes 2 AB, J=296 Hz, CF_{2}); MS (Cl/CH_{4})
m/z (intensidad rel.) 442 (6), 430 (18), 402 (MH+, 100), 303 (9), 72
(42). Anal. Cald. para C_{16}H_{24}F_{5}N_{3}O_{3}.HCl: C,
43,89; H, 5,53; N, 9,59. Encontrado: C, 43,43; H, 6,07; N,
9,23.
Se añadió cloruro de tionilo (0,30 mL, 4,14
mmol)a una suspensión agitada de ácido
4-(4-morfonilcarbonil)benzoico (975 mg, 4,14
mmol) y cloruro de benziltrietilamonio (4 mg, 0,008 mmol) en
1,2-dicloroetano (30 mL) y la reacción se calentó a
reflujo. Después de 2,5 h, la reacción se dejó enfriar a temperatura
ambiente y se concentró in vacuo. El residuo entonces se
azeotropó con CCl_{4} y se puso bajo vacío para dar cloruro de
ácido morfolinotereftálico (cuantitativo) como un aceite naranja
claro que se usó sin purificación adicional. En un matraz RB a
parte, se enfrió una solución agitada del producto de la parte (d)
(1,5 g, 3,43 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (20 mL) hasta -20ºC. Se
añadió NMM (1,35 mL, 12,3 mmol) seguido inmediatamente por la
adición en gotas del cloruro de ácido morfolinotereftálico en
CH_{2}Cl_{2} (5 mL) a una tasa como para mantener la
temperatura de reacción interna a -10ºC o menos. Después de que se
terminara la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar hasta
temperatura ambiente. Después de 1,5 h a temperatura ambiente, la
mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (20 mL), se lavó
con HCl 1N (2 x 20 mL), NaHCO_{3} saturado (2 x 20 mL), salmuera
(1 x 20 mL), se secó (MgSO_{4}) y se concentró. in vacuo
para dar una espuma blanca que inmediatamente se cromatografió
ultrarrápido (eluída con 1:27 MeOH-CH_{2}Cl_{2})
para dar el producto deseado (MDL 104,238) (335 mg, 16%) como una
espuma blanca; IR (KBr) 3690, 3678, 3429, 3271, 3011, 2972, 2931,
2899, 2876, 2862, 1755, 1680, 1631, 1520, 1494, 1458, 1437, 1398,
1373, 1361, 1330, 1302, 1280, 1259, 1234, 1199, 1159, 1114, 1068,
1024, 1012, 896, 860, 842, 787, 773, 763, 669, 597, 563, 540; RMN
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,32 (m, 1H, NH), 7,86 (d,
2H, J=8,5 Hz, arilo), 7,49 (d, 2H, J=7,9 Hz, arilo), 6,70 (m, 1H,
NM), 5,00 (m, 2H), 4,50 (m, 2H), 4,19 (m, 1H),
4,86-3,30 (serie de m, 8H),
2,82-1,95 (serie de m, 4H), 1,05 (m, 9H, 3 x
CH_{3}), 0,88 (d, 3H, J=6,9 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C \delta
174,07, 174,05, 170,6, 169,2, 166,4, 138,66, 138,62, 135,0, 134,9,
127,4, 127,3, 66,8, 66,7, 62,0, 61,7, 59,7, 59,6, 54,1, 54,0, 49,3,
31,5, 31,4, 28,7, 28,5, 20,0, 19,0, 18,8, 18,2, 18,1, 18,09, 18,05,
16,1, 16,0; RMN ^{19}F \delta -82,12 (s, CF_{3}), -120,98 y
-123,12, -121,20 y -122,86 (cuartetes 2AB, J=296 Hz, CF_{2}); MS
(Cl/CH_{4}) m/z (intensidad rel.) 647,619 (MH+), 303 (100),
289,218. Anal. Calcd. para
C_{28}H_{35}F_{5}N_{4}O_{6}.0,3 H_{2}O: C, 53,90; H,
5,75;N, 8,98. Encontrado: C, 53,75; H, 5,86; N, 8,86.
El producto de la parte (a) del ejemplo 1 (2,0 g,
6,0 mmol) se añadió a una solución agitada de ácido
D,L-pipecolínico (1,30 g, 10 mmol) y Et_{3}N (1,5
mL, 11mmol) en DMF (30 mL) y la reacción se calentó a 120ºC durante
2,5 h. Sobre enfriamiento, la reacción se concentró in vacuo
y el residuo aceitoso se disolvió en EtOAc y se lavó con HCl 3N (2
x 30 mL), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró a una espuma
amarilla que se cromatografió ultrarrápido para dar el compuesto
deseado (579 mg, 29%), una mezcla de dos compuestos, como una
espuma blanca; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,94 (s
a, 1H), 5,62 (d, 1H, J=9,8 Hz, NH), 5,45 (d, .5H, J=3,98 Hz,
L-Pec), 5,07 (d, .5H, J=9,25,
D-Pec), 4,60 (dd, .5H, J=8,83, 5,06 Hz,
\alpha-CH de Val), 4,25 (dd, .5H, J=8,69, 4,66
Hz, Val de compuesto D), 3,93 (d app, 1H, J=12,47 Hz, Pec), 3,25 (m,
1H, Pec), 2,31 (m, 1H, Pec), 2,20 (m, .5H, Val de compuesto D),
2,01 (m, .5H, Val), 1,78-1,33 (m, 5H, Pec), 1,44
(s, 9H, tBu), 1,01-0,86 (m, 6H, 2 x CH_{3}).
