ES2201060T3 - Virus del herpes equino recombinante. - Google Patents

Virus del herpes equino recombinante.

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ES2201060T3 ES93919918T ES93919918T ES2201060T3 ES 2201060 T3 ES2201060 T3 ES 2201060T3 ES 93919918 T ES93919918 T ES 93919918T ES 93919918 T ES93919918 T ES 93919918T ES 2201060 T3 ES2201060 T3 ES 2201060T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN VIRUS DEL HERPES EQUINO RECOMBINANTE, QUE NO SE PRODUCE DE FORMA NATURAL. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN VIRUS DEL HERPES EQUINO RECOMBINANTE CAPAZ DE REPLICARSE QUE COMPRENDE DNA VIRAL DE ESPECIES DEL VIRUS DEL HERPES EQUINO Y DNA AJENO, EL DNA AJENO SE INSERTA EN EL DNA VIRAL DEL HERPES EQUINO EN UNA ZONA QUE NO SEA ESENCIAL PARA LA REPLICACION DEL VIRUS DEL HERPES EQUINO. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE AL DNA QUE CODIFICA LA PROTEINA US2 DE UN VIRUS DEL HERPES EQUINO. LA INVENCION SE REFIERE A LOS VECTORES DE HOMOLOGIA PARA PRODUCIR VIRUS DEL HERPES EQUINO RECOMBINANTES QUE PRODUCEN VIRUS DEL HERPES EQUINO RECOMBINANTES INSERTANDO DNA AJENO EN EL DNA VIRAL DEL HERPES EQUINO. LA INVENCION ADEMAS SE REFIERE A UN METODO PARA PRODUCIR UN VIRUS DEL HERPES EQUINO RECOMBINANTE VIVO, Y SEGURO PARA EL FETO.

Description

Virus del herpes equino recombinante.
En esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones mediante números arábigos entre paréntesis. Las citaciones completas de estas referencias pueden encontrarse al final de la memoria descriptiva, inmediatamente antes de las reivindicaciones. Las descripciones de estas publicaciones describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.
La presente invención implica virus del herpes equino recombinantes vivos que comprenden el DNA genómico del virus del herpes equino 1 (EHV-1) ó 4 (EHV-4) del cual se ha suprimido una secuencia de DNA del gen US2, que se muestra para el EHV-1 en la SEC ID Nº 1 y para el EHV-4 en la SEC ID Nº 3, inactivando dicho gen US2. Son útiles para la preparación de vacunas para proteger a los caballos de varias especies de virus del herpes equino infecciosos existentes en la naturaleza. El virus del herpes equino es un miembro de la familia herpesviridiae, que se conocen comúnmente como virus del herpes.
Generalmente, los virus del herpes contienen de 100000 a 200000 pares de bases de DNA como material genético, y se han identificado varias áreas de los genomas de varios miembros que no son esenciales para la replicación del virus in vitro en cultivo celular. Se sabe que las modificaciones de estas regiones del DNA disminuyen la patogenicidad del virus, esto es, atenúan el virus cuando éste infecta una especie animal. Por ejemplo, la inactivación del gen de la timidina quinasa del virus simple del herpes humano (29) o del virus de la pseudorrabia en cerdos (38) hace que estos virus sean menos patogénicos.
La eliminación de regiones específicas de la región de repetición del virus simple del herpes humano ha mostrado que hace al virus menos patogénico (32, 39). Además, en el virus de la enfermedad de Marek se ha identificado una región de repetición que está asociada con la oncogenicidad viral (13). Una región en el virus del herpes saimiri se ha correlacionado de manera similar con la oncogenicidad (21). La eliminación de una región específica de la región de repetición hace que el virus de la pseudorrabia sea menos patogénico (Patente de los EE.UU. Nº 4877737). Se ha mostrado la deleción de una región del virus de la pseudorrabia en cepas que actúan como vacunas existentes en la naturaleza (22). Estas deleciones son, al menos en parte, responsables de la falta de patogenicidad de estas cepas.
Se está generalmente de acuerdo en que los virus del herpes contienen regiones de DNA no esenciales en varias partes del genoma, y que la modificación de estas regiones puede atenuar el virus, conduciendo a una cepa no patogénica a partir de la cual puede derivar una vacuna. Se ha descrito una vacuna del EHV-4 atenuado con una deleción y/o una inserción en el gen de la timidina quinasa (53). El grado de atenuación del virus es importante para la utilidad del virus como vacuna. Las deleciones que causen demasiada atenuación del virus darán como resultado una vacuna que no surtirá efecto en la manifestación de una respuesta inmune adecuada. Aunque se conocen varios ejemplos de deleciones atenuantes, la combinación apropiada de deleciones para cualquier virus del herpes no resulta fácilmente evidente.
Las principales pérdidas económicas en la industria equina son resultado de la infección por dos especies del virus del herpes equino (17). Estas dos especies de virus del herpes equino, actualmente identificadas en la bibliografía como EHV-1 y EHV-4, pertenecen a la subfamilia de alfa-virus del herpes de los virus del herpes, y se caracterizan por su genoma de clase D (33). Al principio, ambas especies se identificaron como EHV-1 y a continuación se diferenciaron como EHV-1 subtipo 1 (EHV-1) y EHV-1 subtipo 2 (EHV-4), respectivamente. El EHV-1 es la causa principal de aborto en yeguas preñadas y el EHV-4 es la causa principal de enfermedad respiratoria en potros y "yearlings". Los productos disponibles actualmente no están diseñados para abordar ambos síndromes, con el resultado de que estos productos son marginalmente eficaces.
El EHV-1 y el EHV-4 se han analizado a nivel molecular. Se han publicado mapas de restricción de los genomas del EHV-1 y el EHV-4 (42 y 8).
Aunque varios de los virus del herpes se han modificado por ingeniería genética, no se han publicado ejemplos de EHV recombinante.
El EHV puede volverse latente en animales sanos, lo que los hace portadores potenciales del virus. Por esta razón, resulta claramente ventajoso ser capaz de distinguir los animales vacunados con virus no virulentos de los animales infectados con virus salvajes o existentes en la naturaleza causantes de enfermedades. El desarrollo de vacunas diferenciales y su acompañamiento con ensayos diagnósticos ha probado ser válido en el manejo de la enfermedad de la pseudorrabia (Registro Federal, Vol. 55, Nº 90, pp. 19245-19253). Una vacuna marcadora diferencial similar sería de gran valor en el manejo de la enfermedad causada por el EHV.
La presente invención proporciona un método para producir un virus EHV recombinante vivo, seguro para el feto, que comprende tratar el DNA viral de un EHV vivo existente en la naturaleza de tal forma que se suprima de dicho DNA viral, DNA correspondiente al gen US2 del EHV existente en la naturaleza. La presente invención proporciona también virus en los que (a) se ha suprimido DNA correspondiente al gen US2, y (b) se ha alterado o suprimido DNA que codifica gpG, gpE, y/o TK. Tales virus son útiles para la creación de vacunas que requieran marcadores diagnósticos y seguridad en animales preñados.
La capacidad de modificar por ingeniería genética el DNA de virus con grandes genomas, tales como el virus de la viruela vacuna y los virus del herpes, ha llevado a la conclusión de que estos virus recombinantes pueden utilizarse como vectores para suministrar antígenos de vacunas y agentes terapéuticos en animales. Los virus del herpes son candidatos atractivos para su desarrollo como vectores porque su gama de hospedantes está limitada principalmente a una única especie diana (16) y tienen la capacidad de establecer infección latente (7) que podría proporcionar una expresión in vivo estable de un gen ajeno. Aunque se han modificado por ingeniería genética varias especies de virus del herpes para expresar productos génicos ajenos, no se han construido virus del herpes equino recombinantes que expresen productos génicos ajenos. Los virus del herpes equino descritos arriba pueden utilizarse como vectores para el suministro de antígenos de vacunas de microorganismos causantes de enfermedades equinas importantes. Tales virus recombinantes multivalentes podrían proteger del EHV así como de otras enfermedades. De modo similar, los virus del herpes equino pueden utilizarse como vectores para el suministro de agentes terapéuticos. El agente terapéutico que se suministra mediante un vector viral de la presente invención debe ser una molécula biológica que sea un subproducto de la replicación del virus del herpes equino. Esto limita el agente terapéutico en un primer análisis bien a DNA, RNA o proteína. Existen ejemplos de agentes terapéuticos de cada una de estas clases, de compuestos en forma de DNA antisentido, RNA antisentido (19), ribozimas (41), tRNAs supresores (3), RNA de cadena doble inductor de interferones y numerosos ejemplos de agentes terapéuticos proteicos, desde hormonas, por ejemplo, insulina, a linfoquinas, por ejemplo, interferones e interleuquinas, a opiatos naturales. El descubrimiento de estos agentes terapéuticos y la elucidación de su estructura y función no hace posible necesariamente, sin embargo, su utilización en un sistema de suministro mediante un vector viral, debido a la experimentación necesaria para determinar si existe un sitio de inserción apropiado.
La invención proporciona un virus del herpes equino recombinante vivo que comprende el DNA genómico del virus del herpes equino 1 (EHV-1) ó 4 (EHV-4) del que se ha suprimido una secuencia de DNA del gen US2, que se muestra para el EHV-1 en la SEC ID Nº 1 y para el EHV-4 en la SEC ID Nº 3, inactivando dicho gen US2. La invención describe el DNA aislado que codifica la proteína US2 de un virus del herpes equino.
La invención proporciona un virus del herpes equino recombinante como se define arriba capaz de replicarse, que contiene además una secuencia de DNA insertada en él. Este virus del herpes comprende DNA viral de las especies del virus del herpes equino 1 ó 4 existentes en la naturaleza con las deleciones indicadas arriba, y DNA ajeno que codifica RNA no existente en la naturaleza en un animal en el cual se introduce el virus del herpes equino recombinante, insertándose el DNA ajeno en el DNA del virus del herpes equino recombinante en un sitio que no es esencial para la replicación del virus del herpes equino.
La invención describe un vector de homología para producir el virus del herpes equino recombinante de la presente invención mediante la inserción de DNA ajeno en el genoma de un virus del herpes equino, que comprende una molécula de DNA de cadena doble que consiste esencialmente en: a) una secuencia de DNA ajeno de cadena doble que codifica RNA no existente en la naturaleza en un animal en el cual se introduce el virus del herpes equino recombinante; b) en un extremo de la secuencia de DNA ajeno, DNA del virus del herpes equino de cadena doble homólogo al DNA genómico situado en uno de los lados de un sitio del genoma que no es esencial para la replicación del virus del herpes equino; y c) en el otro extremo del DNA ajeno, DNA del virus del herpes equino de cadena doble homólogo al DNA genómico situado en el otro lado del mismo sitio del genoma.
La invención expone un método para producir el virus del herpes equino recombinante vivo, seguro para el feto, de la presente invención, que comprende tratar el DNA viral de un virus del herpes equino vivo existente en la naturaleza de tal forma que se suprima del virus DNA de la región US2 del virus del herpes equino existente en la naturaleza.
Figura 1 Detalles de la Cepa Dutta del EHV1. Diagrama del DNA genómico del EHV1 mostrando las regiones única larga, de repetición interna, única corta, y de repetición terminal. Se indica un mapa de restricción para la enzima BamHI (42). Los fragmentos se nombran con letras en orden decreciente del tamaño. La región única corta y la región timidina quinasa están ampliadas mostrando las situaciones de los fragmentos BglII b, EcoRI d, k y c. Se indica la situación de varios genes, éstos son timidina quinasa (Tk), único corto 2 (US2), glicoproteínas G (gpG), D (gpD), I (gpI) y E (gpE) (1).
Figura 2 Detalles de la Cepa Dutta del EHV4. Diagrama del DNA genómico del EHV4 mostrando las regiones única larga, de repetición interna, única corta, y de repetición terminal. Se indican los mapas de restricción para las enzimas EcoRI, PacI y PmeI. Los fragmentos se nombran con letras en orden decreciente del tamaño. La región única corta y la región timidina quinasa están ampliadas mostrando las situaciones de los fragmentos BamHI c, d. Se indica también la situación de dos genes, éstos son timidina quinasa (Tk) (27, 28) y único corto 2 (US2).
Figura 3 Homología entre las proteínas US2 de los virus del herpes equino y las proteínas US2 del HSV-1, PRV, HSV-2, y MDV. (a) Representación tipo matriz de la secuencia de aminoácidos de la proteína US2 del EHV-4 (324 aminoácidos) (SEC ID Nº 4) frente a la secuencia de aminoácidos de la proteína US2 del HSV-1 (291 aminoácidos) (24). (b) Alineamiento de la región conservada (SEC ID Nº 7) entre la proteína US2 del EHV-1 (303 aminoácidos) (SEC ID Nº 2), la proteína US2 del EHV-4 (SEC ID Nº 8), la proteína US2 del HSV-1 (SEC ID Nº 9), la proteína US2 del PRV (SEC ID Nº 11) (256 aminoácidos) (49), la proteína US2 del HSV-2 (SEC ID Nº 10) (291 aminoácidos) (25), la proteína US2 del MDV (SEC ID Nº 12) (270 aminoácidos) (4), y US2 de IBR (SEC ID Nº 13).
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Figura 4 Descripción detallada de la inserción de DNA en el Vector de Homología 450-46.B4. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 450-46.B4. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 14), el empalme B (SEC ID Nº 15), y el empalme C (SEC ID Nº 17). Se describen para cada empalme los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento así como las secuencias de enlace sintéticas que se utilizaron para unir los fragmentos. Las secuencias de enlace sintéticas están subrayadas por una línea doble. Se proporciona también la situación de varias regiones codificantes de genes y elementos de regulación. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus del herpes equino 1 (EHV1), timidina quinasa (TK), glicoproteína H (gpH), y señal de poliadenilación (pA).
