ES2201055T3 - Vacunas de adenovirus recombinante. - Google Patents
Vacunas de adenovirus recombinante.Info
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Abstract
SE MUESTRA LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS O DE INMUNIDAD MEDIATIZADA DE CELULAS A UN ORGANISMO INFECCIOSOS EN UN MAMIFERO DE SANGRE CALIENTE. LA PRODUCCION COMPRENDE LA ADMINISTRACION A DICHO MAMIFERO DE SANGRE CALIENTE INTRANASAL, INTRAMUSCULAR O SUBCUTANEAMENTE, LOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES VIVOS EN EL QUE LA PROTEINA ESTRUCTURAL DE VIRION ESTA SIN CAMBIAR DESDE QUE EN EL ADENOVIRUS NATIVO SE PRODUCE EL ADENOVIRUS RECOMBINANTE A PARTIR DE ESTE, Y QUE CONTIENE EL GEN QUE CODIFICA EL ANTIGENO QUE CORRESPONDE A DICHOS ANTICUERPOS O QUE COMPRENDE DICHA INMUNIDAD MEDIATIZADA DE CELULAS. LAS VACUNAS QUE CONTIENEN LOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES TAMBIEN SON DESCRITAS. ALGUNOS DE LOS ADENOVIRUS RECOMBINANTES TAMBIEN SON NUEVOS PER SE.
Description
Vacunas de adenovirus recombinante.
Un objetivo principal de la investigación
biomédica es proporcionar protección contra las enfermedades
víricas mediante la inmunización. Una estrategia ha sido la
utilización vacunas con gérmenes muertos. Sin embargo, son
necesarias grandes cantidades de material para que la vacuna con
gérmenes muertos retenga una masa antigénica suficiente. Además,
las vacunas con gérmenes muertos se contaminan frecuentemente con
productos indeseables durante su preparación. Las vacunas
heterólogas con gérmenes vivos, que utilizan adenovirus modificado
apropiadamente, que es en sí mismo una vacuna, parecen excelentes
inmunógenos [Chanock R., JAMA, 195, 151 (1967)]. La presente
invención se refiere a vacunas que utilizan adenovirus como
vector.
La adenovacuna comercializada en la actualidad
comprende adenovirus vivos, infecciosos, en una forma farmacéutica
con recubrimiento entérico. Tras la administración al paciente que
se va a vacunar, el virus se transporta a través de las vías
respiratorias superiores (donde se cree que se produce la infección
que provoca la enfermedad) y se libera en el intestino. En el
intestino, el virus se reproduce en la pared intestinal, donde,
aunque no es capaz de causar enfermedad adenovírica, provoca, no
obstante, la formación de anticuerpos contra el adenovirus,
confiriendo de este modo inmunidad contra la enfermedad
adenovírica. En la presente invención se utiliza un adenovirus vivo,
infeccioso, que ha sido modificado para contener genes que
codifican antígenos producidos por otros patógenos. Tras su
liberación, el virus se reproducirá y expresará separadamente tanto
el antígeno adenovírico como el antígeno del patógeno, provocando
de este modo la formación de anticuerpos o de inmunidad celular
tanto contra el adenovirus como contra el otro patógeno. Por
"virus vivo" se entiende, en contraposición a virus
"muerto", un virus que es, bien por sí mismo o junto con
material genético adicional, capaz de producir progenie idéntica.
Por "infeccioso" se entiende la capacidad de introducir el
genoma vírico en las células.
Roy propuso, en la publicación de patente europea
80.806 (1983), un método para producir inmunidad contra las
enfermedades microbianas mediante la administración de un microbio
que contiene un gen foráneo que expresará un antígeno de un segundo
microbio contra el que se confiere inmunidad. Se afirma que las
preparaciones orales preferidas tienen recubrimiento entérico.
Dulbecco propuso vacunas con adenovirus recombinantes en las que la
proteína de la superficie del adenovirus está modificada para que
contenga en su estructura un segmento de una proteína foránea que
producirá una respuesta biológica deseada tras su administración a
animales. [Publicación internacional PCT WO 83/02393 (1983)]. Davis
describe vacunas orales procedentes de adenovirus recombinantes.
[Patente británica GB 2166349 B].
El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1
(VIH-1) se ha asociado etiológicamente al síndrome
de la inmunodeficiencia humana (SIDA) y a trastornos relacionados.
[Barre-Sinoussi, F., Science 220: 868 (1983); Gallo,
R., Science 224: 500 (1984); Popovic, M., Science 224: 497 (1984);
Sarngadharan, M., Science 224: 506 (1984)]. El SIDA es ahora una
epidemia mundial para la que, actualmente, no hay ninguna vacuna o
curación. La mayoría de los esfuerzos para el desarrollo de vacunas
se han centrado en la glicoproteína de la cubierta (env) como
antígeno que puede proporcionar inmunidad protectora. Los
antisueros preparados contra la gp 120 purificada pueden
neutralizar el VIH-1 in vitro. [Crowl, R.,
Cell 41: 979 (1985); Putney, S., Science 234: 1392 (1986); Ho, D.,
J. Virol. 61: 2024 (1987); Nara, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:
3797 (1987)]. El antígeno de la cubierta del VIH-1
ha sido producido en diferentes sistemas de expresión, entre ellos
Escherichia coli [Crowl, R., Cell 41: 979 (1985); Chang, T.,
Bio/Technology 3: 905 (1985); Dawson, G., J. Infect. Dis. 157: 149
(1988)] así como células de mamífero [Chakrabarti, S., Nature 320:
535 (1986); Dewar, R., J. Virol. 63: 129 (1989); Rekosh, D., Proc.
Natl. Acad. Sci.USA 85: 334 (1988); Whealy, M., J. Virol. 62: 4185
(1988)] de levadura [Barr, P., Vaccine 5: 90 (1987)] y de insectos
[Hu, S., Nature 328: 721 (1978); Rusche, J., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84: 6294 (1987)].
Se evaluaron el virus de la vacuna recombinante,
vivo, que expresaba la glicoproteína env completa del
VIH-1 [Hu, S., J. Virol. 61: 3617 (1987)] o la
glicoproteína env gp 120 recombinante purificada [Berman, P., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 5200 (1988)] en chimpancés, como
candidatos para vacunas. La inmunización activa con estas vacunas
provocó buenas respuestas de inmunidad celular así como actividad de
linfocitos T citotóxicos contra el antígeno env [Zarling, J., J.
