ES2201563T3 - Agentes neuroprotectores. - Google Patents

Abstract

Un compuesto sustancialmente puro con **fórmula** donde: Q representa un grupo amidino, un grupo ciano o un grupo de fórmula XYN-, donde X e Y son iguales o diferentes, y cada uno de ellos puede representar un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, o un grupo que contiene un heteroátomo simple o, junto con el átomo de nitrógeno con el cual están enlazados, forman un grupo heterocíclico que contiene nitrógeno; Ra representa una cadena lineal o ramificada de alquileno o un grupo alquenileno que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono y siendo cada uno opcionalmente sustituido por entre 1 y 4 grupos alquilo, teniendo cada uno entre 1 y 3 átomos de carbono; Rb y Rc representa cada uno un grupo alquileno o alquenileno que tiene 3 o 4 átomos de carbono en una cadena lineal, siendo cada uno opcionalmente sustituido por 1 o 2 grupos alquilo, teniendo cada uno entre 1 y 3 átomos de carbono, siendo 7 el número total de átomos de carbono en dichas cadenas lineales de Rby Rc; R2 y R3 son iguales o diferentes entre ellos y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula R, RCO-, ROCO-, or RNHCO-.

Description

Agentes neuroprotectores.

La presente invención está relacionada con los agentes neuroprotectores.

En casos como por ejemplo la hipoxia prolongada y la isquemia, que pueden o no estar asociadas con la hipoglucemia, se pueden encontrar, en grados variables, daños neuronales.

La isquemia tiene lugar típicamente durante los ataques al corazón, pero el daño provocado en estas ocasiones está sustancialmente limitado a los tejidos del corazón, y se han desarrollado algunos tratamientos. Con lo que respecta a esta invención, estamos interesados en los efectos sobre el cerebro de isquemias de más largo término, como pasa con enfermos de derrame cerebral o como resultado de un daño en la cabeza. La severidad de la isquemia depende de la naturaleza del derrame cerebral o del daño, pero, invariablemente, hay daño cerebral, y es esto a lo que se dirige la presente invención.

Se conocen en la técnica diversos agentes neuroprotectores que tratan de paliar el problema del daño cerebral, pero todos los actualmente conocidos tienden a asociarse con los efectos secundarios adversos. Por ejemplo, la MK801 (maleato de dizocilpina) es una molécula bastante simple que se sabe que proporciona un nivel de neuroprotección a los enfermos isquémicos. Sin embargo, la MK801 está también asociada con "efectos psicotrópicos alarmantes" (Martindale), así como con efectos motores adversos. Los efectos neuroprotectores se detallan en Brain Research 755 (1997) 36-46 (Pringle, A. K., et al), incorporado aquí como referencia. Estos mismos autores también describieron los efectos neuroprotectores de la conotoxina en un artículo anterior pero, a pesar de los efectos neuroprotectores de este compuesto, se observan, in vivo, efectos secundarios adversos.

Recientemente, se ha llevado a cabo una investigación en una serie de compuestos poliamina relacionados con la espermidina, y estos compuestos se describen en W093/12777, en relación específica con su uso como agentes reguladores del canal catiónico. Se describen estos compuestos en relación con los métodos para regular el transporte de cationes a través de las membranas celulares que poseen canales catiónicos, siendo los compuestos de poliamina con una mitad basada en lisina o arginina (o una mitad de guanidina) enlazada a una cadena lineal de poliamina. También se hace mención a su efecto sobre los receptores NMDA (N-metil-D-aspartato). El efecto de estos compuestos sobre los canales catiónicos era imprevisible, teniendo varios compuestos un efecto sobre los canales de calcio de tipo P, mientras que otros compuestos tenían efectos sobre los canales de potasio y sodio. Aunque estos compuestos se han usado posteriormente en investigación por sus efectos sobre los canales de calcio, dicha investigación realmente acabó con la publicación en Proc. Natl. Acad. Sci. USA [86,1689-1693 (1989), Llinàs, R, et al], que describía que una sustancia de la toxina de la araña de tela en embudo conocida como FTX era tóxica a los ratones en dosis extremadamente pequeñas.

Los presentes inventores no eran conscientes de la investigación de Llinàs y sus colegas, y estaban buscando compuestos similares, ya que se sabía que tenían actividad bloqueadora del canal de calcio. De hecho, lo que se descubrió fue que, no sólo la actividad bloqueadora del canal de calcio no es muy importante, sino también que hay poco o ningún efecto sobre los receptores NMDA. Además, se demostró también que estos compuestos, a pesar de la investigación inicial, no son tóxicos y que tienen también un sustancial efecto neuroprotector.

Se cree que la razón para las discrepancias entre los primeros resultados y los actuales estriba en la preparación de los compuestos. En particular, el compuesto FTX de la toxina de la araña de tela en embudo se aisló específicamente de la toxina en la técnica anterior, en vez de prepararse separadamente. Actualmente se piensa que este compuesto tiene la siguiente fórmula (1):

1

Utilizando los enfoques que aquí se describen se han fabricado sintéticamente compuestos relacionados, lo cual tiene como resultado una contaminación del producto final pequeña o no detectable. Los resultados de las diversas pruebas han sido, por lo tanto, sumamente sorprendentes al probarse que los compuestos no son tóxicos, además de tener poco efecto sobre los canales de calcio. De hecho, si hubiera un efecto sustancial sobre los canales de calcio de tipo P y/o los compuestos fueran tóxicos, entonces no habría ningún uso para ellos en el campo clínico. En lugar de esto, encontramos que los compuestos, en su forma purificada, tienen utilidad como agentes neuroprotectores.

Así pues, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto sustancialmente puro que tiene la fórmula general (I):

(I)Q--R^{a}--

\delm{C}{\delm{\para}{NR ^{2} R ^{3} }}

*H--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--Z_{n}--

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

--R^{b}--NH--R^{c}--NH--W

donde:

Q representa un grupo amidino, un grupo ciano o un grupo de fórmula XYN-, donde

X e Y son iguales o diferentes, y cada uno de ellos puede representar un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, o un grupo que contiene un heteroátomo simple o, junto con el átomo de nitrógeno con el cual están enlazados, forman un grupo heterocíclico que contiene nitrógeno;

R^{a} representa una cadena alquileno lineal o ramificada o un grupo alquenileno que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono y siendo cada uno opcionalmente sustituido por entre 1 y 4 grupos alquilo, teniendo cada uno entre 1 y 3 átomos de carbono;

R^{b} y R^{c} representa cada uno un grupo alquileno o alquenileno que tiene 3 ó 4 átomos de carbono en una cadena lineal, siendo cada uno opcionalmente sustituido por 1 ó 2 grupos alquilo, teniendo cada uno entre 1 y 3 átomos de carbono, siendo 7 el número total de átomos de carbono en dichas cadenas lineales de R^{b} y R^{c};

R^{2} y R^{3} son iguales o diferentes entre ellos y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula R, RCO-, ROCO-, o RNHCO-, donde

R representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo arilo, siendo dicho grupo alquilo o arilo opcionalmente sustituido por uno o más de los sustituyentes \alpha, definidos debajo;

el átomo de carbono quiral indicado por el asterisco está en la configuración L;

Z es un residuo de aminoácido aromático:

n es 0 ó 1:

R^{1} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo arilo, siendo opcionalmente sustituido por uno o más de los sustituyentes \alpha, definidos debajo; y

W representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o arilo;

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Una clase preferida de compuestos de la presente invención son los compuestos de fórmula (Ia);

(Ia)Q--R^{a}--

\delm{C}{\delm{\para}{NR ^{2} R ^{3} }}

*H--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--Z_{n}--

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

--R^{b}--NH--R^{c}--NH_{2}

(donde Q, R^{a}, R^{b}, R^{c}, R^{2}, R^{3}, Z, n, y R^{1} son como se ha definido más arriba) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Una clase todavía más preferida de compuestos de la presente invención son los compuestos de fórmula (Ib);

(Ib)X--

\delm{N}{\delm{\para}{Y}}

--(

\melm{\delm{\para}{R ^{5} }}{C}{\uelm{\para}{R ^{4} }}

)_{x}--

\delm{C}{\delm{\para}{NR ^{2} R ^{3} }}

*H--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--Z_{n}--

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

-- (

\melm{\delm{\para}{R ^{7} }}{C}{\uelm{\para}{R ^{6} }}

)_{y}--NH—R^{c}--NH_{2}

donde:

X, Y, Z, n y R^{1} son como se ha definido más arriba;

x es un entero entre 1 y 5;

y es 3 o 4;

R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y

el átomo de carbono quiral indicado por el asterisco está en la configuración L;

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los sustituyente \alpha se eligen entre: átomos halógenos, grupos amino, grupos alquilamino, grupos dialquilamino, grupos ciano, grupos hidroxi, grupos alquilo (excepto cuando el grupo sustituido es alquilo), grupos arilo, grupos carbamoílo, grupos alquilcarbamoílo, grupos dialquilcarbamoílo y grupos carboxi y ésteres de los mismos.

La presente invención proporciona además compuestos no tóxicos de fórmula (I), (Ia) o (Ib) como se ha definido más arriba. Se proporciona además una composición neuroprotectora que consta de un compuesto como se ha definido más arriba, además de la utilización de un compuesto como se ha definido más arriba en la fabricación de un medicamento para retrasar el daño neuronal antes, después o durante un evento isquémico.

Se entiende por sustancialmente puro un compuesto que, bajo condiciones de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento), no muestra tener ninguna cantidad significativa de contaminantes detectables de ese modo. Pueden ser aceptables niveles traza de contaminantes en ciertas circunstancias, y tales circunstancias se pueden determinar por los expertos en el momento. En general, los niveles de contaminante deberían ser menores del 1%, y preferiblemente sustancialmente menores del 1%, por ejemplo menos del 0,1%, si es posible tan bajo como el 0,001%.

Como alternativa, es preferible que los compuestos no sean tóxicos, por lo cual se entiende que los compuestos no deberían exhibir niveles inaceptables de toxicidad en las dosis en las cuales se aplican. Preferiblemente, no deberían exhibir toxicidad en ningún caso.

A pesar de lo anterior, la clase de compuestos definidos arriba es útil para neuroprotección bajo condiciones hipóxicas o isquémicas, y lo hemos demostrado mediante tests en el hipocampo, como se describe más abajo. Los niveles en los cuales estos compuestos están activos son sustancialmente más bajos que los niveles en los cuales los compuestos de la técnica anterior están activos.

Se pueden aplicar al paciente los compuestos de la presente invención si se sospecha que está en peligro de un evento isquémico, especialmente un derrame cerebral o un daño en la cabeza. Dicha aplicación profiláctica puede ser sumamente útil. No obstante, también se ha demostrado que los compuestos de la presente invención tienen una actividad útil incluso si se han aplicado después de un evento isquémico, pero se entenderá que es preferible administrar los compuestos tan pronto como sea posible, para evitar tanta degeneración neuronal como sea posible. En algunas circunstancias puede ser deseable administrar repetidas dosis, especialmente cuando el paciente permanece en peligro de un evento isquémico.

