ES2200395T3

ES2200395T3 - Particulas con un revestimiento de polialdehido-dextrano que muestran efectos de matriz reducidos.

Info

Publication number: ES2200395T3
Application number: ES98960825T
Authority: ES
Inventors: Chengrong Wang
Original assignee: Dade Behring Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1997-12-10
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2018-12-08
Also published as: US6231982B1; JP2001513203A; DE69815298D1; EP0961934B1; WO1999030160A1; DE69815298T2; EP0961934A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA PREPARACION DE PARTICULAS MAGNETICAS Y NO MAGNETICAS, REVESTIDAS POR UNA SUSTANCIA DE DEXTRANO DE POLIALDEHIDO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL PROCEDIMIENTO DE FABRICACION DE ESTAS PARTICULAS. LAS PARTICULAS REVESTIDAS DE DEXTRANO DE POLIALDEHIDO DE ESTA INVENCION, QUE PUEDEN PARTICULARMENTE UTILIZARSE EN ANALISIS INMUNOLOGICOS, PRESENTAN UN EFECTO DE MATRIZ REDUCIDO RESPECTO A LAS PARTICULAS TRADICIONALES, QUE ESTAN DESPROVISTAS DE CUALQUIER REVESTIMIENTO DE DEXTRANO DE POLIALDEHIDO.

Description

Partículas con un revestimiento de polialdehído-dextrano que muestran efectos de matriz reducidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a partículas de uso en ensayos inmunológicos. Específicamente, esta invención se refiere a partículas revestidas con una sustancia de polialdehído-dextrano, para reducir el efecto de matriz en los ensayos inmunológicos.

Antecedentes de la invención

El uso de partículas poliméricas, incluyendo a las partículas coloidales, tanto magnéticas como no magnéticas, para unir un compuesto se conoce y se usa en los procedimientos industriales y de laboratorio desde hace tiempo. Por ejemplo, las partículas esféricas de poliestireno-divinilbenceno, resinas de Merrifield, se encuentran entre las primeras y más ampliamente usadas como partículas de sustrato modernas. Estas partículas encontraron gran utilidad en síntesis orgánica, en catálisis para heterogeneizar catalizadores homogéneos, y en materia biotécnica. Debido a que estas primeras partículas eran bastante grandes, podían separarse fácilmente por filtración. No obstante, en algunos campos, y especialmente en bioquímica, resulta deseable usar partículas de tamaño coloidal, debido a que el material usado es escaso, caro, o debe usarse en un procedimiento en el que no pueden usarse partículas más grandes. Cuando las partículas son de tamaño coloidal, no obstante, su separación del medio líquido puede resultar larga y difícil, ya que las partículas coloidales tienden a revestir y obstruir los poros de los filtros. Así pues, las partículas coloidales magnéticas se usan frecuentemente para evitar estas dificultades.

El uso de partículas magnéticas, específicamente partículas magnéticas que poseen un revestimiento polimérico, es de gran utilidad, ya que dichas partículas pueden elevarse magnéticamente hacia un lado del vaso de precipitados, y así decantar simplemente el grueso de la reacción. [Tal y como se usan en la presente invención, las palabras "partícula" o "sustrato particulado" o una variación de éstas, abarcan a las esferas, esferoides, bolas y otras formas. Estas palabras se usan indiferentemente en la presente invención, si no se especifica lo contrario.] Las partículas magnéticas son especialmente útiles en aplicaciones biológicas, especialmente en los casos en los que enzimas, anticuerpos y otras sustancias se unan al revestimiento superficial de las partículas. Las enzimas, anticuerpos u otras sustancias así unidas pueden usarse para capturar un material específico de una muestra, con objeto de concentrarlo y analizarlo, o para capturar un material indeseable de una muestra, dejando al material deseado en la muestra para su posterior uso.

