ES2202409T3

ES2202409T3 - Preparacion de polieter con contenido en acido carboxilico y sustancias biologicamente activas derivadas.

Info

Publication number: ES2202409T3
Application number: ES96202288T
Authority: ES
Inventors: Anthony J. Martinez; Richard B. Greenwald
Original assignee: Enzon Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-05-15
Filing date: 1996-08-14
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-08-14
Also published as: DK0824126T4; DE69628827T3; DK0824126T3; CA2183292A1; ATE243723T1; EP0824126B2; DE69628827D1; DE69628827T2; US5605976A; EP0824126A1; EP0824126B1; US5681567A; CA2183292C

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS PARA PREPARAR ACIDOS CARBOXILICOS DE OXIDO DE POLIALQUILENO DE ELEVADA PUREZA. LOS METODOS INCLUYEN HACER REACCIONAR UN OXIDO DE POLIALQUILENO TAL COMO UN POLIETILENGLICOL CON UN HALOACETATO DE T TILO EN PRESENCIA DE UNA BASE, SEGUIDO DE TRATAMIENTO CON UN ACIDO TAL COMO ACIDO TRIFLUOROACETICO. LOS ACIDOS CARBOXILICOS DEL POLIMERO RESULTANTES POSEEN UNA PUREZA SUFICIENTE DE MODO QUE SE EVITAN LAS ETAPAS DE PURIFICACION CARAS Y LARGAS REQUERIDAS PARA LA OBTENCION DE POLIMEROS DE GRADO FARMACEUTICO.

Description

Preparación de poliéter con contenido en ácido carboxílico y sustancias biológicamente activas derivadas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la preparación de óxidos de polialquileno activados. En particular, la invención se refiere a métodos para la preparación de ácidos carboxílicos de óxidos de polialquileno de alta pureza.

Antecedentes de la invención

La conjugación de óxidos de polialquileno hidrosolubles con fragmentos terapéuticos como proteínas y polipéptidos es conocida. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense número 4,179,337, la descripción de la cual está incorporada en la presente por referencia. La patente '337 expone que los polipéptidos fisiológicamente activos modificados con PEG que circulan durante extensos períodos in vivo, tienen una inmunogenicidad y antigenicidad reducidas.

Con el fin de conjugar los óxidos de polialquileno, los grupos terminales de hidróxilo del polímero deben en primer lugar ser convertidos en grupos funcionales reactivos. Frecuentemente este proceso es referido como "activación" y el producto se llama "óxido de polialquileno activado".

En su mayoría, la investigación se ha dirigido al enlace covalente de óxidos de polialquileno (PAO) a grupos epsilon amino de proteínas, enzimas y polipéptidos. El enlace covalente de óxidos de polialquileno a grupos amino de la lisina ha sido realizado por grupos de enlace como éster de succinoil-N-hidroxisuccinimida, como describe Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175-86(1984), azlactonas, arilo imidatos y tiones de imida cíclica. Ver las patentes estadounidenses no. 5,298,643, 5,321,095, y 5,349,001, por ejemplo. El contenido de cada una de las patentes precedentes está incorporado en la presente por referencia. Los PAO también han sido activados con grupos hidracina para acoplar el polímero a grupos carbohidrato activados.

Además de lo anterior, también se ha informado sobre la conversión de grupos hidroxi terminales de PAO como PEG en ácidos carboxílicos. Los ácidos PEG son útiles en al menos dos casos. En primer lugar, los derivados del ácido carboxílico pueden ser utilizados directamente para conjugar los nucleófilos por medio de fragmentos de hidróxilo o amino disponibles. En segundo lugar, los ácidos carboxílicos de PAO pueden utilizarse como productos intermedios para formar otros tipos de polímeros activados. Por ejemplo, los ácidos carboxílicos de mPEG pueden convertirse en el derivado de éster de succinimidil mediante N-hidroxisuccinimida y un agente de condensación como carbodiimida de diisopropilo. Otros PAO activados pueden ser preparados por la reacción del éster activo con hidracina para producir derivados de PAO-hidracida.

La desventaja principal en la preparación del derivado de ácido carboxílico de óxidos de polialquileno ha sido la dificultad para obtener grandes cantidades de producto puro. Por ejemplo, la Journal of Controlled Release, 10(1989) 145-154 y el Polymer Bulletin 18, (1987), 487-493, describen la síntesis de ácidos de mPEG por conversión de mPEG-OH en un éster etílico y seguido por hidrólisis catalítica base para formar el ácido carboxílico. Aparentemente, este método clásico debería proceder sin dificultades. Sin embargo, en realidad, este método, en el mejor de Vos casos, proporciona ácidos de m-PEG de aproximadamente un 90% de pureza, el principal contaminante del producto siendo el material original, mPEG-OH. Además, la separación del ácido de PEG deseado del alcohol de PEG iniicial es muy difícil. Los métodos de laboratorio estándar como la cristalización fraccional o la cromatografía en columna no son eficaces. J. Polymer Sci. Polymer Chem. Ed, Vol. 22, 341-352 (1984). El intercambio iónico de columna o las técnicas de HPLC tediosos proporcionan una pureza de hasta un 95%, pero estas técnicas no son adecuadas para procesos a gran escala.

La preparación de un producto conjugado con PEG, a veces referido como un producto pegilado, usando los ácidos carboxílicos de PEG impuros da como resultado un producto final contaminado con mPEG. Para los péptidos y los conjugados orgánicos de peso molecular inferior, la extracción del contaminante es muy difícil debido a la ligera diferencia en peso molecular entre el contaminante, mPEG-OH y el conjugado de polímero deseado. Además, el uso de derivados del ácido carboxílico-polímero de pureza inferior necesariamente reduce la producción de los conjugados deseados al tiempo que aumentan los costes de fabricación debido a la necesidad de realizar las tediosas y costosas fases de separación.

Por consiguiente, existe la necesidad de un método mejorado para la preparación de ácidos carboxílicos de óxidos de polialquileno de alta pureza. La presente invención aborda esta necesidad.

