ES2201099T3

ES2201099T3 - Aparato y procedimiento para la cuantificacion de material biologico en una muestra liquida.

Info

Publication number: ES2201099T3
Application number: ES95911886T
Authority: ES
Inventors: Stephen C. Wardlaw; Ali Naqui; Mark W. Pierson; Thomas R. Weschler; Michael P. Finnerty; Charles R. Carpenter
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1995-02-22
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2015-02-22
Also published as: PT746412E; CA2183757C; WO1995023026A1; US5620895A; EP0746412B1; ATE243074T1; US5753456A; JP3145406B2; DE69531097T2; EP0746412A1; DK0746412T3; MX9603595A; DE69531097D1; AU1928795A; CA2183757A1; US5518892A; JPH09509609A

Abstract

ARTICULO (A) ADAPTADO PARA CONTENER UNA MUESTRA LIQUIDA PARA LA CUANTIFICACION DEL MATERIAL BIOLOGICO EN LA MISMA. EL ARTICULO INCLUYE UNA BOLSA CON UNA LAMINA EN LA SUPERFICIE SUPERIOR (1) Y UNA EN LA INFERIOR (2), QUE ENCIERRAN UN VOLUMEN ENTRE ELLAS. LA BOLSA TIENE UNA APERTURA SUPERIOR A TRAVES DE LA CUAL SE PUEDE VERTER LA MUESTRA DE LIQUIDO EN EL VOLUMEN DE LA BOLSA. LA BOLSA TIENE TAMBIEN MULTIPLES PARTICIONES (9), DISPUESTAS PARA QUE SEPAREN UNA O MAS PARTES (3) DE LA MUESTRA ADECUADA EN LA BOLSA. TAMBIEN SE PROPORCIONA EL PASO A TRAVES DEL CUAL PUEDE DISTRIBUIRSE UNA MUESTRA LIQUIDA POR TODO EL VOLUMEN DE LA BOLSA. LA BOLSA ESTA HECHA DE UN MATERIAL AL QUE SE PUEDE HACER FORMAR DISTINTOS COMPARTIMENTOS NO PERMEABLES, QUE CONTENGAN ALICUOTAS DIFERENTES DE LA MUESTRA DE LIQUIDO.

Description

Aparato y procedimiento para la cuantificación de material biológico en una muestra líquida.

Sector de la invención

La presente invención, se refiere a un procedimiento de cuantificación de material biológico en una muestra de líquido, y a un artículo para sostener la muestra de líquido durante la cuantificación.

Antecedentes y trasfondo de la invención

Muchas industrias, necesitan el detectar y cuantificar la concentración y el nivel de material biológico, en una muestra de líquido. Así, por ejemplo, la determinación de concentración bacteriana en agua, es una parte esencial de los test de ensayo de la calidad del agua. Las regulaciones EPA, requieren el que, ninguna forma de coli, o de Escherichia coli, pueda encontrarse presente en el agua potable. El formato de "presencia/ausencia", de un medio de test de ensayo, tal como por ejemplo el medio correspondiente a la mezcla química Colilert®; o Colilert-18®; (IDEXX Laboratoires, ME), utilizándose, cada una de ellas, en el medio de test de ensayo para Escherichia coli y bacterias de la forma coli, es muy útil en la realización de esta determinación. La mezcla química Coliert®, se basa en la Defined Substrate Technology, -Tecnología definida de substratos-, descrita en Edberg, "Method and Medium for use in Detecting Target Microbes In Situ in A Specimen Sample of A Possibly Contaminated Material", -Procedimiento y medio para su uso en la detección de una muestra de espécimen, de un material posiblemente contaminado-, Patente estadounidense US nº 4.925.789.

No obstante, existen áreas, en donde, la cuantificación, y no únicamente la detección, de la concentración bacteriana, es importante. Ejemplos de dichos tipos de áreas, incluyen, por ejemplo, a los residuos de aguas, al agua de entrada en sistemas de purificación, aguas superficiales, y tests de ensayo de productos alimenticios.

En la filtración por membrana, el volumen requerido de la muestra, se filtra a través de la membrana de un muy reducido tamaño de partícula, para atrapar bacterias no específicas. La membrana, se emplaza, a continuación, en un medio el cual soporta el crecimiento de la bacteria pretendida como objetivo. El medio, se incuba a una temperatura específica, durante un transcurso de tiempo específico, y se cuentan algunas colonias resultantes. Un inconveniente de la filtración por membrana, reside en el hecho de que, una muestra, la cual contiene otras partículas además de bacterias, (por ejemplo un muestra de agua residual), puede atascar la membrana y convertirla en no utilizable. Otro inconveniente, reside en el hecho de que, la membrana, atrapa partículas no pretendidas como diana.

El procedimiento del número más probable, se describe en el trabajo de Recles y colegas "Most Probable Number Techniques", -"Técnicas del número más probable"-, publicado en "Compendium of Methods for the Microbiological Examination on Water and Wasterwater", -Compendio de procedimientos para el examen biológico en agua y aguas residuales-, (8º edición, 1992). En este procedimiento, un volumen de una muestra de agua, se dispensa en varios tubos (por ejemplo, 10 tubos de 10 x 10, conteniendo, cada uno de ellos, 10 ml) y se permite el que crezcan bacterias en cada tubo. Después de la incubación, a una temperatura específica, se cuentan los tubos. El número más probable, puede determinarse a partir de la fórmula

NPN/100 ml =\frac{P \ x \ 100}{

\text{raíz}

\ cuadrada \ de \ NT}

\vskip1.000000\baselineskip

en donde, P, es el número de tubos positivos, N, es la muestra en ml, en los tubos negativos, T, es la muestra en ml en todos los tubos, y MPN, es el número más probable. Un inconveniente mayor de este procedimiento, reside en el hecho de que, los límites correspondientes a la gama de un porcentaje de confianza del 95%, es amplio, cuando únicamente se utiliza un reducido número de tubos. Tales límites de confianza, se calculan de una forma bruta, como:

Log \ (MPN) \pm 1.96 = \frac{(0,58)}{

\text{raíz}

\ cuadrada \ de \ n}

\vskip1.000000\baselineskip

en donde, n, es el número de tests de ensayo.