Las consideraciones prácticas limitan la utilidad de la mayoría de las partículas magnéticas revestidas con polímeros en aplicaciones médicas y biológicas. Son factores importantes a considerar el tamaño y forma uniformes de la partícula, la necesidad de un reactivo o muestra de análisis que se una firmemente a la partícula, la biodegradabilidad de la partícula o revestimiento de partícula, de modo que una muestra de análisis pueda recuperarse, y el efecto que la partícula o revestimiento de partícula ejerza sobre los resultados del análisis cuando se analiza una muestra a diversas concentraciones o en diferentes medios, tales como el suero, sangre total o agua, para determinar una curva patrón o la concentración de una sustancia en una muestra de análisis. Se han descrito numerosos tipos de partículas, magnéticas y no magnéticas, en la bibliografía de patentes y técnica, y muchas de ellas se encuentran disponibles comercialmente en fuentes bien conocidas para los expertos en la materia. Pueden encontrarse ejemplos de partículas magnéticas y no magnéticas en las Patentes de Estados Unidos Nºs 5.169.754; 5.248.772 y 5.527.713 (las patentes '754, '772 y '713 todas ellas de Siiman y colaboradores) y en los antecedentes en ellas citados. La Patente de Estados Unidos
US-A-4.452.773 describe partículas magnéticas que poseen un núcleo de Fe_{3}O_{4} revestido con un derivado de dextrano que posee grupos aldehído. El documento WO-A-94/09368 describe partículas poliméricas magnéticas y no magnéticas que se han revestido con aminodextrano entrecruzado con glutaraldehído. La Patente de Estados Unidos
US-A-4.801.504 describe partículas poliméricas revestidas con un dextrano funcionalizado con aldehído. Ninguno de estos documentos menciona cómo se une la capa de dextrano a la partícula, o la presencia de grupos reactivos al aldehído sobre la superficie de dichas partículas. Aunque se ha encontrado que las partículas disponibles comercialmente y las partículas descritas en estas patentes son de utilidad en aplicaciones biológicas, especialmente en ensayos inmunológicos, dichas partículas son conocidas también por mostrar un "efecto de matriz" que supone una grave limitación en la utilidad de tales partículas.

Un "efecto de matriz" tiene lugar cuando una muestra se analiza en medios de muestra variables, por ejemplo, suero, sangre total y agua, o a concentraciones variables en un solo medio. Los resultados de los análisis pueden mostrar un desplazamiento de matriz o una desviación de la media, que depende del medio de disolución y/o de la concentración. En concreto, el efecto de matriz tiene lugar cuando se usan partículas para eliminar un exceso de reactivo, de modo que la disolución remanente pueda analizarse en busca de una especie en concreto. Frecuentemente, las partículas también eliminan sustancias adicionales, a menudo de naturaleza desconocida. Esta eliminación produce la variación o efecto de matriz, y hace que sea extremadamente difícil reproducir los resultados de los análisis o correlacionar los resultados de los análisis o ensayos de un día a otro, o de un análisis a otro llevado a cabo el mismo día.

Se ha encontrado que las partículas disponibles actualmente muestran un efecto de matriz. Como consecuencia de ello, resultaría ventajoso disponer de partículas que minimizasen el efecto de matriz. El tipo de análisis que se beneficiaría de tales sustratos minimizadores del efecto de matriz generalmente es conocido por los expertos en la materia, y pueden encontrarse ejemplos en las Patentes de Estados Unidos Nºs 4.661.408 (la patente '408) y 5.151.348 (la patente '348), ambas de Lau y colaboradores.

Así pues, es un objeto de la invención proporcionar partículas magnéticas y no magnéticas aptas para su uso en los ensayos inmunológicos y compatibles con sustancias biológicas.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar partículas magnéticas y no magnéticas que, cuando se usan en los ensayos inmunológicos, minimicen el efecto de matriz al eliminar selectivamente de un medio de disolución las especies que se desea eliminar.

También es un objeto de la invención proporcionar partículas magnéticas o no magnéticas aptas para su uso en ensayos inmunológicos con anticuerpos, enzimas y sustancias bioquímicas similares.

Resumen de la invención

La invención proporciona partículas magnéticas y no magnéticas, incluyendo a las partículas de tamaño coloidal, que poseen un revestimiento de dextrano o derivado del dextrano (en la presente invención, un "revestimiento coloidal") y que son aptas para su uso en ensayos inmunológicos. Las partículas de la invención se preparan oxidando el dextrano en primer lugar con agentes oxidantes elegidos para obtener una sustancia derivada del dextrano que posee una pluralidad de grupos aldehído colgantes, un polialdehído-dextrano, que hace que la sustancia derivada del dextrano se acople a una partícula magnética o no magnética que posee grupos amino colgantes y otros grupos funcionales reactivos con los grupos aldehído, para obtener una partícula revestida de dextrano útil en los ensayos inmunológicos. Las partículas así revestidas son aptas para su uso en los ensayos inmunológicos y muestran un efecto de matriz reducido con respecto a las partículas convencionales, disponibles comercialmente, sin el revestimiento de polialdehído-dextrano de la invención.

Descripción detallada de la invención

Las partículas revestidas de acuerdo con la invención pueden ser de cualquier tamaño en el intervalo de área superficial de 10-100 m^{2}/g. Para los ensayos inmunológicos, se prefiere a las partículas que poseen un área superficial en el intervalo de 10 a 60 m^{2}/g. Las partículas pueden ser magnéticas o no magnéticas, prefiriéndose a las partículas magnéticas, debido a la facilidad de separación que proporcionan en los ensayos inmunológicos. Un ejemplo de tales partículas magnéticas incluye a aquellas que poseen un núcleo magnético rodeado de un material polimérico. El material polimérico puede ser cualquier material polimérico adecuado para su uso en los ensayos inmunológicos, prefiriéndose al poliestireno y al poliestireno-divinilbenceno por su fácil disponibilidad. Además, preferiblemente el material polimérico posee grupos funcionales reactivos a los grupos aldehído, o bien puede modificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica para contener tales grupos reactivos a los aldehídos. Entre los ejemplos de tales grupos funcionales se incluyen los grupos amino, hidracina, hidracida, aminooxi, cianuro y alcohol, prefiriéndose a los grupos amino.