Resumen de la invención

En un aspecto, la presente invención incluye los métodos para la preparación de ácidos carboxílicos de óxidos de polialquileno. Los métodos incluyen la reacción de un óxido de polialquileno con un haloacetato de alquilo terciario en presencia de una base para formar un éster alquílico terciario intermedio de ácido carboxilico de óxido de polialquileno y después la reacción del éster alquílico terciario intermedio con un ácido como ácido trifluoroacético para formar un ácido carboxílico de óxido de polialquileno. Este método ventajosamente proporciona un material con rendimiento y pureza elevados.

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Dentro de este aspecto de la invención, los óxidos de polialquileno preferidos incluyen polietilenglicol y omega-metoxi-polietilenglicol. Los haloacetatos de alquilos terciarios preferidos comprenden t-butil bromo- o cloro-acetato así como otros ésteres de alcohol terciarios del ácido haloacético. Las bases preferidas usadas en el método incluyen, por ejemplo, t-butóxido de potasio, litio de butilo, y similares. Los métodos pueden realizarse usando t-butóxidos metálicos en un alcohol como t-butanol o en otros disolventes inertes como tolueno.

Los métodos de la presente invención pueden realizarse usando una proporción aproximadamente equimolar de haloacetato de alquilo terciario por óxido de polialquileno. No obstante, se prefiere que el haloacetato de alquilo terciario esté presente en una cantidad superior al óxido de polialquileno en una base molar.

En otros aspectos de la invención, están previstos métodos para la preparación de óxidos de polialquileno alfa y/o omega sustituidos de alta pureza como mono o bis-PEG-aminas, PEG-amidas y PEG-ésteres que incluyen ésteres de succinimidilo, metilo y etilo. Estos aspectos incluyen la conversión de los ácidos carboxílicos de óxidos de polialquilenos descritos anteriormente en el polímero terminalmente sustituido deseado. En un aspecto adicional de la invención, se exponen los métodos para la preparación de óxido de polialquileno - conjugados nucleófilos biológicamente activos. En este aspecto de la invención, los ácidos carboxílicos de óxido de polialquileno son reaccionados con un nucleófilo biológicamente activo de modo que se forma un enlace de éster entre el polímero y el nucleófilo biológicamente activo. Por ejemplo, en este aspecto de la invención puede prepararse taxol-2'PEG-monoésteres y 20-camptotecina PEG-ésteres.

Una de las ventajas principales de la presente invención es que los ácidos carboxílicos de óxido de polialquileno resultantes son preparados en alta pureza. Por consiguiente, los contaminantes del producto, es decir, los materiales de partida, como m-PEG-OH no se encuentran en cantidades apreciables, es decir, se encuentran en cantidades inferiores al 8% y preferiblemente inferiores al 1% e idealmente inferiores al 0.5%. Como resultado, no se requiere la separación del ácido carboxílico deseado del alcohol de partida. Además, no se requiere el intercambio iónico o en columna o las técnicas de HPLC para proporcionar el ácido carboxílico deseado.

Descripción detallada de la invención 1. Sustituyentes políméricos y óxidos de polialquileno

Los derivados del ácido carboxílico de la presente invención se preparan preferiblemente de óxidos de poli(alquileno) (PAO) como polietilenglicol que son hidrosolubles a temperatura ambiente. Dentro de este grupo se encuentran los derivados del óxido de polialquileno omega sustituido como metoxipoli (etilenoglicoles) (mPEG-OH). Otros derivados de PAO alquil-sustituidos adecuados incluyen aquellos que contienen grupos monoterminales C_{1}-C_{4}. Se prefieren polímeros no antigénicos de cadena recta como monometil homopolímeros de PEG. También, son útiles óxidos de polialquileno alternativos como otros homopolímeros de poli(etilenoglicol), otros copolímeros de bloque de alquil-óxido de poli(etileno), y copolímeros de copolímeros de bloque de óxidos de poli(alquileno). Preferiblemente, los óxidos de polialquileno son hechos aceotrópicos antes de ser convertidos en ácido carboxílico.

Los polímeros de la presente invención tienen un peso molecular de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 100.000 daltons y preferiblemente entre aproximadamente 2.000 y aproximadamente 80.000 daltons. No obstante, los más preferidos son los pesos moleculares de entre aproximadamente 4.000 y aproximadamente 50.000 daltons.

El método de la presente invención puede realizarse también con sustancias poliméricas alternativas como dextranos u otros polímeros no inmunogénicos similares que son capaces de ser funcionalizados o activados como mono- o bis- ácidos carboxílicos. El precedente es meramente ilustrativo y está destinado a restringir el tipo de polímeros no antigénicos adecuados para el uso en la presente.

2. Síntesis de los derivados del ácido carboxílico

Los métodos de la presente invención para la preparación de un ácido carboxílico de óxido de polialquileno incluyen:

i): reacción de un óxido de polialquileno con un haloacetato de alquilo terciario como haloacetato de t-butilo en presencia de una base para formar un éster de t-butilo de ácido carboxílico de óxido de polialquileno; y

ii): reacción del éster de t-butilo con un ácido para formar el ácido carboxílico de óxido de polialquileno.

Un aspecto importante del método de la presente invención es que los óxidos de polialquileno pueden ser fácilmente convertidos en ácidos carboxílicos alfa y/o omega mediante un éster de un producto intermedio de terc-butilo con niveles de pureza del producto extremadamente elevados. Los óxidos de polialquileno de varios pesos moleculares, como los expuestos anteriormente en la sección 1, pueden convertirse en sus respectivos aniones con base fuerte y posteriormente ser reaccionados con haloacetatos de terc-butilo disponibles comercialmente, como bromoacetato de t-butilo, para proporcionar el éster de terc-butilo en alta producción. Entonces, este producto intermedio puede ser convertido rápidamente en producciones elevadas en el ácido carboxílico análogo mediante el uso de un ácido como ácido trifluoroacético. El método se realiza a temperaturas de aproximadamente 0 a aproximadamente 50°C. Dentro de este aspecto de la invención, se prefieren las temperaturas de aproximadamente 10 a aproximadamente 40° y se prefieren especialmente las temperaturas de aproximadamente 20 a aproximadamente 30°.

