ES2201078T3

ES2201078T3 - Metodos de aislar antigenos presentados por cd1, vacunas que comprenden antigenos presentados por cd1, y lineas celulares para usar en dichos metodos.

Info

Publication number: ES2201078T3
Application number: ES94920784T
Authority: ES
Inventors: Steven A. Porcelli; Michael B. Brenner; Evan Beckman
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1993-06-21
Filing date: 1994-06-21
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: DE69433115D1; EP0751780B1; DE69433115T2; CA2165786A1; JP2006104206A; DK0751780T3; WO1995000163A1; ATE248602T1; EP0751780A1; EP0751780A4; JPH08511939A

Abstract

ESTA INVENCION ESTA BASADA EN LA OBSERVACION DE LAS FUNCIONES DE LOS CD1 PARA PRESENTAR ANTIGENOS EXTRAÑOS Y AUTOINMUNES A UNA SUBPOBLACION SELECTA DE CELULAS T. BASANDOSE EN ESTA OBSERVACION, SE PROPORCIONAN METODOS PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANTIGENO CON CD1 EN UNA MUESTRA, METODOS PARA DEPURAR ANTIGENOS CON CD1, VACUNAS QUE CONTIENEN ANTIGENOS CON CD1, METODOS PARA BLOQUEAR LA PRESENCIA DE ANTIGENOS CD1, METODOS PARA IDENTIFICAR Y/O AISLAR AGENTES DE BLOQUEO DE LOS ANTIGENOS CD1, METODOS PARA INDUCIR LA EXPRESION DE CD1 Y LINEAS DE CELULAS T PARA USAR EN ESTOS METODOS. LOS ANTIGENOS CON CD1 REFERIDOS, A DIFERENCIA DE LOS ANTIGENOS CON MHC, SON ANTIGENOS HIDROFOBICOS NO POLIPEPTIDICOS. CONCRETAMENTE EL ANTIGENO CON CD1-B AISLADO A PARTIR DE ESPECIES BACTERIANAS ES UN ACIDO MICOLICO.

Description

Métodos de aislar antígenos presentados por CD1, vacunas que comprenden antígenos presentados por CD1, y líneas celulares para usar en dichos métodos.

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud es una solicitud de continuación en parte de la solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/080.072, presentada el 21 de junio de 1993, que es una solicitud de continuación en parte de la solicitud de EE.UU. Nº de serie 07/989.790, presentada el 10 de diciembre de 1992, ambas actualmente abandonadas.

Campo de la invención

La invención aquí descrita se dirige a métodos para detectar la presencia de un antígeno presentado por CD1 en una muestra, métodos para aislar antígenos presentados por CD1 a partir de una muestra, vacunas que comprenden antígenos presentados por CD1 y líneas celulares útiles para el aislamiento, identificación y caracterización de antígenos presentados por CD1. Los antígenos presentados por CD1 de la invención, como los antígenos presentados por MHC, estimulan las células T TCR \alpha:\beta para que sufran una respuesta proliferativa. Sin embargo, a diferencia de los antígenos presentados por MHC, los antígenos presentados por CD1 son antígenos hidrófobos no polipeptídicos. En particular, un antígeno presentado por CD1b, aislado de especies de Mycobacteria, comprende un ácido micólico.

Descripción de los antecedentes de la técnica El sistema inmunitario y las células T

Los animales tienen un sistema complejo de defensas moleculares y celulares, denominadas colectivamente sistema inmunitario, que reconocen y atacan células extrañas o endógenas pero anormales, potencialmente nocivas (representadas respectivamente por, p.ej., patógenos, como bacterias o virus, y células cancerosas o infectadas por patógenos), pero toleran las células normales endógenas. Cuando se estimula mediante biomoléculas extrañas o anormales, el sistema inmunitario experimenta una serie de actividades diseñadas para neutralizar y destruir los patógenos, o las células cancerosas o infectadas por patógenos, con las cuales se asocian las biomoléculas extrañas o anormales. Estas actividades, conocidas colectivamente como respuesta inmunitaria, pueden consistir en una respuesta inmunitaria celular, una respuesta inmunitaria humoral (mediada por anticuerpos), o una respuesta inmunitaria que incluye elementos de respuestas celulares y humorales.

Las respuestas inmunitarias humorales están mediadas por anticuerpos, glicoproteínas que se unen específicamente a biomoléculas extrañas o anormales. Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina (Ig) producidas por células B, linfocitos que se originan en la bolsa aviar o en la médula ósea de mamíferos pero migran a otros órganos y maduran en ellos, particularmente en el bazo. Robertson, M., Nature 301: 114 (1983). Las respuestas inmunitarias celulares son el resultado de actividades de las células T, linfocitos que experimentan maduración en el timo de un animal. Tizard, I.R., Immunology: An Introduction, 2ª edición, Saunders, Philadelphia (a partir de aquí "Tizard"), pág. 163, 1988. Tanto las células T como las células B migran entre varios órganos y/o tejidos dentro del cuerpo de un animal. Lydyard, P., y Grossi, C., Capítulo 3 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al., Editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989.

Las células T median al menos dos tipos generales de funciones inmunológicas, efectora y reguladora, reflejando el hecho de que las actividades de las células T varían considerablemente entre diferentes subpoblaciones de células T en un animal. Rook, G., Capítulo 9 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al., editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Las funciones efectoras incluyen hipersensibilidad retrasada, rechazo de alotrasplantes, inmunidad tumoral, y reactividad de injerto contra el hospedador. Las funciones efectoras reflejan la capacidad de algunas células T para secretar proteínas llamadas linfoquinas, y la capacidad de otras células T (células T "citotóxicas" o "asesinas") para matar a otras células. Las funciones reguladoras de las células T están representadas por la capacidad de las células T "auxiliares". Las células T auxiliares interaccionan con, y producen biomoléculas que influencian el comportamiento, tanto de las células B como de las células T citotóxicas, a fin de promover y dirigir la producción de anticuerpos y las actividades citotóxicas, respectivamente. Mosier, D. E., Science 158: 1573-1575 (1967). Existen también otras clases de células T, incluyendo células T supresoras y células T de memoria. Miedema, F., y Melief, C.J.M., Immunol. Today 6: 258-259 (1983); Tizard, págs. 225- 228.

Las clases de células T se distinguen, hasta cierto punto, basándose en que distintas células T presentan diferentes proteínas CD sobre su superficie. Las células T inmaduras presentan tanto proteínas CD4 como CD8 (es decir, las células T inmaduras son CD4^{+}8^{+}), las células T auxiliares maduras son CD4^{+}8^{-} (es decir, presentan la proteína CD8 pero no la CD4). Smith, L., Nature 326: 798-800 (1987); Weissman, I.L., y Cooper, M.D., Sci. American 269: 65-71 (1993).

Reconocimiento del antígeno

A fin de funcionar adecuadamente, las células T y B del sistema inmunitario de un animal tienen que identificar adecuada y fiablemente el enorme número de composiciones moleculares procedentes de composiciones extrañas ("no propias"), o endógenas ("propias") pero expresadas anormalmente, que se encuentran. El reconocimiento e identificación por el sistema inmunitario se produce a escala molecular. Un antígeno, una composición molecular que tiene el potencial de generar una respuesta inmunitaria, está compuesto por una o más características identificadoras de tamaño molecular conocidas como epítopes. Un antígeno polipeptídico que tiene una secuencia aminoácida que comprende, p.ej. cien aminoácidos, puede comprender docenas de epítopes, en las que cada epítope está definido por una porción del polipéptido que comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 25 aminoácidos. El número de epítopes derivables de polipéptidos solamente, se estima que es aproximadamente diez millones. Tizard, pág. 25.

Un antígeno encontrado por una célula T o B de un animal se tiene que identificar, bien como asociado con antígenos endógenos (es decir, propios) normales, frente a los cuales una respuesta inmunitaria sería nociva para el animal, o con antígenos extraños o anormales (es decir, no propios), frente a los cuales se debería generar una respuesta inmunitaria. Como parte de los medios del sistema inmunitario para identificar antígenos, las células T y B producen receptores antigénicos que se presentan sobre la superficie de las células T o B y a los que se unen antígenos específicos. Turner, M., capítulo 5 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al., editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Las células B producen y presentan receptores antigénicos que comprenden moléculas de Ig que tienen porciones de unión a antígeno exclusivas, debido a las secuencias aminoácidas exclusivas en las regiones variables de cada una de las dos subunidades del anticuerpo, conocidas como cadenas pesada y ligera de Ig. Cada membrana de célula B comprende de 20.000 a 200.000 moléculas de Ig idénticas. Tizard, págs. 78-80 y 202.

Los receptores antigénicos de células T (TCRs) producidos por células T individuales y presentados sobre las mismas, comprenden cadenas pesada (TCR\beta) y ligera (TCR\alpha) (subunidades polipeptídicas) que están unidas por un puente disulfuro sobre la superficie de la célula T. Cada subunidad \alpha y \beta de TCR tiene una región carboxilo-terminal constante, cuya secuencia aminoácida no varía entre distintas células T, y una región amino-terminal variable, cuya secuencia aminoácida varía entre distintas células T. Cuando las subunidades TCR\alpha y TCR\beta se asocian entre sí, las regiones variables de las subunidades polipeptídicas TCR\alpha y TCR\beta se combinan para formar la porción de unión a antígeno exclusiva de un TCR \alpha:\beta. Se ha descrito un segundo tipo de heterodímero TCR, \gamma:\delta, pero su función, en el caso de que la tenga, se desconoce. Davis, M. M., y Bjorkman, P. J., Nature 334: 395-404 (1988). Aunque se ha descrito al menos un heterodímero TCR mixto de función desconocida, TCR \beta:\delta, las células T que llevan moléculas TCR \alpha:\beta son numéricamente dominantes en animales maduros. Hochstenbach, F., y Brenner, M.B., Nature 340: 562-565 (1989).

Aunque cada célula T o B individual presenta receptores antigénicos idénticos, el receptor presentado varía de célula a célula, por tanto una colección de diferentes receptores antigénicos de un animal es bastante diversa. La base genética de esta diversidad es la siguiente: la región variable de una cadena pesada de Ig, o la de una cadena TCR\beta, se codifica por tres segmentos génicos, los segmentos variable (V), de diversidad (D) y de unión (J). La región variable de una cadena ligera de Ig, o la de una cadena TCR\alpha, se codifica mediante segmentos génicos V y J. En el DNA de la línea germinal están presentes múltiples secuencias de DNA que codifican muchos segmentos génicos V, D y J diferentes, como copias sin expresar; también está presente una colección análoga pero diferente de segmentos génicos variables para subunidades de TCR. Durante el desarrollo de un animal, se producen genes que codifican diversas regiones variables en células individuales del sistema inmunitario mediante la unión aleatoria de segmentos génicos V, D y J, o V y J. El procedimiento de reagrupamientos de DNA que produce una región variable ensamblada aleatoriamente de una subunidad pesada de Ig o TCR\beta; se denomina unión V-D-J; el procedimiento análogo que produce una región variable reagrupada de una subunidad ligera o TCR\alpha se denomina unión V-J. Sakano, H., et al., Nature 280: 288-294 (1979); Early, P., et al., Cell 19: 981-992 (1980); Alt, F.W., et al., Science 238: 1079-1087 (1987); Harlow, E., y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, páginas 10-18, 1988; Davis, M.M., y Bjorkman, P.J., Nature 334: 395-404 (1988).

Un gen de una subunidad TCR o de Ig reagrupado funcionalmente es aquel en el cual los reagrupamientos de DNA de unión V-D-J o V-J no han producido un marco de lectura que termine prematuramente debido a la introducción de codones de parada o mutaciones por cambio de marco. Debido a que cada célula T o B del sistema inmunitario expresa genes que codifican sus receptores antigénicos respectivos en los que está presente una región variable reagrupada funcionalmente exclusiva, se generan muchas células T o B diferentes, produciendo cada una un receptor que tiene una región de reconocimiento de antígeno exclusiva. Hay, F., capítulo 6 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al., editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. El catálogo total de diferentes receptores antigénicos presentados sobre las células T de un animal, se denomina el repertorio TCR de un animal. Bevan, M.J., et al, Science 264: 796-797 (1994).

Para células T o B maduras, la unión del antígeno a un receptor antigénico celular activa la célula, es decir, estimula la célula para que asuma actividades relacionadas con la producción de una respuesta inmunitaria celular o humoral. Típicamente, las células T o B maduras activadas proliferan en respuesta al antígeno. Por contraste, para las células T o B inmaduras, la unión del antígeno a un TCR o un receptor antigénico presentado de célula B, respectivamente, produce la eliminación de la célula mediante un procedimiento llamado selección negativa o deleción clonal. La deleción clonal se produce durante el desarrollo normal de un animal silvestre sano, y es un mecanismo mediante el cual el sistema inmunitario aprende a tolerar los antígenos endógenos (propios) normales del animal, es decir, a tratar los autoantígenos del animal como antígenos no inmunogénicos. El fallo del sistema inmunitario para conseguir o mantener la tolerancia de los autoantígenos puede producir respuestas autoinmunes (es decir, respuestas autoinmunes a los autoantígenos) que pueden culminar en una enfermedad autoinmune en animales, incluyendo los seres humanos. Una enfermedad autoinmune se puede producir cuando una respuesta inmunitaria apropiada a un antígeno no propio origina la producción de biomoléculas efectoras inmunes (p.ej. autoanticuerpos) o células que producen una reacción cruzada con los antígenos propios. Las enfermedades autoinmunes humanas incluyen estados incapacitantes como la esclerosis múltiple (MS) y el lupus eritematoso sistémico (SLE). Roitt, I., capítulo 23 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al, editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989; Steinman, L., Sci. American 269: 107-114 (1993).

Presentación del antígeno

Aunque los receptores antigénicos de las células B se pueden unir directamente al antígeno soluble, las células T responden típicamente al antígeno sólo cuando se presenta sobre clases específicas de otras células conocidas genéricamente como células presentadoras de antígeno (APCs). Feldmann, M., y Male, D., capítulo 8 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al, editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Las APCs, p.ej., macrófagos y células dendríticas, presentan antígenos derivados de polipéptidos a través de glicoproteínas, conocidas como proteínas MHC (complejo mayor de histocompatibilidad), que se presentan sobre la superficie de las APCs. Bevan, M.J., et al., Science 264: 796-797 (1994). La nomenclatura para los productos génicos del MHC varía entre las especies. Por ejemplo, las proteínas de MHC humano se denominan también antígenos de linfocito humano (HLA), las proteínas del MHC murino se denominan también antígenos H-2, y las proteínas del MHC de rata se llaman también antígenos RT1. Tizard, pág. 181. Las proteínas de MHC particulares se unen a clases seleccionadas de antígenos con especificidad limitada. Para la mayor parte, los determinantes de especificidad en un complejo TCR:Ag:MHC son (1) las secuencias polipeptídicas exclusivas de la parte variable del TCR y (2) las secuencias polipeptídicas exclusivas del antígeno. Sin embargo, hasta cierto punto, los antígenos oligopeptídicos presentados por MHC están incluidos en una molécula del MHC y el reconocimiento del antígeno por parte del TCR sólo se produce en el contexto de una clase apropiada de molécula del MHC. Janeway, C.A., Sci American 269: 73-79 (1993). Este fenómeno, llamado restricción del MHC, tiene una importancia fundamental para el reconocimiento antigénico y la fisiología de las células T. Zinkernagel, R.M., y Doherty, P.C., Nature 248: 701-702 (1974).

En la presentación de antígenos mediada por el MHC, el receptor antigénico \alpha:\beta de la célula T reconoce los antígenos peptídicos conjuntamente con productos de genes del MHC. En el caso de antígenos solubles, el reconocimiento se produce conjuntamente con moléculas de clase II. Para antígenos virales, el reconocimiento se produce conjuntamente con moléculas de clase I. Adicionalmente, los antígenos solubles grandes se elaboran a partir de polipéptidos mediante una célula accesoria apropiada, como un macrófago o célula dendrítica.

La secuencia general de acontecimientos implicados en el reconocimiento por de antígenos polipeptídicos en la restricción de MHC parte de la célula T, se produce como se indica a continuación. Un antígeno polipeptídico es fagocitado por una célula presentadora de antígeno, introducido en su interior, tratado y, a continuación, un péptido derivado del polipéptido se presenta sobre la superficie celular conjuntamente con moléculas del MHC de clase I o II. A fin de presentar el antígeno, las moléculas de clase I del MHC requieren una proteína adicional, la \beta_{2}-microglobulina. Tizard págs. 181-183. A continuación, un receptor antigénico heterodímero \alpha:\beta de la célula T reconoce el antígeno peptídico junto con el producto génico del MHC. El reconocimiento del péptido antigénico solo o del producto génico del MHC solo, no es suficiente para dar la señal de activación de la célula T. Sólo el complejo MHC:Ag se puede reconocer apropiadamente por una molécula de TCR. Steward, M., capítulo 7 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al, editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989.

