JPH11502703A - 上皮接着性乳酸桿菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌の上皮細胞表面への接着を阻害する薬学的組成物の調製のための、マンノース特異的アドヘシンを有するプランタラム乳酸桿菌の使用に関する本発明で使用されるプランタラム乳酸桿菌の株は、D-マンノースでコートされたアガロース・ビーズに接着し、好ましくはREAに関してプランタラム乳酸桿菌299に70%以上の類似性を有するプランタラム乳酸桿菌のクラスターに属する。本発明はまた、細菌の移動、マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌によって引き起こされる胃腸炎または他の疾患の予防的および／または治療的処置に使用される薬学的組成物の調製のための、該株の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 上皮接着性乳酸桿菌 本発明は、上皮細胞表面、特にヒトの腸粘膜の上皮細胞表面に接着する能力を 有し、上皮細胞に同じ様に接着する病原性細菌によって引き起こされる細菌性障 害の予防的および／または治療的処置に使用し得る、乳酸桿菌（Lactobacillus ）の菌株に関する。 発明の背景 生来の微生物相(microbiota)は、侵入した細菌によるコロニー形成(colonizat ion)に対して、ヒトまたは動物の身体を保護する主要な防御メカニズムの１つで ある。免疫抑制されていたり、抗生物質で治療されていたり、非経口的に栄養供 給されている患者は、正常の糞便ポピュレーション（fecal population）に主に 由来する細菌の流布により引き起こされる敗血症、髄膜炎または尿路感染症のよ うな感染性疾患のリスクを負う。このプロセスの背後にある１つのメカニズムは 、細菌の移動(translocation)であり得、それは生存細菌の、胃腸管から腸間膜 リンパ節および他の臓器への移動(passage)として定義される。 血液中毒、敗血症は、高い死亡率を有する、腹部手術 に伴って今だ非常に頻発する手術合併症である。細菌または細菌産物は、機能不 全となった腸管壁に入り込み、肺、肝臓、心臓等のような他の遠隔臓器に感染ま たは機能不全を誘発するかもしれず、これは多臓器機能不全またはいわゆる集中 治療疾患をもたらす。これらの患者は今日、抗生物質の投与および膿瘍が存在し 得る範囲の外科的処置によって治療される。現在では、抗生物質が、手術後の感 染及びそれによって生ずる疾病のリスクを減少させるために、腸の外科的手術の 前に慣用的に投与されている。しかしながら、抗生物質による処置は、正常な腸 内細菌叢の破壊、および病原性のより高い細菌の異常増殖と関連する。 これらの知見は、例えば抗菌成分の産生により又は競合的増殖によって、宿主 の微生物バランスに有利に影響し得る微生物種に対する関心を増大させた。乳酸 桿菌(Lactobacillus)は、最も研究された種であり、ある場合には病原体の増殖 を妨害することが示されている。 腸管に棲息する細菌は、コロニー形成された（colonized）宿主において腸管 内で下痢のような疾患を引き起こすかもしれないし、或いは尿路または血流のよ うな常態では無菌の部位に二次的にコロニー形成することによって尿路感染症ま たは敗血症を引き起こす。 病原性細菌は、いわゆるビルレンス因子(virulence factor)を所有することに よって疾病を引き起こさないものとは異なる。重要なビルレンス因子は、宿主細 胞の炭水化物レセプター分子に接着する能力である。これはコロニー形成を可能 とし、またトキシンや他の炎症原性(inflammatogenic)物質を宿主細胞に極めて 接近して運搬可能とするが故に、重要なステップである。これらの毒性物質が接 着性細菌によって運搬されると、例えば腸管腔に棲息する細菌によって分泌され る場合よりも、局所的にかなり高い濃度に達する。 尿路感染症を引き起こす細菌は、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロバク ター属（Enterobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）およびプロテウス属（ Proteus）を含み、それらは全て腸内細菌科に属する。これらの細菌の大多数は 、１型フィムブリエ（type １ fimbriae）を有しており、これは、例えば、ヒト 膣上皮細胞上のマンノース含有レセプターおよび尿細管タンパク質であるタム− ホースフォール・タンパク質(Tamm-Horsefall protein)に接着する能力を細菌に 授ける。１型フィムブリエは、膀胱炎のビルレンス因子であることが示されてお り、それは膣および尿管周囲の上皮細胞に結合することによって付与される尿路 内を上昇する能力の増大、並び に尿路内の上皮細胞に結合することによって生ずる刺激性効果の増大の両方に依 存し得る［従って、１型フィムブリエを有する細菌のみが、培養された尿路上皮 細胞中で、サイトカイン反応、即ち、炎症を誘発できた。］。 下痢を引き起こす細菌は、サルモネラ属（Salmonella）および赤痢菌属（Shig ella）を含むが、クレブシエラ属またはエンテロバクター属の腸管内での過剰増 殖もまた幼い乳児の下痢と関連している。マウスでは、１型フィムブリエがサル モネラ属により引き起こされる下痢性疾患のビルレント因子であることが示され ている。さらに、１型フィムブリエはまた他の細菌のコロニー形成を促進し、有 毒物質の上皮近くへの運搬を強化し、それによって下痢を引き起こすようである 。 従来技術 EP-A2-0 199 535 は、ヒト糞便から単離され、インビトロの試験で粘膜細胞に 接着することができる、アシドフィルス乳酸桿菌（L.acidophilus）（ATCC受託 番号53 103）の生物学的に純粋な培養物について記載する。アシドフィルス乳酸 桿菌は、上部胃腸管を通過して移動をうまく行う。しかしながら、インビボでの 接着については実証されていない。 