Los haloacetatos de alquilo terciario son de la fórmula:

XCH_{2} ---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- O ---

\melm{\delm{\para}{R _{3} }}{C}{\uelm{\para}{R _{1} }}

--- R_{2}

donde

X es cloro, bromo o yodo;

R_{1-3} son independientemente seleccionados de alquilos C_{1-8}, alquilos sustituidos o alquilos ramificados, aritos como fenilo o fenilos sustituidos.

Los haloacetatos de t-butilo preferidos incluyen bromoacetato de t-butilo cloroacetato de t-butilo y yodoacetato de t-butilo. Estos haloacetatos de t-butilo están disponibles, por ejemplo, de Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo. De forma alternativa, pueden usarse ésteres de arilo sustituidos o tritilo.

La primera fase de la preparación de los ácidos carboxílicos de óxido de polialquileno de la presente invención incluye la formación de un producto intermedio, éster de t-butilo de ácido carboxílico de óxido de polialquileno. Este producto intermedio se forma por la reacción de un óxido de polialquileno con un haloacetato de t-butilo en el modo descrito anteriormente en presencia de una base. La base preferida es t-butóxido de potasio, aunque también pueden utilizarse alternativas como litio de butilo, amida de sodio o hidruro de sodio. Alternativas adicionales incluyen etóxido de sodio y otras bases fuertes. Estas bases pueden utilizarse en los métodos descritos en la presente como un sólido, o más preferiblemente, disueltas en un solvente adecuado como t-butanol, benceno, tolueno, tetrahidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), hexano y similares.

Con el objetivo de formar el producto intermedio, el óxido de polialquileno es hecho reaccionar con el haloacetato de t-butilo en una cantidad que es una proporción aproximadamente equimolar (1:1). Preferiblemente, no obstante, el haloacetato de t-butilo está presente en un exceso molar de modo que se consiga la conversión completa del óxido de polialquileno. Por tanto, es preferible que la proporción molar de haloacetato de t-butilo para óxido de polialquileno sea superior a 1:1

Una vez se ha formado el producto intermedio de éster de t-butilo, el derivado de ácido carboxílico del óxido de polialquileno puede ser fácilmente proporcionado en paridades que exceden un 92%, preferiblemente que exceden un 97%, más preferiblemente que exceden un 99% e idealmente que exceden un 99.5% de pureza. De este modo, los contaminantes, en particular con respecto al material de partida, por ejemplo, mPEG-OH, sólo son encontrados en cantidades de trazas. En los aspectos preferidos de la invención, donde ácidos carboxílicos de mono- o bis-polietilenoglicol son preparados, la cantidad de contaminante del material de partida encontrada en el producto final es inferior al 8%, preferiblemente inferior al 3%, más preferiblemente inferior al 1%, y aún más preferiblemente en cantidades inferiores al 0.5% en peso.

En este aspecto de la invención, el producto intermedio de éster de t-butilo es hecho reaccionar con al menos una cantidad equivalente de un ácido como ácido trifluoroacético opcionalmente en presencia de una cantidad pequeña de agua con el objetivo de proporcionar el ácido carboxílico terminalmente sustituido del PAO. De forma alternativa, puede usarse ácido clorhídrico diluido, es decir, aproximadamente 1 N de ácido fosfórico sulfúrico, etc.. La cantidad en exceso permite al experto convertir el producto intermedio de éster de t-butilo en el derivado del ácido carboxílico deseado y contrarrestar la capacidad de tampón del PEG o el material de polímero de partida relacionado. Además, es preferible convertir el producto intermedio en el derivado del ácido carboxílico final en presencia de 3 a 5 veces de exceso molar de agua basado en el peso del producto intermedio de éster de t-butilo y realizar la reacción en un solvente inerte como cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo, etc.

El derivado de mono- o bis- ácido carboxílico deseado se obtiene después de permitir un tiempo suficiente para garantizar la conversión del producto intermedio en el derivado de ácido final, que puede ser de aproximadamente 3 horas. No obstante, el tiempo de reacción variará en cierto modo dependiendo de los reactivos particulares y de las condiciones de reacción. Además, la reacción que transforma el producto intermedio de t-butilo en el ácido carboxílico deseado puede realizarse a temperatura ambiente, es decir, 20-30°C, aunque pueden utilizarse temperaturas de aproximadamente 0 a aproximadamente 50°C. Después de la conversión del producto intermedio en el ácido carboxílico final deseado, el solvente, es decir, cloruro de metileno, por ejemplo, es eliminado por destilación mediante técnicas conocidas para los expertos en la materia, como evaporación giratoria o similar. El residuo resultante es recristalizado de cloruro de metileno/éter etílico, tolueno/éter etílico o tolueno/hexano para producir el producto final.

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Tras la finalización del nuevo método, no se requiere la purificación adicional por los métodos convencionales, ya que los métodos descritos en la presente proporcionan el ácido carboxílico deseado en una pureza muy elevada, preferiblemente superior al 99%, proporcionando de este modo al experto un significante ahorro en cuanto al tiempo, trabajo y materiales cuando se desea un polímero de calidad farmacéutica.

3. Fragmentos terminales alfa y/o omega adicionales

Como aspecto adicional de la invención, los derivados del mono- o bis-ácido carboxílico pueden usarse para formar otros óxidos de polialquileno activados. Por ejemplo, el/los grupo(s) del ácido carboxílico terminal pueden convertirse en:

I. Grupos funcionales capaces de reaccionar con un grupo amino como:

a): éster de succinimidil;

b): imidazola de carbonilo;

c): azlactonas;

d): tiones de imida cíclica;

e): isocianatos o isotiocianatos; o

f): aldehidos

II. Grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos del ácido carboxílico y grupos carbonilo reactivos como:

a): aminas primarias; o

b): grupos funcionales de hidracina e hidracida como las hidracidas de ácilo, carbazatos, semicarbazatos, tiocarbazatos, etc.; o

c): alcoholes, como los derivados de ésteres etílicos.