Los genes que codifican proteínas del MHC son diversos; sin embargo, a diferencia de las moléculas de Ig y TCR, que varían entre las distintas células en un animal individual, los antígenos de MHC varían entre animales individuales o entre un grupo y otro de animales individuales relacionados. Los miembros de grupos familiares, representados en el ratón por cepas consanguíneas de ratones, comparten antígenos de MHC similares entre sí, pero no con individuos de otras cepas de ratones. Snell, G.D., Science 213: 172-178 (1981); Owen, M., capítulo 4 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al., editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Debido a que las variantes de moléculas del MHC serán susceptibles de unirse a diferentes antígenos, los antígenos que las células T serán susceptibles de reconocer (es decir, de unirse específicamente a ellos en el contexto del MHC) y a los que responderán, varía entre las diferentes cepas de ratones. Cooke, A., capítulo 11 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al, editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. En seres humanos, los alelos génicos particulares que codifican moléculas de MHC (HLA) están asociados más estrechamente con enfermedades autoinmunes, presumiblemente porque esas moléculas de MHC son más competentes para unirse a (y por tanto presentar a células T) autoantígenos. Vaughan, en Immunological Diseases, 3ª edición, Vol. II, editorial Samter, M., págs. 1029-1037 (1978); Steinman, L., Sci. American 269: 107-114 (1993).

Células T doblemente negativas

Generalmente, los linfocitos T CD8^{+} reconocen los complejos de clase I del MHC, mientras que las células CD4^{+} reconocen los complejos de clase II del MHC, sobre células presentadoras de antígeno. La implicación de CD8 y CD4 en el reconocimiento antigénico por TCRs \alpha:\beta es significativa. Las moléculas de CD4 y CD8 incrementan la avidez de la interacción entre TCR y complejos Ag:MHC y se denominan algunas veces correceptores (Bierer, B.E., et al., Ann. Rev. Immunol. 7: 579-599 (1989); Steward, M., capítulo 7 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al, editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989). Debido a la importancia de CD4 y CD8 en el reconocimiento del antígeno en el contexto del MHC, las células T CD4^{-}CD8^{-} (doblemente negativas; DN) se ha considerado clásicamente que son precursores tímicos inmaduros de células T. Lydyard, L. y Gossi, C., capítulos 2 y 14 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I., et al., editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989; Smith, L. Nature 326: 798-800 (1987); Strominger, J.L., et al., Int. J. Cancer Suppl. 4: 43-47 (1989); Shirai, T., et al., J. Immunology 144: 3756-3761 (1990); Weissman, I.L. y Cooper, M.D., Sci. American 269: 65-71 (1993).

La subpoblación DN de células T es distintiva, respecto a los TCRs que presentan. La mayoría de las células T DN aisladas de la sangre periférica expresan TCRs \delta:\gamma;. Porcelli, S., et al., Immunological Reviews 120: 137-183 (1991). Una gran proporción (aproximadamente 60%) de células T de TCR \alpha:\beta DN expresan productos génicos V\beta8 (Fowlkes, B.J., et al., Nature 329: 251-254 (1987); Bix, M., et al., J. Exp. Med. 178: 901-908 (1993)). Varios análisis en ratones apuntan a una falta sorprendente de diversidad de unión (V-J o V-D-J) y al uso restringido de elementos génicos V y J de la línea germinal, especialmente para las subunidades TCR\alpha. Koseki, H., et al., J. Immunol. 149: 1143-1150 (1992). El examen de células T de TCR \alpha:\beta DN reveló un predominio sorprendente de un reagrupamiento V\alpha24-J\alphaQ invariable (canónico), que carecía de adiciones de región N. Porcelli, S., et al., J. Exp. Med. 178: 1-16 (1993). Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren que las células T de TCR \alpha:\beta DN pueden representar una subpoblación de linfocitos T distinta en cuanto a su desarrollo, cuyo repertorio limitado de receptores refleja el reconocimiento de un conjunto restringido de antígenos y/o moléculas presentadoras de antígeno.

Proteínas CD1

Las moléculas polipeptídicas codificadas por genes del locus CD1 son reconocidas por determinados clones de células T CD4^{-}8^{-} que expresan TCRs, bien \alpha:\beta o \gamma:\delta (Porcelli, S., et al, Nature 341: 447-450 (1989); Faure, F., et al, Euro. J. Immunol. 20: 703-706 (1990)). Debido al parecido estructural de las moléculas CD1, codificadas por genes sobre el cromosoma humano 1, y las moléculas del MHC, codificadas por genes sobre el cromosoma humano 6 (Calabi, F. y Milstein, C., Nature 323: 540-543 (1986); Balk, S.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 252-256 (1989)), se ha sugerido que CD1 puede representar una familia de moléculas presentadoras de antígeno separada de aquellas codificadas por los genes del MHC. Porcelli, S., et al., Nature 341: 447-450 (1989); Strominger, J.L., Cell 57: 895-898 (1989); Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137-183 (1991).

Los cinco genes CD1 presentan un exón y una estructura de dominios (\alpha1, \alpha2, \alpha3), que es similar a la de los genes de clase I del MHC, pero las proteínas están relacionadas en su secuencia sólo lejanamente. Todos los miembros de la familia CD1 comparten un dominio \alpha3 conservado; sin embargo, incluso este dominio muestra sólo 32% de homología en su secuencia de aminoácidos con los residuos consenso de los dominios \alpha3 del MHC de clase I y no existe homología detectable con los dominios \alpha1. Una diferencia principal entre las moléculas del MCH y de CD1 es el polimorfismo. Los genes del MHC humano son extremadamente polimórficos: se han descrito múltiples alelos en cada locus del MHC conocido. Por contraste, los genes CD1 son aparentemente no polimóficos. A pesar de estas diferencias, las proteínas CD1, como las moléculas de clase I de MHC, se expresan como subunidades grandes (cadenas pesadas) asociadas no covalentemente con la \beta_{2}-microglobulina. Van Agthoven, A., y Terhorst, C., J. Immunol. 128: 426-432 (1982); Terhorst, C.,et al., Cell 23: 771-780 (1981)).

Se han identificado hasta el momento cinco genes CD1 en humanos: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e. Cuatro de los cinco productos génicos CD1 definidos serológicamente, se denominan CD1a, CD1b, CD1c y CD1d y se distinguen por cadenas pesadas exclusivas con pesos moleculares aproximados de 49kDa, 45kDa, 43 kDa y 48 kDa, respectivamente (Amiot, M., et al, J. Immunol. 136: 1752-1758 (1986); Porcelli, S., et al., Immunol. Rev. 120: 137-183 (1991); Bleicher, P.A., et al., Science 250: 679-682 (1990)). Las proteínas CD1 se presentan sobre varias APCs, incluyendo las células de Langerhans (que son las principales células dendríticas presentadoras de antígeno en la piel), células B activadas, células dendríticas en los ganglios linfáticos, y sobre los monocitos sanguíneos activados (Porcelli, S., et al., Nature 360: 593-597 (1992); Leukocyte Typing IV, Knapp, W., editorial Oxford University Press, Oxford, U.K., págs. 251-269, 1989; Tissue Antigens, Kissmeyer-Nielsen, F., editorial Munksgard, Copenhagen, Dinamarca, págs. 65-72 (1989).

Los trabajos previos han mostrado que las proteínas CD1 son reconocidas por líneas de células T CD4^{-}8^{-} procedentes de pacientes con SLE. Porcelli, et al., Nature 341: 447-450 (1989). Se lisaron células de leucemia que expresaban proteínas CD1 por células T independientes de la restricción del MHC, aunque no estuviese presente ningún antígeno extraño (no propio). Las células T DN lisaban células leucémicas de forma dependiente de CD1, en ausencia de antígeno. Por tanto, existe la posibilidad de que las proteínas CD1 jueguen un papel en enfermedades autoinmunes.

El dogma central de la inmunología ha sido que el sistema inmunitario no reacciona normalmente frente a sí mismo. La autoinmunidad define un estado en el que la falta de respuesta natural o tolerancia a uno mismo finaliza. Como resultado, los anticuerpos o células reaccionan con constituyentes propios, produciendo por tanto la enfermedad. No existe aún un concepto unificador para explicar el origen y patogénesis de las diversas alteraciones autoinmunes. El proceso de enfermedad puede producirse, entre otras cosas, por linfocitos T sensibilizados. Estos linfocitos producen lesiones tisulares mediante mecanismos poco conocidos que pueden implicar la liberación de linfoquinas destructivas o que atraen otras células inflamatorias hacia la lesión. Para una revisión de autoinmunidad, véase Theofilopoulos, A.N., capítulo 11 en Basic and Clinical Immunology, 6ª edición, Stites, D.P., et al., Appleton y Lang editores, 1987.

Micobacterias y ácidos micólicos

Las Micobacterias son un género de organismos bacterianos intracelulares que, tras la invasión de su hospedador, sobreviven dentro de compartimentos endosomales de monocitos y macrófagos. Las enfermedades micobacterianas humanas incluyen la tuberculosis (producida por M. tuberculosis), la lepra (producida por M. leprae), las úlceras de Bairnsdale (producidas por M. ulcerans), y diversas infecciones producidas por M. marinum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M. chelonei, M. haemophilium y M. intracellulare. Wolinsky, E., capítulo 37 en Microbiology: Including Immunology and Molecular Genetics, 3ª edición, Harper & Row, Philadelphia, 1980; Daniel, T.M., Miller, R.A., y Freedman, S.D., capítulos 119, 120 y 121, respectivamente, en Harrison's Principles of Internal Medicine, 11ª edición, Braunwald, E. et al., Mc Graw-Hill, editores, New York, 1987. Un tercio de la población mundial alberga M. tuberculosis (M. tb.) y presenta riesgo de desarrollar la tuberculosis (TB), que es responsable específicamente de 18,5% de muertes en adultos de edades entre 15 y 59 años. Bloom, B.R., y Murray, C.J.L., Science 257: 1055-1064 (1992). Aunque la mejora de la sanidad pública y a la terapia con antibióticos, han reducido mucho la aparición y/o gravedad de la TB en Estados Unidos, estas estadísticas alarmantes se desvían enormemente de las de los países del tercer mundo. Desgraciadamente, con la llegada del SIDA, la tuberculosis está aumentando a una velocidad próxima a la logarítmica, están apareciendo cepas resistentes a múltiples fármacos y actualmente suponen un tercio de todos los casos en la ciudad de Nueva York. Bloom, B.R., y Murray, C.J.L. Science 257: 1055-1064 (1992); U.S. Congress, Office of
Technology Assessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis, OTA-H-574, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., 1993. Cepas micobacterianas que se habían considerado previamente cepas no patógenas (p.ej. M. avium), se han convertido ahora en los principales asesinos de pacientes de SIDA inmunosuprimidos. Adicionalmente, las vacunas micobacterianas actuales son, bien inadecuadas, en el caso de la vacuna BCG para M. tb., o no están disponibles, en el caso de M. leprae, Kaufmann, S., Microbiol. Sci. 4: 324-328 (1987); U.S. Congress, Office of Technology Assessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis, págs. 62-67, OTA-H-574, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., 1993.

La respuesta principal a las micobacterias implica reacciones de hipersensibilidad retardada mediadas por células (DTH), jugando las células T y los macrófagos los papeles principales en las muertes intracelulares y la inclusión o encapsulamiento (formación de granuloma) del organismo. Una respuesta principal de las células T implica linfocitos CD4^{+} que reconocen proteínas de choque térmico micobacterianas (como la hsp65) como antígenos inmunodominantes. Kaufmann, S.H., et al, Eur. J. Immunol. 17:351-357 (1987). Sin embargo, las micobacterias contienen una extraordinaria proporción de lípidos, que equivalen a 40% del peso seco de Bacillus y al 60% de la pared celular. Goren, M.B., y Brennan, P.J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979. Quizás los miembros más numerosos y diversos de los lípidos micobacterianos sean los ácidos micólicos. Estos \beta-hidroxi ácidos grasos, ramificados en á son un conjunto único de estructuras que se encuentran en micobacterias y especies bacterianas relacionadas. Wolinsky, E., "Mycobacteria", capítulo 37 en Microbiology: Including Immunology and Molecular Genetics, 3ª edición, editorial Davis, B.H., editorial Harper & Row, Philadelphia, 1980.

Los ácidos micólicos se encuentran principalmente en la pared celular, esterificados con los polímeros de arabinogalactano unidos al núcleo de peptidoglicano (McNeil, M.R. y Brennan, P.J., Res. Microbiol. 142: 451-563 (1991); Besra, G.S., Biochemistry 30: 7772-7777 (1991); McNeil, M. et al., Journal of biological Chemistry 266: 13217-13223 (1991)) y se pueden liberar mediante hidrólisis alcalina o ácida (saponificación). Minnikin, D.E., "Mycolic acids" en CRC Handbook of Chromatography: Analysis of Lipids, Murhergee, K.D., y Weber, N., editores, CRC Press, 1993. Los ácidos micólicos son el componente principal de la envuelta lipídica que rodea al organismo, proporcionando al organismo su superficie hidrófoba y su tinción acidorresistente característica. Goren, M.B., y Brenan, P.J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979.

A diferencia de los ácidos grasos eucarióticos y bacterianos, que varían de tamaño entre C_{12} y C_{24}, los ácidos micólicos de las Micobacterias varían de tamaño entre C_{60} y C_{90}, Minnikin, D.E., "Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" en The Biology of Mycobacteria, vol. 1, Ratledge, C., y Sanford, J., editores, Academic Press, London, 1982. Los ácidos micólicos, en contraste con los ácidos grasos de cadena recta, tienen un grupo alquilo ramificado en el carbono á y un grupo hidroxilo en el carbono \beta. Goren, M.B., y Brennan, P.J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979; Minnikin, D.E., "Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" en The Biology of Mycobacteria, vol. 1, Ratledge, C. y Sanford, J., editores, Academic Press, London, 1982; Takayama, K. y Qureshi, N., "Structure and Synthesis of Lipids" en The Mycobacteria: A Sourcebook, parte A, Kubica, G.P. y Wayne, L.G., editores, Marcel Dekker, New York & Basel, 1984. La cadena alquílica larga principal del ácido micólico (el llamado grupo mero) es heterogénea tanto en longitud como en los grupos funcionales unidos. Además de los grupos alqueno (enlaces dobles), los grupos funcionales de los ácidos micólicos incluyen, metoxilo, ceto, restos de metilo aislados, grupos etilénicos y ciclopropanoides. Minnikin, D., E. "Lipids: Complex Lipids, their Chemistry, Biosynthesis and Roles" en The Biology of Mycobacteria, vol. 1, Ratledge, C. y Sanford, J., editores, Academic Press, London, 1982. El gran conjunto de grupos funcionales disponibles para los ácidos micólicos, su longitud de cadena variable y su heterogeneidad entre las cepas, permiten que los ácidos micólicos logren un grado potencialmente grande de variación antigénica, similar a la proporcionada por los péptidos con heterogeneidad entre las cadenas laterales de aminoácidos. Por tanto, estas moléculas lipídicas pueden tener una relevancia inmunológica no apreciada previamente. Para cada especie de Micobacteria, existe una huella dactilar distinguible, basada en los patrones de moléculas de ácido micólico presentes. Tales patrones se han determinado para especies individuales mediante cromatografía en capa fina (TLC). Minnikin, D.E., "Lipids: Complex Lipids, theri Chemistry, Biosynthesis and Roles" en The Biology of Mycobacteria, vol. 1, Ratledge, C. y Sanford, J., editores, Academic Press, London, 1982; Dobson, G., et al, Chemical Methods in Bacterial Systematics, Academic Press, 1985; Valero- Guillén, P.L., et al., Journal of Applied Bacteriology 59: 113-126 (1985)), cromatografía gaseosa (GC) (Valero-Guillén, P.L., et al., Journal of Applied Bacteriology 59: 113- 126 (1985); Athalye, M., et al., Journal of Applied Bacteriology 58: 507-512 (1985); Luquin, M., et al., Journal of Clinical Microbiology 29: 120-130 (1991)) y mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Qureshi, N. et al., Journal of Biological Chemistry 253: 5411-5417 (1978); Qureshi, N. et al., Journal of Biological Chemistry 255: 182-189 (1980); Butler, W.R., et al., Journal of Clinical Microbiology 29: 2468-2472 (1991); Butler, W.R. y Kilburn, J.O., Journal of Clinical Microbiology 28: 2094-2098 (1990).

