ES2200057T3 - Uso de lactobacillus como adhesivo epitelial. - Google Patents

Uso de lactobacillus como adhesivo epitelial.

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ES2200057T3 ES96908428T ES96908428T ES2200057T3 ES 2200057 T3 ES2200057 T3 ES 2200057T3 ES 96908428 T ES96908428 T ES 96908428T ES 96908428 T ES96908428 T ES 96908428T ES 2200057 T3 ES2200057 T3 ES 2200057T3
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Siv Ahrne
Bengt Jeppsson
Marie-Louise Johansson
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE LACTOBACILUS PLANTARUM QUE POSEEN UNA ADHESINA ESPECIFICA DE MANOSA PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE INHIBE LA UNION DE BACTERIAS PATOGENAS QUE EXPRESAN ADHESINAS ESPECIFICAS DE MANOSA SOBRE LA SUPERFICIE CELULAR EPITELIAL. UNA CEPA DE LACTOBACILUS PLANTARUM QUE PUEDE SER UTILIZADA EN LA INVENCION SE ADHIERE A CUENTAS DE AGAROSA RECUBIERTAS DE D-MANOSA, Y PERTENECE PREFERENTEMENTE A UN GRUPO DE L. PLANTARUM CON MAS DE UN 70 % DE SIMILITUD CON L. PLANTARUM 299 EN TERMINOS DE REA. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO AL USO DE DICHAS CEPAS PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE ES UTILIZADA EN EL TRATAMIENTO CURATIVO Y/O PROFILACTICO DE LA TRANSLOCACION BACTERIANA, GASTROENTERITIS Y OTRAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS PATOGENAS QUE EXPRESAN ADHESINAS ESPECIFICAS DE MANOSA.

Description

Uso de lactobacillus como adhesivo epitelial.
El presente invento se refiere a cepas de Lactobacillus que tienen la propiedad de adherirse a las superficies de las células epiteliales, especialmente en la mucosa intestinal humana, y que se pueden usar como tratamiento profiláctico y/o curativo de las alteraciones bacterianas causadas por bacterias patógenas que se adhieren a las células epiteliales de forma similar.
Antecedentes del invento
Los microorganismos endógenos constituyen uno de los mecanismos principales de defensa que protegen al cuerpo humano y animal contra la invasión bacteriana. Los pacientes inmunosuprimidos, tratados con antibióticos y alimentados parenteralmente se encuentran con el riesgo de contraer enfermedades infecciosas como la sepsis, la meningitis o infecciones del tracto urinario producidas por la expansión de bacterias derivadas principalmente de la población fecal normal. Un mecanismo detrás de este proceso puede ser la translocación bacteriana, que se define como el paso de bacterias viables del tracto gastrointestinal a los nódulos linfáticos mesentéricos y a otros órganos.
El envenenamiento de la sangre, sepsis, continúa siendo una complicación quirúrgica muy común en relación con la cirugía abdominal que causa una gran proporción de muertes. Las bacterias o los productos bacterianos pueden atravesar la pared intestinal que funciona mal e infectar o inducir el funcionamiento defectuoso de otros órganos como los pulmones, el hígado, el corazón, etc., y todo ello conduce a una disfunción múltiple de los órganos, que se conoce como enfermedad de cuidados intensivos (intensive-care-disease). Estos pacientes son todavía hoy día tratados mediante la administración de antibióticos y tratamiento quirúrgico del absceso hasta el punto que pueda ser localizado. En la actualidad se administran convencionalmente antibióticos antes de una intervención quirúrgica del intestino para reducir así el riesgo de infecciones postoperatorias y de enfermedades causadas por eso. Sin embargo, el tratamiento con antibióticos está asociado con la destrucción de la flora intestinal normal y con la proliferación de bacterias aún más patógenas.
Estos descubrimientos han conducido a un interés creciente por conocer las especies microbianas que pueden afectar beneficiosamente al balance microbiano del hospedante, por ejemplo, mediante la producción de componentes antimicrobianos o por crecimiento competitivo. Lactobacillus se encuentra entre las especies más estudiadas y, en ciertas ocasiones, se ha demostrado que contrarresta la proliferación de patógenos.
Las bacterias que residen en el intestino pueden provocar enfermedades en el hospedante colonizado tales como diarrea intestinal o al colonizar secundariamente lugares normalmente estériles, como el tracto urinario producir infección del tracto urinario, o como el torrente sanguíneo causar sepsis.
Las bacterias patógenas difieren de aquellas que no provocan enfermedades por la posesión de los llamados factores de virulencia. Un importante factor de virulencia es la capacidad de adherirse a las moléculas de carbohidratos de los receptores de las células del hospedante. Esta es una etapa importante, tanto porque facilita la colonización como porque facilita la liberación de toxinas y otras sustancias que producen inflamación en las proximidades de las células hospedantes. Si estas sustancias tóxicas son liberadas por una bacteria adherente alcanzan unas concentraciones locales muy superiores a las que alcanzarían si fueran secretadas, por ejemplo, por bacterias que residen en el lumen intestinal.
Las bacterias que causan infección del tracto urinario incluyen Escherichia coli, Enterobacter, Klebsiella y Proteus, todas ellas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. La mayoría de estas bacterias posee fimbrias tipo 1 que les confiere la capacidad de adherirse a los receptores que contienen manosa, por ejemplo las células del epitelio vaginal humana, y a la proteína Tamm-Horsefall, proteína de la mucosa urinaria. Las fimbrias tipo 1 se han mostrado un factor de virulencia en la cistitis, lo que puede depender tanto de un aumento en la capacidad de ascender por el tracto urinario que le confiere su unión a las células del epitelio vaginal y periuretral, como de un aumento del efecto irritante causado por la unión a las células epiteliales en el tracto urinario. [De este modo, sólo las bacterias con fimbrias tipo 1 fueron capaces de inducir una respuesta citoquina, es decir inflamación, en células del epitelio urinario de cultivo.]
Las bacterias que causan diarrea incluyen Salmonella y Shigella, pero la proliferación intestinal de Klebsiella o Enterobacter también se ha asociado con diarrea en lactantes de corta edad. Se ha mostrado en ratón que las fimbrias tipo 1 son un factor de virulencia para la enfermedad diarréica causada por Salmonella. Es también probable que las fimbrias tipo 1 faciliten también la colonización de otras bacterias e intensifiquen la liberación de sustancias tóxicas en las proximidades del epitelio, causando por tanto diarrea.
Técnica anterior
El documento EP-A2-0 199 535 describe un cultivo biológicamente puro de Lactobacillus acidophilus, nº de acceso ATCC 53 103, aislado a partir de heces humanas, que es capaz de adherirse a las células de la mucosa en ensayos efectuados in vitro. L. acidophilus consigue su paso a través de la parte alta de la pared del tracto gastrointestinal. Sin embargo, no se ha demostrado su adherencia in vivo.
El documento WO 89/05849 describe bacterias del ácido láctico aisladas del tracto gastrointestinal en cerdos y seleccionadas gracias a, entre otras, su adherencia a las células del epitelio gastrointestinal de cerdo in vitro y su tolerancia al ácido y la bilis. Dichas bacterias pueden usarse para la fermentación de la leche que puede entonces administrarse a las crías de cerdo para prevenir o tratar entre otras la diarrea de E. coli.