Se añadió isobutilcloroformato en gotas a una
solución agitada del producto de la parte (a) del ejemplo 2 (450
mg, 1,37 mmol) y NMM (0,15 mL, 1,37 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco
(20 mL) a -20ºC bajo nitrógeno (0,18 mL, 1,37 mmol). Después de 20
min, clorhidrato de
4-amino-1,1,1,2,2-pentafluoro-5-metil-3-hexanona
(351 mg, 1,37 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -20ºC durante
1 h, después se vertió en HCl diluido frío y se extrajo con
CH_{2}Cl_{2}. El extracto orgánico se lavó con agua,
NaHCO_{3} acuoso diluido, salmuera y se secó (MgSO_{4}). La
concentración in vacuo dio el producto deseado (580 mg, 80%)
como una espuma incolora; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 6,98 (m, 1H, NH), 5,36-4,88 (m, 3H), 4,60
(m, 1H), 4,43 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,10 (m, 1H, CH de Pec),
2,36-1,92 (serie de m, 3H, Pec y CH o Val),
1,79-1,24 (m, 4H), 1,45 (s, 9H, tBu),
1,05-0,83 (m, 12H, 4 x CH_{3}); RMN ^{19}F
\delta -82,10 (s, CF_{3}), -120,74 --123,40 (m, CF_{2}).
Se burbujeó gas HCl en una solución agitada del
producto del ejemplo 2 (b) (530 mg, 1,0 mmol) en EtOAc (10 mL) a
temperatura de baño de hielo durante 4 min. La reacción se agitó
entonces a temperatura ambiente durante 2 h, se concentró in
vacuo y se azeotropó con EtOAc para dar el compuesto deseado
(460 mg, 99%) como una espuma blanca.
Se añadió cloruro de tionilo (0,09 mL, 1,20 mmol)
a una suspensión agitada de ácido
4-(4-morfolinilcarbonil)benzoico (0,28 g, 120
mmol) y cloruro de benciltrietilamonio (2 mg, 0,004 mmol) en
1,2-dicloroetano (25 mL) y la reacción se calentó a
reflujo. Después de 2,5 h, la reacción se dejó enfriar a temperatura
ambiente y se concentró in vacuo. El residuo se azeotropó entonces
con CCl_{4} y se puso bajo vacío para dar cloruro de ácido
morfolinotereftálico (cuantitativo) como un aceite naranja claro que
se usó sin purificación adicional. En un matraz RB a parte, se
enfrió a -20ºC una solución agitada del producto del ejemplo 2
(c)(450 mg, 10,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10 mL). Se añadió NMM
(0,5 mL, 4,0 mmol) e inmediatamente seguido por la adición en gotas
del cloruro de ácido morfolinotereftálico en CH_{2}Cl_{2} (5
mL) a una tasa como para mantener la temperatura de reacción
interna a -10ºC o menos. Después de que terminara la adición, la
mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después
de 1,5 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} (20 mL), se lavó con HCl 1 N (2 x 20 ml),
NaHCO_{3} saturado (2 x 20 mL), salmuera (1 x 20 mL), se secó
(MgSO_{4}) y se concentró in vacuo para dar una espuma
cruda (410 mg). La espuma blanca cruda se cromatografió
ultrarrápido inmediatamente (eluída con 1:27
MeOH-CH_{2}Cl_{2}) para dar el producto deseado
(MDL 105,759) (270 mg, 42%) como una espuma blanca; RMN ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,95-7,76 (m, 2H,
arilo), 7,58-7,39 (m, 2H), 7,20-6,86
(m, 2H, arilo), 5,40-4,30 (m, 4H),
4,20-3,20 (m, 10H, 2 x NCH_{2}CH_{2}O y
NCH_{2} de Pro), 2,60-1,95 (m, 3H),
1,90-1,82 (m, 4H), 1,25-0,75 (m,
12H); RMN ^{19}F (CDCl_{3}) \delta - 81,97 (m, CF_{3}),
-121,82 y -119,87 (m, CF_{2}); MS (Cl/CH_{4}) m/z (intensidad
relativa) 647 (MH+), 564, 536, 474, 428, 363, 331 (100), 317, 289,
246, 218, 186, 158, 104, 84, 72.
El producto del ejemplo 1 (a) (3,14 g, 10 mmol)
se añadió a una solución agitada de
trans-4-hidroxi-L-prolina
(1,31 g, 10 mmol) y Et_{3}N (1,4 mL, 10 mmol) en DMF (40 mL) y
la reacción se calentó a 110ºC durante 3 h. Sobre enfriamiento, la
reacción se concentró in vacuo y el residuo aceitoso se
disolvió en EtOAc y se lavó con HCl 3N (2 x 30 mL), H_{2}O (2 x
10 mL), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró para dar el
compuesto deseado (1,85 g, 56%) como una espuma blanca; RMN ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta 5,70-5,25 (m, 1H,
NH), 5,05 (m, 1H), 4,80-3,95 (m, 4H),
3,85-2,80 (serie de m, 3H),
2,35-1,80 (m, 2H), 1,44 (s, 9H,
t-Bu), 1,01-0,95 (m, 6H, 2 x
CH_{3}); MS (CI/CH_{4}) m/z (intensidad rel), 331 (MH+), 303,
275 (100), 259, 231, 217, 172, 162, 144, 132, 116, 86, 72.