El grupo de activación terminal puede también incluir un fragmento separador localizado cerca del óxido de polialquileno. El fragmento separador puede ser un heteroalquilo, alcoxi, alquilo con contenido en hasta 18 átomos de carbono o incluso una cadena de polímeros adicional. Los fragmentos separadores pueden añadirse usando técnicas de síntesis estándares.

4. Conversión de los derivados de ácido carboxílico

Los derivados poliméricos del ácido carboxílico también sirven como productos intermedios de alta pureza que pueden usarse para formar derivados adicionales de óxido de polialquileno. Por ejemplo, los derivados de ácido carboxílico-PEG alfa y/o omega pueden ser convertidos en sus respectivos derivados de aminos-PEG por conversión del ácido carboxílico-PEG en un producto intermedio de cloruro ácido antes de formar la amina por degradación de Hoffman. De forma similar, las amidas de alta pureza, hidracidas, otros ésteres y similares pueden formarse a partir del éster de N-hidroxisuccinimida activado por el ácido carboxílico de PAO por condensación con el reactivo apropiado (amidas, hidracinas, etc.) mediante técnicas estándares.

De forma alternativa, el derivado del ácido carboxílico puede ser convertido en un éster de succinimidilo mediante reacción del ácido carboxílico con carbodiiimida de diciclohexilo (DCC) o carbodiimida de diisopropilo en presencia de una base.

Estas reacciones de conversión posteriores son técnicas esencialmente estándares bien conocidas para los expertos en la técnica. Un aspecto importante de esta característica de la invención es el hecho de que el producto intermedio, por ejemplo, el ácido carboxílico-PEG es esencialmente puro (99+%) y por tanto le asegura al experto un producto final esencialmente puro.

5. Materiales biológicamente activos adecuados para la conjugación

Los nucleófilos conjugados con los derivados del ácido carboxílico son descritos como "biológicamente activos". No obstante, el término no se limita a actividades fisiológicas o farmacológicas. Por ejemplo, algunos conjugados de nucleófilos como los que contienen enzimas, son capaces de catalizar reacciones en disolventes orgánicos. Asimismo, algunos conjugados de polímeros de la invención también son útiles como diagnósticos de laboratorios. Una característica clave de todos los conjugados es que se mantiene al menos alguna parte de la actividad relacionada con el material biológicamente activo no modificado.

Según la presente invención, el nucleófilo, que tiene un fragmento de hidróxilo disponible capaz de someterse a sustitución sin perder la bioactividad, es hecho reaccionar con el derivado del ácido carboxílico del polímero, como PEG-COOH, bajo las condiciones suficientes para causar la formación de un enlace de éster entre los dos sustituyentes. Como ejemplos ilustrativos, a continuación se muestran los conjugados de taxol y taxotere:

1

\hskip5cm

Protaxol: R_{1} = C_{6}H_{5};

R_{2} = CH_{3}CO

\hskip5cm

Protaxotere: R_{1} = (CH_{3})_{3}CO;

R_{2} = H

El diéster correspondiente puede ser preparado mediante reacción de al menos aproximadamente 2 equivalentes del material bioactivo deseado por equivalente de diácido de PAD. Los detalles que conciernen a la formación de estos conjugados se encuentran en los Ejemplos. Sin embargo, con el fin de ilustrar, las condiciones que generalmente son aceptadas como suficientes para permitir formar el enlace de éster entre los agentes no proteínicos o no peptídicos y el polímero, inducen la disolución del polímero y fragmento objetivo en el sistema de solvente adecuado, es decir, cloruro de metileno a aproximadamente temperatura ambiente, añadiendo un agente activador de ácido como DCC o carbodiimida de diisopropilo y una base como piridina. Por otra parte, usualmente se requerirán los sistemas acuosos para fragmentos objetivos capaces de ser desnaturalizados por sistemas orgánicos.

En otro aspecto de la invención, cuando el ácido carboxílico ha sido convertido en un grupo funcional terminal alternativo, como éster de succinimidil, la conjugación del polímero activado con el nucleófilo deseado se consigue mediante reacción del polímero con un nucleófilo biológicamente activo que contiene un grupo amino disponible. Ver también, por ejemplo, la patente estadounidense número 5,122,614, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia. De forma similar, cuando se usan otros grupos de enlace como los mencionados anteriormente en la Sección 3, los conjugados de PAO pueden ser preparados mediante reacción del polímero activado deseado con un material biológicamente activo que contiene un grupo de enlace objetivo deseado, es decir, NH_{2}, COOH, etc. Debe entenderse que las condiciones usadas para completar estas reacciones de conjugación son seleccionadas para mantener la actividad biológica óptima del conjugado.

Los conjugados son biológicamente activos y tienen numerosas aplicaciones terapéuticas. Los mamíferos que necesitan un tratamiento que incluye un material biológicamente activo pueden ser tratados mediante la administración de una cantidad eficaz de un conjugado de polímero que contiene el material bioactivo deseado. Por ejemplo, a los mamíferos que necesitan la terapia de sustitución enzimática o factores sanguíneos se les pueden dar conjugados poliméricos que conitienen el material deseado. Las dosis de dichos conjugados son cantidades suficientes para conseguir un resultado terapéutico deseado y será evidente para los expertos en experiencia clínica.

Los nucleófilos biológicamente activos de interés de la presente invención incluyen, pero no sin limitarse, proteínas, péptidos, polipéptidos, enzimas, moléculas orgánicas de origen natural y sintético como productos químicos medicinales y similares.