Para alcanzar el resultado deseado tan pronto como sea posible, los métodos adecuados de administración son generalmente por inyección. Así pues, se prefiere particularmente la inyección intravenosa pero, en algunas circunstancias, puede ser preferible administrar el compuesto directamente en el fluido cerebroespinal.

La dosis del compuesto de la presente invención variará dependiendo de muchos factores, incluyendo la edad, el peso corporal y la condición general del paciente, así como el modo, la frecuencia y la ruta de administración. Sin embargo, generalmente se recomienda una dosis de entre 0,01 y 50 mg/kg de peso corporal, siendo más preferida una dosis de entre 0,05 y 20 mg/kg de peso corporal. Esto se puede administrar en una dosis única o en dosis divididas.

En los compuestos de la presente invención, generalmente se prefiere que la longitud total del compuesto sea del orden de la longitud del Compuesto A, como se muestra a partir de ahora. Se puede considerar que el Compuesto A tiene una longitud de 18 unidades, de manera que preferimos que los compuestos de la presente invención no tengan una longitud mayor de 25 unidades, ni menor de 14 unidades. Esta es una preferencia general, pero generalmente se observa que hay una rápida disminución en la actividad con un cambio de longitud significativo, incluso de una unidad, teniendo un efecto generalmente indeseable. En consecuencia, es más preferible que el compuesto tenga una longitud de entre 17 y 22 unidades. Se entiende por "unidad" un átomo en la cadena más larga, excluyendo el hidrógeno, y aquellos átomos lineales enlazados al mismo. Así pues, por ejemplo, en la fórmula (Ia), el grupo NH_{2} se contempla como una unidad, así como los grupos CR^{2}R^{4}, CO, CR^{4}R^{6}, etc.

Q puede representar un grupo ciano, un grupo amidino o un grupo de fórmula XYN-.

Cuando X o Y representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, puede ser un grupo de cadena lineal o ramificada que tiene entre 1 y 6, preferiblemente entre 1 y 4, átomos de carbono. Ejemplos de esto incluyen los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, isopentilo, neopentilo, 2-metilbutilo, 1-etilpropilo, 4-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-metilpentilo, 1-metilpentilo, 3,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 2-etilbutilo, exilo e isohexilo. De éstos, preferimos a aquellos grupos alquilo que tienen entre 1 y 4 átomos de carbono, preferiblemente los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo e isobutilo, y más preferiblemente el grupo metilo.

Cuando X o Y representa un grupo que contiene un heteroátomo simple, éste puede ser un grupo acíclico o cíclico. Ejemplos de grupos acíclicos incluyen el grupo amidino (para formar, con el átomo de nitrógeno al cual X e Y están enlazados, un grupo guanidino), grupos alcoxicarbonilo (para formar un grupo alcoxicarbonilamino), el grupo carbamoílo o grupo tiocarbamoílo (para formar el grupo ureido o el grupo tioureido). Ejemplos de grupos heterocíclicos que se pueden representar por X e Y incluyen a aquellos grupos que tienen entre 5 y 10 átomos en el anillo (en uno o dos anillos), de los cuales del 1 a 4 son heteroátomos de nitrógeno y/o oxígeno y/o sulfuro, siendo los restantes átomos de carbono. Cuando hay 4 heteroátomos, preferimos que todos los 4 sean átomos de nitrógeno. Cuando hay 3 heteroátomos, preferimos que todos los 3, 2 o 1 sean átomos de nitrógeno. Cuando hay 2 heteroátomos, preferimos que 2 o 1 sean átomos de nitrógeno. Ejemplos de tales grupos incluyen los grupos pirrolilo, tetrazolilo, indolilo, tiazolilo, furilo, piranilo, cromenilo, imidazolilo, pirazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, isoindolilo, quinolilo, isoquinolilo, carbazolilo, cromanilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, piperidilo, piperazinilo, indolinilo y morfolinilo.

Si no, X e Y, junto con el átomo de nitrógeno al cual están enlazados, pueden formar un grupo heterocíclico que contiene nitrógeno. Ejemplos de tales grupos heterocíclicos incluyen a aquellos grupos que tienen entre 5 y 10 átomos en el anillo (en uno o dos anillos), de los cuales del 1 al 4 son heteroátomos de nitrógeno y/o oxígeno y/o sulfuro, siendo los restantes átomos de carbono. Cuando hay 4 heteroátomos, preferimos que todos los 4 sean átomos de nitrógeno. Cuando hay 3 heteroátomos, preferimos que todos los 3, 2 o 1 sean átomos de nitrógeno. Cuando hay 2 heteroátomos, preferimos que 2 o 1 sean átomos de nitrógeno. Ejemplos de tales grupos incluyen los grupos 1-pirrolilo, 1- o 2-tetrazolilo, 1-indolilo, 3-tiazolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo, 2-isotiazolilo, 3-oxazolilo, 2-isoxazolilo, 1-piridilo, 1-pirazinilo, 1-isoindolilo, 1-quinolilo, 2-isoquinolilo, 9-carbazolilo, 1-pirrolidinilo, 1-pirrolinilo, 1-imidazolidinilo, piperidino, 1-piperazinilo, 1-indolinilo y morfolino.

Cuando Q representa un grupo alcoxicarbonilamino, la parte alcoxi preferiblemente tiene entre 1 y 6 átomos de carbono y puede ser un grupo lineal o de cadena ramificada. Ejemplos de tales grupos incluyen los grupos metoxicarbonilamino, etoxicarbonilamino, propoxicarbonilamino, isopropoxicarbonilamino, butoxicarbonilamino, pentiloxicarbonilamino y hexiloxicarbonilamino, de los cuales preferimos a aquellos grupos que tengan entre 1 y 4 átomos de carbono, y más preferiblemente el grupo etoxicarbonilamino.

Preferiblemente al menos uno, de X e Y, representa un átomo de hidrógeno. Particularmente preferimos que uno o ambos, de X e Y, represente un átomo de hidrógeno. Los compuestos particularmente preferidos son aquellos compuestos de fórmula (I) en la cual tanto X como Y representan átomos de hidrógeno, o aquellos en los cuales uno, de X e Y, representa un átomo de hidrógeno y el otro representa un grupo amidino. Los compuestos más preferidos son aquellos compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ib) en las cuales tanto X como Y representan átomos de hidrógeno, o aquellos en los cuales uno, de X e Y, representa un átomo de hidrógeno y el otro representa un grupo amidino.

La longitud de los grupos representados por R^{a} y R^{b}, esto es, en la fórmula (Ia), el tamaño de x en combinación con y, no es particularmente importante, pero la longitud total preferida es de preferencia observada. Aunque cualquier grupo alquileno o alquenileno particular representado por R^{a} puede tener una longitud de hasta 6 átomos de carbono, se prefiere restringir cada cadena de alquileno a no más de 5 átomos de carbono, aunque preferiblemente a 3 o a 4, y se prefiere generalmente una combinación global de grupos trimetileno y tetrametileno. Ejemplos de tales grupos alquileno y alquenileno incluyen los grupos metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, vinileno, propenileno, but-1-enileno, but-2-enileno, pent-1-enileno, pent-2-enileno, pent-3-enileno, hex-1-enileno, hex-2-enileno, hex-3-enileno y hex-4-enileno. Así pues, x es preferentemente 3 ó 4, e y es preferentemente 3 ó 4. Asimismo, el grupo alquileno o alquenileno representado por R^{c} es preferentemente un grupo trimetileno o tetrametileno. Cuando R^{b} es un grupo trimetileno, R^{c} es un grupo tetrametileno, y viceversa. Más preferiblemente, R^{b} es un grupo trimetileno y R^{c} es un grupo tetrametileno.

Los diferentes grupos R^{1}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} pueden ser grupos alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono o grupos arilo, los cuales pueden ser no sustituidos o pueden estar sustituidos por al menos uno de los sustituyentes \alpha, definidos más arriba. Ejemplos de grupos alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono incluyen los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo e isohexilo, de los cuales se prefieren a los grupos metilo u etilo, y aún más se prefiere al grupo metilo. Los grupos arilo son grupos aromáticos carbocíclicos que preferiblemente tienen entre 6 y 10 átomos de carbono en el anillo, y más preferiblemente tienen 6 ó 10 átomos de carbono en el anillo, por ejemplo los grupos fenilo, 1-naftilo y 2-naftilo, de los cuales se prefiere el grupo fenilo. Alternativamente, cualquiera de estos grupos se puede sustituir por uno o más de los sustituyentes \alpha.

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Ejemplos de sustituyentes \alpha incluyen:

átomos de halógeno por ejemplo átomos de cloro, floro o bromo;

grupos amino;

grupos alquilamino, en los que la parte alquilo preferiblemente tiene de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo el metilamino, etilamino, propilamino, butilamino, t-butilamino, pentilamino y grupos hexilamino;

grupos dialquilamino, en los que la parte alquilo preferiblemente tiene de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo los grupos dimetilamino, dietilamino, metiletilamino, dipropilamino, dibutilamino, dipentilamino y dihexilamino;

grupos ciano;

grupos hidroxi;

grupos alquilo (excepto cuando el grupo sustituido es alquilo), por ejemplo como se ejemplificó anteriormente con relación a R^{1} etc.;

grupos arilo, por ejemplo como se ejemplificó anteriormente con relación a R^{1} etc.;

grupos carbamoílo;

grupos alquilcarbamoílo, en los que la parte alquilo preferiblemente tiene de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo los grupos metilcarbamoílo, etilcarbamoílo, propilcarbamoílo, butilcarbamoílo, t-butilcarbamoílo, pentilcarbamoílo y hexilcarbamoílo; y

grupos dialquilcarbamoílo, en los que la parte alquilo tiene preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo los grupos dimetilcarbamoílo, dietilcarbamoílo, metiletilcarbamoílo, dipropilcarbamoílo, dibutilcarbamoílo, dipentilcarbamoílo y dihexilcarbamoílo.