Se añadió isobutilcloroformato en gotas (0,70 mL,
5,60 mmol) a una solución agitada del producto del ejemplo 3 (a)
(1,80 g, 5,60 mmol) y NMM (0,60 mL, 5,60 mmol) en CH_{2}Cl_{2}
seco (30 mL) a -20ºC bajo nitrógeno. Después de 20 min, se añadió
clorhidrato de
4-amino-1,1,1,2,2-pentafluoro-5-metil-3-hexanona
(1,40 g, 5,60 mmol), inmediatamente seguido por otro equivalente de
NMM (0,60 mL, 5,60 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -20ºC
durante 1 h, se dejó entonces enfriar a temperatura ambiente y se
vertió en HCl diluido frío y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. El
extracto orgánico se lavó con agua, NaHCO_{3} acuoso diluido,
salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se concentró in vacuo para
dar un aceite crudo que se cromatografió ultrarrápido (5%
MeOH/CH_{2}Cl_{2}) para dar el compuesto deseado (1,44 g, 48%)
como una espuma blanca; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta
7,98 (s a, .5H, J=7,6 Hz, NH), 7,73 (s a, .5H, J=7,6 Hz, NH), 5,47
(s a, 1H, J=8,6 Hz, NH), 5,04-4,95 (m, 1H),
4,76-4,67 (m, 1H), 4,49 (s a, 1H), 4,23 (m, 1H),
3,94 (s a, 1H, J=10,8 Hz), 3,66-3,59 (m, 1H),
2,50-1,98 (serie de m, 4H), 1,42 (s, 9H,
t-Bu), 1,09-0,88 (m, 12H, 4 x
CH_{3}); RMN ^{13}C \delta 173,9, 173,2, 170,6, 170,4,
156,3, 156,2, 80,5, 80,4, 77,4, 77,2, 77,0, 76,5, 70,0, 69,8, 59,7,
59,5, 58,2, 57,7, 57,6, 55,7, 55,5, 35,7, 34,7, 31,0, 30,9, 29,0,
28,6, 28,2, 20,2, 19,9, 19,3, 19,7, 18,3, 18,2, 16,4, 16,1; RMN
^{19}F \delta -82,17 (s, CF_{3}), -82,18 (s, CF_{3}), -121,6
y -122,8 (cuartete AB, J=296 Hz, CF_{2}); MS (CI/CH_{4}) m/z
(intensidad rel) 549 (MNH_{4}^{+}, 12), 532 (MH+, 54), 482
(11), 330 (15), 245 (100), 189 (15).
Se burbujeó gas HCl en una solución del producto
del ejemplo 3 (b) (1,44 g, 2,70 mmol) en EtOAc (20 mL) a
temperatura de baño de hielo durante 4 min. La reacción se agitó
entonces a temperatura ambiente durante 2 h, se concentró in
vacuo y se azeotropó con EtOAc para dar la combinación deseada
de derivados (1,27 g, 100%), siendo el derivado acetoxi el derivado
minoritario, como una espuma blanca.
Se añadió cloruro de tionilo (0,15 mL, 1,90 mmol)
a una suspensión agitada de ácido 4-(4-morfolinil
carbonil)benzoico (280 mg, 1,90 mmol) y cloruro de
benciltrietilamonio (2 mg, 0,004 mmol) en
1,2-dicloroetano (20 mL) y la reacción se calentó a
reflujo. Después de 2h, la reacción se dejó enfriar a temperatura
ambiente y se concentró in vacuo. El residuo se azeotropó
entonces con CCl_{4} y se puso bajo vacío para dar cloruro de
ácido morfolinotereftálico (cuantitativo) como un aceite naranja
claro que se usó sin purificación adicional. En un matraz RB a
parte, se enfrió a -20ºC una solución agitada del producto del
ejemplo 3 (c) (800 mg, 1,71 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (15 mL). Se
añadió NMM (0,42 mL, 3,80 mmol) e inmediatamente seguido por la
adición en gotas de cloruro de ácido morfolinotereftálico en
CH_{2}Cl_{2} (5 mL) a una tasa como para mantener la
temperatura interna de la reacción a -10ºC o menos. Después de que
terminara la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar a
temperatura ambiente. Después de 2h a temperatura ambiente, la
mezcla de reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (20 mL), se lavó
con HCl 1N (2 x 20 ML), NaHCO_{3} saturado (2 x 20 mL), salmuera
(1 x 20 mL), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró in
vacuo para dar una mezcla de dos compuestos (MDL 105,60 como
el producto mayoritario y MDL 105,683 como el producto minoritario)
como una espuma cruda.
La mezcla de los dos compuestos definidos en el
ejemplo 3 (d) se cromatografió ultrarrápido inmediatamente en
SiO_{2}, eluyendo con 1:27 MeOH-CH_{2}Cl_{2}
para producir el compuesto deseado (MDL 105,160) (160 mg, 14,5 %)
como el material R_{f} más elevado (R_{f} de aproximadamente
0,3-0,4) como una espuma blanca; RMN ^{1}H (300
MHz, CDCl_{3}) \delta 7,82 (m, 2H, arilo), 7,45 (d, 2H, J=8,3
Hz, arilo), 7,35 (d, .5H, J=8,4 Hz, NH), 6,91 (d, 1H, J=8,7 Hz,
NH), 4,99 (m, 1H), 4,84 (t, 1H), 4,72 (t, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,55
(s a, 1H), 4,18 (m, 1H), 3,8-3,4 (s a solapando m,
9H), 2,86-2,03 (serie de m, 4H), 1,26 (m, 9H, 3 x
CH_{3}), 0,96 (m, 3H, CH_{3}); RMN ^{13}C \delta 173,2,
172,5, 170,7, 170,4, 169,2, 167,1, 138,8, 134,9, 127,52, 127,50,
127,4, 127,3, 77,55, 77,52, 77,51, 77,46, 77,44, 77,3, 77,2, 77,1,
77,0, 76,88, 76,85, 76,6, 76,56, 76,54, 70,1, 69,9, 66,8, 59,6,
59,5, 58,5, 57,9, 57,0, 56,0, 56,0, 55,7, 36,0, 34,9, 31,42, 31,40,
31,3, 29,2, 28,8, 20,0, 19,85, 19,83, 19,4, 19,2, 18,4, 16,5, 16,4,
16,3, 16,2; RMN ^{19}F (CDCl_{3}) \delta -82,1, -82,15 (s,
CF_{3}), -121,31, 123,02 (cuartete AB J=293 Hz, CF_{2}) y
-121,35, -122,82 (cuartete AB, J=298 Hz, CF_{2}); MS
(Cl/CH_{4}) m/z (intensidad rel) 649 (MH+), 361, 334, 333 (100),
317, 289, 218, 200, 111, 86. Anal. Calcd. para
C_{29}H_{37}F_{5}N_{4}O_{7}: C, 53,70; H, 5,75; N, 8,64.