WO 89/05849は、ブタの胃腸管から単離され、とりわけ、 インビトロでブタ由来の胃腸上皮細胞への接着ならびに酸および胆汁に対する耐 性によって選択された乳酸細菌を記載する。該細菌は、ミルクの発酵に使用でき 、これは、特に、大腸菌性の下痢を予防または治療するために子ブタに与えるこ とができる。 WO 93/01823は、インビボでヒト腸粘膜に定着する(establish)能力と更に経口 投与後少なくとも10日間そこに残存する能力を有する乳酸桿菌属の菌株の単離方 法に関する。該出願は、特に、２つの新規な乳酸桿菌株に関し、該菌株は、ドイ ツ、ブラウンシュワイヒにあるデーエスエム（DSM）（ドイツ微生物収集細胞培 養GmbH）に、ブタペスト条約に従って、1991年７月２日に寄託されている。 それは、 プランタラム乳酸桿菌299 DSM 6595 (Lactobacillus plantarum 299) カセイ乳酸桿菌 エスエスピー．ラムノサス271 DSM 6594 (Lactobacillus casei ssp．rhamnosus 271)、 及びそれらの変異体であり、胃腸管における細菌感染症の予防または治療とくに 外科的手術に関連して抗生物質に代わるものとして使用されている。 SE 463 598は、細菌の胃腸管への接着を増大する調製 物に関し、その調製物は、乳酸桿菌から得られたアドヘシン(adhesin)と名付け られた接着促進タンパク質を含むと言われている。 WO90/09398は、病原体の接着、増殖および／または生存を阻害する生成物に関 する。該生成物は、大腸菌、クロストリジウム属（Clostridium）、サルモネラ 属、キャンピロバクター属（Campylobacter）および連鎖球菌属（Streptococcus ）の菌株のような病原体を阻害する乳酸桿菌の代謝産物である。 発明の説明 現在、驚くべきことに、乳酸桿菌の特定の菌株が、D-マンノース被覆アガロー ス・ビーズに接着することが見出されている。その能力は、マンノース感受性様 式で赤血球を凝集させる能力、並びにメチル-α-D-マンノシドにより阻害され得 る様式でヒト結腸上皮細胞系HT-29に接着する能力と相互に関係している。HT-29 細胞を過ヨウ素酸塩で処理すると、マンノース感受性接着が破壊され、細胞結合 レセプターが炭水化物の性質を有するものであることが確認された。該細菌をプ ロテイナーゼＫで処理しても、また接着が破壊され、結合が細菌細胞表面上のタ ンパク質構造と関連することが示された。従って、乳酸桿菌の接着部分、アドヘ シンは、上皮細胞表面上のマ ンノース含有レセプターに接着するものと考えられる。この接着は、これら細菌 が有する病原性細菌を妨害する能力および宿主防御メカニズムを刺激する能力に 関連しているようにみえる。 特に、この接着は、病原性または潜在的に病原性である細菌の無傷の(intact) 腸管上皮への移動を減じ、潜在的に病原性である細菌の直接的な上皮細胞表面へ の接着を阻害して有毒な炎症性物質を粘膜に運搬する能力を減じ、および粘膜の 再構築に好ましい微小環境を創造することにより非特異的刺激物によって引き起 こされる胃腸の炎症性障害を減じる能力をもたらす。上皮細胞との密接な関連は また、免疫系と相互作用する細菌の能力を増大させるかもしれない。これらの乳 酸桿菌属の菌株は、例えば、貧食細胞の活性化の引き金となり、抗原提示細胞を 刺激して免疫の増強をもたらすかもしれない。 本発明は、マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌の上皮細胞表 面への結合を阻害する薬学的組成物を調製するための、マンノース特異的アドヘ シンを有するプランタラム乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)の使用に関する 。これにより、侵入して有毒な炎症原性物質を粘膜上に運搬する病原性細菌の能 力が減少される。 マンノース特異的アドヘシン類は、大腸菌、クレブシ エラ属、赤痢菌属およびサルモネラ属の種、シュードモナス・エチノイデス(Pse udomonas ethinoides)、コレラ菌およびビブリオ・パラハエモリティクス（Vibr io parahaemolyticus)のような腸内細菌科のメンバーを含む、様々のグラム陰性 細菌の中に記載されている。 大腸菌のマンノース特異的アドヘシンに関する最適なレセプターは明らかにさ れており、それは哺乳動物の糖タンパク質にみられる配列マンノースα1-4マン ノースβを含むことが知られている。他の腸内細菌種のマンノース特異的アドヘ シン類の正確なレセプター構造は、まだ明らかにされておらず、プランタラム乳 酸桿菌株のマンノース特異的アドヘシンのレセプター構造も明らかにされていな い。しかしながら、そのレセプターはManα1-2Man配列を含むはずであると考え られている。マンノース特異的プランタラム乳酸桿菌(L.plantarum)は、マンノ ース含有レセプターに結合する細菌に対して、他のレセプター構造物に結合する 細菌に対する阻害効果と比較して、より強い阻害効果を有しているようである。 本発明は特に、マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌の上皮細 胞表面への結合を阻害する薬学的組成物を調製するための、D-マンノース被覆ア ガロース・ビーズに接着するプランタラム乳酸桿菌の使用に関 する。 プランタラム乳酸桿菌の好ましい株は： プランタラム乳酸桿菌 299 DSM 6595 プランタラム乳酸桿菌 299v DSM 9843 プランタラム乳酸桿菌 79 プランタラム乳酸桿菌 105 プランタラム乳酸桿菌 107 である。 本発明はまた、細菌性障害の予防的または治療的処置のための、マンノース特 異的アドヘシン類を発現する病原性細菌の上皮細胞表面への結合を阻害する薬学 的組成物を調製するための、慣用されている担体と組合せてなる、マンノース特 異的アドヘシンを有するプランタラム乳酸桿菌の使用に関する。 ２つの要因が、乳酸桿菌属の生態学的効果の発揮に重要であるようである。第 １は、腸管にコロニーを形成する(colonize)能力、即ち、生細菌を最後に投与し てからある期間、多数が生き残る能力である。この特性は、乳酸桿菌が有する病 原性細菌の成長及び増殖を抑制する能力に重要であるかもしれないが、十分では ない。第２は、腸管上皮細胞に直接結合する能力である。これは、コロニー形成 を促進する因子の１つであり得るが、コロニー形成に不可欠な因子ではない。上 皮への接着能力は、そ の菌株がコロニー形成できることを保証するものではない。 本発明はさらに、マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌のヒト 腸管上皮細胞表面への接着を阻害する薬学的組成物を調製するための、マンノー ス特異的アドヘシンを有し、またヒト腸粘膜にコロニー形成する能力を有するプ ランタラム乳酸桿菌の使用に関する。 マンノース特異的１型フィムブリエを発現する病原性腸内細菌は、特に、例え ば肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium )およびフレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)といったクレブシエラ属、エン テロバクター属、プロテウス属、サルモネラ属および赤痢菌属エスピピー(spp) 、並びに大腸菌が挙げられる。 乳酸桿菌は、上皮に近接する生態学的ニッチ(ecological niche)を占拠するの で、上皮細胞に直接接着する能力は、乳酸桿菌の菌株が病原性細菌による移動と 粘膜炎症の誘発を減少させる上で重要であるかもしれない。上皮との密接な関連 はまた、乳酸桿菌に微小環境を変化させることを可能にし、これは腸上皮細胞に 直接影響して、それにより刺激物質によって引き起こされた損傷の後の修復を促 進する。 本発明はまた、病原性または潜在的に病原性である細菌の無傷の腸管上皮への 移動を予防的および／または治療的に処置するための、上記のようなプランタラ ム乳酸桿菌の使用に関する。移動は、生存細菌が腸管上皮を通過して、その結果 、それらが、例えば腸間膜リンパ節、血液または他の臓器から回収されることを 意味する。 腸管内での細菌性障害の予防的または治療的処置のための薬学的組成物につい て慣用される担体は、例えば、問題の細菌によって発酵された生理学的に許容さ れる物質、及び特にデンプンまたはミルクに基づく様々な種類の食料品、さらに それだけでなく、不活性な固体あるいは食塩水または水のような液体である。好 適な基質は、胃腸管で再吸収されず、また乳酸桿菌で発酵されるときカルボン酸 を形成する、液体または固体の繊維を含むことが望ましい。好適なデンプン含有 基質の例として、オート麦および小麦のような穀類、トウモロコシ、ジャガイモ のような根菜類およびグリーンバナナのような特定の果物を挙げることができる 。 本発明の組成物のための好ましい基質は、組成物に優れた栄養価を与えるもの であり、例えばWO 89/08405に記載されるような、オートミールに基づく栄養液 である。 本発明の組成物は、任意の好適な様式、好ましくは経 口的または経直腸的、例えば注腸の形態で投与され得る。それはまた、胃を経て 腸管に挿入されるカテーテルを介して、あるいは直接的に腸管に、経腸的に投与 され得る。試験によれば、食物繊維が、例えばオートミール粥またはβ-グルカ ンの形態で供給される場合に、その効果が向上することが示されている。処置は 、1〜2週間の間、日に１回または数回行なわれることが望ましい。 本発明はまた、マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌、とくに １型フィムブリエを発現する大腸菌のヒト膣および尿道の上皮細胞への接着を阻 害する薬学的組成物を調製するための、上述するプランタラム乳酸桿菌の使用に 関する。 図面の説明 図１は、ピアソン乗積モーメント相関係数とUPGMAに基づく、REA-法で特徴づ けられた種々の試験乳酸桿菌の菌株間での類似性を％で表すデンドログラムであ る。 乳酸桿菌属の菌株の単離 乳酸桿菌の菌株は、ヒト粘膜からサンプリングした。結腸の種々の部分からの 生検が、腸内視鏡によって行われ、小腸、すなわち空腸および回腸からの腸管粘 膜の細片が、外科的手術に伴って切除された。粘膜サンプルを、直ちに特性培地 （0.9% NaCl、0.1% ペプトン、0.1% Twe en 80および0.02% シスチン；全数値は％重量／容量を指す）に置き、超音波浴 内で２分間ホモジナイズし、１分間攪拌して、ロゴサ寒天（Rogosa agar; ディ フコ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories)、デトロイト、ミシガン州、アメリ カ合衆国）上に置いた。プレートを嫌気的に37℃で２日間インキュベートした（ ガス・パックアネロビック・システム、BBL）。３個のコロニーにつき１個を各 プレートから無作為に取り、ロゴサ寒天上で純粋培養物として5〜9倍に増殖させ 、凍結緩衝液中に濃培養物として-80℃で保存した。この手順により、プランタ ラム乳酸桿菌の菌株299および299v、並びに105、275および386；フェルメンタム 乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)8704:3；レウテリ乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)108、8557:1、8557:3；ラムノサス乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus ）271；アギリス乳酸桿菌(Lactobacillus agilis)294を単離した。同様にして、 乳酸桿菌の菌株をラットおよびブタの腸管から単離した。それは、それぞれレウ テリ乳酸桿菌R2LCおよび1063、1068および1044である。 