Figura 5 Descripción detallada de la inserción de DNA en el Vector de Homología 467-21.19. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 467-21.19. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 19), el empalme B (SEC ID Nº 20), y el empalme C (SEC ID Nº 23). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen US2. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus del herpes equino 1 (EHV1) y única corta 2 (US2).
Figura 6 Descripción detallada de la inserción de DNA en el Vector de Homología 536-85.30. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 536-85.30. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 24), el empalme B (SEC ID Nº 25), y el empalme C (SEC ID Nº 26). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de las regiones codificantes del gen gpD, MGP, y US3. Los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus del herpes equino 1 (EHV1), glicoproteína de membrana (MGP), único corto 3 (US3) y glicoproteína D (gpD).
Figura 7 Descripción detallada de la inserción de DNA en el Vector de Homología 495-61.39. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 495-61.39. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 27), el empalme B (SEC ID Nº 28), y el empalme C (SEC ID Nº 31). Se describen para cada empalme los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento así como las secuencias de enlace sintéticas que se utilizaron para unir los fragmentos. Las secuencias de enlace sintéticas están subrayadas por una línea doble. Se proporciona también la situación de las regiones que codifican los genes TK y gpH. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus del herpes equino 4 (EHV4) y glicoproteína H (gpH).
Figura 8 Descripción detallada de la inserción de DNA en el Vector de Homología 523-38.9. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 523-38.9. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 33), el empalme B (SEC ID Nº 34), y el empalme C (SEC ID Nº 36). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen US2. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus del herpes equino 4 (EHV4) y único corto 2 (US2).
Figura 9 Descripción detallada de la inserción de DNA en el Vector de Homología 580-57.25. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido 580-57.25. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 37), el empalme B (SEC ID Nº 38), y el empalme C (SEC ID Nº 39). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen US9. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus del herpes equino 4 (EHV4) y único corto 9 (US9).
Figura 10 Descripción detallada de la inserción del gen marcador en el Vector de Homología 467-22.A12. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el gen marcador. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 40), el empalme B (SEC ID Nº 41), el empalme C (SEC ID Nº 43) y el empalme D (SEC ID Nº 43). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen lacZ. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus de la pseudorrabia (PRV), gen Z del operón lactosa (lacZ), Escherichia coli (E. coli), señal de poliadenilación (pA), y glicoproteína X (gpX).
Figura 11 Descripción detallada de la inserción del gen marcador en el Vector de Homología 523-42.A18. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el gen marcador. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 46), el empalme B (SEC ID Nº 47), el empalme C (SEC ID Nº 49) y el empalme D (SEC ID Nº 51). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen lacZ. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus de la pseudorrabia (PRV), gen Z del operón lactosa (lacZ), Escherichia coli (E. coli), señal de poliadenilación (pA), y glicoproteína X (gpX).
Figura 12 Descripción detallada de la inserción del gen marcador en el Vector de Homología 552-45.19. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el gen marcador. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 52), el empalme B (SEC ID Nº 53), el empalme C (SEC ID Nº 55) y el empalme D (SEC ID Nº 57). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen uidA. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus de la pseudorrabia (PRV), gen A de la uronidasa (uidA), Escherichia coli (E. coli), virus simple del herpes tipo 1 (HSV-1), señal de poliadenilación (pA), y glicoproteína X (gpX).
Figura 13 Descripción detallada de la inserción del gen marcador en el Vector de Homología 593-31.2. El diagrama muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el gen marcador. El origen de cada fragmento se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se muestran las secuencias situadas en los empalmes entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador, incluyendo el empalme A (SEC ID Nº 58), el empalme B (SEC ID Nº 59), el empalme C (SEC ID Nº 61) y el empalme D (SEC ID Nº 63). Los sitios de restricción utilizados para generar cada fragmento se indican en el empalme correspondiente. Se proporciona también la situación de la región que codifica el gen lacZ. Se utilizan los siguientes dos convencionalismos: los números entre paréntesis () se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [] indican los restos de sitios que se destruyeron durante la construcción. Se utilizan las siguientes abreviaturas: virus de la pseudorrabia (PRV), gen Z del operón lactosa (lacZ), Escherichia coli (E. coli), señal de poliadenilación (pA), y glicoproteína X (gpX).
La presente invención proporciona un virus del herpes equino recombinante no existente en la naturaleza. Así, este virus del herpes equino recombinante es de las especies EHV-1 y EHV-4. Más específicamente, la presente invención proporciona un virus del herpes equino recombinante vivo que comprende el DNA genómico del virus del herpes equino 1 (EHV-1) ó 4 (EHV-4) del cual se ha suprimido una secuencia de DNA del gen US2, que se muestra para el EHV-1 en la SEC ID Nº 1 y para el EHV-4 en la SEC ID Nº 3, inactivando dicho gen US2.
Para los propósitos de esta invención, el término "virus del herpes equino" incluye las especies EHV-1 y EHV-4, aunque también podrían ser utilizables otras especies. A estas especies se hizo referencia previamente en la bibliografía como EHV-1, subtipo 1 y EHV-1 subtipo 2, respectivamente.
La invención proporciona así un virus del herpes equino recombinante en el que una secuencia de DNA que no es esencial para la replicación del virus se ha suprimido del DNA genómico del virus.
Para los propósitos de esta invención, "una secuencia de DNA que no es esencial para la replicación del virus" es una secuencia situada en el genoma donde no cumple una función necesaria para la replicación viral. Ejemplos de secuencias necesarias incluyen las siguientes: secuencias de unión de proteínas de complejos, secuencias que codifican la transcriptasa inversa o una glicoproteína esencial, secuencias de DNA necesarias para la encapsidación, etc.
En la presente invención, la secuencia suprimida se suprime del gen US2 del virus. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-1EHV-002. El virus S-1EHV-002 se ha depositado el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2358. La presente invención proporciona además virus del herpes equino recombinantes vivos como se describe arriba que comprenden al menos una deleción más de una secuencia de DNA del virus. La secuencia de DNA suprimida se suprime del gen que codifica la glicoproteína gpG, el que codifica la glicoproteína gpE, del gen de la timidina quinasa y/o del gen que codifica la glicoproteína grande de membrana (MGP). La presente invención describe un virus del herpes equino recombinante con una deleción en el gen TK designado S-1EHV-001. El S-1EHV-001 se ha depositado el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2357. Otro virus del herpes equino recombinante con una deleción en el gen TK se designa S-4EHV-001. El S-4EHV-001 se ha depositado el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2361. Sin embargo, debe recalcarse que los dos virus del herpes específicos mencionados arriba no forman parte de la presente invención.
Así, la invención proporciona un virus del herpes equino recombinante con una secuencia de DNA suprimida del gen de la timidina quinasa del virus, además de la secuencia de DNA suprimida del gen US2 del virus. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-1EHV-004. El virus S-1EHV-004 se ha depositado el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2360. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-4EHV-002. El virus S-4EHV-002 se ha depositado el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2362. La presente invención proporciona un ejemplo más de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-4EHV-023. El virus S-4EHV-023 se ha depositado el 5 de agosto de 1993, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR.
La invención proporciona también un virus del herpes equino recombinante con una secuencia de DNA suprimida del gen de la timidina quinasa del virus, además de la secuencia de DNA suprimida del gen US2 del virus, en el que una tercera secuencia que no es esencial para la replicación del virus se suprime del DNA genómico del virus. Una realización de esta invención es un virus del herpes equino recombinante en el que la tercera secuencia de DNA suprimida se suprime del gen gpG del virus. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-1EHV-003. El virus S-1EHV-003 se ha depositado el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2359. Una realización más de esta invención es un virus del herpes equino recombinante en el que la tercera secuencia de DNA suprimida se suprime del gen gpE del virus.
La presente invención describe el DNA aislado que codifica la proteína US2 del virus del herpes equino procesado en la presente.
La presente invención proporciona el virus del herpes equino recombinante descrito arriba capaz de replicarse que comprende DNA viral de una forma mutada de una especie del virus del herpes equino 1 ó 4 existente en la naturaleza y DNA ajeno que codifica RNA no existente en la naturaleza en un animal en el que se introduce el virus del herpes equino recombinante, insertándose el DNA ajeno en el DNA del virus del herpes equino existente en la naturaleza en un sitio que no es esencial para la replicación del virus del herpes equino.
Para los propósitos de esta invención, "un virus del herpes equino recombinante capaz de replicarse" es un virus del herpes equino vivo que se ha generado mediante los métodos de recombinación bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los métodos descritos en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR EHV RECOMBINANTE en Materiales y Métodos, y del que no se ha suprimido material genético esencial para la replicación del virus del herpes equino recombinante.
Para los propósitos de esta invención, "un sitio de inserción que no es esencial para la replicación del virus del herpes equino" es un lugar del genoma en el que una secuencia de DNA no es necesaria para la replicación viral. Ejemplos de secuencias de DNA que son esenciales incluyen las siguientes: secuencias de unión de proteínas de complejos, secuencias que codifican la transcriptasa inversa o una glicoproteína esencial, secuencias de DNA necesarias para la encapsidación, etc.
La invención describe además DNA ajeno que codifica RNA que codifica un polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido es antigénico en un animal en el que se introduce el virus del herpes equino recombinante. En una realización del polipéptido, el polipéptido es un marcador detectable. Preferiblemente, el polipéptido es la \beta-galactosidasa de E. coli. Preferiblemente, el polipéptido es la \beta-glucuronidasa de E. coli. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-4EHV-004.
Para los propósitos de esta invención, este polipéptido antigénico es un polímero linear de más de 10 aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos que estimula al animal para que produzca anticuerpos.
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En una realización del polipéptido, el polipéptido es un polipéptido producido normalmente por un virus del herpes equino, una bacteria Streptococcus equi, un Virus de la Anemia Infecciosa, un virus de la gripe equina o un virus de la encefalitis equina. Preferiblemente, el virus del herpes equino existente en la naturaleza es el EHV-1 y el DNA ajeno procede del EHV-4. Preferiblemente, el virus del herpes equino existente en la naturaleza es el EHV-4 y el DNA ajeno procede del EHV-1. Preferiblemente, el DNA ajeno codifica una glicoproteína gpB, gpC, gpD o gpH.
En una realización de la presente invención, el virus del herpes equino existente en la naturaleza es el EHV-4 y el polipéptido antigénico es del gen gpD o gpB de la especie EHV-1 del virus del herpes equino. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-4EHV-010.
En otra realización de la presente invención, el virus del herpes equino existente en la naturaleza es el EHV-4 y el polipéptido antigénico es del gen de la hemaglutinina o de la neuraminidasa de un subtipo del virus A de la gripe equina. Preferiblemente, el subtipo del serotipo de del virus A de la gripe equina es el A1. Preferiblemente, el subtipo se caracteriza además como un aislado del subtipo A1 del virus A de la gripe equina. Preferiblemente, el aislado es Influenza A/equine/Prague/56. La presente invención proporciona un ejemplo de un virus del herpes equino recombinante de este tipo designado S-4EHV-011.
En otra realización de la presente invención, el subtipo del virus A de la gripe equina es el A2. Preferiblemente, el subtipo se caracteriza además como un aislado del subtipo A2 del virus A de la gripe equina. Preferiblemente, el aislado es Influenza A/equine/Miami/63. Preferiblemente, el aislado es Influenza A/equine/Kentucky/81. Preferiblemente, el aislado es Influenza A/equine/Alaska/91. La presente invención proporciona ejemplos de virus del herpes equino recombinantes de esos tipos designados S-4EHV-012, S-4EHV-013 y S-4EHV-014, respectivamente.
La presente invención describe un vector de homología para producir un virus del herpes equino recombinante de la presente invención mediante la inserción de DNA ajeno en el genoma de un virus del herpes equino, que comprende una molécula de DNA de cadena doble que consiste esencialmente en: a) una secuencia de DNA ajeno de cadena doble que codifica RNA no existente en la naturaleza en un animal en el cual se introduce el virus del herpes equino recombinante; b) en un extremo de la secuencia de DNA ajeno, DNA del virus del herpes equino de cadena doble homólogo al DNA genómico situado en un lado de un sitio del genoma que no es esencial para la replicación del virus del herpes equino; y c) en el otro extremo de la secuencia de DNA ajeno, DNA del virus del herpes equino de cadena doble homólogo al DNA genómico situado en el otro lado del mismo sitio del genoma. En una realización del vector de homología, el virus del herpes equino es el EHV-1.
En otra realización del vector de homología, el virus del herpes equino es el EHV-4. Así, el sitio del genoma que no es esencial para la replicación está presente dentro de una secuencia de DNA incluida dentro del gen US2 y posiblemente además dentro del gen TK, gpG, gpE y/o MGP. En una realización del vector de homología, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del fragmento de restricción BglII b del EHV-1. Preferiblemente, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo a un subfragmento de restricción Sau3A y a un subfragmento de restricción entre BstEII y PstI. En otra realización del vector de homología, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del fragmento de restricción BamHI n del EHV-1. Preferiblemente, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del subfragmento de restricción entre BamHI y NcoI y el subfragmento de restricción entre EcoRI y PstI. En otra realización del vector de homología, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del fragmento de restricción EcoRI k del EHV-1. Preferiblemente, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del subfragmento de restricción entre EcoRI y PvuII y el subfragmento de restricción entre PstI y BamHI. En otra realización del vector de homología, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del fragmento de restricción BamHI c del EHV-4. Preferiblemente, el DNA de cadena doble del virus del herpes equino es homólogo al DNA genómico presente dentro del subfragmento de restricción entre PvuII y FspI y el subfragmento de restricción entre PvuII y SmaI. En otra realización del vector de homología, el DNA de cadena doble del virus del herpes es homólogo al DNA genómico presente dentro del fragmento de restricción BamHI d del EHV-4. Preferiblemente, el DNA de cadena doble del virus del herpes es homólogo al DNA genómico presente dentro del subfragmento de restricción entre XbaI y PstI y el subfragmento de restricción entre PstI y HindIII. En otra realización del vector de homología, el DNA de cadena doble del virus del herpes es homólogo al DNA genómico presente dentro del fragmento de restricción EcoRI j del EHV-4. Preferiblemente, el DNA de cadena doble del virus del herpes es homólogo al DNA genómico presente dentro del subfragmento de restricción entre EcoRI y AatII y el subfragmento de restricción entre FspI y FspI.