Immunol. 139: 988 (1987)]. Todos los animales experimentales
presentaron seroconversión, a juzgar por los análisis de ELISA y de
inmunotransferencia. Sin embargo, los chimpancés inmunizados no
desarrollaron títulos, o bien desarrollaron títulos muy bajos, de
anticuerpos neutralizantes contra el VIH-1. La
prueba de provocación con virus vivos no consiguió proteger a los
chimpancés contra estas vacunas. Se encontraron anticuerpos
neutralizantes de tipo específico contra el VIH-1 en
los chimpancés, en la etapa temprana de la infección, dirigidos
contra un dominio variable (V3) de la mitad
C-terminal de gp 120 [Goudsmit, J., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 4478 (1988)]. También se ha comprobado que la gp
120 recombinante sintetizada en células de insectos provoca
respuestas de inmunidad humoral en cabras (Rusche J., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 6294 (1987)]. Zagury [Nature 332: 728 (1988)] ha
demostrado reacciones inmunitarias anamnésicas tanto humorales como
celulares en seres humanos, utilizando un virus de la vacuna
recombinante que expresaba gp 160. [Chakrabarti, S., Nature 320: 535
(1986); Hahn, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4813 (1985)].
También se comprobaron tanto la inmunidad celular específica de
grupo como la citotoxicidad celular contra células T4 infectadas.
Estos resultados indican que puede alcanzarse la inmunidad contra el
VIH-1 en seres humanos utilizando una vacuna basada
en la env recombinante. Recientemente, Desrosiers ha demostrado que
la vacunación con el virus de la inmunodeficiencia de los simios
(SIV) entero inactivado puede proteger a macacos de la prueba de
provocación con SIV vivos. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6353
(1989)]. Estos datos ofrecen esperanzas de que sea posible la
protección, con vacunas, contra la infección por el virus del SIDA
humano, VIH-1.
Chanda describe elevados niveles de expresión de
las glucoproteínas de la cubierta del VIH-1 en
presencia del gen rev, utilizando formas recombinantes del
adenovirus de tipo 7, independiente de colaboradores. [Virology 175:
535 (1990)]. Vernon describe la caracterización ultraestructural de
la subunidad gag del VIH-1 en un sistema de vector
de adenovirus recombinante. [J. Gen. Virology 72: 1243 (1991)].
Vernon describe asimismo la preparación de los adenovirus
recombinantes del VIH-1,
Ad7-rev-gag y
Ad4-rev-gag.
La presente invención proporciona la utilización
de un adenovirus recombinante vivo para preparar un medicamento
para su utilización en el tratamiento para producir anticuerpos o
inmunidad celular contra el virus de la inmunodeficiencia humana de
tipo 1, en el que la proteína estructural del virión permanece
invariable respecto a la del adenovirus nativo a partir del cual se
ha producido el adenovirus recombinante, y que contiene el gen que
codifica el antígeno correspondiente a dichos anticuerpos o que
induce dicha inmunidad celular, en el que el adenovirus
recombinante se selecciona a parir de uno o más del grupo formado
por:
Ad7-tplenv-tplHrev,
Ad7-tplgag-tplHrev,
Ad7-rev-gag,
Ad4-tplenv-tplHrev, Ad4-
tplgag-tplHrev,
Ad4-rev-gag,
Ad5-tplenv-tplHrev, y
Ad5-tplgag-tplHrev,
estando destinado el medicamento para su
administración intranasal a un mamífero del orden de los Primates,
incluido el
hombre.
En una realización adicional de la invención, el
medicamento comprende además una o más de una proteína subunitaria
del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1.
Preferiblemente, la proteína subunitaria es env o gag.
Aunque la descripción se refiere específicamente
a adenovirus que tienen una deleción en la región temprana 3 (E3),
también pueden utilizarse como vectores adenovirus que están
atenuados, contienen una lesión sensible a la temperatura o una
deleción E1.
En una realización preferida, el método de
tratamiento incluye administrar el adenovirus recombinante tanto de
modo profiláctico a un mamífero susceptible al
VIH-1 como en forma de inmunoterapia tras la
detección del VIH en dicho mamífero. Se utilizaron pautas de
administración con los siguientes adenovirus recombinantes para
producir las respuestas contra el VIH.
| Nombre del virus | Nombre descriptivo | Nombre de la ATCC |
| Ad7-env | Ad7-tplenv-tplHrev | VR-2299 |
| Ad7-gag | Ad7-tplgag-tplHrev | VR-2393 |
| Ad7-gag-1 | Ad7-rev-gag | VR-2392 |
| Ad4-env | Ad4-tplenv-tplHrev | VR-2293 |
| Ad4-gag | Ad4-tplgag-tplHrev | VR-2391 |
| Ad4-gag-1 | Ad4-rev-gag | VR-2390 |
| Ad5-env | Ad5-tplenv-tplHrev | VR-2297 |
| Ad5-gag | Ad5-tplgag-tplHrev | VR-2298 |
En relación con la tabla anterior, Ad4, Ad5 y Ad7
se refieren a adenovirus humanos de tipo 4, 5 y 7, respectivamente,
en los que la región E3 se ha eliminado por deleción. Env se
refiere al gen de la glicoproteína de la cubierta del VIH (gp 160).
Gag se refiere al gen gag/pro del VIH. Rev se refiere al gen
regulador del VIH. Hrev se refiere una versión modificada del gen
rev, en la que se cambiaron las secuencias nucleotídicas sin
cambiar la secuencia aminoácida, empleando codones de uso frecuente
en seres humanos. Tpl se refiere a la secuencia del líder
tripartito corriente arriba del adenovirus, con una secuencia
intercalada entre el primer y el segundo líder, que se han colocado
delante de los genes recombinantes.
En realizaciones adicionales de la presente
invención se proporcionan virus
X-tplY-tplHrev recombinantes vivos,
en los que X es Ad4, Ad5 o Ad7, e Y es env o gag.
Como se describe en detalle más adelante, la
administración intranasal de virus Ad-VIH
recombinantes a chimpancés sin experiencia previa del virus dio
lugar a la sensibilización y al refuerzo de las respuestas
inmunitarias tanto humorales como celulares dirigidas contra los
antígenos recombinantes del VIH. Se comprobó que los adenovirus
recombinantes administrados a chimpancés producían anticuerpos
contra las proteínas env y gag del VIH. Se observaron anticuerpos
de IgG específicos contra el VIH en las secreciones nasales,
salivales y vaginales tras la administración de los adenovirus
recombinantes y se observaron anticuerpos de IgA específicos contra
el VIH en las secreciones nasales y salivales. El primer grupo de
virus recombinantes (Ad7) parecía liberarse durante un período de
tiempo más prolongado y provocó la mejor respuesta con anticuerpos
anti-Ad. Los resultados también demostraron que la
administración de vacunas Ad-VIH por la vía
intranasal era superior a la administración de virus recombinantes
con recubrimiento entérico por la vía oral.