Encontrado: C, 53,44; H, 5,77; N, 8,38.
Se obtuvo MDL 105,683 como el material R_{f}
inferior (R_{f} de aproximadamente 0,05-0,1) de
la mezcla de los dos compuestos que se cromatografiaron
ultrarrápido como se describe en el ejemplo 3 (e). Dicho
procedimiento produjo MDL 105,683 (90 mg, 7,6 %) como una espuma
blanca; RMN ^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,84 (d, 2H,
J=8,4 Hz, arilo), 7,72 (.5H, J=8,4 Hz, NH), 7,47 (d, 2H, J=8,3 Hz,
arilo), 6,74 (d, 1H, J=8,6 Hz, NH), 5,36 (m, 1H), 5,00 (m, 1H),
4,83 (dd, .5H, J=8,6, 7,2 Hz), 4,69 (t, .5H), 4,08 (s a, 1H),
3,9-3,3 (s a solapando m, 9H), 2,81 (m, .5H), 2,64
(m, .5H), 2,41-2,06 (serie de m, 3H), 2,04 (s, 3H,
OCH_{3}), 1,02 (m, 9H, 3 x CH_{3}), 0,94 (m, 3H, CH_{3}); RMN
^{13}C \delta 173,0, 172,3, 170,4, 170,1, 169,9, 169,2, 166,3,
138,7, 127,4, 127,3, 72,5, 72,4, 66,8, 59,6, 59,5, 58,5, 57,8,
56,3, 56,2, 53,2, 52,9, 34,0, 32,8, 31,8, 31,7, 31,6, 29,3, 29,2,
28,8, 24,9, 20,9, 20,0, 19,8, 19,5, 19,3, 17,95, 17,92, 17,7, 16,4,
16,2; RMN ^{19}F (CDCl_{3}) \delta - 82,1, -82,13 (s,
CF_{3}), -121,22, -123,06 (cuartete AB J=296 Hz, CF_{2}) y
-121,28, -122,86 (cuartete AB, J=301 Hz, CF_{2}); MS (Cl/CH_{4})
m/z (intensidad relativa) 691 (MH+), 631, 472, 444, 389, 375
(100), 349, 318, 317, 289, 264, 225, 218, 128, 100. Anal Calcd. para
C_{31}H_{39}F_{5}N_{4}O_{8}: C, 53,91; H, 5,69; N, 8,11.
Encontrado: C, 54,40; H, 5,79; N, 8,15.
Se burbujeó HCl (g) durante 2 min en una solución
enfriada con hielo de
t-butiloxicarbonil-O-bencil-L-hidroxiprolina
(5,0 g, 15,6 mmol) en EtOAc (30 mL). La reacción entonces se tapó,
se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y se concentró in
vacuo para proporcionar un sólido blanco que se trituró con éter
y se secó bajo vacío para producir el compuesto deseado (3,92 g,
98%), pf 188-190ºC; RMN ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 9,1 (s a, 1H), 7,3 (m, 5H), 4,56 (s, 2H),
4,4-4,2 (m, 2H), 3,6-3,38 (m, 3H),
2,6-2,58 (m, 1H); m/z (intensidad rel) 262
(M++C_{3}H_{5}), 250 (M++C_{2}H_{5}), 222 (MH+, 100), 176,
130, 107, 91, 85, 69.
El producto del ejemplo 1 (a) (3,14 g, 10 mmol)
se añadió a una solución agitada de sal clorhidrato de
trans-4-benciloxi-L-prolina
(2,57 g, 10 mmol) y Et_{3}N (3,0 mL, 22 mmol) en DMF y la
reacción se calentó a 80ºC durante 1,5 h. Sobre enfriamiento, la
reacción se concentró in vacuo y el residuo aceitoso se
disolvió en EtOAc y se lavó con HCl 3N (2 x 30 mL), H_{2}O (2 x
10 mL), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. para dar el
compuesto deseado (1,8 g, 42%). La cristalización (EtOAc/hexano)
proporcionó un sólido blanco: pf 125-1280º; RMN
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,0 (s a, 1H),
7,4-7,2 (m, 5H), 5,35 (d, 1H, J=9,2 Hz, NH), 4,65
(m, 1H), 4,52 (m, 2H), 3,70 (m, 1H), 2,5-1,8 (serie
de m, 3H), 1,44 (s, 9H, tBu), 0,98 (d, 3H, J=6,8 Hz, CH_{3}), 0,92
(d, 3H, J=6,8 Hz, CH_{3}).
Se añadió isobutilcloroformato (0,43 mL, 3,30
mmol) en gotas a una solución agitada del producto del ejemplo 5
(b) (1,40 g, 3,30 mmol) y NMM (0,36 mL, 3,30 mmol) en
CH_{2}Cl_{2} seco (20 mL) a -20ºC bajo nitrógeno. Después de 20
min, se añadió clorhidrato de
4-amino-1,1,1,2,2-pentafluoro-5-metil-3-hexanona
(840 mg, 3,30 mmol), inmediatamente seguido por otro equivalente de
NMM (0,36 mL, 3,30 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -20ºC
durante 1 h, entonces se dejó calentar a temperatura ambiente y se
vertió en HCl diluido frío y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. El
extracto orgánico se lavó con agua, NaHCO_{3} acuoso diluido,
salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró in
vacuo para producir el compuesto deseado (2,0 g, 95%) como un
sólido blanco: pf 91-93ºC; RMN ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 7,96 (.5H, NH), 7,33 (m, 5H), 5,28 (m, 1H,
NH), 4,95 (m, 1H), 4,83 (m, 1H), 4,70 (t, .5H), 4,54 (q, 2H,
CH_{2}Ph), 4,30 (m, 2H), 4,07-3,9 (m, 1H), 3,60
(m, 1H), 2,68 (dt, .5H), 2,33 (m, 1H), 2,2-1,88 (m,
3H), 1,44 (s, 9H, tBu), 1,09-0,86 (m, 12H, 4 x
CH_{3}).