El documento WO 93/01823 alude a un procedimiento para aislar cepas de Lactobacillus con la capacidad de establecerse in vivo en la mucosa intestinal humana y de permanecer allí después de su administración oral durante al menos 10 días. Dicha aplicación hace referencia especialmente a dos nuevas cepas de Lactobacillus, las cuales se encuentran depositadas el 2 de Julio de 1991 y según el Acuerdo de Budapest en el DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -, Braunschweig, Alemania, esto es
Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595
Lactobacillus casei ssp. rhamnosus 271 DSM 6594
así como a sus variantes que se usan en la profilaxis o tratamiento de las infecciones bacterianas del tracto gastrointestinal, especialmente sustituyendo a antibióticos en relación con las operaciones quirúrgicas.
El documento SE 463 598 alude a un preparado para incrementar la adherencia de las bacterias al tracto gastrointestinal; tal preparado se dice que contiene una proteína promotora de la adhesión, llamada adhesina, que se obtiene del Lactobacillus.
El documento WO 90/09398 alude a productos que inhiben la adhesión, crecimiento y/o supervivencia de patógenos. Dichos productos son metabolitos de Lactobacillus que inhiben a patógenos tales como cepas de Escherichia coli, Clostridium, Salmonella, Campylobacter y Streptococcus.
El documento WO 93/09793 alude a composiciones de Lactobacillus y leche descremada y a métodos para la prevención de infecciones urogenitales microbianas. El invento se relaciona particularmente con la capacidad de ciertas cepas de Lactobacillus hidrofóbicas o hidrofílicas para adherirse a las células uroepiteliales y resistir la acción de ciertos agentes antimicrobianos, lo que previene infecciones urogenitales. El mecanismo de adherencia que se describe involucra interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas entre adhesiones de la pared celular de naturaleza no protéica en Lactobacillus y adhesiones protéicas de los sobrenadantes circundantes.
Descripción de la invención
Sorprendentemente se ha encontrado ahora que ciertas cepas de Lactobacillus se adhieren a bolas de agarosa recubiertas de D-manosa; tal capacidad se correlaciona con su capacidad de aglutinar eritrocitos de un modo sensible a manosa, así como con su capacidad de adherirse a la línea celular epitelial del colon humano HT-29 de manera inhibible por metil-alfa-D-manósido. El tratamiento con peryodato de estas células HT-29 suprime su adherencia sensible a la manosa lo que confirma que el receptor de unión a la célula tenía naturaleza de carbohidrato. Tratamientos de la bacteria con proteinasa K también suprimen la adherencia, lo que indica que esta unión compromete a estructuras protéicas de la superficie celular bacteriana. Por tanto, se cree que la adhesina, que es la parte adhesiva de Lactobacillus, se adhiere a receptores que contienen manosa de la superficie de células epiteliales. Esta adherencia parece estar relacionada con la capacidad de estas bacterias para contrarrestar a bacterias patógenas y estimular los mecanismos de defensa del hospedante.
En particular esta adherencia origina una capacidad de disminuir la traslocación de bacterias patógenas o potencialmente patógenas a lo largo del epitelio intestinal intacto, al inhibir la adherencia de bacterias potencialmente patógenas directamente a la superficie de la célula epitelial, reduciendo por tanto su capacidad de liberar sustancias tóxicas e inflamatorias a la mucosa y de disminuir el daño inflamatorio intestinal causado por irritantes no específicos al crearse un microambiente favorable para la reconstrucción de la mucosa. Una estrecha asociación con las células del epitelio puede también aumentar la capacidad de la bacteria para interaccionar con el sistema inmune. Estas cepas de Lactobacillus pueden, por ejemplo, desencadenar la activación de fagocitos y estimular a las células presentadoras de antígenos lo que intensifica la inmunidad.
La presente invención está basada en el uso de Lactobacillus plantarum que tiene una adhesina específica de manosa para la preparación de una composición farmacéutica que inhibe la unión de bacterias patógenas que expresan adhesinas específicas de manosa a la superficie de células epiteliales. Con esto su capacidad de invadir o liberar sustancias tóxicas y que producen inflamación en la mucosa se reducirá.
Las adhesinas específicas de manosa se han descrito diversas bacterias Gram-negativas, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae, como especies de E. coli, Klebsiella, Shigella y Salmonella y Pseudomonas echinoides, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus.
El receptor óptimo para la adhesina específica de manosa de E. coli se ha descrito y se sabe que contiene la secuencia manosa-alfa1-4manosa\beta que se da en las glicoproteínas de mamíferos. La estructura exacta del receptor de las adhesinas específicas de manosa de otras especies enterobacterianas no se ha descrito aún, como tampoco se ha descrito la estructura del receptor de la adhesina específica de manosa de las cepas de Lactobacillus plantarum. Se cree, sin embargo, que el receptor debiera tener una secuencia Man-alfa1-2Man. Es posible que L. plantarum específica de manosa tenga un efecto inhibitorio más pronunciado en bacterias que se unen a los receptores que contienen manosa comparado con su efecto en bacterias que se unen a otras estructuras de receptor.
El invento alude al empleo de Lactobacillus plantarum 299v, número de déposito DSM 9843, que tiene adhesina específica de manosa así como capacidad para colonizar la mucosa intestinal humana, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la infección del tracto urinario al inhibir la adherencia de las bacterias patógenas que expresan fimbrias tipo 1, especialmente bacterias pertenecientes a Klebsiella, Enterobacter, Proteus o Escherichia coli, a las células del epitelio uretral humanas.
Cepas de Lactobacillus plantarum relacionadas son:
Lactobacillus plantarum 299 DSM 6595
Lactobacillus plantarum 79
Lactobacillus plantarum 105
Lactobacillus plantarum 107
El invento también alude al empleo de Lactobacillus plantarum 299v, número de depósito DSM 9843, en combinación con un vehículo convencional para la preparación de una composicion farmacéutica que inhibe la unión de bacterias patógenas que expresan adhesinas específicas de manosa a la superficie de células epiteliales para el tratamiento profiláctico o curativo de alteraciones bacterianas.
Dos factores parecen cruciales en el ejercicio de estos efectos ecológicos de Lactobacilli. El primero es la capacidad de colonizar el intestino, esto es sobrevivir en gran número por un período de tiempo después de la última administración de bacterias vivas. Esta propiedad puede ser importante para la capacidad de Lactobacilli para suprimir el crecimiento y la proliferación de bacterias patógenas, pero no suficiente. El segundo es la capacidad de unirse directamente a células del epitelio intestinal. Este puede ser uno de los factores que promueva la colonización, pero no es un requisito previo para la colonización. La capacidad de adherirse al epitelio no garantiza que la cepa sea capaz de colonizar.
Las bacterias entéricas patógenas que expresan fimbrias tipo 1 específico de manosa pertenecen especialmente a las subespecies (spp.) de Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Salmonella y Shigella, como por ejemplo, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium y Shigella flexneri y Escherichia coli.