乳酸桿菌の菌株も、下記のようにして、ナイジェリアのオギ(ogi)またはピト( pito)から単離した。オリジナル・サンプルを、超音波浴中で５分間処理し、ボ ルテック ス上で２分間混合し、希釈し、続いてロゴサ寒天（ディフコ）上で３日間、37℃ でインキュベートした。無作為に採種した細菌コロニーを試験した。この手順に より、プランタラム乳酸桿菌株79および107、125、98、53、97M2、97、101、120 および44が得られた。 乳酸桿菌属の菌株はまた、サイレージ(silage)、すなわちプランタラム乳酸桿 菌36E、256およびATCC8014から単離された。So5は、ソッカーボラゲット、アー レヴ（S 桿菌の出発培養物であり、レウテリ乳酸桿菌BRはBRA-ミルク（アーラ・エコノミ スク・フェーレニング(Arla Ek 中で商業的に使用される菌株である。 菌株の同定 ATCC 14917^TおよびDSM 20016^Tは、それぞれプランタラム乳酸桿菌およびレウ テリ乳酸桿菌に対するタイプ株である。タイプ株は種を定義し、^Tでマークされ る。特定のタイプ株と70%以上のDNA:DNAホモロジーを有する全ての他の株は、特 定の種に属すると言われる。 インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティックバクテリオロジー (1995)45:670-675 ヨハンソン，エム−エルら(Johansson，M-L)には、単離され た菌株に ついての、全染色体DNAの制限エンドヌクレアーゼ分析による分類が記載されて いる。得られた「フィンガープリント」において、比較としてトータルパターン の類似性を反映する遺伝子グループまたはクラスターが形成される。この分析法 によると、プランタラム乳酸桿菌株は図１に見られるように、異なる遺伝子グル ープ1a、1b、1cに分けることができた。クラスター1cに属する菌株は全て、プラ ンタラム乳酸桿菌299と＞50%の類似性を有し、菌株299v、107、105および79は＞ 70%の類似性を有する。 菌株299および299vは、共に健康なヒト腸粘膜から単離されたものであり、ド イツ微生物収集細胞培養GmbHにそれぞれ1991年７月２日および1995年３月16日に 寄託され、寄託番号DSM 6595(299)およびDSM 9843(299v)が与えられている。表現型同定 菌株299、299v、79、105および107は、グラム陽性の、pH 5.5のロゴサ寒天上 で生育するカタラーゼ陰性桿菌であり、グルコースから嫌気的に乳酸を産生する ことができる。それらの菌株が有する種々の炭水化物の発酵能力を表１に示す。 試験は、製造業者の指示に従って、API 50 CHによって行った。 表現型的には、それらの菌株は、プランタラム乳酸桿 菌として同定できる。 プラスミド・プロフィーリング それらの菌株を、チャシー(Chassy)ら(1976)に記載される方法に従い、プラス ミドの内容に関して試験を行った。プランタラム乳酸桿菌299、299v、79および1 05は、同一のプラスミド・プロフィール、即ち、4、9、15、21＞30 MDaの５個の プラスミドを有していた。プランタラム乳酸桿菌107は、4、15および21 MDaの３ 個のプラスミドを有していた。 プランタラム乳酸桿菌２９９の培養 −-80℃の冷凍庫からの接種物(inoculate)を、50 mlのラクトバシラス・キャ リーング・メディウム（Lactobacillus Carrying Medium）（LCM、エフシミユ・ アンド・ハンセン(Efthymiou & Hansen)、ジャーナル・オブ・インフェクシャス ディジーズ(J．Infect．Dis.)、110: 258-267、1962）またはロゴサに加える、 −37℃にて約40時間インキュベートする、 −50 mlを500 ml LCM中に接種する、 −37℃にて約40時間インキュベートする、 −500 mlを５リットル中に接種する、 −37℃にて約25〜30時間インキュベートする、 −10 000 rpmで10分間遠心する、 −生理食塩水中で１度洗浄する、 −ペレットを約１リットルの生理食塩水に溶解する。 この量は、約400-500リットルのオートミール粥に十分であると評価される。 培養培地は、最適化されない。恐らく、より優れた緩衝機能により、ロゴサはLC Mよりも好適に作用した。2%グルコースをLCMに加えた。同じ手順が他の乳酸桿菌 属の菌株を産生するのに使用することができる。 インビボでのプランタラム乳酸桿菌のコロニー形成(colonization) インビボでのコロニー形成能力を評価するために、WO 93/01823に記載される ように、12人の健康なボランティアに10日間、8×10⁷ CFU/gの凍結乾燥した乳酸 桿菌の菌株を含む100 mlの液体オートミール粥を与えた。投与が完了してから10 日後、プランタラム乳酸桿菌299を、腸粘膜上に優位に見い出すことができた。 別の試験で、プランタラム乳酸桿菌株105および107についてコロニー形成能力 を評価した。各被験菌株を1.5×10⁹ CFU含む凍結乾燥試料が日に１度、８日間摂 取された。投与を開始する１日前、および投与終了の１日および８日後に、直腸 から生検材料を採取した。さらに、空腸からも生検材料を採取した。投与終了か ら８日後、投与された菌株は、全くロゴサ・プレートから再単離されなか った。 赤血球凝集反応試験 腸内細菌科の中、例えば、大腸菌株に存在するマンノース含有レセプターに関 するアドヘシン類であって、１型フィムブリエと関連し結腸上皮細胞への結合を 仲介するアドヘシン類に、乳酸桿菌の菌株のアドヘシン類が似ているかどうか調 べるために、種々の起源の赤血球に対して赤血球凝集反応試験を行った。 洗浄した細菌をPBS中に2 X 10¹⁰/mlで懸濁し、細菌懸濁液の２倍希釈液を顕微 鏡スライド上で、等量の3%赤血球懸濁PBS、または100 mMのメチル-α-D-マンノ シドを含むPBSと混合した。該スライドを一定の時間間隔で穏やかに傾斜させ、1 5分後に、裸眼および250倍の光学顕微鏡を用いて赤血球凝集をみた。