Si las partículas son magnéticas, el material magnético contenido en las partículas puede ser cualquier material magnético susceptible de atracción mediante un magneto permanente o un electromagneto. Entre los ejemplos de tales materiales magnéticos se incluyen los óxidos magnéticos de hierro, óxidos magnéticos de cromo, MnFeO_{4}, ZnFeO_{4}, CoFe_{2}O_{4} y materiales magnéticos similares.

Otro ejemplo de partículas magnéticas que pueden usarse en la práctica de la invención son las partículas magnéticas de óxido de cromo que poseen grupos superficiales colgantes que son reactivos al aldehído o que pueden modificarse para contener dichos grupos reactivos al aldehído. Entre tales partículas magnéticas de óxido de cromo se incluyen aquellas que comprenden un núcleo de CrO_{2} que posee una superficie reducida que se reviste a continuación con sílice, y se reviste adicionalmente con un silano, tal y como describe Lau en la patente '408. La capa de silano externa es capaz de unir a proteínas, incluyendo a anticuerpos y a especies antígeno, ligandos, haptenos o compuestos de unión, directamente o mediante agentes de acoplo intermedios, al núcleo revestido. Los agentes de unión y/o acoplo útiles en la práctica de la invención incluyen ácidos y anhídridos dicarboxílicos, poliaminas, polialdehídos, y agentes heterobifuncionales tales como clorhidrato de 2-iminotiolano, sulfosuccinimidil-4-(N-maleidometil)ciclohexano-1-carboxilato, éster de m-maleimidosuccinimida, aminobenzoato de N-succinimidil-(4-iodoacetilo), y especies similares conocidas por los expertos en la materia.

Los materiales de dextrano usados en la práctica de la invención pueden ser de cualquier peso molecular, por ejemplo, desde aproximadamente 20.000 hasta aproximadamente 2.000.000 Dalton de peso molecular. Dichos materiales se encuentran disponibles comercialmente.

En general, un polialdehído-dextrano se prepara por escisión y oxidación parcial de aproximadamente 2% a aproximadamente 20% de los anillos de glucopiranosa en el dextrano. No obstante, debido a que la posibilidad de ruptura de la estructura polimérica de una molécula de dextrano aumenta conforme aumenta el número de anillos oxidados, el porcentaje de anillos oxidados se encontrará preferiblemente entre aproximadamente 2% y aproximadamente 15%, y preferentemente entre aproximadamente 2% y aproximadamente 10%.

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En la práctica de la invención, puede usarse cualquier agente oxidante conocido por los expertos en la materia, que sea adecuado para la escisión y oxidación parcial de los anillos de glucopiranosa-dextrano. Entre los ejemplos de tales agentes oxidantes se incluyen los compuestos perhalogenados de fórmula XO_{4}^{-1}, en la que X = Cl, Br o I, ozono, peróxidos y agentes oxidantes similares. Se prefiere al peryodato sódico. La cantidad de agente oxidante usada en la práctica de la invención se basa en la consideración de que un solo anillo de glucopiranosa puede abrirse y oxidarse para contener dos grupos aldehído sin fracturar los enlaces que le unen a otros anillos de glucopiranosa en la molécula de dextrano. Como consecuencia, se debería tener cuidado con el procedimiento de escisión/oxidación del anillo, con objeto de asegurar que no tiene lugar una oxidación excesiva que podría resultar en la fractura de la molécula de dextrano en especies de menor peso molecular.

Como resultado de la oxidación parcial, el producto resultante contiene anillos de glucopiranosa unidos entre sí mediante derivados de los anillos que contienen grupos aldehído, un material polialdehído-dextrano (PAD). El material PAD se hace reaccionar con un sustrato particulado que posee grupos funcionales reactivos al aldehído, tales como aminas, para dar lugar a un sustrato particulado revestido con PAD, adecuado para su uso en ensayos inmunológicos. Cuando se usa en tales ensayos, las partículas revestidas con PAD producen un efecto de matriz reducido o minimizado con respecto a partículas similares que no se han revestido con PAD. Las partículas revestidas con PAD de todos los tipos, tanto magnéticas como no magnéticas, de naturaleza polimérica, como las bolas de poliestireno y látex, o de naturaleza no polimérica, como las partículas magnéticas de óxido de cromo descritas anteriormente, son capaces de unirse a proteínas, incluyendo a anticuerpos y especies antígeno, ligandos, haptenos o compuesto de unión, directamente o mediante agentes de acoplo intermedios.