Se burbujeó gas HCl en una solución agitada del
producto de ejemplo 5 (c) (330 mg, 0,53 mmol) en EtOAc (10 mL) a
temperatura de baño de hielo durante 2 min. La reacción se agitó
entonces a temperatura ambiente durante 1 h, se concentró in
vacuo y se azeotropó con EtOAc para dar el compuesto deseado
(240 mg, 81%) como una espuma blanca: RMN ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 8,22 (m, 2H, NH_{2}), 7,33 (m, 5H), 5,04 (c
app, 1H), 4,88 (cd, 1H), 4,52 (c, 2H, CH_{2}Ph), 4,33 (m, 1H),
4,0-3,8 (series de m, 4H), 2,42-2,1
(m, 4H), 1,09-0,86 (m, 12H, 4 x CH_{3}).
Se añadió cloruro de tionilo (0,15 mL, 1,90 mmol)
a una suspensión agitada de ácido
4-(4-morfolinilcarbonil)benzoico (280 mg,
1,90 mmol) y cloruro de benciltrietilamonio (2 mg, 0,004 mmol) en
1,2-dicloroetano (20 mL) y la reacción se calentó a
reflujo. Después de 2 h, la reacción se dejó enfriar a temperatura
ambiente y se concentró in vacuo. El residuo entonces se azeotropó
con CCl_{4} y se puso bajo vacío para dar cloruro de ácido
morfolinotereftálico (cuantitativo) como un aceite naranja claro que
se usó sin purificación adicional. En un matraz RB a parte, se
enfrió a -20ºC una solución agitada del producto del ejemplo 5 (d)
(558 mg, 1,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (15 mL). Se añadió NMM
(0,40 mL, 4,0 mmol) e inmediatamente seguido por la adición en gotas
de cloruro de ácido morfolinotereftálico en CH_{2}Cl_{2} (5 mL)
a una tasa como para mantener la temperatura de reacción interna a
-10ºC o menos. Después de que se terminara la adición, la mezcla de
reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 2 h a
temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} (20 mL), se lavó con HCl 1N (2 x 20 mL),
Na2HCO_{3} (2 x 20 mL), salmuera (1 x 20 mL), se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró in vacuo para dar una
espuma cruda que se cromatografió ultrarrápido inmediatamente
(eluida con 1:27 MeOH-CH_{2}Cl_{2}) para dar el
producto deseado (520 mg, 70%) como una espuma blanca; RMN ^{1}H
(300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,84 (dd, 2H, arilo), 7,78 (d, .5H,
NH), 7,45 (dd, 2H, arilo), 7,29 (m, 5H), 7,21 (d, .5H, NH), 6,87 (d,
1H, NH), 4,98 (m, 1H), 4,82 (m, 1H), 4,69 (t, .5H), 4,54 (dc, 2H,
CH_{2}Ph), 4,31 (s a, 1H), 4,08 (dc, 1H),
3,9-3,25 (serie de m, 9H), 2,69 (dt, .5H), 2,46 (dt,
5H), 2,34 (m, 1H), 2,17 (m, 1H), 1,02 (m, 9H, 3 x CH_{3}), 0,89
(m, 3H, CH_{3}); RMN ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 193,1,
172,9, 172,2, 170,7, 170,4, 169,3, 162,2, 138,4, 137,5, 137,4,
135,2, 128,5, 128,4, 128,2, 127,9, 127,8, 127,78, 127,73, 127,71,
127,5, 127,4, 127,3, 119,5, 115,76, 107,1, 106,6, 71,4, 71,2, 66,7,
59,6, 59,4, 58,7, 58,0, 56,0, 52,6, 52,3, 48,14, 48,11, 48,10, 48,0,
42,6, 42,57, 42,52, 42,4, 33,5, 32,4, 31,8, 29,1, 28,6, 20,0, 19,8,
19,4, 19,3, 17,8, 17,6, 16,3, 16,1; RMN ^{19}F (CDCl_{3})
\delta -82,10, -82,13 (s, CF_{3}), -121,3, -122,9 y -121,4,
-122,8 (cuartete AB, J=296 Hz, CF_{2}); MS (CI/CH_{4}) m/z
(intensidad rel) 767 (M++29), 740 (10), 739 (MH+,27),
632(11), 520 (7), 492 (5), 424 (18), 423 (100), 403 (3), 345
(5), 317 (30), 289 (4), 218 (3), 176 (11), 91 (2). Anal Calcd. para
C_{36}H_{43}F_{5}N_{4}O_{7}\cdot0.4H_{2}O: C, 57,95; H,
5,92; N, 7,54. Encontrado: C, 58,10; H, 5,84; N, 7,49.
Una mezcla de 288,0 g (1,11 mol) de
Boc-Val ácido
N-metil-O-metil
hidroxámico y 4,7 L de Et_{2}O anhidro se cargó en un matraz de 12
L y 3 cuellos equipado con un agitador, termómetro, condensador de
hielo seco, tubo de dispersión de gas y purga de N_{2} continua.