La presente invención describe también un vector de homología en el que el DNA ajeno que se inserta corresponde al DNA que codifica el gen gpH, gpB, gpD o gpC de una especie del virus del herpes equino EHV-1. La presente invención describe también un vector de homología en el que el DNA ajeno que se inserta corresponde al DNA que codifica la glicoproteína gpH, gpB, gpD o gpC de una especie del virus del herpes equino EHV-4.
La presente invención describe también una vacuna que comprende una cantidad inmunizante eficaz de un virus del herpes equino recombinante de la presente invención y un vehículo adecuado.
Vehículos adecuados para el virus del herpes equino, que podrían ser apropiados para utilizar con el virus del herpes equino recombinante de la presente invención, son bien conocidos en la técnica, e incluyen proteínas, azúcares, etc. Un ejemplo de un vehículo aceptable de este tipo es un medio de cultivo fisiológicamente equilibrado que contenga uno o más azúcares estabilizantes tales como proteínas hidrolizadas estabilizadas, lactosa, etc.
Para los propósitos de esta invención, una "cantidad inmunizante eficaz" del virus del herpes equino recombinante de la presente invención, es una cantidad necesaria para estimular la producción de anticuerpos por el equino en el que se ha introducido el virus en cantidad suficiente para proteger al equino de una infección si se enfrentara a un virus del herpes equino salvaje u otro virus del herpes equino al que el virus del herpes equino recombinante esté dirigido.
La presente invención describe también un método para inmunizar un equino que comprende la administración de una dosis inmunizante eficaz de la vacuna descrita en la presente invención.
Para los propósitos de esta invención, la vacuna puede administrarse por cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Alternativamente, la vacuna puede administrarse intranasalmente u oralmente.
La presente invención describe también un método de ensayo en un equino para determinar si el equino ha sido vacunado con la vacuna descrita en la presente invención o infectado con un virus del herpes equino existente en la naturaleza, que comprende: (a) obtener del equino a ensayar una muestra de fluido corporal adecuado; (b) detectar en la muestra la presencia de anticuerpos contra el virus del herpes equino, indicando la ausencia de tales anticuerpos que el equino no ha sido vacunado ni infectado; y (c) en el equino en el que están presentes anticuerpos contra el virus del herpes equino, detectar en la muestra la ausencia de anticuerpos contra antígenos del virus del herpes equino que están presentes normalmente en el fluido corporal de un equino infectado por un virus del herpes equino existente en la naturaleza pero que no están presentes en un equino vacunado, indicando la ausencia de tales anticuerpos que el equino fue vacunado y no está infectado. En una realización del método, el antígeno del virus del herpes equino que no está presente en el equino vacunado es la glicoproteína gpE.
La presente invención describe un método para producir el virus del herpes equino recombinante vivo, seguro para el feto, de la presente invención que comprende tratar el DNA viral de un virus del herpes equino vivo existente en la naturaleza, que comprende el DNA genómico del EHV-1 ó -4, de tal forma que se suprima del virus DNA correspondiente a la región US2 del virus del herpes equino existente en la naturaleza.
La presente invención describe también un célula hospedante infectada con el virus del herpes equino recombinante de la presente invención. En una realización, la célula hospedante es una célula de mamífero. Preferiblemente, la célula de mamífero es una célula Vero.
Para los propósitos de esta invención, una "célula hospedante" es una célula utilizada para propagar un vector y su inserto. La infección de las células se llevó a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se expone en el PROCEDIMIENTO DE INFECCIÓN-TRANSFECCIÓN en los Materiales y Métodos.
A continuación se detallan los métodos para construir, seleccionar y purificar los virus del herpes equino recombinantes.
Los siguientes Ejemplos no sólo describen métodos para producir los virus del herpes equino recombinantes de la presente invención con una deleción de secuencias de DNA del gen US2 y posiblemente además del gen TK, gpE, gpG y/o MPG, sino también métodos para producir virus del herpes equino recombinantes con deleciones en genes o combinaciones de genes que no comprende la presente invención, que, sin embargo, satisfacen los propósitos de la presente invención. Estos Ejemplos no están dentro del alcance de la presente invención. Se mantienen por propósitos ilustrativos y como base para entender y realizar la presente invención.
Preparación de muestras de reserva del virus EHV
S-1EHV-000 y S-4EHV-000 son aislados frescos del EHV-1 y EHV-4, respectivamente, y se obtuvieron del Dr. S. K. Dutta (College of Veterinary Medicine, University of Maryland, College Park, MD 20742). Las muestras de reserva del virus EHV se prepararon infectando células Vero a una proporción de infección de 0,01 PFU/célula (PFU: unidades de formación de colonias, del inglés "plaque forming units") en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina (estos componentes se obtuvieron de Irvine Scientific o un proveedor similar, y se denominan en lo sucesivo medio DME completo) con suero bovino fetal al 1%. Una vez completado el efecto citopático, se recogieron el medio y las células y las células se sedimentaron a 3000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga clínica. Las células se resuspendieron en un décimo del volumen original de medio, y se añadió un volumen igual de leche desnatada (leche desnatada en polvo al 9% peso/volumen en H_{2}O). Las muestras de virus se congelaron a -70ºC. Los títulos fueron aproximadamente 10^{8} PFU/ml para el EHV-1 y aproximadamente 10^{7} PFU/ml para el EHV-4.
Preparación de DNA del virus del herpes
Para la preparación de DNA del virus del herpes, se infectó una monocapa confluente de células Vero en un matraz de 25 cm^{3} o una placa petri de 60 mm con 100 \mul de muestra de virus. Después de incubar durante una noche, o cuando las células mostraron un 100% de efecto citopático, las células se rasparon dentro del medio. Las células y el medio se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga clínica. El medio se decantó, y el sedimento de células se resuspendió suavemente en 0,5 ml de una solución que contenía NONIDET P-40™ al 0,5% (condensado de octilfenol y óxido de etileno que contiene una media de 9 moles de óxido de etileno por molécula) (NP-40, adquirido de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.). La muestra se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añadieron 10 \mul de una solución de reserva de RNAsa A (Sigma) (la solución de reserva era 10 mg/ml, hervida durante 10 minutos para inactivar la DNAsa). La muestra se centrifugó para sedimentar los núcleos. El sedimento de DNA se retiró con una pipeta pasteur o un palillo de madera y se desechó. El fluido sobrenadante se decantó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía 25 \mul de dodecilsulfato sódico al 20% (Sigma) y 25 \mul de proteinasa-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim). La muestra se mezcló e incubó a 37ºC durante 30-60 minutos. Se añadió un volumen igual de fenol saturado con agua y la muestra se mezcló brevemente. La muestra se centrifugó en una minifuga Eppendorf durante 5 minutos a máxima velocidad. Se retiró la fase acuosa superior a un nuevo tubo Eppendorf, y se añadieron dos volúmenes de etanol absoluto, y el tubo se puso a -20ºC durante 30 minutos para precipitar el ácido nucleico. La muestra se centrifugó en una minifuga Eppendorf durante 5 minutos. El sobrenadante se decantó, y el sedimento se dejó secar al aire y se rehidrató en \sim16 \mul de H_{2}O. Para la preparación de cantidades mayores de DNA, el procedimiento se escaló para empezar con un frasco sobre rodillos de 850 cm^{3} de células Vero. El DNA se almacenó en Tris 0,01 M pH 7,5, EDTA 1 mM a 4ºC.
Técnicas de biología molecular
Las técnicas para la manipulación de bacterias y DNA, incluyendo aquellos procedimientos como la digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, extracción de DNA de los geles, ligación, fosforilación con quinasa, tratamiento con fosfatasa, crecimiento de cultivos bacterianos, transformación de bacterias con DNA, y otros métodos de biología molecular se describen en Maniatis et al. (1982) y Sambrook et al. (1989). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para introducir sitios de restricción convenientes para la manipulación de varios DNAs. Los procedimientos utilizados se describen en Innis et al. (1990). En general, los fragmentos amplificados fueron menores de 500 pares de bases en tamaño, y las regiones críticas de los fragmentos amplificados se confirmaron mediante secuenciación de DNA. Excepto que se indique, estas técnicas se utilizaron con variaciones mínimas.
Ligación
El DNA se unió por acción de la enzima DNA ligasa de T4 (BRL). Las reacciones de ligación contenían cantidades variables de DNA (de 0,2 a 20 \mug), Tris 20 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mM, ATP 200 \muM y 20 unidades de DNA ligasa de T4 en un volumen final de reacción de 10-20 \mul. La ligación tuvo lugar durante 3-16 horas a 15ºC.
Secuenciación de DNA
La secuenciación se realizó utilizando el USB Sequenase Kit y ^{35}S-dATP (NEN). Se llevaron a cabo reacciones utilizando las mezclas de dGTP y las mezclas de dITP para clarificar las áreas de compresión. Alternativamente, las áreas comprimidas se resolvieron en geles de formamida. Los moldes fueron subclones de plásmido de cadena doble o subclones de M13 de cadena sencilla, y los cebadores se prepararon tanto para el vector justo fuera del inserto a secuenciar, o para una secuencia previamente obtenida. La secuencia obtenida se ensambló y se comparó utilizando el software Dnastar. La manipulación y comparación de las secuencias obtenidas se llevó a cabo con los programas Superclone y Supersee de Coral Software.
Transferencia Southern de DNA
El procedimiento general de transferencia Southern se tomó de Maniatis et al. El DNA se transfirió a filtros de nitrocelulosa y se hibridó con sondas de DNA marcadas apropiadas. Las sondas para las transferencias Southern se prepararon utilizando bien el Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit de Boehringer Mannheim o el Nick Translation Kit de Bethesda Research Laboratories (BRL). En ambos casos se siguieron los procedimientos recomendados por los fabricantes.
Transfección de DNA para generar virus recombinante
El método se basa en el procedimiento del fosfato de calcio de Graham y Van der eb (1973) con las siguientes modificaciones. El DNA del virus y/o el plásmido se diluyó hasta 298 \mul en Tris 0,01 M pH 7,5, EDTA 1 mM. Se añadieron 40 \mul de CaCl_{2} 2 M seguidos de un volumen igual de solución salina tamponada con HEPES 2X (10 g de ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico (HEPES), 16 g de NaCl, 0,74 g de KCl, 0,25 g de Na_{2}HPO_{4}\cdot2H_{2}O, 2 g de dextrosa por litro de H_{2}O y tamponado con NaOH a pH 7,4). La mezcla se incubó a continuación en hielo durante 10 minutos, y a continuación se añadió gota a gota a una monocapa confluente al 80% de células Vero que crecían en una placa petri de 60 mm bajo 5 ml de medio (DME con suero bovino fetal al 1%). Las células se incubaron 4 horas a 37ºC en un incubador humidificado que contenía CO_{2} al 5%. Las células se lavaron a continuación una vez con 5 ml de PBS 1X (1,15 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,2 g de KH_{2}PO_{4}, 0,89 g de NaCl, 0,2 g de KCl por litro de H_{2}O), una vez con 5 ml de glicerol al 20%/PBS (v/v), una vez más con 5 ml de PBS 1X, y a continuación se les suministró 5 ml de medio (DME con suero bovino fetal al 2%). Las células se incubaron a 37ºC como antes durante 3-7 días hasta que el efecto citopático del virus era del 50-100%. El virus se recogió como se describió anteriormente para la preparación de las soluciones de reserva de virus. Esta solución de reserva se denominó solución de reserva de transfección y subsiguientemente se sometió a escrutinio para buscar virus recombinantes mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS.
Procedimiento de recombinación homóloga para generar virus del herpes recombinante
Este método se basa en la recombinación homóloga entre el DNA del virus del herpes y el DNA del vector de homología plásmidico que tiene lugar en células de cultivo de tejidos cotransfectadas con estos elementos. Se mezclaron entre 0,1 y 1 \mug de DNA plasmídico que contenía DNA ajeno flanqueado por secuencias apropiadas clonadas del virus del herpes (el vector de homología) con aproximadamente 0,3 \mug de DNA del virus del herpes intacto. Los DNAs se diluyeron hasta 298 \mul en Tris 0,01 M pH 7,5, EDTA 1 mM, y se utilizaron para la transfección células Vero conforme a la TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR VIRUS RECOMBINANTE (véase arriba).
Procedimiento de ligación directa para generar virus del herpes recombinante
En lugar de utilizar vectores de homología y basarse en la recombinación homóloga para generar virus recombinante, hemos desarrollado también la técnica de ligación directa para crear virus del herpes mediante ingeniería genética. En este caso, un gen ajeno clonado no requería secuencias de DNA del virus del herpes flanqueantes, sino que solamente se requería que tuviera sitios de restricción disponibles para cortar el fragmento del gen ajeno del vector plasmídico. Se utilizó una enzima de restricción compatible para cortar el DNA del virus del herpes. Un requerimiento de la técnica es que la enzima de restricción utilizada para cortar el DNA del virus del herpes debe cortar en un número limitado de sitios. Para el EHV-4, serían apropiadas las enzimas de restricción PmeI o PacI (véase la Figura 2). También pueden utilizarse sitios de restricción previamente introducidos en el virus del herpes por otros métodos. El DNA del virus del herpes se mezcla con un exceso molar de 30 veces de DNA plasmídico (típicamente 5 \mug de DNA del virus frente a 10 \mug del DNA plasmídico), y la mezcla se somete a corte con la enzima de restricción apropiada. La mezcla de DNA se extrae con fenol y se precipita con etanol para retirar las enzimas de restricción, y se somete a ligación conforme al procedimiento de ligación detallado arriba. La mezcla de DNA ligado se resuspende a continuación en 298 \mul de Tris 0,01 M pH 7,5, EDTA 1 mM y se utiliza para la transfección células Vero conforme a la TRANSFECCIÓN DE DNA PARA GENERAR VIRUS RECOMBINANTE (véase arriba).