Los siguientes ejemplos se dan a modo de ilustración de la invención, y no deben tomarse como limitantes de la misma. Por ejemplo, un dextrano de 2.000.000 de peso molecular puede usarse en lugar del dextrano de 40.000 de peso molecular usado en los ejemplos. Según la presente invención, el término agua se refiere a agua desionizada o destilada.

Preparación de polialdehído-dextrano

Se disuelven dieciséis gramos de dextrano de peso molecular 40.000 (PM) en aproximadamente 60 ml de agua desionizada, y se añaden 2,1143 g (9,88 mmol) de peryodato sódico (NaIO_{4}) en agitación a temperatura ambiente (aproximadamente 18-30ºC). La proporción entre dextrano y NaIO_{4} usada en la reacción es de aproximadamente 10:1. Una vez completada la adición de peryodato sódico, la mezcla de reacción se agita durante una noche, aproximadamente 12-20 horas, a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción se dializa tres veces frente a cuatro litros de agua. Tras la diálisis, la disolución dializada que contiene polialdehído-dextrano (PAD) se liofiliza para obtener un polialdehído-dextrano seco.

El grado de formación de polialdehído y el porcentaje de anillos de dextrano abiertos puede determinarse usando un patrón que contenga naranja de metilo y clorhidrato de hidroxilamina. Para preparar el patrón, se colocan 4,375 g de clorhidrato de hidroxilamina y aproximadamente 1 mg de naranja de metilo en un matraz volumétrico de 250 ml. Se añaden aproximadamente 200 ml de agua desionizada; y se agitan vigorosamente los contenidos del matraz hasta que se disuelven el clorhidrato de hidroxilamina y el naranja de metilo. El pH de la disolución resultante se ajusta a aproximadamente 4 usando una disolución de ácido clorhídrico o hidróxido sódico, para dar una disolución que posea un color entre rojo y amarillo, es decir, un color naranja. El volumen de la disolución resultante se ajusta entonces a 250 ml usando agua desionizada, para obtener una disolución de hidroxilamina 0,25 N (Normal) de color naranja.

El grado de sustitución de aldehído presente en el producto PAD se determina disolviendo 100 mg del material PAD liofilizado en 25 ml de la disolución patrón de clorhidrato de hidroxilamina 0,25 N. Se deja reposar la disolución resultante a temperatura ambiente durante 2 horas, para asegurar la completa disolución del material PAD y el desarrollo de un color rojo. A continuación, se valora la disolución usando NaOH 0,0100 N hasta que el color de la disolución que contiene PAD coincide con el color naranja del patrón de clorhidrato de hidroxilamina 0,25 N. El grado de sustitución del aldehído puede calcularse entonces usando la fórmula:

D = [V x C x PM] - 100

en la que:

1. D equivale al grado de sustitución en tanto por ciento;

2. V equivale al volumen de NaOH 0,0100 N usado para ajustar el color de la disolución de clorhidrato de hidroxilamina que contiene PAD;

3. C es 0,0100, la concentración de la disolución de NaOH; y

4. PM es el peso molecular del material de dextrano inicial, que en los ejemplos de la presente invención es 40.000.

En el ejemplo anterior, se determinó que aproximadamente 5% de los anillos de glucopiranosa-dextrano se oxidaron para generar aproximadamente 24 grupos aldehído por molécula.

Preparación de Partículas de PAD-Cromo

Se obtuvieron partículas magnéticas de cromo con grupos amina colgantes como las descritas en la patente '408 en DuPont Company, y se lavaron tres veces con una disolución salina tampón fosfato (PBS) como 1X PBS descrita en la patente '713 en la columna 10, líneas 42-45, o PBS como la descrita en la patente '348 en la columna 6, líneas 2-4. Después de lavar, las partículas de cromo se diluyeron con PBS a 5% p/v. Se disolvió una muestra de 9,045 g de PAD (40.000 PM, 5,43 mmol de grupos -CHO) y 0,845 g de NaCNBH_{3} (13,5 mmol) en PBS, y se añadieron 150 ml de la disolución de partículas de cromo al 5% p/v a la disolución de PAD. La mezcla de reacción se rotó mecánicamente a temperatura ambiente durante aproximadamente 48 horas. Entonces, las partículas se mantuvieron magnéticamente en un lado del vaso de reacción, se decantó la disolución de reacción, y se lavaron las partículas tres veces con PBS y tres veces con agua. Alternativamente, puede usarse un procedimiento preferido de centrifugación a aproximadamente 2.000 hasta aproximadamente 5.000 rpm, preferiblemente a aproximadamente 3.300 rpm hasta aproximadamente 3.500 rpm, y decantación del líquido sobrenadante. Las partículas de PAD-Cromo resultantes se diluyeron entonces con 60 ml de agua hasta 5% p/v.