La solución resultante se enfrió a -60ºC hasta -65ºC. Se añadieron
un total de 885,2 g (3,60 mol) de C_{2}F_{5}I vía tubo de
dispersión de gas durante aproximadamente 30 min a la solución de
Boc- Val ácido
N-metil-O-metil
hidroxámico mientras se mantenía una temperatura de aproximadamente
-65ºC. Inmediatamente tras completar la adición de gas, se
añadieron un total de 2,39 L de CH_{3}Li\cdotLiBr en Et_{2}O
(3,59 mol) durante 1 h manteniendo una temperatura de reacción de
-52ºC a -58ºC. Se formó un precipitado después de que se había
añadido aproximadamente 1/3 del CH_{3}Li\cdotLiBr pero se dio
una solución completa al final de la adición. La solución
resultante se agitó a -52ºC a -58ºC durante 1h. La reacción se
monitorizó por GC (Rt de MDL 101,286=1,3 min, Rt de
Boc-Val ácido
N-metil-O-metil
hidroxámico=5,1 min) y se encontró que contenía 7,2% de
Boc-Val ácido
N-metil-O-metil
hidroxámico. Se añadieron un total de 255 mL (3,47 mol) de acetona
durante aproximadamente 15 min manteniendo una temperatura de
reacción de -52ºC hasta -58ºC y la mezcla resultante se agitó
durante 10 min. La mezcla se interrumpió en un matraz de 22 L que
contenía 4,7L de KHSO_{4} 0,75 M que se había enfriado hasta
aproximadamente 0ºC. La capa orgánica se separó y se lavó con 3L de
H_{2}O. La capa orgánica se secó usando 500 g de MgSO_{4} y se
filtró para retirar el agente secante. El filtrado se concentró a
40ºC/100 torr a un semi-sólido que pesó 409 g. El
material crudo se disolvió en 1,2 L de hexano a 45ºC y se enfrió
lentamente durante aproximadamente 30 min a -25ºC hasta -30ºC. El
sólido que cristalizó se filtró y se lavó con 250 mL de hexano a
-30ºC. El MDL 101,286 obtenido se secó a vacío (25ºC/100 torr) para
dar 176,7 g. El filtrado se concentró a 35ºC/100 torr a un residuo
que pesó 153,5 g. El material se puso en un aparato de destilación
Kugelrohr y se acumuló un precursor a 40ºC/0,6 torr. Se cambió el
recipiente y se acumuló un total de 100,5 g de MDL 101,286 crudo a
40ºC-60ºC/0,6 torr. El producto crudo se disolvió en
500 mL de hexano a aproximadamente 50ºC. La solución resultante se
enfrió a -30ºC. El sólido que cristalizó se filtró y se lavó con
100 mL de hexano frío (-30ºC). El producto se secó a vacío a
25ºC/100 torr para dar otros 68,0 g de MDL 101,286 para una
producción total de 244,7 g (70% rendimiento) que fue 99.9% puro
por GC.
Anal. Calcd. para C_{12}H_{18}F_{5}NO_{3}
(319,28): C, 45,14, H, 5,68, N, 4,39; Encontrado: C, 45,30, 45,49,
H, 5,50, 5,58, N, 4,26, 4,35.
En una forma de realización adicional, la
presente invención proporciona un método para el tratamiento de un
paciente que está aquejado de una enfermedad inflamatoria asociada a
neutrófilo que comprende la administración al mismo de una cantidad
terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I. El término
"enfermedad inflamatoria asociada a neutrófilo" se refiere a
enfermedades o dolencias caracterizadas por la migración de
neutrófilos al lugar de inflamación y su participación en la
degradación proteolítica de matrices biológicas. Las enfermedades
inflamatorias asociadas a neutrófilo para las que el tratamiento
con un compuesto de fórmula I será particularmente útil incluyen:
enfisema, fibrosis quística, síndrome de dificultad respiratoria
adulto, septicemia, coagulación intravascular diseminada, gota,
artritis reumatoide, bronquitis crónica y enfermedad inflamatoria
del intestino. Los compuestos de fórmula I que se prefieren
particularmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias
asociadas a neutrófilos incluyen:
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-L-2-acetamida;
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-D,L-2-pipecolinamida;
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-trans-4-hidroxiprolinamida;
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-trans-4-acetoxiprolinamida;
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-trans-4-benciloxiprolinamida.
Tal y como se usa en la presente invención, el
término "paciente" se refiere a un animal de sangre caliente
como un mamífero que está aquejado de un estado de enfermedad
inflamatoria particular. Se entiende que son ejemplos de animales
dentro del alcance del significado del término los cerdos de Guinea,
perros, gatos, ratas, ratones, caballos, ganado, ovejas, y
humanos.
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, en
administración de dosis única o múltiple al paciente, en
proporcionar alivio de los síntomas asociados con enfermedades
inflamatorias asociadas a neutrófilos. Tal y como se usa en la
presente invención, "alivio de los síntomas" de una enfermedad
respiratoria se refiere a una disminución en la gravedad sobre lo
esperado en la ausencia del tratamiento y no necesariamente indica
una eliminación total o cura de la enfermedad. Se consideran varios
factores por el diagnosticador que atiende al determinar la
cantidad o dosis terapéuticamente eficaz, incluyendo, pero no
limitados a: las especies de mamífero; su tamaño, edad, y salud
general; la enfermedad específica involucrada; el grado o
involucración de la gravedad de la enfermedad; la respuesta del
paciente individual; el compuesto particular administrado; el modo
de administración; las características de bioaccesibilidad de la
preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; el uso
de medicación concomitante; y otra circunstancias relevantes.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
compuesto de fórmula I se espera que varíe desde aproximadamente
0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal por día (mg/kg/día)
hasta aproximadamente 100 mg/kg/día. Las cantidades preferidas se
espera que varíen desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 10
mg/kg/día.
Los compuestos de esta invención son inhibidores
de la elastasa muy potentes, particularmente de la elastasa
neutrófila humana. Se cree que los compuestos de esta invención
ejercen su efecto inhibitorio a través de la inhibición de la enzima
elastasa y por ello proporcionan alivio para las enfermedades
mediadas por la elastasa que incluyen pero no se limitan a
enfisema, fibrosis quística, síndrome de dificultad respiratoria
adulto, septicemia, coagulación intravascular diseminada, gota y
artritis reumatoide. Sin embargo, se entiende que la presente
invención no se limita por ninguna teoría particular o mecanismo
propuesto para explicar su eficacia en una aplicación de uso
final.
