ES2200558T3 - Peptidos de rho-conotoxina que tienen actividad selectiva sobre el receptor alfa-1. - Google Patents
Peptidos de rho-conotoxina que tienen actividad selectiva sobre el receptor alfa-1.Info
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Abstract
Un péptido del grupo de las -conotoxinas aislado, sintético o recombinante, o un derivado del mismo que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor 1.
Description
Péptidos de \rho-conotoxina que
tienen actividad selectiva sobre el receptor
\alpha-1.
La presente invención se refiere a nuevos
péptidos y a derivados de los mismos útiles como antagonistas
selectivos del adrenoceptor \alpha_{1}. La invención también se
refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden estos péptidos,
a sondas de ácido nucleico útiles para encontrar análogos activos
de estos péptidos, a ensayos para encontrar compuestos que tengan
actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1} y al
uso de estos péptidos en la profilaxis o tratamiento de afecciones
tales como, pero sin limitación, afecciones urinarias o
cardiovasculares.
Los caracoles marinos del género Conus
(conos) usan una estrategia bioquímica sofisticada para capturar a
sus presas. Como depredadores de cualquier pez, gusano o de otros
moluscos, los conos inyectan a su presa un veneno que contiene un
cóctel de péptidos bioactivos pequeños. Estas moléculas de toxina,
que se denominan conotoxinas, interfieren con la neurotransmisión al
dirigirse a una diversidad de receptores y canales de iones. El
veneno de cualquier especie individual del género Conus
puede contener más de 100 péptidos diferentes. Las conotoxinas se
dividen en clases basándose en sus dianas fisiológicas. Hasta la
fecha, se han descrito diez clases. La clase de péptidos
perteneciente al grupo de las \omega-conotoxinas
se dirige y bloquea canales de Ca^{2+} sensibles al voltaje
inhibiendo la liberación de neurotransmisores. Las
\alpha-conotoxinas y las
\Psi-conotoxinas se dirigen y bloquean los
receptores nicotínicos ACh, produciendo un bloqueo ganglionar y
neuromuscular. Los péptidos de la clase de las
\mu-conotoxinas actúan bloqueando canales de
Na^{+} sensibles al voltaje, inhibiendo potenciales de acción
muscular y nerviosa. Las \delta-conotoxinas se
dirigen y retrasan la inactivación de canales de Na^{+} sensibles
al voltaje, potenciando la excitabilidad neuronal. La clase de
péptidos pertenecientes al grupo de las
\kappa-conotoxinas se dirige y bloquea canales de
K^{+} sensibles al voltaje, y también puede aumentar la
excitabilidad neuronal. Las conopresinas son antagonistas del
receptor de vasopresina y las conantoquinas son antagonistas del
receptor NMDA. Más recientemente, se ha descrito el prototipo de una
nueva clase de \gamma-conotoxina, que se dirige a
un canal de cationes no específico sensible al voltaje, y de una
nueva clase de \sigma-conotoxina, que antagoniza
el receptor 5HT_{3}.
Ahora se ha descubierto que existe una nueva
clase de conotoxinas, denominadas en lo sucesivo la clase de
\rho-conotoxinas, que se caracterizan por tener actividad antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Los adrenoceptores \alpha_{1} juegan papeles importantes en muchos procesos fisiológicos y patofisiológicos de los sistemas cardiovascular y urogenital, incluyendo inotropia y cronotropia del miocardio, hipertrofia cardíaca y arritmias, vasoconstricción, contracción del músculo liso y enfermedad prostática. Los fármacos antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} son útiles como herramientas para la investigación básica y como agentes terapéuticos.
\rho-conotoxinas, que se caracterizan por tener actividad antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Los adrenoceptores \alpha_{1} juegan papeles importantes en muchos procesos fisiológicos y patofisiológicos de los sistemas cardiovascular y urogenital, incluyendo inotropia y cronotropia del miocardio, hipertrofia cardíaca y arritmias, vasoconstricción, contracción del músculo liso y enfermedad prostática. Los fármacos antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} son útiles como herramientas para la investigación básica y como agentes terapéuticos.
La Patente de Estados Unidos 5.620.993 (Patane
et al) describe algunas de las funciones conocidas de los
receptores adrenérgicos del subtipo \alpha_{1}, así como algunos
agentes farmacológicos conocidos que se unen a dichos receptores.
Los péptidos de la presente invención son los primeros péptidos
presentados que tienen actividad antagonista del adrenoceptor
\alpha_{1}. Además, los péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas actúan de forma no competitiva en
la inhibición de la acción de la noradrenalina. De esta manera,
parece ser que las \rho-conotoxinas actúan en un
sitio distinto del sitio de activación de la noradrenalina y
distinto del sitio de acción de antagonistas de
\alpha-adrenorreceptores tradicionales tales como
el prazosín.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente
invención se proporciona un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas aislado, sintético o
recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del
adrenoceptor \alpha_{1}.
El péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas puede ser un péptido natural
aislado a partir de un cono, o un derivado del mismo.
Preferiblemente, el péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas es \rho-TIA o
un derivado del mismo. \rho-TIA puede aislarse a
partir del conducto del veneno del cono cazador de peces Conus
tulipa. Es un péptido que consta de 19 aminoácidos y contiene 2
enlaces disulfuro. La secuencia de aminoácidos de
\rho-TIA es la siguiente:
SEC ID Nº.
1FNWRCCLIPACRRNHKKFC
El extremo C puede ser un ácido libre o puede
estar amidado.
Como se usa en este documento, el término
"selectivo", a menos que el contexto requiera otra cosa,
significa que la capacidad del péptido de actuar como antagonista de
un adrenoceptor \alpha_{1} es considerablemente mayor que su
capacidad de actuar como antagonista de otros adrenoceptores
\alpha. Preferiblemente, la actividad en otros adrenoceptores
\alpha es insignificante.
El término "derivado", como se usa en este
documento en relación con péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas naturales, tales como
\rho-TIA, se refiere a un péptido que difiere de
los péptidos naturales en una o más deleciones, adiciones o
substituciones de aminoácidos, o en una o más modificaciones de
cadenas laterales. Los derivados que no tienen actividad antagonista
selectiva del adrenoceptor \alpha_{1} no se incluyen dentro del
alcance de la presente invención. Uno de tales derivados inactivos
es el péptido \rho-TIA truncado mostrado a
continuación:
SEC ID Nº.
2CCLIPACRRNHKKFC
Los estudios de la truncación
C-terminal de \rho-TIA han
indicado que el resto en la posición 4 puede ser importante para la
unión. Por consiguiente, se prefieren los péptidos en los que se
retiene el resto de arginina en la posición 4 o se ha substituido
con otro aminoácido con una carga positiva.
También se ha descubierto que los restos en las
posiciones 1, 2 y 3 pueden substituirse para modificar la potencia
y la selectividad de \rho-TIA. Tales
modificaciones incluyen la adición o substitución de uno o más
restos de tirosina, lo cual facilitaría el marcaje de derivados de
\rho-TIA para el desarrollo de ensayos.
Las substituciones incluyen alteraciones de
aminoácidos en las que un aminoácido se reemplaza por un resto
aminoacídico diferente natural o no convencional. Tales
substituciones pueden clasificarse como "conservativas", en
cuyo caso un resto aminoacídico contenido en un polipéptido se
reemplaza por otro aminoácido natural de carácter similar en
relación con la polaridad, la funcionalidad de la cadena lateral o
el tamaño, por ejemplo, Ser\cdot Thr\cdot Pro\cdot Hyp\cdot
Gly\cdot Ala, Val\cdot Ile\cdot Leu, His\cdot Lys\cdot
Arg, Asn\cdot Gln\cdot Asp\cdot Glu o Phe\cdot Trp\cdot
Tyr. Debe entenderse que también pueden ser substitutos adecuados
de los aminoácidos naturales algunos aminoácidos no convencionales.
Por ejemplo, la ornitina, la homoarginina y la
dimetil-lisina están relacionadas con His, Arg y
Lys.
Las substituciones incluidas por la presente
invención también pueden ser "no conservativas", en las que un
resto aminoacídico que está presente en un polipéptido se substituye
por un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tal como un
aminoácido natural de un grupo diferente (por ejemplo, la
substitución de un aminoácido cargado o hidrófobo por alanina) o,
como alternativa, en las que un aminoácido natural se substituye
por un aminoácido no convencional.
Las substituciones de aminoácidos típicamente son
de restos individuales, pero pueden ser de múltiples restos,
agrupados o dispersos.
Preferiblemente, las substituciones de
aminoácidos son conservativas.
Las adiciones incluyen la adición de uno o más
restos aminoacídicos naturales o no convencionales. Las deleciones
incluyen la deleción de uno o más restos aminoacídicos.
Como se ha indicado anteriormente, la presente
invención incluye péptidos en los que uno o más de los aminoácidos
ha experimentado modificaciones en la cadena lateral. Los ejemplos
de modificaciones de cadena lateral contemplados por la presente
invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como por
medio de alquilación reductora por reacción con un aldehído seguida
de reducción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato;
acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con
cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido
2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguida de reducción con NaBH_{4}.