Las partículas de PAD-Cromo preparadas según se ha descrito se usaron en un ensayo inmunológico para medir la ciclosporina A en muestras de sangre total o de suero. Para llevar a cabo en ensayo, se activó en primer lugar una muestra de 60 ml de PAD-Cromo al 5% p/v mediante la adición de 0,5885 g de NaIO_{4} a la disolución de
PAD-Cromo. La mezcla resultante se agitó mecánicamente durante una noche, aproximadamente 12-20 horas, a temperatura ambiente. Una vez completada la rotación, las partículas se mantuvieron magnéticamente en el vaso de reacción, se decantó la disolución, las partículas se lavaron tres veces con PBS y tres veces con agua, y finalmente se diluyeron con PBS para producir 60 ml de disolución de partículas al 5% p/v.

Preparación de Ciclosporina C-CA-IgG para unirla a partículas de PAD-Cromo

En un procedimiento separado, se derivatizó la ciclosporina C con un ácido dicarboxílico o anhídrido de ácido dicarboxílico mediante los procedimientos conocidos por los expertos en la materia, para formar un derivado de ciclosporina C-ácido hemidicarboxílico, CsC-CA, parecido al derivado ciclosporina C-hemisuccinato descrito en la patente '348 en la columna 4, líneas 28-34. [Nota: Ciclosporina A también puede usarse en el procedimiento, pero es más difícil de derivatizar debido a que sólo posee un grupo hidroxilo, que está estéricamente impedido. La ciclosporina C posee dos grupos hidroxilo, uno de los cuales está estéricamente impedido, como en la ciclosporina A, y el otro no lo está. Esta diferencia no afecta a los resultados del ensayo inmunológico. Puede reemplazarse la ciclosporina C usada en estos ejemplos por ciclosporina A]. La especie CsC-CA se une a continuación a una proteína como la albúmina o una globulina, mediante los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. CsC-CA se unió a IgG para formar el conjugado CsA-CA-IgG, apto para unirse a un sustrato.

En un procedimiento preferido, la ciclosporina C se derivatizó en primer lugar con una diamina, y a continuación con un ácido dicarboxílico o un anhídrido de ácido dicarboxílico mediante los procedimientos conocidos por los expertos en la materia, para formar un derivado ciclosporina C-diamina-ácido hemicarboxílico, CsC-DA, parecido a la especie CsC-CA descrita anteriormente y a la ciclosporina C-hemisuccinato descrita en la patente '348 en la columna 4, líneas 28-38. La especie CsC-DA se conjugó entonces con IgG tal y como se ha descrito anteriormente, y en último lugar con PAD-Cromo para formar CsC-DA-IgG-PAD-Cromo. El uso de la diamina para formar la especia CH_{3}CDA constituye el objeto de la Patente de Estados Unidos Nº 5.990.274.

Cabe destacar que tanto las partículas de CsC-DA-IgG-PAD-Cromo como las partículas de CsC-CA-PAD-Cromo dieron lugar a un efecto de matriz reducido con respecto a las partículas que no contenían PAD, por ejemplo, CsC-CA-IgG-Cromo. Los datos que se presentan en la presente invención se obtuvieron usando las partículas de CsC-DA-IgG-PAD-Cromo de la invención y las partículas de CsC-CA-IgG-Cromo de la técnica anterior.

Los ácidos dicarboxílicos y los anhídridos de ácidos dicarboxílicos pueden elegirse del grupo formado por los ácidos o anhídridos malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, ftálico, isoftálico, y tereftálico, y especies similares. Se prefiere a los anhídridos de ácido.

La diamina usada para preparar CsC-DA puede ser cualquier diamina de fórmula general H_{2}NCH_{2}-(CH_{2})_{x}-CH_{y}-(CH_{3}) _{2}-NH_{2} y C_{6}H_{4+a}(NH_{2})_{2}, en las que x = 0-3, y = 1 ó 2, y z = 1 cuando y = 1 o z = 0 cuando y = 2; y a = 0 ó 6. Entre los ejemplos se incluyen etilendiamina, fenilendiamina, propilendiamina, 1,4-ciclohexanodiamina, tetrametilendiamina y compuestos diamina similares. Además, en la práctica de la invención pueden usarse también otras poliaminas. Son ejemplos de tales poliaminas adicionales, sin limitación a éstas, dietilentriamina, 1,5-diamino-3-(2-aminoetil)pentano y poliaminas similares. Además, en la práctica de la invención también pueden usarse compuestos éter que contengan aminas. Entre los ejemplos de tales compuestos, sin limitación a éstos, se incluyen etilenglicol-bis-(2-aminoetil) éter, etilenglicol-bis-(3-aminopropil) éter y compuestos similares conocidos por los expertos en la materia.