Las respuestas inmunitarias óptimas dirigidas
contra los antígenos del VIH requerían infección primaria con
inmunización de refuerzo con un Ad-VIH recombinante
heterotípico para provocar un alto nivel de anticuerpos de unión
contra el VIH. La administración intranasal de los virus
Ad-VIH sensibilizó eficazmente a los chimpancés para
responder con altas concentraciones de anticuerpos neutralizantes
contra el VIH-1 tras la posterior inmunización de
refuerzo con la proteína subunitaria del VIH-1.
Los siguientes Ejemplos muestran la construcción
de adenovirus recombinantes representativos de la presente
invención. Los virus recombinantes se propagaron en células A549 y
después se titularon en células A549.
La construcción de adenovirus recombinantes que
contenían el gen de la proteína de la cubierta del VIH ha sido
descrita [Chanda, P., Virology 175: 535 (1990)]; se utilizó un
procedimiento similar para incorporar gag y pro [véase Vernon, S.,
J. Gen. Virology 72: 1243 (1991)]. Brevemente, se construyó un
fragmento de ADN que contenía las regiones codificantes completas
de gag y pro (335 a 2165 pb) de la cepa LAV del
VIH-1 [Wain-Hobson, S., Cell 40: 9,
(1985)] con un sitio Sa/I único delante del codón AUG del gen gag y
un sitio XbaI en la posición 2165 pb, para la inserción del elemento
vírico de respuesta rev (rre; 7178 a 7698 pb). Un fragmento SaI de
2,37 kb que contenía las tres secuencias del VIH-1,
se insertó en un sitio SaI en una casete de expresión que contenía
el principal promotor tardío (MLP) del adenovirus de tipo 7 (Ad7),
el líder tripartito (TPL) con una secuencia intercalada entre los
líderes primero y segundo y el sitio de poliadenilación
(poli-A) de hexon, como se describe en Chanda
[Virology 175: 535 (1990)]. La casete se insertó 159 pb desde el
extremo derecho de un genoma Ad7 [Sussenbach, The Adenoviruses,
Ginsberg, ed., Plenum Press, pp. 34-124 (1984)] que
contenía el gen rev del VIH-1 [Feinberg, M., Cell
46: 807 (1986); Sodroski, J., Nature 321: 412 (1986)] en una región
E3 [79,5 a 88,4 unidades cartográficas (m.u.)] eliminada por
deleción [Chanda, P., Virology 175: 535 (1990)].
Siguiendo el procedimiento para la construcción
del adenovirus recombinante Ad7- gag-1 en el Ejemplo
1, se insertaron una casete de expresión similar que contenía
secuencias Ad4 análogas y las tres regiones codificantes del VIH en
un sitio 139 pb desde el extremo derecho de un genoma Ad4 que
contenía el gen rev del VIH-1 en una deleción E3
entre 76 y 86 m.u.
El
Ad5-tplenv-tplHrev contiene la
secuencia codificante completa de la gp160 del
VIH-1 (cepa LAV) y una versión modificada del gen
rev, llamada Hrev. Tanto el gen env como el rev están precedidos
por una copia sintética del líder tripartito del Ad5
(Ad5-tpl). El Ad5-tpl se sintetizó
químicamente y se clonó en el vector pTZ. Después, la secuencia de
ADN de la gp160 se insertó detrás del Ad5-tpl, para
crear el clon Ad5-tplenv/PTZ18R. El Hrev (\sim360
pb) también se sintetizó químicamente, cambiando las secuencias
nucleotídicas sin cambiar la secuencia de aminoácidos con ayuda de
la utilización de diferentes codones. Esto se realizó para evitar
la recombinación homóloga, ya que existen algunas secuencias
idénticas entre env y rev. De modo análogo al de la construcción
Ad5-tplenv, se insertó también el gen Hrev detrás
del tpl en el vector pTZ18R, para crear el plásmido
Ad5-tplHrev. La secuencia completa que contenía
Ad5-tplHrev se cortó y se insertó detrás de
Ad5-tplenv, para crear el plásmido
Ad5-tplenv-tplHrev. Este plásmido se
insertó a continuación en la región E3 eliminada por deleción de la
cepa Marietta del Ad5 (deleción 78,8-85,7_m.u.) en
la posición 78,8 m.u. Este plásmido se linealizó con la enzima BglI
y después se mezcló con el fragmento SnaB1 0-87
m.u. procedente del virus Ad5 de tipo salvaje purificado. Después de
transfectar las células A549 con las mezclas de ADN, se escogieron
placas del virus recombinante, se purificaron tres veces en placas
y se confirmaron sus estructuras genómicas por análisis de los
sitios de endonucleasas de restricción en ADN extraído de células
infectadas por el método de Hirt. [J. Mol Bio. 26: 365 (1967)].
\newpage
El
Ad5-tplgag-tplHrev contiene las
regiones gag y pro completas, así como el gen rev modificado, Hrev.
Una copia del líder tripartito sintético del Ad5 se colocó delante
de los genes gag y Hrev. Un fragmento de ADN que contenía las
regiones gag y pro completas (335 a 2165 pb de la cepa LAV del
VIH-1) se construyó con un sitio SalI único delante
del codón AUG del gen gag y un sitio Xba en la posición 2165 pb,
para la inserción del elemento de respuesta rev vírico (rre;
7178-7698 pb). Se construyeron dos plásmidos
independientes Ad5-tplgag así como
Ad5-tplHrev, de modo similar al descrito para
Ad5-tplenv-tplHrev. Después, el
fragmento Ad5-tplHrev se insertó detrás de
Ad5-tplgag, para crear el plásmido
Ad5-tplgag-tplHrev. Después se
insertó el fragmento
Ad5-tplgag-tplHrev en el sitio XbaI
único en la posición 78,8 del mapa de la cepa Marietta del Ad5 con
una deleción E3 (deleción E3 78,8-85,7 m.u.).
Después, el plásmido final que contenía la secuencia Ad5 se
linealizó y se mezcló con el fragmento vírico SnaB1
0-87 m.u. para la transfección. Se escogieron
placas recombinantes, se purificaron tres veces en placas y se
analizaron por análisis de Hirt del ADN extraído de las células
infectadas.