2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguida de reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidina de los restos de arginina
puede modificarse por la formación de productos de condensación
heterocíclicos con reactivos tales como
2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo puede modificarse por
activación de carbodiimida por medio de la formación de
O-acilisourea, seguida de una modificación
posterior, por ejemplo, para dar una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse por
métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o
yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico;
formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiólicos;
reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida
substituida; formación de derivados mercuriales usando
4-cloromercuribenzoato, ácido
4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de
fenilmercurio,
2-cloromercuri-4-nitrofenol
y otros mercuriales; o carbamoilación con cianato a pH alcalino.
Ninguna modificación de restos de cisteína debe afectar a la
capacidad del péptido de formar los enlaces disulfuro necesarios.
También es posible reemplazar los grupos sulfhidrilo de la cisteína
con equivalentes de selenio, de tal forma que el péptido forme un
enlace de diselenio en lugar de uno o más de los enlaces
disulfuro.
Los restos de triptófano pueden modificarse, por
ejemplo, por oxidación con N-bromosuccinimida o
alquilación del anillo de indol con bromuro de
2-hidroxi-5-nitrobencilo
o haluros de sulfenilo. Por otra parte, los restos de tirosina
pueden alterarse por nitración con tetranitrometano para formar un
derivado de 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo de imidazol de un
resto de histidina puede realizarse por alquilación con derivados
de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con
dietilpirocarbonato.
Los restos de prolina pueden modificarse, por
ejemplo, por hidroxilación en la posición 4.
En la tabla 1 se muestra una lista de algunos
aminoácidos que tienen cadenas laterales modificadas y otros
aminoácidos no naturales.
| Aminoácido no convencional | Código | Aminoácido no convencional | Código |
| ácido \alpha-aminobutírico | Abu | L-N-metilalanina | Nmala |
| \alpha-amino-\alpha-metilbutirato | Mgabu | L-N-metilarginina | Nmarg |
| aminociclopropano-carboxilato | Cpro | L-N-metilasparagina | Nmasn |
| ácido L-N-metilaspártico | Nmasp | ||
| ácido aminoisobutírico | Aib | L-N-metilcisteína | Nmcys |
| aminonorbonil-carboxilato | Norb | L-N-metilglutamina | Nmgln |
| ácido L-N-metilglutámico | Nmglu | ||
| ciclohexilalanina | Chexa L-N-metilhistidina | Nmhis | |
| ciclopentilalanina | Cpen | L-N-metilisoleucina | Nmile |
| D-alanina | Dal | L-N-metil-leucina | Nmleu |
| D-arginina | Darg | L-N-metil-lisina | Nmlys |
| ácido D-aspártico | Dasp | L-N-metilmetionina | Nmmet |
| D-cisteína | Dcys | L-N-metilnorleucina | Nmnle |
| D-glutamina | Dgln | L-N-metilnorvalina | Nmnva |
| ácido D-glutámico | Dglu | L-N-metilornitina | Nmorn |
| D-histidina | Dhis | L-N-metilfenilalanina | Nmphe |
| D-isoleucina | Dile | L-N-metilprolina | Nmpro |
| D-leucina | Dleu | L-N-metilserina | Nmser |
| D-lisina | Dlys | L-N-metiltreonina | Nmthr |
| D-metionina | Dmet | L-N-metiltriptófano | Nmtrp |
| D-ornitina | Dorn | L-N-metiltirosina | Nmtyr |
| D-fenilalanina | Dphe | L-N-metilvalina | Nmval |
| D-prolina | Dpro | L-N-metiletilglicina | Nmetg |
| D-serina | Dser | L-N-metil-t-butilglicina | Nmtbug |
| D-treonina | Dthr | L-norleucina | Nle |
| D-triptófano | Dtrp | L-norvalina | Nva |
| D-tirosina | Dtyr | \alpha-metil-aminoisobutirato | Maib |
| D-valina | Dval | \alpha-metil-\gamma-aminobutirato | Mgabu |
| D-\alpha-metilalanina | Dmala | \alpha-metilciclohexilalanina | Mchexa |
| D-\alpha-metilarginina | Dmarg | \alpha-metilciclopentilalanina | Mcpen |
| D-\alpha-metilasparagina | Dmasn | \alpha-metil-\alpha-naftilalanina | Manap |
| D-\alpha-metilaspartato | Dmasp | \alpha-metilpenicilamina | Mpen |
| D-\alpha-metilcisteína | Dmcys | N-(4-aminobutil)glicina | Nglu |
| D-\alpha-metilglutamina | Dmgln | N-(2-aminoetil)glicina | Naeg |
| D-\alpha-metilhistidina | Dmhis | N-(3-aminopropil)glicina | Norn |
| D-\alpha-metilisoleucina | Dmile | N-amino-\alpha-metilbutirato | Nmaabu |
| D-\alpha-metil-leucina | Dmleu | \alpha-naftilalanina | Anap |
| D-\alpha-metil-lisina | Dmlys | N-bencilglicina | Nphe |
| D-\alpha-metilmetionina | Dmmet | N-(2-carbamiletil)glicina | Ngln |
| D-\alpha-metilornitina | Dmorn | N-(carbamilmetil)glicina | Nasn |
| D-\alpha-metilfenilalanina | Dmphe | N-(2-carboxietil)glicina | Nglu |
| D-\alpha-metilprolina | Dmpro | N-(carboximetil)glicina | Nasp |
| D-\alpha-metilserina | Dmser | N-ciclobutilglicina | Ncbut |
| D-\alpha-metiltreonina | Dmthr | N-cicloheptilglicina | Nchep |
| D-\alpha-metiltriptófano | Dmtrp | N-ciclohexilglicina | Nchex |
| D-\alpha-metiltirosina | Dmty | N-ciclodecilglicina | Ncdec |
| D-\alpha-metilvalina | Dmval | N-ciclododecilglicina | Ncdod |
| D-N-metilalanina | Dnmala | N-ciclooctilglicina | Ncoct |
| D-N-metilarginina | Dnmarg | N-ciclopropilglicina | Ncpro |
| D-N-metilasparagina | Dnmasn | N-cicloundecilglicina | Ncund |
| D-N-metilaspartato | Dnmasp | N-(2,2-difeniletil)glicina | Nbhm |
| D-N-metilcisteína | Dnmcys | N-(3,3-difenilpropil)glicina | Nbhe |
\newpage
| Aminoácido no convencional | Código | Aminoácido no convencional | Código |
| D-N-metilglutamina | Dnmgln | N-(3-guanidinopropil)glicina | Narg |
| D-N-metilglutamato | Dnmglu | N-(1-hidroxietil)glicina | Nthr |
| D-N-metilhistidina | Dnmhis | N-(hidroxietil)glicina | Nser |
| D-N-metilisoleucina | Dnmile | N-(imidazoliletil)glicina | Nhis |
| D-N-metil-leucina | Dnmleu | N-(3-indoliletil)glicina | Nhtrp |
| D-N-metil-lisina | Dnmlys | N-metil-\gamma-aminobutirato | Nmgabu |
| N-metilciclohexilalanina | Nmchexa | D-N-metilmetionina | Dnmmet |
| D-N-metilornitina | Dnmorn | N-metilciclopentilalanina | Nmcpen |
| N-metilglicina | Nala | D-N-metilfenilalanina | Dnmphe |
| N-metilaminoisobutirato | Nmaib | D-N-metilprolina | Dnmpro |
| N-(1-metilpropil)glicina | Nile | D-N-metilserina | Dnmser |
| N-(2-metilpropil)glicina | Nleu | D-N-metiltreonina | Dnmthr |
| D-N-metiltriptófano | Dnmtrp | N-(1-metiletil)glicina | Nval |
| D-N-metiltirosina | Dnmtyr | N-metil-naftilalanina | Nmanap |
| D-N-metilvalina | Dnmval | N-metilpenicilamina | Nmpen |
| ácido \gamma-aminobutírico | Gabu | N-(p-hidroxifenil)glicina | Nhtyr |
| L-t-butilglicina | Tbug | N-(tiometil)glicina | Ncys |
| L-etilglicina | Etg | penicilamina | Pen |
| L-homofenilalanina | Hphe | L-\alpha-metilalanina | Mala |
| L-\alpha-metilarginina | Marg | L-\alpha-metilasparagina | Masn |
| L-\alpha-metilaspartato | Masp | L-\alpha-metil-t-butilglicina | Mtbug |
| L-\alpha-metilcisteína | Mcys | L-metiletilglicina | Metg |
| L-\alpha-metilglutamina | Mgln | L-\alpha-metilglutamato | Mglu |
| L-\alpha-metilhistidina | Mhis | L-\alpha-metilhomofenilalanina | Mhphe |
| L-\alpha-metilisoleucina | Mile | N-(2-metiltioetil)glicina | Nmet |
| L-\alpha-metil-leucina | Mleu | L-\alpha-metil-lisina | Mlys |
| L-\alpha-metilmetionina | Mmet | L-\alpha-metilnorleucina | Mnle |
| L-\alpha-metilnorvalina | Mnva | L-\alpha-metilornitina | Morn |
| L-\alpha-metilfenilalanina | Mphe | L-\alpha-metilprolina | Mpro |
| L-\alpha-metilserina | Mser | L-\alpha-metiltreonina | Mthr |
| L-\alpha-metiltriptófano | Mtrp | L-\alpha-metiltirosina | Mtyr |
| L-\alpha-metilvalina | Mval | L-N-metilhomofenilalanina | Nmhphe |
| N-(N-(2,2-difeniletil) | Nnbhm | N-(N-(3,3-difenilpropil) | Nnbhe |
| carbamilmetilglicina | carbamilmetilglicina | ||
| 1-carboxi-1-(2,2-difeniletilamino) | Nmbc | O-metil-L-serina | Omser |
| ciclopropano | |||
| O-metil-L-homoserina | Omhser |
Estos tipos de modificaciones pueden ser
importantes para estabilizar al péptido si se administra a un
individuo o para uso como un reactivo de diagnóstico.