Procedimiento para generar virus del herpes recombinante a partir de fragmentos de dna subgenómicos
La capacidad para generar virus del herpes mediante cotransfección de fragmentos subgenómicos solapantes clonados se ha demostrado para el virus de la pseudorrabia (48) y para el virus del herpes de los pavos (47). Si se generan deleciones y/o inserciones mediante ingeniería genética directamente dentro de los fragmentos subgenómicos antes de la cotransfección, este procedimiento da como resultado una alta frecuencia de virus que contienen la alteración genómica, reduciendo enormemente la cantidad de escrutinios necesarios para purificar el virus recombinante. Nosotros nos anticipamos utilizando esta técnica para generar mediante ingeniería genética inserciones de genes ajenos dentro de deleciones atenuantes específicas (US2, TK y gpE) en el EHV-4. En el primer paso de este procedimiento se introducen deleciones en virus separados mediante recombinación homóloga con genes de marcadores enzimáticos como se describe más abajo. El vector de homología utilizado en este paso se construye de tal forma que el gen del marcador enzimático esté flanqueado por un sitio de una enzima de restricción que no corte el EHV-4 en la región de DNA a suprimir. En el segundo paso, se construye una genoteca de fragmentos subgenómicos solapantes, capaces de regenerar el virus salvaje, a partir del DNA 4EHV-000 cortado al azar. En el tercer paso, los fragmentos subgenómicos se clonan a partir de cada uno de los virus recombinantes individuales que contienen las deleciones atenuantes/inserciones del gen marcador que se generaron en el primer paso. En cada caso el fragmento subclonado se corresponde en tamaño y situación con uno de los fragmentos subgenómicos salvajes construidos en el segundo paso. Esto se lleva a cabo mediante el escrutinio de una genoteca de subclones de DNA del virus recombinante cortado al azar con sondas generadas a partir de los extremos del fragmento subgenómico salvaje apropiado. Los sitios de restricción que habían sido generados mediante ingeniería genética para flanquear los genes marcadores en el primer paso se utilizan ahora para reemplazar los genes marcadores en cada fragmento subgenómico con varios genes ajenos (tales como gpB del EHV-1, gpD del EHV-1, HA de la gripe equina, o NA de la gripe equina). En el cuarto paso, la cotransfección de los fragmentos subgenómicos solapantes salvajes y derivados de la deleción/inserción apropiados permite la generación de virus EHV-4 recombinantes que incorporan cualquier combinación deseada de deleciones y/o inserciones.
Escrutinio para buscar virus del herpes recombinante que exprese los genes de marcadores enzimáticos
Cuando se incorporó el gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ) o la \beta-glucuronidasa (uidA) de E. coli en un virus recombinante, las colonias que contenían los recombinantes se visualizaron mediante un simple ensayo. Durante el ensayo de las colonias, se incorporó el sustrato enzimático (300 \mug/ml) en la capa superior de agarosa. Para el gen marcador lacZ se utilizó el sustrato BLUOGAL™ (indolil-\beta-D-galactosidasa halogenada, GIBCO-Bethesda Research Labs). Para el gen marcador uidA se utilizó el sustrato X-Glucuro Chx (sal de ciclohexilamonio del ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónico, Biosynth AG). Las colonias que expresaban la enzima marcadora activa se volvieron azules. Las colonias azules se recogieron a continuación y depositaron sobre células Vero frescas y se purificaron mediante un nuevo aislamiento de colonias azules. En las estrategias de virus recombinantes en las que se retira el gen del marcador enzimático, el ensayo implica la purificación de colonias blancas a partir de un fondo de colonias azules parenterales. En ambos casos los virus se purificaron típicamente con tres rondas de purificación de colonias.
Selección de virus resistente a Ara-T
Muchos análogos de los nucleósidos inhiben la replicación de alfa-virus del herpes. Un fármaco antiviral de este tipo es la arabinosiltimina (Ara-T; Rayo Chemicals, Canada). La resistencia de los mutantes del EHV a Ara-T se debe a mutaciones en el TK viral, de tal forma que se seleccionan los virus TK negativos (TK-). Las soluciones de transfección de reserva se cultivaron sobre células Vero en presencia de 200 \mug/ml de Ara-T en medio DME completo con suero bovino fetal al 1%. La selección se repitió entre una y dos veces. Los virus de reserva generados a partir de la selección con Ara-T se sometieron a ensayo mediante autorradiografía de colonias con timidina (37, 38). Las colonias seleccionadas a partir de las reservas positivas se sometieron a ensayo relativo a la deleción del TK mediante el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Obsérvese que los virus TK negativos construidos utilizando la selección con Ara-T (S-1EHV-001 y S-4EHV-001) exhibieron cambios en fragmentos de restricción no relacionados con el sitio TK. Se observaron diferencias en los fragmentos BamHI c, d y g en S-4EHV-001 y en el fragmento p en S-1EHV-001. Puesto que no se observaron cambios similares en S-4EHV-004, en el que la deleción del TK se introdujo sin la selección con Ara-T, creemos que este procedimiento es un procedimiento menos deseable para la selección de virus recombinantes.
Construcción de virus con deleciones
La estrategia utilizada para construir virus con deleciones implicó la utilización de las técnicas de recombinación homóloga y/o ligación directa. Inicialmente, se construyó un virus mediante recombinación homóloga, en el que el DNA a suprimir se reemplazó por un gen marcador tal como la \beta-galactosidasa (lacZ) o la \beta-glucuronidasa (uidA) de E. coli. A continuación se construyó un segundo virus en el que se suprimió el gen marcador, bien mediante recombinación homóloga o mediante ligación directa. La ventaja de esta estrategia es que ambos virus pueden purificarse mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS. El primer virus se purifica seleccionando las colonias azules de un fondo de colonias blancas, el segundo virus se purifica seleccionando las colonias blancas de un fondo de colonias azules.
Clonación de los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del virus de la gripe equina
Los genes de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) del virus de la gripe equina pueden clonarse esencialmente como se describe en Katz et al. para el gen HA del virus de la gripe humana. El RNA viral preparado a partir del virus cultivado en células MDBK se convierte primero a cDNA utilizando un oligonucleótido cebador específico para el gen diana. El cDNA se utiliza a continuación como molde para la clonación por PCR (51) de la región del gen diana. Los cebadores para la PCR se diseñan para incorporar sitios de restricción que permitan la clonación de las regiones codificantes amplificadas en vectores que contengan las señales apropiadas para la expresión en el EHV. Se requiere un par de oligonucleótidos cebadores para cada región codificante. Las regiones codificantes del gen HA de los virus con serotipo 2 (H3) (Influenza A/equine/Miami/63, Influenza A/equine/Kentucky/81, e Influenza A/equine/Alaska/91) podrían clonarse utilizando los siguientes cebadores 5'-GGGTCGACATGACAGACAACCATTATTTTGATAC-3' (SEC ID Nº 64) para cebar el cDNA y combinado con 5'-GGGTCGACTCAAATGCAAATGTTGCATCTGAT-3' (SEC ID Nº 65) para la PCR. La región codificante del gen HA del virus con serotipo 1 (H7) (Influenza A/equine/Prague/56) podría clonarse utilizando los siguientes cebadores 5'- GGGATCCATGAACACTCAAATTCTAATATTAG-3' (SEC ID Nº 66) para cebar el cDNA y combinado con 5'-GGGATCCTTATATACAAATAGTGCACCGCA-3' (SEC ID Nº 67) para la PCR. Las regiones codificantes del gen NA de los virus con serotipo 2 (N8) (Influenza A/equine/Miami/63, Influenza A/equine/Kentucky/81, e Influenza A/equine/Alaska/91) podrían clonarse utilizando los siguientes cebadores 5'-GGGTCGACATGAATCCAAATCAAAAGATAA-3' (SEC ID Nº 68) para cebar el cDNA y combinado con 5'-GGGTCGACTTACATCTTATCGATGTCAAA-3' (SEC ID Nº 69) para la PCR. La región codificante del gen NA del virus con serotipo 1 (N7) (Influenza A/equine/Prague/56) podría clonarse utilizando los siguientes cebadores 5'-GGGATCCATGAATCCTAATCAAAAACTCTTT-3' (SEC ID Nº 68) para cebar el cDNA y combinado con 5'-GGGATCCTTACGAAAAGTATTTAATTTGTGC-3' (SEC ID Nº 71) para la PCR. Obsérvese que esta estrategia general puede utilizarse para clonar las regiones codificantes de los genes HA y NA de otras cepas del virus A de la gripe equina.
Vector de homología 450-46.B4
El plásmido 450-46.B4 se construyó con el propósito de suprimir una porción del gen de la timidina quinasa del EHV-1. Puede utilizarse también para insertar DNA ajeno en el EHV-1. Contiene un único sitio para la enzima de restricción XbaI en el que puede insertarse el DNA ajeno. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23 y 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas que se indican en la Figura 4. El vector plasmídico proviene de un fragmento de restricción entre BamHI y HindIII de aproximadamente 2978 pares de bases de pSP65 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción Sau3A de aproximadamente 779 pares de bases del fragmento de restricción BglII b del EHV-1 (42). El fragmento 2 es un subfragmento de restricción entre BstEII y PstI de aproximadamente 1504 pares de bases del fragmento de restricción BglII b del EHV-1 (42).
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Vector de homología 467-21.19
El plásmido 467-21.19 se construyó con el propósito de suprimir una porción del gen único corto 2 del EHV-1. Puede utilizarse también para insertar DNA ajeno en el EHV-1. Contiene un único sitio para la enzima de restricción EcoRI en el que puede insertarse el DNA ajeno. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes como se indica en la Figura 5. El vector plasmídico proviene de un fragmento de restricción entre BamHI y PstI de aproximadamente 2983 pares de bases de pSP65 (Promega). Obsérvese que el sitio EcoRI ha sido eliminado del vector plasmídico por digestión con la nucleasa S1. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre BamHI y NcoI de aproximadamente 767 pares de bases del fragmento de restricción BamHI n del EHV-1 (42). El fragmento 2 es un subfragmento de restricción entre EcoRI y PstI de aproximadamente 1283 pares de bases del fragmento de restricción BamHI n del EHV-1 (42).
Vector de homología 536-85.30
El plásmido 536-85.30 se construyó con el propósito de suprimir el gen de la glicoproteína G del EHV-1. Se utilizó para insertar DNA ajeno en el EHV-1. Contiene un par de sitios para la enzima de restricción SalI en el que puede insertarse el DNA ajeno. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23 y 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes como se indica en la Figura 6. El vector plasmídico proviene de un fragmento de restricción entre EcoRI y PstI de aproximadamente 2643 pares de bases de pNEB193 (New England Biolabs). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre EcoRI y PvuII de aproximadamente 2292 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI k del EHV-1 (42). El fragmento 2 es un subfragmento de restricción entre PstI y BamHI de aproximadamente 1077 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI k del EHV-1 (42).
Vector de homología 495-61.39
El plásmido 495-61.39 se construyó con el propósito de suprimir una porción del gen de la timidina quinasa del EHV-4. Puede utilizarse también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. Contiene un único sitio para la enzima de restricción XbaI en el que puede insertarse el DNA ajeno. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas que se indican en la Figura 7. El vector plasmídico proviene de un fragmento de restricción entre SmaI y HincII de aproximadamente 2988 pares de bases de pSP65 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre PvuII y FspI de aproximadamente 830 pares de bases del fragmento de restricción BamHI c del EHV-4 (8). El fragmento 2 es un subfragmento de restricción entre PvuII y SmaI de aproximadamente 1220 pares de bases del fragmento de restricción BamHI c del EHV-4 (8).
Vector de homología 523-38.9
El plásmido 523-38.9 se construyó con el propósito de suprimir una porción del gen único corto 2 del EHV-4. Puede utilizarse también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. Contiene un único sitio para la enzima de restricción PstI en el que puede insertarse el DNA ajeno. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes como se indica en la Figura 8. El vector plasmídico proviene de un fragmento de restricción entre XbaI y HindIII de aproximadamente 2984 pares de bases de pSP65 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre XbaI y PstI de aproximadamente 1098 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI g del EHV-4 (8). El fragmento 2 es un subfragmento de restricción entre PstI y HindIII de aproximadamente 2799 pares de bases del fragmento de restricción BamHI d del EHV-4 (8).
Vector de homología 580-57.25
El plásmido 580-57.25 se construyó con el propósito de suprimir el gen gpE del EHV-4. Puede utilizarse también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. Contiene un único sitio para la enzima de restricción BamHI en el que puede insertarse el DNA ajeno. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes como se indica en la Figura 9. El vector plasmídico proviene de un fragmento de restricción entre EcoRI y HincII de aproximadamente 2973 pares de bases de pSP65 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre EcoRI y AatII de aproximadamente 2046 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI j del EHV-4 (8). El fragmento 2 es un subfragmento de restricción entre FspI y FspI de aproximadamente 1976 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI j del EHV-4 (8).