Sumario de la invención

Diversos aspectos de la invención proporcionan:

- un método para producir una vacuna que contiene un antígeno presentado por CD1,

- una vacuna que induce una respuesta de células T específicas en un animal,

- el uso de un antígeno presentado por CD1 (o su equivalente funcional) para fabricar un medicamento que induce una respuesta de una célula T específica, para vacunación),

- un agente bloqueante de CD1 que inhibe la presentación de antígeno restringida a CD1,

- un método para inhibir la presentación de antígeno restringida a CD1 mediante células CD1^{+},

- un método para detectar un antígeno presentado por CD1 en una muestra,

- un método para aislar un antígeno presentado por CD1 de una muestra, y

- un antígeno presentado por CD1, aislado,

como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la invención proporciona un método para producir una vacuna que contiene un antígeno presentado por CD1, que comprende las siguientes etapas:

(a) incubar una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1, con células positivas para CD1;

(b) separar dichas células positivas para CD1 que presentan antígeno CD1 unido de dicha muestra;

(c) separar el antígeno presentado por CD1 de dichas células positivas para CD1 que presentan dicho antígeno; y

(d) formular dicho antígeno presentado por CD1 separado, para formar una vacuna.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una vacuna que contiene el antígeno presentado por CD1, que comprenden las siguientes etapas:

(a) fraccionar una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1, en dos o más fracciones;

(b) ensayar dichas fracciones para la presencia de un antígeno presentado por CD1; y

(c) formular una o más fracciones que contengan dicho antígeno presentado por CD1, para formar una vacuna.

En otro aspecto, la invención proporciona además un método en el que:

(a) dicho antígeno presentado por CD1 se presenta mediante una molécula de CD1, seleccionada del grupo formado por CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e; o

(b) dicho antígeno presentado por CD1 se aísla de una especie micobacteriana seleccionada del grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. fortuitum y M. avium.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una vacuna que induce una respuesta de células T específicas en un animal, tras administrar a dicho animal la vacuna que comprende una cantidad efectiva, inductora de células T específicas, de un antígeno presentado por CD1 o uno de sus equivalentes funcionales y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona además una vacuna que comprende:

(a) una o más citoquinas u otras moléculas que inducen la expresión de CD1 sobre células presentadoras de antígeno; o

(b) uno o más antígenos diferentes.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un antígeno presentado por CD1 (o su equivalente funcional) para fabricar un medicamento que induce una respuesta de células T específicas para vacunación.

En otro aspecto, la invención proporciona además una vacuna o el uso de una vacuna, en los que un antígeno presentado por CD1:

(a) se aísla de dimicolato de 6,6-trehalosa saponificado; o

(b) es un lípido; o

(c) es un ácido micólico.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un agente bloqueante de CD1, que inhibe la presentación de antígeno restringida a CD1, seleccionado del grupo formado por un anticuerpo, un péptido sintético, un inhibidor de la presentación del antígeno restringida a CD1, y un antagonista antigénico derivado de un antígeno presentado por CD1.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para inhibir la presentación del antígeno restringida a CD1 mediante células positivas para CD1, que comprende la etapa de poner en contacto células que muestran una molécula de CD1, con un agente bloqueante de CD1, excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un antígeno presentado por CD1 aislado, que se puede producir mediante un método, y un método para detectar antígeno presentado por CD1 en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a) poner en contacto dichas muestras con células positivas para CD1;

(b) poner en contacto dichas células positivas para CD1 con células T; y

(c) medir la respuesta proliferativa o citolítica de dichas células T.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un antígeno presentado por CD1 aislado que se puede producir mediante un método, y un método para aislar dicho antígeno presentado por CD1 de una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a) incubar dicha muestra con células positivas para CD1, que se unen a dicho antígeno presentado por CD1, a fin de producir células positivas para CD1 que presentan antígeno CD1 unido;

(b) separar dichas células positivas para CD1 que presentan antígeno CD1 unido, de dicha muestra; y

(c) separar el antígeno presentado por CD1 de dichas células positivas para CD1 que presentan dicho antígeno.

Por tanto, la presente invención se basa en la observación nueva e inesperada de que las moléculas CD1 funcionan presentando antígenos extraños, así como antígenos autoinmunes a las células T. La invención se basa además en la observación de que los monocitos sanguíneos aislados se pueden inducir para que expresen CD1, y por tanto se transformen en competentes para presentar antígenos a células T, poniendo en contacto los monocitos con el factor estimulante de colonias de granulocito/macrófago (GM-CSF) e interleuquina-4 (IL-4). Basándose en estas dos observaciones, la presente invención describe métodos para aislar células presentadoras de antígeno CD1^{+} (APCs CD1^{+}), que se usan para identificar, aislar y purificar antígenos presentados por CD1, diversos métodos para determinar si una muestra contiene uno o más antígenos presentados por CD1, métodos para aislar y purificar antígenos presentados por CD1, antígenos presentados por CD1 purificados, aislados por los métodos aquí descritos, y métodos para usar los antígenos presentados por CD1 aislados en vacunas.

Se describen métodos para determinar si una muestra contiene un antígeno presentado por CD1. En uno de tales métodos, se puede determinar la presencia de un antígeno presentado por CD1 en la muestra mediante las siguientes etapas: (1) poner en contacto la muestra con células que se han inducido para que expresen una proteína CD1, (2) poner en contacto las células de la primera etapa con células T CD4^{-}8^{-} (doblemente negativas; DN), que reconocen específicamente un antígeno presentado por CD1, y (3) medir la respuesta proliferativa o citolítica de las células T DN, en el que la proliferación incrementada de células T o la citolisis de células diana CD1^{+} mediada por células T, respectivamente, se correlaciona con la presencia de un antígeno presentado por CD1.

Se describen también métodos para determinar si una muestra contiene un agente bloqueante de CD1, es decir, una composición que inhibe la presentación de antígeno restringida a CD1. El ensayo para antígeno presentado por CD1 descrito anteriormente se realiza en duplicado, realizándose un primer ensayo (testigo) como anteriormente, y un segundo ensayo que contiene adicionalmente una muestra sospechosa de contener un agente bloqueante de CD1. La presencia de agentes bloqueantes de CD1 en la muestra se correlaciona con una respuesta proliferativa o citolítica de las células T en el segundo ensayo, que es menor que la medida en el primer ensayo.

Se describe también la inducción de la expresión de CD1 en las células, como monocitos, a fin de producir células presentadoras de antígeno CD1^{+} (APCs). En un método, la expresión de CD1 se induce en monocitos sanguíneos aislados, poniendo en contacto las células con una o más citoquinas. Las citoquinas preferidas para la inducción de CD1 son el factor estimulante de colonias de granulocito/macrófago (GM-CSF), GM-CSF en combinación con interleuquina-4 (IL-4), o interleuquina-3 (IL-3). Las APCs CD1^{+} son células que expresan y presentan proteínas CD1 y, por tanto, son competentes para presentar antígenos restringidos para CD, a células T TCR \alpha:\beta DN. Las APCs CD1^{+} se usan en varios de los métodos aquí descritos.

Se describen también células T TCR \alpha:\beta CD4^{-}8^{-} (DN) para uso en los métodos aquí descritos. Las células T TCR \alpha:\beta DN reconocen (es decir, se unen específicamente a) antígenos unidos a CD1, y proliferan como consecuencia de tal reconocimiento. Se describen aquí tres de tales líneas celulares aisladas, denominadas DN1, DN2 y DN6.

Se describen asimismo métodos para aislar un antígeno presentado por CD1, de una muestra. En uno de tales métodos, una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1 se fracciona primeramente usando técnicas convencionales. Las fracciones resultantes se ensayan a continuación, usando los procedimientos aquí descritos para la presencia de un antígeno presentado por CD1. Las fracciones que contienen el antígeno presentado por CD1, se usan luego en el desarrollo de vacunas o se fraccionan nuevamente para obtener niveles mayores de pureza del antígeno presentado por CD1.

Se describen también métodos alternativos para aislar antígenos presentados por CD1 de una muestra, que se basan en la capacidad de un antígeno presentado por CD1 para unirse, bien a CD1 aislado, bien a CD1 expresado sobre la superficie de una célula. En uno de tales métodos, se incuba una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1, bien con APCs CD1^{+}, bien con moléculas de CD1 purificadas. Los complejos resultantes de antígeno:APC CD1^{+} o antígeno: molécula de CD1 se eliminan a continuación de la muestra y se someten a condiciones en las que la molécula de CD1 libera el antígeno presentado por CD1 unido. El antígeno presentado por CD1 liberado se purifica a continuación, separado, bien de la APC CD1^{+}, o de la molécula de CD1 purificada, y se puede caracterizar después usando métodos inmunológicos, bioquímicos y/o genéticos convencionales. Los antígenos presentados por CD1 purificados, o sus derivados sintéticos u obtenidos mediante ingeniería genética, se ensayan a continuación para actividad antigénica presentada por CD1 en los procedimientos aquí descritos, y se pueden usar en la formulación de vacunas.

Utilizando los procedimientos anteriores para aislar un antígeno presentado por CD1, la presente invención proporciona además antígenos presentados por CD1 aislados, que se han preparado mediante los métodos aquí descritos. Los antígenos presentados por CD1 aislados, preparados por los métodos descritos, se pueden utilizar, bien en la caracterización de la naturaleza de los antígenos presentados por CD1, en el desarrollo o formulación de vacunas, o en el desarrollo de terapias autoinmunes.

La presente invención se basa además en la observación de que la presentación del antígeno mediada por CD1, puede servir como base para el desarrollo de una enfermedad autoinmune. Basándose en esta observación, la presente invención proporciona medios para inhibir la presentación de antígeno mediada por CD1, mediante una APC CD1^{+}. La presentación de antígeno mediada por CD1 se puede inhibir mediante diversas composiciones que se describen aquí o se aíslan mediante los métodos aquí descritos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 (cuadros a y b). Expresión de CD1a, CD1b y CD1c por monocitos cultivados con GM-CSF e IL-4, y fenotipo superficial de células T restringidas a CD1b, específicas para Mycobacterium tuberculosis.

Cuadro a. Análisis citométrico de flujo de monocitos sanguíneos periféricos cultivados durante 60 horas en medio que contiene GM-CSF e IL-4, que muestran expresión de CD1a, CD1b y CD1c. Las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal testigo (mAb) (línea discontinua) o mAbs con la especificidad indicada en cada bloque del histograma (líneas continuas). Los monocitos cultivados en ausencia de citoquinas o con interferón-\gamma; no expresaron niveles significativos de CD1a, CD1b o CD1c (datos no mostrados).

Cuadro b. Análisis citométrico de flujo de la línea DN1 de células T, que muestra su expresión de TCRs \alpha:\beta, ausencia de expresión de CD4, y expresión mínima o inexistente de CD8 (las líneas discontinuas y continuas representan mAbs testigo y específicos, como en el cuadro a).

Fig. 2 (cuadros a-d). Especificidad antigénica y autorrestricción de las respuestas proliferativas de la línea DN1 de células T CD4^{-}8^{-} y su subclon DN1.C7.

Cuadro a. Respuestas proliferativas (recuentos por minuto (CPM)) de ^{3}H- incorporado a timidina) de DN1 frente a M. tuberculosis (cuadros llenos), M. leprae (círculos llenos), Escherichia coli (círculos vacíos) y toxoide del tétanos (cuadros vacíos). Las células presentadoras de antígeno eran monocitos heterólogos CD1^{+}, tratados con GM-CSF e IL-4. La concentración de antígeno (basada en el contenido de proteína) se muestra en el eje X.

Cuadro b. Respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T frente a M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml), que requiere células presentadoras de antígeno CD1^{+} (APCs CD1^{+}). Las APCs se indican mediante símbolos, como sigue: ninguna APC, cuadrado vacío; monocitos tratados con GM-CSF e IL-4 (APCs CD1^{+}), círculos llenos; monocitos tratados con IFN\gamma (CD1^{+}), círculos vacíos; monocitos recién aislados (CD1^{+}), triángulos huecos. El número de APCs añadido a cada cultivo se muestra en el eje X.

Cuadro c. Las APCs de todos los donantes ensayados soportaban la respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T frente a M. tuberculosis. Barras huecas, células T más APCs sin M. tuberculosis; barras llenas, células T más APCs con M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml). Las APCs eran células mononucleares de sangre periférica tratadas con GM-CSF e IL-4, de cinco donantes no relacionados. El tipaje de HLA confirmó que ningún alelo de los loci HLA-A, -B,
-C, -DR o -DQ era compartido por los cinco donantes (datos no mostrados).

Cuadro d. mAb Anti-CD1b inhibía específicamente la respuesta proliferativa de DN1 y DN1.C7 frente a M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml). Las APCs eran monocitos tratados con GM-CSF e IL-4. Barras llenas, respuesta proliferativa de células T a APCs con M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml); líneas discontinuas, respuesta a APCs en ausencia de M. tuberculosis; "nd", no determinada. Los anticuerpos monoclonales usados fueron P3 (testigo IgG), OKT6 (anti-CD1a), WM-25 (anti-CD1b; Favaloro, E.J., et al., Disease Markers 4: 261-270 (1986)), 10C3 (anti-CD1c), W6/32 (anti-MHC, clase I), e IVA12 (anti-MHC, clase II); Shaw, S., Hum. Immun. 12: 191-211 (1985)).

Fig. 3. Comparación de la capacidad de líneas de células presentadoras de antígeno CR1 y monocitos estimulados por citoquina, para estimular el crecimiento de líneas 2.13.DN1 y G7 de células T, clones derivados de la línea DN1 de células T. Barras huecas, células T más APCs sin M. tuberculosis; barras llenas, células T más APCs con M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml).

Fig. 4 (cuadros a-d). Presentación de M. tuberculosis por transfectantes CD1 de la línea C1R de células linfoblastoides. Las células C1R transfectadas de forma estable con el vector de DNA pSR\alpha-NEO (falso) o con construcciones de pSR\alpha-NEO que contienen cDNAs que codifican la molécula de CD1 indicada (CD1a, CD1b y CD1c), se cultivaron durante 12 horas en medio solo (barras huecas), o en medio que contenía M. tuberculosis (25 \mug de proteína/ml, barras llenas), se marcaron con ^{51}Cr y se usaron como células diana para un ensayo citolítico con varias células T efectoras. La proporción de célula T efectora a célula diana fue 50:1.

Cuadro a. M. tb. línea DN1 de células T específicas para Ag presentado por CD1b.

Cuadro b. DN1.C7, subclon de DN1.

Cuadro c. Clon BK6 autorreactivo para CD1a.

Cuadro d. Clon 3C8 autorreactivo para CD1c.

Fig 5 (cuadros a-c). La presentación del antígeno de M. tuberculosis restringida a CD1b, no requiere moléculas codificadas por la región de clase II del MHC, pero implica el tratamiento del antígeno mediante una vía sensible a cloroquina.

Cuadro a. Lisis de transfectantes CD1 T2 mediante la línea DN1 de células T. Las células T2 transfectadas con vector de DNA solo (falso transfectante) se indican mediante círculos, y las células T2 transfectadas con CD1b, mediante triángulos. Los símbolos vacíos representan células diana no preincubadas con M. tuberculosis, y los símbolos llenos representan células diana preincubadas durante 12 horas con M. tuberculosis (10 \mug de proteína/ml). El análisis citométrico de flujo mostró que la incubación de células T2 transfectadas con CD1b, con M. tuberculosis, no tenía efecto sobre la expresión de CD1b (datos no mostrados).

Cuadro b. La fijación de glutaraldehído de las APCs CD1b^{+} evita la presentación de M. tuberculosis a la línea DN1. Las APCs CD1b^{+} (células mononucleares de sangre periférica tratadas con GM-CSF e IL-4, PBMCs) se cultivaron durante 12 horas en presencia de M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml; "APCs pulsadas") o en medio solo ("APCs no pulsadas"), se recogieron y se fijó una alícuota de cada suspensión celular con glutaraldehído al 0,0125% durante 30 segundos. Las preparaciones de APC resultantes se ensayaron para su capacidad para estimular la proliferación de la línea DN1, en ausencia (barras vacías) o presencia (barras llenas) de antígeno soluble de M. tuberculosis (1 \mug de proteína/ml).

Cuadro c. Inhibición de la presentación restringida a CD1b de M. tuberculosis mediante cloroquina. Se pulsaron APCs CD1b^{+} de un individuo HLA- DR7^{+} con antígeno de M. tuberculosis durante 60 minutos a 37ºC, en presencia de la concentración indicada de cloroquina, se fijaron con glutaraldehído, y se usaron como APCs en ensayos proliferativos con la línea DN1 (círculos llenos) o con la línea DG.1 (triángulos vacíos) de células T, CD4^{+} restringidas a HLA-DR7^{+}, específica de M. tuberculosis. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de respuestas, comparado con APCs pulsadas con M. tuberculosis fijadas, en ausencia de cloroquina, y son representativos de tres experimentos similares.