Al llevar a cabo el tratamiento de un paciente
que está aquejado de un estado de enfermedad descrito
anteriormente, se puede administrar un compuesto de fórmula I en
cualquier forma o modo que haga el compuesto bioaccesible en
cantidades eficaces, incluyendo rutas por vía oral, aerosol, y
parenterales. Por ejemplo, los compuestos de fórmula I se pueden
administrar por vía oral, por aerosolización, subcutáneamente,
intramuscularmente, intravenosamente, transdérmicamente,
intranasalmente, rectalmente, tópicamente, y formas similares. Se
prefiere generalmente la administración por vía oral o aerosol. Uno
experimentado en la técnica de preparar formulaciones puede
seleccionar fácilmente la forma y modo adecuado de administración
dependiendo de las características particulares del compuesto
seleccionado, del estado de enfermedad que se va a tratar, de la
fase de la enfermedad, y otras circunstancias relevantes.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, Mack Publishing
Co. (1990).
Los compuestos se pueden administrar solos o en
la forma de una composición farmacéutica en combinación con
vehículos o excipientes aceptables farmacéuticamente, proporción y
naturaleza de los cuales se determina por la solubilidad y
propiedades químicas del compuesto seleccionado, la ruta de
administración elegida, y la práctica farmacéutica estándar. Los
compuestos de la invención, aunque son eficaces por sí mismos,
pueden formularse y administrarse en la forma de sus sales
farmacéuticamente aceptables, como por ejemplo, sales de adición
ácida, para fines de estabilidad, conveniencia de cristalización,
solubilidad aumentada y similares.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona composiciones que comprenden un compuesto de
fórmula I en mezcla o de otra forma en asociación con uno o más
vehículos inertes. Estas composiciones son útiles, por ejemplo, como
patrones de ensayo, como medios oportunos de realizar envíos de
cantidades, o como composiciones farmacéuticas. Una cantidad
ensayable de un compuesto de fórmula I es una cantidad que es
fácilmente medible por procedimientos de ensayo patrones y técnicas
como son las bien conocidas y apreciadas por aquellos experimentados
en la materia. Las cantidades ensayables de un compuesto de fórmula
I generalmente variarán desde aproximadamente el 0,001% hasta
aproximadamente el 75% de la composición en peso. Los vehículos
inertes pueden ser cualquier material que no degrade o de otra
manera reaccione covalentemente con un compuesto de fórmula I. Son
ejemplos de vehículos inertes adecuados el agua; tampones acuosos,
como aquellos que son generalmente útiles en análisis de
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC), solventes
orgánicos, como acetonitrilo, acetato de etilo, hexano y similares;
y vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Más particularmente, la presente invención
proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I en mezcla o de
otra manera en asociación con uno o más vehículos o excipientes
farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas se preparan de un
modo bien conocido en la materia farmacéutica. El vehículo o
excipiente puede ser un material sólido, semi sólido, o líquido que
puede servir como vehículo o medio para el ingrediente activo. Los
vehículos o excipientes adecuados son bien conocidos en la materia.
La composición farmacéutica puede adaptarse para uso oral,
parenteral o tópico y puede administrarse al paciente en forma de
comprimidos, cápsulas, supositorios, solución, suspensiones, o
similares.
Los compuestos de la presente invención pueden
administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o
con un vehículo comestible. Pueden ir dentro de cápsulas de
gelatina o comprimidos en comprimidos. Para el fin de administración
terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar a excipientes
y usarse en forma de comprimidos, troqueles, cápsulas, elixires,
suspensiones, siropes, galletas de barquillo, chicles y similares.
Estas preparaciones deberían contener por lo menos el 4% del
compuesto de la invención, el ingrediente activo, pero puede
variarse dependiendo de la forma particular y puede estar
convenientemente entre el 4% hasta aproximadamente el 70% del peso
de la unidad. La cantidad de compuesto presente en composiciones es
tal que se obtendrá una dosis adecuada. Las composiciones y
preparaciones preferidas según la presente invención se preparan de
forma que una unidad de dosis oral contiene entre
5,0-300 miligramos de un compuesto de la
invención.
Los comprimidos, píldoras, cápsulas, troqueles y
similares pueden también contener uno o más de los siguientes
adyuvantes: aglutinantes como celulosa microcristalina, tragacanto
de goma o gelatina; excipientes como almidón o lactosa, agentes
desintegrantes como ácido algínico, primogel, almidón de maíz y
similares; lubricantes como estearato de magnesio o Esterotex;
deslizantes como dióxido de silicona coloidal; y pueden añadirse
agentes endulzantes como sacarosa o sacarina o un agente
saborizante como pipermint, salicilato de metilo, o saborizante de
naranja. Cuando la forma de unidad de dosis es una cápsula, puede
contener, además de los materiales de los tipos anteriores, un
vehículo líquido como polietilenglicol o aceite graso. Otras formas
de unidad de dosis pueden contener otros materiales diversos que
modifican la forma física de la unidad de dosis, por ejemplo, como
cobertores. Así, comprimidos o píldoras pueden cubrirse con azúcar,
shellac, u otros agentes cobertores entéricos. Un sirope puede
contener, además de los compuestos presentes, sacarosa como agente
endulzante y ciertos conservantes, tintes y colorantes y
sabores.
Los materiales usados para preparar estas
diversas composiciones deberían ser farmacéuticamente puros y no
tóxicos en las cantidades usadas.
Para el fin de administración terapéutica
parenteral, los compuestos de la presente invención pueden
incorporarse a una solución o suspensión. Estas preparaciones
deberían contener al menos el 0,1% de un compuesto de la invención
pero puede variarse para estar entre el 0,1 y aproximadamente el 50%
del peso del mismo. La cantidad del compuesto inventivo presente en
dichas composiciones es tal que se obtendrá una dosis adecuada. Las
composiciones y preparaciones preferidas según la presente
invención se preparan de tal forma que una unidad de dosis
parenteral contiene entre 5,0 y 100 miligramos de compuesto de la
invención.