Vector de homología 467-22.A12
El plásmido 467-22.A12 se construyó con el propósito de suprimir una porción de la región codificante del gen US2 del virus EHV-1. Incorpora un gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ) de E. coli flanqueado por el DNA del virus EHV-1. El gen marcador lacZ se insertó en el vector de homología 467-21.19 en el único sitio EcoRI. El gen marcador está orientado de forma opuesta al gen US2 en el vector de homología. En la Figura 10 se da una descripción detallada del gen marcador. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas que se indican en la Figura 10. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre SalI y BamHI de aproximadamente 413 pares de bases del fragmento de restricción BamHI 10 del PRV (22). El fragmento 2 es un fragmento de restricción entre BamHI y PvuII de aproximadamente 3010 pares de bases del plásmido pJF751 (11). El fragmento 3 es un subfragmento de restricción entre NdeI y SalI de aproximadamente 754 pares de bases del fragmento de restricción BamHI #7 del PRV (22).
Vector de homología 588-81.13
El plásmido 588-81.13 se construyó con el propósito de suprimir una porción de la región codificante del gen US2 del virus EHV-4. Incorpora un gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ) de E. coli flanqueado por el DNA del virus EHV-4. El gen marcador lacZ se insertó como un fragmento de restricción PstI en el vector de homología 523-38.9 en el único sitio PstI. El gen marcador está orientado en dirección opuesta al gen US2 en el vector de homología. En la Figura 11 se da una descripción detallada del gen marcador. Se construyó utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas que se indican en la Figura 11. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre SalI y BamHI de aproximadamente 413 pares de bases del fragmento de restricción BamHI 10 del PRV (22). El fragmento 2 es un fragmento de restricción entre BamHI y PvuII de aproximadamente 3010 pares de bases del plásmido pJF751 (11). El fragmento 3 es un subfragmento de restricción entre NdeI y SalI de aproximadamente 754 pares de bases del fragmento de restricción BamHI #7 del PRV (22).
Vector de homología 552-45.19
El plásmido 552-45.19 se construyó con el propósito de suprimir una porción de la región codificante del gen TK del virus EHV-4. Incorpora un gen marcador de la \beta-glucuronidasa (uidA) de E. coli flanqueado por el DNA del virus EHV-4. El gen marcador uidA se insertó en el vector de homología 495-61.39 en el único sitio XbaI. El gen marcador está orientado de forma opuesta al gen TK en el vector de homología. En la Figura 12 se da una descripción detallada del gen marcador. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas que se indican en la Figura 12. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre SalI y EcoRI de aproximadamente 404 pares de bases del fragmento de restricción BamHI #10 del PRV (22). Obsérvese que el sitio EcoRI se introdujo en el lugar indicado en la Figura 12 mediante clonación por PCR. El fragmento 2 es un fragmento entre EcoRI y SmaI de aproximadamente 1823 pares de bases del plásmido pRAJ260 (Clonetech). Obsérvese que los sitios EcoRI y SmaI se introdujeron en las los lugares indicados en la Figura 12 mediante clonación por PCR. El fragmento 3 es un subfragmento de restricción entre SmaI y SmaI de aproximadamente 784 pares de bases del fragmento de restricción BamHI Q del HSV-1 (24). Obsérvese que este fragmento está orientado de tal forma que la secuencia de poliadenilación (AATAAA) se sitúe lo más cerca posible del empalme C.
Vector de homología 593-31.2
El plásmido 593-31.2 se construyó con el propósito de suprimir la región codificante del gen gpE del virus EHV-4. Incorpora un gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ) de E. coli flanqueado por el DNA del virus EHV-4. El gen marcador lacZ se insertó en el vector de homología 580-57.25 en el único sitio BamHI. El gen marcador está orientado igual que el gen gpE suprimido en el vector de homología. En la Figura 13 se da una descripción detallada del gen marcador. Puede construirse utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintéticas que se indican en la Figura 10. El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre SalI y BamHI de aproximadamente 413 pares de bases del fragmento de restricción BamHI 10 del PRV (22). El fragmento 2 es un fragmento de restricción entre BamHI y PvuII de aproximadamente 3010 pares de bases del plásmido pJF751 (11). El fragmento 3 es un subfragmento de restricción entre NdeI y SalI de aproximadamente 754 pares de bases del fragmento de restricción BamHI #7 del PRV (22).
Vector de homología 616-40
El plásmido 616-40 se construyó con el propósito de suprimir una porción del gen de la timidina quinasa del EHV-4. Se utiliza también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. Contiene un único sitio NotI en el que se inserta el DNA ajeno. El vector de homología 616-40 proviene de una genoteca de cósmidos preparada con DNA cortado del virus 4EHV-004. Se generó una genoteca de subclones que contenían fragmentos subgenómicos del EHV solapantes como sigue. El DNA del 4EHV-004 se cortó y a continuación se seleccionó por tamaños en un gradiente de glicerol como se ha descrito (48), eligiéndose los fragmentos de 40-50 kb como población de insertos. Las fracciones combinadas se diluyeron al doble con TE, se añadieron un décimo del volumen de NaAc 3 M y 2,5 volúmenes de etanol, y el DNA se precipitó a 30000 rpm en un rotor Beckman SW41 durante 1 hora. Los fragmentos cortados se pulieron para proporcionar extremos romos, mediante tratamiento inicial con DNA polimerasa de T4, utilizando concentraciones bajas de dNTP para propiciar la eliminación de los extremos 3' colgantes, seguido del tratamiento con polimerasa Klenow para rellenar los extremos 3' retraídos. Estos fragmentos de inserto se ligaron a continuación con el 384-94. El vector de tipo cósmido 384-94 es un derivado de pHC79 de Gibco BRL, Inc. del que se suprimió el gen de resistencia a tetraciclina por digestión mediante endonucleasas de restricción con HindIII y AvaI, y se insertó un enlazador de DNA que contenía los sitios de restricción NotI-BamHI-NotI. El vector de tipo cósmido 384-94 se sometió a digestión con BamHI, los extremos se volvieron romos mediante tratamiento con polimerasa Klenow y se trató con fosfatasa intestinal de ternera. La mezcla de ligación que contenía el vector de tipo cósmido 384-94 y los fragmentos de DNA genómico del 4EHV-004 se encapsidó a continuación utilizando extractos de encapsidación Gigapack XL (Stratagene). La ligación y encapsidación fueron como recomienda el fabricante. Las colonias se hicieron crecer en cultivos durante una noche y se extrajo el DNA de tipo cósmido (23, 34). El DNA de tipo cósmido se analizó por digestión mediante endonucleasas de restricción con NotI. Los clones de DNA de tipo cósmido se sometieron a escrutinio para buscar la presencia de un fragmento NotI de 3,0 kb que indicaba la presencia del promotor gX del PRV-inserto del gen ajeno uidA en un sitio NotI dentro de la deleción del gen TK. Se aisló un cósmido, 607-21.16, que contenía la deleción del gen TK con una inserción del gen uidA. El cósmido, 607-21.16, se sometió a digestión con NotI para eliminar el promotor gX/gen uidA y se sometió a una nueva ligación para obtener el vector de homología, 616-40. El vector de homología, 616-40, contiene secuencias de DNA que rodean el gen TK de aproximadamente 22600 pares de bases que incluye aproximadamente 4000 pares de bases del fragmento EcoRI e, aproximadamente 600 pares de bases del fragmento EcoRI q entero y aproximadamente 18000 pares de bases del fragmento EcoRI a. El vector proviene de un fragmento de restricción BamHI de aproximadamente 4430 pares de bases del vector de tipo cósmido 384-94 (derivado de pHC79 de Gibco-BRL). El vector de homología 616-40 contiene la deleción de 653 pares de bases en el gen TK con un único sitio NotI y sin un gen marcador adicional insertado.
Vector de homología 593-20.5
El plásmido 593-20.5 se construyó con el propósito de suprimir el gen gpE del virus EHV-4 e insertar el gen marcador de la \beta-glucuronidasa (uidA) bajo el control del promotor gX del PRV. Se utiliza también para insertar otro DNA ajeno, incluyendo los genes HA y NA de la gripe equina en el EHV-4. Se construyó utilizando técnicas de DNA recombinante estándar (23, 34), uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El plásmido proviene de un fragmento de restricción entre EcoRI y HincII de aproximadamente 2973 pares de bases de pSP65 (Promega). El fragmento 1 es un subfragmento de restricción entre EcoRI y AatII de aproximadamente 2046 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI j del EHV-4 (8). El fragmento 2 es un fragmento BamHI de aproximadamente 3011 pares de bases que contiene el promotor gX del PRV, el gen uidA, y el sitio de poliadenilación del HSV-1. El fragmento 3 es un subfragmento de restricción entre FspI y FspI de aproximadamente 1976 pares de bases del fragmento de restricción EcoRI j del EHV-4.
Ejemplos Ejemplo 1 Gen único corto 2
La deleción del gen US2 en un virus del herpes equino hace que un virus del herpes equino recombinante sea seguro para su utilización en equinos preñados, esto es, hace que el virus sea incapaz de causar el aborto del feto.
Hemos caracterizado las regiones únicas cortas del EHV-1 y EHV-4 mediante análisis de secuencia de DNA. La SEC ID Nº 1 muestra la secuencia de las primeras 1322 bases del fragmento BamHI n (véase la Figura 1) que se leen desde el empalme BamHI n - BamHI d. Esta secuencia contiene un ORF (del inglés, "open reading frame", marco de lectura abierto) de 303 aminoácidos que presenta homología con algunos genes US2 de otros virus del herpes (véase la Figura 3). La SEC ID Nº 3 muestra las 1252 bases de la secuencia que comienza 198 bases corriente arriba del sitio HindIII situado aproximadamente en el medio del fragmento EcoRI g del EHV-4 (véase la Figura 2). La secuencia se lee hacia atrás en dirección al empalme EcoRI g - EcoRI b y contiene un ORF de 324 aminoácidos. Después de secuenciar la región única corta, encontramos que contenía un gen US2 que presentaba homología con varios genes US2 de otros virus del herpes (véase la Figura 5). Puesto que determinamos la posición y secuencia del gen US2 en el virus del herpes equino, podemos suprimir el gen US2 del EHV-1 y el EHV-4 y atenuar, así como hacer que el virus sea seguro para su utilización en caballos preñados.
Ejemplo 2 Vector de homología 450-46.B4
El vector de homología 450-46.B4 es un plásmido utilizado para atenuar el EHV-1 a través de la inactivación del gen TK. La inactivación del gen TK se lleva a cabo mediante la deleción de DNA que codifica la TK del EHV-1. El plásmido 450-46.B4 lleva una copia del gen TK (31) en el que se ha introducido una deleción de aproximadamente 202 pares de bases entre los aminoácidos 115 y 182. El plásmido, utilizado conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE y a la SELECCIÓN DE VIRUS RESISTENTE A ARA-T, genera un EHV-1 que contiene un gen TK suprimido.
El plásmido 450-46.B4 es utilizable también para insertar DNA ajeno en el EHV-1. El plásmido contiene un único sitio de restricción XbaI situado en el sitio de la deleción. El DNA ajeno clonado en este sitio da como resultado un plásmido que podría utilizarse conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE para generar un EHV-1 que contenga DNA ajeno. Obsérvese que si se inserta un gen marcador apropiado (por ejemplo, lacZ de E. coli) en el vector de homología, entonces se genera un virus recombinante sin la SELECCIÓN DE VIRUS RESISTENTE A ARA-T.
Para que los procedimientos descritos arriba resulten exitosos, es importante que el sitio de deleción/inserción esté en una región que no sea esencial para la replicación del EHV-1 y que el sitio esté flanqueado con DNA del virus del herpes equino apropiado para mediar la recombinación homóloga entre los DNAs del virus y el plásmido. Obsérvese que la deleción se diseñó de tal forma que esté limitada a una porción específica de la región codificante de la TK. Esta región contiene aminoácidos importantes para la actividad enzimática de la TK. La deleción no elimina secuencias que estén implicadas con genes flanqueantes que sean importantes para un crecimiento viral eficiente (12). Hemos demostrado que el sitio de inserción/deleción en el vector de homología 450-46.B4 inserta DNA ajeno en el EHV-1, como queda representado por los dos virus EHV-1 recombinantes de los Ejemplos 7 y 9.
Ejemplo 3 Vector de homología 467-21.19
El vector de homología 467-21.19 es un plásmido utilizado para atenuar el EHV-1 a través de la inactivación del gen US2. La inactivación del gen US2 se lleva a cabo mediante la deleción de DNA que codifica la US2 del EHV-1. El plásmido 467-21.19 lleva una copia del gen US2 en el que se ha introducido una deleción de aproximadamente 93 pares de bases entre los aminoácidos 174 y 205. El plásmido podría utilizarse conforme a la CONSTRUCCIÓN DE VIRUS CON DELECIONES para generar un EHV-1 que contenga un gen US2 suprimido.
El plásmido 467-21.19 es utilizable también para insertar DNA ajeno en el EHV-1. El plásmido contiene un único sitio de restricción EcoRI situado en el sitio de la deleción. El DNA ajeno clonado en este sitio da como resultado un plásmido que podría utilizarse conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE para generar un EHV-1 que contenga DNA ajeno.
Para que los procedimientos descritos arriba resulten exitosos, es importante que el sitio de deleción/inserción esté en una región que no sea esencial para la replicación del EHV-1 y que el sitio esté flanqueado con DNA del virus del herpes equino apropiado para mediar la recombinación homóloga entre los DNAs del virus y el plásmido. Obsérvese que la deleción se diseñó de tal forma que esté limitada a la región única corta y no elimine secuencias de las repeticiones interna o terminal. Hemos demostrado que el sitio de inserción/deleción en el vector de homología 467-21.19 inserta DNA ajeno en el EHV-1, como queda representado por los dos virus EHV-1 recombinantes de los Ejemplos 7 y 9.