Los adenovirus recombinantes se cultivaron en
células A549 y se recogieron después de 3 ciclos de
congelación-descongelación. Los lisados clarificados
de células infectadas se liofilizaron y se envasaron 60 a 100 mg en
cápsulas de gelatina nº 2 utilizando un émbolo de una jeringa de 1
ml en condiciones de deshumidificación. Las cápsulas se recubrieron
con ftalato acetato de celulosa al 10% en acetona/etanol al 100%
(1:1) mojando manualmente cada extremo 6 veces y secando al aire
entre cada ocasión. En estas condiciones se formó un recubrimiento
de 69 a 77 mg de ftalato acetato de celulosa. Se analizaron
muestras de cápsulas para comprobar su resistencia al líquido
gástrico simulado (pepsina al 0,32%, NaCl al 0,2% pH 1,2) a 37ºC,
utilizando un aparato de análisis de desintegración VanKel durante
1 h. Las cápsulas se inspeccionaron para determinar agujeros o
fisuras y se transfirieron a un tubo de 15 ml que contenía 10 ml de
líquido intestinal simulado (pancreatina al 1,0%, fosfato de
potasio monobásico 0,05 M pH 7,5) y se sometieron a rotación a
37ºC. Todas las cápsulas analizadas fueron resistentes al líquido
gástrico simulado durante 1 h a 37ºC con agitación y comenzaron a
disolverse en el plazo de 15 min en líquido intestinal simulado. La
cantidad de virus se valoró en monocapas de células A549 confluentes
mediante un ensayo de placas, y la estabilidad del ADN vírico se
confirmó por análisis de Hirt.
La inmunogenicidad de los adenovirus
recombinantes para el VIH se evaluó en chimpancés utilizando tres
pautas de tratamiento. La primera pauta de tratamiento consistía en
administrar los adenovirus recombinantes por vía oral, por medio de
una cápsula con recubrimiento entérico (Ejemplo 5) a las 0, 7 y 26
semanas, seguido por una dosis de refuerzo con las proteínas
subunitarias env + gag utilizando Alum como adyuvante. La segunda
pauta de tratamiento consistía en tratar además a los chimpancés que
habían sido sometidos a la pauta 1 a las 46 y 58 semanas con una
dosis de refuerzo adicional de adenovirus recombinantes
administrados por vía intranasal. La tercera pauta de tratamiento
consistía en administrar adenovirus recombinantes por vía intranasal
a chimpancés sin experiencia previa de tratamiento a las 0, 24 y 52
semanas, seguido por una dosis de refuerzo con la subunidad env a
la semana 72.
La siguiente tabla presenta un resumen de las
pautas de tratamiento 1 y 2.
Pautas de tratamiento 1 y
2
| Inmunización | Tiempo | Chimpancés 1 y 2 | Chimpancé 3 |
| Pauta 1 | |||
| Primaria* | 0 semanas | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad7-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad7-env |
| 2,0 x 109 ufp de Ad7-gag-1 | |||
| 1^{er} Refuerzo* | 7 semanas | 1,1 x 10^{10} ufp de Ad4-env | 1,1 x 10^{10} ufp de Ad4-env |
| 1,0 x 10^{10} ufp de Ad4-gag-1 | |||
| 2^{o} Refuerzo* | 26 semanas | 7,9 x 10^{10} ufp de Ad5-env | 7,9 x 10^{10} ufp de Ad5-env |
| 3^{er} Refuerzo^{+} | 34 semanas | 200 \mug de env en Alum al 0,2% | 200 \mug de env en Alum al 0,2% |
| 500 \mug de env en Alum al 0,2% |
(Continuación)
| Inmunización | Tiempo | Chimpancés 1 y 2 | Chimpancé 3 |
| Pauta 2 | |||
| 1^{er} Refuerzo | 46 semanas | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad7-env | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad7-env |
| intranasal | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad7-gag | ||
| 1^{er} Refuerzo | 58 semanas | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad4-env | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad4-env |
| intranasal | 1,0 x 10^{8} ufp de Ad4-gag | ||
| * Cada dosis se administró en cápsulas de gelatina con recubrimiento entérico, en 3 dias consecutivos. | |||
| ^{+} Administrada por vía intramuscular. |
La siguiente tabla presenta un resumen de la
pauta de tratamiento 3.
Pauta de tratamiento
3
| Inmunización | Tiempo | Chimpancés 4 y 5 | Chimpancé 6 |
| Primaria* | 0 semanas | 1,0 x 10^{7} ufp de Ad7-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad7-env |
| 1,0 x 10^{7} ufp de Ad7-gag | |||
| 1^{er} Refuerzo* | 24 semanas | 1,0 x 10^{7} ufp de Ad4-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad4-env |
| 1,0 x 10^{7} ufp de Ad4-gag | |||
| 2^{o} Refuerzo* | 52 semanas | 1,0 x 10^{7} ufp de Ad5-env | 1,5 x 10^{7} ufp de Ad5-env |
| 1,0 x 10^{7} ufp de Ad5-gag | |||
| 3^{er} Refuerzo^{+} | 75 semanas | 0,5 mg de env | |
| * Administrada por vía intranasal | |||
| ^{+} Administrada por vía intramuscular. |
Pauta de tratamiento
1
Tres chimpancés (2 machos y 1 hembra) que habían
dado resultados negativos en los análisis de la presencia de
anticuerpos neutralizantes contra los adenovirus humanos de tipo 4
y 7 se evaluaron utilizando la pauta de tratamiento 1. Se
administraron cápsulas con recubrimiento entérico que contenían
adenovirus recombinantes, utilizando una sonda gástrica, con
anestesia, en tres días consecutivos. Dos chimpancés (1 y 2)
recibieron ambos virus recombinantes env y gag, mientras que el
tercer chimpancé (3) recibió sólo virus recombinantes env.
Las preparaciones de subunidades procedentes de
adenovirus, que contenían los productos del gen env o gag, se
purificaron a partir de cultivos de células A549 infectadas [véase
Vernon, S., J. Gen. Virology 72: 1243 (1991) y Natuk, R., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 7777 (1992)]. Los antígenos recombinantes
se formularon con adyuvante Alum y se administraron por vía
intramuscular 200 \mug/dosis de partículas de env y 500
\mug/dosis de partículas de gag.
Se recogieron muestras de sangre entera, suero y
heces a diferentes tiempos durante el transcurso del experimento.