La capacidad para adherirse directamente a las células epiteliales puede ser importante para las cepas de Lactobacillus para disminuir la translocación y la inducción de inflamación de la mucosa por las bacterias patógenas, dado que Lactobacilli ocupa un nicho ecológico cercano al epitelio. Una estrecha asociación con el epitelio también facilita que Lactobacilli cambie el microambiente, lo que afecta directamente a las células del epitelio intestinal, y por tanto, promueve la reparación tras el daño causado por agentes irritantes.
Los vehículos convencionales para una composición farmacéutica para el tratamiento profiláctico o curativo de alteraciones bacterianas en el intestino son, por ejemplo, sustratos aceptables fisiológicamente fermentados por las bacterias en cuestión, así como productos alimenticios de diversos tipos, especialmente aquellos basados en almidón o leche, pero también sustancias sólidas o líquidas inertes, como disolución salina o agua. Un sustrato adecuado debiera contener fibras líquidas o sólidas que no se reabsorben en el tracto gastrointestinal y que cuando fermentan por Lactobacillus forman ácidos carboxílicos. Como ejemplo de sustratos adecuados que contienen almidón pueden mencionarse los cereales tales como avena y trigo, maíz, raíces vegetales como las patatas y ciertas frutas como las bananas verdes.
De acuerdo con el invento un sustrato preferido para la composición, que también aporta a ésta un excelente valor nutricional, es una disolución nutritiva basada en harina de avena, según se describe por ejemplo en el documento WO 89/08405.
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es un dendrograma que muestra la similitud en porcentaje (%) entre diferentes cepas analizadas de Lactobacillus que han sido caracterizadas por el método- REA, basado en el coeficiente de correlación del momento del producto Pearson y UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean).
Aislamiento de las cepas de Lactobacillus
Se han obtenido muestras de cepas de Lactobacillus de la mucosa humana. Se obtuvieron biopsias de diferentes partes del colon mediante enteroscopía y fragmentos de la mucosa intestinal del intestino delgado, es decir, del yeyuno e íleon, se extrajeron coincidiendo con operaciones quirúrgicas. Las muestras de mucosa se pusieron inmediatamente en un medio especial (0,9% NaCl, 0,1% peptona, 0,1% Tween 80 y 0,02% cistina; todos los valores se refieren a % en peso/volumen), se homogeneizaron en un baño de ultrasonidos durante 2 minutos y se agitaron durante 1 minuto antes de colocarlas sobre agar Rogosa (Difco Laboratories, Detroit, Michigan EE.UU.). Las placas se incubaron anaeróbicamente a 37ºC durante 2 días (Gas Pak Anaerobic System, BBL). Entre una y tres colonias se tomaron al azar de cada palca, se hicieron crecer en cultivos puros entre 5 y 9 veces sobre agar Rogosa y se guardaron como cultivos densos en un tampón congelado a -80ºC. Merced a este procedimiento se aislaron las cepas Lactobacillus plantarum 299 y 299v, así como 105, 275 y 386; Lactobacillus fermentum 8704:3; Lactobacillus reuteri 108, 8557:1, 8557:3; Lactobacillus rhamnosus 271; Lactobacillus agilis 294. De modo similar se aislaron cepas de Lactobacillus de intestinos de rata y cerdo, esto es Lactobacillus reuteri R2LC y 1063, 1068 y 1044, respectivamente.
También se aislaron cepas de Lactobacillus a partir del ogi o pito nigerianos de la siguiente manera. La muestra original se trató en un baño de ultrasonidos durante 5 minutos y se mezcló por agitación con vórtice durante 2 minutos, se diluyó y después se incubó en agar Rogosa (Difco) durante 3 días a 37ºC. Se analizaron colonias de bacterias escogidas al azar. Por este procedimiento se obtuvieron las cepas de Lactobacillus plantarum 79 y 107, 125, 98, 53, 97M2, 97, 101, 120 y 44.
También se aislaron cepas de Lactobacillus a partir de ensilaje, esto es Lactobacillus plantarum 36E, 256 y ATCC8014. So5 es un cultivo iniciador de Lactobacillus plantarum obtenido por Sockerbolaget, Arlöv y Lactobacillus reuteri BR es la cepa que se emplea comercialmente en leche BRA (BRA-milk, Arla Ekonomisk Förening, Estocolmo, Suecia).
Identificación de las cepas
ATCC 14917^{T} y DSM 20016^{T} son las cepas tipo de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus reuteri, respectivamente. Una cepa tipo define la especie y debe estar marcada con una ``^{T}''. El resto de cepas que presenten una homología DNA:DNA con una cepa tipo particular de más del 70% se dice que pertenecen a esa especie particular.
En International Journal of Systematic Bacteriology (1995) 45:670-675, Johansson, M-L, et al. describen la clasificación de las cepas aisladas por medio de análisis del DNA cromosómico total mediante endonucleasas de restricción. En la huella genética obtenida se forman grupos genéticos o clusters que reflejan esta similaridad en el patrón global de comparación. De acuerdo con este método de análisis las cepas de Lactobacillus plantarum pueden dividirse en diferentes grupos genéticos 1a, 1b, 1c, como puede verse en la Figura 1. Todas las cepas del grupo genético 1c tienen una similaridad con L. plantarum 299 > 50% y las cepas 299v, 107, 105 y 79 tienen una similaridad > 70%.
Las cepas 299 y 299v, ambas aisladas de mucosa intestinal humana sana, se depositaron el 2 de Julio de 1991 y el 16 de Marzo de 1995, respectivamente, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH y se les dió los números de déposito DSM 6595(299) y DSM 9843 (299v).
Identificación fenotípica
Las cepas 299, 299v, 79, 105 y 107 son Gram-positivas, que crecen como bastoncitos catalasa-negativos en agar Rogosa a pH 5,5 y que son capaces de producir ácido láctico a partir de glucosa anaeróbicamente. La capacidad de estas cepas de fermentar distintos carbohidratos se muestra en la Tabla 1. Los análisis se han llevado a cabo mediante el API 50 CH de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Estas cepas pueden identificarse fenotípicamente como Lactobacillus plantarum.