Fig. 6. Efecto de la digestión del antígeno con las proteasas indicadas sobre la respuesta proliferativa de la línea DG.1 de células T frente al antígeno de M. tuberculosis.

Fig. 7. Efecto de la digestión del antígeno con las proteasas indicadas sobre la respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T frente al antígeno de M. tuberculosis.

Fig. 8. Efecto de la digestión del antígeno con las proteasas indicadas sobre la respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T frente al antígeno de M. fortuitum.

Fig. 9. (cuadros a-c). El antígeno micobacteriano reconocido por una línea DN de células T TCR^{+} \alpha:\beta se fracciona cuantitativamente en la fase orgánica tras la extracción con disolventes orgánicos y se restringe a CD1b. La extracción con disolventes orgánicos diferencia el antígeno micobacteriano restringido a CD1b de antígenos micobacterianos reconocidos por una línea de células T TCR^{+} \alpha:\beta CD4^{+} restringidas a la clase II de MHC y el pequeño ligando micobacteriano no proteico reconocido por células T \gamma:\delta; (V\gamma2V\delta2) DN. Pfeffer, K., et al., J. Immunology 148: 575-583 (1992). Los sonicados micobacterianos totales se extrajeron con cloroformo/metanol/H_{2}O y las tres fases resultantes se ensayaron cultivando las células T con monocitos CD1^{+} y las diluciones indicadas de las diversas preparaciones antigénicas.

Cuadro a. Respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T DN restringidas a CD1b a los sonicados micobacterianos totales (línea discontinua), fase orgánica (línea continua), fase acuosa (línea continua) o superficie de contacto (línea continua). La concentración de antígeno a lo largo del eje X se representa como 1/dilución normalizada hasta la preparación de sonicado total estándar.

Cuadro b. Respuesta proliferativa de la línea DG.1 de células T CD4^{+}, específica de Micobacterias, restringidas a HLA-DR7 (MHC), frente a fracciones micobacterianas, tras extracción con disolventes orgánicos.

Cuadro c. Respuesta proliferativa del clon DG.SF68 de células T V\gamma2V\delta2, frente a fracciones micobacterianas, tras extracción con disolventes orgánicos.

Fig. 10. Respuesta citolítica de la línea DN1 a transfectantes CD1 de células C1R pulsadas con preparaciones antigénicas micobacterianas. Se usaron como dianas transfectantes CD1b o CD1c (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447-450 (1989)) de células linfoblastoides C1R, en un ensayo citolítico estándar pulsado, bien con preparaciones antigénicas de M. tuberculosis tras extracción con disolventes orgánicos (+), o con medio solo (-). El reconocimiento de las células C1R transfectadas con CD1b por la línea DN1 de células T, se produce sólo cuando están pulsadas con antígeno. No se produce ningún reconocimiento específico de antígeno para las dianas CD1c^{+}.

Fig. 11. Estructura química del dimicolato de 6,6-trehalosa (cord factor).

Fig. 12. (cuadros a-c). El antígeno micobacteriano reconocido por la línea DN1 de células T es ácido micólico.

Cuadro a. La respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T restringida a CD1b, se correlaciona con picos de ácido micólico en HPLC C18 de fase inversa. La fracción purificada de cadena acilo micobacteriana que contiene todo el antígeno restringido a CD1b, se sometió a cromatografía usando HPLC de fase inversa, y las fracciones resultantes se ensayaron para la capacidad de estimular una respuesta proliferativa por la línea DN1 de células T. La parte superior del cuadro presenta el espectro de absorbancia a 254 angstroms (expresado como unidades de densidad óptica, DO x 10^{-4}) (línea continua) del material eluido y la concentración de cloruro de metileno correspondiente (línea discontinua) del gradiente de elución. El pico de absorbancia grande que eluye entre 2 y 6 minutos está exento de bromuro de bromofenacilo, el agente derivatizante. La parte inferior del cuadro muestra la respuesta proliferativa de la línea DN1 de células T, frente a cada fracción de un minuto. La respuesta frente al antígeno restringido a CD1b se observa como un pico ancho que se correlaciona con ácido micólico.

Cuadro b. El dimicolato de 6,6-trehalosa saponificado (cord factor), estimula una respuesta proliferativa mediante la línea DN1 de células T restringidas a CD1b, pero no el dibehenato de trehalosa saponificado. Los ácidos micólicos se generaron mediante saponificación de dimicolato de trehalosa purificado, bien de M. tuberculosis (H37Ra) o de M. kansasii. El dibehenato de trehalosa (cord factor sintético) se trató de forma idéntica. La concentración de antígeno se expresa en \mug/ml de cord factor a lo largo del eje X.

Cuadro c. El análisis HPLC de fase inversa de dimicolato de trehalosa purificado de M. tuberculosis (H37Ra), produce la estimulación de la línea DN1 de células T restringidas a CD1b, mediante fracciones correspondientes a los picos de ácido micólico. El dimicolato de trehalosa saponificado de M. tuberculosis se sometió a cromatografía como en el experimento mostrado en el cuadro a, y las fracciones se ensayaron para la capacidad de inducir una respuesta proliferativa mediante la línea DN1. Como se observa en el cuadro a, la bioactividad se correlaciona con los picos de ácido micólico tempranos.

Fig. 13. Respuesta citolítica de la línea DN1 de células T, frente a los transfectantes CD de células C1R pulsados con ácido micólico, preparados a partir de cord factor de M. tb. (Sigma) mediante saponificación. Los transfectantes CD1a, CD1b, CD1c o falsos, de células linfoblastoides C1R, se pulsaron con ácidos micólicos preparados a partir de dimicolato de trehalosa (+) o con medio solo (-) y se usaron como dianas en ensayos citolíticos, cuyos resultados se proporcionan como % de lisis específica.

Fig. 14. El ácido micólico no es mitogénico, sino un antígeno específico restringido por CD1b y reconocido por la línea DN1 de células T. Se ensayaron cuatro líneas de células T específicas para Micobacterias y dos líneas adicionales de células T para la capacidad de responder, bien a los sonicados totales de M. tuberculosis, a preparaciones de ácido micólico procedentes de cord factor purificado o de ácidos micólicos purificados por HPLC procedentes, bien de sonicados o de cord factor de M. tb.. Se muestran las respuestas de tres líneas de células T representativas, específicas de Micobacterias, DN1 ( ) (DN, restringidas a CD1b, TCR^{+} \alpha:\beta), DG.1 (\Box) (CD4^{+}, restringidas a HLA-DR7, TCR^{+} \alpha:\beta) y DN6 (\circ) (DN, restringidas a CD1c, TCR^{+} \alpha:\beta). Las APCs para las seis líneas de células T ensayadas eran de manera idéntica PBMCs tratadas con GM-CSF e IL-4 (CD1^{+}) de un individuo positivo HLA-DR7.

Cuadro superior. Respuestas proliferativas de tres líneas de células T específicas de Micobacterias, frente a los sonicados totales de M. tb. (H37Ra, Sigma). La concentración de antígeno se presenta sobre el eje X, como cpm x 10^{-3}. Las tres líneas de células T mostradas responden a los sonicados micobacterianos totales.

Cuadro intermedio. Respuesta proliferativa a ácidos micólicos purificados mediante HPLC, aislados de sonicados de M. tb. Sólo la línea de células T restringidas a CD1b responde al ácido micólico purificado.

Cuadro inferior. Respuestas proliferativas a ácidos micólicos purificados mediante HPLC, producidos a partir de cord factor purificado de M. tb. (Sigma). Sólo la línea DN1 de células T restringidas a CD1b prolifera como respuesta a ácidos micólicos de cord factor. No se muestran tres líneas adicionales de células T ensayadas en el mismo experimento, SP-F3 (Roncarlo, M.G., et al., J. Exp. Medicine 168: 2139-2152 (1988)) (CD4^{+} TCR^{+} \alpha:\beta, restringidas a DR, específicas ara el toxoide del tétanos), CP.1.15 (Morita, C.T., et al., Eur. J. Immunol. 21: 2999-3007 (1991)) (DN, TCR^{+}, V\gamma2V\delta2 autorreactivas para CD1a), y BK6 (Porcelli, S., Nature 341: 447-450 (1989) (DN, TCR^{+} \alpha:\beta, autorreactiva para CD1a). Ninguna de las tres respondió a ácidos micólicos purificados, pero dos proliferaron como respuesta a su antígeno específico (toxoide del tétanos - SP-F3, preparación de M. tuberculosis <1 kDa - CP.1.15). BK6 muestra actividad citolítica frente a CD1a, pero es incapaz de proliferar como respuesta a APCs CD1a^{+} de cualquier tipo ensayado. Porcelli, S., Nature 341: 447-450 (1989).

Fig. 15. Efecto de los anticuerpos monoclonales indicados sobre la respuesta proliferativa de la línea 2.13.DN1 (DN1, cuadro superior) y 8.23.DN1 (DN2, cuadro inferior) de células T.

Fig. 16. Presentación restringida a CD1c del antígeno de M. tuberculosis a la línea DN2 de células T. Resultados de ensayos citolíticos de células CR1 transfectadas con vector (falso, cuadro a) y con moléculas de DNA que codifican la proteína CD1 indicada (CD1a, CD1b y CD1c), en los que las células transfectadas se preincubaron, bien con M. tuberculosis (círculos llenos), o sin él (círculos vacíos).

Fig. 17. Presentación restringida a CD1c del antígeno de M. tuberculosis a la línea DN6 de células T. Resultados de ensayos citolíticos de células CR1 transfectadas con vector (falso, cuadro a) y con moléculas de DNA que codifican la proteína CD1 indicada (CD1a, CD1b y CD1c), en los que las células transfectadas se preincubaban, bien con M. tuberculosis (círculos llenos), o sin él (círculos vacíos).

Fig. 18. Respuesta proliferativa de la línea DN6 restringida a CD1c, frente a antígenos de M. tb. en sonicados, tras extracción de los antígenos con disolventes orgánicos. La proliferación está en cpm (incorporación de ^{3}H timidina) y se presenta sobre el eje Y. Las APCs eran monocitos que expresaban CD1. Los antígenos se titularon sobre logs 6 y se muestran los resultados desde un punto representativo (1:3, dilución 750 del antígeno). Se restaron las cpm de fondo (definidas desde un testigo de medio solo) de todos los valores.

Fig. 19. Respuesta proliferativa de la línea DN6 restringida a CD1c, frente a antígenos de M. tb. en sonicados, antes y después de la saponificación de los antígenos. La respuesta proliferativa en cpm se representa sobre el eje Y y la concentración de antígeno (mostrada como 1/dilución), se representa sobre el eje X. Se sonicó en PBS el equivalente de 10 mg de M. tb. (cepa H37Ra; Difco) y se usó, bien directamente o previamente saponificado. Todas las diluciones de antígeno se normalizaron hasta la concentración inicial estándar de 200 mg de bacterias liofilizadas en 5 ml.

Descripción de las realizaciones preferidas Glosario

Antígeno: Una molécula o composición de interés que (1) induce una respuesta inmunitaria en un animal y (2) interactúa específicamente con uno o más componentes del sistema inmunitario del animal que reconocen el antígeno.

Antígeno extraño: Un antígeno que no es endógeno a un animal normal, sano.

Antígeno autoinmune: Una molécula o composición de interés endógena normal en un animal, que es un antígeno en una enfermedad autoinmune. Sinónimo de "antígeno propio" o "autoantígeno".

Antígeno presentado por CD1: Un antígeno que está unido a un miembro de la familia de proteínas CD1 y presentado sobre la superficie de una APC CD1^{+}. Los antígenos presentados por CD1 varían en tamaño y composición, dependiendo de su origen y del miembro de la familia CD1 por el que son reconocidos. Según se usa aquí, el término "antígeno presentado por CD1" incluye aquellos antígenos identificados aquí y/o aquellos antígenos aislados usando los procedimientos aquí descritos. Sinónimo de "antígeno restringido a CD1". "Antígeno unido a CD1" designa un antígeno presentado por CD1 que está unido a su molécula apropiada de CD1.

Familia de proteínas CD1: Una colección de proteínas que se han identificado por su estructura, reacción inmunológica cruzada y/o distribución, como relacionadas con moléculas CD1 conocidas. Una proteína CD1 específica se puede denominar como un miembro de la familia CD1 de proteínas. Miembros de la familia CD1 de proteínas incluyen, pero no se limitan a: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1e (véase Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137-183 (1991)).

Célula positiva para CD1: Una célula que expresa y presenta una o más miembros de la familia CD1 de proteínas. Sinónimo de "célula CD1^{+}". Un experto en la técnica puede usar los procedimientos aquí descritos, o conocidos en la técnica, para determinar si una célula está expresando uno o más miembros de la familia CD1 de proteínas (véase Ejemplo 1 y Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137-183 (1991)).

Célula presentadora de antígeno (APC): Una célula que presenta moléculas de antígeno sobre su superficie a través de vehículos de proteína y que presenta el antígeno a las células T. Los vehículos proteicos que se unen a antígeno incluyen moléculas del MHC de clase I, moléculas del MHC de clase II y moléculas de CD1; las APCs correspondientes se designan APCs MHCI^{+}, APCs MHCII^{+} y APCs CD1^{+}.

Célula T restringida a CD1: Un linfocito maduro de sangre periférica, positivo para TCR (TCR^{+}), que puede reconocer un antígeno presentado por CD1, unido a CD1. La definición de células T restringidas a CD1 es más restringida que la definición de células T reconocida en la técnica, ya que está limitada al subgrupo de células T que interacciona con un antígeno presentado por CD1, unido a CD1. Las células T restringidas a CD1 preferidas de la siguiente invención, se caracterizan por ser CD4^{-}8^{-}.

Célula T CD4^{-}8^{-}: Un linfocito maduro de sangre periférica TCR^{+}, que no expresa CD4 ni CD8. Sinónimo de "célula T doblemente negativa" y "célula T DN". Las técnicas para identificar células CD4^{-}8^{-} son bien conocidas en la técnica y se pueden emplear fácilmente en la presente invención, por ejemplo, usando citometría de flujo, como se describió en el Ejemplo 1 y en Panchomoorthy, G. et al., J. Immunol. 147: 3360-3369 (1991)). Usando tales procedimientos, se han aislado tres líneas de células T CD4^{-}8^{-}, denominadas DN1, DN2 y DN6, y se describen aquí. DN2 y DN6 parecen ser equivalentes, excepto porque DN6 presenta una velocidad de crecimiento mejor.

Adyuvante: Una molécula o composición de interés que, cuando se introduce en un animal con un antígeno, incrementa la respuesta inmunitaria a ese antígeno.

Obtenido mediante ingeniería genética: Sujeto a manipulación humana destinada a introducir un cambio genético.

Muestra: Cualquier solución, emulsión, suspensión o extracto que se puede ensayar usando los procedimientos aquí descritos. Una muestra puede ser, pero no está limitada a, un extracto soluble o un extracto orgánico. Los Ejemplos 1 y 2 proporcionan varios tipos de muestras procedentes de Mycobacterium tuberculosis.

Puesta en contacto: El proceso de incubar un artículo en presencia de otro. Por tanto, cuando una célula se pone en contacto con una muestra, la célula se incuba con la muestra.

Fraccionamiento: Someter una muestra a condiciones o procedimientos que separan los componentes de la muestra, basándose en propiedades físicas o químicas como por ejemplo, pero no limitadas a, tamaño, carga, solubilidad o composición. Ejemplos de procedimientos de fraccionamiento incluyen, pero no están limitados a, precipitación selectiva, extracción orgánica, diálisis o cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de intercambio iónico.

Expresar: El procedimiento de producir un producto génico mediante transcripción de una molécula de DNA, para generar una molécula correspondiente de RNAm que se traduce mediante los ribosomas formando un polipéptido y factores celulares asociados.

Presentación: El proceso de localizar una proteína o un complejo proteína:antígeno, hacia la superficie externa de una célula, donde la proteína o el complejo proteína:antígeno es accesible a una segunda célula o a moléculas presentadas por una segunda célula. Se dice que una proteína, o un complejo proteína:antígeno es presentado por una célula cuando está presente sobre la superficie externa de la célula y, por tanto, es accesible a una segunda célula y/o a moléculas presentadas por una segunda célula.

Tratamiento de antígeno: El proceso mediante el cual se trata un antígeno mediante factores celulares, a fin de hacerlo competente para la presentación.

Agente bloqueante de CD1: Una composición o compuesto que es capaz de bloquear la interacción de un antígeno presentado por CD1 con CD1, o de bloquear la interacción entre los complejos CD1:antígeno y sus correspondientes receptores de células T. Los agentes bloqueantes incluyen (1) agentes que se unen a CD1, (2) agentes que se unen a un antígeno presentado por CD1, (3) agentes que se unen a un complejo CD1:antígeno, (4) agentes que se unen a un receptor de célula T que reconoce un complejo CD1:antígeno, y (5) agentes que evitan el tratamiento de un antígeno presentado por CD1.