Ejemplos de dichos grupos sustituidos incluyen: grupos metilo halógeno-sustituidos, preferiblemente que tienen tres átomos de halógeno, como son los grupos triclorometilo y trifluorometilo; grupos fenilo halógeno-sustituidos, como son los grupos o-, m- y p-clorofenilo, o-, m- y p-fluorofenilo, o-, m- y p-bromofenilo, 2,3-diclorofenilo, 2,3-difluorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 3,4-difluorofenilo, 2,4,6-triclorofenilo y 2,4,6-trifluorofenilo; grupos alquilo amino-sustituidos, como son los grupos aminometilo, 2-aminoetilo, 3-aminopropilo y 4-aminobutilo; grupos alquilo alquilamino-sustituidos (en los que la parte alquilo del grupo alquilamino preferiblemente tiene de 1 a 4 átomos de carbono), como son los grupos metilaminometilo, 2-metilaminoetilo, 3-metilaminopropilo, 4-metilaminobutilo, etilaminometilo, 2-etilaminoetilo, 3-etilaminopropilo, 4-etilaminobutilo, propilaminometilo, 2-propilaminoetilo, 3-propilaminopropilo, 4-propilaminobutilo, butilaminometilo, 2-butiloaminoetilo, 3-butilaminopropilo y 4-butilaminobutilo; grupos alquilo dialquilamino-sustituidos (en los que cada parte alquilo del grupo dialquilamino preferiblemente tiene de 1 a 4 átomos de carbono), como son los grupos N,N-dimetilaminometilo, 2-N,N-dimetilaminoetilo, 3-N,N-dimetilaminopropilo, 4-N,N-dimetilaminobutilo, N,N-dietilaminometilo, 2-N,N-dietilaminoetilo, 3-N,N-dietilaminopropilo, 4-N,N-etilami-
nobutilo, N,N-propilaminometilo, 2-N,N-propilaminoetilo, 3-N,N-propilaminopropilo, 4-N,-propilaminobutilo, N,N-
butilaminometilo, 2-N,N-butilaminoetilo, 3-N,N-butilaminopropilo y 4-N,N-butilaminobutilo; grupos alquilo arilo-sustituidos (particularmente fenilo o naftilo), como son los grupos bencilo, fenetilo, 3-fenilpropilo o 4-fenilbutilo; grupos alquilo carbamoíl-sustituidos, como son los grupos carbamoílmetilo, 2-carbamoíletilo, 3-carbamoílpropilo y 4-carbamoílbutilo; grupos alquilo alquilcarbamoíl-sustituidos (en los que la parte alquilo del grupo alquilcarbamoílo preferiblemente tiene de 1 a 4 átomos de carbono), como son los grupos metilcarbamoílmetilo, 2-metilcarbamoíletilo, 3-metilcarbamoílpropilo, 4-metilcarbamoílbutilo, etilcarbamoílmetilo, 2-etilcarbamoíletilo, 3-etilcarbamoílpropilo, 4-etilcarbamoílbutilo, propilcarbamoílmetilo, 2-propilcarbamoíletilo, 3-propilcarbamoílpropilo, 4-propilcarbamoílbutilo, butilocarbamoílmetilo, 2-butilcarbamoíletilo, 3-butilcarbamoílpropilo y 4-butilcarbamoílbutilo; grupos alquil dialquilcarbamoíl-sustituidos (en los que cada parte alquilo del grupo dialquilcarbamoílo tiene preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono), como son los grupos N,N-dimetilcarbamoílmetilo, 2-N,N-dimetilcarbamoíletilo, 3-N,N-dimetilcarbamoílpropilo, 4-N,N-dimetil-carbamoílbutilo, N,N-dietilcarbamoílmetilo, 2-N,N-dietilcarbamoíletilo, 3-N,N-dietilcarbamoílpropilo, 4-N,N-etilcarbamoílbutilo, N,N-propilcarbamoílmetilo, 2-N,N-propilcarbamoíletilo, 3-N,N-propilcarbamoílpropilo, 4-N,N-propilcarbamoílbutilo, N,N-butilcarbamoílmetilo, 2-N,N-butilcarbamoíletilo, 3-N,N-butilcarbamoílpropilo y 4-N,N-butilcarbamoílbutilo; grupos alquilo carboxi-sustituidos, como son los grupos carboximetilo, 2-carboxietilo, 3-carboxipropilo y 4-carboxibutilo y los ésteres de éstos; y o-, m- y p-aminofenilo, metilaminofenilo, etilaminofenilo, propilaminofenilo, butilaminofenilo, N,N-dimetilaminofenilo, N,N-dietilaminofenilo, N,N-dipropilaminofenilo, N,N-dibutilaminofenilo, bifenililo, carbamoílfenilo, etilcarbamoílfenilo, etilcarbamoílfenilo, propilcarbamoílfenilo, butilcarbamoílfenilo, N,N-dimetil-carbamoílfenilo, N,N-dietilcarbamoílfenilo, N,N-dipro-
pilcarbamoílfenilo, N,N-dibutilcarbamoílfenilo y grupos carboxifenilo y ésteres de los grupos carboxifenilo.

Ejemplos de grupos éster incluyen:

grupos alquilo que tienen de 1 a 20 átomos de carbono, más preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono, como son aquellos ejemplificados anteriormente y grupos alquilo de peso molecular elevado que son bien conocidos en la técnica, como son los grupos heptilo, octilo, nonilo, decilo, dodecilo, tridecilo, pentadecilo, octadecilo, nonadecilo e icosilo, pero más preferiblemente los grupos metilo, etilo y grupos t-butilo;

grupos cicloalquilo que tienen de 3 a 7 átomos de carbono, por ejemplo el ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y grupos cicloheptilo;

grupos aralquilo, en los que la parte alquilo tiene de 1 a 3 átomos de carbono y la parte arilo es un grupo aromático carbocíclico que tiene de 6 a 14 átomos de carbono, el cual puede estar sustituido o no sustituido y, si está sustituido, tiene al menos uno de los sustituyentes \alpha definidos y ejemplificados anteriormente, aunque se prefieren los grupos sin sustituir; ejemplos de dichos grupos aralquilo incluyen al bencilo, fenetilo, 1-feniletilo, 3-fenilpropilo, 2-fenilpropilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo, 2-(1-naftil)etilo, 2-(2-naftil)etilo, benzhidrilo (i.e. difenilmetilo), trifenilmetilo, bis-(o-nitrofenil)metilo, 9-antrilmetilo, 2,4,6- trimetilbencilo, 4-bromobencilo, 2-nitrobencilo, 4-nitrobencilo, 3-nitrobencilo, 4-metoxibencilo y grupos piperonilo;

grupos alquenilo que tienen de 2 a 6 átomos de carbono, como son los grupos vinilo, alilo, 2-metilalilo, 1-propenilo, isopropenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo y 5-hexenilo, de los cuales se prefieren los grupos vinilo, alilo, 2-metilalilo, 1-propenilo, isopropenilo y butenilo, siendo los mas preferidos los grupos alilo y 2-metilalilo;

grupos alquilo halogenados que tienen de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, en los que la parte alquilo es definida y ejemplificada en relación a los grupos alquilo anteriores, y el átomo de halógeno es cloro, flúor, bromo o yodo, tales como los grupos 2,2,2-tricloroetilo, 2-haloetilo (e.g. 2-cloroetilo, 2-fluoroetilo, 2-bromoetilo o 2-yodoetilo), 2,2-dibromoetilo y 2,2,2-tribromoetilo;

grupos sililalquilo sustituidos, en los que la parte alquilo es como se definió y ejemplificó anteriormente, y el grupo sililo tiene hasta 3 sustituyentes que se eligieron de grupos alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono y grupos fenilo que no están sustituidos o tienen al menos un sustituyente que se elige de los sustituyentes que se definieron y ejemplificaron anteriormente, por ejemplo un grupo 2-trimetilsililetilo;

grupos fenilo, en los que el grupo fenilo está sustituido o no sustituido, preferiblemente con al menos un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono o grupo acilamino, por ejemplo el fenilo, tolilo y grupos benzamidofenilo;

grupos fenacilo, que pueden estar no sustituidos o tener al menos uno de los sustituyentes \alpha definidos y ejemplificados anteriormente, por ejemplo el mismo grupo fenacilo o el grupo p-bromo-fenacilo;

grupos terpenilo cíclicos y acíclicos, por ejemplo los grupos geranilo, nerilo, linalilo, fitilo, mentilo (especialmente el m- y p-mentilo), tujilo, carilo, pinanilo, bornilo, notcarilo, norpinanilo, norbornilo, mentenilo, camfenilo y norbornenilo;

grupos alcoximetilo, en los que la parte alcoxi tiene de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono y la mismo puede estar sustituida por un grupo alcoxi no sustituido sencillo, como son los grupos metoximetilo, etoximetilo, propoximetilo, isopropoximetilo, butoxometilo y metoxietoximetilo;

grupos aciloxialquilo alifáticos, en los que el grupo acilo es preferiblemente un grupo alcanoílo y es más preferiblemente un grupo alcanoílo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, y la parte alquilo tiene de 1 a 6, y preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono como son los grupos acetoximetilo, propioniloximetilo, butiriloximetilo, isobutiriloximetilo, pivaloiloximetilo, 1-pivaloiloxietilo, 1-acetoxietilo, 1-isobutiriloxietilo, 1-pivaloiloxipropilo, 2-metil-1-pivaloiloxipropilo, 2-pivaloiloxipropilo, 1-isobutiriloxietilo, 1- isobutiriloxipropilo, 1-acetoxipropilo, 1-acetoxi-2-metilpropilo, 1-propioniloxietilo, 1-propioniloxipropilo, 2-acetoxipropilo y 1-butiriloxietilo;

grupos aciloxialquilo alifáticos cicloalquil-sustituidos, en los que el grupo acilo es preferiblemente un grupo alcanoílo y más preferiblemente un grupo alcanoílo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, el sustituyente cicloalquilo tiene de 3 a 7 átomos de carbono, y la parte alquilo tiene de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, como son los grupos (ciclohexilacetoxi)metilo, 1-(ciclohexilacetoxi)etilo, 1-(ciclohexilacetoxi)propilo, 2-metil-1-(ciclohexilacetoxi)propilo, (ciclopentilacetoxi)metilo, 1-(ciclopentilacetoxi)etilo, 1-(ciclopentilacetoxi)propilo y 2-metil-1-(ciclopentilacetoxi)propilo;

grupos alcoxicarboniloxialquilo, especialmente el grupo 1- (alcoxicarboniloxi) etilo, en el que la parte alcoxi tiene de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 6, y más preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, y la parte alquilo que tiene de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, como son los grupos 1-metoxicarboniloxietilo, 1-etoxicarboniloxietilo, 1- propoxicarboniloxietilo, 1-isopropoxicarboniloxietilo, 1-butoxicarboniloxietilo, 1-isobutoxicarboniloxietilo, 1-sec-butoxicarboniloxietilo, 1-t-butoxicarboniloxietilo, 1- (1-etilpropoxicarboniloxi) etilo y 1- (1, 1-dipropilbutoxicarboniloxi) etilo, y otros grupos alcoxicarbonilalquilo, en los que ambos grupos alcoxi y alquilo tienen de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, como son los grupos 2-metil-1-(isopropoxicarboniloxi) propilo, 2- (isopropoxicarboniloxi) propilo, isopropoxicarboniloximetilo, t-butoxicarboniloximetilo, metoxicarboniloximetilo y etoxicarboniloximetilo;