TABLA 1 Patrones de fermentación obtenidos en API 50CH a 30ºC y a 37ºC de las cepas L. plantarum 299, L. plantarum 299v, L. plantarum 107, L. plantarum 105 y L. plantarum 275
L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum
299 299v 107 105 79
30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C
Glicerol - - - - - - - - - -
Eritriol - - - - - - - - - -
D-arabinosa - - - - - - - - - -
L-arabinosa + + + + + + + + + +
Ribosa + + + + + + + + + +
D-xilosa - - - - - - - - - -
L-xilosa - - - - - - - - - -
Adonitol - - - - - - - - - -
\beta-metil-xilósido - - - - - - - - - -
Galactosa + + + + + + + + + +
TABLA 1 (continuación)
L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum L. plantarum
299 299v 107 105 79
30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C 30^{o}C 37^{o}C
D-glucosa + + + + + + + + + +
D-fructosa + + + + + + + + + +
D-manosa + + + + + + + + + +
L-sorbosa - - - - - - - - - -
Ramnosa - - - - - - - - - -
Dulcitol - - - - - - - - - -
Inositol - - - - - - - - - -
Manitol + + + + + + + + + +
Sorbitol + + + + + + + + + +
\alpha-metil-D-manósido + + + + + + + + + +
\alpha-metil-D-glucósido - - - - - - - - - -
N-acetil-glucosamina + + + + + + + + + +
Amigdalina + + + + + + + + + +
Arbutina + + + + + + + + + +
Asculina + + + + + + + + + +
Salicina + + + + + + + + + +
Celobiosa + + + + + + + + + +
Maltosa + + + + + + + + + +
Lactosa + + + + + + + + + +
Melobiosa + + + + + + + + + +
Sacarosa + + + + + + + + + +
Trehalosa + + + + + + + + + +
Insulina - - - - - - - - - -
Melecitosa + + + + + + + + + +
D-rafinosa - - + - + - - - - -
Almidón - - - - - - - - - -
Glucógeno - - - - - - - - - -
Xilitol - - - - - - - - - -
\beta-gentobiosa + + + + + + + + + +
D-turanosa + + + + + + + + + +
D-lixosa - - - - - - - - - -
D-tagarosa - - - - - - - - - -
D-fucosa - - - - - - - - - -
L-fucosa - - - - - - - - - -
D-arabitol - - + - + - + - + -
L-arabitol - - - - - - - - - -
Gluconato + + + + + + + + + +
2-ceto-gluconato - - - - - - - - - -
5-ceto-gluconato - - - - - - - - - -
Perfil plasmídico
Las cepas se analizaron de acuerdo con el método descrito por Chassy et al. (1976) para determinar su contenido en plásmidos. Lactobacillus plantarum 299, 299v, 79 y 105 presentaron perfiles plasmídicos idénticos, es decir, cinco plásmidos de 4, 9, 15, 21 y >30 MDa. Lactobacillus plantarum 107 tenía tres plásmidos de 4, 15 y 21 MDa.
Cultivo de Lactobacillus plantarum 299
-
Se añade un inóculo de un congelador a -80ºC a 50 ml de medio de Lactobacillus (Lactobacillus Carrying Medium, LCM, Efthymiou & Hansen, J. Infect. Dis., 110:258-267, 1962) o de Rogosa,
-
se incuba alrededor de 40 horas a 37ºC,
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se inoculan los 50 ml en 500 ml de LCM,
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se incuban unas 40 horas a 37ºC,
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se inoculan 500 ml en 5 litros,
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se incuban aproximadamente 25-30 horas a 37ºC,
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se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 minutos,
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se lava una vez en disolución salina fisiológica,
-
el sedimento se disuelve en aproximadamente 1 litro de disolución salina fisiológica.
Esta cantidad se estima suficiente para aproximadamente 400-500 litros de gachas de harina de avena. Los medios de cultivos no están optimizados. Rogosa funcionó mejor que LCM, posiblemente debido a su mejor función tamponadora. Se añadió un 2% de glucosa al LCM. El mismo procedimiento de cultivo puede emplearse en la producción de otras cepas de Lactobacillus.
Colonización de Lactobacillus plantarum in vivo
Para evaluar la capacidad de colonizar in vivo se administró a 12 voluntarios sanos 100 ml de gachas de harina de avena líquidas que contenían 8 x 10^{7} CFU/g de cepa liofilizada de Lactobacillus, durante 10 días, según se describe en el documento WO 93/01823. Se encontró Lactobacillus plantarum 299 en posición dominante en la mucosa intestinal 10 días después de finalizada su administración.
En otro ensayo se analizó la capacidad para colonizar de las cepas L. plantarum 105 y 107. Una preparación liofilizada que contenía 1,5 x 10^{9} CFU de cada cepa de prueba se ingirió una vez al día durante 8 días. Se tomaron biopsias del recto un día antes del comienzo de la administración y uno y ocho días después de que se terminase la administración. Además, también se tomaron biopsias del yeyuno. No se reaisló ninguna de las cepas administradas, a partir de placas de Rogosa, ocho días después del final de la administración.
Test de hemaglutinación
Con el fin de investigar si las adhesinas de las cepas de Lactobacillus se asemejaban a las adhesinas de los receptores que contienen manosa dentro de la familia Enterobacteriaceae, por ejemplo las que se encuentran en cepas de E. coli, que a su vez se asocian con fimbrias tipo 1 y median la unión a células epiteliales de colon, se efectuaron análisis de hemaglutinación con eritrocitos de origenes diferentes.
Las bacterias lavadas se suspendieron, 2 x 10^{10}/ml en PBS y suspensiones de bacterias diluidas dos veces se mezclaron en portaobjetos de microscopio con volumenes iguales de suspensiones de eritrocitos al 3% en PBS, o en PBS que contenía 100 mM de metil- alfa-D-manósido. Los portaobjetos se agitaron muy suavemente en intervalos regulares y la aglutinación se leyó 15 minutos después a ojo y mediante el empleo de microscopio de luz brillante a un aumento de 250 x. Se registró como título de aglutinación el valor recíproco de la dilución de suspensión bacteriana más alta que dió aglutinación visible a los 15 minutos.
Las glicoproteínas unidas a membrana de los eritrocitos contienen manosa y E. coli con adhesinas específicas de manosa aglutinó un amplio intervalo de eritrocitos de forma sensible a la manosa.
Las cepas de L. plantarum pertenecientes al grupo genético 1c aglutinaron eritrocitos de seres humanos, conejos de Indias, pollos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, caballos y cerdos, pero más raramente eritrocitos ovinos y bovinos. Con la excepción de los eritrocitos de ovejas y bueyes, las aglutinaciones fueron completamente inhibidas, o muy reducidas por el metil-alfa-D-manósido. Se observó una débil hemaglutinación sensible a manosa en algunas cepas del grupo 1b, mientras que otros grupos genéticos dieron negativo.
La hemaglutinación sensible a manosa (MSHA, mannose-sensitive hemagglutination) de L. plantarum se asemejó mucho a la de E. coli, aunque con algunas diferencias. Así con L. plantarum los eritrocitos de pollo dieron los mayores títulos de MSHA, mientras que los eritrocitos de caballo resultaron una de las especies de eritrocitos menos activas. Sin embargo, en E. coli los eritrocitos de caballo proporcionaron los mayores títulos, incluso ligeramente superiores que los obtenidos para los eritrocitos de pollo. Comparativamente los eritrocitos de los conejillos de Indias mostraron una fuerte actividad de hemaglutinación tanto en L. plantarum como en E. coli, mientras que los eritrocitos humanos fueron de baja actividad en E. coli comparados con los de otras especies, pero comparativamente activos en aglutinación en L. plantarum.