Los compuestos de fórmula I de la presente
invención pueden también administrarse por aerosol. El término
aerosol se usa para indicar una variedad de sistemas que van desde
aquellos de naturaleza coloidal hasta sistemas que consisten en
paquetes presurizados. El suministro puede ser por un gas licuado o
comprimido o por un sistema de bombeo adecuado que dispense los
ingredientes activos. Los aerosoles de compuestos de fórmula I
pueden suministrarse en sistemas de una sola fase, bifásicos, o
trifásicos para suministrar el ingrediente activo. El suministro
del aerosol incluye el recipiente necesario, activadores, válvulas,
subrecipientes, y similares. Los aerosoles preferidos pueden
determinarse por uno experimentado en la materia.
Los compuestos de fórmula I de esta invención
pueden también administrarse tópicamente, y cuando se hace así el
vehículo puede comprender adecuadamente una solución, ungüento o
base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender una o más de
las siguientes: petrolatum, lanilina, polietilenglicoles, cera de
abeja, aceite mineral, diluyentes como agua y alcohol, y
emulsionantes y estabilizantes. Las formulaciones tópicas pueden
contener una concentración de la fórmula I o su sal
farmacéuticamente aceptable desde aproximadamente el 0,1 hasta
aproximadamente el 10% peso/volumen (peso por unidad de
volumen).
Las soluciones o suspensiones pueden también
incluir uno o más de los adyuvantes siguientes: diluyentes estériles
como agua para inyección, solución salina, aceites fijados,
polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes
sintéticos; agentes antibacterianos como bencil alcohol o
metilparabeno; antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito de
sodio; agentes quelantes como ácido etilen diaminotetraacético;
tampones como acetatos, citratos, o fosfatos y agentes para el
ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. La
preparación parenteral puede ir dentro de ampollas, jeringas
desechables o viales de dosis múltiple hechos de cristal o
plástico.
La elastasa neutrófila humana se ensayó in
vitro usando como sustrato,
N-MeOsuc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida,
accesible comercialmente. El tampón de ensayo, el pH y las técnicas
de ensayo son similares a las descritas por Mehdí, y col.,
Biochemical and Biophisical Research Communications, 166, 595
(1990). La enzima se purificó de esputo humano, a pesar de que
recientemente se ha hecho accesible comercialmente. La
caracterización cinética de inhibidores inmediatos es por medio del
diagrama Dixon, mientras que la caracterización de inhibidores de
unión lenta y/o fuerte usó técnicas de análisis de datos revisadas
por Williams y Morrison. La síntesis y uso analítico de un sustrato
de elastasa altamente sensible y adecuado se describe en J. Bieth,
B. Spiess y C. G. Wermuth, Biochemical Medicine, 11 (1974)
350-375. La tabla 2 resume la capacidad de
compuestos seleccionados de esta invención para inhibir la
elastasa.
| MDL# | P_{2} | K_{i}(nM)* |
| 104.235 |
| MDL# | P_{2} | K_{i}(nM)* |
| 105.683 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MARION MERREL DOW INC.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2110 E. GALBRAITH ROAD
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: CINCINNATI
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: OHIO
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMÉRICA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 45215
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 513-948-7961
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 214320
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS INHIBIDORES DE LA ELASTASA
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentin Release #1,0 Version #1,30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Xaa}
Claims (15)
1. Un compuesto de la fórmula
(I)(SEC ID Nº 1)
o un hidrato o una sal farmacéuticamente
aceptable del mismo en la que
P_{4} es Ala, bAla, Leu, Ile, Val, Nva, bVal,
Nle o un enlace;
P_{3} es Ala, bAla, Leu, Ile, Val, Nva, bVal,
Nle, o Lys sustituida en su grupo amino epsilon con un grupo
morfolino-B;
P_{2} es
Pro(4-OBzl);
R_{1} es una cadena lateral de Ala, Leu, Ile,
Val, Nva o bVal;
K es
o
en la
que
Z es N o CH, y
B es un grupo de las fórmulas
y en la que R' es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6}.
2. Un compuesto de la reivindicación 1 en el que
R_{1} es -CH(CH_{3})_{2} o
-CH_{2}CH_{2}CH_{3}.
3. Un compuesto de la reivindicación 2 en el que
K es
en el
que
Z es N y B es un grupo de las fórmulas
y en el que R' es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6}.
4. Un compuesto de la reivindicación 3 en el que
P_{3} es Ile, Val o Ala.
5. Un compuesto de la reivindicación 4 en el que
P_{4} es Ala o un enlace.
6. Un compuesto de la reivindicación 5 en el que
R_{1} es -CH(CH_{3})_{2}.
7. Un compuesto de la reivindicación 6 en el que
K es
y en el
que
Z es N y B es un grupo de las fórmulas
y en el que R' es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1-6} es particularmente
preferido.
8. Un compuesto de la reivindicación 7 en el que
P_{3} es Val.
9. Un compuesto de la reivindicación 8 en el que
P_{4} es un enlace.
10. Un compuesto según la reivindicación 1 en el
que el compuesto es
N-[4-(4-morfolinilcarbonil)benzoil]-L-valil-N'-[3,3,4,4,4-pentafluoro
-1-(1-metiletil)-2-oxobutil]-trans-4-benciloxiprolinamida.
11. Una composición que comprende un compuesto de
la reivindicación 1 y un vehículo.
12. Una composición farmacéutica que comprende un
compuesto de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
13. Uso de un compuesto como en una de las
reivindicaciones 1-10, opcionalmente en combinación
con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de
un inhibidor de la elastasa neutrófila humana.
14. Uso de un compuesto como en una de las
reivindicaciones 1-10, opcionalmente en combinación
con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de
una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad
inflamatoria asociada a neutrófilo.
15. Uso de un compuesto como en una de las
reivindicaciones 1-10, opcionalmente en combinación
con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de
una composición farmacéutica para el tratamiento de enfisema.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25279994A | 1994-06-02 | 1994-06-02 | |
| US252799 | 1994-06-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2199992T3 true ES2199992T3 (es) | 2004-03-01 |
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ID=22957608
Family Applications (1)
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