Resumen de la invención

La presente invención, proporciona un procedimiento sencillo, para la cuantificación precisa y exacta, del número de bacterias en una muestra de líquido, o para la cuantificación de cualquier otro tipo de material biológico particular, discreto, en la muestra. Tales tipos de materiales biológicos, pueden incluir a los hongos u otros organismos vivientes, así como también, agregados de proteínas, tales como las enzimas, o cofactores uniformes, utilizando mezclas de reacción, que son bien conocidas por parte de las personas especializadas en este arte de la técnica. La invención, utiliza, de una forma general, un nuevo artículo para retener un una muestra líquida, para la cuantificación de material biológico, en la muestra líquida, en la cual, se proporcionan reactivos químicos y/o microbianos. Así, por ejemplo, tales tipos de reactivos químicos, pueden ser un medio específico de detección biológica para bacterias, tal como las mezclas químicas Colilert®; o Colilert-18®, mezclas éstas que se han discutido anteriormente, o un medio de detección biológica específico, tal como la mezcla química Enterolert®. El dispositivo utilizado, es generalmente en forma de una bolsa modificada. La bolsa, acepta la muestra de líquido a ser sometida a test de ensayo, distribuye esta muestra a través de su volumen interno y, a continuación, la posiciona (por mediación de cualesquiera de un gran número de medios), en el interior de los compartimientos separados, en el interior de la bolsa. Generalmente, tales tipos de compartimientos, permitirán el que acontezcan reacciones químicas por separado, en una pluralidad de alícuotos del líquido a ser sometidos a test de ensayo. En una sencilla forma de realización, la invención, se caracteriza por una bolsa de plástico, en el interior de la cual, se introduce una muestra de líquido y, se provoca que, dicha muestra de líquido, se separe en alícuotos, mediante simple sellado por calor, de las superficies opuestas de la bolsa, para formar minibolsas, que contienen, cada una de ellas, un alícuoto de la muestra de liquido original.

Así, de esta forma, en un primer aspecto, la presente invención, se caracteriza por un artículo que soporta o retiene una muestra de líquido, para la cuantificación de material biológico, en la muestra de líquido, en el cual, se encuentra provisto un medio de test de ensayo, el cual comprende: una bolsa que tiene una hoja o lámina de la superficie superior y una hoja o lámina de la superficie inferior, las cuales encierran un volumen entre ellas, teniendo, la citada bolsa, una abertura superior, a través de la cual, la muestra líquida y, el medio de test de ensayo, se vierten al interior del citado volumen, en la citada bolsa; una pluralidad de divisiones o particiones, en la citada bolsa, configurada para separar una o más porciones de la citada mezcla de muestra líquida/medio de test de ensayo, y para efectuar una sencilla y rápida separación en alícuotos de la citada mezcla, y en donde existe un paso, a través del cual, se distribuye el medio de test de ensayo, en la totalidad del volumen, en la bolsa; en donde, la bolsa, está fabricada a base de un material el cual se ha diseñado de tal forma que se formen compartimentos discretos no comunicantes, para retener los alícuotos separados, de la mezcla de la muestra líquida, y el medio de test de ensayo, con objeto de permitir la detección o la presencia o ausencia del material biológico, en cada uno de los citados compartimientos, permitiendo el que, la misma reacción química/biológica, acontezca por separado, en el interior de cada uno de los citados compartimientos, sin un efecto significante, en las reacciones, en los compartimientos contiguos, con objeto de obtener los resultados de los tests de ensayo, en un alto grado de fiabilidad y exactitud estadísticas; y en donde, la bolsa en su totalidad, está formada en el interior del citado compartimiento.

Mientras que, la bolsa, puede tener cualquier forma particular, se prefiere el que, ésta, se encuentre formada en una forma generalmente rectangular, con la abertura superior de la bolsa, en una porción final estrechante de la bolsa, y de un tamaño suficiente como para permitir el que el líquido, se vierta fácil y rápidamente en el interior del volumen. La hoja de superficie superior y la hoja de superficie inferior, son simples superficies opuestas de la porción interior de la bolsa, y pueden modificarse tal y como de describe posteriormente, a continuación.

Por "partición", se entenderá el hecho de que, el artículo, se encuentra configurado de tal forma que, el volumen de la muestra, se separa en una o más porciones. Ejemplos de estas porciones, se facilitan abajo, a continuación.

Mediante "paso", se entenderá el hecho de que se encuentra provisto un medio, en el interior de la bolsa, que permite una más rápida y fácil distribución de la muestra líquida, a través del volumen de la bolsa, y entre las particiones. Ejemplos de estos pasos, se proporcionan posteriormente, más abajo, y el término, se usa en un amplio sentido.

Por "discreto", se entenderá el hecho de que, los compartimentos formados en la bolsa, permiten el que acontezcan reacciones químicas separadas, en el interior de dichos compartimientos, sin un efecto significativo en la reacciones de los compartimientos contiguos.

Por "efecto no significativo", se entenderá el hecho de que, en la utilización normal, una muestra positiva, puede distinguirse rápida y fácilmente, de una muestra negativa.

Por "líquido de muestra", se entenderá una referencia que incluye a una muestra, la cual, es un líquido en su forma general (tal como agua), o una muestra que se ha licuado (tal como partículas de comida).

En formas de presentación preferidas, la bolsa, tal y como se ha explicado anteriormente, arriba, es de una forma general rectangular, con una abertura superior a lo largo de un lado estrechante de la bolsa y, los tres restantes lados, se encuentran sellados, para evitar el paso de líquido a través de estos lados. Así, de esta forma, el artículo, se encuentra formado de una forma que es suficiente para sostener y retener la muestra de líquido, mientras se forman los compartimientos discretos en el artículo, durante el uso. En una forma de presentación, la hoja o lámina de superficie inferior de la bolsa, se encuentra dividida, para formar una pluralidad de hoyos, los cuales retienen la muestra. Las hojas o láminas superior e inferior, se unen, a continuación, y se sellan por calor, a lo largo de las líneas y las divisiones, formando una pluralidad de compartimientos para retener las muestras de líquido, por ejemplo, el número de compartimientos, se encuentra situado entre un número de 40 y 60 inclusive, encontrándose situado, de una forma preferente, en un número de 50, y siendo, los compartimientos, igual en tamaño, para retener una cantidad de alícuotos que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 0,1 hasta 2 ml por alícuoto y, la bolsa, se encuentra formada a base de un material apropiado, tal como el poli(cloruro de vinilo).