15分以内に 目に見える凝集を示す細菌懸濁液の最大稀釈率の逆数を、赤血球凝集力価として 記録した。 赤血球の膜結合糖タンパク質は、マンノースを含んでおり、マンノース特異的 アドヘシン類を有する大腸菌は、広範囲の赤血球をマンノース感受性様式で凝集 させる。 遺伝子グループ1cに属するプランタラム乳酸桿菌株は、ヒト、モルモット、ニ ワトリ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ウマおよびブタに由来する赤血 球を凝集 させ、より稀にではあるが、ヒツジまたはウシの赤血球も凝集させる。ヒツジお よび雄ウシの赤血球を除いて、赤血球凝集反応は、メチル-α-D-マンノシドによ り完全に阻害されるか、またはかなり減ぜられた。弱いマンノース感受性赤血球 凝集反応が、1bグループに属する幾つかの菌株で見られたが、他の遺伝子グルー プは陰性であった。 プランタラム乳酸桿菌のマンノース感受性赤血球凝集反応(MSHA)は、大腸菌の それと非常に似ていたが、幾つかの相違点も観察された。例えば、プランタラム 乳酸桿菌では、ニワトリ赤血球は最も高いMSHA力価を示すが、ウマ赤血球は、最 も活性が低い赤血球種の１つであった。他方、大腸菌では、ウマ赤血球は、ニワ トリ赤血球よりも僅かに高く、最も高い力価を示した。モルモット赤血球は、プ ランタラム乳酸桿菌および大腸菌の両者に対して比較的強い赤血球凝集活性を示 し、それに対してヒト赤血球は、大腸菌に対しては他の赤血球と比較すると低い 活性であったが、プランタラム乳酸桿菌との赤血球凝集反応では比較的活性であ った。 ＨＴ−２９細胞への接着 種々の乳酸桿菌属の菌株について、ヒト結腸癌細胞系HT-29の腸上皮細胞に接 着するそれらの能力を試験した （ウォルド，エー(Wold，A)ら、インフェクション・アンド・イミュニティ(Infe ction and Immunity)、1988年10月、p．2531-2537に記載された方法)。ヒト腺癌 細胞系 HT-29の細胞を、10%ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミンおよび50μg/mlの ゲンタマイシンを補足したイーグル培地（シグマ・ケミカル(Sigma Chemical Co .)、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）中で培養した。細胞がコンフ ルエンスに達してから数日後、それらをEDTA含有緩衝液(0.54 mM)で剥がし、洗 浄し、ハンクス平衡塩類溶液(HBSS：Hank's balanced salt solution)に 5x10⁶/ mlで懸濁した。細菌を回収し、洗浄し、HBSSに5x10⁹/ml（２x 597 nmでの光学密 度1.5）で懸濁した。細胞、細菌およびHBSSを、1:1:3の比率で混合し、エンド・ オーバー・エンド回転で、30分間４℃でインキュベートした。該細胞を、氷冷PB Sで１度洗浄し、中性緩衝ホルマリン（ヒストフィックス(Histofix)、ヒストラ ボ(Histolab)、ゲ た。少なくとも40個の細胞のそれぞれに付着した細菌の数を、干渉位相差顕微鏡 （500倍、ニコン・オプトフォト、干渉位相差装置付き、ベルクストロム・イン スツルメン スウェーデン）を用いて測定し、細胞当りの細菌の平均 数を計算した。接着阻害を調べるために、1.5%の種々の単糖（グルコース、マン ノース、メチル-α-D-マンノシド）を接着アッセイに含めた。結果を下記の表２ に示す。表中、表題、および株ならびに遺伝子グループは以下の通りである： −HT-29 VHは、細菌／−細胞の数の平均値であり；実験数はカッコ内に示して ある； −α-メチルマンノシド、マンノース、およびグルコースはそれぞれ、α-メチ ルマンノシド、マンノース、およびグルコースそれぞれの存在下での細菌／細胞 の数の平均値を指し；実験数はカッコ内に示してある； −nは、α-メチルマンノシドを有する又は有しないアドヘシンの比較における 対の値(paired values)の数である； −dは、α-メチルマンノシドを有する又は有しない平均差である；陽性＝マン ノシドを有する阻害； −pは、比較のためのp値であり；対の値に関するスチューデントT検定である 。 これらの結果から、乳酸桿菌の菌株の最初の５株は、インビトロでHT-29細胞 への強力な接着を示し、その接着は、糖α-メチルマンノシドによって阻害され ることが判る。 接着試験を、プランタラム乳酸桿菌の菌株ならびに５つの大腸菌株を用いて繰 り返した。４つの野生型株をパキスタン人乳児の結腸叢から単離し、ベッテルハ イム，エム．エフ．ら(Bettelheim，M.F.)、ジャーナル・オブ・マイクロバイオ ロジー(J．Med．Microbiol.) 2: 225- 236、1969に記載されるように、バイオタイピング(biotyping)によって大腸菌で あると同定した。大腸菌株を、37℃にて、0.1% CaCl₂を含む静置ルリアブロス(s tatic Luria broth)中で終夜培養し、マンノース特異的アドヘシン類を有する１ 型フィムブリエの発現を促進させた。１型フィムブリエおよびマンノース特異的 アドヘシンを発現する形質転換株である大腸菌506 MSを、クロラムフェニコール 25μg/mlを含むトリプシン処理したダイズ寒天培地上で培養した。プランタラム 乳酸桿菌の菌株を、ロゴサ寒天上で24時間、37℃で嫌気的に培養した。 接着阻害を試験するために、単糖（D-グルコース（USB、クリープランド、オ ハイオ州、アメリカ合衆国）、メチル-α-D-グルコシド（シグマ(Sigma)）、D- マンノース（メルク、アメリカ合衆国）、N-アセチル-グルコサミン（USB）、N- アセチル-ガラクトサミン（USB）およびN-アセチル-ノイラミン酸（シグマ）） を接着アッセイ中に最終濃度60 mMとなるように含めた。 ヒトのボランティアにコロニー形成することが既に示されていたプランタラム 乳酸桿菌の菌株299および299vは、HT-29細胞に中程度（約10細菌／細胞）まで接 着することが示された。