Ejemplo 4 Vector de homología 536-85.30
El vector de homología 536-85.30 es un plásmido utilizado para atenuar el EHV-1 a través de la eliminación del gen de la glicoproteína G (gpG) y una porción del gen de la glicoproteína grande de membrana (MGP) de la región única corta. El plásmido 536-85.30 lleva una porción de la región única corta en la que se ha generado mediante ingeniería genética una deleción de aproximadamente 2384 pares de bases que elimina toda la región codificante de la gpG y los 307 aminoácidos del extremo N-terminal de la MGP. El plásmido puede utilizarse conforme a la CONSTRUCCIÓN DE VIRUS CON DELECIONES para generar un EHV-1 con una deleción en gpG/MGP.
El plásmido 536-85.30 es utilizable también para insertar DNA ajeno en el EHV-1. El plásmido contiene un par de sitios de restricción SalI situados en el sitio de la deleción. El DNA ajeno clonado en estos sitios da como resultado un plásmido que podría utilizarse conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE para generar un EHV-1 que contenga DNA ajeno.
Ejemplo 5 Vector de homología 495-61.39
El vector de homología 495-61.39 es un plásmido utilizado para atenuar el EHV-4 a través de la inactivación del gen TK. La inactivación del gen TK se lleva a cabo mediante la deleción de DNA que codifica la TK del EHV-4. El plásmido 495-61.39 lleva una copia del gen TK (27) en el que se ha generado mediante ingeniería genética una deleción de aproximadamente 653 pares de bases entre los aminoácidos 98 y 317. El plásmido se utiliza conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE y a la SELECCIÓN DE VIRUS RESISTENTE A ARA-T para generar un EHV-4 con una deleción en el gen que codifica la TK.
El plásmido 495-61.39 es utilizable también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. El plásmido contiene un único sitio de restricción XbaI situado en el sitio de la deleción. El DNA ajeno clonado en este sitio da como resultado un plásmido que podría utilizarse conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE para generar un virus EHV-4 que contenga DNA ajeno. Obsérvese que si se inserta un gen marcador apropiado (por ejemplo, lacZ de E. coli) en el vector de homología, entonces se genera un virus recombinante sin la SELECCIÓN DE VIRUS RESISTENTE A ARA-T.
Para que los procedimientos descritos arriba resulten exitosos, es importante que el sitio de deleción/inserción esté en una región que no sea esencial para la replicación del EHV-4 y que el sitio esté flanqueado con DNA del virus del herpes equino apropiado para mediar la recombinación homóloga entre los DNAs del virus y el plásmido. Obsérvese que la deleción se diseñó de tal forma que esté limitada a una porción específica de la región codificante de la TK. Esta región contiene aminoácidos importantes para la actividad enzimática de la TK. La deleción no elimina secuencias que estén implicadas con genes flanqueantes que sean importantes para un crecimiento viral eficiente (18, 12).
Ejemplo 6 Vector de homología 523-38.9
El vector de homología 523-38.9 es un plásmido utilizado para atenuar el EHV-4 a través de la inactivación del gen US2. La inactivación del gen US2 se lleva a cabo mediante la deleción de DNA que codifica la US2 del EHV-4. El plásmido 523-38.9 lleva una copia del gen US2 en el que se ha generado mediante ingeniería genética una deleción de aproximadamente 711 pares de bases entre los aminoácidos 131 y 324. El plásmido podría utilizarse conforme a la CONSTRUCCIÓN DE VIRUS CON DELECIONES para generar un EHV-4 con una deleción en el gen que codifica la US2.
El plásmido 523-38.9 es utilizable también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. El plásmido contiene un único sitio de restricción PstI situado en el sitio de la deleción. El DNA ajeno clonado en este sitio da como resultado un plásmido que podría utilizarse conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE para generar un EHV-4 que contenga DNA ajeno.
Para que los procedimientos descritos arriba resulten exitosos, es importante que el sitio de deleción/inserción esté en una región que no sea esencial para la replicación del EHV-4 y que el sitio esté flanqueado con DNA del virus del herpes equino apropiado para mediar la recombinación homóloga entre los DNAs del virus y el plásmido. Obsérvese que la deleción se diseñó de tal forma que esté limitada a la región única corta y no elimine secuencias de las repeticiones interna o terminal. Hemos demostrado que el sitio de inserción/deleción en el vector de homología 523-38.9 inserta DNA ajeno en el EHV-4, como queda representado por los dos virus EHV-4 recombinantes de los Ejemplos 13 y 14.
Ejemplo 7 Vector de homología 580-57.25
Hemos determinado que la deleción del gen de la glicoproteína E del virus del herpes equino resulta útil para atenuar el virus para su utilización en una vacuna para caballos y para proporcionar un marcador serológico negativo.
El vector de homología 580-57.25 es un plásmido utilizado para atenuar el EHV-4 a través de la eliminación del gen de la glicoproteína E (gpE) (8 y SEC ID Nºs 5 & 6). El plásmido 580-57.25 lleva una porción de la región única corta en la que se ha generado mediante ingeniería genética una deleción de aproximadamente 1694 pares de bases que elimina toda la región codificante de la gpE. El plásmido puede utilizarse conforme a la CONSTRUCCIÓN DE VIRUS CON DELECIONES para generar un virus EHV-4 con una deleción en el gen que codifica la gpE.
El plásmido 580-57.25 es utilizable también para insertar DNA ajeno en el EHV-4. El plásmido contiene un único sitio de restricción BamHI situado en el sitio de la deleción. El DNA ajeno clonado en este sitio da como resultado un plásmido que podría utilizarse conforme al PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE para generar un EHV-4 que contenga DNA ajeno.
Ejemplo 8 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-1EHV-001
El S-1EHV-001 es un virus de tipo 1 (EHV-1) del virus del herpes equino que tiene una deleción de aproximadamente 202 pares de bases en el gen TK. El virus del herpes equino S-1EHV-001 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2357.
El S-1EHV-001 se obtuvo a partir del S-1EHV-000 (cepa Dutta). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 450-46.B4 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-1EHV-000 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se seleccionó conforme a la SELECCIÓN DE VIRUS RESISTENTE A ARA-T. Se seleccionaron clones individuales después de dos rondas de selección y se sometieron a ensayo mediante autorradiografía de colonias con timidina (37, 38). Las colonias seleccionadas de las solución de reserva TK negativas se sometieron a ensayo relativo a la deleción en TK mediante el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Se seleccionó una colonia que resultó ser TK menos mediante el ensayo de incorporación de timidina así como en el análisis Southern y se designó S-1EHV-001.
La construcción de este virus establece que el gen de la timidina quinasa del EHV-1 no es un gen esencial y es un sitio viable para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación del gen TK atenúa el virus.
Ejemplo 9 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-1EHV-002
El S-1EHV-002 es un virus de tipo 1 (EHV-1) del virus del herpes equino que tiene dos deleciones en la región única corta del genoma. La primera deleción es de aproximadamente 93 pares de bases y elimina los aminoácidos 174 a 205 del gen US2 (SEC ID Nº 1). La segunda deleción es de aproximadamente 2283 pares de bases y elimina porciones de los genes gpG y MGP de la región única corta. El gen de la \beta-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli se insertó en la deleción del gen US2 y está bajo el control del promotor gpX del PRV. El virus del herpes equino S-1EHV-002 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2358.
El S-1EHV-002 se obtuvo a partir del S-1EHV-000 (cepa Dutta). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 467-22.A12 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-1EHV-000 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS. El resultado final de la purificación de colonias azules fue el virus recombinante designado S-1EHV-002. Este virus se caracterizó mediante elaboración de mapas de restricción y el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Este análisis confirmó la inserción del gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ) y la deleción de aproximadamente 93 pares de bases en el gen US2. Para caracterizar la segunda deleción de la región única corta, el fragmento EcoRI k suprimido del S-1EHV-002 se subclonó y se sometió a análisis de secuencia de DNA. Este análisis confirmó una deleción que comienza con el aminoácido 14 del gen gpG y continúa hasta el aminoácido 303 del gen MGP. La deleción tuvo lugar de tal forma que los 13 aminoácidos restantes del gen gpG están en el mismo marco de lectura que los 494 aminoácidos restantes del gen MGP.
La construcción de este virus establece que los genes US2 y gpG del EHV-1 no son genes esenciales y son sitios viables para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación del gen US2 atenúa el virus y la deleción en el gen de la glicoproteína G del virus proporciona un marcador serológico negativo para diferenciarlo del EHV-1 salvaje.
Ejemplo 10 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-1EHV-003
El S-1EHV-003 es un virus de tipo 1 (EHV-1) del virus del herpes equino que tiene dos deleciones en la región única corta y una deleción en la región única larga del genoma. La primera deleción es una deleción de aproximadamente 202 pares de bases del gen TK. La segunda deleción es de aproximadamente 93 pares de bases y elimina los aminoácidos 174 a 205 del gen US2 (SEC ID Nº 1). La tercera deleción es de aproximadamente 2283 pares de bases y elimina porciones de los genes gpG y MGP de la región única corta. El gen de la \beta-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli se insertó en la deleción del gen US2 y está bajo el control del promotor gpX del PRV. El virus del herpes equino S-1EHV-003 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2359.
El S-1EHV-003 se obtuvo a partir del S-1EHV-002 (véase el Ejemplo 9). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 450-46.B4 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-1EHV-002 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se seleccionó conforme a la SELECCIÓN DE VIRUS IBR RESISTENTE A ARA-T. Se seleccionaron clones individuales después de dos rondas de selección y se sometieron a ensayo mediante autorradiografía de colonias con timidina (37, 38). Las colonias seleccionadas de las solución de reserva TK negativas se sometieron a ensayo relativo a la deleción en TK mediante el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Se seleccionó una colonia que resultó ser TK menos mediante el ensayo de incorporación de timidina así como en el análisis Southern y se designó S-1EHV-003.
La construcción de este virus establece que pueden realizarse deleciones múltiples que inactiven los genes TK y US2 y eliminen los genes gpG en un único virus EHV-1. Este virus resulta útil porque la inactivación de los genes TK y US2 atenúa el virus y la deleción de la región que codifica la glicoproteína G de este virus proporciona un marcador serológico negativo para diferenciarlo del EHV-1 salvaje.
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Ejemplo 11 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-1EHV-004
El S-1EHV-004 es un virus de tipo 1 (EHV-1) del virus del herpes equino que tiene una deleción en la región única larga y una deleción en la región única corta del genoma. La primera deleción es una deleción de aproximadamente 202 pares de bases del gen TK. La segunda deleción es de aproximadamente 93 pares de bases y elimina el DNA que codifica los aminoácidos 174 a 205 del gen US2 (SEC ID Nº 1). El gen de la \beta-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli se insertó en la deleción del gen US2 y está bajo el control del promotor gpX del PRV. El virus del herpes equino S-1EHV-004 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2360.
El S-1EHV-004 se obtuvo a partir del S-1EHV-001 (véase el Ejemplo 8). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 467-22.A12 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-1EHV-001 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS. El resultado final de la purificación de colonias azules fue el virus recombinante designado S-1EHV-004. Este virus se caracterizó mediante elaboración de mapas de restricción y el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Este análisis confirmó la inserción del gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ), la deleción de aproximadamente 93 pares de bases en el gen US2, y la deleción de aproximadamente 202 pares de bases en el gen TK.
La construcción de este virus establece que los genes US2 y TK del EHV-1 no son esenciales y son sitios viables para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación de los genes TK y US2 atenúa el virus.
Ejemplo 12 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-001
El S-4EHV-001 es un virus de tipo 4 (EHV-4) del virus del herpes equino que tiene una deleción de aproximadamente 202 pares de bases en el gen TK. El virus del herpes equino S-4EHV-001 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2361.
El S-4EHV-001 se obtuvo a partir del S-4EHV-000 (cepa Dutta). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 450-46.B4 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-000 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se seleccionó conforme a la SELECCIÓN DE VIRUS IBR RESISTENTE A ARA-T. Se seleccionaron clones individuales después de dos rondas de selección y se analizaron mediante el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Se seleccionó una colonia que resultó ser TK menos mediante el análisis Southern y se designó S-4EHV-001.
La construcción de este virus establece el gen de la timidina quinasa del EHV-4 como un gen no esencial y un sitio viable para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación del gen TK atenúa el virus. La construcción de este virus demuestra también que un vector de homología derivado del EHV-1 puede generar mediante ingeniería genética un EHV-4 de manera análoga.
Ejemplo 13
Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-002
El S-4EHV-002 es un virus de tipo 4 (EHV-4) del virus del herpes equino que tiene una deleción en la región única larga y una deleción en la región única corta del genoma. La primera deleción es una deleción de aproximadamente 202 pares de bases en el gen TK. La segunda deleción es de aproximadamente 705 pares de bases y elimina los aminoácidos 131 a 324 del gen US2 (SEC ID Nº 3). El gen de la \beta-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli se insertó en la deleción del gen US2 y está bajo el control del promotor gpX del PRV. El virus del herpes equino S-4EHV-002 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2362.
El S-4EHV-002 se obtuvo a partir del S-4EHV-001 (véase el Ejemplo 12). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 523-42.A18 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-001 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS. El resultado final de la purificación de colonias azules fue el virus recombinante designado S-4EHV-002. Este virus se caracterizó mediante elaboración de mapas de restricción y el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Este análisis confirmó la inserción del gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ), la deleción de aproximadamente 705 pares de bases en el gen US2, y la deleción de aproximadamente 202 pares de bases en el gen TK.
La construcción de este virus establece los genes US2 y TK del EHV-4 como genes no esenciales y como sitios viables para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación de los genes TK y US2 atenúa el virus.