La presente invención se basa en la observación nueva e inesperada de que las moléculas CD1 funcionan presentando antígenos a las células T. La invención se basa además en la observación de que las células se pueden inducir para que expresen CD1, y por tanto, transformarse en competentes para presentar antígenos a células T, poniendo en contacto las células con citoquinas, como el factor estimulante de colonias de granulocito/macrófago (GM-CSF) y la interleuquina 4 (IL-4). Basándose en estas dos observaciones, la presente invención describe varios métodos para determinar si una muestra contiene antígeno presentado por CD1, métodos para aislar y purificar antígenos presentados por CD1, antígenos presentados por CD1 purificados mediante los métodos aquí descritos, así como métodos para aislar células positivas para CD1, que se pueden usar en la identificación, aislamiento y purificación de antígenos presentados por CD1.

En una realización, la presente invención proporciona métodos para determinar si una muestra contiene antígeno presentado por CD1. En uno de tales métodos, la presencia de un antígeno presentado por CD1 en una muestra se puede determinar en primer lugar, poniendo en contacto la muestra con una célula positiva para CD1, en segundo lugar, poniendo en contacto la célula de la primera etapa con una célula T, y luego midiendo la proliferación de la célula T.

Se han descrito métodos para caracterizar clases de células T, y aislar subpoblaciones de células T. Wysocki, L.J., y Sato, V.L., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 2844-2848 (1978); Wasik, M.A. y Morimoto, C., J. Immunol. 144: 3334- 3340 (1990); Harriman, G.R, et al., J. Immunol. 145: 4206-4414 (1990); Koulova, L, et al., J. Immunol. 145: 2034-2043 (1990); Steward, M. y Male, D. capítulo 25 en Immunology, 2ª edición, Roitt, I. et al., editores, Gower Medical Publishing, London, New York, 1989. Se han descrito métodos de cultivo de células T in vitro y de inmortalización de células T mediante fusión con células de crecimiento no restringido, como mielomas. Paul, W.E., et al., Nature 294: 697-699 (1981); Williams, N., Nature 296: 605-606 (1982). Las técnicas de identificación de células T CD4^{-}8^{-} son bien conocidas en la técnica y se pueden emplear fácilmente en la presente invención, por ejemplo usando citometría de flujo, como se describe en el Ejemplo 1 y por Panchomoorthy, G., et al., J. Immunol. 147: 3360-3369 (1991)). La presente invención avanza estas técnicas, proporcionando métodos para enriquecer las poblaciones de células T, para obtener clones de células T aislados, que son reactivos frente a antígenos presentados por CD1. Se deja que una población de células T se divida y se aísla una subpoblación de células T mezcladas, basándose en la proliferación en presencia de APCs CD1^{+} y de antígeno presentado por CD1, o en la actividad citolítica frente a células transfectadas que expresan moléculas de CD1 en presencia de un antígeno presentado por CD1. Usando tales procedimientos, se han aislado tres líneas de células T CD4^{-}8^{-} denominadas DN1, DN2 y DN6, y se describen aquí. DN2 y DN6 parecen ser equivalentes, excepto porque DN6 presenta una velocidad de crecimiento mejor.

Se describe también la inducción de expresión en una célula. En uno de tales métodos, se puede inducir una célula para que exprese CD1, poniendo en contacto la célula con una o más citoquinas. Las citoquinas preferidas para inducción de CD1 son el factor estimulante de colonias de granulocito/macrófago (GM-CSF), GM-CSF en combinación con interleuquina-4 (IL-4), o la interleuquina 3 (IL-3). El Ejemplo 1 describe que los monocitos se pueden inducir para que expresen diversos miembros de la familia CD1, poniendo en contacto el monocito con 100 unidades de cada de GM- CSF e IL-4, durante 60 horas en RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10%. Usando los métodos y materiales aquí descritos, un experto en la técnica puede variar fácilmente el tiempo de contacto, el tipo de citoquina y la concentración y las condiciones de contacto, para obtener resultados similares, con la condición de que la etapa de contacto sea suficiente para inducir la expresión de CD1.

Se conocen varios procedimientos en la técnica para determinar la proliferación de células T, que se pueden usar en los métodos anteriores. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente tales procedimientos para usarlos en la presente invención. Uno de tales procedimientos, descrito en el Ejemplo 1, mide la velocidad de incorporación de ^{3}H-timidina a través de centelleo y mediante métodos descritos en Morita, C.T., et al., Eur. J. Immunol. 21: 2999-3007 (1991)).

Se describen asimismo métodos para aislar un antígeno presentado por CD1 de una muestra. En uno de tales métodos, una muestra se fracciona primeramente usando procedimientos convencionales. Las fracciones de la muestra se ensayan a continuación para la presencia de un antígeno presentado por CD1, como se esbozó anteriormente. Los Ejemplos 2 y 3 describen procedimientos de fraccionamiento usando extracción orgánica con cloroformo:metanol y cromatografía de ácido silícico a fin de fraccionar una muestra que contiene un extracto de M. tuberculosis, para purificar un antígeno presentado por CD1.

La presente invención proporciona adicionalmente métodos para aislar un antígeno presentado por CD1, que se basan en la especificidad de unión de CD1 a un antígeno presentado por CD1. En uno de tales métodos, una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1, se pone en contacto primero, bien con CD1 purificado, o con una célula que expresa y presenta CD1 (una "célula CD1^{+}"). A continuación, el complejo antígeno:CD1 resultante, o complejo antígeno:célula CD1^{+} se separa de la muestra. Usando dicho procedimiento, se obtiene un complejo antígeno: CD1 o un complejo antígeno: célula CD1^{+} purificados. Para purificar adicionalmente el antígeno presentado por CD1, cualquiera de los tipos de complejo se trata bajo condiciones apropiadas, de forma que el antígeno unido a CD1 se liberará de la molécula de CD1.

Los dos métodos de aislamiento anteriores se pueden combinar por el experto en la técnica para derivar otros métodos destinados a aislar los antígenos presentados por CD1. En una de tales combinaciones, una muestra se fracciona, como se describió anteriormente, previamente a la realización del método de purificación que se basa en la unión a CD1 de un antígeno presentado por CD1.

La presente invención proporciona además antígenos presentados por CD1 que se identifican o aíslan usando los procedimientos aquí descritos. A diferencia de los antígenos presentados por MHC, los antígenos presentados por CD1 no son polipéptidos. Un antígeno no peptídico, presentado por CD1, descrito en detalle en los Ejemplos 2-4, es un antígeno lipídico aislado de M. tuberculosis, que comprende ácidos micólicos. Otro antígeno presentado por CD1, descrito en los Ejemplos 5 y 6, es un lípido más complejo. Tales antígenos se usan en la formulación y desarrollo de vacunas.

Los antígenos presentados por CD1 de la presente invención (aquellos identificados o aislados usando los procedimientos aquí descritos) son fácilmente utilizables como vacunas. Un experto en la técnica puede emplear procedimientos de formulación de rutina, a fin de formular un antígeno presentado por CD1 aislado, para su uso como vacuna. Véanse Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18, Gennaro, A.R., editorial Mack, Easton, 1990; The Pharmacologic Basis of Therapeutics, 7ª edición, Gilman, A.G., et al., MacMillian editores, New York, 1985.

Los antígenos presentados por CD1 de la presente invención se pueden purificar como se describe aquí, con un amplio intervalo de purezas. Un experto en la técnica sabrá emplear diversas estrategias de purificación, para obtener un antígeno presentado por CD1 que se ha purificado hasta el punto requerido para un uso previsto.

Las vacunas de la presente invención se pueden formular usando un antígeno presentado por CD1 purificado, o se pueden formular usando un antígeno unido a CD1. Debido a que los antígenos restringidos a CD1 se presentan a las células T como un complejo de antígeno y CD1, el uso de un complejo de antígeno:CD1 puede proporcionar, en algunos casos, propiedades de inmunización superiores.

También se describen ensayos para inhibidores de la presentación de antígenos restringidos a CD1 a las células T, es decir, agentes bloqueantes de CD1. En uno de tales ensayos, la presentación del antígeno a CD1 se inhibe usando un agente bloqueante de CD1, para bloquear la capacidad de un antígeno restringido a CD1, para unirse a CD1. Según se usa aquí, un agente bloqueante de CD1 se dice que "inhibe la presentación de antígeno restringido a CD1" cuando el agente bloqueante de CD1 reduce (1) la unión de un antígeno presentado por CD1 a una molécula de CD1 o (2) la unión de un complejo CD1:antígeno presentado por CD1 a sus receptores correspondientes de las células T. Algunos agentes bloqueantes de CD1 son capaces de bloquear dicha unión hasta niveles no detectables, mientras que otros agentes bloqueantes de CD1 sólo reducen ligeramente dicha unión. Los agentes bloqueantes de CD1 incluyen (1) agentes que se unen a CD1, (2) agentes que se unen al antígeno presentado por CD1, (3) agentes que se unen al complejo CD1:antígeno, y (4) agentes que se unen a los receptores de células T que reconocen el complejo CD1:antígeno. Ejemplos respectivos de agentes bloqueantes incluyen, pero no están limitados a, (1) anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen a la porción de una molécula de CD1 que se une al antígeno presentado por CD1 y la bloquean, (2) anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen a la porción de un antígeno presentado por CD1 que se une a CD1 y la bloquean, (3) oligopéptidos sintéticos que derivan de la porción de unión a CD1:antígeno de un receptor de célula T, y que se unen a la porción del complejo CD1:antígeno que se une a receptores de células T intactos, y la bloquean, y (4) compuestos sintéticos que comprenden un antígeno presentado por CD1, unido químicamente a una molécula de CD1 purificada o a uno de sus derivados sintéticos.

En una alternativa para inhibir la presentación de antígenos restringidos a CD1, se puede emplear un agente bloqueante de CD1 que bloque la interacción del complejo antígeno:CD1 con las moléculas de TCR sobre la célula T. Inhibiendo la etapa de presentación, se puede inhibir la activación de subconjuntos específicos de células T. Actualmente están en marcha experiencias piloto de tratamiento de seres humanos afectados por una enfermedad autoinmune (MS), con péptidos derivados de moléculas de TCR. Oksenberg, J.R., et al., J. Neurol. Sci. 115 (Suplemento): S29-S37 (1993). Las moléculas de DNA que codifican para polipéptidos TCR presentados por células T, que reconocen los antígenos presentados por CD1 de la invención, se aíslan según los métodos conocidos en la técnica. Oksenberg, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:988-992 (1989); Oksenberg, J.R., et al., Nature 345: 344-346 (1990) y fe de erratas, Nature 353:94 (1991); Uematsu, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 534-538 (1991); Panzara, M.A., et al., Biotechniques 12: 728-735 (1992); Uematsu, Y., Immunogenet. 34: 174-178 (1991). La secuencia de DNA se convierte en una secuencia polipeptídica, y la porción de la secuencia polipeptídica que corresponde a la región variable que se une al antígeno de un polipéptido TCR se usa para diseñar oligopéptidos sintéticos que se unen a complejos CD1:antígeno sobre las APCs, inhibiendo por tanto la presentación del antígeno. Los oligopéptidos se sintetizan químicamente de acuerdo con métodos estándar (Steward y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockland, Illinois, 1985) y se purifican de mezclas de reacción mediante cromatografía líquida de alta presión, de fase inversa (HPLC). Adicionalmente o alternativamente, son bien conocidos en la técnica los métodos para producir anticuerpos anti-TCR y péptidos que se unen a anti-TCR, con respecto a la presentación del MHC y se pueden adaptar fácilmente al sistema de presentación de CD1 aquí descrito. Strominger, J.L, Cell 57: 895-898 (1989); Davis, M.M., y Bjorkman, P.J., Nature 334: 395-404 (1989).

Un experto en la técnica puede emplear fácilmente métodos conocidos de producción de anticuerpos, así como diseño racional de agentes bloqueantes, a fin de obtener los agentes bloqueantes de la presente invención. Harlow, E., y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Synthetic Peptides: Answers Guide, Freeman, W.H., New York, 1991; Kasprzak, A.A., Biochemistry 28: 9230-9238 (1989). Adicional o alternativamente, se pueden escrutar bibliotecas de moléculas diversas para moléculas miembros individuales que sean agentes bloqueantes de CD1. Los agentes bloqueantes efectivos de CD1 se identifican por su capacidad para inhibir las respuestas proliferativas y/o citolíticas, mediadas por células T, usando los materiales y métodos aquí descritos.

Las realizaciones de la invención descritas anteriormente se pueden usar para los propósitos indicados, solas o combinadas entre sí o con otras composiciones y/o métodos complementarios.

La forma y método de realizar la presente invención se puede entender más completamente por los expertos mediante referencia a los siguientes ejemplos, que no están destinados de ningún modo a limitar el alcance de la presente invención o de las reivindicaciones referentes a la misma.

Ejemplo 1 Presentación de antígeno por CD1b Métodos

Se realizó citometría de flujo, como se describió previamente (Panchamoorthy, G., et al., J. Immunology 147: 3360-3369 (1991)), usando los siguientes anticuerpos monoclonales (mAbs): P3 (testigo de IgG1; Panchamoorthy, G., et al., J. Immunology 147: 3360-3369 (1991)), OKT6 (anti-CD1a; Reinherz, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 1588-1592 (1980)), 4A7.6 (anti-CD1b; Olive, D., et al., Immunogenetics 20: 253-264 (1984)), 10C3 (anti-CD1c; Martin, L.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 9189-9193 (1987)), W6/32 (anti-HLA-A, B,C; Brodsky, F.M., y Parham, P.P, J. Immunology 128: 129-135 (1982)), BMA031 (TCR anti-\alpha:\beta; Lanier, L.L., et al., en Leukocyte Typing III, editorial McMichael, A.J, págs. 175-178, Oxford University Press, 1987), OKT4 (anti-CD4; Reinherz, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 1588-1592 (1980)), OKT8 (anti-CD8\alpha; Reinherz, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 1588-1592 (1980)) y 2ST8-5H7 (anti-CD8\beta; Shiue, L., et al., J. Exp. Med. 168: 1993-2005 (1988)).

Se aislaron monocitos de concentrados de leucocitos de donantes normales, mediante adherencia plástica (Anegon, I., et al., J. Immunology 147: 1973- 3980 (1991)), y se separaron mediante incubación a 37ºC en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con EDTA 0,53 mM (PBS/EDTA). Las células adherentes eran típicamente >90% CD14^{+} y MHC de clase II^{+}, y negativas para CD1a, CD1b y CD1c, según se determinó mediante tinción superficial (datos no mostrados). Para inducir la expresión de CD1, los monocitos se cultivaron durante 60 horas en RPMI-1640 (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 10% (FCS, Hyclone) con 100 unidades/ml, tanto de GM-CSF, como de IL-4 (Genetics Research Institute). Las células se recogieron usando PBS/EDTA, como anteriormente.

La línea DN1 de células T se estableció a partir de la sangre periférica de un donante normal aleatorio. Las células mononucleares no adherentes se trataron con mAbs OKT4 y OKT8 y complemento de conejo, y las células viables restantes se pusieron en suspensión en una mezcla de mAbs OKT4 (anti-CD4), OKT8 (anti- CD8\alpha) y anti-TCR\delta1 (Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137-183 (1991)), durante 1 hora, se lavaron y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con glóbulos magnéticos acoplados a inmunoglobulina anti-ratón de cabra (Dynal). Tras la separación magnética y la separación de las células CD4^{+} y/o CD8^{+} y/o \delta-TCR, las células TCR^{+} CD4^{-}8^{-} \alpha:\beta restantes se cultivaron con números iguales de monocitos autólogos en medio completo (RPM-1640 con FCS al 10% y complementos adicionales, como se describió previamente por Morita, C.T., et al. (Eur. J. Immun.. 21: 2999-3007 (1991)) con 100 U/ml tanto de GM-CSF, como de IL-4. Se añadió un extracto soluble de M. tuberculosis, producido mediante sonicación de bacilos desecados (cepa H37Ra (Difco)) en PBS, seguida de centrifugación a 100.000 g para clarificar (es decir, para extraer el material insoluble) los sonicados, hasta una concentración de proteína bacteriana de 10 \mug/ml. Se obtiene una actividad antigénica más soluble (es decir, proliferativa de células T), a partir de sonicados de M. tb acuosos solubles, añadiendo detergentes como CHAPS u octil-glucósido durante la etapa de sonicación; sin adición de detergente, se pierde de 90 a 95% de la actividad antigénica durante la clarificación posterior a la sonicación. Los cultivos se volvieron a estimular cada 10 a 14 días con M. tuberculosis y monocitos CD1^{+} heterólogos (inducidos a expresar CD1 como se describió anteriormente) en medio completo, y se alimentaron cada tres a cuatro días con medio reciente que contenía interleuquina-2 (IL-2) recombinante 1nM.