Otros derivados contemplados por la presente
invención incluyen una serie de variantes de glicosilación de una
molécula completamente desglicosilada hasta una molécula
glicosilada modificada. Los modelos de glicosilación alterados
pueden deberse a la expresión de moléculas recombinantes en
diferentes células hospedadoras.
Las \rho-conotoxinas de la
presente invención típicamente se amidan en el extremo C, sin
embargo, se consideran dentro del alcance de la presente invención
compuestos con un extremo carboxilo libre u otras modificaciones en
el extremo C. Preferiblemente, los péptidos se amidan o tienen un
carboxilo libre en el extremo C.
Preferiblemente, los derivados de péptidos del
grupo de las \rho-conotoxinas naturales retendrán
los restos Cys y un modelo de enlaces disulfuro característico. Los
derivados pueden incluir restos de Cys adicionales siempre que
estén protegidos durante la formación de los enlaces disulfuro.
\newpage
En la modificación para formar derivados de
péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas
naturales, es útil comparar las secuencias de aminoácidos de los
péptidos naturales activos para determinar cuáles de los restos se
conservan, si se conserva alguno, entre las especies activas. La
substitución de estos restos conservados, aunque no está prohibida,
es menos preferida que las substituciones de restos no
conservados.
Pueden usarse derivados en los que una Ala
reemplaza a uno o más restos para identificar el farmacóforo.
Preferiblemente, sólo uno o dos aminoácidos se remplazan por Ala al
mismo tiempo. Pueden obtenerse nuevos péptidos adicionales en los
que se reemplacen restos cargados, polares o hidrófobos,
respectivamente, para ayudar a definir de forma más precisa el tipo
de interacciones implicadas en la unión de esta clase de péptidos
farmacológicos a su receptor. Los reemplazos no conservativos, en
los que se invierte la carga o restos polares reemplazan a restos
hidrófobos, pueden identificar adicionalmente los restos implicados
en la unión. Todos estos péptidos pueden mostrar una mayor potencia,
o una mayor selectividad por un subtipo de adrenoceptor
\alpha_{1}. También podrían incluirse cambios de aminoácidos no
nativos para mejorar la potencia, la selectividad y/o la
estabilidad.
Lo más probable es que los retos expuestos estén
implicados en la unión al receptor y pueden reemplazarse
sistemáticamente. Se da una importancia particular al cambio de los
restos implicados en la unión y de los restos situados en la
periferia del farmacóforo, usando formas de cadena lateral más
larga, o a cambios no conservados para seleccionar interacciones de
unión adicionales para conseguir una mayor potencia y/o
selectividad. La reducción o el aumento de los tamaños de los
bucles y de la cola de TIA modifica adicionalmente la actividad.
Debe tenerse en cuenta que
\rho-TIA consta de una cola (restos
1-4) y dos bucles (restos 7-10 y
12-18), sin embargo, los péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas y los derivados de la presente
invención no se restringen a los que tienen esta disposición
particular de aminoácidos y enlaces disulfuro. También son posibles
otras disposiciones, y siempre que el péptido resultante tenga
actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}, dicho
péptido se incluirá dentro del alcance de la presente invención.
Preferiblemente, los péptidos tendrán al menos dos restos de
cisteína y al menos un enlace disulfuro o, más preferiblemente,
cuatro restos de cisteína y dos enlaces disulfuro.
La conectividad de los enlaces disulfuro en estos
péptidos puede ser A-C/B-D,
A-D/B-C o
A-B/C-D, siendo preferida la primera
en el caso de \rho-TIA. A, B, C y D se refieren al
primer, segundo, tercer y cuarto restos de Cys implicados en la
formación de enlaces disulfuro, respectivamente.
Estos péptidos también pueden marcarse y usarse
para establecer ensayos de unión para identificar nuevas moléculas
que actúan en el mismo sitio. Por ejemplo, el ligando marcado de
\rho-TIA puede incluir tritio o puede tener yodo
radiactivo o estar unido de forma similar a través de una Tyr u
otro resto apropiado. Una exploración de las Tyr a lo largo de cada
péptido establecerá una localización adecuada par la incorporación
de la Tyr. La inhibición de la unión de tales péptidos marcados a
homogeneizados de tejido o a adrenoceptores expresados por ciertos
compuestos o mezclas permitiría la identificación de nuevos
péptidos activos en este sitio, incluyendo péptidos presentes en
suero y en tejido nervioso y muscular de mamíferos, incluyendo
tejidos humanos. El ensayo también permitirá la identificación de
moléculas no peptídicas que también actúan en el mismo sitio que
\rho-TIA, y que pueden tener utilidad como formas
de estos péptidos activas por vía oral. Los péptidos marcados
también permitirán realizar estudios autorradiográficos para
identificar la localización de la unión de los péptidos a lo largo
de diversos tejidos.
Pueden usarse porciones de estas secuencias para
examinar bases de datos ESTR para identificar en mamíferos péptidos
o proteínas que contengan una información de secuencia relacionada
que pueda usarse para identificar ligandos endógenos que actúen de
una manera similar en mamíferos.
Las \rho-conotoxinas de la
presente invención pueden prepararse usando métodos de síntesis de
péptidos convencionales seguidas de la formación oxidativa de
enlaces disulfuro. Por ejemplo, los péptidos lineales pueden
sintetizarse por la metodología en fase sólida usando la química
BOC, como se describe por Schnoltzer et al (1992). Después de
la desprotección y escisión del soporte sólido, los péptidos
reducidos se purifican usando cromatografía preparativa. Los
péptidos reducidos purificados se oxidan en sistemas tamponados,
por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2. Los péptidos oxidados
se purifican usando cromatografía preparativa.
Las referencias que describen la síntesis de
conotoxinas incluyen Sato et al., Lew et al y el
documento
WO 91/07980.
WO 91/07980.
Las \rho-conotoxinas también
pueden prepararse usando la tecnología de ADN recombinante. Una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia peptídica deseada
puede insertarse en un vector adecuado y la proteína puede
expresarse en un sistema de expresión apropiado. En algunos casos,
puede ser apropiada una modificación química adicional del péptido
expresado, por ejemplo, una amidación C-terminal.
En algunas circunstancias, puede ser deseable realizar la formación
de enlaces oxidativos del péptido expresado como una etapa química
posterior a la expresión del péptido. Esto puede estar precedido
por una etapa de reducción para proporcionar el péptido no plegado.
Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente las
condiciones apropiadas para la reducción y oxidación del
péptido.
La invención proporciona además una molécula de
ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica o es complementaria o a la secuencia que codifica un
péptido de \rho-conotoxina descrita
anteriormente.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una sonda de ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica todo o parte de un péptido de
\rho-conotoxina.
\rho-conotoxina.
En una realización particularmente preferida, la
sonda de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica o es complementaria a una secuencia que codifica la
secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1.
Como se usa en este documento, una referencia a
una "sonda" incluye la referencia a un cebador usado en una
amplificación o una sonada para uso en una hibridación directa.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere a anticuerpos contra los péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con la invención.
Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden
seleccionarse entre anticuerpos naturales contra los péptidos o
pueden inducirse específicamente contra los péptidos usando
técnicas convencionales. En este último caso, puede ser necesario
asociar primero los péptidos con una molécula de soporte. Los
anticuerpos de la presente invención son particularmente útiles
como agentes terapéuticos o de diagnóstico.
A este respecto, pueden usarse anticuerpos
específicos para seleccionar los polipéptidos de acuerdo con la
invención. Las técnicas para tales ensayos son bien conocidas en la
técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de sándwich y ELISA. El
conocimiento de los niveles de péptido puede ser importante para
controlar ciertos protocolos terapéuticos.