En todavía otras formas de presentación, la pluralidad de particiones o divisiones, son de un diseño que se encuentran situadas avanzando de una forma aproximadamente paralela las unas con respecto a las otras, en una dirección que va desde la abertura hasta el final distal de la bolsa. Las divisiones, forman una pluralidad de pasos, a través de los cuales puede fluir una muestra líquida, y las divisiones, son de una longitud tal, que, el paso, se encuentra presente entre la abertura y a las divisiones, con objeto de facilitar adicionalmente la distribución de la muestra de líquido, entre las divisiones; puede aportarse un paso adicional, entre las divisiones y el final distal de la bolsa, con objeto de facilitar la distribución del líquido, adicionalmente, entre las divisiones; y la bolsa, se encuentra formada a partir de un polietileno co-extrusionado con plástico del tipo MYLAR®, tal como, por ejemplo, tereftalato de polietileno (PET).

En todavía otras formas adicionales de presentación, una primera pluralidad de compartimientos, son de una misma medida (por ejemplo, de 2 ml) y, una segunda pluralidad y/o una tercera pluralidad de compartimientos, están provistos con diferentes medidas, por ejemplo, de un tamaño más pequeño (como por ejemplo, de un tamaño comprendido entre 0,02 y 0,2 ml), con respecto a la primera pluralidad: y, las divisiones, se forman como hoyos, en bien ya sea una, o ambas, de las láminas u hojas superficial e inferior (tal y como se ejemplifica posteriormente, más abajo). Estas formas de presentación tienen una particular aplicación para su uso, cuando, la concentración del material biológico a ser cuantificada en la muestra, es alta. Los varios tamaños de los compartimientos, eliminan la etapa de diluir la muestra, ahorrando, con ello, tiempo y posibles errores, debidos a la dilución, e incrementan los márgenes de la detección.

En un aspecto adicional relacionado, la invención, se caracteriza por un procedimiento de cuantificación de un material biológico en una muestra líquida. El procedimiento, incluye la etapas de proporcionar un artículo tal y como se describe anteriormente, arriba, y añadir reactivos químicos y/o microbiológicos, como un medio de test de ensayo, a la muestra líquida, la cual se emplaza, a continuación, en el interior de la bolsa. El procedimiento, incluye adicionalmente la distribución de la mezcla de medio de test de ensayo y muestra líquida, en el interior de la bolsa y, la formación de una pluralidad de compartimientos discretos, que no se comunican entre ellos, en la bolsa, de tal forma que, la mezcla del medio de test de ensayo y de la muestra, se fijen y aseguren en una pluralidad de alícuotos separados, en el interior de los compartimientos. El procedimiento, involucra, finalmente, la detección de la presencia o ausencia del citado material biológico en cada compartimiento, mediante cualquiera del número de medios estandarizados, por ejemplo, tal y como se describe anteriormente, arriba.

En formas preferidas de presentación, el material biológico a ser cuantificado, es Escherichia coli y bacterias de la forma coli y, el medio de test de ensayo, es un medio específico de detección biológica, tal como por ejemplo Colilert® o Colilert-18®; el procedimiento par formar los compartimientos, incluyen el sellado por calor de la bolsa, para formar los compartimientos, siendo, los sellados entre los compartimientos, en versión no permeable, para la muestra de líquido, el medio de test de ensayo, y cualquier reactivo resultante, tal y como se ha discutido anteriormente, arriba; y, el sellado por calor, involucra la aplicación de calor a la bolsa, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente cinco segundos, utilizando un dispositivo de sellado por calor, con una temperatura de aproximadamente 121-177ºC (250-350ºF). En otras formas preferidas de presentación, el procedimiento, incluye el incubar la bolsa a la temperatura deseada, durante un deseado transcurso de tiempo, para permitir el crecimiento de las bacterias, o la reacción, de cualquier entidad química, en la muestra de líquido, y medio de test de ensayo.

Así, de esta forma, la presente invención, es un nuevo procedimiento para la cuantificación de material biológico en una muestra de líquido. Este procedimiento, involucra unos resultados más fidedignos y precisos, y más rápidos, que los procedimientos tradicionales de filtración por membrana, y los procedimientos del número más probable. El procedimiento, incluye, de una forma general, las siguientes etapas: la adición de un medio de test de ensayo a la muestra; el emplazamiento de la muestra en un artículo designado para retener la muestra, y permitir su rápida y sencilla distribución en alícuotos, en un número de sub-muestras; la distribución de la muestra de una forma substancialmente igual, entre una pluralidad de compartimientos discretos, no permeables, en el artículo; el sellado de los compartimientos de tal forma que, la mezcla del medio de test de ensayo y la muestra, se aseguren y fijen en el interior de los compartimientos; la incubación del artículo; y el registro de los resultados del análisis.

La presente invención, se caracteriza también por un nuevo artículo el cual retiene la muestra durante el procedimiento de cuantificación, teniendo, el citado artículo, las limitaciones tal y como se definen en la reivindicación principal.

El artículo, y su uso, depende de la presencia de una pluralidad de compartimientos, los cuales se encentran sellados, de tal forma que, éstos, son esencialmente no permeables a la muestra y al medio de test de ensayo utilizado, y a cualesquiera productos de reacción resultantes. El número de compartimientos, puede variar, pero debería ser suficiente como para que, cualquier tipo de muestra, pueda ser analizada con las requeridas precisión y exactitud. En las formas preferidas de presentación, la pluralidad de compartimientos, se crean mediante, o bien formando hoyos en el interior de la bolsa, previamente a la adición de la muestra y, a continuación, sellando dichos hoyos en compartimientos, después de la adición de la muestra, o mediante la división de las divisiones preexistentes en compartimientos, después de la adición de la muestra. Son posibles también otros medios para cumplir con la creación del compartimiento, tales como, mediante la aportación de una bastidor rígido, en el interior del cual se coloca la bolsa de muestra, y procediendo a cerrar el bastidor, de tal forma que se efectúe la división de la muestra, mediante la presión a partir del bastidor, en una pluralidad de líneas de intersección. Un bastidor de este tipo, se podría dejar en su lugar, hasta que se lea el resultado de la muestra y, a continuación, éste puede retirarse y utilizarse con otra muestra.