Unión de CsC-DA-IgG a partículas de PAD-Cromo

Las partículas magnéticas de PAD-Cromo se lavaron tres veces con PBS antes de la reacción con el conjugado CsC-DA-IgG. Después del lavado, se prepararon 150 ml de una disolución acuosa de partículas de PAD-Cromo al 5% en p/v, y se añadieron 150 ml de una disolución que contenía 300 mg de CsC-DA-IgG sobre la disolución de PAD-Cromo. Después de la adición de la disolución de CsC-DA-IgG, se añadieron 168 mg de NaCNBH_{3} y la reacción resultante se rotó mecánicamente a temperatura ambiente fresca, unos 4ºC, durante aproximadamente 48 horas. Tras la rotación, se añadieron 120 ml de albúmina de suero bovino acuoso (BSA) al 30% y 240 mg de NaCNBH_{3} a la mezcla de reacción, y la mezcla resultante se rotó mecánicamente durante 16-20 horas adicionales. La reacción de acoplo o conjugación se interrumpió por la adición de 420 ml de tampón de Glicina 2 M a la mezcla de reacción, seguido de rotación mecánica durante aproximadamente 1 hora. Las partículas magnéticas de PAD-Cromo derivatizadas se mantuvieron entonces en un lado del vaso de reacción mediante el uso de un magneto manual, se decantó la disolución de reacción, y las partículas se lavaron tres veces con agua, tres veces con metanol y tres veces con tampón PBS. Alternativamente, se separaron las partículas por centrifugación según se describe en la presente invención, una vez decantado el líquido sobrenadante. Después del último lavado, se diluyeron las partículas con 150 ml de PBS para dar lugar a una disolución de partículas de CsC-DA-IgG-PAD-Cromo al 5% en p/v, designada como Muestra Nº 40-101A.

Partícula de Ciclosporina C-Cromo sin PAD

Con objeto de comparar con las partículas de CsC-DA-IgG-PAD-Cromo de la invención, se prepararon partículas de CsC-CA-IgG-Cromo, sin el revestimiento de PAD sobre las partículas de cromo, y se designaron como Muestra Nº 66-37. Estas partículas se prepararon haciendo reaccionar partículas magnéticas de cromo que poseen grupos amino colgantes con glutaraldehído, seguido de la reacción con la especie CsC-CA-IgG para generar partículas de CsC-CA-IgG-Cromo. Se comparó la ciclosporina A de los dos tipos de partículas en un ensayo inmunológico, usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como los que se dan en la patente '348.

Ensayo de Ciclosporina A:

Las muestras que contenían ciclosporina A se obtuvieron en:

Muestra A. Ciba-Corning (líquido congelado TDM I.2, Lot 952051), no se da la ciclosporina nominal;

Muestra B: Baxter Dade (Control de Ensayo Inmunológico L1, Lot 1AC-1I6M), valor nominal de ciclosporina A de 11-46 ng/ml;

Muestra C: BioRad (control de sangre total humana, Lot 73032 L2), y valor nominal de ciclosporina A de 126-196 ng/ml; y

Muestra D: Baxter Dade (TDM Plus XL, Lot TDL2-206), y valor nominal de ciclosporina A de 147-175 ng/ml.

Las células de las muestras que contenían ciclosporina A se sometieron a lisis mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia, para liberar la ciclosporina A; por ejemplo, mediante el uso de un detergente.

Se preparó una disolución patrón del anticuerpo anti-ciclosporina A marcado con \beta-D-galactosidasa, según los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. La concentración de anti-ciclosporina A-\beta-D-galactosidasa en la disolución patrón era de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 mg/ml. La disolución patrón se diluyó en proporción de 1:100 a 1:300, de patrón a agua, para su uso en los ensayos inmunológicos. El conjugado anti-ciclosporina A-\beta-D-galactosidasa se designó CGC (conjugado de ciclosporina-galactosidasa). El anticuerpo anti-ciclosporina puede ser policlonal o monoclonal y puede obtenerse comercialmente o prepararse según los procedimientos conocidos. Se prefiere al anticuerpo monoclonal.

Se llevó a cabo el ensayo inmunológico unido a enzima de ciclosporina A de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En general, los procedimientos usados para demostrar la utilidad de la invención siguen a los descritos en la patente '348. Por ejemplo, se añadió una cantidad en exceso de CGC a las muestras que contenían ciclosporina A obtenidas a partir de las células sometidas a lisis, Muestras de A a D, y la mezcla resultante se incubó durante un periodo de tiempo en el intervalo de 0,5-20 minutos, generalmente 1-5 minutos. Después de la incubación, cada muestra se dividió en dos partes y se añadió una cantidad de partículas de PAD-Cromo 40-101A a una parte, y partículas sin PAD 66-37 (es decir, partículas de Cromo) a otra parte. Las disoluciones resultantes se incubaron durante aproximadamente 1-10 minutos para permitir que CGC se una a las partículas. Las partículas se mantuvieron magnéticamente en un lado del vaso de reacción y se decantó la disolución de reacción. La disolución de reacción resultante se sometió a un ensayo inmunológico de ciclosporina A usando clorofenol rojo-\beta-D-galactosidasa (CPRG) o resorufina-\beta-D-galactosidasa (ReG) como sustrato de \beta-D-galactosidasa para producir un cromóforo.