También es posible preparar anticuerpos
antiidiotípicos usando técnicas conocidas en la técnica. Estos
anticuerpos antiidiotípicos y su uso como agentes terapéuticos
representan un aspecto adicional de la invención.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden ser ADN o ARN. Cuando la molécula de ácido
nucleico está en forma de ADN, puede ser ADN genómico o ADNc. Las
formas de ARN de las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención son generalmente ARNm.
Aunque las moléculas de ácido nucleico de la
presente invención generalmente están en forma aislada, pueden
integrarse, unirse, fusionarse de otra manera o asociarse con otras
moléculas genéticas tales como moléculas de vectores y, en
particular, moléculas de vectores de expresión. Los vectores y los
vectores de expresión generalmente son capaces de replicarse y, si
es pertinente, de expresarse en una célula procariota, en una
célula eucariota o en ambos tipos celulares. Preferiblemente, las
células procariotas incluyen E. coli, Bacillus sp y
Pseudomonas sp. Las células eucariotas preferidas incluyen
levaduras, hongos, células de mamífero y células de insecto.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente
invención contempla una construcción genética que comprende una
porción de vector y un gen capaz de codificar un péptido de acuerdo
con la invención.
Preferiblemente, la porción génica de la
construcción genética está unida operativamente a un promotor
presente en el vector de tal forma que dicho promotor sea capaz de
dirigir la expresión de la porción génica en una célula
apropiada.
La presente invención incluye tales
construcciones genéticas y células procariotas o eucariotas que las
comprenden.
Pueden obtenerse quimeras de
\rho-conotoxinas tales como
\rho-TIA, con otras conotoxinas o adicionalmente
con otros péptidos o proteínas, para introducir la actividad en
otras moléculas por medio de ingeniería genética, en algunos casos
para producir una nueva molécula con funcionalidad extra.
Preferiblemente, esto se realizaría usando el segmento o segmentos
de la secuencia de estos péptidos que contienen el farmacóforo.
Cuando el farmacóforo es discontinuo, los segmentos que constituyen
el farmacóforo deben colocarse en la nueva construcción para
permitir la unión al receptor. Las quimeras con otras conotoxinas
pueden incluir restos de Cys adicionales y restos disulfuro
adicionales.
Es común que los péptidos del grupo de las
conotoxinas dentro de una clase de actividad tengan un modelo
similar de formación de enlaces disulfuro, con bucles de péptidos
entre los restos de cisteína respectivos. En el caso de
\rho-TIA, los enlaces disulfuro unen el primer y el tercer, y el segundo y el cuarto restos de cisteína. Este modelo es similar al modelo de unión observado para los péptidos del grupo de las \alpha-conotoxinas. Por consiguiente, pueden prepararse derivados quiméricos substituyendo un bucle de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas por el bucle que comprende una secuencia de otro péptido, incluyendo \alpha-conotoxinas.
\rho-TIA, los enlaces disulfuro unen el primer y el tercer, y el segundo y el cuarto restos de cisteína. Este modelo es similar al modelo de unión observado para los péptidos del grupo de las \alpha-conotoxinas. Por consiguiente, pueden prepararse derivados quiméricos substituyendo un bucle de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas por el bucle que comprende una secuencia de otro péptido, incluyendo \alpha-conotoxinas.
La invención también incluye dímeros, trímeros,
etc. de péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas, así como péptidos del grupo de
las \rho-conotoxinas unidos a otros péptidos.
Preferiblemente, los péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con la invención
tienen de 10 a 30 aminoácidos, más preferiblemente de 15 a 25.
La secuencia génica completa para los péptidos
del grupo de las \rho- conotoxinas naturales puede obtenerse
usando una estrategia 5' RACE y 3' RACE combinada junto con
clonación y secuenciación del ADN.
\newpage
Aunque \rho-TIA presenta alguna
homología de secuencia con las
\alpha-conotoxinas, que son bloqueantes del
receptor nicotínico ACh, no se descubrió que
\rho-TIA (10 \muM) se dirigiera al subtipo
neuronal o muscular del receptor nicotínico ACh en ensayos que
usaban preparaciones aisladas de íleon de cobaya y de hemidiafragma
de nervio frénico de ratón.
Por consiguiente, en un aspecto preferido de la
presente invención, el péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas se caracteriza adicionalmente
porque carece de actividad en el subtipo neuronal o muscular del
receptor nicotínico ACh.
En estudios de unión, también se descubrió que
existe una variación en la afinidad de \rho-TIA
por los subtipos de receptores adrenérgicos \alpha_{1a},
\alpha_{1b} y \alpha_{1d}. Por consiguiente, en un aspecto
adicional de la invención, se proporciona un péptido del grupo de
las \rho-conotoxinas aislado, sintético o
recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva de
\alpha_{1}, y que tiene selectividad por un subtipo de
\alpha_{1} con respecto a los demás subtipos.
Los péptidos del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con la presente
invención son antagonistas selectivos del adrenoceptor \alpha_{1}.
Por consiguiente, la invención proporciona el uso de una
\rho-conotoxina de acuerdo con la invención como
un antagonista selectivo del adrenoceptor \alpha_{1}, y en el
tratamiento o profilaxis de enfermedades o afecciones en las que una
actividad antagonista en los adrenoceptores \alpha_{1} está
asociada con un tratamiento eficaz. Tal actividad en agentes
farmacológicos está asociada con la eficacia en la profilaxis o
tratamiento de enfermedades o afecciones de los sistemas urinario o
cardiovascular, o de trastornos del estado de ánimo, o en el
tratamiento o control del dolor o la inflamación.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de
afecciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares o de
trastornos del estado de ánimo, o para el tratamiento o control del
dolor o la inflamación, que incluye la etapa de administrar a un
mamífero una cantidad eficaz de un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas aislado, sintético o
recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del
adrenoceptor \alpha_{1}.
Los ejemplos de enfermedades o afecciones del
sistema urinario incluyen hiperplasia prostática benigna y
trastornos relacionados. Los ejemplos de enfermedades o afecciones
cardiovasculares incluyen arritmia de diversas regiones,
hipertensión e insuficiencia cardíaca coronaria. Los ejemplos de
trastornos del estado de ánimo incluyen adicciones tales como el
hábito de fumar. Los ejemplos de dolor incluyen dolor crónico,
dolor neuropático y dolor inflamatorio.
Preferiblemente, el mamífero necesita tal
tratamiento, aunque el péptido puede administrarse en un sentido
profiláctico.
La invención también proporciona una composición
que comprende un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas aislado, sintético o
recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del
adrenoceptor \alpha_{1}, y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente, la composición está en forma de
una composición farmacéutica.
También se proporciona el uso de un péptido del
grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético
o recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del
adrenoceptor \alpha_{1}, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento o profilaxis de afecciones o enfermedades urinarias
o cardiovasculares, o trastornos del estado de ánimo, o para el
tratamiento o control del dolor o la inflamación.
Como se apreciará fácilmente por los
especialistas en la técnica, la vía de administración y la
naturaleza del vehículo farmacéuticamente aceptable dependerá de la
naturaleza de la afección y del mamífero a tratar. Se cree que la
elección de un vehículo o sistema de liberación particular, y la
vía de administración, pueden determinarse fácilmente por una
persona especialista en la técnica. En la preparación de cualquier
formulación que contenga los péptidos activos, debe tenerse cuidado
de garantizar que la actividad del péptido no se destruye en el
proceso y que el péptido es capaz de alcanzar su sitio de acción
sin destruirse. En algunas circunstancias, puede ser necesario
proteger al péptido por medios conocidos en la técnica tales como,
por ejemplo, microencapsulación. De forma similar, la vía de
administración elegida debe ser tal que el péptido alcance su sitio
de acción.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso
inyectable incluyen soluciones o dispersiones inyectables
estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de
soluciones inyectables estériles. Deben ser estables en las
condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden protegerse
contra la oxidación y la acción contaminante de microorganismos
tales como bacterias u hongos.
Los especialistas en la técnica pueden determinar
fácilmente las formulaciones apropiadas para los péptidos o
péptidos modificados de la presente invención usando estrategias
convencionales. La identificación de intervalos de pH preferidos y
excipientes adecuados, por ejemplo, antioxidantes, es rutinaria en
la técnica (véase, por ejemplo, Cleland et al, 1993).
Rutinariamente se usan sistemas tampón para proporcionar valores de
pH de un intervalo deseado e incluyen tampones de ácido
carboxílico, por ejemplo, acetato, citrato, lactato y succinato. Se
dispone de una diversidad de antioxidantes para tales
formulaciones, incluyendo compuestos fenólicos tales como BHT o
vitamina E, agentes reductores tales como metionina o sulfito, y
quelantes de metales tales como EDTA.