Ejemplo 14 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-003
El S-4EHV-003 es un virus de tipo 4 (EHV-4) del virus del herpes equino que tiene una deleción en la región única corta del genoma. La deleción es de aproximadamente 705 pares de bases y elimina los aminoácidos 131 a 324 del gen US2 (SEC ID Nº 3). El gen de la \beta-galactosidasa (gen lacZ) de E. coli se insertó en la deleción del gen US2 y está bajo el control del promotor gpX del PRV. El virus del herpes equino S-4EHV-003 se depositó el 12 de marzo de 1992, de conformidad con el Tratado de Budapest, en el Depósito Internacional de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patentes con el Depósito de Cultivos de Patentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU., con el Nº de Acceso ATCC VR 2363.
El S-4EHV-003 se obtuvo a partir del S-4EHV-000 (cepa Dutta). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 523-42.A18 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-000 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS. El resultado final de la purificación de colonias azules fue el virus recombinante designado S-4EHV-003. Este virus se caracterizó mediante elaboración de mapas de restricción y el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Este análisis confirmó la inserción del gen marcador de la \beta-galactosidasa (lacZ) y la deleción de aproximadamente 705 pares de bases del gen US2.
La construcción de este virus establece el gen US2 del EHV-4 como no esencial y como un sitio viable para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación del gen US2 atenúa el virus.
Ejemplo 15 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-004
El S-4EHV-004 es un virus de tipo 4 (EHV-4) del virus del herpes equino que tiene una deleción de aproximadamente 653 pares de bases entre los aminoácidos 98 y 317 del gen de la timidina quinasa (28). El gen de la \beta-glucuronidasa (gen uidA) de E. coli se insertó en la deleción del gen TK y está bajo el control del promotor gpX del PRV.
El S-4EHV-004 se obtuvo a partir del S-4EHV-000 (cepa Dutta). Esto se llevó a cabo utilizando el vector de homología 552-45.19 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-000 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS. El resultado final de la purificación de colonias azules fue el virus recombinante designado S-4EHV-004. Este virus se caracterizó mediante elaboración de mapas de restricción y el procedimiento de TRANSFERENCIA SOUTHERN DE DNA. Este análisis confirmó la inserción del gen marcador de la \beta-glucuronidasa (uidA) y la deleción de aproximadamente 653 pares de bases del gen TK.
La construcción de este virus establece que el gen TK del EHV-4 no es esencial y es un sitio viable para la inserción de DNA ajeno. Este virus resulta útil porque la inactivación del gen TK atenúa el virus.
Ejemplo 16 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-010
Los virus EHV-4 recombinantes que expresan glicoproteínas del EHV-1 se utilizan en vacunas para proteger frente a la infección por ambos virus EHV-1 y EHV-4. De manera similar, los virus EHV-1 recombinantes que expresan glicoproteínas del EHV-4 se utilizan en vacunas para proteger frente a la infección por ambos virus EHV-1 y EHV-4.
El S-4EHV-010, un EHV-4 recombinante con deleciones en los genes TK, US2 y gpE y con inserciones de los genes de la gpD y gpB del EHV-1, en lugar de los genes TK y gpE, respectivamente, se construye de la siguiente manera. El S-4EHV-010 proviene del S-4EHV-004 (véase el Ejemplo 15) a través de la construcción de cuatro virus intermedios. El primer virus intermedio, el S-4EHV-005, se construyó de manera similar al S-4EHV-003, utilizando el vector de homología 588-81.13 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-004 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia azul (sustrato lacZ). El virus resultante tiene deleciones en los genes TK y US2 e inserciones de uidA y lacZ en las deleciones de los genes TK y US2, respectivamente. El segundo virus intermedio, S-4EHV-006, se construyó utilizando el vector de homología 523-38.9 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-005 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato lacZ). El virus resultante tiene deleciones en los genes TK y US2 y una inserción del gen uidA en la deleción del gen TK. El tercer virus intermedio, S-4EHV-007, se construyó utilizando el vector de homología 593-31.2 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-006 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia azul (sustrato lacZ). El virus resultante tiene deleciones en los genes TK, US2 y gpE e inserciones de los genes uidA y lacZ en las deleciones de los genes TK y gpE, respectivamente. El cuarto virus intermedio, S-4EHV-009, se construyó utilizando el vector de homología 580-57.25, en el que se había insertado el gen gpB del EHV-1, y el virus S-4EHV-007 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. Obsérvese que el gen gpB del EHV-1 está clonado como un subfragmento entre FspI y ClaI de aproximadamente 3665 pares de bases de un fragmento PstI de aproximadamente 5100 pares de bases del EHV-1 (43). La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato lacZ). El virus resultante tiene deleciones en los genes TK, US2 y gpE e inserciones de los genes uidA y gpB del EHV-1 en las deleciones de los genes TK y gpE, respectivamente. Finalmente, se construye el S-4EHV-010 utilizando el vector de homología 495-61.39, en el que se inserta el gen gpD del EHV-1, y el virus S-4EHV-009 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. Obsérvese que el gen gpD del EHV-1 está clonado como un subfragmento entre SmaI y EcoRV de aproximadamente 1929 pares de bases del fragmento BamHI D de aproximadamente 10500 pares de bases del EHV-1 (1). La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato uidA). Este virus se utiliza en una vacuna para proteger a los caballos de la infección con el EHV-1 y el EHV-4. La deleción del gen de la glicoproteína E de este virus proporciona un marcador serológico negativo para diferenciarlo del EHV-1 y el EHV-4 salvajes.
Ejemplo 17 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-011
Se han publicado virus de la viruela recombinantes que codifican los genes de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) de los virus de la gripe que median inmunidad protectora frente a la infección con el virus de la gripe homólogo (5, 44). La liberación de los antígenos HA y NA de varios subtipos del virus de la gripe equina a través de virus EHV recombinantes se utiliza para proporcionar inmunidad protectora frente al virus de la gripe equina además del virus del herpes equino.
El S-4EHV-011, un EHV-4 recombinante con deleciones en los genes TK, US2 y gpE y con los genes de la hemaglutinina y neuraminidasa de la Influenza A/equine/Prague/56 del aislado de la gripe equina insertados en lugar del gen gpE, se construye de la siguiente manera. El S-4EHV-011 proviene del S-4EHV-023 a través de la construcción de un virus intermedio. El S-4EHV-023 se construyó utilizando el vector de homología 616-40 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-006 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato uidA). El virus intermedio, S-4EHV-008, se construyó utilizando el vector de homología 593-20.5 (véase Materiales y Métodos) y el virus S-4EHV-023 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia azul (sustrato uidA). El virus resultante tiene deleciones en los genes TK, US2 y gpE y una inserción de uidA en la deleción del gen gpE. Finalmente, se construye el S-4EHV-011 utilizando el vector de homología 580-57.25, en el que se insertaron los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Prague/56 de la gripe equina, y el virus S-4EHV-008 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. Obsérvese que los genes del virus de la gripe se clonaron utilizando las técnicas descritas en la sección de Materiales y Métodos. El gen de la hemaglutinina se colocó bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV y el gen de la neuraminidasa se colocó bajo el control del promotor gpX del PRV. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato uidA). Este virus se utiliza en vacunas para proteger a los caballos de la infección con el EHV-4 y el virus de la gripe equina. Una vacuna eficaz requiere antígenos de varias cepas de la gripe diferentes. Esto se lleva a cabo mediante la construcción de virus recombinantes múltiples que expresen HA y NA de varias cepas de la gripe diferentes (véanse los Ejemplos 18-20). Una vacuna más eficaz se formula mezclando este virus recombinante con los descritos en los Ejemplos 18-20.
Ejemplo 18 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-012
El S-4EHV-012, un EHV-4 recombinante con deleciones en los genes TK, US2 y gpE y con los genes de la hemaglutinina y neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Miami/63 de la gripe equina insertados en lugar del gen gpE, se construye de la siguiente manera. El S-4EHV-012 proviene del S-4EHV-023 (véase el Ejemplo 16) a través de la construcción de un virus intermedio. El virus intermedio, S-4EHV-008, se construyó como se describe en el Ejemplo 17. El S-4EHV-012 se construye utilizando el vector de homología 580-57.25, en el que se han insertado los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Miami/63 de la gripe equina, y el virus S-4EHV-008 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. Obsérvese que los genes del virus de la gripe se clonaron utilizando las técnicas descritas en la sección de Materiales y Métodos. El gen de la hemaglutinina se colocó bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV y el gen de la neuraminidasa se colocó bajo el control del promotor gpX del PRV. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato uidA). Este virus se utiliza en una vacuna para proteger a los caballos de la infección por el EHV-4 y el virus de la gripe equina. Una vacuna más eficaz se formula mezclando este virus recombinante con los descritos aquí en los Ejemplos 17, 19 y 20.
Ejemplo 19 Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-013
El S-4EHV-013, un EHV-4 recombinante con deleciones en los genes TK, US2 y gpE y con los genes de la hemaglutinina y neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Kentucky/81 de la gripe equina insertados en lugar del gen gpE, se construye de la siguiente manera. El S-4EHV-013 proviene del S-4EHV-023 (véase el Ejemplo 16) a través de la construcción de un virus intermedio. El virus intermedio, S-4EHV-008, se construyó como se describe en el Ejemplo 17. El S-4EHV-013 se construye utilizando el vector de homología 580-57.25, en el que se insertan los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Kentucky/81 de la gripe equina, y el virus S-4EHV-008 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. Obsérvese que los genes del virus de la gripe se clonaron utilizando las técnicas descritas en la sección de Materiales y Métodos. El gen de la hemaglutinina se colocó bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV y el gen de la neuraminidasa se colocó bajo el control del promotor gpX del PRV. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato uidA). Este virus se utiliza en una vacuna para proteger a los caballos de la infección por el EHV-4 y el virus de la gripe equina. Una vacuna más eficaz se formula mezclando este virus recombinante con los descritos aquí en los Ejemplos 17, 18 y 20.
Ejemplo 20
Preparación del virus del herpes equino recombinante designado S-4EHV-014
El S-4EHV-014, un EHV-4 recombinante con deleciones en los genes TK, US2 y gpE y con los genes de la hemaglutinina y neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Alaska/91 de la gripe equina insertados en lugar del gen gpE, se construye de la siguiente manera. El S-4EHV-014 proviene del S-4EHV-023 (véase el Ejemplo 17) a través de la construcción de un virus intermedio. El virus intermedio, S-4EHV-008, se construyó como se describe en el Ejemplo 17. El S-4EHV-014 se construye utilizando el vector de homología 580-57.25, en el que se insertaron los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Alaska/91 de la gripe equina, y el virus S-4EHV-008 en el PROCEDIMIENTO DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA PARA GENERAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE. Obsérvese que los genes del virus de la gripe se clonaron utilizando las técnicas descritas en la sección de Materiales y Métodos. El gen de la hemaglutinina se colocó bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV y el gen de la neuraminidasa se colocó bajo el control del promotor gpX del PRV. La solución de transfección de reserva se sometió a escrutinio mediante el ESCRUTINIO PARA BUSCAR VIRUS DEL HERPES RECOMBINANTE QUE EXPRESE LOS GENES DE MARCADORES ENZIMÁTICOS, para buscar un virus recombinante de colonia blanca (sustrato uidA). Este virus es utilizable como vacuna para proteger a los caballos de la infección por el EHV-4 y el virus de la gripe equina. Una vacuna más eficaz se formula mezclando este virus recombinante con los descritos aquí en los Ejemplos 17, 18 y 19.
Ejemplo 21 Vacunas que utilizan el EHV para expresar antígenos de microorganismos Streptococcus equi causantes de varias enfermedades
Se ha mostrado que la proteína M (14) juega un papel importante en la respuesta inmune a Streptococcus equi, el agente causante de la enfermedad respiratoria severa Strangles. La liberación de este antígeno a través de un virus EHV recombinante daría como resultado una inmunidad fuertemente protectora sin las secuelas post-vacunales que acompañan frecuentemente a las bacterinas a base del cultivo completo o extracto proteico de Streptococcus equi. Se contempla que los procedimientos que se han utilizado para expresar los genes marcadores (lacZ y uidA) en S-1EHV-002, S-1EHV-003, S-1EHV-004, S-4EHV-002, S-4EHV-003 y S-4EHV-004 y que se describen en la presente, son aplicables para la expresión de este y otros antígenos potenciales de Streptococcus equi.
Los antígenos de los siguientes microorganismos se utilizan para desarrollar vacunas equinas: virus de la anemia infecciosa equina, virus de la encefalitis equina, rinovirus equino, rotavirus equino, artritis viral equina, rabia, adenovirus equino de la neumonía, enfermedad del caballo africano, exantema coital equino, papilomatosis equina, citomegalovirus equino, leptospirosis, tétano, ántrax, colibacilosis, salmonelosis, pasteurelosis, Ehrlichia risticii, enfermedad asociada a brucela, actinomicosis, Taylorella equigenitolia, y enfermedad asociada a micoplasma.
Ejemplo 22 Regeneración del S-4EHV-004 a partir de fragmentos subgenómicos clonados con fragmentos de DNA de un virus salvaje cooperador
El protocolo se utilizó para generar un virus del herpes equino recombinante combinando fragmentos genómicos del EHV clonados en cósmidos y fragmentos genómicos del virus cooperador salvaje que contenía menos de una unidad de formación de colonias. La presencia de DNA genómico del EHV salvaje en la mezcla de transfección aumenta la eficiencia de obtención de un virus del herpes equino recombinante. Se clonaron fragmentos subgenómicos solapantes del DNA de los virus 4EHV-000 (salvaje) y 4EHV-004. El DNA de los subclones de tipo cósmido del 4EHV000 y el 4EHV-004 se sometieron a digestión con las endonucleasas de restricción apropiadas para liberar los insertos del vector de tipo cósmido. La transfección con una mezcla apropiada de estos cinco fragmentos que cubrían todo el genoma del EHV y concentraciones muy bajas de DNA del virus salvaje (menos de una unidad de formación de colonias) dio como resultado la producción del virus 4EHV-004. El cien por cien de los virus en la solución de cotransfección de reserva eran virus recombinantes que llevaban el gen uidA.