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Adherencia a las células HT-29
Se analizaron varias cepas de Lactobacillus en su capacidad para adherirse a las células del epitelio intestinal de la línea celular HT-29 de carcinoma de colon humano (según método descrito por Wold, A, et al., Infection and Immunity, Oct. 1988, p. 2531-2537). Para ello las células de la línea celular de adenocarcinoma humano HT-29 se cultivaron en medio Eagle suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 50 \mug/ml de gentamicina (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Mo, EE.UU.). Unos días después de que las células alcanzaron la confluencia éstas se despegaron con tampón que contenía EDTA (0,54 mM), se lavaron y se suspendieron en disolución salina balanceada de Hank (HBSS, Hank's balanced salt solution) a 5 x 10^{6}/ml. Las bacterias se recogieron, lavaron y suspendieron en HBSS a 5 x 10^{9}/ml (2 x una densidad óptica de 1,5 a 597 nm). Las células, las bacterias y el HBSS se mezclaron en proporción 1:1:3 y se incubaron con rotación oscilante durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo y se fijaron con formalina tamponada neutra (Histofix, Histolab, Göteborg, Suecia). El número de bacterias unidas a cada una de al menos 40 células se determinó mediante microscopio de contraste de interferencia (aumento de 500 x, Nicon Optophot, con equipo de contraste de interferencia, Bergström Instruments, Göteborg, Suecia) y se calculó el número medio de bacterias por célula. Para analizar la inhibición de la adherencia se incluyó en el ensayo de adherencia 1,5% de varios monosacáridos (glucosa, manosa, metil- alfa-D-manósido). Los resultados se muestran más adelante en la Tabla 2, en la cual los encabezamientos, aparte de cepa y grupo genético, son como sigue:
- HT-29 VH es el valor medio del número de bacterias/célula; el número de experimentos realizados se muestra dentro del paréntesis;
- alfa-metil manósido, manosa y glucosa respectivamente se refieren al valor medio del número de bacterias/célula en presencia de alfa-metil manósido, manosa y glucosa, respectivamente; el número de experimentos realizados se muestra dentro del paréntesis;
- n es el número de valores emparejados que comparan la adherencia en presencia y ausencia de alfa-metil manósido;
- d es la diferencia media en presencia y ausencia de alfa-metil manósido; un valor positivo indica inhibición con el manósido;
- p es el valor p de comparación obtenido del test de la T de Student de los valores emparejados.
TABLA 2
Cepa Grupo HT-29 \alpha-metil manosa glucosa n d p
genérico VH manósido
299v L. plantarum 1c 11,2(9) 5,9(9) 8,3(4) 11,4(6) 9 5,3 0,004
299 L. plantarum 1c 10,7(8) 4,9(8) 11,6(3) 10,6(5) 8 5,8 0,002
79 L. plantarum 1c 11,7(8) 5,7(8) 6,8(3) 10,7(5) 8 5,9 <0,0001
105 L. plantarum 1c 10,8(7) 7,8(7) 9,8(3) 10,3(4) 7 3,0 0,15
107 L. plantarum 1c 10,3(7) 6,9(7) 10,8(2) 15,3(4) 7 3,4 0,01
386 L. plantarum 1c 5,8(4) 4,6(4) 7,0(4) 7,6(4) 4 1,2 0,59
275 L. plantarum 1c 1,6(3) 1,3(3) 2,9(3) 3,1(3) 3 0,3 0,52
36E L. plantarum 1b 6,0(6) 6,6(6) 7,7(2) 3,5(2) 6 - 0,6 0,58
256 L. plantarum 1b 4,9(6) 4,5(6) 7,7(3) 9,8(6) 6 0,4 0,74
125 L. plantarum 1c 8,7 2,9 - - 3 - 0,0036
ATCC14917 L. plantarum 1b 5,6(6) 6,2(3) 1,9(1) 9(1) 3 -0,6 0,70
So5 L. plantarum 1,3(1) 1,6(1) 3,5(1) 2,7(1)
ATCC8014 L. plantarum 4,8(5) 1,0(1) 5,0(1) 5,0(1)
98 L. plantarum 1b 0,2(5) 0(1)
53 L. plantarum 1a 0,4(5) 0(1)
97M2 L. plantarum 6,4(5) 7,7(2) 2 -0,2 0,70
97 L. plantarum 1a 1,2(4) 6,7(1)
101 L. plantarum 1a 0,3(1) 1,0(1) 4,2(1) 3,8(1)
120 L. plantarum 0(4) 0(1)
44 L. plantarum 3,1(1) 6,7(1) 9,7(1) 6,5(1)
8704:3 L. fermentum 2,8(3) 10,9(1)
TABLA 2 (continuación)
Cepa Grupo HT-29 \alpha-metil manosa glucosa n d p
genérico VH manósido
BR L. reuteri 5,3(4) 13,6(1)
106 L. reuteri 0,3(4) 0(1)
1063 L. reuteri 2,5(4) 12,1(1)
1068 L. reuteri 2,2(1) 3,3(1)
1044 L. reuteri 1,7(4) 2,6(2)
M90 L. reuteri 4,0(4) 1,3(1) 2,7(1) 4,0(1)
8557:1 L. reuteri 2,0(4) 4,1(1)
8557:3 L. reuteri 0,8(4) 0,8(1)
DSM20016T L. reuteri 5,0(3) 13,8(1)
R2LC L. reuteri 0(3) 1,15(1) 0,3(1) 0,8(1)
294 L. agilis 0,7(3) 2,4(1)
271 L. rhamnosus 0(2)
A partir de estos resultados puede verse que las primeras cinco cepas de Lactobacillus muestran una fuerte adherencia a las células HT-29 in vitro, la cual es inhibida por el azúcar alfa-metil manósido.
Este test de adherencia se repitió con las cepas de Lactobacillus plantarum y con otras cinco cepas de Escherichia coli. Se aislaron cuatro cepas naturales de la flora rectal de lactantes pakistaníes que se identificaron como E. coli por biotipificación, según lo describen Bettelheim, M. F., et al., J. Med. Micorbiol. 2:225-236, 1969. Estas cepas de E. coli se cultivaron toda la noche a 37ºC en caldo de cultivo estático de Luria que contenía 0,1% de CaCl_{2} para promover la expresión de las adhesinas específicas de manosa con fimbrias tipo 1. La cepa transformante de E. coli 506 MS que expresa fimbrias tipo 1 y adhesinas específicas de manosa se cultivó en agar tríptico de soja que contenía 25 \mug de cloranfenicol/ml. Las cepas de L. plantarum se cultivaron aeróbicamente en agar Rogosa durante 24 horas a 37ºC.
Para analizar la inhibición a la adherencia se incluyeron en el test de adherencia los siguientes monosacáridos a una concentración final de 60 mM: D-glucosa (USB, Cleveland, Ohio, EE.UU.), metil-alfa-D-glucósido (Sigma), D-manosa (Merck, EE.UU.), N-acetil-glucosamina (USB), N-acetil-galactosamina (USB) y ácido N-acetil-neuramínico (Sigma).
Las cepas de L. plantarum 299 y 299v, que anteriormente se había demostrado que colonizaban a voluntarios humanos, se mostró que se adhieren a las células HT-29 de forma moderada (aproximadamente 10 bacterias/célula). Esto también se observó para todas las demás cepas de L. plantarum pertenecientes al grupo genético 1c, a excepción de una. El metil-alfa-D-manósido redujo la adherencia de estas cepas en 45-73%. En las cepas del grupo 1b se observó un menor grado de adherencia (2-5 bacterias/célula). Su adherencia se redujo por metil-alfa-D-manósido en un 33-58%. Otras cepas de L. plantarum que no pertenecían a los grupos 1b o 1c se adhirieron en números bajos y su adherencia no fue inhibida por el metil-alfa-D-manósido.