Se preparó la sangre entera para obtener poblaciones de leucocitos
para FACS, CTL del VIH (utilizando virus de la vacuna recombinantes
que expresaban VIH-env, VIH-gag, o
los productos del gen lac) y para ensayos linfoproliferativos con
gp160, gp120 y p24 purificadas del VIH recombinante. Las muestras de
suero y de heces se almacenaron a -70ºC hasta su utilización.
\newpage
Se descongelaron muestras de heces de chimpancés
y se prepararon suspensiones al 10% (V/V) en DMEM que contenía
antibióticos. Se utilizaron suspensiones de heces clarificadas para
infectar monocapas de células A549 confluentes en placas de cultivo
de tejidos de 60 mm. Tras un período de adsorción de 1 h, se eliminó
por lavado el material no unido y se aplicó una capa de medio con
agar al 0,5% sobre las monocapas. Se dejó desarrollar las placas
durante 7-10 días y las placas se visualizaron por
tinción con rojo neutro, se contaron y se retiró suavemente la capa
de agar, teniendo cuidado de no perturbar la monocapa de células.
La hoja de células se transfirió a filtros de nitrocelulosa
(Millipore Tipo HA, 0,45 \mum), previamente empapados en SSC 20X,
que se colocaron sobre la hoja de células y se dejaron en contacto
con la monocapa de células durante 2 a 4 minutos. Los filtros se
retiraron, se secaron con aire y se calentaron durante 2 h en una
estufa de vacío a 80ºC. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron dos
veces con SSc 3X/SDS al 0,1% a temperatura ambiente y se
prehibridaron e hibridaron siguiendo procedimientos estándar
[Poncet, D., J. Virol. Methods 26: 27 (1989)]. Se añadieron sondas
de oligonucleótidos marcados con ^{32}P al tampón de hibridación
(1 x 10^{6} CPM) y se incubaron toda la noche a 42ºC. Se
prepararon sondas de ADN para detectar secuencias específicas de
fibra de Ad4, fibra de Ad5, fibra de Ad7, VIH-env o
VIH-gag. [Wain-Hobson, Cell 40: 9
(1985)]. Los filtros se lavaron, se autorradiografiaron y se
contaron las señales de hibridación.
Se prepararon diluciones dobles sucesivas
(empezando con 1:4) de suero de perro termoinactivado (56ºC durante
30 min) en placas de microvaloración de 96 pocillos (0,05
ml/pocillo) y se mezclaron con 0,05 ml de medio que contenía
30-100 TCID_{50} del virus durante 1 h a 37ºC. A
cada pocillo se añadieron 0,05 ml de medio que contenía 2 x
10^{4} células A549 y las placas se incubaron a 37ºC con CO_{2}
al 5% durante 7-10 días. Todas las muestras se
realizaron por duplicado. Se incluyeron testigos de virus y células
no infectadas en cada ensayo para determinar el punto final en los
sueros analizados. Los títulos se expresaron como los recíprocos de
la dilución mínima a la que se observaba el 50% del efecto
citopático.
La detección anticuerpos anti-VIH
y las respuestas de los chimpancés con anticuerpos contra antígenos
del VIH-1 se midieron analizando varias diluciones
con kits comerciales de ELISA y de inmunotransferencia, siguiendo
las instrucciones del fabricante (DuPont, Wilmington, DE).
Se recogieron heces de cada chimpancé antes y
después de la inoculación con virus y se almacenaron a -70ºC. Se
prepararon suspensiones de cada muestra al diez por ciento y se
utilizaron para infectar monocapas de células A549 confluentes. Tras
7-10 días, se identificaron placas víricas por
tinción con rojo neutro y las monocapas de células se transfirieron
a membranas de nitrocelulosa. Se hibridaron muestras
representativas con varias sondas de oligonucleótidos marcados para
detectar secuencias específicas de genes de Ad4, Ad5, Ad7,
VIH-env o VIH-gag. La identificación
de virus Ad-VIH recombinantes específicos pudo
determinarse por esta técnica de hibridación de placas. Ninguno de
los virus recombinantes se liberó en las heces durante más de 7
días tras la inoculación. Los títulos máximos estuvieron siempre
asociados a las muestras de los días 1-3 y
representaban probablemente los virus del inóculo que no se habían
absorbido. Estudios previos con chimpancés utilizando virus
Ad-HBsAg recombinantes habían sugerido que los virus
Ad-HBsAg recombinantes podían detectarse durante
30-40 días tras la inoculación. En el caso de la
vía de administración por cápsula con recubrimiento entérico parece
ser que estos virus recombinantes no se replicaron bien in
vivo.
La seroconversión al serotipo de vectores de
adenovirus utilizado se determinó por procedimientos de análisis de
neutralización. Se midieron títulos séricos de anticuerpos
anti-adenovirus muy bajos a modestos para los 3
serotipos utilizados en cada uno de los chimpancés.
La seroconversión a los productos de los genes
del VIH recombinante se determinó o bien por técnicas de ELISA o de
inmunotransferencia. No se detectó respuesta de ELISA en ninguno de
los chimpancés antes de la segunda inoculación de refuerzo con el
virus Ad5-env recombinante. Dos semanas después de
la inoculación con Ad5-env pudieron medirse
respuestas anti-env en 2 de los 3 animales. La
inyección intramuscular de preparaciones de gag y/o env tuvo un
ligero efecto de refuerzo en 1 de los 3 animales. El análisis de
inmunotransferencia resultó mucho más sensible que el de ELISA y
presentaba la ventaja adicional de identificar qué productos de los
genes env y/o gag estaban siendo reconocidos como inmunógenos. Se
midieron títulos séricos de anticuerpos bajos, tanto tras la dosis
primaria con virus Ad7 recombinante como con la primera dosis de
refuerzo con virus Ad4 recombinantes. Se observó un aumento
significativo en los títulos séricos de anticuerpos contra los
productos del gen env tras la segunda inmunización de refuerzo con
el virus Ad5-env recombinante. Se observaron
aumentos significativos en los 2 animales que recibieron los
productos del gen gag tras la inyección con preparaciones de
subunidades. A pesar de los relativamente buenos títulos de
anticuerpos contra los antígenos del VIH observados en la
inmunotransferencia, sólo 1 de los 3 animales respondió con
anticuerpos séricos neutralizantes. Esta respuesta fue muy baja en
el chimpancé 2 (título de 10 a 20).
\newpage
Estos resultados se resumen en la siguiente
tabla.