Estos aspectos de la invención, son aplicables a cualquier material biológico discretamente distribuido, como por ejemplo, bacterias, parásitos, levaduras, virus o proteínas, que se encuentren presente en cualquier nivel, en una muestra, con la condición de que, una, o una pluralidad de unidades del material, pueda ser detectada. La elección del medio de test de ensayo, dependerá de material biológico a ser detectado. El medio de test de ensayo, puede ser un medio que detecte la presencia del material biológico que se pretende cuantificar y, de una forma preferible, no detectar la presencia de otro material biológico parecido que se encuentre en el medio. Éste debe ser también un material, el cual provoque algunos cambios visibles o, de otro modo, sensibles, tales como el cambio de color, o fluorescencia, si el material biológico que se pretende detectar, se encuentra presente en la muestra.

Tal y como se ha remarcado anteriormente, arriba, la bolsa utilizada en esta invención, puede fabricarse a base de cualquier material que pueda formarse en compartimientos no permeables, tales como polietileno co-extrusionado con un plástico del tipo MYLAR®, tal como el tereftalato de dioctilo (PET). El material elegido, puede variar en dependencia del substrato o del producto de cualquier reacción química. Así, por ejemplo, en el producto Colilert®, la presencia de bacterias específicas, se indica mediante la producción de ortonitrofenol (ONP), y una cantidad significativa de este producto, no debe ser capaz de pasar a través del material de la bolsa, después del sellado por calor. Si la reacción produce un gas, entonces, el material, puede ser permeable a los gases, pero no permeable a los líquidos, a menos que se requiera una detección de la presencia del gas.

La invención, hace uso de un nuevo dispositivo de sellado, el cual se encuentra diseñado para sellar una bolsa horizontalmente para dispensar una muestra en 50-100 bolsitas o tubos, tal y como se ha discutido anteriormente, arriba. Con objeto de realizar un diseño de estas características, la partes selladas, están previstas de tal modo que formen un ángulo, más bien que el ser paralelas las unas con respecto a las otras, de tal forma que no se atrape el aire en la bolsa, sino que se desplace. El sellante por calor, es esencialmente una tostadora y, la bolsa con la muestra, se emplaza en el interior del sellador por calor, de tal forma que, únicamente una rebanada de pan, penetre en el tostador. Así, de esta forma, de un modo distinto a los anteriores dispositivos de sellado, las láminas o paletas de sellado por calor, contactan la una con la otra a lo largo de la longitud de la paleta, en un ángulo mayor de 0º e inferior de aproximadamente 45º, siendo el ángulo, generalmente, de un valor situado entre 1º y 15º y, a medida que el sellado progresa, las dos láminas, se llevan a una posición esencialmente paralela la una con la otra.

En otra forma de presentación del dispositivo de sellado en concordancia con la presente invención, el dispositivo, es un sellador del tipo de rodillos calentados, diseñado para sellar el artículo. El artículo, se coloca en una bandeja, la cual avanza de una forma relativa con respecto a un rodillo fijo, el cual aplica calor, a una temperatura que se encuentra situada dentro de unos márgenes de 160-188ºC (320-370ºF), durante un transcurso de aproximadamente 1-2 segundos, a cada fila de divisiones, en el artículo.

En otras formas de presentación, la máquina de sellado por calor, se encuentra provista con una pluralidad de elementos de sellado por calor, de tal forma que se pueda obtener un sellado por calor simultáneo y, de esta forma, la división o reparto de una muestra en los artículos de la presente invención.

En las formas de presentación que se han presentado anteriormente, arriba, en las cuales se aportan compartimientos de diferentes tamaños, será evidente, para aquéllas personas especializadas en este arte de la técnica, el hecho de que, una bolsa de este tipo, aporta unas ventajas significativas, con respecto a aquéllas que disponen de compartimientos de un solo tamaño. Estas bolsas, permiten una cuantificación más precisa y exacta, sin la dilución de la muestra. Así, de esta forma, las ventajas de la una bolsa de este tipo, se basan el que, ésta, elimina las etapas de dilución (ahorrándose tiempo con ello, y evitándose cualquier posible error debido a la dilución), y ésta, aporta también un ahorro en material necesario para proceder a la realización del ensayo.

Esta invención, tiene aplicación en otros sectores, tales como la cuantificación de bacterias en alimentos. Los presentes procedimientos para la detección de la presencia de bacterias en productos alimenticios, utilizan un bolsa d de plástico, a la cual, se le añade el alimento y un tampón. La bolsa, se coloca, a continuación, en una máquina, la cual provoca el que se libere la bacteria. Otra versión de este procedimiento, hace uno de una bolsa, con un revestimiento de filtro en el interior, por ejemplo, las bolsa de filtro Stomacher®. El producto alimenticio, se coloca en el interior del revestimiento y, la bacteria, se libera al interior de la bolsa exterior. Esta bolsa, puede dividirse y distribuirse en compartimientos, tal y como se ha descrito anteriormente, arriba. De una forma alternativa, la deseada cantidad de material, puede extraerse de la bolsa de Stomacher®, después de que se haya procesado, y colocado en el interior de una de las formas de realización del artículo descrito aquí, y se haya sometido a test de ensayo, tal y como de describe aquí.

Otras características y ventajas de la presente invención, se evidenciarán, a partir de la descripción que se facilita a continuación, de las formas preferidas de presentación de ésta, y a partir de las reivindicaciones anexadas.

Descripción resumida de los dibujos

Las figuras 1, 2 y 3, son una vista isométrica, de una vista superior y una vista lateral, respectivamente, de una artículo adaptado para retener líquido para su uso en el procedimiento de cuantificación de material biológico de una muestra de líquido.

Las figuras 4 y 5, son una vista lateral y una vista superior, respectivamente, de otra forma de presentación de un artículo, de utilidad en la presente invención.

La figura 6, es una vista superior de una tercera forma de presentación del artículo de la presente invención.

Las figuras 7 y 8, son una vista lateral y una vista superior, respectivamente, de una cuarta forma de presentación de un artículo de esta invención.

La figura 9, es una vista asimétrica de una quinta forma de presentación de un artículo de la presente invención.

