ES2202571T3 - Moleculas biologicamente activas de tipo peptidico que inducen un efecto potenciador de la actividad biologica de la hormona de crecimiento. - Google Patents
Moleculas biologicamente activas de tipo peptidico que inducen un efecto potenciador de la actividad biologica de la hormona de crecimiento.Info
- Publication number
- ES2202571T3 ES2202571T3 ES97901145T ES97901145T ES2202571T3 ES 2202571 T3 ES2202571 T3 ES 2202571T3 ES 97901145 T ES97901145 T ES 97901145T ES 97901145 T ES97901145 T ES 97901145T ES 2202571 T3 ES2202571 T3 ES 2202571T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- peptide
- growth hormone
- hapten
- adjuvant
- sequences
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/168—Steroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/184—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA CONSTRUCCION PEPTIDICA QUE COMPRENDE EN SU TOTALIDAD O EN PARTE LA SECUENCIA QUE VA DE LA POSICION 104 A LA 113 DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO GH O UNA SECUENCIA HOMOLOGA QUE PRESENTE UNA INMUNORREACTIVIDAD CRUZADA CON DICHA SECUENCIA; ESTE FRAGMENTO PEPTIDICO VA UNIDO POR UN ENLACE COVALENTE A UN PEPTIDO TRANSPORTADOR Y/O UN ADYUVANTE, Y ES CAPAZ DE INDUCIR IN VIVO UN EFECTO POTENCIADOR DE LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO.
Description
Moléculas biológicamente activas de tipo
peptídico que inducen un efecto potenciador de la actividad
biológica de la hormona decrecimiento.
La presente invención se refiere a una molécula
biológica activa de tipo peptídico que, cuando está unida de modo
covalente con ciertos péptidos transportadores y/o a ciertos
adyuvantes, es capaz de inducir in vivo un efecto potenciador
de la actividad biológica de la hormona de crecimiento GH.
La potenciación de la actividad biológica de la
GH por anticuerpos, más particularmente la actividad somatogénica,
fue observada en primer lugar por Holder y col. (1980), que basaron
sus estudios sobre la medida de una incorporación de sulfatos
radioactivos en el cartílago costal, así como sobre el aumento de
peso inducido por la GH en los ratones enanos del tipo Snell.
Tres estudios basados sobre los mismos parámetros
efectuados por Holder y col. (1985) y Aston y col (1986 y 1987),
mostraron que la mayor parte de los anticuerpos estudiados tenían un
efecto potenciador de la acción biológica de la GH. Los trabajos de
Wallis y col. (1987) han confirmado el fenómeno de aumento de la
actividad somatogénica de la hormona de crecimiento bovino por los
anticuerpos anti-GH. Estos basaron sus estudios en
la medida de la tasa plasmática IGF-I (Insuline
growth factor) y el aumento de peso de las ratas hipofisectomizadas
de raza Wistar.
En particular, la solicitud de patente europea EP
284 406 (COOPERS ANIMAL HEALTH LTD), describe un péptido que tiene
homología de estructura primaria con una secuencia continua de
residuos de aminoácido de la hormona de crecimiento en la región que
se escalona entre las posiciones 35 a 53, o de péptidos en
reactividad cruzada, pudiendo ser utilizado dicho péptido en una
composición antigénica con el fin de potenciar los efectos de
crecimiento en un vertebrado. Los experimentos descritos por Aston y
col. corresponden a una administración in vivo de
anticuerpos, o bien en forma de sueros, cuando son obtenidos del
borrego, o bien en forma de anticuerpos monoclonales, y esta
administración pasiva de anticuerpos dirigidos contra el péptido o
dirigidos contra la hormona natural GH nativa, complejados en dicha
hormona, aumenta la actividad biológica de ésta. No se ha demostrado
que el péptido 35-53 de la hormona de crecimiento
pudiera ser utilizado en el campo de la inmunización activa.
Trabajos recientes realizados con los anticuerpos
potenciadores, parecían indicar que si la GH sola se fija a los
hepatocitos, el complejo GH-MAb o el complejo
formado de la hormona según la invención y de un anticuerpo
potenciador monoclonal, se fijaría preferentemente al nivel de las
células sinusoidales (células de Kupffer) (Tans y col. (1994)). Así
pues, se podría entonces admitir que la síntesis de
IGF-1 y de IGF BP3 a nivel de los hepatocitos
(Massart y col. (1993)) podría ser aumentada igualmente por la
acción de dichos complejos a nivel de estas células
sinusoidales.
Se describe en la solicitud de patente EP 137 234
(THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED), que ciertos anticuerpos de la
hormona de crecimiento son capaces de potenciar la actividad de
ésta, en tal caso se sabe que generalmente tales anticuerpos, al
menos in vivo, tienen tendencia a antagonizar su acción.
Tales anticuerpos pueden además ser producidos in situ por la
"vacunación" del animal huésped con un fragmento específico de
la hormona de crecimiento, de modo que se cree que una clase de
anticuerpos policlonales de especificidad limitada podría potenciar
la actividad de la hormona endógena.