Las enzimas de interés incluyen las enzimas de carbohidrato específico, enzimas proteolíticas, oxidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Sin limitarse a enzimas particulares, ejemplos de enzimas de interés incluyen asparaginasa, arginasa, arginina deaminasa, adenosina deaminasa, superóxido dismutasa, endotoxinasas, catalasas, quimiotripsina, lipasas, uricasas, adenosina difosfatasa, tirosinasas y bilirrubina oxidasa. Las enzimas de carbohidrato específico de interés incluyen glucosa oxidasas, glucosidasas, galactosidasas, glucocerebrosidasas, glucouronidasas, etc.

Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés comprenden, pero sin limitarse, hemoglobina, proteínas de suero como factores sanguíneos incluyendo Factores VII, VIII y IX; inmunoglobulinas, citoquinas como interleuquinas, \alpha-, \beta-, y \gamma- interferones, factores de estimulación de colonias incluyendo los factores de estimulación de las colonias de granulocito, factores de crecimiento derivados de plaquetas y proteínas que activan la fosfolipasa (PLAP). Otras proteínas de interés general biológico o terapéutico incluyen insulina, proteínas de planta como lectinas y ricinos, factores de necrosis tumoral, factores de crecimiento, factores de crecimiento de tejido, factores de crecimiento TGF\alpha o TGF\beta y epidermial, hormonas, somatomedinas, eritropoietina, hormonas pigmentarias, factor de liberación hipotalámico, hormonas antidiuréticas, prolactina, gonadotropina coriónica, hormona foliculoestimulante, hormona tirotrópica, activador de plasminógeno tisular y similares. Las inmunoglobulinas de interés incluyen IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos derivados.

Algunas proteínas como las interleuquinas, interferones y los factores de estimulación de colonias también existen en forma no glicosilada, normalmente como resultado del uso de técnicas recombinantes. Las versiones no glicosiladas también se encuentran entre los nucleófilos biológicamente activos de la presente invención.

Los nucleófilos biológicamente activos de la presente invención también incluyen cualquier parte de un polipéptido que demuestra bioactividad in-vivo. Este incluye las secuencias de aminoácidos, fragmentos de antisentido y similares, fragmentos de anticuerpos, proteínas de enlace de antígenos de cadena simple, ver, por ejemplo la patente estadounidense número 4,946,778, la descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia, moléculas de enlace que incluyen fusiones de anticuerpos o fragmentos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos catalíticos, nucleótidos y oligonucleótidos.

Las proteínas o partes derivadas pueden ser preparadas o aisladas mediante técnicas conocidas para los expertos en la técnica como el cultivo de tejidos, la extracción de fuentes animales, o por metodologías de ADN recombinante. También se contemplan las fuentes transgénicas de las proteínas, polipéptidos, secuencias de aminoácidos y similares. Estos materiales se obtienen de animales transgénicos, es decir, ratones, cerdos, vacas, etc., donde las proteínas son expresadas en leche, sangre o tejidos. Los insectos insectos transgénicos y sistemas de expresión de baculovirus también se contemplan como fuentes. Además, las versiones mutantes de proteínas, como los TNF mutantes e interferones mutantes también se encuentran dentro del campo de la invención.

Otras proteínas de interés son proteínas alérgenas como artemisa, Antígeno E, veneno de abeja, alérgeno de ácaro y similares.

Los nucleófilos biológicamente activos útiles no se limitan a proteínas y péptidos. Esencialmente, cualquier compuesto biológicamente activo se incluye dentro del campo de la presente invención. Las moléculas quimioterapéuticas como productos químicos farmacéuticos, es decir, agentes antitumorales, agentes cardiovasculares, antirieoplásticos, agentes antiinfecciosos, agentes antiansiedad, agentes gastrointestinales, agentes de activación del sistema nervioso central, analgésicos, agentes de fertilidad o anticonceptivos, agentes antiinflamatorios, agentes esteroidales, agentes antiurecémicos, agentes cardiovasculares, agentes de vasodilatación, agentes de vasoconstricción y similares están incluidas. En los aspectos preferidos de la invención, el derivado del ácido carboxílico es hecho reaccionar bajo condiciones que permiten un enlace de éster entre el polímero y el fragmento quimioterapéutico. Los nucleófilos biológicamente activos preferidos comprenden en particular taxol, taxanas, taxotere, camptotecina, podofilotoxina, hemoglobina, glucocerebrosidasa, galactosidasa, arginasa, asparaginasa, arginina deaminasa y superóxido dismutasa.

Lo precedente es ilustrativo de los nucleófilos biológicamente activos adecuados para conjugar con los polímeros de la invención. Debe entenderse que los materiales biológicamente activos no mencionados específicamente pero que tienen grupos nucleofílicos adecuados también se incluyen y se encuentran dentro del campo de la presente invención.

6. Síntesis de los conjugados biológicamente activos

Uno o más de los ácidos poliméricos pueden unirse a un nucleófilo biológicamente activo mediante reacciones químicas estándares. El conjugado está representado por las fórmulas:

mPAO-O-CH_{2}-C(O)-(Y-nucleófilo)

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(nucleófilo-Y)-C(O)-CH_{2}-O-(PAO)-O-CH_{2}-C(O)-(Y-nucleófilo)

donde:

PAO es un óxido de polialquileno hidrosoluble

m es metilo; y

Y es N(L), O o S., donde L. es H, arilo o alquilo C_{1-12}.

El límite superior del PAO fijado al nucleófilo es determinado por el número de sitios de unión disponibles, es decir, los fragmentos de hidróxilo si se usa el ácido de PAO, y el grado de unión polimérico requerido por el experto. El grado de conjugación puede modificarse variando la estequiometría de la reacción mediante técnicas bien conocidas. Puede obtenerse más de un conjugado de polímero por reacción de un exceso estequiométrico del polímero activado con el nucleófilo.