\newpage

grupos cicloalquilcarboniloxialquilo y cicloalquiloxicarboniloxialquilo, en el que el grupo cicloalquilo tiene de 3 a 10, preferiblemente de 3 a 7 átomos de carbono, es mono o policíclico y está sustituido opcionalmente por al menos un (y preferiblemente únicamente uno) grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono (e. g. que se eligen de aquellos grupos alquilo ejemplificados anteriormente) y la parte alquilo tiene de 1 a 6, mas preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono (e. g. que se eligen de aquellos grupo alquilo ejemplificados anteriormente) y es más preferiblemente metilo, etilo o propilo, por ejemplo los grupos 1-metilciclohexilcarboniloximetilo, 1-metilciclohexiloxicarboniloximetilo, ciclopentiloxicarboniloximetilo, ciclopentilcarboniloximetilo, 1-ciclohexiloxicarboniloxietilo, 1-ciclohexilcarboniloxietilo, 1-ciclopentiloxicarboniloxietilo, 1-ciclopentilcarboniloxietilo, 1-cicloheptiloxicarboniloxietilo, 1-cicloheptilcarboniloxietilo, 1-metilciclopentilcarboniloximetilo, 1-metilciclopentiloxicarboniloximetilo, 2-metil-1-(1-metilciclohexilcarboniloxi)propilo, 1-(1-etilciclohexilcarboniloxi)propilo, 2-(1-metilciclohexilcarboniloxi)propilo, 1-(ciclohexilcarboniloxi)propilo, 2-(ciclohexilcarboniloxi)propilo, 2-metil-1-(1-metilciclopentilcarboniloxi)propilo, 1-(1-metilciclopentilcarboniloxi)propilo, 2-(1-metilciclopentilcarboniloxi)propilo, 1-(ciclopentilcarboniloxi)propilo, 2-(ciclopentilcarboniloxi)propilo, 1-(1-metil-ciclopentilcarboniloxi)etilo, l-(l-metilciclopentilcarboniloxi)propilo, adamantiloxicarboniloximetilo, adamantilcarboniloximetilo, I-adamantiloxicarboniloxi- etilo y 1-adamantilcarboniloxietilo;

grupos cicloalquilalcoxicarboniloxialquilo en los que el grupo alcoxi tiene un único sustituyente cicloalquilo, el sustituyente cicloalquilo tiene de 3 a 10, preferiblemente de 3 a 7, átomos de carbono y es mono o policíclico, por ejemplo los grupos ciclopropilmetoxicarboniloximetilo, ciclobutilmetoxicarboniloximetilo, ciclopentilmetoxicarboniloximetilo, ciclohexilmetoxicarboniloximetilo, 1-(ciclopropilmetoxicarboniloxi)etilo, 1-(ciclobutilmetoxicarboniloxi)etilo, 1-(ciclopentilmetoxicarboniloxi)etilo y 1-(ciclohexilmetoxicarboniloxi)etilo;

grupos terpenilcarboniloxialquilo y terpeniloxicarboniloxialquilo, en los que el grupo terpenilo es como se ejemplificó anteriormente, y es preferiblemente un grupo terpenilo cíclico, por ejemplo los grupos 1-(mentiloxicarboniloxi)etilo, 1-(mentilcarboniloxi)etilo, mentiloxicarboniloximetilo, mentilcarboniloximetilo, 1-(3-pinaniloxicarboniloxi)etilo, 1-(3-pinanilcarboniloxi) etilo, 3-pinaniloxicarboniloximetilo y 3-pinanilcarboniloximetilo;

grupos alquilo 5-alquilo o 5-fenilo [que se pueden sustituir por al menos uno de los sustituyentes \alpha, definidos y ejemplificados anteriormente] (2-oxo-1,3-dioxolen-4-ilo) en los que cada grupo alquilo (que puede ser el mismo o diferente) tiene de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, átomos de carbono, por ejemplo los grupos (5-metil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo, (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo, (5-isopropil-2-oxo-1,3-dioxolen-4- il)metilo, (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo y 1-(5-metil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)etilo; y

otros grupos, especialmente los que son fácilmente eliminados in vivo como son los grupos ftalidilo, indanilo y 2-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzodioxolen-4-ilo.

De los grupos anteriores, preferimos especialmente a aquellos grupos que se pueden eliminar fácilmente in vivo, y más preferiblemente los grupos aciloxialquilo alifáticos, alcoxicarboniloxialquilo, cicloalquilcarboniloxialquilo, ftalidilo y (5-sustituido 2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo.

No obstante, preferimos que R^{1}, R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} sean todos hidrógenos.

Generalmente se prefiere que el grupo Z no esté presente, i.e. que no sea 0, pero cuando está presente, entonces es preferible que corresponda al residuo de un aromático, y preferiblemente a un aromático hidrofóbico, un aminoácido, más preferiblemente un \alpha-aminoácido, como por ejemplo la histidina, la fenilalanina, la tirosina, el triptófano o la fenilglicina, de las cuales la fenilalanina o la tirosina se prefieren más.

R^{c} es un grupo alquileno opcionalmente sustituido por 1 o 2 grupos alquilo, preferiblemente metilo. Tal grupo alquileno tiene 3 ó 4 átomos de carbono en una cadena lineal y se sustituye opcionalmente por 1 ó 2 grupos alquilo, preferiblemente metilo. Ejemplos de tales grupos incluyen los grupos metileno, etileno, metiletileno, 1-, 2- ó 3-metiltrimetileno, trimetileno, propileno, tetrametileno, pentametileno y hexametileno, de los cuales los grupos trimetileno y tetrametileno se prefieren generalmente.

Los compuestos preferidos de la presente invención son los siguientes compuestos de fórmula A a D:

Compuesto de fórmula A

2

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Compuesto de fórmula B

3

Compuesto de fórmula C

4

Compuesto de fórmula D

5

Compuesto de fórmula E

6

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Compuesto de fórmula F

7

Compuesto de fórmula G

8

Compuesto de fórmula H

9

Compuesto de fórmula I

10

De éstos, se prefieren especialmente a los Compuestos de fórmula A, D, E, F, G, H e I, siendo los Compuestos de fórmula A y D más preferidos, y siendo el Compuesto de fórmula A el más preferido.

Los compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante diversos procesos los cuales, por sí mismos, son bien conocidos en la técnica. Si no, se pueden preparar mediante el procedimiento siguiente:

Se hincha resina Wang (0,03 mmol) en tetrahidrofurano anhidro (1,0 ml) y se añade poco a poco carbonil diimidazol (4 equivalentes, 0,12 mmol). Se agita la mezcla resultante durante 16 horas a temperatura ambiente y entonces se filtra, después de lo cual se lava con tetrahidrofurano, etanol y diclorometano. Se seca entonces la resina in vacuo.

Se vuelve a hinchar la resina en diclorometano anhidro (1,0 ml) y se añade poco a poco 1,3-diaminopropano (10 equivalentes, 0,3 mmol). Se agita la mezcla resultante durante 2 horas y entonces se filtra, después de lo cual se lava con (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y entonces se seca in vacuo.

De nuevo se vuelve a hinchar la resina en diclorometano anhidro (1,0 ml) y se añade 2,6-lutidina (5 equivalentes, 0,15 mmol), seguido por la agregación cuidadosa del cloruro de 2,4-dinitrobencensulfonilo (4 equivalentes, 0,12 mmol). Se agita la mezcla durante dos horas bajo atmósfera inerte y entonces se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se seca in vacuo.

Se hincha la resina resultante en tetrahidrofurano anhidro (1,0 ml) y entonces se añade trifenilfosfina (4 equivalentes, 0,12 mmol), el D-aminoalcohol desprotegido (4 equivalentes, 0,12 mmol) y se disuelve con agitación. Se añade gota a gota el dietilazodicarboxilato (4 equivalentes, 0,12 mmol) y la mezcla se agita durante 12 horas y entonces se filtra y se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano), después de lo cual se seca in vacuo.

Se hincha entonces la resina en diclorometano (1,0 ml) y se añade propilamina (5 equivalentes, 0,15 mmol) y la mezcla se agita durante 1 hora, después de lo cual se filtra y se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y entonces se seca in vacuo.

Se hincha de nuevo la resina en diclorometano (1,0 ml) y se añade dicarbonato de di-t-butilo (10 equivalentes, 0,3 mmol) y N,N-dimetilaminopiridina (5 mol%, 0,0015 mmol). Se agita entonces la mezcla durante 16 horas. Se filtra y se lava entonces la resina (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y entonces se seca in vacuo.

Se agita entonces la resina en 2% hidrato de hidrazina/dimetilformamida (1,0 ml) durante 1 hora y entonces se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se seca in vacuo.

Se disuelven Fmoc AA (4 equivalentes, 0,12 mmol), TBTU (4 equivalentes, 0,12 mmol), y diisopropiletilamina (8 equivalentes, 0,48 mmol) en dimetilformamida anhidra (1,0 ml) y se añade la mezcla a la resina. Se agita el conjunto durante 12 horas y entonces se filtra y se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se seca in vacuo.

Se añade a la resina 20% piperidina/dimetilformamida (1,0 ml) y se agita la mezcla durante 0,5 horas y entonces se filtra y se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano), después de lo cual se seca in vacuo.

Se disuelve Boc AA (4 equivalentes, 0,12 mmol), TBTU (4 equivalentes, 0,12 mmol), y diisopropiletilamina (8 equivalentes, 0,48 mmol) en dimetilformamida (1,0 ml) y se añade la mezcla a la resina. Se agita entonces el conjunto durante 12 horas y se filtra y se lava (dimetilformamida, metanol, diclorometano), después de lo cual se seca in vacuo.

Se añade 50%TFA/45%diclorometano/2,5%H_{2}O/2,5% triisopropilsilano (1,0 ml) a la resina y se agita la mezcla durante 1 hora. La resina se filtra y se lava con diclorometano (1,0 ml) y se concentra el producto filtrado in vacuo. Se tritura el aceite amarillo viscoso resultante con éter de etilo anhidro (3x2 ml) para producir el compuesto requerido.