El disolvente o medio de dispersión para la
solución o dispersión inyectable puede contener cualquiera de los
sistemas disolventes o excipientes convencionales para péptidos
activos, y puede contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y
similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La
fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por medio del uso
de un recubrimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento
del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y por
medio del uso de tensioactivos. La prevención de la acción de
microorganismos puede conseguirse cuando sea necesario por medio de
la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos,
por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico,
timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir
agentes para ajustar la osmolalidad, por ejemplo, azúcares o
cloruro sódico. Preferiblemente, la formulación para inyección será
isotónica con la sangre. La absorción prolongada de las
composiciones inyectables puede conseguirse por medio del uso en
las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo,
monoestearato de aluminio y gelatina. Las formas farmacéuticas para
uso inyectable pueden administrarse por cualquier vía apropiada,
incluyendo inyección intravenosa, intramuscular, intracerebral,
intratecal, epidural o infusión.
Las soluciones inyectables estériles se preparan
por medio de la incorporación de los compuestos activos en la
cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos
ingredientes distintos tales como los indicados anteriormente,
cuando se requiera, seguido de una esterilización por filtración.
Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos
ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que
contiene el medio de dispersión básico y otros ingredientes
requeridos seleccionados entre los enumerados anteriormente. En el
caso de polvos estériles para la preparación de soluciones
inyectables estériles, son métodos de preparación preferidos el
secado al vacío o la liofilización de una solución filtrada
previamente de forma estéril del ingrediente activo más cualquier
ingrediente deseado adicional.
Cuando los ingredientes activos están protegidos
convenientemente, pueden administrarse por vía oral, por ejemplo,
con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o
pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o
blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse
directamente en los alimentos de la dieta. Para la administración
terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con
excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles,
comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones,
jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones
preferiblemente contienen al menos un 1% en peso de compuesto
activo. Por supuesto, el porcentaje de las composiciones y
preparaciones puede variar y, convenientemente, puede estar
comprendido entre aproximadamente un 5 y aproximadamente un 80% del
peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales
composiciones terapéuticamente útiles será tal que se obtenga una
dosificación adecuada.
Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y
similares también pueden contener los componentes indicados más
adelante: Puede añadirse un aglutinante tal como goma arábiga,
almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato
dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón
de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como
estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa,
lactosa o sacarina, o un agente aromatizante tal como menta, aceite
de pirola o aroma de cerezas. Cuando la forma de dosificación es
una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo
anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes otros diversos
materiales como recubrimientos o para modificar de otra manera la
forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los
comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca,
azúcar o ambas substancias. Un jarabe o elixir puede contener el
compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y
propilparabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante
tal como aroma de cerezas o de naranja. Por supuesto, cualquier
material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación
unitaria debe ser farmacéuticamente puro y substancialmente no
tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto o los
compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y
formulaciones de liberación sostenida.
La presente invención también incluye cualquier
otra forma adecuada para la administración, por ejemplo, para la
aplicación tópica tal como cremas, lociones y geles, o
composiciones adecuadas para la inhalación o la administración
intranasal, por ejemplo, soluciones o polvos secos.
Se prefieren las formas de dosificación
parenterales, incluyendo las adecuadas para la administración
intravenosa, intratecal, intracerebral o epidural.
Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente
aceptables incluyen todos y cada uno de los siguientes:
disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes
antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de
la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para
substancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica.
Excepto en el caso de que algún medio o agente convencional no sea
compatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las
composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden
incorporarse ingredientes activos adicionales.
Es especialmente ventajoso formular las
composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para
facilitar la administración y para permitir una uniformidad en la
dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en este
documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas
como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar;
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material
activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en
asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación
para las nuevas formas de dosificación unitaria de la invención
está gobernada y depende directamente de (a) las características
particulares del material activo y el efecto terapéutico particular
que se desee conseguir, y (b) las limitaciones intrínsecas de la
técnica de la formación de composiciones de un material activo para
el tratamiento de enfermedades en sujetos vivos que tienen un
estado de enfermedad en el que se ve perjudicada la salud corporal
como se describe en este documento con detalle.
Para una administración conveniente y eficaz, el
ingrediente activo principal se mezcla, en cantidades eficaces, con
un vehículo farmacéuticamente aceptable en una forma de
dosificación unitaria. Una forma de dosificación unitaria puede
contener, por ejemplo, el compuesto activo principal en cantidades
que varían de 0,25 \mug a aproximadamente 2000 mg. Expresado en
proporciones, el compuesto activo generalmente está presente en una
cantidad de aproximadamente 0,25 \mug a aproximadamente 200 mg/ml
de vehículo. En el caso de composiciones que contienen ingredientes
activos adicionales, las dosificaciones se determinan por
referencia a la dosis habitual y la forma de administración de
dichos ingredientes.
La invención se describirá a continuación
haciendo referencia a los dibujos adjuntos y ejemplos, sin embargo,
debe entenderse que la particularidad de la siguiente descripción no
substituye a la generalidad de la descripción anterior de la
invención.
Haciendo referencia a las figuras:
La figura 1 es una representación gráfica que
muestra el efecto de \rho-TIA a lo largo del
tiempo de la contracción isométrica de una preparación
representativa de conducto deferente de próstata de rata
biseccionado sometida a estimulación de campo con un solo pulso
supramáximo (55 V, 1 ms). \rho-TIA (100
nM-3 \mul) se añadió al baño de órganos
acumulativamente, usando una progresión de unidades de dosificación
semilogarítmica.
La figura 2 es una representación gráfica que
muestra las curvas de logaritmo de la
concentración-respuesta para la noradrenalina en el
conducto deferente de epidídimo de rata biseccionado en ausencia
(O) y presencia de \rho-TIA 1 \muM (\Delta), 3
\muM ( ) o 10 \muM (\diamondsuit). Los puntos de datos son
medias \pm SEM de respuestas de 5 experimentos distintos. Algunas
barras de error están oscurecidas por los símbolos.
La figura 3 es una representación gráfica del
efecto de \rho-TIA sobre la inhibición mediada
por el adrenoceptor \alpha_{2} de la respuesta de espasmo del
conducto deferente de próstata de rata biseccionado a la
estimulación de campo con un solo pulso supramáximo (55 V, 1 ms).
Curvas de logaritmo de la concentración-respuesta
para noradrenalina en ausencia (O) y presencia (\Delta) de
\rho-TIA 10 \muM. Cada punto en la media de 5
experimentos y las barras verticales indican la SEM.
La figura 4 es una representación gráfica del
efecto de \rho-TIA sobre la unión por el
antagonista del adrenoceptor \alpha_{1} radiomarcado
[^{125}I]-HEAT a preparaciones de membrana de
células COS-1 transfectadas de forma transitoria con
clones de ADNc para los tres subtipos de adrenoceptor \alpha_{1},
\alpha_{1a}, \alpha_{1b} y \alpha_{1d}. Cada punto representa
la media de tres experimentos \pm SEM. Algunas barras de error
están obscurecidas por los símbolos.
La figura 5 es una representación esquemática que
muestra la derivación de secuencias peptídicas de veneno de conos.
La PCR 5'RACE usando los cebadores AP1 + RHO-1B
produce 5'UTR y la secuencia peptídica líder que después se usa
para generar cebadores de PCR específicos para
\rho-conotoxinas. La 3'UTR, usando los cebadores
RHO-1A + ANCHOR, completó la derivación de la
secuencia peptídica madura restante y la secuencia de 3'UTR.
Los datos para los siguientes ejemplos se
expresaron como media \pm s.e. de la media a partir de los
resultados obtenidos con n = 3-6 experimentos. Para
la evaluación estadística se usaron ensayos t de Student de
dos colas o ANOVA y los valores de p<0,05 se consideraron
significativos. El ajuste de la curva sigmoidea de las curvas de
concentración-respuesta para el cálculo de los
valores de EC_{50} se realizó por regresión no lineal usando el
paquete de software Igor Pro (WaveMetrics). Los datos de unión del
radioligando se analizaron usando el programa de ajuste de curvas no
lineal iterativo Prism (GraphPad). Los valores de IC_{50} se
convirtieron en valores de K_{i} usando la ecuación de
Cheng-Prusoff y una K_{D} para
[^{125}I]-HEAT de 66 pM.
Los siguientes fármacos se obtuvieron en Sigma:
indometacina, hidrogenotartrato de nicotina, bitartrato de
(-)-noradrenalina, clorhidrato de prazosín, suramina, tetrodotoxina y clorhidrato de yohimbina. [^{125}I]-HEAT (actividad específica 2200 Ci/mmol) se obtuvo en New England Nuclear.
(-)-noradrenalina, clorhidrato de prazosín, suramina, tetrodotoxina y clorhidrato de yohimbina. [^{125}I]-HEAT (actividad específica 2200 Ci/mmol) se obtuvo en New England Nuclear.