Los nucleófilos biológicamente activos, como enzimas, proteínas y polipéptidos, pueden ser hechos reaccionar con los polímeros activados en un medio de reacción acuoso que puede ser tamponado, dependiendo de los requisitos del pH del nucleófilo. En general, el pH óptimo para la reacción se encuentra entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.0 y preferiblemente aproximadamente 7.4 para materiales proteínicos/polipeptídicos. Los fragmentos orgánicos/quimioterapéuticos son reaccionados en sistemas no acuosos. Las condiciones de reacción óptimas para la estabilidad de los nucleófilos, la eficiencia de la reacción, etc. se encuentra dentro del nivel del experto en la materia. La temperatura preferida se encuentra entre 4°C y 37°C. La temperatura del medio de reacción no debe exceder la temperatura en la que el nucleófilo puede desnaturalizarse o descomponerse. Se prefiere que el nucleófilo sea reaccionado con un exceso del polímero activado. Después de la reacción, el conjugado es recuperado y purificado como por diafiltración, cromatografía en columna o combinación, o similares.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran ciertos aspectos de la invención. Todas las partes y porcentajes están en peso a menos que se especifique de otro modo y todas las temperaturas están en grados Celsius.

Materiales

El metoxipoli(etilenoglicol) (m-PEG-OH) PM 5.000 daltons es obtenido de Union Carbide; PEG PM 20.000 y 40.000 daltons es obtenido de Serva, Inc. Los disolventes fueron obtenidos de Aldrich Chemical de Milwaukee, Wisconsin. Cada uno de los productos preparados en los Ejemplos 1-11 fueron confirmados estructuralmente por carbon^{13} NMR.

Ejemplo 1 Éster de t-butilo de ácido carboxílico de m-PEG (5.000)

Una solución de 75 gramos (0.015 moles) de m-PEG-OH en 750 ml de tolueno fue hecha azeotrópica con la extracción de 150 ml de destilado. La mezcla fue entonces enfriada a 30°C y, a continuación, se añadieron 25 ml (0.025 moles) de una solución molar de 1.0 de t-butóxido de potasio en t-butanol. La mezcla resultante fue agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación se añadieron 5.9 gramos (0.030 moles) de bromoacetato de t-butilo. La mezcla turbia resultante fue calentada a reflujo, seguido por la eliminación del calor y agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla reactiva fue filtrada a través de celita y el solvente fue eliminado por evaporación giratoria. El residuo se recristalizó de cloruro de metileno/éter etílico para producir 75.9 gramos (98% de producción). La pureza del producto nombrado fue determinada por ^{13}CNMR siendo superior a un 99%; mPEG-OH < 1.0%. Asignaciones de ^{13}CNMR: (CH_{3})_{3}C, 27.6 partes por millón; OCH_{3}, 58.3 partes por millón; (CH_{3})_{3}C, 80.6 partes por millón; C = O, 168.9 partes por millón.

Ejemplo 2 Ácido carboxílico de m-PEG (5.000)

Una solución de 10.0 gramos (2 mmoles) de éster de t-butilo del ácido carboxílico de m-PEG, 50 ml de ácido trifluoracético, y 0.1 ml de agua en 100 ml de cloruro de metileno fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. El solvente fue entonces eliminado por evaporación giratoria y seguidamente por recristalización del residuo de cloruro de metileno/éter etílico para producir 9.4 gramos (95% de producción) del producto. Se determinó que la pureza del producto deseado era superior a un 99%, mPEG-OH < 1.0%. Asignaciones de ^{13}CNMR: OCH_{3}, 58.3;
C = O, 170.7 partes por millón.

Ejemplo 3 Éster de t-butilo del ácido carboxílico de m-PEG (12.000)

Una solución de 50 gramos (4.2 mmoles) de m-PEG-OH (12.000) en 750 ml de tolueno fue hecha azeotrópica con la extracción de 150 ml de destilado. La mezcla reactiva fue entonces enfriada a 30°C, y a continuación se añadieron 6.3 ml (6.3 mmoles) de una solución molar 1.0 de t-butóxido de potasio en t-butanol. La mezcla resultante fue agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, y entonces se añadieron 2.3 gramos (12.0 mmoles) de t-butilbromoacetato. La mezcla turbia resultante fue calentada a reflujo, seguido por la eliminación del calor y agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla reactiva fue filtrada a través de celita y el solvente fue eliminado por evaporación giratoria. El residuo se recristalizó de cloruro de metileno/éter etílico para producir 41.2 gramos (82% de producción). La pureza del producto nombrado fue determinada por ^{13}CNMR, siendo superior a un 99%; mPEG-OH < 1.0%. Asignaciones ^{13}CNMR: (CH_{3})_{3}C, 27.5 partes por millón; OCH_{3}, 58.4 partes por millón; (CH_{3})_{3}C, 80.7 partes por millón; C = O, 169.0 partes por millón.

Ejemplo 4 Ácido carboxílico de m-PEG (12.000)

Una solución de 10.0 gramos (0.83 mmoles) de éster de t-butilo de ácido carboxílico de m-PEG (12.000), 50 ml de ácido trifluoroacético, y 0.1 ml de agua en 100 ml de cloruro de metileno fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. El solvente fue entonces eliminado por evaporación giratoria, seguido por la trituración en éter etílico para producir 9.75 gramos (98% de producción) del producto. La pureza del producto nombrado fue determinada por ^{13}CNMR, siendo superior a un 99%; mPEG-OH < 1.0%. Asignaciones de ^{13}CNMR: OCH_{3}, 58.3 partes por millón;
C = O, 170.6 partes por millón.

Ejemplos 5, 6 y 7

Siguiendo los procedimientos de los Ejemplos 3 y 4, también se prepararon ácidos de m-PEG PM = 2.000, 20.000 y 42.000. Se descubrió que los productos respectivos fueron un 99% puros y se recuperaron en producciones (de los alcoholes) de un 89% para el PM 2.000; un 52% para el PM 20.000; y un 76% para el PM 42.000.