Tanto la preparación de los compuestos de la invención como la actividad neuroprotectora se ilustra en los ejemplos, no limitantes, acompañantes. En estos ejemplos se utilizan las siguientes abreviaturas:

Arg	arginina;
Boc	t-butoxicarbonilo;
DIC	di-isopropilcarbodiimida;
EDT	etan-1,2-diol;
Fmoc	N-fluorenilmetoxicarbonilo;
HOBt	hidroxibenzotriazol;
Lys	lisina;
ODS	octadecilsilano
Orn	ornitina;
Phe	fenilalanina;
Pmc	N^{G}-2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-ilsulfonilo;
RP-HPLC	cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa;
TFA	ácido trifluoroacético;

Síntesis de los compuestos Ejemplo 1 N^{1}-L-Arginilspermidina[Compuesto de fórmula A]

Se trataron 0,152 g de N^{l}-Fluorenilmetoxicarbonil-N^{4}-(4'- benzoiloxicarbonil-(1'-fenoxi)etanoamido resin)-N^{8}-t- butoxicarbonilspermidina con 5 ml de una solución 20% v/v de piperidina en dimetilformamida. Se filtró la resina, y entonces se trató de nuevo con 5 ml de una solución 20% v/v de piperidina en dimetilformamida durante otros 30 minutos. Al final de este período, se filtró y se lavó la resina, en este orden, con 10 ml de dimetilformamida, 5 ml de metanol y finalmente dos veces con, cada vez, 10 ml de cloruro de metileno. Se disolvió Fmoc-Arg (Pmc) OH (0,1027 g; 0,154 mmol) en cloruro de metileno (9 ml), y entonces se añadió HOBt (0,021 g; 0,155 mmol). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadió N^{4}-(4'-Benzoiloxicarbonil(1'-fenoxi) etanoamido resin)-N^{8}-t-butoxicarbonilspermidina (0,1032 g; 0,031 mmol) seguido por DIC (24 ml; 0,155 mmol). Se agitó la mezcla con cuidado durante 20 horas a temperatura ambiente. Después de una prueba de ninhidrina negativa se filtró la resina y se lavó con cloruro de metileno (1x10 ml), metanol (1x5 ml), cloruro de metileno (2x10 ml), entonces se secó en vacío. La eliminación del Fmoc se llevó a cabo como arriba. Se desprotegió la N^{1}-Arg(Pmc)-N^{4}-(4'-Benzoiloxicarbonil-(1'- fenoxi)etanoamido resin)-N^{8}-t-butoxicarbonilspermidina utilizando TFA-fenol-agua-triisopropilsilano-etano-1,2-ditiol (EDT)(81,5: 5: 5: 1: 2,5 por volumen; 2,5 ml) durante 5 horas a temperatura ambiente. La resina se eliminó por filtración a través de una pipeta Pasteur que contenía un tapón de lana de vidrio apretado y se lavó con cloruro de metileno (4x4 ml). Se eliminó el disolvente in vacuo, se disolvió el residuo en CH_{3}CN (1 ml) y se vertió en éter etílico frío (25 ml) para dar un precipitado blanco que se separó por centrifugación. Se decantó el sobrenadante y se volvió a suspender el sólido en éter etílico (25 ml). Se separó de nuevo el sólido por centrifugación y se repitió el procedimiento dos veces. Se disolvió el producto en agua antes de liofilizarlo. Se analizó el producto (19,2 g) y se purificó por RP-HPLC (ODS, eluyendo isocráticamente con agua/0,1% TFA).

Ejemplo 2 Compuestos B, C, Z^{1}, Z^{2} y Z^{3}

Se prepararon estos compuestos de manera análoga utilizando Fmoc-L-Lys (t-butoxicarbonilo), Fmoc-L-Om (t-butoxicarbonilo), Fmoc-D-Arg (Pmc), Fmoc-D-Lys (t-butoxicarbonilo) y Fmoc-D-Orn (t-butoxicarbonilo), respectivamente.

Análisis de los compuestos N-L-Arginilspermidina (Compuesto de fórmula A)

\deltaH (300 MHz, D_{2}O): 3,86 (1H, t, J-6,6, Arg alpha-CH); 3,28-3,02 (4H, m); 2,95-2,78 (6H, m); 1,98-1,70 (4H, m); 1,68-1,40 (6H, m)

\deltaC (75 MHz, D_{2}O): 173,1 (COOH); 159,6 (NH=C(NH-2)NH); 55,6 (CH); 49,6 (CH_{2}); 47,8 (CH_{2}); 42,9 (CH_{2}); 41,4 (CH_{2}); 39,1 (CH_{2}); 30,8 (CH_{2}); 28,1 (CH_{2}); 26,5 (CH_{2}); 26,3 (CH_{2}); 25,4 (CH_{2})

M/Z: (ES+) 302,3 (M+H)^{+}, 416,3 (M+H+TFA)^{-}.

N^{1}-D-Arginilspermidina (Compuesto Z^{1})

\deltaH (360 MHz, D_{2}O): 3,78 (1H, t, J-6,5 Arg alpha-CH); 3,32-3,04 (4H, m); 3,03-2,83 (6H, m); 1,87-1,69 (4H, m); 1,68-1,55 (4H, m); 1,54-1,42 (2H, m)

\deltaC (95 MHz, D_{2}O): 53,8 (CH); 47,7 (CH_{2}); 45,9 (CH_{2}); 41,1 (CH_{2}); 39,5 (CH_{2}); 37,2 (CH_{2}); 29,0 (CH_{2}); 26,2 (CH_{2}); 24,6 (CH_{2}); 24,4 (CH_{2}); 23,5 (CH_{2});

M/Z: (ES+) 302,3 (M+H)^{+}, 416,3 (M+H+TFA)^{+}.

N^{1}-L-Lzsinilspermidina [Compuesto de la fórmula B]

\deltaH (360 MHz, D_{2}O): 3,84 (1H, t, J-6,6, Lys alpha-CH), 3,23 (2H, aft, J7, 5), 3,09-2,80 (8H, m), 1,89-1,73 (4H, m), 1,72-1,49 (6H, m), 1,44-1, 26 (2H, m);

M/Z: (ES+) 274,3 (M+H) ^{+}, 410,3 (M+Na+TFA) ^{+}.

N^{1}-D-Lisinilespermidina (Compuesto Z^{2})

\deltaH (360 MHz, D_{2}O): 3,84 (1H, t, J-6,5, Lys alpha-CH); 3,23 (2H, aft, J 7,5); 3,09-2,84 (8H, m); 1,90-1,74 (4H, m); 1,73-1,50 (6H, m); 1,40-1,27 (2H, m)

M/Z: (ES+) 274,3 (M+H) ^{+}, 388,4 (M+H+TFA) ^{+},

N'-L-Ornitilespermidina [Compuesto de fórmula C]

\deltaH (360 MHz, D_{2}0): 3,94 (1H, t, J-6,6, Orn alpha-CH); 3,31 (2H, aft, J 7,5); 3,18-2,89 (8H. m); 2,08-1,80 (4H, m); 1,78-1,52 (6H, m)

M/Z: (ES+) 260,3 (M+H)^{+}, 374,3 (M+H+TFA)^{+}.

N'-D-Ornitilespermidina (Compuesto Z^{3})

\deltaH (360 MHz, D_{2}O): 3,88 (1H, t, J-6,6, Orn alpha-CH); 3,23 (2H, aft, J 7,5); 3,10-2,80 (8H, m); 1,98-1,78 (4H, m); 1,75-1,50 (6H, m)

M/Z: (ES+) 260,3 (M+H)^{+}, 374,3 (M+H+TFA)^{+}.

Análisis de HPLC

Se analizaron los compuestos de la presente invención por HPLC. Los resultados mostraron que los compuestos, cuando se hacían mediante el procedimiento preferido de la presente invención, estaban sustancialmente libres de los reactivos originales.

Ejemplo 3 Arginin-L-fenilalanin-spermidinA: Compuestos de fórmula G

Se hinchó resina Wang (0,03 mmol, 50 mg) en tetrahidrofurano anhidro (1,0 ml) y se añadió carbonil diimidazol (4 equivalentes, 0,12 mmol, 19 mg). Se agitó entonces la mezcla resultante durante 16 horas a temperatura ambiente, después de lo cual se filtró y se lavó con tetrahidrofurano, etanol y diclorometano. Se secó entonces la resina in vacuo.

Se volvió a hinchar a la resina en diclorometano anhidro (1,0 ml), y se añadió 1,4-diaminobutano (10 equivalentes, 0,3 mmol, 25 mg). Se agitó entonces la mezcla resultante durante 2 horas y entonces se filtró y lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano), después de lo cual se secó in vacuo.

De nuevo se volvió a hinchar la resina en diclorometano anhidro (1,0 ml), y se añadió 2,6-lutidina (5 equivalentes, 0,15 mmol, 16 mg), seguido por la cuidadosa adición de cloruro de 2,4-dinitrobencensulfonilo (4 equivalentes, 0,12 mmol, 32 mg). Se agitó entonces la mezcla durante 2 horas bajo una atmósfera inerte y entonces se lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se secó in vacuo.

Se hinchó entonces la resina resultante en tetrahidrofurano anhidro (1,0 ml) y trifenilfosfina (4 equivalentes, 0,12 mmol, 32 mg). Se añadió el d-aminoalcohol desprotegido (4 equivalentes, 0,12 mmol, 29 mg) y se disolvió mediante agitación. Se añadió por goteo dietil azodicarboxilato (4 equivalentes, 0,12 mmol, 21 mg) y se agitó la mezcla durante 12 horas y entonces se filtró y se lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano). Se secó entonces in vacuo.

Se hinchó entonces la resina en diclorometano (1,0 ml), y se añadió propilamina (5 equivalentes, 0,15 mmol, 13 mg). Se agitó entonces la mezcla durante 1 hora después de lo cual se filtró y lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se secó entonces in vacuo.

De nuevo se hinchó la resina en diclorometano (1,0 ml), se añadió dicarbonato de dibutilo (10 equivalentws, 0,3 mmol, 33 mg) y N, N-dimetilaminopiridina (5mol%, 0,0015 mmol, 0,2 mg), y se agitó la mezcla durante 16 horas. Se filtró y lavó entonces la resina (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se secó entonces in vacuo.

Se agitó entonces la resina durante 1 hora en 2% de hidrato de hidrazina/dimetilformamida (1,0 ml) y entonces se lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano), después de lo cual se secó in vacuo.

Se disolvió Fmoc-Phe-OH (4 equivalentes, 0,12 mmol, 46 mg), TBTU (4 equivalentes, 0,12 mmol, 39 mg) y diisopropiletilamina (8% 0,48 mmol, 62 mg) en dimetilformamida anhidra (1,0 ml), y se añadió la mezcla a la resina. Se agitó entonces el conjunto durante 12 horas, y entonces se filtró y lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se secó in vacuo.

Se añadió 20% piperidina/dimetilformamida (1,0 ml) a la resina y se agitó la mezcla durante 0,5 horas. Entonces se filtró y lavó (dimetilformamida, MeOH, diclorometano) y se secó in vacuo.

Se disolvió Boc-Arg (Phe-OH (4 equivalentes, 0,12 mmol, 63 mg), TBTU (4 equivalentes, 0,12 mmol, 39 mg), y diisopropiletilamina (8 equivalentes, 0,48 mmol, 62 mg) en dimetilformamida (1,0 ml) y se añadió la mezcla a la resina. Se agitó entonces el conjunto durante 12 horas, y entonces se filtró y lavó (dimetilformamida, metanol, diclorometano) y se secó in vacuo.

Se añadió 50% TFA/45% diclorometano/2,5% H_{2}O/2,5% triisopropilsilano (1,0 ml) a la resina, se agitó la mezcla durante 1 hora. Se filtró la resina y se lavó con diclorometano (1.0 ml) y el producto filtrado se concentró in vacuo. Se trituró el aceite amarillo viscoso resultante con éter de etilo anhidro (3x2 ml) para producir el compuesto título como su sal tetrakis TFA (1 9mg, 70%):

\newpage

Análisis

LCMS

90% (detección ELS). M/z 449 (ES^{+}).

NMR:

Se vio que ^{1}H NMR estaba de acuerdo con la anterior estructura.