Resultados obtenidos utilizando la pauta de
tratamiento
1
| Titulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Titulo máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (días) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 1 | Ad7-env, Ad7-gag-1 | 2,2 | 128 | - | 20 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag-1 | 2,2 | 8 | - | 20 | <10 | |
| Ad5-env | 7+ | 128 | 100 | - | <10 | |
| subunidad: env + gag | 100 | 1000 | <10 | |||
| 2 | Ad7-env, Ad7-gag-1 | 3,2 | 64 | - | 20 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag-1 | 1,7 | 128 | 20 | 100 | <10 | |
| Ad5-env | 7+ | 64 | 10000 | - | 20 | |
| subunidad: env + gag | 1000 | 10000 | 10 | |||
| 3 | Ad7-env | 2 | 6 | 20 | N/A* | <10 |
| Ad4-env | 1 | 128 | 20 | N/A | <10 | |
| Ad5-env | 7+ | 512 | 1000 | N/A | <10 | |
| subunidad: env | 100 | N/A | <10 | |||
| *N/A= No aplicable |
La inmunidad celular se midió en una población de
células mononucleares de sangre periférica de chimpancés. Se midió
la actividad CTL específica para el VIH determinando la lisis de
células diana singénicas infectadas con formas recombinantes del
virus de la vacuna que expresaban o bien los productos del gen
VIH-env, o los productos del gen
VIH-gag, o el producto del gen lac (testigo de
citotoxicidad no específica). Un indicio de la actividad CTL
específica para el VIH se midió de esta manera.
Se realizaron ensayos linfoproliferativos para
determinar si las preparaciones de env (gp160, gp120) o gag (p24)
recombinantes purificadas eran capaces de estimular la
blastogénesis. No se midió ninguna proliferación tras la inoculación
primaria y sólo 1 de los 3 animales mostró una respuesta
linfoproliferativa tras la administración de la primera dosis de
refuerzo con virus Ad4 recombinantes. Los 3 animales respondieron
con respuestas proliferativas tras la segunda dosis de refuerzo
(Ad5-env) y la tercera dosis de refuerzo
(preparaciones con subunidades).
Pauta de tratamiento
2
Tres chimpancés (2 machos y 1 hembra) que habían
sido previamente inoculados con virus Ad-VIH
recombinantes en cápsulas con recubrimiento entérico y que habían
recibido dosis de refuerzo con subunidades gag y/o env procedentes
de adenovirus (pauta de tratamiento 1) se infectaron por vía
intranasal con virus Ad7-VIH (semana 46), y 12
semanas después (semana 58) con virus Ad4-VIH. Los
adenovirus recombinantes se administraron en medio de cultivo de
tejidos diluido con solución salina tamponada con fosfato, gota a
gota, en las fosas nasales de los chimpancés, con anestesia. Dos
chimpancés (números 1 y 2) recibieron ambos virus recombinantes env
y gag, mientras que el tercer chimpancé (número 3) recibió sólo
virus recombinantes env.
Se recogieron muestras de sangre entera, suero y
heces a diferentes tiempos durante el transcurso del experimento y
se prepararon como se describe en la Pauta 1. La detección de
adenovirus en las muestras de heces o en exudados nasales, los
procedimientos de análisis de neutralización de adenovirus y la
detección de anticuerpos contra el VIH se realizaron según los
procedimientos descritos en la Pauta 1.
La primera dosis intranasal de refuerzo con virus
Ad7 recombinantes se administró en una dosis de 1x10^{8} ufp/
chimpancé. En el momento de la administración del virus, los
chimpancés 3, 1 y 2 tenían títulos séricos de anticuerpos
neutralizantes anti-Ad7 de < 4, 8 y 64,
respectivamente, derivados de inmunizaciones orales previas. Se
examinaron exudados nasales y muestras de heces para determinar la
presencia de virus recombinantes liberados, por medio de una
técnica de hibridación en placas. Se detectó el virus
Ad7-env recombinante en los exudados nasales hasta
un máximo de 7 días tras la inoculación en dos de los animales. Se
comprobó que los virus Ad7-env y
Ad7-gag recombinantes estaban presentes en muestras
de heces de 5 a 12 días tras la inoculación. Hubo correlación entre
el título sérico de Ad7 y la capacidad de detectar virus
recombinantes en los exudados nasales y en las muestras de heces.
Dos animales presentaron una respuesta marginal con anticuerpos
anti-VIH, que se vio considerablemente aumentada por
las dosis intranasales de refuerzo. El tercer animal experimentó
una menor respuesta. Entonces pudieron detectarse en los tres
animales anticuerpos neutralizantes, de bajo título, dirigidos
contra el VIH. Se detectaron anticuerpos secretores en exudados
nasales que contenían anticuerpos de unión anti-gag
y/o env. No se observaron signos o síntomas de enfermedad
respiratoria en estos animales como resultado de la administración
intranasal de los virus Ad7 recombinantes.
Tres meses después, se inmunizaron los chimpancés
con virus Ad4 recombinantes a una dosis única de 1x10^{8}
ufp/chimpancé/virus. Estos animales tuvieron títulos séricos de
anticuerpos neutralizantes anti-Ad4 entre 128 y 256,
debido a la inmunización oral previa en el momento de la prueba de
provocación intranasal. A los 3 días después de la infección, 2 de
los animales (2 y 3) tuvieron un ligero catarro. El tercer animal
(número 1) murió el día 5 de una neumonía bacteriana (se aisló
Streptococcus pneumoniae). Los otros dos animales
presentaron ruidos respiratorios ásperos durante la auscultación y
se aisló S. pneumoniae a partir de ambos chimpancés. Se iniciaron
tratamientos con antibióticos y ambos chimpancés se
recuperaron.
Durante el examen retrospectivo de esta situación
se realizaron varias observaciones. En el momento de la
administración intranasal, el chimpancé número 1 ya tenía fiebre y
un hemograma anómalo. Hubo un número desproporcionado de células
polimorfonucleares presentes y un nivel del 5% de células en cayado
(células polimorfonucleares inmaduras); en conjunto, esta
información indica que tuvo lugar una infección bacteriana
significativa antes de la inoculación con el virus. Las muestras de
autopsia del pulmón, hígado, bazo y suero fueron todas negativas en
lo referente a la presencia de adenovirus infecciosos, según reveló
el cultivo de tejidos utilizando 3 pasadas en ciego en monocapas de
células A549 susceptibles. Se obtuvieron resultados similares por
técnicas de hibridación en placas. Las muestras del pulmón y del
hígado incluidas en parafina resultaron negativas en lo referente a
la presencia de antígenos de adenovirus, utilizando un kit comercial
de inmunofluorescencia para antígenos de adenovirus. Se observaron
cuerpos de inclusión en secciones de pulmón teñidas con H&E.