Alternativamente, se prepararon columnas de soporte sólido que contenían partículas de CsC-DA-IgG-PAD-Cromo o CsC-CA-IgG-Cromo según se describe en la patente '348. Para cada una de las muestras de la A a la D se usó un par de columnas. Se añadió un exceso de CGC a cada muestra y se incubó la muestra tal y como se ha descrito. Después de la incubación, se inyectó la muestra en un analizador clínico tal y como se describe en la patente '348, se eluyó a través de la columna según se ha descrito y se recogió. Después de la elución, se añadió sustrato de \beta-D-galactosidasa a la disolución y se midió la absorbancia a 577 nm.

Con objeto de obtener una curva patrón para los resultados del análisis de comparación de las partículas de
PAD-Cromo y de Cromo, se preparó una muestra de sangre total que contenía 0, 125, 350, 700 y 1100 ng/ml de ciclosporina A. Estas muestras se ensayaron inmunológicamente tal y como se ha descrito, usando CGC y los resultados se dan en las Tablas 1 y 2. Los resultados de las Tablas 1 y 2 indican que las muestras de sangre total tratadas con partículas de PAD-Cromo 40-101A de la invención dan una respuesta separatoria mayor con respecto a las muestras tratadas con las partículas de Cromo 66-37 de la técnica anterior. Se cree que la separación mejorada de la respuesta se debe al hecho de que las partículas de PAD-Cromo son más selectivas, eliminando a CGC y un poco de las otras sustancias con respecto a las partículas de Cromo de la técnica anterior.

TABLA 1

Resultados de Ciclosporina a usando una Dilución de CGC 1:300
	mA/min
ng/ml de Ciclosporina A	Partículas de Cromo^{1}	Partículas de PAD- Cromo^{2}
0	107	83
125	126	137
350	153	226
700	183	301
1100	204	333
Nota:1. Partículas de Cromo de la muestra 66-37
\hskip0,7cm 2. PAD-Cromo de la muestra 40-101A

TABLA 2

Resultados de Ciclosporina a usando una Dilución de CGC 1:100
	mA/min
ng/ml de Ciclosporina A	Partículas de Cromo^{1}	Partículas de PAD- Cromo^{2}
0	256	161
125	327	373
350	427	646
700	529	861
1100	585	970^{3}
Nota:1. Partículas de Cromo de la muestra 66-37
\hskip0,7cm 2. PAD-Cromo de la muestra 40-101A
\hskip0,7cm 3. Monocromático, mA/min es aproximadamente 1200

Después de que el análisis inicial con ciclosporina A marcase las muestras de sangre total, las partículas de PAD-Cromo y las partículas de Cromo de la técnica anterior se usaron en bioensayos con las muestras de la A a la D que contenían ciclosporina A. Estos bioensayos se llevaron a cabo según se describe en la presente invención y en la patente '348, y los resultados se muestran en la Tabla 3. Los resultados indican que cuando una fuente de sangre total se trata con partículas de PAD-Cromo para eliminar el exceso de CGC, el efecto de matriz que se aprecia entre las diluciones de CGC de 1:300 y 1:100 se minimiza. Por ejemplo, para la muestra de sangre A de Ciba-Corning y partícula de PAD-Cromo para eliminar el exceso de CGC, la diferencia en el ensayo entre usar 1:300 y 1:100 de CGC (91,8-66,2=-25,6) es menor que la diferencia para el mismo ensayo cuando se usan partículas de cromo convencional para eliminar el exceso de CGC (209,3-95,6=113,7). El hecho de que los resultados de los ensayos no sean los mismos en ambas diluciones indica que cuando las partículas se añaden a la muestra de análisis para eliminar el exceso de CGC, también eliminan algunas sustancias desconocidas que afectarían a los resultados del análisis. No obstante, los resultados también indican que las partículas de PAD-Cromo de la invención minimizan este efecto de matriz.