Referencias
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53. WO 92/01045
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Cochran Ph.D., Mark D
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Virus del Herpes Equino Recombinantes
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 71
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
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(A)
DESTINATARIO: John P. White
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(B)
CALLE: 30 Rockefeller Plaza
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(C)
CIUDAD: Nueva York
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(D)
ESTADO: Nueva York
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(E)
PAÍS: EE.UU.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 10112
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(v)
FORMA LEÍBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
SOPORTE: Disquete
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(B)
ORDENADOR: PC compatible de IBM
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión #1.25
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(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD EN CURSO:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
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(B)
FECHA DE ARCHIVO:
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(C)
CLASIFICACIÓN::
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN AL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: White, John P
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (212)977-9550
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (212)664-0525
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TELEX: 422523
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1322 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus del herpes equino 1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Dutta
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: S-1 EHV-000
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 432-54.N17
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN El MAPA: -83
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 249.. 1157
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
OTRA INFORMACIÓN: /codón de iniciación= 249
\hskip3cm
/producto= "producto del gen US2" 
\hskip3cm
/gen= "US2" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
1
2
201
200 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
3
300
4 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1252 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus del herpes equino 4
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Dutta
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: S-4EHV-000
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 497-52.53 y 480-18.9
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -83
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 153..1124
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /codón de iniciación= 153
\hskip3cm
/producto= "producto del gen US2" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
5
6
600
7 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 324 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
8
9 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1149 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus del herpes equino 4
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Dutta
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: S-4EHV-000
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-42.A12
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -89
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 271..1149
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 271 
\hskip3cm
/función= "glicoproteína de membrana" 
\hskip3cm
/producto= "Extremo N-terminal de la glicoproteína E" 
\hskip3cm
/gen= "gpE" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID ND:5:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 293 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
12
13 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus del herpes equino 1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Dutta
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: S-1EHV-000
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -83
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= EHV1-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 123." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
14 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus del herpes equino 4
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Dutta
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: S-4ENV-000
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -83
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: XG
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= EHV4-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 123." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
15 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus simple del herpes 1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: 17
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -88
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiquetas HSV1-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 124." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
16 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus simple del herpes 2
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: NG52
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -88
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta* HSV2-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 123." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
17 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus de la pseudorrabia
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: NIA-3
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -90
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= PRV-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 148." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
18 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: gamma-virus del herpes de la enfermedad de Marek
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: RB1B
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -88
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..19
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta* NOV-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 132." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC 10 Nº 12:
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Virus del herpes bovino 1
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CEPA: Cooper
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
AISLADO INDIVIDUAL: S-IBR-000
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
POSICIÓN EN EL MAPA: -85
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
UNIDADES: %G
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: Región
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..18
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /etiqueta= IBR-US2
\hskip3cm
/nota= "Región conservada del gen US2 que comienza en el aminoácido 115." 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
20
2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 450-46.B4 (Figura 4 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 450-46.B4 (Figura 4 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..66
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /producto= "Región del gen de la timidina quinasa del EHV1 suprimido"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
22 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 17:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genérico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 450-46.B4 (Figura 4 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..30
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen de la glicoproteína H del EHV1" 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
24 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 18:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Leu Gly His Gly Phe Het Gly Leu Gin}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 19:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-21.19 (Figura 5 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 20:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-21.19 (Figura 5 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..30
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen US2 del EHV1" 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 33..65
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 33 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen US2 del EHV1" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
26 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 21:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Cys Gly Lys Leu Phe Glu Thr Ile Pro}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 22:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Leu Val Arg Pro Pro Thr Val Lys Arg}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 23:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-21.19 (Figura 5 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
27 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 24:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 536-85.30 (Figura 6 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
28 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 25:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 536-85.30 (Figura 6 Empalme B)
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
29 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 26:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 536-85.30 (Figura 6 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 27:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 495-61.39 (Figura 7 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
31 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 28:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 495-61.39 (Figura 7 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: COS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..24
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen de la timidina quinasa del EHV4 suprimido" 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 46..66
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 46 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen de la timidina quinasa del EHV4 suprimido" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 29:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Asp Asp Ala Ala Leu Ile Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 30:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Glu Ser Leu Leu Pro}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 31:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 495-61.39 (Figura 7 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..33
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen de la glicoproteína H del EHV4" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 32:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Pro Pro Arg Arg Arg Leu Glu Pro Pro}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 33:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-38.9 (Figura 8 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 33:
34 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 34:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-38.9 (Figura 8 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..33
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/producto= "Región del gen US2 del EHV4 suprimido" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 34:
35 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 35:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Pro Tyr His Leu Trp Val Leu Gly Ala Ala}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 36:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-38.9 (Figura 8 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 36:
36 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 37:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 530-57.25 (Figura 9 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 37:
37 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 38:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 580-57.25 (Figura 9 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 38:
38 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 39:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 580-57.25 (Figura 9 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 39:
39 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 40:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-22.A12 (Figura 10 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 40:
40 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 41:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-22.A12 (Figura 10 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 16..66
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 16 
\hskip3cm
/producto= "Péptido N-terminal de proteína híbrida" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 41:
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 42:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Het Lys Trp Ala Thr Trp Ile Asp Pro Val Val Leu Gin Arg Arg Asp Trp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 43:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-22.A12 (Figura 10 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..93
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/función= "Final de traducción de la proteína híbrida" 
\hskip3cm
/producto= "Péptido C-terminal" 
\hskip3cm
/nombre estándar= "Traducción de secuencia de DNA sintética" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 43:
42 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 44:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 44:
43 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 45:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 467-22.A12 (Figura 10 Empalme D)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 45:
44 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 46:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-42.A18 (Figura 11 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 46:
45 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 47:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-42.A18 (Figura 11 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 16..66
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 16 
\hskip3cm
/producto= "Péptido N-terminal de proteína híbrida" 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 47:
46 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 48:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Het Lys Trp Ala Thr Trp Ile Asp Pro Val Val Leu Gin Arg Arg Asp Trp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 49:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-42.A18 (Figura 11 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..93
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/función= "Final de traducción de proteína híbrida" 
\hskip3cm
/producto= "Péptido C-terminal" 
\hskip3cm
/nombre estándar= "Traducción de secuencia de DNA sintética" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 49:
47 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 50:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 50:
48 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 51:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 523-42.A18 (Figura 11 Empalme D)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 51:
49 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 52:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 552-45.19 (Figura 12 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 52:
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 53:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 552-45.19 (Figura 12 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 31..66
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 31 
\hskip3cm
/producto= "Péptido N-terminal de proteína híbrida" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 53:
51 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 54:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Het Asn Ser Het Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 55:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 552-45.19 (Figura 12 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..15
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/codón de iniciación= 1 
\hskip3cm
/producto= "Péptido C-terminal de proteína híbrida" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 55:
52 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 56:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gin Gly Gly Lys Gin}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 57:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 552-45.19 (Figura 12 Empalme D)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 57:
53 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 58:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 593-31.2 (Figura 13 Empalme A)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 58:
54 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 59:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 593-31.2 (Figura 13 Empalme B)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: COS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 16..66
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/producto= "Péptido N-terminal de proteína híbrida" 
\hskip3cm
/gen= "16" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 59:
55 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 60:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Het Lys Trp Ala Thr Trp Ile Asp Pro Val Val Leu Gin Arg Arg Asp Trp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 61:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 593-31.2 (Figura 13 Empalme C)
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1..93
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /parcial
\hskip3cm
/producto= "Péptido C-terminal de proteína híbrida" 
\hskip3cm
/gen= "1" 
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 61:
56 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 62:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 62:
\vskip1.000000\baselineskip
57 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 63:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGTCGACAT GAAGACAACC ATTATTTTGA TAC 
\hfill
33 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 64:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: circular
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Plásmido
\vskip0.666000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CLON: 593-31.2 (Figura 13 Empalme D)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 64:
58 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 65:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGTCGACTC AAATGCAAAT GTTGCATCTG AT 
\hfill
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 66:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGATCCATG AACACTCAAA TTCTAATATT AG 
\hfill
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 67:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGATCCTTA TATACAAATA GTGCACCGCA 
\hfill
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 68:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGATCCTTA TATACAAATA GTGCACCGCA 
\hfill
30 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 69:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGTGGACTT ACATCTTATC GATGTCAAA 
\hfill
29 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 70:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 70:
59 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 71:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Oligonucleótido cebador sintético
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GGGATCCTTA CGAAAAGTAT TTAATTTGTG 
\hfill
31

Claims (33)

1. Un virus del herpes equino recombinante vivo que comprende el DNA genómico del virus del herpes equino 1 (EHV-1) ó 4 (EHV-4) del cual se ha suprimido una secuencia de DNA del gen US2, que se muestra para el EHV-1 en la SEC ID Nº 1 y para el EHV-4 en la SEC ID Nº 3, inactivando dicho gen US2.
2. El virus del herpes de la reivindicación 1 que comprende al menos una deleción más de una secuencia de DNA.
3. El virus del herpes de la reivindicación 2, en el que la secuencia de DNA se suprime del gen que codifica la timidina quinasa (TK), del gen que codifica la glicoproteína E (gpE), del gen que codifica la glicoproteína G (gpG), y/o del gen que codifica la glicoproteína grande de membrana (MGP).
4. El virus del herpes de la reivindicación 1-3 que contiene además una secuencia de DNA ajeno insertada en él.
5. El virus del herpes de la reivindicación 4 en el que la secuencia de DNA ajeno codifica un marcador detectable.
6. El virus del herpes de la reivindicación 5 en el que el marcador detectable es la \beta-galactosidasa.
7. El virus del herpes de la reivindicación 4 en el que el DNA ajeno es de un virus de la gripe equina.
8. El virus del herpes de la reivindicación 4, en el que el DNA ajeno es de un gen que codifica la glicoproteína B (gpB) del virus del herpes equino 1 (EHV-1) o la glicoproteína D (gpD) del EHV-1.
9. El virus del herpes de la reivindicación 7 en el que el DNA ajeno es de los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Prague/56 del virus de la gripe equina.
10. El virus del herpes de la reivindicación 7, en el que el DNA ajeno es de los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Miami/63 del virus de la gripe equina.
11. El virus del herpes recombinante vivo de la reivindicación 7 en el que el DNA ajeno es de los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Kentucky/81 del virus de la gripe equina.
12. El virus del herpes equino de la reivindicación 7, en el que el DNA ajeno es de los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa del aislado Influenza A/equine/Alaska/91 del virus de la gripe equina.
13. El virus del herpes de la reivindicación 4 que tiene una deleción en el gen US2 y que tiene una secuencia de DNA que codifica la \beta-galactosidasa de E. coli insertada en el lugar de la deleción del gen US2.
14. El virus del herpes de la reivindicación 13 que tiene también una deleción en el gen que codifica la TK.
15. El virus del herpes de la reivindicación 13 en el que se suprimen también el gen gpG y una porción del gen MGP.
16. El virus del herpes de la reivindicación 14 en el que se suprimen también el gen gpG y una porción del gen MGP.
17. El virus del herpes de la reivindicación 3 que tiene una deleción en el gen que codifica la TK y en el gen que codifica la gpE.
18. El virus del herpes de la reivindicación 17 que tiene un secuencia de DNA que codifica la gpB del EHV-1 insertada en el lugar de la deleción del gpE y la gpD del EHV-1 insertada en el lugar de la deleción del TK.
19. El virus del herpes de la reivindicación 17 que tiene un secuencia de DNA del gen de la hemaglutinina y la neuraminidasa de un virus de la gripe equina insertada en el lugar de la deleción del gpE.
20. El virus del herpes de la reivindicación 19 en el que los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa son del aislado Influenza A/equine/Prague/56 del virus de la gripe equina.
21. El virus del herpes de la reivindicación 19 en el que los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa son del aislado Influenza A/equine/Miami/63 del virus de la gripe equina.
22. El virus del herpes de la reivindicación 19 en el que los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa son del aislado Influenza A/equine/Kentucky/81 del virus de la gripe equina.
23. El virus del herpes de la reivindicación 19 en el que los genes de la hemaglutinina y la neuraminidasa son del aislado Influenza A/equine/Alaska/91 del virus de la gripe equina.
24. El virus del herpes de la reivindicación 13 designado por el Nº de Acceso de la ATCC VR 2363 (S-4EHV-003).
25. El virus del herpes de la reivindicación 14 designado por el Nº de Acceso de la ATCC VR 2362 (S-4EHV-002).
26. El virus del herpes de la reivindicación 14 designado por el Nº de Acceso de la ATCC VR 2360 (S-1EHV-004).
27. El virus del herpes de la reivindicación 15 designado por el Nº de Acceso de la ATCC VR 2358 (S-1EHV-002).
28. El virus del herpes de la reivindicación 16 designado por el Nº de Acceso de la ATCC VR 2359 (S-1EHV-003).
29. El virus del herpes de la reivindicación 18 designado S-4EHV-010 construido como se describe en el Ejemplo 16.
30. El virus del herpes de la reivindicación 20 designado S-4EHV-011 construido como se describe en el Ejemplo 17.
31. El virus del herpes de la reivindicación 21 designado S-4EHV-012 construido como se describe en el Ejemplo 18.
32. El virus del herpes de la reivindicación 22 designado S-4EHV-013 construido como se describe en el Ejemplo 19.
33. El virus del herpes de la reivindicación 23 designado S-4EHV-014 construido como se describe en el Ejemplo 20.
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