これはまた、遺伝子グループ1cに属する他のプランタラ ム乳酸桿菌の菌株の１つを除く全てについ てそうであった。メチル-α-D-マンノシドは、これらの菌株の接着を45-73%だけ 減少させた。より低い程度の接着（2-5細菌／細胞）が、グループ1bに属する菌 株の中で見られた。それらの接着は、メチル-α-D-マンノシドによって、33-58% だけ減少された。遺伝子グループ1bまたは1cに属しない他のプランタラム乳酸桿 菌の菌株のうち接着したのは少数で、それらの接着はメチル-α-D-マンノシドに よって阻害されなかった。 D-マンノースはまた、プランタラム乳酸桿菌299および299vの接着を減少させ たが、メチル-α-D-グルコシドよりも低い程度であった。試験された他の単糖、 即ち、D-グルコース、メチル-α-D-グルコシド、L-フコース、ガラクトース、N- アセチル-グルコサミン、N-アセチル-ガラクトサミンおよびN-アセチル-ノイラ ミン酸のいずれも、プランタラム乳酸桿菌299および299vのHT-29細胞への接着を 阻害しなかった。 試験されたマンノース特異的アドヘシン類を有する大腸菌株は、15-45細菌／ 細胞のレベルで接着した。大腸菌506 MSの接着は、メチル-α-D-マンノシドおよ びD-マンノースの両方によって、同程度(94%)まで阻害された。 60 mMのメチル-α-D-マンノシドの存在下または不存在下でインキュベーショ ンし、洗浄し、３回の実験（大腸 菌345、253、810及び476については１回の実験のみ）の平均値を求めた、細菌の HT-29細胞への接着の結果を、下の表３に示す。 アガロース・ビーズに固定されたＤ−マンノースへの結合 D-マンノース被覆アガロース・ビーズへの細菌の結合試験を、サンチェスおよ びジョンソン（Sanchez and Jonson）(APMIS.，1990，98: 353-357)に従って、 僅かに変更を加えて行った。PBS中に10¹⁰/mlの割合で懸濁された洗浄細菌を、D- マンノースを共有結合して含む市販のアガロース・ビーズ（アガロース-p-アミ ノフェニル-α-D-マンノピラノシド、シグマ、セントルイス、アメリカ合衆国） または無修飾のアガロース・ビーズ（4% ビーズ化アガロース、PL-バイオケミカ ル、ミルウォーキー、ウイスコンシン州、アメリカ合衆国）をPBS中に含む1:4懸 濁液を等量用いて顕微鏡スライド上で混合した。スライドを２分間傾け、その後 、干渉位相差顕微鏡（500倍、ニコン・オプティフォト）で観察した。マンノー スで被覆されたビーズへの細菌の接着の観察は、無修飾アガロース・ビーズへの 結合がない場合は、陽性反応と判断された。この試験の結果を、表３に示す。マ ンノース被覆アガロース・ビーズへの結合は、次のようにして評価した： − マンノースを欠くコントロール・ビーズと比較して、結合に差違は無い； ＋ 細菌は、薄層でビーズの表面領域の50％以上を覆っている； ± 細菌は、厚めの層でビーズの全表面領域を覆っており、時として多層コー ティングとして現れる。 D-マンノースで被覆されたアガロース・ビーズへの結合は、HT-29細胞に接着 し、マンノース感受性様式で赤血球を凝集する全てのプランタラム乳酸桿菌株、 即ち、グループ1cに属する全菌株、およびATCC 14917^T、グループ1bに属する256 および36Eで観察された。大抵の陽性の菌株は、マンノース被覆アガロース・ビ ーズに強く反応した；弱い反応は、プランタラム乳酸桿菌275およびATCC14917^T および256で観察された。マンノース感受性接着に対して陰性であった全てのプ ランタラム乳酸桿菌株はまた、サブグループ1aに属するプランタラム乳酸桿菌97 を除いて、マンノースで被覆されたビーズと陰性であった。しかしながら、プラ ンタラム乳酸桿菌97は、時として他の実験ではマンノース感受性接着を示した。 大腸菌506 MSは、強度に陽性であるプランタラム乳酸桿菌株と殆ど同じレベル で結合した。 細菌およびＨＴ−２９細胞のメタ過ヨウ素酸塩による酸化並びに酵素処理 洗浄した細菌またはHT-29細胞を、0.1 Mのクエン酸−リン酸緩衝液（pH 4.5） 中、0.01 Mのメタ過ヨウ素酸塩（メルク、アメリカ合衆国）に懸濁した。細菌は 、37℃で１時間インキュベートし、一方HT-29細胞は室温で15分間または30分間 インキュベートした。インキュベーション後、細菌または細胞をスピンダウンし 、PBS中で２回洗浄し、HBSSに再懸濁した。コントロールのインキュベーション を、上記と同じ緩衝液中0.01 Mのヨウ化ナトリウム（マリンクロット・ケミカル ワークス（Mallinckrodt Chemical Works）、セントルイス、ミズーリ州、アメ リカ合衆国）、あるいは緩衝液のみを用いて行った。 洗浄した細菌またはHT-29細胞を、2mg/mlのプロテイナーゼＫ（15単位/mg、シ グマ）を含むPBSまたはPBSのみに懸濁し、37℃で１時間インキュベートし、洗浄 して上記のように再懸濁した。 HT-29細胞を過ヨウ素酸塩で15分間または30分間処理すると、細胞崩壊が生じ ；処理と下記の接着アッセイ後には細胞の5-10%しか残らなかった。さらに、15 分間処理された細胞に対するプランタラム乳酸桿菌のマンノース感受性接着は、 高く維持（緩衝液コントロールとの関係で p=0.41）されたが、それに対して30分間処理された細胞は、プランタラム乳酸桿 菌にマンノース感受性様式では結合せず（緩衝液コントロールとの関係でp=0.03 3）、過ヨウ素酸塩での30分間処理によって、接着がほとんど破壊された（緩衝 液コントロールとの関係でp=0.0005、ヨウ素酸塩コントロールとの関係でp=0.00 67）。細菌細胞表面炭水化物の過ヨウ素酸塩による酸化は、結合にあまり影響し なかった。 プランタラム乳酸桿菌をプロテイナーゼＫで処理すると、それらのHT-29細胞 への接着能力が完全に破壊されたが（p=0.0008、表５）、大腸菌506 MSをこの酵 素で処理した後には、該細菌の接着にいかなる減少も観察されなかった。