La D-manosa también redujo la adherencia de L. plantarum 299 y 299V, pero en un grado menor que el metil-alfa-D-glucósido. Ninguno de los otros monosacáridos analizados, es decir, D-glucosa, metil-alfa-D-glucósido, L-fucosa, galactosa, N-acetil-glucosamina, N-acetil-galactosamina y ácido N-acetil-neuramínico, inhibieron la adherencia de L. plantarum 299 ni 299v a las células HT-29.
Las cepas de E. coli con adhesinas específicas de manosa analizadas se adhirieron a un nivel de 15-45 bacterias/célula. La adherencia de E. coli 506 MS se inhibió hasta niveles similares (94%) tanto por el metil-alfa-D-manósido como por la D-manosa.
Los resultados de la adherencia de las bacterias a las células HT-29 tras incubación en presencia y ausencia de 60 mM de metil-alfa-D-manósido y tras el lavado y el cálculo de los valores medios de 3 experimentos (un único experimento para E. coli 345, 253, 810 y 476) se muestran abajo en la Tabla 3.
Unión a D-manosa inmovilizada en bolas de agarosa
Los análisis de la unión de las bacterias a las bolas de agarosa recubiertas de D-manosa se realizaron de acuerdo a Sanchez y Jonson (APMIS., 1990, 98:353-357), con pequeñas modificaciones. Las bacterias lavadas, suspendidas en PBS a 10^{10}/ml se mezclaron sobre portaobjetos de microscopio con volumenes iguales de una suspensión 1:4 en PBS de bolas de agarosa comercial que contenían D-manosa unida covalentemente (Agarosa-p-aminofenil-alfa-D-manopiranósido, Sigma, St. Louis, EE.UU.) o simplemente bolas de agarosa (agarosa en bolas al 4%, PL-Biochemical, Milwaukee, Wis, EE.UU.). Los portaobjetos se agitaron muy suavemente durante 2 minutos y después se observaron en un microscopio de contraste de interferencia (aumento de 500 x, Nicon Optiphot). La observación de bacterias adheridas a las bolas de agarosa recubiertas de manosa en ausencia de unión a las bolas de agarosa sin recubrir se consideró una reacción positiva. Los resultados de este análisis se muestran en la Tabla 3. La unión a las bolas de agarosa recubiertas de manosa se estimó como sigue:
-
Sin diferencia en la unión al compararlas con el control de las bolas sin manosa;
+
Las bacterias cubren el 50% o más de la superficie específica de las bolas en una capa fina;
++
Las bacterias cubren toda la superfie específica de las bolas en una capa gruesa, incluso a veces pareciendo un revestimiento de múltiples capas.
Todas las cepas de L. plantarum que se adhirieron a las células HT-29 y que aglutinaron eritrocitos de forma sensible a la manosa también se unieron a las bolas de agarosa recubiertas de D-manosa, es decir, todas las cepas del grupo 1c y las ATCC 14917^{T}, 256 y 36E del grupo 1b. La mayoría de las cepas positivas reaccionaron considerablemente con las bolas de agarosa recubiertas con manosa; tan sólo se observaron reacciones débiles en L. plantarum 275, ATCC 14917^{T} y 256. Todas las cepas de L. plantarum que habían dado negativo en la adherencia sensible a la manosa también dieron negativo con las bolas recubiertas de manosa, a excepción de L. plantarum 97 perteneciente al subgrupo 1a. Sin embargo, esta cepa había mostrado ocasionalmente adherencia sensible a manosa en otros experimentos.
E. coli 506 MS se unió aproximadamente al mismo nivel que las cepas más positivas de L. plantarum.
TABLA 3
Grupo Bacterias adheridas/célula Unión a bolas de
Cepa genérico (media \pm DE) agarosa recubiertas
HBSS + metil-manósido p de manosa
L. plantarum
97 1a 1,2 \pm 0,9 1,5 \pm 0,9 +
101 1a 0,5 \pm 0,4 1,1 \pm 0,8 -
53 1a 0,8 \pm 0,4 2,0 \pm 0,9 -
ATCC 14917^{T} 1b 5,2 \pm 0,8 2,2 \pm 0,7 0,070 +
256 1b 3,7 \pm 0,3 1,8 \pm 1,5 0,020 +
36E 1b 2,4 \pm 1,8 1,6 \pm 1,5 0,17 ++
98 1b 0,6 \pm 0,6 0,4 \pm 0,2 -
299 (=DSM6595) 1c 8,1 \pm 1,1 3,8 \pm 0,5 0,029 ++
299v (=DSM9843) 1c 11,7 \pm 1,4 3,4 \pm 0,5 0,017 ++
107 1c 11,9 \pm 1,7 3,7 \pm 0,5 0,020 ++
105 1c 13,3 \pm 5,0 3,8 \pm 0,4 0,093 ++
79 1c 12,1 \pm 3,5 3,3 \pm 0,4 0,056 ++
125 1c 8,7 \pm 1,6 2,9 \pm 1,7 0,0036 ++
275 1c 2,9 \pm 0,3 1,6 \pm 0,2 0,038 +
386 1c 11,6 \pm 2,8 4,1 \pm 0,9 0,021 ++
So5 2,2 \pm 0,4 4,6 \pm 2,2 -
TABLA 3 (continuación)
Grupo Bacterias adheridas/célula Unión a bolas de
Cepa genérico (media \pm DE) agarosa recubiertas
HBSS + metil-manósido p de manosa
L. plantarum
ATCC 8014^{T} 2,7 \pm 1,0 4,5 \pm 1,5 -
120 0,9 \pm 0,6 0,8 \pm 0,7 -
44 1,4 \pm 1,2 1,6 \pm 0,2 -
E. coli
345 18,4 0,7
253 45,4 2,7
810 26,2 0,5
476 16,3 1,7
SO6MS 34,5 \pm 8,9 2,6 \pm 0,9 0,020 ++
Oxidación de metaperyodato y tratamiento enzimático de las bacterias y de las células HT-29
Las bacterias o las células HT-29 lavadas se suspendieron en 0,01 M de metaperyodato (Merck, EE.UU.) en tampón fosfato-citrato 0,1 M a pH 4,5. Las bacterias se incubaron a 37ºC durante una hora, mientras que las células HT-29 se incubaron a temperatura ambiente 15-30 minutos. Tras la incubación, las bacterias o las células se centrifugaron, se lavaron dos veces en PBS y se suspendieron en HBSS. Las incubaciones control se realizaron con 0,01 M de yodato sódico (Mallinckrodt Chemical Works, Saint Louis, Mo, EE.UU.) en el mismo tampón que el descrito o en tampón sólo.
Las bacterias o las células HT-29 lavadas se suspendieron en PBS que contenía 2 mg/ml de Proteinasa K (15 unidades/mg, Sigma) o en PBS sólo, se incubaron a 37ºC durante una hora y se lavaron y suspendieron como se describió anteriormente.