Se sacrificaron ratas Wistar macho
(250-350 g) por un golpe en la cabeza y se
desangraron. Se retiraron los conductos deferentes y se liberaron de
tejido conjuntivo. Cada conducto deferente se cortó en segmentos de
epidídimo y de próstata biseccionados. Las porciones de tejido se
montaron bajo una tensión de 0,5 g en baños de órganos de 5 ml que
contenían solución fisiológica salina a 37ºC y se burbujearon con
CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. La composición de la solución del
baño era (mM): NaCl, 119; KCl, 4,7; MgSO_{4}, 1,17;
KH_{2}PO_{4}, 1,18; NaHCO_{3}, 25,0; glucosa, 5,5; CaCl_{2},
2,5; EDTA, 0,026. Las preparaciones de tejido se dejaron equilibrar
durante al menos 45 minutos antes de la experimentación. Se
registraron contracciones isométricas usando un transductor de
fuerza (Narco Bio-System F-60) y se
registraron digitalmente en un ordenador Power Macintosh con el
software Chart versión 3.5.4/s y un sistema de adquisición de datos
MacLab/8s (ADInstruments) a una frecuencia de muestreo de 10 o 200
Hz.
Los segmentos prostáticos biseccionados se
pusieron entre dos electrodos estimuladores de platino. Para
examinar el efecto de \rho-TIA sobre la
contracción inducida eléctricamente del músculo liso mediada por la
neurotransmisión simpática, se añadieron concentraciones crecientes
del péptido acumulativamente al baño de órganos cuando el tejido se
estaba sometiendo a la estimulación de campo eléctrico. Se
generaron pulsos eléctricos individuales con una amplitud de 55 V y
una duración de 1 ms por un estimulador Grass S44 a intervalos de 3
minutos. Las contracciones resultantes podían anularse por
tetrodotoxina (0,1 mM), lo que indica que eran de origen
neurogénico. Además, la fase inicial de la contracción era sensible
a suramina (0,3 mM) y la segunda fase podía inhibirse por prazosín
(0,5 \muM).
La respuesta del conducto deferente de próstata
de rata biseccionado a la estimulación de campo fue bifásica. La
primera fase de la contracción fue la mayor de las dos, y tuvo un
máximo aproximadamente 200 ms después de la estimulación. La segunda
fase alcanzó un máximo aproximadamente 500-600 ms
después del estímulo. \rho-TIA actuó reduciendo la
segunda fase de la contracción de una manera dependiente de la
concentración (figura 1). El pico monofásico generado restando la
señal obtenida en presencia de la mayor concentración de
\rho-TIA usada (10 \muM) de las otras, ilustra
que el efecto de la conotoxina era específico sólo para el segundo
componente de la contracción. Se descubrió que la concentración de
conotoxina que inhibe la segunda fase de la concentración en un 50%,
el valor de IC_{50}, era de aproximadamente 300 nM (figura
1).
El modelo de inhibición producido por
\rho-TIA se parece al observado usando prazosín u
otros antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} (McGrath, 1978, J
Physiol Lond, 283, 23-39). Sin embargo, se
ha observado que cuando se usan altas concentraciones de prazosín
(0,5 \muM), se pierde la especificidad de la acción, siendo
también sensible a la inhibición el primer componente de la
contracción. El primer componente está mediado por la acción del
co-transmisor simpático ATP en los purinoceptores
P_{2x}, y puede anularse por antagonistas del purinoceptor
P_{2x} tales como suramina. Por lo tanto, se considera probable
que la inhibición no específica de la primera fase de la contracción
se deba al bloqueo de los canales neuronales de Na^{+}, un efecto
anestésico local que se ha notificado previamente para el prazosín
y algunos otros antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} (Bralet
et al., 1985, Br J Pharmacol, 84, 47-55;
Northover, 1983, Br J Pharmacol, 80, 85-93;
Perez et al., 1994, Mol Pharmacol, 46,
823-31). \rho-TIA actuó como un
antagonista no competitivo funcional, lo que sugiere que actuaba
alostéricamente en un nuevo sitio para modular la unión de
noradrenalina al adrenoceptor \alpha_{1}.
Estos experimentos fueron similares a los
descritos en el ejemplo 1, con la excepción de que los segmentos de
epidídimo biseccionados no se estimularon eléctricamente. Estas
preparaciones de tejido se usaron para examinar el efecto de
\rho-TIA sobre la respuesta contráctil después de
la unión a la noradrenalina. Se establecieron curvas de
concentración acumulativa-respuesta en ausencia y
en presencia de \rho-TIA. La conotoxina, a una
concentración de 1 \muM, 3 \muM o 10 \muM, se añadió al baño
de órganos y se equilibró con el tejido durante 20 min antes de la
aplicación de dosis de noradrenalina. Se generó una sola curva de
concentración-respuesta por preparación, sirviendo
como controles segmentos de tejido contralaterales que no se habían
expuesto a \rho-TIA.
Para confirmar que el efecto de
\rho-TIA sobre la respuesta a la estimulación de
campo se debía a la acción del péptido corriente abajo de la
liberación del neurotransmisor, se examinó su efecto sobre la
respuesta a noradrenalina aplicada exógenamente.
Se generaron curvas de logaritmo de la
concentración-respuesta a noradrenalina en
segmentos biseccionados del conducto deferente de epidídimo de rata
en ausencia y presencia de \rho-TIA (figura 2).
El efecto de \rho-TIA a una concentración de 1
\muM fue una reducción de 3 veces en la sensibilidad del tejido a
la noradrenalina, observada como un desplazamiento de la curva de
concentración-respuesta a la derecha. A las
concentraciones superiores (3 \muM y 10 \muM),
\rho-TIA actuó reduciendo la sensibilidad del
tejido adicionalmente, aumentando la EC_{50} de la noradrenalina
en un factor de 5,2 y 16,7. Las dos concentraciones máximas de
\rho-TIA también actuaron reduciendo el nivel de
la respuesta máxima al 82 y 42% de la respuesta de control,
respectivamente.
La reducción de la respuesta máxima del conducto
deferente a la noradrenalina producida por
\rho-TIA es coherente con el hecho de que la
conotoxina actúe como un antagonista no competitivo del adrenoceptor
\alpha_{1}. Inicialmente, la curva de concentración de
noradrenalina-respuesta se desplaza a la derecha sin
ningún cambio en la tensión máxima desarrollada. Según aumenta la
concentración de \rho-TIA, un desplazamiento
adicional de la curva a la derecha acompaña a la reducción
progresiva en la respuesta máxima. Este resultado indica la
existencia de un conjunto de adrenoceptores \alpha_{1}
"sobrantes" en este tejido, y confirma los hallazgos de
Diaz-Toledo y Marti 1988 Eur Pharmacol, 156,
315-24 y Minnerman & Abel 1984, Mol Pharmacol,
25, 53-63, que demostraron una reserva
funcional de
\alpha-adrenoceptores en el conducto deferente de rata. Aunque actúa de una manera no competitiva, \rho-TIA no es un antagonista irreversible, ya que hay una lenta recuperación de la inhibición de la respuesta inducida eléctricamente del conducto deferente producida por la conotoxina tras el lavado de la preparación con solución sin fármaco.
\alpha-adrenoceptores en el conducto deferente de rata. Aunque actúa de una manera no competitiva, \rho-TIA no es un antagonista irreversible, ya que hay una lenta recuperación de la inhibición de la respuesta inducida eléctricamente del conducto deferente producida por la conotoxina tras el lavado de la preparación con solución sin fármaco.
Se siguió un protocolo experimental similar al
del ejemplo 1, con la excepción de que la estimulación del campo
eléctrico se realizó con pulsos individuales de la misma duración y
amplitud, pero a intervalos de 20 s. En presencia de prazosín (0,5
\muM), se estableció una curva de concentración
acumulativa-respuesta para noradrenalina que
producía la inhibición de la respuesta de espasmo. Tras el lavado y
la recuperación, se reemplazó el prazosín y se aplicó
\rho-TIA (10 \muM) al baño de órganos. Después de un período de equilibro de 20 min, se generó una segunda curva de concentración-respuesta a la noradrenalina.
\rho-TIA (10 \muM) al baño de órganos. Después de un período de equilibro de 20 min, se generó una segunda curva de concentración-respuesta a la noradrenalina.
La liberación de los
co-transmisores simpáticos ATP y noradrenalina desde
reservas neuronales está modulada por la activación de
adrenoceptores \alpha2 presinápticos (Amobi & Smith, 1988, J
Auton Pharmacol, 8, 141-52; McCulloch et al.,
1985 Br J Pharmacol, 86, 455-64). Para
determinar si \rho-TIA actúa bloqueando los
adrenoceptores \alpha_{2}, se examinó su efecto sobre la
inhibición por noradrenalina de la contracción purinérgica de
segmentos del conducto deferente de rata. Ciertos fármacos
antagonistas del adrenoceptor \alpha_{2}, tales como la
yohimbina, antagonizan el efecto inhibidor de la noradrenalina en
este ensayo (Warming et al., 1982 Arch Int Phannacodyn Ter,
259, 14-30).