Las figuras 10 y 11, son una vista superior y una vista lateral, respectivamente, de una sexta forma de presentación del artículo de esta invención.

Descripción detallada de la invención

Se presentan, a continuación, algunas formas de presentación del artículo para su uso en el procedimiento de cuantificación del material biológico, en una muestra de líquido.

En estas formas de presentación, el material biológico a ser cuantificado, es la bacteria Escherichia coli y bacterias de la forma coli, y el medio de test de ensayo, es la mezcla química Colilert®. El uso de estas formas de presentación, para detectar la bacteria Escherichia coli y otras bacterias del tipo coli, y el uso de la mezcla química Coliert®, es únicamente a título de ejemplo. La presente invención, es aplicable a cualquier material biológico, que se encuentre presente a cualquier nivel, en una muestra de líquido, (con la condición de que, únicamente pueden detectarse una o más unidades de material), a cualquier medio de test de ensayo aplicable. Así, por ejemplo, la invención, es aplicable a la detección de enterococcus de bacterias totalmente viables.

Ejemplo 1

Una primera forma de presentación del artículo que retiene a la muestra durante la cuantificación, es el que se ilustra en las figuras 1-3. Con referencia, en primer lugar, a la figura 1, el artículo A, se encuentra formado, de una forma general, como una bandeja correspondiente a una combinación bolsa/cubitos de hielo. El artículo A, está formado de dos hojas o láminas rectangulares, una hoja o lámina de superficie superior 1 y una hoja o lámina de superficie inferior 2, fabricadas a base de poli(cloruro de vinilo). La hoja o lámina superior 1, es esencialmente plana.

Con referencia a las figuras 1-3, la hoja o lámina superficial 2, está formada de tal modo que tenga un determinado número de hoyos 3, los cuales sobresalen en un lado de la hoja o lámina, en una dirección que se aleja de la lámina u hoja superior. (Las dimensiones de las varias porciones, se muestran en las figuras, en pulgadas). En esta forma de presentación, existen cincuenta hoyos 3, de igual tamaño, reteniendo, cada uno de ellos, aproximadamente 2 ml de líquido. La hoja (lámina) superior 1 y la hoja superior 2, se encuentran selladas conjuntamente, a lo largo de la longitud de los lados largos 4 y 5, y a lo largo de un lado estrecho o pequeño 6. El cuarto lado 6, se deja sin sellar, con objeto de crear una abertura a través de la cual, la muestra, puede añadirse en el artículo. Además de los tres lados sellados, la hoja de superficie 1 y la hoja de superficie 2, no se encuentran selladas o unidas, dejando un paso 8, entre la hoja de superficie 1 y la hoja de superficie 2, el cual permite el que la muestra se distribuya a través del artículo y entre todos los hoyos.

Utilizando esta primera forma de presentación, el procedimiento de cuantificación del nivel de bacterias del tipo Escherichia coli y de la forma coli, en la muestra, se realiza de la siguiente forma. En primer lugar, se procede a verter 100 ml de la muestra a someter a test de ensayo y del medio de test de ensayo, la mezcla química Coliert®, a través de los lados abiertos 7. La mezcla, se dispersa de una formas substancialmente igual, entre los cincuenta hoyos 3. Con 100 ml, habrán aproximadamente 2 ml de mezcla en cada hoyo 3.

El lado abierto 7, a continuación, se sella. La hoja de superficie superior 1 y la hoja de superficie inferior 2, se sellan, a continuación, a lo largo de las posiciones verticales y horizontales 9, entre los hoyos, creando cincuenta compartimientos discretos cerrados, conteniendo, cada uno de ellos, alrededor de 2 ml de muestra y medio de test de ensayo.

Los sellados, pueden formarse mediante diferente procedimientos, siempre y cuando, el sellado, sea del tipo no permeable para la muestra y el medio de test de ensayo, y cualesquiera tipos de reactivos resultantes, y siempre y cuando que, el sellado, no destruya o perjudique de una forma significativa, el material biológico a ser cuantificado, o afecte al resultado del sometimiento de éste al test de ensayo. En esta forma de presentación, los sellados, se forman mediante sellado por calor. El sellado por calor, se realiza procediendo a aplicar calor al artículo, a lo largo de las divisiones, durante un transcurso de tiempo de 5 segundos, utilizando un dispositivo de sellado por calor, con una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van desde 143 a 188ºC (de 290 a 370ºF), en el dispositivo. La temperatura resultante de la muestra de líquido, no crecerá más de aproximadamente -15ºC - -13ºC (5-10ºC).

El artículo, se incuba, a continuación, a una temperatura de aproximadamente 35ºC, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente veinticuatro horas.

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Los resultados, se analizan procediendo a contar el número de compartimientos, los cuales muestran que se encuentran presentes las bacterias Escherichia coli y de la forma coli.La presencia de estos organismos, se evidenciará mediante el cambio de color de la muestra. La cantidad de bacterias Escherichia coli y de la forma coli, puede determinarse mediante procedimientos rutinarios de análisis estadístico.

Ejemplo 2

Haciendo referencia a las figura 1-3, otra vez, el sellado por calor de las divisiones, se realiza de una forma ligeramente distinta. Se procede a aplicar un adhesivo activado por calor, tal como uno del tipo Dupont nº 5 Lid Stock Coating, a la superficie superior 1, con objeto de facilitar el sellado de la superficie superior 1 y la superficie inferior 2. El sellado por calor, se realiza procediendo a aplicar calor al artículo, a lo largo de las divisiones, durante un transcurso de tiempo de 5 segundos, utilizando un dispositivo de sellado por calor, con una temperatura que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes que van desde 137 hasta 155ºC (280-310ºF), en el dispositivo. Las ventajas de este procedimiento, son las de un mejor sellado, y el de la utilización de una menor temperatura.

Ejemplo 3

Se trata, en este caso, de una segunda forma de presentación del artículo, la cual se ilustra en las figuras 4 y 5. Haciendo referencia a la figura 4, el artículo B, se encuentra configurado, de una forma general en forma de una bolsa, con las aperturas 10 en el extremo superior del artículo, lo cual permite el que se pueda verter la cantidad deseada de muestra al interior del artículo. El artículo, está fabricado a base de polietileno (PE) co-extrusionado con plástico del tipo MYLAR®, tal como el tereftalato de polietileno (PET). Los tres lados, 11, 12 y 13, del artículo, se encuentran sellados, para formar un artículo, generalmente rectangular, en forma de bolsa.