Se realizaron ensayos de respuesta de proliferación de células T por triplicado, con 5 x 10^{4} de células T cada uno y se irradiaron APCs (5.000 Rad) en 200 \mul de medio completo en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Linbro). Se produjeron extractos solubles de M. leprae y Escherichia coli según se describió para M. tuberculosis. Se añadieron anticuerpos monoclonales como inmunoglobulina purificada, hasta una concentración final de 25 \mug/ml. Los cultivos se recogieron en el día cinco (día tres para el bloqueo de mAb), tras un pulso de seis horas con ^{3}H- timidina 1 \muCi (6,7 Ci/mmol, New England Nuclear), e incorporación de ^{3}H determinada mediante recuento de centelleo líquido. Los resultados se expresan como recuentos medios por minuto (CPM) de incorporación de ^{3}H-timidina de cultivos triplicados. Los monocitos aislados o las células mononucleares de sangre periférica totales (PBMCs) se trataron con GM-CSF e IL-4 recombinantes como anteriormente, o con 100 U/ml de IFN\gamma durante 60 horas, antes de combinarlas con células T para ensayos de proliferación. El clon DN1.C7 de células T es representativo de cuatro sublones caracterizados extensamente, derivados de DN1 mediante estimulación de fitohemaglutinina (PHA) en cultivo de dilución limitativa y propagado usando estimulación de PHA e IL-2, como se describió previamente. Morita, C.T, et al., Eur. J. Immunol. 21: 2999-3007 (1991). Todos los clones derivados de la línea DN1 tenían un fenotipo superficial indistinguible del mostrado en Fig. 1b, es decir, expresión TCR \alpha:\beta, sin expresión de CD4, y con expresión mínima o sin expresión de CD8.

Se realizaron ensayos de respuesta citolítica de células T, como sigue. Se han descrito métodos para transfectar células C1R y ensayar la actividad citolítica específica mediante liberación de ^{51}Cr, Balk, S.P., et al., Science 253: 1411-1415 (1991) y Morita, C.T., et al., Eur. J. Immun. 21: 2999-3007 (1991), respectivamente. Se aisló BK6, un clon de células T citotóxicas TCR \alpha:\beta que lisa células que presentan CD1a, a partir de la sangre de un paciente con SLE, según se describió previamente (Porcelli, S. et al., Nature 341: 447-450 (1989)), y el clon 3C8, un clon de células T citotóxicas TCR \alpha:\beta que lisa células que presentan CD1c, a partir de la sangre de un donante normal, usando el mismo método. Se marcaron células transfectadas con ^{51}Cr y se usaron como células diana en ensayos citolíticos con una proporción de efector (célula T) a diana (transfectante) de aproximadamente 50:1. Se han descrito métodos para ensayar la liberación de ^{51}Cr y calcular el % de lisis específica. Brener, M.B., et al., Nature 325: 689-694 (1987).

Se prepararon transfectantes estables de células T2, usando el método descrito para las células C1R. Balk, S.P., et al., Science 253: 1411-1415 (1991). Las APCs para los experimentos de fijación de glutaraldehído y cloroquina fueron PMBCs tratadas con GM-CSF e IL-4 como se describió anteriormente, y la fijación de glutaraldehído y el tratamiento con cloroquina de las APCs se realizaron según los métodos publicados. Chesnut, R.W., et al., J. Immun. 129: 2382-2388 (1982); Roncarolo, M.G., et al., J. Immun. 147: 781-787 (1991). La línea DG.1 de células T CD4^{+}, se derivó de un paciente de artritis reumatoide HLA-DR7^{+}, mediante estimulación repetida de los linfocitos del fluido sinovial con células B transformadas con EBV autólogas y un derivado de proteína purificado (PPD, Statens Serum Institute; datos no mostrados) de M. tuberculosis. Se realizaron ensayos de respuesta proliferativa como anteriormente, excepto porque se añadieron 2 x 10^{5} APCs por pocillo y se determinó la incorporación de ^{3}H-timidina después de tres días.

Resultados

A fin de desarrollar un sistema para detectar la presentación de antígeno por moléculas de CD1, se valoró la capacidad de varias citoquinas recombinantes para inducir la expresión de CD1a, CD1b y CD1c sobre los monocitos de sangre periférica, que normalmente no expresan niveles significativos de esas moléculas. Leukocyte Typing IV, Knapp, W, editorial Oxford University Press, Oxford, G.B., págs. 251- 269, 1989. Se observaron consecuentemente niveles elevados de CD1a, CD1b y CD1c, sobre monocitos cultivados con una combinación de factor estimulante de colonias de granulocito/macrófago (GM-CSF) e interleuquina-4 (IL-4) (Fig. 1a). Alternativamente, se puede usar GM-CSF solo, aunque el nivel de expresión de CD1 resultante es algo menor que el procedente del tratamiento combinado de GM-CSF e IL-4. Se puede usar también interleuquina 3 (IL-3), sola o en combinación con otras citoquinas. Los monocitos cultivados en ausencia de citoquinas, o aquellos cultivados con interferón-\gamma, no expresaron niveles significativos de CD1a, CD1b o CD1c (datos no mostrados).

Debido a que los monocitos son células presentadoras de antígeno (APCs) eficientes, se razonó que los monocitos CD1^{+} podrían estimular una respuesta de la célula T restringida a CD1, frente a un antígeno exógeno. Debido a que la mayoría de las células T específicas de CD1 identificadas hasta la fecha tienen un fenotipo doblemente negativo (DN; CD4^{-}8^{-}) (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447-450 (1989); Faure, F. et al., Eur. J. Immun. 20: 703-706 (1990)), la investigación se centró en este subconjunto de células y se produjo una línea de células T mediante estimulación repetida de células T CD4^{-}8^{-} TCR^{+} \alpha:\beta, con un extracto soluble de M. tuberculosis y monocitos CD1^{+} heterólogos (Fig. 1b).

Los estudios funcionales de la línea de células T resultante (denominada DN1), mostraron que dichas células T producían respuestas proliferativas específicas frente a antígenos derivados de M. tuberculosis y a los bacillos M. leprae, estrechamente relacionados, pero no frente a antígenos bacterianos no relacionados, como los de E. coli o el toxoide del tétanos (Fig. 2a). Estas respuestas dependían de los monocitos que se pretrataban con GM-CSF e IL-4 (Fig. 2b), y no se restringían por determinantes polimórficos del MHC (Fig. 2c). Esta ausencia de restricción del MHC era consecuente con la restricción de la presentación del antígeno por moléculas distintas del MHC. A fin de determinar si las moléculas de CD1 se requieren para la presentación de antígeno de M. tuberculosis, se determinaron los efectos de anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para moléculas de CD1 o MHC sobre la proliferación de la línea DN1 de células T y un subclón representativo, DN1.C7, inducida por M. tuberculosis. Sólo el mAb anti-CD1b mostró un bloqueo significativo de la respuesta proliferativa inducida por M. tuberculosis., y no se observaron efectos consistentes con mAbs anti- CD1a o CD1c, o con mAbs frente a determinantes monomórficos de moléculas de MHC de clase I o moléculas de MHC de clase II (Fig. 2d).

Los transfectantes de células B son dianas efectivas para la actividad de células T citolíticas CD4^{-}8^{-} TCR \alpha:\beta. Usando la línea celular linfoblastoide B C1R (Zenmour, J., et al., Immun. 148: 1941-1948 (1992)), se produjeron transfectantes estables que expresaban y presentaban CD1a, CD1b o CD1c a niveles comparables, y se ensayaron respecto a su capacidad para presentar M. tuberculosis en un ensayo citolítico. Sólo las células C1R transfectadas con secuencias de DNA que codificaban para CD1b e incubadas con M. tuberculosis previamente al ensayo, se lisaban mediante la línea DN1 de células T DN TCR \alpha:\beta y su subclón DN1.C7 (Figs. 4a y b). La especificidad de esta respuesta restringida a CD1b se confirmó usando dos clones testigo de células T CD4^{-}8^{-} TCR^{+} \alpha:\beta, BK3 y 3C8, que se derivaban mediante estimulación mitógena, sin exposición a antígenos de M. tuberculosis. Estudios previos muestran que BK6 y 3C8 lisan líneas celulares diana que expresan CD1a y CD1b, respectivamente (datos no mostrados). Como para todos los demás clones de células T reactivas a CD1 descritos previamente a esta memoria descriptiva (Porcelli, S., et al., Nature 341: 447-450 (1989); Faure, F., et al., Eur. J. Immun. 20: 703-706 (1990); Balk, S.P., et al., Science 253: 1411-1415 (1991)), estos clones parece que son autorreactivos y reconocen sus ligandos de CD1 no polimórficos, en ausencia de antígenos exógenos. Como se esperaba, los clones BK6 y 3C8 lisaban sólo trasnfectantes C1R que expresaban CD1a o CD1c, respectivamente, y la lisis no era afectada significativamente por la incubación previa de las células diana con M. tuberculosis (Figs. 4c y d).

La ausencia de restricción del MHC demostrada por los experimentos precedentes demostró que las moléculas presentadoras de antígeno codificadas por MHC no estaban implicadas en la presentación restringida a CD1b de antígenos de M. tuberculosis a la línea DN1. Como un ensayo más restrictivo de esta hipótesis, se produjeron transfectantes CD1b de la línea de células T2, en los que las deleciones cromosómicas extensivas en ambos loci del MHC producen una falta total de expresión de la molécula de clase II del MHC. Salter, R.D., et al., Immunogenetics 21: 235-246 (1985); Erlich, H., et al., Hum. Immun. 16: 205-219 (1986). Los genes transportadores ligados al MHC TAP-1 y TAP-2 (analizados en Parham, P., Nature 357: 193-194 (1992)) se delecionan también de T2, produciendo una expresión y función defectiva de las moléculas de clase I del MHC. Hosken, N.A., y Bevan, M., Science 248: 367- 370 (1990); Wei, M, y Cresswell, P., Nature 356: 443-446 (1992). Sin embargo, la transfección de CD1b en T2, condujo a la expresión de CD1b sobre la superficie celular, a un nivel similar al observado sobre otras líneas de células B (datos no mostrados) y produjo una célula diana que presentaba M. tuberculosis a la línea DN1 (Fig. 5a).

La presentación de antígenos exógenos a células T requiere generalmente la captación y tratamiento de moléculas de antígeno proteico complejo mediante células presentadoras de antígeno, procedimiento que se bloquea mediante fijación de aldehído de la superficie de la APC y mediante aminas lisosomotrópicas, como la cloroquina. Ziegler, H.K., y Unanue, E.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 175-179 (1982); Chesnut, R.W., et al., J. Immun. 129: 2382-2388 (1982). Mediante estos criterios, la presentación restringida a CD1b de M. tuberculosis mostró también un requerimiento de captación y tratamiento de antígeno. La fijación suave de APCs CD1b^{+} con glutaraldehído, anuló completamente su capacidad para estimular la línea DN1 en presencia de antígenos solubles de M. tuberculosis, aunque las mismas APCs pulsadas con M. tuberculosis previamente a la fijación, conservaban su capacidad de estimular una respuesta proliferativa (Fig. 5b). Adicionalmente, la presentación de antígenos de M. tuberculosis a la línea CD1 se inhibía fuertemente mediante cloroquina, con una dependencia de dosis prácticamente idéntica a la de la inhibición de la presentación de antígenos micobacterianos mediada por MHC de clase II (Fig. 5c), indicando que el tratamiento de los antígenos para respuestas restringidas a CD1b y MHC de clase II pueden implicar vías u organelos similares, o que las vías comparten uno o más factores celulares sensibles a cloroquina. Es interesante que se ha demostrado recientemente que las células T2 son defectivas en el tratamiento de antígenos presentados por moléculas de MHC de clase II (Riberdy, J.M, y Creswell, P., J. Immun. 148: 2586-2590 (1992)), debido a que las células T2 carecen de genes DMA y DMB. Morris, P., et al., Nature 368: 551-554 (1994); Fling, S.P., et al., Nature 368: 554-558 (1994). Por tanto, nuestro descubrimiento de que las células T2 transfectadas con CD1b pueden presentar M. tuberculosis a DN1, sugiere que los requisitos de tratamiento del antígeno para las moléculas CD1b y MHC de clase II, aunque similares en cuanto a la sensibilidad a cloroquina, no son idénticos.

Varios investigadores han especulado con que las células T carentes de expresión tanto de moléculas CD4 como CD8, podrían reconocer antígenos presentados por moléculas de la superficie celular distintas de las codificadas por los loci clásicos de MHC de clase I y II. Porcelli, S., et al., Immun. Rev. 120: 137-183 (1991); Janeway, C.A. Jr., et al., Immun. Today 6: 73-76 (1988); Buestone, J.A., y Matis, L.A., J. Immun. 142: 1785-1788 (1989). Los resultados anteriores muestran que un miembro de la familia CD1, CD1b, puede restringir la respuesta de las células T específicas CD4^{-}8^{-} no restringidas del MHC, a un antígeno extraño exógeno. Como otras proteínas CD1, las cadenas pesadas de CD1b se asocian no covalentemente con \beta_{2}-microglobulina (Olive, D., et al., Immunogenetics 20: 253-264 (1984)) y muestran una homología secuencial limitada pero significativa, tanto frente a moléculas de clase I, como de clase II, del MHC. Calabi, F., y Milstein, C., Nature 323: 540-543 (1986); Balk, S.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 252-256 (1989). Estas características estructurales de CD1b, junto con su papel crítico en el reconocimiento del antígeno (descrito anteriormente), sustentan la conclusión de que CD1b es una molécula presentadora de antígeno no polimórfica, codificada por un locus genético no ligado al MHC.

Estos resultados indican un papel potencial para las células T restringidas a CD1 en la defensa del hospedador normal frente a enfermedades microbianas. Los resultados anteriores sugieren un paralelismo funcional entre las moléculas de CD1 y de clase II del MHC, ya que ambas median la presentación de antígenos exógenos tratados a través de una vía sensible a cloroquina, y ambas pueden actuar también como ligandos para las TCRs de las células T autorreactivas. Porcelli, S., et al., Nature 341: 447-450 (1989); Glimcher, L.H., y Shevach, E.M., J. Exp. Med. 156: 640-645 (1982). La distribución tisular limitada de las moléculas de CD1 in vivo, proporciona una similitud adicional con la familia de clase II del MHC, ya que los miembros de ambas familias se expresan preeminentemente sobre tipos celulares implicados en la presentación del antígeno a las células T, incluyendo las células de Langerhans, células dendríticas en tejidos linfoides y muchos otros, células 8 y, posiblemente, monocitos activados por citoquinas. Porcelli, S., et al.,Immun. Rev. 120: 137-183 (1991). Por contraste, la ausencia de polimorfismo estructural de las moléculas de CD1, su regulación exclusiva por citoquina sobre los monocitos, y el fenotipo CD4-8- de las células T restringidas a CD1 aquí descritos, son diferencias importantes que distinguen a los sistemas de presentación de antígeno CD1 y MHC. Estas diferencias apuntan a un papel distinto para las células T restringidas a CD1 en la inmunidad celular.

Ejemplo 2 Un antígeno no peptídico es presentado por CD1b Métodos

El antígeno presentado por CD1b es una macromolécula no dializable (datos no mostrados). Se podría obtener una actividad más antigénica (es decir, proliferativa de células T) a partir de sonicados solubles acuosos de M. tb., añadiendo detergentes como CHAPS u octilglucósido durante la sonicación (véase más arriba). Este resultado sugiere que el antígeno es hidrófobo.

A fin de caracterizar la naturaleza química de los antígenos presentados por CD1, se purificaron antígenos micobacterianos de la cepa no patógena de M. tb. H37Ra (Difco) y de M. fortuitum (una cepa de crecimiento rápido que también contiene actividad antigénica). Las bacterias eran, bien bacterias disponibles comercialmente (M. tb. H37Ra, Difco) o se cultivaban y recogían (M. fortuitum), se sonicaban y se sometían a protocolos de fraccionamiento secuencial y se analizaban para la actividad biológica. Todas las fracciones producidas se ensayaron respecto a su capacidad para estimular la línea DN1 de células T DN, en un ensayo de proliferación de 5 días, usando monocitos irradiados, tratados con GM-CSF e IL-4 como APCs, y midiendo la incorporación de ^{3}H-timidina en un pulso de 6 horas Porcelli, S., et al., Nature 360: 593-597 (1992)). La pared celular, la membrana celular y las fracciones citoplasmáticas se prepararon, bien a partir de M. tb. o de M. fotuitum, usando un método adaptado de protocolos publicados. Hunter, S.W. et al., Journal of Biological Chemistry 265: 14065-14068 (1990). En resumen, las células se liofilizaron, se volvieron a suspender en PBS/octilglucósido, se sonicaron durante 20 minutos y se sometieron a ultracentrifugación diferencial para producir fracciones citosólica, de membrana y de pared celular. Los glóbulos de pared celular se purificaron adicionalmente mediante un gradiente de sacarosa diferencial. Las características estructurales de las tres fracciones se confirmaron mediante tinción negativa con microscopía electrónica. La mayoría de la bioactividad para la línea celular DN1 estaba presente en la fracción de la pared celular (datos no mostrados).