La respuesta del conducto deferente a la
estimulación eléctrica en presencia de prazosín se inhibió por la
noradrenalina con un valor de -log de IC_{50} de 5,96 \pm 0,052
(figura 3). Este valor no fue significativamente diferente del valor
del -log de IC_{50} determinado en presencia de
\rho-TIA 10 \muM (5,90 \pm 0,031, p
> 0,3, n = 5).
Se descubrió que \rho-TIA no
antagonizaba la acción de la noradrenalina en los adrenoceptores
\alpha_{2}. Por lo tanto,
\rho-TIA es capaz de distinguir entre los adrenoceptores \alpha_{1} y \alpha_{2}.
\rho-TIA es capaz de distinguir entre los adrenoceptores \alpha_{1} y \alpha_{2}.
Se dejaron en ayunas durante una noche cobayas
macho (285-425 g) y después se sacrificaron por un
golpe en la cabeza y se desangraron. Se tomaron segmentos con una
longitud de aproximadamente 1,5 cm del íleon, y el contenido
luminal se retiró por un lavado suave con una solución de baño. Las
preparaciones se montaron bajo una tensión de reposo de 1,0 g en
baños de órganos de 5 ml. La solución de baño contenía (mM): NaCl,
136,9; KCl, 2,68; CaCl_{2}, 1,84; MgCl_{2}, 1,03; glucosa,
5,55; NaHCO_{3}, 11,9; y KH_{2}PO_{4}, 0,45; se calentó a 37ºC
y se burbujeó con CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. En la solución de
baño se incluyó indometacina (10 \muM) para mantener un valor
basal estable. Después de un período de equilibro de al menos 40
min, se añadieron dosis de nicotina (4 \muM) a intervalos de 15
minutos. Cuando se descubrió que la respuesta contráctil a la
nicotina era reproducible, el tejido se expuso a
\rho-TIA durante 25 min. Después de este tiempo,
se aplicó otra dosis de nicotina. Las respuestas a la nicotina se
midieron isométricamente y se digitalizaron a una velocidad de
muestreo de 10 Hz.
Las respuestas a la nicotina de los segmentos de
íleon no se vieron afectadas significativamente por
\rho-TIA (10 \muM). En ausencia de
\rho-TIA, la respuesta media fue de 3,29 \pm
0,67 g, y en presencia de \rho-TIA fue de 4,13
\pm 0,70 g
(p > 0,25; ensayo t de dos colas; n = 4).
(p > 0,25; ensayo t de dos colas; n = 4).
El presente descubrimiento de que la repuesta de
segmentos de íleon de cobaya a la nicotina y la respuesta del
hemidiafragma de nervio frénico de ratón a la estimulación
eléctrica no se ven afectadas por \rho-TIA indica
que, a diferencia de las \alpha-conotoxinas, esta
nueva conotoxina no se dirige al subtipo neuronal ni al subtipo
muscular del receptor nicotínico ACh.
Se retiraron los hemidiafragmas izquierdo y
derecho, con los nervios frénicos unidos, de ratones Quackenbush
macho (20-30 g) sacrificados por dislocación
cervical. La base de cada hemidiafragma se puso entre dos
electrodos estimuladores de platino paralelos y el nervio frénico se
puso a lo largo de dos bucles de platino pequeños para la
estimulación de campo. Las preparaciones se montaron en baños de
órganos de 5 ml bajo una tensión de 1,0 g, y se bañaron en una
solución de la siguiente composición (mM): NaCl, 135,0; KCl, 5,0;
CaCl_{2}, 2,0; MgCl_{2}, 1,0; glucosa, 11,0; NaHCO_{3}, 15,0;
y KH_{2}PO_{4}, 1,0. La solución de baño se calentó a 37ºC y se
burbujeó continuamente con CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. Después
de un período de equilibrio de al menos 30 min, se realizaron
estimulaciones directas e indirectas alternas a intervalos de 10 s.
La estimulación directa se realizó usando un pulso de 30 V con una
duración de 2 ms suministrado a los electrodos puestos frente a
cualquier lado del músculo, y la estimulación indirecta se realizó
con un pulso de 3 V con una duración de 0,2 ms suministrado a los
electrodos que rodeaban al nervio frénico. Se examinó el efecto de
una sola dosis de \rho-TIA a una concentración de
10 \muM sobre estas respuestas inducidas directa e
indirectamente. Las concentraciones se registraron de la misma
manera que se ha descrito para las preparaciones del conducto
deferente.
\rho-TIA (10 \muM) no afectó
a las contracciones del hemidiafragma de ratón inducidas por
estimulación de campo del nervio frénico o por estimulación
muscular directa (n = 4; datos no mostrados), lo que indica que
\rho-TIA no se dirige al receptor nicotínico ACh
del músculo.
Las construcciones de adrenoceptor \alpha
usadas fueron el ADNc de \alpha_{1A}-AR de rata,
el ADNc de \alpha_{18}-AR de hámster y el ADNc de
\alpha_{1D} de rata clonados en el vector de expresión eucariota
modificado pMT2', como se ha descrito previamente (Hwa et al., 1995,
J Biol Chem, 270, 23189-95; Perez et al.,
1991, Mol Pharmacol, 40, 876-83; Perez et
al., 1994, Mol Pharmacol, 46, 823-31). Se
cultivaron células COS-1 (American Type Culture
Collection) y se transfectaron de forma transitoria con las
construcciones usando el método de DEAE-dextrano
(Cullen, 1987, Methods Enzymol, 152,
684-704). La eficacia de transfección para este
método varía de un 30 a un 40%. Las células se recogieron 72 h
después de la transfección. Se prepararon membranas a partir de las
células COS-1 transfectadas, como se ha descrito
previamente (Perez et al., 1991, Mol Pharmacol, 40,
876-83). Las membranas se resuspendieron en tampón
HEM (HEPES 20 mM, pH 7,5, EGTA 1,5 mM, MgCl_{2} 12,5 mM) que
contenía glicerol al 10% (v/v) y se almacenaron a -70ºC. Las
características de unión a ligandos de los receptores expresados se
determinaron en una serie de estudios de unión a radioligandos que
usaban [^{125}I]-HEAT, un antagonista específico
del adrenoceptor \alpha_{1}. El procedimiento incluía tubos
duplicados que contenían membranas de células
COS-1, [^{125}I]-HEAT 70 pM,
tampón HEM y \rho-TIA (a 9 concentraciones
diferentes) en un volumen de reacción total de 250 \mul. Se
determinó la unión no específica en presencia de fentolamina (100
\muM). Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las
reacciones se interrumpieron por la adición de tampón HEM enfriado
con hielo y se filtraron en filtros de vidrio Whatman GF/C con un
recolector de células Brandel. Los filtros se lavaron 5 veces con
el tampón HEM enfriado con hielo. La cantidad de radiactividad
unida se analizó usando un Contador Packard
Auto-gamma 500.
Los adrenoceptores \alpha_{1} son una familia
heterogénea, y se han clonado tres subtipos distintos,
\alpha_{1A}, \alpha_{1B} y \alpha_{1D}. La acción de
\rho-TIA en los estudios de unión de
radioligandos fue inhibir la unión de
[[^{125}I]-HEAT a los tres subtipos de
adrenoceptores \alpha_{1} expresados, confirmando que el
adrenoceptor \alpha_{1} es la diana de la conotoxina (figura 4).
Se determinó que los valores de -log de K_{i} eran de 7,29 \pm
0,141 para el subtipo \alpha_{1A}; 7,70 \pm 0,179 para el
subtipo \alpha_{1B}; y 7,09 \pm 0,057 para el subtipo
\alpha_{1D}. Se descubrió que la diferencia en la potencia de
\rho-TIA en los adrenoceptores \alpha_{1B} y
\alpha_{1D} era significativa (p < 0,05), lo que indica
que \rho-TIA y sus análogos tienen la capacidad
de distinguir entre los subtipos de adrenoceptores \alpha_{1}.
\rho-TIA era el más potente en
el subtipo de adrenoceptor \alpha_{1B}. El valor de K_{i} de 20
nM indicó que \rho-TIA es aproximadamente 2
órdenes de magnitud menos potente que el antagonista clásico del
adrenoceptor \alpha_{1} prazosín en este subtipo, basándose en los
datos presentados en la bibliografía. El descubrimiento de
antagonistas específicos de subtipo es de interés por su utilidad
potencial como herramientas de investigación para investigar la
estructura y el funcionamiento de los adrenoceptores \alpha_{1},
y como agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de
afecciones tales como la hiperplasia prostática benigna (Chapple,
1995, Br J Urol, 1, 47-55). Los estudios de unión de
radioligandos también indicaron que \rho-TIA
actuaba de forma no competitiva para inhibir la unión de
[^{125}I]-HEAT, lo cual es indicativo de un
modulador alostérico que actúa en un sitio separado del sitio de
unión de noradrenalina en el adrenoceptor \alpha_{1}.