El tratamiento de las células HT-29 con peryodato durante 15 ó 30 minutos condujo a la destrucción celular; sólo un 5-10% de las células permaneció tras el tratamiento y el posterior ensayo de adherencia. Aún así, la adherencia sensible a la manosa de L. plantarum a las células que habían sido tratadas durante 15 minutos permaneció elevada (p=0,41 en relación con el control de tampón), mientras que las células que se habían tratado durante 30 minutos no se unieron a L. plantarum de manera sensible a la manosa (p=0,033 en relación con el control de tampón) y el tratamiento de peryodato durante 30 minutos casi suprimió la adherencia (p=0,0005 en relación al control de tampón, p=0,0067 en relación al control de yodato). La oxidación del peryodato de los carbohidratos de la superficie celular bacteriana no afectó demasiado a la unión.
El tratamiento de L. plantarum con proteinasa K anuló completamente su capacidad de adherirse a las células HT-29 (p=0,0008, Table 5), mientras que no se observó reducción en la adherencia de E. coli 506 MS tras el tratamiento de las bacterias con este enzima. El tratamiento con proteinasa K de las células HT-29 no tuvo claros efectos en la adherencia de L. plantarum 299v (p=0,36), pero tendió a reducir la adherencia de E. coli 506 MS con fimbrias tipo 1 (p=0,15, Tabla 4).
Estos experimentos confirman que el receptor unido a la célula es de tipo carbohidrato y que una estructura protéica en la superficie de la célula bacteriana está implicada en la adhesión a dicho receptor.
Adherencia de Salmonella typhimurium a las células HT-29
Salmonella es un patógeno importante en las enfermedades diarréicas. Muchas cepas de Salmonella portan fimbrias tipo 1, que puede detectarse por hemaglutinación sensible a manosa.
Para este análisis de adherencia se seleccionó una cepa de Salmonella derivada de un paciente con enfermedad gastrointestinal, Salmonella typhimurium 11014, la cual exhibe aglutinación sensible a manosa de los eritrocitos. Esta cepa de Salmonella se marcó con la sonda fluorescente FITC (Isotiocianato de fluoresceina, Sigma) incubando las bacterias y FITC en un tampón carbonato, pH 9,6, toda la noche en frío. Las bacterias se lavaron 3 veces antes de ser usadas en el ensayo de adherencia.
Para este ensayo, 0,1 ml de células HT-29 (5 x 10^{6}/ml) se mezclaron con 5 x 10^{8} bacterias de Salmonella fluorescente y 5 x 10^{8} bacterias no marcadas de Lactobacillus plantarum 299 o 299v. La mezcla se incubó en frío durante 30 minutos con rotación oscilante. Tras lavar las células, se contabilizaron las bacterias adheridas en un microscopio equipado para la detección de fluorescencia. Los resultados se presentan en la tabla de abajo.
TABLA 4 Adherencia a las células HT-29
Número de bacterias / célula
Salmonella thypimurium 11014 25
Salmonella thypimurium 11014 1
+ 2,5% metil-\alpha-D manósido
Salmonella thypimurium 11014 7
+ Lactobacillus plantarum 299
Salmonella thypimurium 11014 12
+ Lactobacillus plantarum 299v
Es evidente a partir de la Tabla de arriba que la cepa de Salmonella se adhirió a las células de colon humanas, esto es a las células HT-29, vía un mecanismo específico de manosa. Esta adherencia sensible a la manosa pudo ser bloqueada en gran medida por Lactobacillus plantarum. Ambas bacterias estaban presentes simultáneamente, en cantidades iguales.
Es probable que si la cepa de Lactobacillus fue añadida con anterioridad a la cepa patógena ocupase los sitios para las bacterias patógenas portadoras de adhesinas específicas de manosa, resultando por tanto imposible para ellas el llegar a estabilizarse y causar la enfermedad.
El fallo hepático agudo tiene una elevada mortalidad y una proporción significativa de esta mortalidad puede atribuirse a la elevada incidencia de sepsis. En pacientes críticamente enfermos o inmunocomprometidos la mayoría de las infecciones están causadas por la microflora del propio paciente y muchos pacientes que mueren de sepsis o de fallo de múltiples órganos tienen bacterias entéricas para las que no se han identificado focos sépticos, lo que indica que esas infecciones se han podido originar en el tubo digestivo. Debido a la elevada frecuencia de sepsis bacteriana clínicamente significativa durante fallos hepáticos fulminantes se ha suscitado la posibilidad de llevar a cabo un tratamiento profiláctico. En el fallo hepático agudo o tras una operación importante de hígado hay una mayor translocación bacteriana desde el tubo digestivo, que podría explicar algunas de las complicaciones infecciosas que se observan en esas condiciones. Con el fin de elucidar el mecanismo y encontrar posibles medidas preventivas se ha diseñado el siguiente modelo.
Ensayo en ratas
Efecto de un suplemento con Lactobacilli en fallos de lesión hepática aguda
El objetivo de este experimento es estudiar el efecto de un suplemento rectal con diferentes cepas de Lactobacillus hasta el punto de translocación bacteriana en un modelo de lesión hepática aguda. También se investiga la infuencia de tal administración en el número de Enterobacteriaceae en colon e intestino ciego.
Ratas macho Sprague-Dawley con un peso de 200-300 g se dividieron en 7 grupos de seis animales cada uno: normal, control de lesión hepática aguda (ALI), suplementado con Lactobacillus reuteri R2CL (SR), suplementado con Lactobacillus rhamnosus 271 (SS), suplementado con Lactobacillus plantarum 299v (SP), suplementado con Lactobacillus fermentum 8704:3 (SF) y suplementado con Lactobacillus reuteri 108 (ST). Todos los animales recibieron comida normal para ratas (R3, Lactamin AB, Estocolmo) y agua ad libitum durante todo el experimento y se mantuvieron en ciclos de 12 horas de luz/oscuridad y a temperatura ambiente de 22ºC. Las diferentes cepas de Lactobacillus se administraron rectalmente una vez diariamente durante 8 días. El suplemento diario de las cepas de Lactobacillus fue de alrededor a 3 x 10^{9} CFU por animal en 3 ml. La lesión aguda del hígado se indujo en el 8º día mediante inyección intraperitoneal de D-galactosamina (Sigma Chemical Co., St. Louis, EE.UU.), 1,1 g/kg de peso corporal, lo que trae consigo un aumento en la filtración de las bacterias desde el lumen intestinal hasta órganos distantes. En el grupo control de lesión hepática aguda, la disolución salina normal se suplementó diariamente durante 8 días y la lesión hepática se indujo el 8º día. Las muestras se recogieron 24 horas después de haber inducido la lesión hepática. Bajo anestesia con éter se llevó a cabo una laparotomía a través de una incisión en la línea media en condiciones de asepsia. Se tomaron sangre portal y aórtica para los análisis bacterianos. Se obtuvieron muestras del lóbulo caudado del hígado y de los nódulos linfáticos mesentéricos (MLN, mesenteric lymph nodes) para el estudio bacteriológico; contenidos cecales y colónicos para el recuento bacteriano.