Para valorar directamente si el antígeno restringido a CD1b es una proteína, se realizó una serie de digestiones del antígeno con proteasa. Usando diversas endopeptidasas, bien con especificidad de aminoácido limitada, (quimotripsina (residuos hidrófobos), tripsina (Lys, Arg), y V-8 (ácidos)), o con un reconocimiento de aminoácidos amplio (subtilisina, proteinasa K, pronasa), se digirieron los sonicados, bien de M. tb. o de M. fortuitum, y luego se ensayaron para la capacidad de inducir respuestas proliferativas de las células T. Como testigo, se ensayó también un clon DG.1 de células T CD4^{+}, restringido a DR7, procedente de este laboratorio, que reconoce un determinante en el PPD (derivado proteico purificado) micobacteriano. El análisis mediante SDS-PAGE y la tinción posterior con plata, demostró que la digestión con proteasa V8, proteinasa K, pronasa E o subtilisina, degrada las proteínas contenidas en las preparaciones antigénicas micobacterianas (datos no mostrados).

Resultados

El antígeno de M. tuberculosis reconocido por DG.1, una línea celular de células T CD4^{+} representativa, restringida a la clase II de MHC, se transforma en inefectivo mediante tratamiento con proteasa V8, proteinasa K, o tripsina (Figura 6). Como se muestra en la Figura 6, las células DG.1 proliferaron fuertemente como respuesta al digerido falso del sonicado micobacteriano, pero con la excepción de la quimotripsina, todos los demás tratamientos con proteasa anularon completamente la respuesta proliferativa.

Por contraste, los antígenos de M. tuberculosis y M. fortuitum presentados a la línea DN1 por CD1b no quedan afectados por estas proteasas ampliamente reactivas (Figuras 7 y 8, respectivamente). El antígeno micobacteriano presentado por CD1b es diferente fundamentalmente del presentado por las moléculas presentadoras de antígeno de clase I y II del MHC. Está bien establecido que las moléculas del MHC se unen y presentan antígenos peptídicos de aproximadamente 8-9 aminoácidos para la clase I y de 13-25 aminoácidos para la clase II. Debido a que dicho antígeno presentado por CD1b es una macromolécula resistente a proteasa, no parece probable que sea un péptido. Por tanto, el sistema CD1 es el primer sistema de presentación de antígeno conocido que presenta sustancias extrañas distintas de péptidos, a las células T TCR^{+} \alpha:\beta.

Ejemplo 3 Purificación de un antígeno presentado por CD1b Métodos

Se cultivaron bacterias M. fortuitum en cultivo líquido hasta la fase estacionaria y se recogieron mediante centrifugación, se esterilizaron mediante aplicación de vapor de agua en autoclave (250ºC, 125,11 KPa) y se liofilizaron. Bacterias M. tb. (cepa H37Ra, Difco) o M. fortuitum se pusieron en suspensión en solución salina tamponada con fosfato (200 mg de bacterias por 5 ml de PBS), y la suspensión bacteriana se sonicó con una sonda de baño de ultrasonidos para disgregar las células. El sonicado resultante se extrajo con disolventes orgánicos, usando un sistema de extracción de 2 fases basado en Folch (cloroformo/metanol/agua) que extrae cuantitativamente lípidos micobacterianos en una fase orgánica. Goren, M.B. y Brennan, P.J., Mycobacterial Lipids: Chemistry and Biologic Activities in Tuberculosis, 1979. El sonicado se combinó con tres volúmenes de una solución de cloroformo:metanol (2:1 v/v) en un recipiente de vidrio, y la mezcla se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 24 horas. Las fases de la mezcla se separaron mediante centrifugación a 800 g, y la fase orgánica se recogió y transfirió a un matraz de vidrio. Cada fracción se secó a continuación mediante evaporación rotativa (fase orgánica) o se liofilizó (fase acuosa y superficie de contacto). Tras la evaporación, la fase orgánica dejó una película fina de material ceroso sobre la superficie del matraz. A fin de preparar material para ensayo en ensayos de proliferación de células T, se reconstituyeron alícuotas de las fracciones en forma de liposomas, mediante adición de agua (20 ml por 200 mg de bacterias en el sonicado original), seguido de sonicación en un baño de ultrasonidos de agua. A continuación, la suspensión bruta resultante se forzó a pasar repetidamente a través de una membrana de filtro de 0,1 nm, a fin de crear una suspensión se liposomas de tamaño uniforme. Alternativamente, se añadió medio de células T con suero bovino fetal al 10%, a la fracción seca y sonicada, sin preparación adicional.

Para una purificación adicional, el material extraído de M. tuberculosis como se describió anteriormente, se disolvió en hexano y se aplicó a una columna de ácido silícico. La elución con disolventes orgánicos de polaridad creciente sobre columnas de sílice, logra la separación de lípidos basada en su polaridad. Los lípidos más polares, como fosfolípidos, se unen con la máxima fuerza a la columna de sílice y eluyen los últimos, mientras que los glicolípidos se unen generalmente con menor fuerza y eluyen antes. Los lípidos neutros, como triglicéridos o esteroles, se unen con la máxima debilidad y, por tanto, eluyen los primeros.

Se preferían columnas de extracción de fase sólida (SPE) abiertas y pequeñas (BakerBond, JT Baker), debido a la capacidad de tratar muchas muestras simultáneamente. Se usó una columna basada en sílice "unida" (unida covalentemente) con grupos funcionales ciano (CN), para fraccionar los extractos orgánicos de M. tb. La fase orgánica del extracto de cloroformo/metanol de bacterias se secó y se volvió a poner en suspensión en hexano. El equivalente de 5,3 mg de bacterias desecadas en 200 \mul de hexano se cargó en una columna SPE CN de 0,5 g. La columna se lavó con hexano y luego con cloroformo en hexano al 25% (v/v) con más del 100% de recuperación de bioactividad. Analizando la fracción activa sobre placas TLC basadas en sílice, según el método de Kupke y Zeugner (Christie, W.W. Lipid analysis, pág. 117, Pergamon Press, Oxford, G.B., 1982)), sólo se visualizaron dos especies principales de lípidos con acetato cúprico, correspondientes a ácidos grasos libres y ácidos micólicos (datos no mostrados). Estos resultados reflejan una purificación destacada desde el material orgánico de partida.

Los ensayos de proliferación se recogieron en el día 2 (DG.SF68), el día 3 (DG.1) o el día 5 (DN1). DG.SF68 es un clon de células T V\gamma2V\delta2, derivado en este laboratorio (PNAS en prensa, CM). Las APCs fueron monocitos tratados con GM-CSF e IL-4 (DN1) o PBMC (DR7^{+}) (DG.1), o PBMC sin tratar (DG.SF68). Los ensayos citolíticos se presentan como % de lisis específica y se realizaron como se describe. Porcelli, S. et al., Nature 341: 447-450 (1989). Los datos mostrados (Figura 9) corresponden a una proporción de efector a diana de 50:1 y a un antígeno de M. tuberculosis a una dilución de 1:20.

Resultados

El antígeno relevante de M. tuberculosis se aísla de una preparación comercial de la cepa H37Ra (Difco), mediante extracción en una mezcla de cloroformo y metanol, según se describió anteriormente. Aunque la superficie de contacto contiene más de 95% de proteínas, 100% de la actividad antigénica restringida a CD1b (es decir la capacidad para inducir una respuesta proliferativa de células T DN TCR \alpha:\beta) de los extractos de Mycobacterium se extrae en la fase orgánica (Figura 9a). Esto sustenta fuertemente la conclusión original de la naturaleza no peptídica del antígeno bacteriano relevante. Por contraste, se localizó un antígeno convencional restringido a la clase II del MHC, reconocido por las células T DN TCR^{+} \gamma:\delta, en la fase de la superficie de contacto entre las fases acuosa y orgánica (Figura 9b). Por contraste, en cuatro preparaciones antigénicas independientes, el antígeno restringido a CD1b se repartió cuantitativamente en la fase orgánica. Los resultados de ensayos citolíticos de transfectante de las fases, confirmaron que el antígeno presentado por CD1b está presente en la fase orgánica (Figura 10).

Bajo estas condiciones, 100% de la actividad antigénica presentada por CD1 se recuperó cuantitativamente tras cromatografía SPE CN. Además, la extracción de fase orgánica sirvió como una etapa de purificación excelente y la fase orgánica se usó como materia prima para la cromatografía posterior. Un procedimiento alternativo y algo más general para purificar el antígeno para la cromatografía posterior es saponificar bacterias completas o sonicadas, y extraer con una solución acidificada de hexanos. Una purificación adicional del antígeno se obtiene usando cromatografía de ácido silícico, como se describió anteriormente.

Ejemplo 4 El ácido micólico es un antígeno presentado por CD1b Métodos

Dados los resultados anteriores y otros datos preliminares que sugieren la actividad cromatografiada conjuntamente sobre columnas de HPLC de sílice modificada con CN con preparaciones de cadenas acílicas de ácidos grasos libres (datos no mostrados), parecía plausible que el antígeno presentado por CD1b fuese un lípido micobacteriano exclusivo, posiblemente un ácido micólico. A fin de afrontar este problema, se usó un método de HPLC que separa los ácidos micólicos sobre cromatografía de columna de fase inversa, para preparar ácidos micólicos. Butler, W.R., et al. Journal of Clinical Microbiology 23: 182-185 (1986); Butler, W.R., et al. Journal of Clinical Microbiology 26: 50-53 (1988); Floyd, M.M., et al., Journal of Clinical Microbiology 30: 1327-1330 (1992). La cromatografía de fase inversa separa las cadenas de acilo primeramente basándose en la longitud de la cadena acílica o "número de carbonos", por tanto, es relativamente fácil lograr una buena separación entre ácidos grasos libres y ácidos micólicos, que son mucho mayores.

Este método de HPLC requiere una saponificación inicial de la muestra, seguida de derivatización de los ácidos grasos o ácidos micólicos con el compuesto bromuro de p-bromofenacilo, que absorbe ultravioletas (DO_{254}), que se une al extremo carboxilo de una cadena acílica. En experimentos preliminares, se determinó que el procedimiento de derivatización de la fracción bacteriana con bromuro de p-fenacilo destruía la bioactividad. Sin embargo, la actividad antigénica restringida a CD1b se podría recuperar luego mediante saponificación con KOH metanólico, procedimiento que libera el extremo carboxilo de la cadena acílica, escindiendo el grupo bromuro de fenacilo (como se ensayó mediante DO_{254} sobre HPLC). Este resultado indica que la cadena acílica tiene que escindirse para lograr una forma que se pueda presentar por APCs positivas y/o que un grupo carboxilo libre es crítico para la presentación del antígeno restringida a CD1b. Esta es una evidencia adicional de que el antígeno comprende una cadena acílica.

La preparación purificada de columna SPE CN (Ejemplo 3) se usó como materia prima para la cromatografía C18. Las muestras se saponificaron con KOH metanólico y se derivatizaron con el grupo bromuro de bromofenacilo, absorbedor de UV. La fracción activa se ensayó sobre una columna C18 (Alltech Nucleosil C18 5 \mum, 25 cm x 4,6 mm), usando un gradiente lineal de 30 a 90% de cloruro de metileno en metanol, durante 50 minutos a 1 ml/min. Usando como referencia un estándar interno C_{90} (Ribi), el cromatograma resultante (Figura 12, cuadro a, parte superior), tiene un patrón comparable a los resultados publicados. Floyd, M.M., et al., Journal of Clinical Microbiology 30: 1327-1330 (1992). Las fracciones se volvieron a suspender en medios completos con FCS al 10% y se ensayó a una dilución de 1:17, en relación con el volumen de sonicado original.

Resultados

Se descubrió que la bioactividad, ensayada mediante el ensayo de respuesta proliferativa de células T, migraba conjuntamente con los picos tempranos en la región de los ácidos micólicos (Fig. 12a). Para confirmar que el ácido micólico es presentado por CD1b, se ensayó una fuente alternativa de ácidos micólicos, cord factor purificado (dimicolato de trehalosa; Fig. 11). Tras saponificación, el dimicolato de trehalosa purificado de M. tb. (de Sigma) o M. kansasii (de Patrick Brennan), estimuló la proliferación de la línea DN1 de células T (Fig. 12b). Sin embargo, no se logró ninguna estimulación mediante material preparado de dibehanato de trehalosa purificado, un derivado sintético del cord factor que contiene dos cadenas de ácido graso C_{22}, más que ácidos micólicos, que se liberan mediante saponificación. Esto sustenta fuertemente que el ácido micólico, y no la trehalosa (que está presente en cada una de las muestras) ni los ácidos grasos, es el antígeno presentado por CD1b a la línea DN1 de células T TCR \alpha:\beta doblemente negativas. A continuación, se realizó un análisis de HPLC del cord factor saponificado de Sigma, y nuevamente se localizó la bioactividad en las fracciones correspondientes a los picos de ácido micólico tempranos (Fig. 12c). Conjuntamente, los datos anteriores demuestran que el antígeno micobacteriano restringido a CD1b, reconocido por la línea DN1 de células T, es una especie de ácido micólico.

Se sabe que las micobacterias son adyuvantes altamente efectivos. Aldovini, A., y Young, R.A., Nature 351: 479-482 (1991). Una fuente del antígeno presentado por CD1b, ácido micólico, usada aquí es el dimicolato de trehalosa (es decir, cord factor micobacteriano), que se ha demostrado que fomenta la formación de anticuerpos (Bekierkunst, A., et al., J. Bacteriol. 100: 95-102 (1969); Bekierkunst, A., et al., Infection and Immunity 4: 245-255 (1971); Bekierkunst, A., et al., Infection and Immunity 4: 256-263 (1971)) y estimula la inmunidad inespecífica frente a infecciones bacterianas (Parant, M., et al., Infect. Immun. 20: 12-19 (1978)) y tumores (Bekierkunst, A., et al., Infection and Immunity 10: 1044-1050 (1974).

A fin de asegurar que la actividad antigénica purificada contiene un antígeno auténtico y no un mitógeno inespecífico, se observó la especificidad de la respuesta proliferativa de células T frente a preparaciones de M. tb. brutas, a ácido micólico purificado mediante HPLC de M. tb. y cord factor saponificado. Los sonicados totales de M. tb. (Fig. 4, cuadro superior), contienen antígeno reconocido por la línea DG.1 de células T CD4^{+} TCR^{+} \alpha:\beta restringidas a la clase II del MHC, así como un antígeno reconocido por la línea DN1 de células T restringidas a CD1b y la línea DN6 de células T restringidas a CD1c (véase Ejemplo 5, debajo). Sin embargo, el ácido micólico purificado por HPLC procedente, bien de M. tb. (Fig. 14, cuadro central) o de cord factor saponificado (Fig. 14, cuadro inferior), contiene antígenos reconocidos sólo por células T DN1 restringidas a CD1b. Esta especificidad se demuestra también en el ensayo citolítico de transfectante (Fig. 13). La respuesta restringida a CD1b de DN1 se bloqueaba mediante anticuerpos anti-CD1b, pero no quedaba afectada por anticuerpos frente a la clase I o II del MHC (Figura 15, cuadro superior).

Ejemplo 5 Presentación de antígeno por CD1c

Además de la presentación de antígenos por CD1b descrita en el Ejemplo 1, las moléculas CD1c también presentan antígenos. Se aisló una línea de células T separada CD4^{-}8^{-} TCR^{+} \alpha:\beta, derivada mediante estimulación repetida con monocitos tratados con GM-CSF e IL-4 (para inducir la expresión de CD1) y antígenos de M. tuberculosis, y se denominó DN2 (también denominada 8.23.DN1). La proliferación de DN2 se inhibe completamente mediante la adición de mAbs frente a CD1c, pero no queda afectada por adición de mAbs frente a CD1b (Figura 15, cuadro inferior). Un ensayo citolítico confirma este resultado: se preincubaron células C1R transfectadas con vector solo o con vector que codificaba CD1a, CD1b o CD1c, con o sin sonicado de M. tuberculosis, y se usaron como dianas en un ensayo citolítico. Sólo se reconocen las células C1R CD1c^{+} (Fig. 16); el reconocimiento se incrementa mediante preincubación con el sonicado. Por tanto, las moléculas CD1c presentan antígenos de M. tuberculosis a células T DN2.