El artículo B, tiene nueve divisiones verticales 14, las cuales avanzan a lo largo de la longitud de la bolsa, entre la abertura 10 y el extremo opuesto 12. Las divisiones 14, están también selladas. Las divisiones 14, se encuentran ubicadas, de tal forma que se forma un primer canal 15, cerca de la abertura, con objeto de facilitar el vertido de la muestra al interior del artículo, y para asegurar el que, la muestra, se distribuya entre las divisiones. Un segundo canal 16, se deja en el fondo del artículo, con objeto de asegurar el hecho de que, la muestra, se mueva a través del artículo, y desplace cualquier aire.

Haciendo referencia a la figura 4, en ésta, una serie de pasos pre-formados 17, se encuentran formados entre las divisiones verticales 14, con objeto de asegurar el hecho de que, la muestra, se mueva a través del artículo, entre las divisiones.

Utilizando esta segunda forma de presentación en concordancia con la invención, el procedimiento de cuantificación del nivel de bacterias Escherichia coli y bacterias de la forma coli, en la muestra, se ejecuta del siguiente modo. En primer lugar, se procede a verter en el artículo, a través del lado abierto 11, aproximadamente 100 ml de la muestra a ser sometida a test de ensayo y del medio de mezcla química Colilert®. La mezcla, se dispersa a través del artículo y entre las particiones, mediante la vía de los canales 15 y 16 y los pasos 17. El lado abierto 11, se sella a continuación. El artículo, a continuación, se sella, a lo largo de nueve divisiones, de tal forma que, estas nuevas nueve particiones, conjuntamente con las divisiones existentes 14, formen 100 compartimientos separados de aproximadamente igual tamaño. El sellado, se realiza de una forma tal que, la mezcla de la muestra y el medio de test de ensayo, se distribuyan de una forma substancialmente igual, en el interior y entre estos 100 compartimientos. En cada compartimiento, habrá, aproximadamente, 1 ml de muestra y de medio de test de ensayo.

Las particiones y los sellados, en el artículo, pueden llevarse a cabo mediante diferentes procedimientos, siempre y cuando, el sellado, sea no permeable para la muestra y el medio de test de ensayo, y cualquiera de los reactivos resultantes, y siempre y cuando que, el sellado no destruya de forma significativa el material biológico a ser cuantificado, o afecte al test de ensayo de éste. En esta forma de presentación, los sellados, se efectúan mediante sellado por calor. El sellado por calor, se realiza procediendo a aplicar calor al artículo, a lo largo de las divisiones, durante un transcurso de tiempo de 2 segundos, utilizando un alambre de sellado por calor, con una temperatura situada dentro de unos márgenes de aproximadamente 148-177ºC (300-350ºF).

Después del sellado, el artículo, se incuba entonces a una temperatura de aproximadamente 35ºC, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente 24 horas. Los resultados, se analizan, entonces, procediendo a contar el número de compartimientos, los cuales muestran que se encuentran presentes las bacterias Escherichia coli y de la forma coli.

Ejemplo 4

En la figura 6, se muestra una tercera forma de presentación, la cual tiene una aplicación particular, para su uso cuando, la concentración del material biológico a ser cuantificado, en la muestra, es alto. Los diferentes tamaños de los compartimientos, eliminan la etapa de diluir la muestra, ahorrando tiempo con ello, y posibles errores debidos a la dilución. Adicionalmente, esta característica de "autodilución", incrementa los márgenes de la cuantificación.

Con referencia a la figura 6, el artículo C y su uso, son similares a la primera forma de presentación descrita anteriormente, arriba, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, hay unos compartimientos, 30, 31 y 32, de tres diferentes tamaños. Existen cincuenta compartimientos 30, cada uno de los cuales, retiene aproximadamente 2 ml de muestra. Existen cincuenta compartimientos 31, cada uno de los cuales, retiene aproximadamente 0,2 ml de muestra. Existen cincuenta compartimientos 32, cada uno de los cuales, retiene aproximadamente 0,02 ml de muestra.

Ejemplo 5

En la figuras 7 y 8, se muestra una cuarta forma de presentación, y tiene una aplicación particular, para su uso cuando, la concentración del material biológico a ser cuantificado, en la muestra, es alto. Los diferentes tamaños y compartimientos, eliminan la etapa de diluir la muestra, ahorrando tiempo con ello, y posibles errores debidos a la dilución.

Con referencia a las figuras 7 y 8, el artículo D y su uso, son similares a los de la segunda forma de presentación descrita anteriormente, arriba, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, existen nueve divisiones 40, que forman los pasos realizados 50 de un tamaño, nueve divisiones que forman lo pasos 51 de un tamaño menor, y nueve divisiones que forman pasos realizados 52, de un tamaño todavía más reducido. El artículo, se sella, a continuación, a lo largo de nueve divisiones horizontales, tal y como se describe anteriormente, arriba, en el segundo ejemplo. Este sellado, tendrá como resultado 300 compartimientos. Las nuevas nueve divisiones, conjuntamente con las divisiones existente 40, forman 100 compartimientos separados, reteniendo, cada uno de ellos, aproximadamente 1 ml de muestra. Las nuevas nueve divisiones, conjuntamente con las divisiones existente 41, forman 100 compartimientos separados, reteniendo, cada uno de ellos, aproximadamente 0,1 ml de muestra. Las nuevas nueve divisiones, conjuntamente con las divisiones existente 42, forman 100 compartimientos separados, reteniendo, cada uno de ellos, aproximadamente 0,01 ml de muestra.

Ejemplo 6

En la figura 9, se muestra una quinta forma de presentación, la cual tiene una aplicación particular, para su uso cuando, la concentración del material biológico a ser cuantificado, en la muestra, es alto. Los dos diferentes tamaños y compartimientos, eliminan la etapa de diluir la muestra, ahorrando tiempo con ello, y posibles errores debidos a la dilución. Adicionalmente a ello, esta característica de "autodilución", incrementa los márgenes de la cuantificación.