Hubo un desacuerdo entre los expertos acerca de si estas
inclusiones fueron causadas, o no, por adenovirus. Varias semanas
después, otro chimpancé tuvo un desenlace similar en el mismo
centro de primates y murió. Aunque es probable que la
administración de adenovirus recombinantes haya tenido sólo un papel
mínimo, si alguno, en provocar la muerte del chimpancé número 1, se
consideró prudente administrar antibióticos de forma profiláctica
antes y después de cualquier otra administración intranasal de
adenovirus recombinantes a los chimpancés.
La siguiente tabla muestra los resultados
obtenidos utilizando la pauta de tratamiento 1 y los virus Ad7
recombinantes en la Pauta 2.
Resultados obtenidos utilizando las pautas de
tratamiento 1 y
2
| Títulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Título máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (días) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 1 | Pauta 1 | |||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag-1 | 2,2 | 128 | - | 20 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad4-env, Ad4-gag-1 | 2,2 | 8 | - | 20 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad5-env | 7+ | 128 | 100 | - | <10 | |
| \hskip0.3cm subunidad: env + gag | 100 | 1000 | <10 | |||
| Pauta 2 | ||||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag | 12 | 512 | 10000 | 10000 | 10 | |
| 2 | Pauta 1 | |||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag-1 | 3,2 | 64 | - | 20 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad4-env, Ad4-gag-1 | 1,7 | 128 | 20 | 100 | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad5-env | 7+ | 64 | 10000 | - | 20 | |
| \hskip0.3cm subunidad: env + gag | 1000 | 10000 | 10 | |||
| Pauta 2 | ||||||
| \hskip0.3cm Ad7-env, Ad7-gag | 9 | 8192 | 1000 | 10000 | 20 |
(Continuación)
| Títulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Título máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (días) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 3 | Pauta 1 | |||||
| \hskip0.3cm Ad7-env | 2 | 6 | 20 | N/A* | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad4-env | 1 | 128 | 20 | N/A | <10 | |
| \hskip0.3cm Ad5-env | 7+ | 512 | 1000 | N/A | <10 | |
| \hskip0.3cm subunidad: env | 100 | N/A | <10 | |||
| Pauta 2 | ||||||
| \hskip0.3cm Ad7-env | 7 | 256 | 10000 | N/A | 10 | |
| *N/A= No aplicable |
Pauta de tratamiento
3
Tres chimpancés (2 machos y 1 hembra) que
resultaron negativos en el escrutinio referente a la presencia de
anticuerpos neutralizantes contra los adenovirus humanos de tipo 4,
5 y 7 se evaluaron utilizando la pauta de tratamiento 3. Dos
chimpancés (números 4 y 5) recibieron ambos virus recombinantes env
y gag, mientras que el tercer chimpancé (número 6) recibió sólo
virus recombinantes env. Se administraron antibióticos a los
chimpancés de forma profiláctica y no se observaron trastornos
respiratorios.
Se recogieron muestras de sangre entera, suero y
heces a diferentes tiempos durante el transcurso del experimento y
se prepararon como se describe en la Pauta 1. La detección de
adenovirus en muestras de heces o exudados nasales, los ensayos de
neutralización adenovirus y de detección de anticuerpos contra el
VIH se realizaron según los procedimientos descritos en la Pauta
1.
Los virus recombinantes se liberaron en las heces
durante 22 a 34 días después de la infección. No se detectaron virus
recombinantes en las secreciones nasales examinadas 2 semanas
después de la infección. La seroconversión al serotipo de vectores
de adenovirus utilizado se determinó por ensayos de neutralización.
Se midieron excelentes títulos séricos de anticuerpos
anti-adenovirus en los 3 chimpancés, dirigidos
contra los serotipos Ad7 utilizados en cada uno de los chimpancés.
La seroconversión a los productos genéticos del VIH recombinante se
determinó por inmunotransferencia. Cuatro semanas después de la
inmunización primaria con los virus Ad7 recombinantes, pudieron
medirse respuestas anti-env y
anti-gag en 2 de los 3 chimpancés. A las 20 semanas
después de la infección, los 3 animales presentaron niveles
medibles de anticuerpos contra antígenos del VIH. No se encontraron
anticuerpos secretores en los exudados nasales examinados durante
las 4 primeras semanas después de la inmunización primaria. Ninguno
de los 3 chimpancés desarrolló respuestas detectables con
anticuerpos neutralizantes anti-VIH.
Los virus Ad4 recombinantes se liberaron en las
heces durante 14-28 días después de la infección. El
examen de los exudados nasales demostró que los virus Ad4
recombinantes podían detectarse en los 3 chimpancés durante por lo
menos 7 días después de la infección. Se desarrollaron respuestas
significativas anti-Ad4 contra el serotipo Ad4 tras
la administración intranasal. La magnitud fue ligeramente inferior a
la medida contra los virus Ad7 recombinantes. Se midieron
excelentes respuestas a la dosis de refuerzo contra los antígenos
gag y/o env en los tres animales. Se midieron respuestas con un
bajo título (1:2) de anticuerpos anti-gag y/o
anti-env en los exudados nasales de los chimpancés
4 y 5. Tampoco se midieron anticuerpos neutralizantes
anti-VIH en ninguno de los animales.
Los virus Ad5 recombinantes se liberaron en las
heces durante 8 días después de la infección. No se detectaron virus
recombinantes en los exudados nasales a las 0, 1 ó 2 semanas
después de la infección. Se midieron anticuerpos secretores IgG e
IgA en los exudados nasales de los 3 animales. Se detectaron
anticuerpos secretores en la saliva de los 3 animales y en los
exudados vaginales del único chimpancé hembra. Se detectaron
anticuerpos neutralizantes anti-VIH específicos de
tipo en los tres chimpancés.
Tablas resumen: La siguiente tabla muestra
los resultados obtenidos utilizando la pauta de tratamiento 3.