En conclusión, hay muchas clases estructurales de
compuestos que tienen la capacidad de actuar como antagonistas del
adrenoceptor \alpha_{1}. Entre estas clases se encuentran los
alcaloides, un grupo que comprende varios productos naturales. Éstos
incluyen dicentrina (Teng et al., 1991, Br J Pharmacol, 104,
651-6) y deshidroevodiamina (Chiou et al., 1996, J
Cardiovasc Pharmacol, 27, 845-53) aislada a
partir de fuentes vegetales, e himenina, un alcaloide aislado a
partir de una esponja marina (Kobayashi et al., 1986, Experientia,
42, 1064-5). Otro antagonista de adrenoceptor
\alpha_{1} aislado a partir de una especie de esponja marina es
la aaptamina. A diferencia de la himenina, la aaptamina no es un
alcaloide, sino que más bien es un compuesto heteroaromático
(Ohizumi et al., 1984, J Pharm Pharmacol, 36,
785-6). Estos alcaloides no actúan con un alto grado de especificidad y, se han observado acciones antitrombóticas y anestésicas locales además del bloqueo del adrenoceptor \alpha_{1}. \rho-TIA es estructuralmente distinto de todas estas moléculas orgánicas pequeñas existentes, tanto naturales como sintéticas, ya que es el único ejemplo hasta la fecha de un péptido antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Además, \rho-TIA es la primera conotoxina encontrada que se dirige al adrenoceptor \alpha_{1}, y de esta manera representa el primer miembro de una nueva clase de péptidos que denominamos la familia de \rho-conotoxinas.
785-6). Estos alcaloides no actúan con un alto grado de especificidad y, se han observado acciones antitrombóticas y anestésicas locales además del bloqueo del adrenoceptor \alpha_{1}. \rho-TIA es estructuralmente distinto de todas estas moléculas orgánicas pequeñas existentes, tanto naturales como sintéticas, ya que es el único ejemplo hasta la fecha de un péptido antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Además, \rho-TIA es la primera conotoxina encontrada que se dirige al adrenoceptor \alpha_{1}, y de esta manera representa el primer miembro de una nueva clase de péptidos que denominamos la familia de \rho-conotoxinas.
La secuencia génica completa para la
\rho-conotoxina se aisló usando una estrategia
5'RACE (Random Amplification of cDNA
Ends (Amplificación Aleatoria de Extremos de ADNc)) y una
estrategia 3'RACE junto con clonación y secuenciación del ADN.
El cebador oligonucleotídico
RHO-1B se diseñó a partir de la secuencia peptídica
del péptido \rho-TIA maduro. La relación entre el
oligonucleótido y el péptido es la siguiente, junto con la
secuencia oligonucleotídica:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\rho -TIA \+ - \+ FNWRCCLIPACRRNHKKFC \+ SEC ID
Nº. 1\cr RHO-1B \+ 5'- \+
RCARAAYTTYTTRTGRTT-3' \+ SEC ID Nº. 3\cr AP1 \+
5'- \+ CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' \+ SEC ID Nº.
4\cr}
(donde N=A/C/G/T, R=A/G,
Y=C/T).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se
realizó usando el oligonucleótido RHO-1B en
combinación con el oligonucleótido AP1 en plantillas de ADNc
procedentes del ARNm aislado a partir de conductos de veneno de
conos. Los productos de PCR, que representan la región 5' del gen
de \rho-TIA se aislaron, se purificaron, se
clonaron en vectores bacterianos y se secuenciaron. La secuencia
génica para \rho-TIA se obtuvo a partir de C.
tupila (figura 5).
La secuencia de ADN para las regiones 5' del gen
de \rho-TIA se usó para diseñar oligonucleótidos
que fueran capaces de detectar la secuencia de
\rho-TIA, y la secuencia de otros péptidos muy
relacionados. En la figura 5 se muestra la posición de los
oligonucleótidos con respecto a la secuencia del gen. El
oligonucleótido RHO-1A se usa en una PCR junto con
el oligonucleótido ANCHOR para producir fragmentos de ADN
correspondientes al péptido líder, el péptido maduro y las regiones
3' no traducidas (3'UTR) del gen. La PCR de plantillas de ADNc de
conductos de veneno de C. tulipa produce fragmentos de ADN
correspondientes a \rho-TIA.
La secuencia de ADN para ANCHOR es:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
ANCHOR \+
5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT-3'
\+ SEC ID Nº.
5\cr}
La secuencia génica para el péptido
\rho-TIA producido usando 5'RACE y 3'RACE
representa fragmentos solapantes del gen. Estos fragmentos se
combinan para producir una secuencia consenso para cada gen. Las
secuencias consenso son los ADNc completos para los genes, e
incluyen 5'UTR, el péptido líder, el péptido maduro y la 3'UTR.
A lo largo de toda esta memoria descriptiva y de
las reivindicaciones que se presentan a continuación, a menos que
el contexto requiera otra cosa, se entenderá que el término
"comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que
comprende" implican la inclusión del número entero o etapa o
grupo de números enteros o etapas indicado, pero no la exclusión de
ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o
etapas.
Los especialistas en la técnica apreciarán que la
invención descrita en este documento es susceptible de variaciones
y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Se
entenderá que la invención incluye todas estas variaciones y
modificaciones. La invención también incluye todas las etapas,
características, composiciones y compuestos mencionados o indicados
en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y todas y
cada una de las combinaciones de dos o más de dichas etapas o
características.
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip0.333000\baselineskip
<150> PP6273/98
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
1998-10-02
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Natural
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Trp Arg Cys Cys Leu Ile Pro Ala Cys
Arg Arg Asn His Lys}
Lys Phe Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Natural
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Leu Ile Pro Ala Cys Arg Arg Asn His
Lys Lys Phe Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Cys Ala Arg Ala Ala Tyr Thr Thr Tyr Thr
Thr Arg Thr Gly Arg}
\sac{Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipccatcctaat acgactcact atagggc
\hfill27
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipaactggaaga attcgcggcc gcaggaat
\hfill28
Claims (22)
1. Un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas aislado, sintético o
recombinante, o un derivado del mismo que tiene actividad
antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}.
2. Un péptido de
\rho-conotoxina de acuerdo con la reivindicación
1, que tiene la secuencia:
SEC ID Nº.
1FNWRCCLIPACRRNHKKFC
o una secuencia que ha experimentado una o más
deleciones, adiciones o substituciones de aminoácidos, o
modificaciones de la cadena
lateral.
3. Un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con la reivindicación
2, que es \rho-TIA.
4. Un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una actividad insignificante o
nula en el subtipo neuronal o muscular del receptor nicotínico
ACh.
5. Una \rho-conotoxina de
acuerdo con la reivindicación 1, que tiene selectividad por un
subtipo \alpha_{1} con respecto a los demás subtipos.
6. Una \rho-conotoxina de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene
cuatro restos de cisteína y dos enlaces disulfuro.
7. Un péptido de
\rho-conotoxina de acuerdo con la reivindicación
6, donde la conectividad del enlace disulfuro es
A-C/B-D, donde A, B, C y D se refieren al primer, segundo, tercer y cuarto restos de cisteína implicados en la formación de enlaces disulfuro, respectivamente.
A-C/B-D, donde A, B, C y D se refieren al primer, segundo, tercer y cuarto restos de cisteína implicados en la formación de enlaces disulfuro, respectivamente.
8. Uso de un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, en un ensayo de unión a receptores
para ensayar la actividad de una molécula como antagonista de la
actividad del adrenoceptor \alpha_{1}.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que es
complementaria a una secuencia que codifica un péptido del grupo de
las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una sonda de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una
secuencia que codifica todo o parte de un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7.
11. Un anticuerpo monoclonal o policlonal contra
un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Una construcción genética que comprende una
porción de vector y un ácido nucleico capaz de codificar un péptido
del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. Un péptido quimérico que comprende un
segmento o secuencia de un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas natural como se define en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un segmento o secuencia
de otro péptido o proteína biológicamente activa, de tal forma que
el péptido quimérico resultante posea una actividad asociada con
dicho otro péptido o proteína.
14. Un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o la
profilaxis de afecciones o enfermedades urinarias o
cardiovasculares, o de trastornos del estado de ánimo, o para el
tratamiento o control del dolor o la inflamación.
15. Uso de un péptido del grupo de las
\rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento o la profilaxis de enfermedades o afecciones en las
que el antagonismo selectivo de adrenoceptores \alpha_{1} está
asociado con un tratamiento o una profilaxis eficaz.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15,
donde el medicamento es para el tratamiento o la profilaxis de
afecciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares, o de
trastornos del estado de ánimo, o para el tratamiento o control del
dolor o la inflamación.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
donde la enfermedad o afección del sistema urinario es hiperplasia
prostática o un trastorno relacionado.
\newpage
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
donde la enfermedad o afección cardiovascular es una arritmia,
hipertensión o insuficiencia cardíaca coronaria.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
donde el trastorno del estado de ánimo es una adicción.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
donde el dolor es un dolor crónico, dolor neuropático o dolor
inflamatorio.
21. Una composición que comprende un péptido del
grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético
o recombinante, de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
22. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 21, que es una composición farmacéutica.
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