Con referencia a la figura 11, el artículo E, y su uso, son similares a la tercera forma de presentación, correspondiente al artículo C, descrito anteriormente, arriba, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que existen dos diferentes tamaños de compartimientos, 43 y 44. Hay cincuenta compartimientos 43, cada uno de los cuales, retiene aproximadamente 2 ml de muestra. Hay cincuenta compartimientos 44, cada uno de los cuales, retiene aproximadamente 0,2 ml de muestra.

Ejemplo 7

En las figuras 10 y 11, se ilustra una sexta forma de presentación del artículo, el artículo F. Con referencia a las figuras 10 y 11, el artículo F, se encuentra formado, de una forma general, como el artículo A mostrado en las figuras 1-3, con la adición de un 51^{avo} hoyo 45. Este 51^{avo} hoyo 45, retiene el exceso de líquido desbordante procedente de los otros 50 hoyos 3, y elimina o reduce el riesgo consistente en que, cualquier líquido pueda desbordar hacia fuera del artículo, durante el proceso de sellado. Así, de esta forma, el hoyo, sirve para evitar la contaminación del líquido en el interior del artículo.

El uso del artículo F, es el mismo que para el artículo A, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, los resultados, pueden analizarse procediendo a contar el número de los 51 compartimientos (excluyendo el 51º hoyo), que muestran que se encuentra presente la bacteria de Escherichia coli y bacterias de la forma coli.

Ejemplo 8

En una variación de la forma de presentación descrita aquí, la hoja o lámina de superficie superior 1, está fabricada a base de un folio con soporte de papel, revestido con un plástico tal como polietileno y, la hoja o folio de superficie 2, está fabricada a base de poli(cloruro de vinilo).

Ejemplo 9

En una pequeña variante de las formas de presentación aquí descritas, el artículo, se encuentra formado para retener 10 ml, en total. Esta variación, tiene una aplicación particular en las industrias de productos alimenticios y otras industrias, en donde es factible o permisible, el utilizar una unidad de muestra más pequeña.

Fabricación

Las formas de presentación que se han revelado anteriormente, arriba, pueden fabricarse mediante procedimientos estandarizados, como por ejemplo, mediante técnicas de moldeo, que son bien conocidas en este arte especializado de la técnica.

Uso

En formas de ejecución de experimentos comparativos de esta invención, se proporcionan resultados comparables a las técnicas tradicionales para la cuantificación de Escherichia coli. De hecho, en algunos casos, se evidencia la idea de que, las formas de presentación de la presente invención, proporcionan una mejor recuperación de bacterias Escherichia coli.

Otras forma de presentación, se encuentran en las reivindicaciones que se anexan a continuación.

Claims

1. Artículo para la retención de una muestra de líquido, para la cuantificación de material biológico, en la muestra de líquido, en el cual, se proporciona un medio de test de ensayo, que comprende:

una bolsa que tiene una hoja o lámina de la superficie superior (1) y una hoja o lámina de la superficie inferior (2), las cuales encierran un volumen entre ellas, teniendo, la citada bolsa, una abertura superior (7), a través de la cual, la muestra líquida y, el medio de test de ensayo, se vierten al interior del citado volumen, en la citada bolsa;

una pluralidad de divisiones o particiones (9), en la citada bolsa, configurada para separar una o más porciones de la citada muestra líquida/mezcla de medio de test de ensayo, y para efectuar una sencilla y rápida separación en alícuotos de la citada mezcla, y en donde existe un paso, a través del cual, se distribuye el medio de test de ensayo, en la totalidad del volumen, en la bolsa;

en donde, la bolsa, está fabricada a base de un material al cual se ha diseñado de tal forma que se formen compartimentos discretos no comunicantes (3), para retener los alícuotos separados, de la muestra líquida, y la mezcla de medio de test de ensayo, con objeto de permitir la detección o la presencia o ausencia del material biológico, en cada uno de los citados compartimientos, permitiendo el que, la misma reacción química/biológica, acontezca por separado, en el interior de cada uno de los citados compartimientos, sin un efecto significativo, en las reacciones, en los compartimientos contiguos, con objeto de obtener los resultados de los tests de ensayo, en una fiabilidad y exactitud altamente estadística; y

en donde, la bolsa en su totalidad, está formada en el interior del citado compartimiento.

2. El artículo de la reivindicación 1, en donde, la citada bolsa, es de una forma generalmente rectangular, la citad abertura superior (7) s encuentra a lo largo de un lado de la bolsa y, los tres lados restantes (4, 5 y 6), se encuentran sellados, para evitar el paso de líquido a su través.

3. El artículo de la reivindicación 1, en donde, los citados compartimientos, se forman procediendo a sellar por calor una pluralidad de líneas, a lo largo de las citada hojas o láminas de superficie superior o inferior, de la citada bolsa.

4. El artículo de la reivindicación 1, en donde, la pluralidad de divisiones o particiones (9), están configuradas para formar una pluralidad de hoyos discretos (3), en la bolsa, para retener la muestra de líquido.

5. El artículo de la reivindicación 4, en donde, el número de hoyos (3), se encuentra comprendido entre 40 y 60, inclusive.

6. El artículo de la reivindicación 4, en donde, los hoyos (3), son de un tamaño substancialmente igual.

7. El artículo de la reivindicación 4, en donde, los compartimientos, son de un tamaño para retener aproximadamente dos ml de líquido.

8. El artículo de la reivindicación 4, en donde, los compartimientos, son de un tamaño para retener aproximadamente 0,2 ml de líquido.

9. El artículo de la reivindicación 1, en donde, la bolsa, está formada a partir de poli(cloruro de vinilo).

10. El artículo de la reivindicación 1, en donde, la hoja o lámina de superficie superior (1) de la bolsa, está formada a base de un folio con soporte de papel, recubierto con polietileno y, la hoja o lámina de superficie inferior (2), está formada a base de poli(cloruro de vinilo).

11. El artículo de la reivindicación 1, en donde existe una pluralidad de particiones o divisiones (14) en un diseño que avanzan de una forma paralela las unas con respecto a las otras, en la dirección que va desde la citada abertura (10), hasta el final distal (12) de la bolsa,

en donde, tales tipos de divisiones, forman una pluralidad de pasos (17), a través de los cuales puede fluir una muestra líquida; y

en donde, tales tipos de divisiones (14), son de una longitud tal, que, el citado paso (15), se encuentra presente entre la citada abertura (10) y las citadas divisiones (14), con objeto de facilitar la distribución de una muestra de líquido, entre las divisiones (14).