D-aminoalcohol desprotegido:

Dde = N-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iloiden)etilo

Preparación del D- aminoalcohol desprotegido

Se añadió 2-acetildimedona (1,1 equivalentes, 22 mmol, 4,0 g) a una solución de 3-amino-1-propanol (1,5 g, 20 mmol) en etanol y se calentó la mezcla a 50ºC durante una hora. Se concentró la solución resultante in vacuo para producir un sólido cristalino rojo que se trituró con hexano para proporcionar un sólido de color hueso (4,74 g, 95%)

Ejemplo 4 Compuesto de fórmula D

Se llenó una jeringuilla PTFE de 2 ml con N^{1}-Fluorenilmetoxicarbonil- N^{4}-(4'-benzoiloxicarbonil(1'-fenoxi)etanamido resin)-N^{8}-Bocespermidina (\approx31 mg, 0,263 mmol/g) y se trató 3 veces con 20% piperidina en dimetilformamida (2 ml) durante 30 minutos, seguido por un lavado con dimetilformamida (2x2 ml) y CH_{2}Cl_{2} (4x2 ml).

La amina primaria resultante se acopló a Fmoc-Phe utilizando 5 equivalentes (0,041 mmol) del ácido Fmoc-carbamoílo y activación DIC/HOBt en CH_{2}Cl_{2}/ imetilformamida (1 ml/1 gota). Después de 4 horas, con agitación ocasional, las pruebas de ninhidrina indicaron que el acoplamiento era completo. Después de tratamiento con 20% piperidina en dimetilformamida (2 ml, 2x30 mn) y de lavado con dimetilformamida (2x2 ml) y CH_{2}Cl_{2} (4x2 ml) se acopló el ácido guanidino carboxílico Di(Boc)-protegido a la muestra. Se consiguió el acoplamiento utilizando 3 equivalentes (0,025 mmol) del ácido carboxílico con activación DIC/HOBt en CH_{2}Cl_{2}/dimetilformamida (1 ml/1 gota). Después de 5 horas, con agitación ocasional, las pruebas de ninhidrina indicaron que el acoplamiento era completo.

Después de lavar con dimetilformamida (2x2 ml) y CH_{2}Cl_{2} (4x2 ml), el compuesto se desprotegió del soporte sólido, siendo la resina pre-hinchada en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) antes del tratamiento con TFA-H_{2}O (95: 5; 0,4 ml) durante 1,5 horas.

La muestra de resina se lavó con TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:1, 2 ml) y entonces el lavado se filtró en un vial. Se redujo el disolvente in vacuo y se disolvió el residuo en agua, congelada y liofilizada. Se analizó el compuesto por ES ME y dio como pico principal el ión molecular deseado.

M/Z: (ES^{+}) 448,4

Ejemplo 5 Protocolo para estudiar el daño Neuronal Hipóxico

Se estudió el daño neuronal hipóxico utilizando cultivos organotípicos de cortes del hipocampo [Pringle A. K. et al. (1996 Stroke 27 2124-2130)].

Se prepararon los cultivos según el método de Stoppini et al (1991 J. Neurosci. Meth. 37 173-182) a partir de crías de rata Wistar de 8-10 días de edad (Bioresources Unit, Bioresources University of Southampton). Se mantuvieron los cultivos in vitro durante 14 días (37ºC, 5% CO_{2}) durante los cuales se cambió el medio (50% de medio esencial mínimo (MEM), 25% de solución salina equilibrada de Hank (HBSS), 25% de suero de caballo inactivado por calentamiento, complementado con 1 mM de glutamina, 5 mg/ml de glucosa y 1,5% de fungizona) cada 3 días. Se indujo la hipoxia sustituyendo dicho medio de cultivo por un medio libre de suero (SF) (75% MEM, 25% HBSS, 1 mM de glutamina, 5 mg/ml de glucosa, 1,5% de fungizona) saturado con 95% N_{2}/5% CO_{2} (y así libre de oxígeno), y colocando los cultivos en una cámara hermética en la cual el ambiente también se saturó con N_{2}/CO_{2}. Después de 180 minutos de hipoxia, los cultivos se replaquearon en un medio SF normóxico y se volvieron a colocar en la incubadora durante 24 horas. Se agregaron los compuestos a los cultivos ya sea antes (pre), durante o después (post) de la hipoxia (abreviado aquí como "pdp") o justo en el período de recuperación posthipóxico ("post") [Johnson, T. D. (1996 Trends Pharmacol. Sci. 22-27)]. Se evaluó el daño celular utilizando el tinte de exclusión fluorescente yoduro de propidio (PI, 5 \mug/ml), que las células sanas no dejan entrar, pero que sí entran en células con membranas de plasma dañadas y se vuelven muy fluorescentes al unirse al ADN. Se cuantificó el daño en las células neuronales utilizando el software "NIH Image 1.55" (desarrollado por Wayne Rasband en el US National Institutes for Health y disponible en Internet mediante ftp anónimo en zippe.nimh.nih.gov). En resumen, se midió el área de las capas de células CA1, CA3 y de circunvolución dentada (DG) a partir de una imagen de transmisión. Después de 24 horas del inicio de la hipoxia, se captó una imagen fluorescente utilizando un microscopio estándar Leica de fluorescencia invertida con un juego de filtros de rodamina. Se determinó el área de fluorescencia PI antes de la preparación en las capas de células neuronales utilizando la función "density slice" del software Image. Se expresa el daño celular como el área porcentual de las capas de células corporales en la cual la fluorescencia PI es detectable. Después del procesamiento de imagen, se fijaron los cultivos durante la noche en paraformaldehído al 4% y se tiñieron con tionina.

Los datos se expresaron como la media\pmsem. Se reunieron los datos de los grupos no-medicamentos antes del análisis. Se determinó el significado estadístico utilizando el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido por pruebas de t-Student no pareadas post-hoc. Como únicamente las células dentro de la región CA1 fueron susceptibles al daño inducido por hipoxia, se calcularon todos los datos farmacológicos únicamente para esta región.

Protocolo para estudiar la neurotoxicidad mediada por el receptor a NMDA

Se prepararon y mantuvieron cultivos organotípicos de un corte del hipocampo como se describió antes. Se preparó NMDA como una solución reserva de 50 mM en agua destilada, y se diluyó como se requirió en el medio libre de suero. Se indujo neurotoxicidad al colocar los cultivos en medio libre de suero que contiene ya sea 10 \muM o 30 \muM NMDA durante 180 minutos. Después de este tiempo, se replaquearon los cultivos en medio libre de suero y se mantuvieron durante 24 horas en la incubadora. Se agregó ya sea 300 \muM L-ArgSp o el vehículo (medio libre de suero) al medio de cultivo, antes, durante y después de la exposición a NMDA. Durante toda la duración del experimento, se incluyeron en el medio 5 \mug/ml PI. Se determinó el daño neuronal después de 24 horas, a través de imaginería fluorescente PI y se cuantificó como se describió previamente.

Estudios de la circulación sanguínea

Se anestesiaron inicialmente a las ratas Wistar macho adultas (250-300 g) con 4% de halothane y se mantuvo posteriormente la anestesia con 1,5% de halothane mezclado con 7% N_{2}O en O_{2}. Se canalizó la arteria femoral para registrar de manera continua la presión de la sangre. También se canalizó la vena femoral para permitir la inyección del compuesto. Se dejaron 15-30 minutos para que los animales se estabilizaran y entonces se les inyectó 0,25-0,3 ml de una solución de 1 mg/ml de L-ArgSp. Después de la inyección del compuesto, se hizo un seguimiento de las ratas durante 60 minutos. Después de este período, se finalizó la anestesia y se dejó que las ratas se despertaran. En estos estudios, se tomaron medidas de la presión sanguínea arterial media (MABP) inducida después de una inyección intravenosa de 1 mg/kg L-ArgSp en la vena femoral de ratas Wistar macho anestesiadas. La MABP se calculó inmediatamente antes de la inyección de L-ArgSp (pre-inyección) y 30 segundos y 10 minutos después de la inyección (post-inyección). Se presentan los datos como media\pmsem de cuatro observaciones.

Isquemia global del prosencéfalo

Se anestesió a los animales como se describe arriba, y se insertó un termistor en el músculo temporal izquierdo para registrar la temperatura corporal. Se hizo una incisión en la piel media dorsal del cuello utilizando microcirugía, se identificaron las arterias vertebrales y ocluyeron utilizando un electrodo monopolar al nivel de C 1. Se cerró la incisión, y se permitió a los animales recuperarse de la anestesia y regresar a sus jaulas durante 24 horas. Después de esto, se reanestesió a los animales y se expusieron las arterias carótidas comunes (CCAs). Se dividieron en dos grupos a los animales. El grupo 1 recibió 0,25-0,3 ml de una solución 1 mg/ml de L-ArgSp (dosis final 1 mg/kg) mientras que el grupo 2 recibió de 0,25-0,3 ml o agua destilada estéril. Se prepararon las muestras independientemente y se seleccionó al azar antes de la inyección. Se inyectaron los animales 15 minutos antes de la oclusión de las CCAs con clips microvasculares durante 15 minutos. Después de esto, se cerró la piel, y se dejó a los animales recuperarse. Se sacrificaron los animales por anestesia y fueron perfundidos transcardialmente después de 24 horas con 1% de paraformaldehído y se extrajeron y procesaron los cerebros para histología. Un observador "ciego" determinó el número de neuronas vivas y muertas en los campos CA1, CA3 de la capa celular piramidal, y la capa celular granular de circunvolución dentada a partir de secciones coronales teñidas de hematoxiloina y eosina.

Resultados (i) Procedimientos de control

Después de 14 días in vitro, los cultivos organotípicos del corte del hipocampo conservaron gran parte de la estructura y morfología del hipocampo in vivo. Específicamente, en las secciones teñidas con tionina eran visibles capas de células granulares piramidales (CA1 y CA3/4) y de circunvolución dentada claramente identificables. Las neuronas parecían sanas, con núcleos grandes y ligeramente teñidos rodeados por un citoplasma intensamente teñido (Figura 1).

En las 24 horas después de 3 horas de hipoxia, la fluorescencia PI era detectable en la región CA1 de la capa de células piramidales (35,6\pm1,43% daño, n= 108), con poco (pero no significativo estadísticamente) marcado PI tanto en las células piramidales CA3 (7,1\pm1,3%) como en las células granulares dentadas (3,9\pm2,9%). Se observó poca fluorescencia PI en los controles sin tratar mantenidos en un medio libre de suero durante 24 horas. Después del teñido con tionina, los cultivos de control eran indistinguibles de los cortes sin tratar, con neuronas que parecían grandes y sanas. En contraste, en los cultivos expuestos a 180 minutos de hipoxia las células piramidales CA3 y las células granulares dentadas parecían normales, pero las células CA1 tenían núcleos picnóticos pequeños, teñidos con un color oscuro, con el citoplasma poco visible indicando muerte neuronal - como se muestra en la Figura 1. La Figura 1 muestra imágenes de fluorescencia PI de cultivos de control sin tratar (A) o de cultivos 24 horas después de 3 horas de hipoxia (B). No se detecta fluorescencia PI en los cultivos sin tratar, pero está presente un intenso teñido en la capa de células piramidales CA1 del cultivo tratado con hipoxia. (C+D) Secciones teñidas con tionina correspondientes a la región CA1 de los cultivos que se muestran en A+B. (C) Las neuronas contienen un núcleo ligeramente teñido rodeado por un citoplasma teñido con un color oscuro (flecha blanca). (D) En contraste, las neuronas en los cultivos tratados con hipoxia aparecen como núcleos picnóticos pequeños, teñidos con un color oscuro (flecha negra). En esta Figura, las barras de escala son: A, B: 1 mm; C, D: 100 \mum.