Ejemplo 8 Éster de di-t-butilo del ácido di-carboxílico de PEG (40.000)

Una solución de 50 gramos (1.3 mmoles) de PEG-(OH)_{2} en 750 ml de tolueno fue hecha azeotrópica con la extracción de 150 ml de destilado. La mezcla reactiva fue enfriada a 30°C, y a continuación se añadieron 4 ml (4.0 mmoles) de una solución 1.0 molar de t-butóxido de potasio en t-butanol. La mezcla resultante fue agitada durante 1 hora a temperatura ambiente, y entonces se añadió 1.6 gramos (8.0 mmoles) de oft-butilbromoacetato. La mezcla turbia resultante fue calentada a reflujo, seguido de la eliminación del calor y agitación durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla reactiva fue filtrada a través de celita y el solvente fue eliminado por un evaporador giratorio. El residuo se recristalizó de cloruro de metileno/éter etílico para producir 45.2 gramos (86% de producción). Sin embargo, se descubrió que el producto nombrado era superior a un 99% puro, el material de partida estando presente en una cantidad inferior a un 1.0%. Asignaciones de ^{13}CNMR: (CH^{3})_{3}C, 27.7 partes por millón; (CH)_{3}C 3, 80.9 partes por millón; C = O, 169.1 partes por millón.

Ejemplo 9 Ácido di-carboxílico de PEG (40.000)

Una solución de 20.0 gramos (0.5 mmoles) de éster de t-butilo de ácido carboxílico de PEG (40.000), 100 ml de ácido trifluoroacético, y 0.1 ml de agua en 200 ml de cloruro de metileno fue agitada a temperatura ambiente durante 3 horas. El solvente fue entonces eliminado por evaporación giratoria, seguido de la recristalización del residuo de cloruro de metileno/éter etílico para producir 16.9 gramos (84% producción) del producto. Se confirmó que la pureza del producto nombrado era superior a un 99%. Asignaciones de ^{13}CNMR: C = O, 170.9 partes por millón.

Ejemplos 10 y 11

Siguiendo los procedimientos de los Ejemplos 8 y 9, también se prepararon di-ácidos de PEG de PM = 6.000 y 35.000. Se determinó que las producciones (de los alcoholes) fueron un 77% para el derivado de PM 6.000 y un 81% para el derivado de PM 35.000. En todos los casos, se determinó que la pureza del producto final era superior a un 99%.

Ejemplo 12-comparativo

En este ejemplo se prepararon muestras de mPEG-COOH (PM 5.000) usando el éster etílico en vez del derivado de t-butilo de la presente invención con el objetivo de demostrar las diferencias sustanciales en pureza proporcionadas por los método; de la presente invención. El porcentaje de la pureza fue determinado por ^{13}CNMR.

Ejemplo 12(a)

Éster etílico del ácido carboxílico de m-PEG (5.000)

Una solución de 10.0 g (2.0 mmoles) de m-PEG-OH en 150 ml de tolueno fue hecha azeotrápica con la extracción de 75 ml de destilado. La mezcla reactiva fue enfriada a 40°C, y a continuación se añadieron 0.6 g (5.0 mmoles) de

\hbox{t-butóxido}

de potasio. La mezcla resultante fue agitada durante 2 horas a 40°C, y luego se añadieron 3.3 g (20 mmoles) de bromoacetato de etilo. La solución resultante fue agitada durante 18 horas a 40°C, seguido de la filtración a través de celita y la extracción del solvente del filtrado por evaporación giratoria. El residuo se recristalizó de 2-propanol para producir 7.2 g (71 producción). Asignaciones de ^{13}CNMR: CH_{3}CH_{2}, 13.12 partes por millón; (CH)_{3}0, 57.83 partes por millón; CH_{3}CH_{2}, 59.47 partes por millón: C = O, 169.18 partes por millón. Impureza: m-PEG-CH_{2}OH, 60.20 partes por millón.

Ejemplo 12(b)

Ácido carboxílico de m-PEG (5.000)

Una solución de 3.0 g (0.6 mmoles) del éster etílico del ácido carboxílico de m-PEG (5.000) del Ejemplo 12(a) y 0.2 g (5.0 mmoles) de hidróxido sódico en 25 ml de agua fue agitada durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla reactiva fue entonces acidificada con ácido clorhídrico a pH 2.0, seguido de la extracción con cloruro de metileno. Los extractos combinados fueron secados sobre sulfato de sodio anhidrico y filtrados, seguido de la extracción del solvente del filtrado por evaporación giratoria. El residuo se recristalizó de 2-propanol para producir 2.4 g (80% de producción). Asignaciones de ^{13}CNMR: (CH)_{3}0, 57.91 partes por millón; C = O, 170.30 partes por millón. Impureza: m-PEG-CH_{2}OH, 60.50 partes por millón.

La cantidad media de impureza de m-PEG-OH encontrada usando las preparaciones estándares de literatura del ácido de m-PEG es de un 17%. En ocho procedimientos realizados usando las técnicas comparativas anteriores, la cantidad de impurezas variaba desde un 9% hasta un 31%. Estos resultados fueron entonces comparados con los resultados obtenidos del producto del Ejemplo 2 (mPEG-COOH) y se muestran a continuación:

Tabla comparativa
Método	%Pureza
Éster etílico (ocho preparaciones)	69-91
Éster de t-butilo (Ejemplo 2)	99+

Como puede observarse de lo precedente, se proporcionan ventajas sustanciales con la síntesis del derivado del ácido carboxílico usando el éster de t-butilo. Además, puede observarse que el ácido carboxílico de PEG derivado del éster etílico requiere purificación adicional antes de que pueda ser considerado adecuado para las reacciones de conjugación con los nucleófilos biológicamente activos.