Se aisló una segunda línea de células T CD4^{-}8^{-} TCR+ \alpha:\beta, restringidas a CD1c, derivada mediante estimulación repetida con monocitos tratados con GM-CSF e IL-4 (para inducir la expresión de CD1) y antígenos de M. tuberculosis, y se denominó DN6. Los ensayos citolíticos (Fig. 17) indican que DN6 lisa células CD1c^{+}, en presencia de antígeno de M. tb.

Ejemplo 6 Caracterización de un antígeno presentado por CD1c

El antígeno presentado a células T DN6 por CD1c no es ácido micólico (Fig. 14, cuadro central). Sin embargo, la caracterización química del antígeno reconocido por DN6 indica que el antígeno es un lípido complejo. Cuando los sonicados de M. tb. se extraen con cloroformo:etanol (como se describió en el Ejemplo 3), la actividad antigénica se encuentra sustancialmente, tanto en la fase de la superficie de contacto, como en la fase orgánica (Fig. 18). El antígeno recuperado de la fase orgánica puede unirse a columnas SPE CN y eluirse (como se describió en el Ejemplo 3). Estos estudios demuestran que el antígeno es hidrófobo y tiene las propiedades cromatográficas de un lípido.

Sin embargo, a diferencia del antígeno micobacteriano restringido a CD1b, los resultados de experimentos adicionales indican que el antígeno presentado por CD1c, reconocido por DN6, es un lípido complejo y no una cadena acílica libre. La saponificación de los sonicados de M. tb. elimina la respuesta proliferativa de DN6 (Fig. 20). Debido a que la saponificación rompe enlaces éster y conecta cadenas acílicas a las cadenas principales de carbohidrato, este resultado sugiere que el antígeno reconocido por las células T DN6 es un resto distinto de una cadena acílica libre, o comprende un resto adicional distinto de una cadena acílica libre. La saponificación presumiblemente destruye o extrae el resto adicional que puede ser, p.ej., una cadena principal de polisacárido o un punto de ramificación. Por tanto, en contraste con el reconocimiento del ácido micólico libre por la línea de células T DN1, la línea de células T DN6 reconoce una estructura lipídica más compleja.

Es digno de mención que los antígenos presentados por CD1, reconocidos por líneas DN1 y DN6 de células T, no son exclusivos de M. tuberculosis. Mas bien, los antígenos presentados por CD1, reconocidos por DN1 y DN6, presentan reacción cruzada frente a antígenos encontrados en muchas especies micobacterianas ensayadas hasta la fecha (M. fortuitum, M. avium, M. bovis (BCG) y M. leprae). En el caso del reconocimiento restringido a CD1c por células T DN6, se reconoce un antígeno en Corynebacteria (datos no mostrados), un género separado pero relacionado que produce ácidos micólicos. Takayama, K., y Qureshi, N., "Structure and Synthesis of Lipids" en The Mycobacteria: A Sourcebook, parte A, Kubica, G.P. y Wayne, L.G., editores, Marcel Dekker, New York & Basel, 1984. Por tanto, los antígenos presentados por CD1 incluyen al menos varios antígenos lipídicos bacterianos; en el caso de la autoimunidad, los antígenos presentados por CD1 incluyen antígenos lipídicos endógenos.

Ejemplo 7 Vacunas que comprenden antígenos presentados por CD1+

Previamente a la presente descripción, no se sabía que los lípidos poseían inmunogenicidad mediada por células T específicas, potencialmente potente. Los antígenos lipídicos presentados por CD1 aquí descritos, se pueden usar como componentes esenciales de composiciones diseñadas para funcionar como vacunas para patógenos micobacterianos. Las vacunas que comprenden antígenos presentados por CD1 se pueden administrar directamente mediante inyección. Alternativamente, debido a la presencia de CD1 sobre células encontradas en el epitelio gastrointestinal (Bleicher, P.A., et al., Science 250: 679-682 (1990)), se puede emplear la administración oral de vacunas que comprenden antígenos presentados por CD1, para introducir tales vacunas en un animal que precise una vacuna que comprenda un antígeno presentado por CD1.

Las vacunas que comprenden los antígenos presentados por CD1 de la presente invención se formulan según métodos conocidos. Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18, Gennaro, A.R., editor, Mack, Easton, 1990; The Pharmacologist Basis of Therapeutics, Edición 7, Gilman, A.G., et al., editores, MacMillian, New York, 1985. Se pueden añadir agentes estabilizantes y solubilizantes de lípidos, farmacéuticamente aceptables, conocidos para los expertos en la técnica, a las vacunas que comprenden antígenos presentados por CD1, para aumentar su efectividad. Teng, N., et al., solicitud de patente PCT publicada WO 91/01750 (21 de febrero de 1991). Nunberg, J.H., patente de EE.UU. 4.789.702 (6 de diciembre de 1988).

Ejemplo 8 Medios y métodos para inhibir la presentación de antígeno restringida a CD1

La descripción del sistema de presentación de antígeno CD1 permite varios medios y métodos para inhibir la presentación de antígeno restringida a CD1. Cualquier composición que inhiba el tratamiento de antígenos presentados por CD1, que interfiera con la unión del antígeno a una molécula de CD1, o que interfiera con la unión del complejo CD1:antígeno a una molécula de TCR, inhibirá la presentación de antígeno restringida a CD1. Tales composiciones, llamadas agentes bloqueantes de CD1, son útiles para controlar la inmunidad mediada por células T, que se produce, por ejemplo, en las enfermedades autoinmunes. Oksenberg, J.R, et al., J. Neurol. Sci. 115 (suplemento): S29-S37 (1993).

Los agentes bloqueantes de CD1 incluyen, pero no se limitan a, (1) molécula de CD1 purificada, o uno de sus derivados sintéticos, capaces de unirse a un antígeno presentado por CD1, y de prevenir la interacción del antígeno con el CD1 presentado sobre las APCs; (2) un polipéptido TCR purificado o uno de sus derivados, capaz de unirse a un complejo CD1-antígeno sobre una APC CD1^{+} y de evitar la interacción del complejo con los receptores de las células T; (3) un antagonista de antígeno que comprende un antígeno presentado por CD1, modificado químicamente, o un derivado de un antígeno presentado por CD1; (4) un complejo CD1-antígeno purificado o uno de sus derivados sintéticos, capaz de unirse a un receptor de las células T que reconoce un complejo CD1-antígeno sobre una APC CD1^{+} y de evitar la interacción de los receptores de las células T con los complejos CD1-antígeno; (5) un anticuerpo que se une a una molécula de CD1 y, por tanto, evita la interacción de la molécula de CD1 y de un antígeno presentado por CD1; (6) un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une a una TCR, que reconoce un antígeno presentado por CD1 y, por tanto, evita la interacción del TCR con su correspondiente complejo CD1:antígeno; y (8) una composición que bloquea una etapa esencial en la vía, mediante la que se tratan los antígenos presentados por CD1 antes de ser presentados.

Los Ejemplos precedentes contienen ejemplos de agentes bloqueantes de CD1, como sigue.

Los agentes bloqueantes de CD1 de tipo (5) están representados por el anticuerpo monoclonal WM25 frente a CD1b, que inhibe específicamente la presentación de antígeno restringida a CD1b (Fig. 15, cuadro superior) y el anticuerpo monoclonal 10C3 frente a CD1c, que inhibe específicamente la presentación de antígeno restringida a CD1c (Fig. 15, cuadro inferior). Un experto en la técnica puede usar los métodos aquí descritos para aislar anticuerpos que actúan como agentes bloqueantes de tipo (6) o (7), A Critical Analysis of Antibody Therapy in Transplantation, Burlington, W.J., editorial CRC Press, Boca Raton, 1992.

Los agentes bloqueantes de tipo (8) están representados por cloroquina (Fig. 5c), que inhibe una etapa en el tratamiento de antígenos restringidos a CD1b. Los métodos para formular y administrar cloroquina son conocidos por los expertos en la técnica. Webster, L.T., "Drugs Used in the Chemotherapy of Protozoal Infections", capítulos 41 y 42 en Goodman y Gilma's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8ª edición, Gilman, A.G., et al., editores Pergamon New Press, New York, 1990. Aunque la cloroquina inhibe también la presentación de antígeno restringida a MHC, los expertos en la materia, usando los métodos aquí descritos, pueden identificar y/o aislar composiciones que inhiben específicamente el tratamiento de los antígenos restringidos a CD1.

Los agentes bloqueantes de tipo (3), es decir, antagonistas de antígeno, se pueden derivar de antígenos restringidos a CD1 mediante los métodos de la invención. Variantes de antígenos peptídicos restringidos a MHC, que se unen con afinidades más débiles que el antígeno peptídico original, actúan como antagonistas para células T maduras en la presentación de antígenos restringidos a MHC. Wraith, D.C. et al., Cell 59: 247-255 (1989); Smilek, D.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 9633-9637 (1991). De igual forma, los antígenos presentados por CD1 se aíslan mediante los métodos de la invención y se modifican químicamente, según técnicas estándar, a fin de producir derivados de antígeno presentados por CD1, no antigénicos o débilmente antigénicos. Por ejemplo, el ácido micólico derivatizado con bromuro de p- bromofenacilo es no antigénico (Ejemplo 4). Los antagonistas de antígeno se identifican como derivados de antígeno presentados por CD1, que inhiben o evitan las respuestas de células T proliferativa o citolítica de transfectante CD1, que se producen sólo cuando está presente el antígeno presentado por CD1 original, no modificado (Ejemplo 1).

Los agentes bloqueantes de tipo (2), es decir, derivados de TCR que bloquean la interacción del complejo antígeno:CD1 con las moléculas de TCR sobre las células T, se pueden preparar por los expertos en la técnica a partir de la descripción. Las moléculas de DNA que codifican los polipéptidos TCR presentados por una línea de células T que reconoce un antígeno presentado por CD1 de la invención, se aíslan según métodos conocidos en la técnica. Oskenberg, J.R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 988-992 (1989); Oskenberg, J.R., et al., Nature 345: 344-346 (1990) y errata, Nature 353: 94 (1991); Uematsu, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 534-538 (1991); Panzara, M.A., et al., Biotechniques 12: 728-735 (1992); Uematsu, Y., Immunogenet. 34: 174-178 (1991). La secuencia de DNA se convierte en una secuencia polipeptídica, y la parte de la secuencia polipeptídica que corresponde a la región variable que se une al antígeno, de un polipéptido TCR, se usa para diseñar oligopéptidos sintéticos que se unen a los complejos CD1:antígeno sobre las APCs, inhibiendo así la presentación del antígeno. Los oligopéptidos se sintetizan químicamente según métodos estándar (Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockland, Illinois, 1985) y se purifican a partir de mezclas de reacción mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de fase inversa. Actualmente están en marcha experiencias piloto de tratamiento de seres humanos que padecen una enfermedad autoinmune, MS, con péptidos derivados de moléculas TCR \alpha:\beta restringidas a MHC. Oksenberg, J.R., et al., J. Neurol. Sci. 115 (suplemento): S29-S37 (1993). Los péptidos derivados de TCR que funcionan como agentes bloqueantes de CD1, se identifican como péptidos derivados de TCR que inhiben o evitan las respuestas de células T proliferativa o citolítica de transfectante CD1, que se producen en presencia del antígeno presentado por CD1 (Ejemplo 1).

Los ensayos para antígenos presentados por CD1 aquí descritos, se pueden usar para escrutar bibliotecas moleculares para agentes bloqueantes de CD1. Se preparan bibliotecas de composiciones molecularmente diversas mediante medios químicos, bioquímicos y/o biotecnológicos. Tales bibliotecas incluyen bibliotecas combinatorias de péptidos sintéticos (Houghten, R.A., et al., Biotechniques 13: 412-421 (1992)) y bibliotecas de proteínas de fusión preparadas mediante tecnología de DNA recombinante, p.ej. bibliotecas de presentación de fagos. Koivunen, E., et al., J. Biol. Chem. 268: 20205-20210 (1993). Las bibliotecas se escrutan para la presencia de miembros que inhiben o evitan las respuestas de células T DN proliferativa y/o citolítica de CD1 aquí descritas. Se aíslan miembros bloqueantes de CD1 de la biblioteca, según técnicas conocidas en la técnica y apropiadas para el tipo de biblioteca empleada. Lowman, H.B., et al., Biochemistry 30: 10832-10838 (1991); Felicia, F., et al., J. Mol. Biol. 22: 301-310 (1991); Dandekar, T., et al., Neurochem. Int. 7: 247-253 (1985); Owens, R.A., et al., Biophys. Res. Commun. 181: 402-408 (1991).

A fin de detectar un agente bloqueante de CD1 en una muestra, se realizan ensayos para el antígeno presentado por CD1 por duplicado. El primer ensayo (testigo) es un ensayo proliferativo o citolítico de células T, realizado esencialmente según se describe en el Ejemplo 1. El segundo ensayo es idéntico al primer ensayo en todos los aspectos excepto en uno: el segundo ensayo contiene adicionalmente una muestra sospechosa de contener un agente bloqueante de CD1. La presencia de agentes bloqueantes de CD1 en la muestra se correlaciona con una respuesta proliferativa o citolítica de células T en el segundo ensayo, que es significativamente menor que la medida en el primer ensayo.

Claims

1. Un método para producir una vacuna que contiene un antígeno presentado por CD1, que comprende las siguientes etapas:

(a): incubar una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1 con células positivas para CD1;

(b): separar dichas células positivas para CD1, que presentan antígeno unido a CD1, de dicha muestra;

(c): separar el antígeno presentado por CD1 de dichas células positivas para CD1 que presentan dicho antígeno; y

(d): formular dicho antígeno presentado por CD1 separado, para formar una vacuna.

2. Un método para producir una vacuna que contiene un antígeno presentado por CD1, que comprende las siguientes etapas:

(a): fraccionar una muestra que contiene un antígeno presentado por CD1 en dos o más fracciones;

(b): ensayar dichas fracciones para la presencia de un antígeno presentado por CD1; y

(c): formular una o más fracciones que contienen dicho antígeno presentado por CD1, de forma que constituyan una vacuna.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que:

(a): dicho antígeno presentado por CD1 se presenta mediante una molécula de CD1 seleccionada del grupo formado por CD1a, CD1b, CD1c, CD1d y CD1d; o

(b): dicho antígeno presentado por CD1 se aísla de una especie micobacteriana, seleccionada del grupo formado por M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, M. fortuitum y M. avium.

4. Una vacuna que induce una respuesta de una célula T específica en un animal, tras su administración a dicho animal, comprendiendo dicha vacuna una cantidad efectiva, inductora de una célula T específica, de un antígeno presentado por CD1 o uno de sus equivalentes funcionales y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Una vacuna según la reivindicación 4, producida mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Una vacuna según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente:

(a): una o más citoquinas u otras moléculas que inducen la expresión de CD1 sobre células presentadoras de antígeno; o

(b): uno o más antígenos diferentes.

7. Uso de un antígeno presentado por CD1 (o su equivalente funcional), para la fabricación de un medicamento que induce una respuesta de una célula T específica, para la vacunación.

8. Una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 y 6, o uso según la reivindicación 7, en los que dicho antígeno presentado por CD1:

(a): se aisla de dimicolato de 6,6-trehalosa saponificado; o

(b): es un lípido; o

(c): es un ácido micólico.

9. Un agente bloqueante de CD1 que inhibe la presentación de antígeno restringida a CD1, seleccionado del grupo formado por un anticuerpo, un péptido sintético, un inhibidor de la presentación de antígeno restringida a CD1, y un antagonista de antígeno derivado de un antígeno presentado por CD1.

10. Un método para inhibir la presentación de antígeno restringida a CD1 por células positivas para CD1, que comprende la etapa de poner en contacto células que presentan una molécula de CD1 con el agente bloqueante de CD1 de la reivindicación 9, excluyendo los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

11. Un método para detectar un antígeno presentado por CD1 en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a): poner en contacto dicha muestra con células positivas para CD1;

(b): poner en contacto dichas células positivas para CD1 con células T; y

(c): medir la respuesta proliferativa o citolítica de dichas células T.

12. Un método para aislar un antígeno presentado por CD1 de una muestra, que comprende las siguientes etapas:

(a): incubar dicha muestra con células positivas para CD1 que se unen a dicho antígeno presentado por CD1, a fin de generar células positivas para CD1 que presenten dicho antígeno CD1 unido;

(b): separar dichas células positivas para CD1 que presentan antígeno unido, de dicha muestra; y

(c): separar el antígeno presentado por dichas células positivas para CD1 que presentan dicho antígeno.

13. Un antígeno presentado por CD1, aislado, producido mediante un método según la reivindicación 12.

14. Un antígeno presentado por CD1 para uso en terapia, en el que el antígeno induce una repuesta de células T específicas.