(ii) Efectos de la L-Arginilespermidina (Compuesto A)

Después de incubación con 300 \muM L-ArgSp durante 24 horas, no se observó ningún incremento de fluorescencia PI tomando como base lo anterior. La agregación de 300 \muM L-ArgSp durante 30 minutos antes de la hipoxia, durante el episodio hipóxico y en el período de recuperación de 24 horas fue completamente neuroprotector. La fluorescencia PI era detectable en 0,2\pm0,02 de CA1 (n=12, p < 0.001 vs controles de hipoxia). En los cortes teñidos con tionina, las neuronas eran indistinguibles de las de los cultivos de control o sin tratar.

Cuando se retrasó la agregación de la L-ArgSp hasta el momento inmediatamente posterior a la hipoxia (post-hipoxia), se observó todavía un significativo efecto neuroprotector. Esto era dependiente de la concentración (0,3-300 \muM), estando el EC_{50} entre 3 y 30 \muM. Se redujo el daño observado en el subcampo CA1 en estos cultivos (ver Figura 1, Tabla1 - mostrada más abajo) demostrando que retrasar la agregación del compuesto no reducía significativamente la eficacia neuroprotectora.

TABLA 1

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
Hipoxia de Control	108	35,6\pm1,43
(A) L-ArgSp (300 \muM) pre	12	0,2\pm0,02***	99,4
(A) L-ArgSp (300 \muM)	16	9,9\pm3,5***	72, 2
(Z^{1}) D-ArgSp (300 \muM)	8	32,6\pm4,1	8,4
(B) L-LysSp (300 \muM)	16	27,0\pm3,7*	24,2
(Z^{2}) D-LysSp (300 \muM)	14	36,3\pm3,5	0
(C) L-OrnSp (300 \muM)	12	30,6\pm3,8	14,0
(Z^{3}) D-OrnSp (300 \muM)	11	36,71\pm3,2	0
L-Arg (300 \muM)	11	38,5\pm4,0	0
D-Arg (300 \muM)	10	32,7\pm7,0	8,1
Espermidina (300 \muM)	12	34,2\pm5,4	3,9

La Tabla 1 representa la cuantificación del área porcentual de la capa de células piramidales CA1 en la cual se detectaba fluorescencia PI 24 horas después de 3 horas de hipoxia (% Daño CA1). Se almacenaron los datos de cada uno de los cultivos expuestos a la hipoxia solos (hipoxia de control). El porcentaje de neuroprotección se calculó como el (((% daño en la hipoxia de control -% daño tratado con fármaco)/% daño en la hipoxia de control) *100). Los datos se expresan como media\pmsem, n = número de cultivos, *p < 0,05, ** < 0,01, ***p < 0,001 vs hipoxia de control.

Para determinar si tanto los componentes espermidina como arginina de la L-ArgSp eran esenciales para la generación del efecto neuroprotector, también evaluamos los efectos de la agregación post-hipoxia de 300 \muM espermidina y 300 \muM L-arginina.

Ni la espermidina ni la L-arginina produjeron individualmente una reducción en el daño (ver Tabla 1). Estos datos indican que es necesario tener un compuesto con la estructura definida más arriba - como por ejemplo un compuesto preparado conjugando L-arginina con espermidina - para la eficacia neuroprotectora. Este resultado contrasta con los descubrimientos de WO 91/00853 donde se reivindica que la espermidina bloquea directamente los conductos de calcio. Con nuestro presente trabajo, hemos mostrado que la espermidina purificada no tiene efectos neuroprotectores en nuestra prueba. A estas alturas, creemos que la diferencia es atribuible al hecho de que en WO 91/00853 no se intentó ninguna purificación con la espermidina y por eso sólo se puede presuponer que la espermidina utilizada era impura.

iii) Efecto de cambiar la cadena lateral del ácido carbamoílo

Cuando se sustituyó el residuo de arginina con los ácidos carbamoílo relacionados, lisina u ornitina, la eficacia neuroportectora de los compuestos resultantes era menor que con L-ArgSp. No obstante, todavía se observó eficacia neuropretectora. La agregación de 300 \muM L-lisinilespermidina (L-LysSp) inmediatamente después de la hipoxia (post- hipoxia) produjo una pequeña pero significativa reducción en la fluorescencia PI en la región CA1 (ver Tabla 1). La agregación post-hipóxica de 300 \muM L-ornitilespermidina (L-OrnSp) produjo menos de una reducción significativa en el daño.

iv) Estereoespecificidad del efecto neuroprotector

La sustitución de los ácidos L-carbamoílo con sus respectivos D-enantiómeros produjo una reducción profunda de la eficacia neuroprotectora de los compuestos en comparación con los L-enantiómeros, ya que la agregación de 300 \muM D-ArgSp, D-LysSp o D-OrnSp en la post-hipoxia no dio como resultado ninguna reducción observable de fluorescencia PI (ver Tabla 1). Además, las células del subcampo CA1 aparecieron con núcleos picnóticos reducidos, teñidos con un color oscuro, indicando muerte neuronal. Estos resultados demostraron claramente que hemos encontrado que la actividad óptica L es importante para la eficacia neuroprotectora. Por lo tanto, los compuestos más preferidos de la presente invención tienen actividad óptica L.

Además, y en contraste directo con las enseñanzas de WO 91/00853, encontramos que sustituir la lisina por arginina (compuesto A y B) reduce la acción neuroprotectora pero no la invierte.

v) Histograma

La Figura 2 presenta un histograma que demuestra la dependencia de la concentración del efecto neuroprotector de L-ArgSp (0,3-300 \muM) al agregarlo inmediatamente después de la hipoxia. El daño neuronal se expresa como el porcentaje del área de CA1 en el cual se ha medido fluorescencia PI 24 horas después de tres horas de hipoxia (%Daño CAT). (***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,5 vs hipoxia de control (control). n= 108 control. n= 14 0,3 \muM, n =7 3 \muM, n= 14 30 \muM, n= 16 300 \muM).

vi) L-ArgSp no impide el daño neuronal mediado por NMDA

24 horas después de 180 minutos de exposición a 10 \muM NMDA, se detectó fluorescencia PI en el subcampo CA1 de la capa celular piramidal, pero no en otras áreas de los cultivos. El aumento de la concentración de NMDA a 30\muM produjo una ofensa más severa, produciéndose un daño neuronal significativo tanto en la región CA1 como en la CA3 de la capa celular piramidal, pero moderada en las células granulares de la circunvolución dentada.

La agregación de 300\muM L-ArgSp al medio durante el experimento no redujo el daño producido por 10 \muM o 30 \muM NMDA. La Figura 3 muestra un histograma que demuestra la falta de eficacia neuroprotectora de L-ArgSp contra la neurotoxicidad mediada por NMDA al agregarse después de NMDA. El daño neuronal se expresa como el área porcentual de CA1 (barras sólidas) o CA3 (barras sombreadas) en la cual se midió fluorescencia PI 24 horas después de 180 minutos de exposición a NMDA (media\pmsem, n=8 para cada grupo).

vii) Estudios de la circulación sanguínea

Se presentan en la Tabla 2 los resultados de estos estudios:

TABLA 2

Tiempo	MABP (mmHg)	% Cambio
pre-inyección	79,9\pm3,9
30 segs	72,2\pm5,1	-9,6
10 minutos	79,2\pm6, 5	-0,9

Los registros que se hicieron de la presión sanguínea 60 minutos después de la inyección, inmediatamente antes de que se despertara a la rata, fueron idénticos a los que se tomaron 10 minutos después de la administración del fármaco. La pequeña reducción en la MABP producida por el L-ArgSp no fue estadísticamente significativa. No se produjo ningún efecto ni en la temperatura corporal ni en el ritmo cardíaco de estos animales después de la administración de L-ArgSp. Al despertarse, no se observaron efectos adversos del compuesto en los animales. Se ha dejado a cinco ratas que se recuperaran durante tres días después de la administración de 1 mg/kg L-ArgSp y no se han observado déficits de conducta a largo término en estos animales

viii) L-ArgSp reduce el daño neuronal que sigue a la isquemia global del prosencéfalo in vivo

Quince minutos de isquemia global del prosencéfalo es una ofensa particularmente severa, produciendo daño neuronal por toda la formación hipocampal. Cuando se evaluó 24 horas después de la isquemia, los animales que recibieron el vehículo únicamente mostraron una pérdida neuronal en CA1, CA3 y la circunvolución dentada con severidad siendo regionalmente dependiente (CA1 > CA3 > DG). En animales tratados con 1 mg/kg L-ArgSp 15 minutos antes de la inducción de isquemia, se disminuyó significativamente la pérdida neuronal, particularmente en la región CA1 extremadamente vulnerable. Estos datos se describieron en la figura 4 que representa un histograma que demuestra el porcentaje de neuronas vivas (como se determinó histológicamente) (%Neuronas vivas) en CA1, CA3 y la circunvolución dentada (DG) de ambos tratados con el vehículo (bandas sólidas) y animales tratados con L-ArgSp (bandas sombreadas).

(**P < 0,01, *P < 0,05 vs controles tratados con vehículo; los datos representan la media\pmsem, n=5 control, n=7 L-ArgSp).

Discusión del ejemplo

Utilizando técnicas de química de fase sólida hemos sintetizado, entre otras, arginilespermidina. Hemos mostrado que este compuesto, en particular el L-enantiómero, posee una significativa eficacia neuroprotectora, incluso si se retrasa la agregación del compuesto hasta que ha finalizado el episodio hipóxico.

Los datos demostraron que los compuestos de la presente invención deben contener los componentes primeros antes mencionados unidos a los componentes segundos antes mencionados vía dicho enlace amida como se conjugó la espermidina y L-Arg para tener eficacia neuroprotectora. En este aspecto, no se detectó eficacia utilizando espermidina y L-Arg solas. Por lo tanto, una conclusión a la que se podría llegar es que la acción del compuesto de la presente invención, en particular L-ArgSp, es mediada a través de un sitio receptor que requiere la presencia de tanto el primer como el segundo componente en la misma molécula.