12. El artículo de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente un segundo paso (16), entre las divisiones y el final (12) del artículo, distal a la citada apertura (10), con objeto de facilitar la distribución de la muestra de líquido, entre las divisiones (14).

13. El artículo de la reivindicación 11, en donde, las citadas divisiones (14), se forman mediante el sellado por calor de una pluralidad de líneas, a lo largo de las citadas superficies superior (1) e inferior (2), de la citada bolsa.

14. El artículo de la reivindicación 1, en donde, la bolsa, se encuentra formada a partir de un polietileno co-extrusionado con tereftalato de polietileno.

15. El artículo de la reivindicación 4, en donde, una primera pluralidad de hoyos (30), es de un tamaño y, una segunda pluralidad de hoyos (31), es de un tamaño más pequeño.

16. El artículo de la reivindicación 15, en donde, una tercera pluralidad de hoyos (32), es de un tamaño diferente de la primera y segunda pluralidad de hoyos.

17. El artículo de la reivindicación 1, en donde, las citadas divisiones o particiones, comprenden hoyos en una o ambas de las hojas o láminas de superficie superior (1) e inferior (2).

18. El artículo de la reivindicación 15, en donde, los citados compartimientos, se forman mediante el sellado por calor de una pluralidad de líneas a lo largo de las citadas hojas o láminas de superficie superior (1) e inferior (2), de la citada bolsa.

19. El artículo de la reivindicación 18, en donde:

el número de la primera pluralidad de hoyos (30), se encuentra comprendido entre 40 y 60; y

el número de la segunda pluralidad de hoyos (31), se encuentra comprendido entre 40 y 60; y

20. El artículo de la reivindicación 19, en donde:

la primera pluralidad de hoyos (30), es de un tamaño para retener aproximadamente dos ml de líquido; y

la segunda pluralidad de hoyos (31), es de un tamaño para retener aproximadamente 0,2 ml de líquido.

21. Un procedimiento de cuantificación de un material biológico, en una muestra de líquido en el cual se encuentra provisto un medio de test de ensayo, que comprende las etapas de:

proporcionar una bolsa que tiene una hoja o lámina de la superficie superior (1) y una hoja o lámina de la superficie inferior (2), las cuales encierran un volumen entre ellas, teniendo, la citada bolsa, una abertura superior (7), a través de la cual, la muestra líquida y, el medio de test de ensayo, se pueden verter al interior del citado volumen, en la citada bolsa;

en donde, la bolsa, está fabricada a base de un material al cual se ha diseñado de tal forma que se formen compartimentos discretos no permeables (3), para retener los alícuotos separados, de la muestra líquida;

añadir un medio de test de ensayo a la muestra de líquido;

emplazar la muestra y el medio de test de ensayo en la citada bolsa;

distribuir la muestra de líquido en el medio de test de ensayo, en el interior de la bolsa;

formar una pluralidad de compartimientos discretos no comunicantes, en la totalidad de la bolsa, de tal forma que, la mezcla de test de ensayo y la muestra líquida, se fije y asegure en una pluralidad de alícuotos separados, en el interior de los compartimientos; y

detectar la presencia o ausencia del material biológico, en cada uno de los citados compartimientos, permitiendo el que, la misma reacción química acontezca por separado, en el interior de cada uno de los citados compartimientos, sin un efecto significativo, en las reacciones, en los compartimientos contiguos, con objeto de obtener los resultados de los tests de ensayo, en una gran fiabilidad y exactitud estadísticas.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en donde, la bolsa, está provista de una pluralidad de divisiones (9), configuradas para separar una o más porciones de la citada muestra de líquido, en la bolsa.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en donde, la pluralidad de divisiones o particiones, está configurada para formar una pluralidad de hoyos discretos (3), en la bolsa, para retener la muestra de líquido.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en donde, el número de hoyos (3), se encuentra comprendido entre 40 y 60, inclusive.

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25. El procedimiento de la reivindicación 23 en donde, los hoyos (3), son de un tamaño substancialmente igual.

26. El procedimiento de la reivindicación 21, en donde, el material biológico a ser cuantificado, es Escherichia coli y bacterias de la forma coli y, el medio de test de ensayo, es un medio de detección biológica específica.

27. El procedimiento de la reivindicación 21, en donde, la etapa para formar los compartimientos, comprende:

el sellado por calor de la bolsa, para formar los compartimientos;

en donde, los sellados entre los compartimientos, son no permeables para la muestra de líquido, el medio de test de ensayo y cualquier reactivo resultante.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en donde, el sellado por calor, comprende:

el aplicar calor a la bolsa, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente cinco segundos, utilizando un dispositivo de sellado por calor, con una temperatura que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre aproximadamente 143ºC y 218ºC (290 y 370ºC).

29. El procedimiento de la reivindicación 27, en donde, el sellado por calor, comprende:

el aplicar un adhesivo activado por calor a la superficie interior del citado artículo;

el aplicar calor a la bolsa, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente cinco segundos, utilizando un dispositivo de sellado por calor, con una temperatura que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre aproximadamente 137ºC y 155ºC (280 y 310ºC).

30. El procedimiento de la reivindicación 27, en donde, el sellado por calor, comprende:

el aplicar calor a la bolsa, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente 1-2 segundos, a cada fila de las divisiones en el artículo, con una temperatura que se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre aproximadamente 160ºC y 188ºC (320 y 370ºC).

31. El procedimiento de la reivindicación 21, en donde, la etapa de detección, comprende el incubar la bolsa, a la deseada temperatura, durante un transcurso de tiempo deseado.

32. El procedimiento de la reivindicación 21, en donde, la etapa de formar una pluralidad de compartimientos discretos, no permeables, en la bolsa, comprende:

la formación de una primera pluralidad de compartimientos (30), de un tamaño; y

la formación de una segunda pluralidad de compartimientos (31), de un tamaño menor.

33. El procedimiento de la reivindicación 28 que comprende, adicionalmente:

la formación de una tercera pluralidad de compartimientos (32) de un tamaño diferente de la citada primera (30) y segunda (31) pluralidad de compartimientos.