Resultados obtenidos utilizando la pauta de
tratamiento
3
| Titulos máximos | ||||||
| Liberación | de anti-VIH en | |||||
| del virus | Titulo máximo | inmunotrans- | Titulo máximo | |||
| Chimpancé | Virus | recombinante | de anti-Adeno | ferencia | de anti-VIH | |
| n^{o} | recombinante | Heces (dias) | neutralizantes | env | gag | neutralizantes |
| 4 | Ad7-env, Ad7-gag | 22,22 | 1024 | 100 | 1000 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag | 14,14 | 128 | 10000 | 10000 | <10 | |
| Ad5-env, Ad5-gag | 8,8 | 32 | 10000 | 10000 | 20 | |
| subunidad: env | N/A* | N/A | >10000 | 10000 | 640 | |
| 5 | Ad7-env, Ad7-gag | 34,27 | 1024 | 100 | 10000 | <10 |
| Ad4-env, Ad4-gag | 14,14 | 512 | 10000 | 10000 | <10 | |
| Ad5-env, Ad5-gag | 8,8 | 32 | 10000 | 10000 | 20 | |
| subunidad: env | N/A | N/A | 1000 | 10000 | 320 | |
| 6 | Ad7-env | 34 | 1024 | 100 | N/A | <10 |
| Ad4-env | 28 | 512 | 10000 | N/A | <10 | |
| Ad5-env | 8 | 32 | 10000 | N/A | 40 | |
| subunidad: env | N/A | N/A | >10000 | N/A | 320 | |
| *N/A= No aplicable |
La siguiente tabla resume las respuestas
anti-VIH detectadas en secreciones de chimpancés
tras la inmunización intranasal de refuerzo con los virus
Ad5-VIH recombinantes.
Respuestas con anticuerpos
anti-VIH detectadas en
secreciones
| Secreción analizada | ||||||||
| Semanas | ||||||||
| Chimpancé | Antígeno | tras el | Nasal | Saliva | Vaginal | |||
| número | reconocido | refuerzo** | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG |
| 4 | env | 0 | -* | 360 | - | - | - | - |
| 1 | 180 | 360 | - | - | - | 90 | ||
| 2 | 180 | 2880 | 20 | 20 | - | 90 | ||
| 4 | 720 | 1440 | - | 20 | - | 360 | ||
| gag | 0 | - | 180 | - | - | - | - | |
| 1 | 360 | 360 | - | 20 | - | 90 | ||
| 2 | 720 | 2880 | - | 20 | - | 90 | ||
| 4 | 720 | 720 | - | 20 | - | 90 | ||
| 5 | env | 0 | - | - | - | - | N/A^{+} | N/A |
| 1 | - | 90 | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | - | 2880 | - | - | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A |
(Continuación)
| Secreción analizada | ||||||||
| Semanas | ||||||||
| Chimpancé | Antígeno | tras el | Nasal | Saliva | Vaginal | |||
| número | reconocido | refuerzo** | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG |
| gag | 0 | - | - | - | - | N/A | N/A | |
| 1 | - | 90 | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | 90 | 1440 | - | - | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A | ||
| 6 | env | 0 | - | - | - | - | N/A | N/A |
| 1 | - | - | - | - | N/A | N/A | ||
| 2 | - | 1440 | 20 | 20 | N/A | N/A | ||
| 4 | - | 360 | - | - | N/A | N/A | ||
| * - equivale a menos de 90 para los exudados nasales y vaginales, y menos de 20 para las muestras | ||||||||
| salivales. | ||||||||
| ^{+} N/A = no aplicable |
El adenovirus recombinante vivo que se va a
utilizar según la invención para la producción de vacunas puede
construirse insertando en un adenovirus un gen que codifica un
antígeno que corresponde a un anticuerpo contra un organismo
infeccioso en animales de sangre caliente o que induce la inmunidad
celular contra un organismo infeccioso en animales de sangre
caliente. La inserción puede realizarse según se describe en P.K.
Chanda et al., Virology, 175, 535-547
(1990); véase en particular la página 539.
El adenovirus recombinante vivo que se va a
utilizar según la invención puede purificarse en placas. Pueden
aumentarse las cantidades del virus para la producción de vacunas
por replicación en un hospedador adecuado. La replicación puede
realizarse en cultivo celular. Las células del cultivo celular son
preferiblemente células BK (de riñón bovino) o células de carcinoma
humano, particularmente células de carcinoma cervical humano, por
ejemplo, la línea celular HeLa, o células de carcinoma de pulmón
humano, por ejemplo, la línea celular A549. El virus puede
almacenase a -70ºC en un medio tal como DMEM con suero de ternero
fetal al 5%.
Para la administración intranasal, la vacuna
puede comprender el virus con un estabilizante, por ejemplo, SPGA
(sacarosa, fosfato, glutarato y albúmina) y, cuando convenga, uno o
más azúcares.
La invención se utiliza preferiblemente para el
tratamiento de mamíferos del orden de los Primates (incluido el
hombre).
Claims (12)
1. Utilización de un adenovirus recombinante para
preparar un medicamento para su utilización en el tratamiento para
producir anticuerpos o inmunidad celular contra el virus de la
inmunodeficiencia humana de tipo 1, en el que la proteína
estructural del virión permanece invariable respecto a la del
adenovirus nativo a partir del cual se ha producido el adenovirus
recombinante, y que contiene el gen que codifica el antígeno
correspondiente a dichos anticuerpos o que induce dicha inmunidad
celular, en el que el adenovirus recombinante se selecciona a partir
de uno o más del grupo formado por:
Ad7-tplenv-tplHrev,
Ad7-tplgag-tplHrev,
Ad7-rev-gag,
Ad4-tplenv-tplHrev,
Ad4-tplgag-tplHrev,
Ad4-rev-gag,
Ad5-tplenv-tplHrev y
Ad5-tplgag-tplHrev, estando
destinado el medicamento para su administración intranasal a un
mamífero del orden de los Primates, incluido el hombre.
2. Utilización según la reivindicación 1, que
comprende además la utilización de una o más de una proteína
subunitaria del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 para
preparar un medicamento para su administración en dicho método para
producir anticuerpos o inmunidad celular.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que la subunidad es env o gag.
4. Utilización según las reivindicaciones 2 ó 3,
en la que se administran una o más dosis del adenovirus
recombinante vivo, con la administración subsiguiente de una o más
dosis de una proteína que es una subunidad del virus de la
inmunodeficiencia humana de tipo 1.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en la que la proteína que es una subunidad
del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 es env.
6. Adenovirus recombinante vivo que es
X-tplY-tplHrev; en el que X es Ad4,
Ad5 o Ad7, e Y es env o gag.
7. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad4-tplenv-tplHrev.
8. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad5-tplenv-tplHrev.
9. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad7-tplenv-tplHrev.
10. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad4-tplgag-tplHrev.
11. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad5-tplgag-tplHrev.
12. Adenovirus recombinante según la
reivindicación 6, que es el
Ad7-tplgag-tplHrev.
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