La sustitución de L-arginina con L-lisina (L-LysSp) u ornitina (L-OrnSp) produce aún compuestos activos. Sin embargo, las actividades de estos compuestos no son tan grandes como aquellas para la L-ArgSp. Esto sugiere que la funcionalidad guanidinio es deseable para la actividad óptima pero que otros grupos cargados positivamente pueden tomar su lugar con éxito relativamente.

Por lo tanto, se cree comúnmente que una característica altamente preferida para la actividad es la posición espacial relativa de la carga positiva terminal sobre el ion guanidinio o amonio y el grupo alfa-carbamoílo. Se sugiere esto por la longitud relativa de las cadenas laterales y su reducción en la longitud total yendo de Arg a Lys a Orn y sugiere que los compuestos son capaces de exhibir una capacidad de enlace bifuncional.

También, en una realización altamente preferida de la presente invención, parece que el sitio de enlace es estereoespecífico, requiriendo que el ácido carbamoílo esté en la configuración L para una actividad óptima. Tanto D-ArgSp como D-LysSp fueron inactivos en relación a sus correspondientes L-enantiómeros.

Los datos de flujo sanguíneo muestran que los compuestos de la presente invención, en particular el compuesto de fórmula A, tiene un efecto adverso menor en el flujo sanguíneo que FTX.

Ejemplo 6

Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 5, pero utilizando diferentes dosis de un lote fresco del Compuesto A (pdp). Se muestran los resultados en la Tabla 3.

TABLA 3

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
Ninguno (Control de Hipoxia)	50	23,9\pm2,7
0.3 \muM Compuesto A pdp	8	20,2\pm8,4	15,5
1 \muM Compuesto A pdp	8	20,1\pm8,2	15,9
3 \muM Compuesto A pdp	15	6,5\pm3,0**	72,8

TABLA 3 (continuación)

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
l0 \muM Compuesto A pdp	7	8,8\pm3,9*	63,2
30 \muM Compuesto A pdp	8	7,3\pm4,2*	65,9
300 \muM Compuesto A pdp	16	8,0\pm3,0**	66,5
*p < 0,05, **p < 0,01

Ejemplo 7

Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 5, pero utilizando varios compuestos derivados del Compuesto A por sustitución del grupo \alpha-amino. Se muestran los resultados en la Tabla 4.

TABLA 4

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
Ninguno (Hipoxia)	25	27,5\pm3.2	-
300 \muM N\alphaCBZ-Compuesto A pre	11	9,3\pm4,3**	66,2
300 \muM N\alphaCBZ-Compuesto A post	12	12,4\pm4,3**	54,9
Ninguno (Hipoxia)	57	21,3\pm2,4	-
0.3 \muM N\alphaCBZ-Compuesto A post	8	16,6\pm7,2	22,1
3 \muM N\alphaCBZ-Compuesto A post	15	16,7\pm4,0	21,6
30 \muM N\alphaCBZ-Compuesto A post	14	14,8\pm4,5	30,5
300 \mum N\alphaCBZ-Compuesto A post	14	9,0\pm2,7*	57,7
Ninguno (Hipoxia)	33	20,3\pm2,4
300 \mum N\alphaacetilo-Compuesto A pre	15	10,4\pm4,0*	48
300 \mum N\alphaacetilo-Compuesto A post	20	16,3\pm3,1	18,5
Ninguno (Hipoxia)	49	26,8\pm4,1
300 \muM N\alphabencilo-Compuesto A post	8	6,4\pm4,9**	76,1
*p < 0,05, **p < 0,01
CBZ = benciloxicarbonilo

Ejemplo 8

Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 5, pero utilizando un compuesto (PyrAla3,4) en el cual la arginina del Compuesto A se sustituye por piridilalanina. Se muestran los resultados en la Tabla 5.

TABLA 5

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
Ninguno (Hipoxia)	40	28,4\pm2,3	-
300 \muM PyrAla3,4 post	7	29,9\pm3,7	-5,3

Se puede ver que este compuesto tiene un efecto protector negativo.

Ejemplo 9

Se repitieron los procedimiento del Ejemplo 5, pero utilizando o un Compuesto I (en el cual la arginina del Compuesto A se sustituye por citrulina) o un compuesto en el cual la arginina del Compuesto A se sustituye por glutamina (Gln3,4). Se muestran los resultados en la Tabla 6.

TABLA 6

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
Ninguno (Hipoxia)	16	23,2\pm4,9
300 \muM Compuesto I post	7	10,9\pm5,7*	53
300 \muM Gln3,4 post	8	19,8\pm6,5	14,7
* p < 0,05,

Se puede ver que, mientras que el Compuesto I ejerce un significativo efecto protector, la Gln3,4 no tiene tal efecto.

Ejemplo 10

Se repitieron los procedimientos del Ejemplo 5, pero utilizando o un Compuesto A o un compuesto relacionado al Compuesto A pero que en el cual R^{c} es un grupo tetrametileno, i.e. el número total de átomos de carbono en R^{b} y R^{c} es 8 (Arg4,4). Se muestran los resultados en la Tabla 7.

TABLA 7

Compuesto	n	% Daño CA1	% Protección
Ninguno (Hipoxia)	15	27,7\pm3,1
300 \muM Compuesto A post	8	12,1\pm3,5**	56,3
300 \muM Arg4,4 post	7	26,7\pm2,1	3,6
** p < 0,01

Se puede ver que, mientras que el Compuesto A ejerce un significativo efecto protector, la Arg4,4 no tiene tal efecto.

Conclusión de los ejemplos

En resumen, se sintetizaron varios compuestos basados en espermidina (poliamina) utilizando un nuevo enfoque de fase sólida y se evaluaron por sus efectos protectores contra el daño neuronal por hipoxia inducida en cultivos de corte del hipocampo. Los efectos neuroprotectores de la 300 \muM L-arginilespermidina fueron espectaculares, observándose una protección completa cuando se agregó antes de la hipoxia. Cuando se agregó después de la hipoxia, se observó que la protección dependía de la concentración, con una protección sustancial (>70%) a 300 \muM con un EC 50 de entre 3-30 \muM. La L-lisinilespermidina y la L-ornitilespermidina también eran protectoras, aunque en una menor extensión que la arginilespermidina. Significativamente, los D-enantiómeros de los tres compuestos eran sustancialmente menos activos (de serlo) que los L-enantiómeros en proporcionar actividad neuroprotectora.

La fusión de química de fase sólida/combinatoria y de modelos in vitro de daños neuronales (p.ej. daños relacionados con la isquemia) proporciona un excelente medio para sintetizar e investigar gran cantidad de compuestos potencialmente neuroprotectores.

Este enfoque presenta la posibilidad de generar compuestos que pueden influir profundamente en el tratamiento de daños neurológicos severos como por ejemplo los ocurridos después de un derrame cerebral.

Claims (17)

1. Un compuesto sustancialmente puro con fórmula general (I)

(I)Q--R^{a}--

\delm{C}{\delm{\para}{NR ^{2} R ^{3} }}

*H--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--Z_{n}--

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

--R^{b}--NH-R^{c}--NH--W

donde:

Q representa un grupo amidino, un grupo ciano o un grupo de fórmula XYN-, donde

X e Y son iguales o diferentes, y cada uno de ellos puede representar un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, o un grupo que contiene un heteroátomo simple o, junto con el átomo de nitrógeno con el cual están enlazados, forman un grupo heterocíclico que contiene nitrógeno;

R^{a} representa una cadena lineal o ramificada de alquileno o un grupo alquenileno que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono y siendo cada uno opcionalmente sustituido por entre 1 y 4 grupos alquilo, teniendo cada uno entre 1 y 3 átomos de carbono;

R^{b} y R^{c} representa cada uno un grupo alquileno o alquenileno que tiene 3 o 4 átomos de carbono en una cadena lineal, siendo cada uno opcionalmente sustituido por 1 o 2 grupos alquilo, teniendo cada uno entre 1 y 3 átomos de carbono, siendo 7 el número total de átomos de carbono en dichas cadenas lineales de R^{b} y R^{c};

R^{2} y R^{3} son iguales o diferentes entre ellos y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula R, RCO-, ROCO-, or RNHCO-, donde

R representa un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo arilo, siendo dicho grupo alquilo o arilo opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes \alpha, definidos más abajo;

el átomo de carbono quiral indicado por el asterisco está en la configuración L;

Z es un residuo de aminoácido aromático:

n es 0 ó 1:

R^{1} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo arilo, siendo dicho grupo alquilo o arilo opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes \alpha, definidos debajo;

W representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo o arilo; y

los sustituyente \alpha se eligen entre: átomos halógenos, grupos amino, grupos alquilamino, grupos dialquilamino, grupos ciano, grupos hidroxi, grupos alquilo (excepto cuando el grupo sustituido es alquilo), grupos arilo, grupos carbamoílo, grupos alquilcarbamoílo, grupos dialquilcarbamoílo y grupos carboxi y ésteres de los mismos.

y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

2. Compuestos según la Reivindicación 1, con fórmula (Ia):

(Ia)Q--R^{a}--

\delm{C}{\delm{\para}{NR ^{2} R ^{3} }}

*H--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--Z_{n}--

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

--R^{b}--NH--R^{c}--NH_{2}

donde Q, R^{a} R^{b}, R^{c}, R^{2}, R^{3}, Z, n, y R^{1} son como en la Reivindación 1.

3. Compuestos según la Reivindicación 1, con fórmula (Ib):

(Ib)X--

\delm{N}{\delm{\para}{Y}}

--(

\melm{\delm{\para}{R ^{5} }}{C}{\uelm{\para}{R ^{4} }}

)_{x}--

\delm{C}{\delm{\para}{NR ^{2} R ^{3} }}

*H--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--Z_{n}--

\delm{N}{\delm{\para}{R ^{1} }}

-- (

\melm{\delm{\para}{R ^{7} }}{C}{\uelm{\para}{R ^{6} }}

)_{y}--NH—R^{c}--NH_{2}

donde:

X, Y, Z, n y R^{1} son como se definen en la Reivindicación 1;

x es un entero entre 1 y 5;

y es 3 ó 4;

R^{4}, R^{5}, R^{6} y R^{7} pueden ser iguales o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y

el átomo de carbono quiral indicado por el asterisco está en la configuración L;

4. Compuestos según cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en las cuales Z representa un residuo de aminoácido aromático en la configuración L.

5. Compuestos no tóxicos de fórmula (I) como se definen en la Reivindicación 1.

6. Compuestos no tóxicos de fórmula (Ia) como se definen en la Reivindicación 3.

7. Compuestos no tóxicos de fórmula (Ib) como se definen en la Reivindicación 4.

8. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

11

9. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

12

10. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

13

\newpage

11. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

14

12. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

15

13. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

16

14. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

17

\newpage

15. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

18

16. Un compuesto según la Reivindicación 1, el cual es:

19

17. El uso de un compuesto según cualquiera de las Reivindicaciones anteriores para la fabricación de un medicamento para tratar a un mamífero para proteger a dicho mamífero de un daño neuronal causado por un evento isquémico.