HT-29 細胞のプロテイナーゼＫ処理は、プランタラム乳酸桿菌299vの接着に明確な効果 を有しない(P=0.36)が、１型フィムブリエを有する大腸菌506 MSの接着を減少さ せる傾向（p=0.15、表４）があった。 これらの実験は、細胞結合レセプターが炭水化物の性質を有しており、細菌細 胞表面上のタンパク質構造が該レセプターへの接着に関連することを確認する。 ネズミチフス菌のＨＴ−２９細胞への接着 サルモネラ属は、下痢性疾患の主要な病原体である。多くのサルモネラ属の菌 株は、１型フィムブリエを有し ており、それはマンノース感受性赤血球凝集反応によって検出できる。 胃腸疾患を有する患者由来のサルモネラ属の菌株であって、赤血球のマンノー ス感受性凝集反応を示すネズミチフス菌11014(Salmonella typhimurium)が、こ の接着試験のために選ばれた。そのサルモネラ属の菌株を、炭酸緩衝液、pH 9.6 中で、細菌とFITC（フルオレセインイソチオシアネート、シグマ）を終夜冷却下 でインキュベートすることにより、蛍光プローブFITCで標識化した。該細胞は、 接着アッセイに使用する前に、３回洗浄した。 接着のために、0.1 ml HT-29細胞（5.10⁶/ml）を、5.10⁸蛍光サルモネラおよ び5.10⁸非標識プランタラム乳酸桿菌299または299vと混合した。該混合物を、エ ンド・オーバー・エンド回転で、冷却しながら30分間インキュベートした。細胞 を洗浄した後、接着している細菌を蛍光検出装置付きの顕微鏡でカウントした。 結果を、下記の表に示す。 上の表から、サルモネラ菌株がマンノース感受性メカニズムを介して、ヒト結 腸細胞であるHT-29細胞に接着したことが明らかである。このマンノース感受性 接着は、プランタラム乳酸桿菌によって高い程度までブロックされ得た。細菌は 、同時に等しい量で存在していた。 乳酸桿菌属の菌株が、病原性菌株より先に加えられていたならば、それがマン ノース特異的アドヘシン類を有する病原性細菌に代わって、それらの部位を占拠 し、これにより病原性細菌が定着し、疾病を引き起こすことを不可能にするよう である。 急性肝不全は、高い死亡率を有し、その死のかなりの 割合が、敗血症の高い発生率に起因し得る。非常に具合が悪いか又は免疫無防備 状態の患者では、殆どの感染症は患者自身の微生物叢によって引き起こされ、敗 血症または多臓器不全で死亡する多くの患者は腸内細菌を有するが、これらの感 染症が腸に由来したかもしれないことを示すいかなる敗血症巣も同定されない。 劇症性肝不全の際、臨床的に重要な細菌性敗血症が高い頻度で起こるがゆえに、 予防的処置の可能性が提起されてきた。急性肝不全においてまたは生命の危機を 伴う肝臓手術の後では、腸からの細菌移動の増加があり、これから、これらの状 況下で見られる感染性合併症の幾つかを説明できるかもしれない。そのメカニズ ムを明らかにし、可能な予防手段を見い出すために、下記のモデルがデザインさ れた。 ラットにおける試験 急性肝臓障害不全における乳酸桿菌の補給の効果 この実験の目的は、急性肝臓障害モデルにおいて、細菌移動の範囲に対する種 々の乳酸桿菌の菌株の直腸補給の効果を研究するためものである。結腸および盲 腸の腸内細菌の数に対する、そのような投与の影響についても調べた。 体重が200-300gの範囲の雄スプラグーダウリー(Sprag ue-Dawley)ラットを、６匹ずつ７群に分けた（正常、コントロールの急性肝臓障 害(ALI)、レウテリ乳酸桿菌R2CLを補給されたもの(SR)、ラムノサス乳酸桿菌271 を補給されたもの(SS)、プランタラム乳酸桿菌299vを補給されたもの(SP)、発酵 乳酸桿菌8704:3を補給されたもの(SF)、およびレウテリ乳酸桿菌108を補給され たもの(ST)）。全動物は、実験を通して通常のラット用餌（R3、ラクタミン・エ ービー(Lactamin AB)、ストックホルム）および水を随意に与えられ、12時間の 明暗サイクルで22℃の室温で飼育された。異なる乳酸桿菌属の菌株が、１日に１ 回、８日間、直腸から投与された。乳酸桿菌属の菌株の１日の補給は、動物１匹 につき3 ml中約3 x 10⁹ CFUであった。８日目に、1.1g/体重kgのD-ガラクトセア ミン（シグマ・ケミカル Co.、セントルイス、アメリカ合衆国）を腹腔内注射す ることにより、急性肝臓障害を誘発した。それにより腸管腔から遠位の臓器への 細菌漏出の増大をがもたらされる。急性肝臓コントロール群では、普通の食塩水 が８日間毎日補給され、肝臓障害が８日目に誘発された。肝臓障害の喚起から24 時間後に、サンプルを集めた。エーテル麻酔下に、正中切開によって無菌的に開 腹術を行った。門脈と大動脈の血液を、細菌学的試験のために集めた。肝臓の尾 状葉および腸間膜リンパ節(MLN)の サンプルを、細菌学的研究用に取得して、盲腸および直腸の内容物を細菌カウン ト用に取得した。 細菌学的分析において、組織サンプルを5 mlの滅菌輸送培地中においた。サン プルを、超音波浴内に５分間置き、チルターン（（Chiltern）、ターマグラス(T erma-Glas)、スウェーデン）上で２分間攪拌した。ブレインハートインフュージ ョン寒天BHI(Brain heart infusion agar BHI)（オキソイド(Oxoid)）上に1.0 m lのサンプルを置くことにより、全嫌気的プレート・カウント(total aerobic pl ate count)が行われ、37℃で３日間インキュベートされた。全嫌気的プレート・ カウントは、サンプルをBHI上に置き、嫌気的条件下で37℃でインキュベートす ることによって行われた。３日後、各プレート上に形成されたコロニー数をカウ ントし、最初の組織重量に対して修正した。組織サンプルは、組織グラム当りで 表示した。全数値は、平均値±SEMで示されている。結果は、不対スチューデン トt検定を用いて、統計学的に評価する。0.05未満の確率(probability level)が 、有意であると判断された(p＜0.05)。 