TABLA 3

Comparación de Partículas de PAD-Cromo con
Partículas de Cromo Convencional
Muestra	Partícula	CGC 1:300 mA/min	CGC 1:100 mA/min	mA/min^{1} (1:300-1:100)
A	PAD-Cromo^{2}	91,8	66,2	25,6
	Cromo^{3}	209,3	95,6	113,7
B	PAD-Cromo	6,6	46,3	39,7
	Cromo	6,3	-88,9	95,2
C	PAD-Cromo	99,5	98,0	1,5
	Cromo	205,7	147,5	58,2
D	PAD-Cromo	87,5	74,7	12,8
	Cromo	16,3	98,8	85,5
Nota:1. "mA/min" (1:300-1:100) es el valor absoluto de la diferencia en la velocidad de absorbancia
para una sola muestra de sangre y sustrato particulado usando dos diluciones diferentes de CGC
\hskip0,7cm 2. PAD-Cromo pertenece a la muestra de partículas 40-101A
\hskip0,7cm 3. Cromo pertenece a la muestra de partículas 66-37

Claims

1. Partículas que muestran un efecto de matriz reducido en los ensayos inmunológicos, comprendiendo dichas partículas partículas magnéticas o no magnéticas que contienen grupos funcionales reactivos al aldehído y que comprenden un revestimiento de polialdehído-dextrano, formado dicho revestimiento por el enlace covalente entre una sustancia polialdehído dextrano y los grupos funcionales reactivos al aldehído.

2. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 1, en las que la partícula es una partícula magnética que comprende un núcleo de un material magnético, un material polimérico que reviste al núcleo magnético, y grupos funcionales reactivos al aldehído dependientes del material polimérico.

3. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 1, en las que la partícula es una partícula magnética que comprende un núcleo de óxido de cromo, que posee una superficie reducida, un revestimiento de sílice, y un revestimiento de silano que posee grupos funcionales reactivos al aldehído o que es capaz de ser derivatizado para que contenga grupos funcionales reactivos al aldehído.

4. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 1, en las que el polialdehído-dextrano posee un peso molecular de 20.000 a 2.000.000 de Daltons.

5. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 4, en las que el polialdehído-dextrano se prepara mediante escisión y oxidación parcial de los anillos de glucopiranosa-dextrano, siendo el número de anillos parcialmente escindidos y oxidados en dicho polialdehído-dextrano de 2% a 20%, y manteniéndose el peso molecular del polialdehído-dextrano prácticamente igual.

6. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 1, en las que los reactivos particulados comprenden además un antígeno, anticuerpo, proteína, hapteno, ligando y compuestos de unión enlazados al revestimiento de polialdehído-dextrano directamente o mediante agentes de acoplo intermedios.

7. Partículas de óxido de cromo magnético revestidas con polialdehído-dextrano que muestran un efecto de matriz reducido en los ensayos inmunológicos, que comprenden un núcleo de óxido de cromo magnético, que posee una superficie reducida, y revestidas con una o una pluralidad de revestimientos, terminando con un revestimiento que posee grupos funcionales reactivos al aldehído, y un material polialdehído-dextrano enlazado a dichas partículas de óxido de cromo mediante una reacción covalente entre los grupos aldehído del dextrano y los grupos reactivos al aldehído.

8. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 7, en las que el material de polialdehído-dextrano posee un peso molecular de 20.000 a 2.000.000 de Daltons.

9. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 7, en las que el polialdehído-dextrano se prepara mediante escisión y oxidación parcial de los anillos de glucopiranosa-dextrano, siendo el número de anillos parcialmente escindidos y oxidados en dicho polialdehído-dextrano de 2% a 20%, y permaneciendo el peso molecular del polialdehído-dextrano prácticamente igual.

10. Las partículas de acuerdo con la reivindicación 7, en las que las partículas comprenden además un antígeno, anticuerpo, proteína, hapteno, ligando y compuestos de unión enlazados al revestimiento de polialdehído-dextrano directamente o mediante agentes de acoplo intermedios.

11. Un procedimiento para elaborar una partícula revestida de polialdehído-dextrano, según se define en las reivindicaciones de 1 a 10, que comprende:

(a) escisión y oxidación parcial de los anillos de glucopiranosa-dextrano con un agente oxidante elegido para dar lugar a un material polialdehído-dextrano de sustancialmente el mismo peso molecular que el material de dextrano de partida, y

(b) revestimiento de un sustrato concreto que posee grupos funcionales reactivos al aldehído dependientes con el material polialdehído dextrano de la etapa (a) para obtener una partícula revestida con polialdehído-dextrano.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el agente oxidante se elige entre los compuestos perhalogenato, ozono, peroxidasas y agentes oxidantes similares capaces de escindir los anillos de glucopiranosa-dextrano y oxidar los anillos escindidos para contener los grupos aldehído dependientes.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho procedimiento comprende además el acoplo entre un antígeno, anticuerpo, proteína, hapteno, ligando y compuesto de unión y el revestimiento polialdehído-dextrano, directamente o mediante agentes de acoplo intermedios.

\newpage

14. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que las partículas revestidas son partículas magnéticas de óxido de cromo revestidas con polialdehído-dextrano.