Ejemplo 13 Preparación de éster de 20-camptotecina PEG 5.000

El ácido de mPEG 5.000 (400 Mg, 0.079 mmol) del Ejemplo 2 fue hecho azeotrópico con tolueno y entonces disuelto en 10 ml de cloruro de metileno anhídrico a temperatura ambiente y tratado con 1,3-diisopropilo carbodiimida (18.1 \mul, 0.119 mmol), 4-dimetiloamino piridina (14.5 mg, 0.119mmol) y (S)-(+)-camptotecina (41.32 mg, 0.119 mmol) a 0°C. La solución reactiva fue calentada a temperatura ambiente durante 30 minutos y mantenida a esa temperatura durante 16 horas. La solución reactiva fue entonces lavada con 0.1 N HCI, secada y evaporada para producir un sólido blanquecino que fue purificado por cromatografía (gel de sílice, MeOH/CH_{2}Cl_{2}). El material purificado se cristalizó de CH_{2}Cl_{2}/éter.

Ejemplo 14 A. Preparación de monoéster de taxol-2' PEG 5.000

El ácido de mPEG 5.000 (625 mg, 0.125 mmol) del Ejemplo 2 fue hecho azeotrópico y entonces disuelto en 20 ml de cloruro de metileno anhídrico a temperatura ambiente. La solución anterior fue tratada con 1,3-diisopropil-carbodiimida (26 \mul, 0.17mmol), 4-dimetiloaminopiridina (32 mg, 0.26mmol) y taxol (146 mg, 0.17 mmol) a 0°. La solución reactiva fue calentada a temperatura ambiente después de 30 minutos y mantenida a esa temperatura durante 16 horas. La mezcla reactiva fue entonces lavada con 0.1 n HCI, secada y evaporada para producir un sólido blanco que se cristalizó de 2-propanol para producir 585 mg (80% producción) del producto puro.

Aunque se han descrito las formas de realización de la invención actualmente preferidas, los expertos en la técnica se darán cuenta de que pueden realizarse cambios y modificaciones sin salirse del objetivo de la invención.

Claims

1. Método para la preparación de un ácido carboxílico de óxido de polialquileno, que comprende:

i): reacción de un óxido de polialquileno con un haloacetato de alquilo terciario en presencia de una base para formar un éster de alquilo terciario del ácido carboxílico de óxido de polialquileno; y

ii): reacción de dicho éster de alquilo terciario con un ácido para formar dicho ácido carboxílico de óxido de polialquileno.

2. Método según la reivindicación 1, donde dicho óxido de polialquileno es polietilenoglicol.

3. Método según la reivindicación 2, donde dicho polietilenoglicol es metoxipolietilenoglicol omega.

4. Método según la reivindicación 1, donde dicho haloacetato de alquilo terciario comprende la fórmula:

XCH_{2} ---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--— O ---

\melm{\delm{\para}{R _{3} }}{C}{\uelm{\para}{R _{1} }}

--- R_{2}

donde

X es cloro, bromo o yodo;

R_{1-3} son seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilos C_{1-8}, alquilos sustituidos C_{1-8} o alquilos ramificados C_{1-8} y arilos.

5. Método según la reivindicación 4, donde dicho haloacetato de alquilo terciario es haloacetato de butilo terciario.

6. Método según la reivindicación 5, donde dicho haloacetato de t-butilo es bromoacetato de t-butilo.

7. Método según la reivindicación 5, donde dicho haloacetato de t-butilo es cloroacetato de t-butilo.

8. Método según la reivindicación 1, donde dicha base es t-butóxido de potasio.

9. Método según la reivindicación 1, donde dicha base es seleccionada del grupo consistente en litio de butilo, amida de sodio y hidruro sódico.

10. Método según la reivindicación 5, donde la proporción molar de dicho haloacetato de t-butilo para dicho óxido de polialquileno es superior a 1:1.

11. Método según la reivindicación 1, donde dicho ácido es ácido trifluoroacético.

12. Método según la reivindicación 1, donde dicho ácido es seleccionado del grupo consistente en ácido sulfúrico, fosfórico y clorhídrico.

13. Método según la reivindicación 1, donde dicha fase de reacción ii) se realiza a una temperatura de aproximadamente 0° a aproximadamente 50°C.

14. Método según la reivindicación 13, donde dicha fase de reacción ii) se realiza a una temperatura de aproximadamente 20 a aproximadamente 30°C.

15. Método según la reivindicación 1, donde dicha fase de reacción ii) se realiza en presencia de agua.

16. Método según la reivindicación 1, donde dicho óxido de polialquileno tiene un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 100.000.

17. Método según la reivindicación 16, donde dicho óxido de polialquileno tiene un peso molecular de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 80.000.

18. Método según la reivindicación 17, donde dicho óxido de polialquileno tiene un peso molecular de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 50.000.

19. Método según la reivindicación 1, donde la pureza de dicho ácido carboxílico de óxido de polialquileno es superior al 92%.

20. Método según la reivindicación 19, donde la pureza de dicho ácido carboxílico de óxido de pollialquileno es superior al 97%.

21. Método según la reivindicación 20, donde la pureza de dicho ácido carboxílico de óxido de polialquileno es superior al 99%.

22. Método según la reivindicación 1, que comprende además la conversión de dicho ácido carboxílico de óxido de polialquileno en un óxido de polialquileno terminado de aminas.

23. Método según la reivindicación 1, que comprende además la conversión de dicho ácido carboxílico de óxido de polialquileno en un óxido de polialquileno terminado de éster de succinimidilo.

24. Método según la reivindicación 1, que comprende además la reacción de dicho ácido carboxílico de óxido de polialquileno con un nucleófilo biológicamente activo bajo condiciones suficientes para formar un conjugado biológicamente activo de modo que dicho óxido de polialquileno es unido a dicho nucleófilo biológicamente activo por un enlace de éster.

25. Método según la reivindicación 24, donde dicho nucleófilo biológicamente activo es taxol.

26. Método según la reivindicación 24, donde dicho nucleófilo biológicamente activo es camptotecina.

27. Método según la reivindicación 24, donde dicho nucleófilo biológicamente activo es podofilotoxina.