En los análisis bateriológicos las muestras de tejido se colocaron en 5 ml de medio estéril de transporte. Las muestras se colocaron en un baño ultrasónico durante 5 minutos y se agitaron en un Chiltern (Terma-Glass, Suecia) durante 2 minutos. El recuento de las placas aeróbicas totales se efectuó tras colocar 1,0 ml de muestra en una infusión de agar BHI cerebro-corazón (Oxoid) e incubarlas a 37ºC durante 3 días. El recuento de placas anaeróbicas se efectuó tras colocar las muestras en BHI e incubarlas bajo condiciones anaeróbicas a 37ºC. Tras 3 días se contabilizó el número de colonias formadas en cada placa y se corrigió atendiendo al peso del tejido original. Las muestras de tejido se expresaron por gramos de tejido. Todos los valores se presentaron como media \pm EEM (Error Éstandar de la Media). Los resultados fueron evaluados estadísticamente empleando el test t de Student de no emparejados. Un nivel de probabilidad menor que 0,05 se consideró significativo (p<0,05).
TABLA 5 Translocación bacteriana al hígado y MLN
Grupo Hígado, CFU/g MLN, CFU/g
ALI 5300 \pm 1750 4940 \pm 2060
SR 880 \pm 530* -
SS 1460 \pm 990* 180 \pm 40*
SP 20 \pm 10** -
SF 160 \pm 80** 70 \pm 30*
ST 930 \pm 850** 20 \pm 5*
*Indica p < 0,05 **Indica p < 0,01
El tratamiento previo de las ratas con Lactobacillus plantarum 299v redujo significativamente la translocación bacteriana desde el tubo digestivo y mejoró el estado del hígado.
Se investigó la microflora bacteriana mediante la toma de muestras del contenido del intestino ciego y del colon que fueron inmediatamente colocadas en 5 ml de medio estéril de transporte, colocadas en un baño de ultrasonidos y agitadas en Chiltern como anteriormente se ha descrito. Los recuentos de Enterobacteriaceae viables se obtuvieron a partir del agar "violet red-bile-glucose" VRBG (Oxoid) que se incubó aeróbicamente a 37ºC durante 24 horas.
TABLA 6 Recuento de Enterobacteriaceae en colon e intestino ciego
Grupo CFU/g en el colon CFU/g en el intestino ciego
Normal 4,1 \pm 1,7 6,5 \pm 0,3
ALI 6,8 \pm 0,2 4,9 \pm 0,1
SR 6,7 \pm 0,2 5,1 \pm 0,2
SS 5,1 \pm 1,1 3,5 \pm 1,1
SP 4,7 \pm 1,0 * 4,3 \pm 0,2
SF 1,9 \pm 1,2 ** 5,5 \pm 0,2
ST 3,0 \pm 1,4 4,3 \pm 0,1
* Indica p < 0,05 ** Indica p < 0,01
La tabla anterior muestra que el recuento de Enterobacteriaceae en colon al igual que en el intestino ciego disminuyó en todos los grupos de ratas suplementados con Lactobacillus.
Ensayo clínico
Se suministró Pro Viva (sopa de escaramujo basada en avena fermentada con Lactobacillus plantarum 299v, Sk\ring{a}nemejerierna Ekonomisk Förening, Malmö, Sweden) a 26 niños que sufrían de gastroenteritis aguda en el hospital de Szezecin, Polonia, durante un período medio de 5,5 días. El producto se dió en una cantidad de 400 ml/día; 200 ml por la mañana y 200 ml por la tarde.
Antes de empezar el tratamiento todos los niños hacían entre 3 y 9 deposiciones blandas por día, lo que se redujo tras el tratamiento hasta una frecuencia de 1-2 deposiciones por día. Seis pacientes tenían patógenos en los cultivos de heces efectuados con anterioridad al tratamiento, esto es Salmonella en 3 niños, E. coli enteropatógena en 2 niños, Enterobacter aeromonas y Giardia intestinalis en 1 niño. Tras el tratamiento todos estos patógenos estaban ausentes en los cultivos de heces. Todos estos patógenos, con la excepción de Giardia intestinalis se sabe tienen fimbrias tipo 1 y se adhieren a las células de los epitelios intestinales vía mecanismos específicos de manosa. Es probable que la capacidad de Lactobacillus plantarum 299v para competir con los patógenos por los sitios de unión a las glicoproteínas que contienen manosa en las células epiteliales, o en la capa de mucosa, sea la responsable de la desaparición de estas bacterias de los cultivos de heces tras la administración de Lactobacillus plantarum.
Conclusión
La extendida incidencia de las adhesinas específicas de manosa entre las bacterias Gram-negativas que residen en el tracto intestinal sugiere que estas adhesinas son importantes en el proceso de colonización intestinal. Nunca con anterioridad se había identificado una adhesina específica de manosa en una especie Gram-positiva tal como Lactobacillus plantarum. Puede asumirse que la capacidad de adherirse a los receptores que contienen manosa tiene su importancia en la pronunciada capacidad colonizadora de esta bacteria. Sin embargo, también bacterias que no poseen la capacidad de adherirse a los receptores de la mucosa pueden ser buenos colonizadores del tracto intestinal, por ejemplo la cepa 271, que no se adhiere a las células epiteliales del intestino.
Probablemente, la capacidad de unirse a receptores que contienen manosa en el epitelio proporciona a Lactobacillus plantarum la capacidad especial de contrarrestar el efecto de bacterias patógenas. En primer lugar, es un buen colonizador intestinal. En segundo lugar, competirá con las bacterias patógenas por los sitios de los receptores que son importantes para la capacidad colonizadora de las bacterias patógenas, es decir, los receptores de la mucosa que contienen manosa. En tercer lugar, al unirse a los receptores presentes en las células del epitelio intestinal Lactobacillus plantarum será capaz de influir sobre el micromedio cercano a estas células epiteliales. Entonces, el cambio en el micromedio llevado a cabo por Lactobacilli afectará más probablemente a las células epiteliales que si estas bacterias Lactobacilli residieran en un lugar más distante del epitelio. En cuarto lugar, Lactobacillus plantarum al unirse a los receptores que contienen manosa de las células epiteliales será capaz de obstaculizar la unión de bacterias patógenas, reduciendo por tanto su capacidad de liberar directamente sustancias tóxicas, o de otro modo irritantes, a las células epiteliales, lo que es a menudo un requisito previo para la acción patógena de esas bacterias.

Claims (2)

1. Uso de Lactobacillus plantarum 299v, con el número de depósito DSM 9843, que tiene adhesinas específicas de manosa así como capacidad para colonizar la mucosa intestinal humana, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección del tracto urinario al inhibir la adherencia de las bacterias patógenas que expresan fimbrias tipo 1, especialmente bacterias pertenecientes a Klebsiella, Enterobacter, Proteus o Escherichia coli, a las células del epitelio uretral humanas.
2. Uso, de acuerdo con la reivindicación 1, de Lactobacillus plantarum 299v, con el número de depósito DSM 9843, en combinación con un vehículo convencional para la preparación de una composición farmacéutica.
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