ラットをプランタラム乳酸桿菌299vで予め処理すると、腸からの細菌移動が有 意に減少し、肝臓の状態が改善された。 細菌の微生物叢は、盲腸および結腸の内容物からサンプルを採取することによ って調べられた。それらのサンプルは、前述するように、直ちに5 ml滅菌輸送培 地に置かれ、超音波浴に入れられ、チルターン上で先のように攪拌された。嫌気 的に37℃で24時間インキュベートされたバイオレット赤-胆汁-グルコース寒天VR BG(Violet red-bile-glucose agar VRBG)（オキソイド）から、生存腸内細菌の 総数が得られた。 上記の表は、結腸ならびに盲腸の腸内細菌総数が、乳酸桿菌を補給された全て の群で減少したことを示す。 臨床試験 プロビバ（(Pro Viva); プランタラム乳酸桿菌299vで発酵されたオート麦を基 礎とするバラの実スープ、スカ スウェーデン）を、ポーランド、スゼゼチンの病院で急性胃腸炎を患っている26 人の子供に、平均5.5日間与えた。この製品は、朝200mlと夜200ml、１日につき4 00mlの量で 与えられた。 処置前、全ての子供は、１日に３〜９回のゆるい便があり、処置後には、それ が１日に１〜２回の便の頻度に減った。治療前、６人の患者は便培養物中に病原 体を有しており、それは、３人の子供についてサルモネラ、、２人の子供につい て腸内病原性大腸菌、各１人の子供についてエンテロバクター・アエレモナス(E nterobacter aeromonas)およびジアルジア・インテスティナリス(Giardia intes tinalis)であった。処置後、全てのこれらの病原体が便培養物から消失した。ジ アルジア・インテスティナリスを除いて、これら全ての病原体は、１型フィムブ リエを有し、マンノース特異的メカニズムを介して腸管上皮細胞に接着すること が知られている。上皮細胞上または粘膜層内でマンノース含有糖タンパク質の結 合部位に関して病原体と競合するプランタラム乳酸桿菌299vの能力が、プランタ ラム乳酸桿菌投与後に便培養物からこれらが細菌の消失した原因となったようで ある。 結 論 腸管に棲息するグラム陰性細菌間でのマンノース特異的アドヘシン類の広範囲 な存在は、これらのアドヘシン類が腸管のコロニー形成に重要であることを示唆 する。マンノース特異的アドヘシンは、これまでプランタラム 乳酸桿菌のようなグラム陽性種には確認されなかった。マンノース含有レセプタ ーに接着する能力が、この細菌が有する明白なコロニー形成能力に重要であると 推測され得る。しかしながら、粘膜レセプターに接着する能力を欠く細菌、例え ば腸上皮細胞に接着しない菌株271も、腸管の優れたコロニー形成体であり得る 。 上皮上でマンノース含有レセプターに結合する能力が、病原性細菌の効力を妨 害する特別な能力をプランタラム乳酸桿菌に与えるようである。第１に、それは 優れた腸管のコロニー形成体である。第２に、それは、病原性細菌のコロニー形 成能力に重要であるレセプター部位、即ち、マンノース含有粘膜レセプターに対 して、病原性細菌と競合する。第３に、腸管上皮細胞上に存在するレセプターに 結合することによって、プランタラム乳酸桿菌は、上皮細胞の即座の微細環境(m icromilieu)に影響し得る。従って、乳酸桿菌によって付与された微細環境の変 化は、乳酸桿菌属の細菌が上皮からより遠く離れた箇所に棲息する場合よりも、 より一層上皮細胞に影響するらしい。第４に、上皮細胞上のマンノース含有レセ プターに結合することによって、プランタラム乳酸桿菌は病原性細菌の付着を妨 げることができ、それにより、これら細菌の病原性作用にしばしば必須となる、 有毒な、さも なければ上皮細胞を直接刺激する物質を運搬するそれらの能力を減少させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヨハンソン マリー−ルイーゼ スウェーデン国 エス−222 46 ルンド フライゲルヴェーゲン 14 (72)発明者 モリン ゲーラン スウェーデン国 エス−224 67 ルンド エクザメンスヴェーゲン ２ (72)発明者 ウォルド アグネス スウェーデン国 エス−431 38 メール ンダール アンティロップガタン ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌の上皮細胞表面への 接着を阻害する薬学的組成物を調製するための、マンノース特異的アドヘシンを 有するプランタラム乳酸桿菌の使用。 ２． プランタラム乳酸桿菌がD-マンノース被覆アガロース・ビーズに接着する ことを特徴とする請求項１に記載の使用。 ３． プランタラム乳酸桿菌299v、寄託番号DSM 9843である請求項１または２に 記載の使用。 ４． 細菌による障害の予防的または治療的処置のための、マンノース特異的ア ドヘシン類を発現する病原性細菌の上皮細胞表面への結合を阻害する薬学的組成 物を調製するための、慣用されている担体と組合せてなる、請求項１〜３のいず れかに記載のプランタラム乳酸桿菌の使用。 ５． マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌のヒト腸上皮細胞表 面への接着を阻害する薬学的組成物を調製するための、マンノース特異的アドヘ シンを有するとともにヒト腸粘膜にコロニー形成する能力を有するプランタラム 乳酸桿菌の使用。 ６． １型フィムブリエを発現する腸内細菌、とくにク レブシエラ属、エンテロバクター属、プロテウス属、サルモネラ属および赤痢菌 属に属する細菌または大腸菌を阻害するための請求項１〜６のいずれかに記載の 使用。 ７． 無傷の腸上皮を越える病原性または潜在的に病原性の細菌の移動を予防的 および／または治療的に処置するための請求項１〜５のいずれかに記載の使用。 ８． マンノース特異的アドヘシン類を発現する病原性細菌のヒト膣および尿道 の上皮細胞への接着を阻害する薬学的組成物を調製するための、請求項１〜３の いずれか１つに記載のプランタラム乳酸桿菌の使用。 ９． １型フィムブリエを発現する大腸菌の接着を阻害するための請求項８に記 載の使用。