En la presente invención se muestra que ciertas
secuencias de la hormona de crecimiento asociadas a una molécula
portadora y/o un adyuvante son capaces de potenciar la actividad de
dicha hormona en un vertebrado. El descubrimiento del fragmento de
péptido de la presente invención es el resultado de una búsqueda
basada, en un primer caso, en la selección de anticuerpos
monoclonales (MAb) del tipo de los IgG, cuyas reactividades frente a
la hormona de crecimiento, en particular de la hormona de
crecimiento bovina, aparecían más elevadas. Después de la
purificación de dichos Mab, se han retenido cuatro tipos. El efecto
de estos últimos sobre la respuesta en IGF-I
plasmática inducido por una inyección única de bGH en la rata
hipofisectomizada inmadura ha sido sometido a ensayo por Massart y
col. (1993). Se ha podido finalmente identificar un epitopo
reconocido por un anticuerpo potenciador denominado 2H4, siendo
capaz este anticuerpo de reconocer específicamente una secuencia
peptídica situada en la hélice \alpha Nº3 de la hormona de
crecimiento nativo.
Cualquier referencia de estructura primaria,
secundaria o terciaria de la GH es indicada en este documento en
Scanes C.G. y col. (1995).
El objeto de la presente invención es
proporcionar un medio que permita la potenciación de la hormona de
crecimiento GH de modo eficaz y más duradero que los medios de la
técnica anterior. Principalmente, la presente invención proporciona
un péptido, o hapteno, capaz, cuando está unido de forma covalente a
un péptido transportador y/o adyuvante, de inducir in vivo un
efecto potenciador de la actividad biológica de esta hormona.
Un efecto de este tipo puede ser el resultado de
una inmunización activa del tipo de vacunación, donde la
administración del hapteno induce principalmente la producción de
los anticuerpos específicos in vivo.
La presente invención se refiere, por tanto, a
una construcción peptídica que tiene un efecto potenciador de la
actividad biológica de la hormona de crecimiento GH, caracterizada
porque consta de una de las siguientes estructuras:
- a)
- al menos un hapteno constituido total o parcialmente de las secuencias que van de la posición 104 a 113 de dicha hormona de crecimiento, unida o no de modo covalente a un péptido transportador,
- b)
- la estructura en a) asociada o no de modo covalente a un adyuvante,
- c)
- al menos un hapteno constituido total o parcialmente de las secuencias que van de la posición 104 a 113 de dicha hormona de crecimiento, asociada o no de modo covalente a un adyuvante.
La identificación exacta de esta secuencia de la
GH o "péptido GH" es el resultado del análisis de un cierto
número de anticuerpos monoclonales anti-GH,
responsables de un efecto potenciador después de la administración
del complejo anticuerpo-GH. Este fragmento
peptídico, cuya secuencia peptídica resultante de GH puede ser
considerada además como una molécula del tipo hapteno, es reconocido
por el anticuerpo 2H4. Por otro lado, entre los anticuerpos que
tienen los mejores efectos potenciadores, se puede indicar que la
afinidad de 2H4 para GH es débil con respecto a estos otros
anticuerpos.
Según una construcción peptídica preferida de la
invención, dicha secuencia de la hormona de crecimiento GH está
comprendida en la secuencia siguiente:
GTSDRVYEKL
Preferentemente, incluso dicha secuencia de la
hormona GH es seleccionada entre las secuencias siguientes:
TSDRVYEKL
GTSDRVYEK
SDRVYEKL
TSDRVYEK
GTSDRVYE
Estos cinco péptidos corresponden respectivamente
a las regiones 105-113, 104-112,
106-113, 105-112,
104-111, de la hormona de crecimiento GH, tal como
se publica en Scanes y col. (1995) y pueden obtenerse por técnicas
convencionales de síntesis peptídica.
Un heptano no es, por definición, inmunógeno, el
péptido de la invención está unido de modo covalente a un
transportador. A título de ejemplo, tales transportadores pueden ser
de manera ventajosa secuencias peptídicas resultantes de la
ovalbúmina, la KLH (Keyhole Limpet Hemocianine) o la albúmina y más
particularmente los péptidos siguientes:
323-339 de la ovalbúmina,
378-398 o 379-398 o
378-397 o 378-396 o
378-395 del péptido CS.T3, descrito por Sinigaglia
y col.
45-60 de la proteína 1A del virus
sincitial respiratorio,
120-140 de la proteína que
envuelve el ARN genómico del virus de la hepatitis B.
Estas secuencias están copuladas de forma
covalente a la extremidad carboxílica o aminada del "péptido
GH".
El fragmento peptídico de la invención puede
estar unido de modo covalente a otra de las moléculas
transportadoras siguientes, un adyuvante del tipo
N-acetil-muramil (MAP) asociado a un
péptido, como el MDP o sus derivados.
Según un modo de realización preferido del
fragmento peptídico según la invención, el adyuvante es el
muramil-dipéptido (MDP) o uno de sus derivados, tal
como la MDP-lisina Lys
(NH_{2})-D-isoGlu-L-Ala-NMc-Nur.
El derivado de MDP está copulado entonces de modo
covalente al extremo carboxílico del péptido constituido del
"péptido GH" y del transportador, de un modo normalmente
similar al descrito en EP 89290.
El fragmento peptídico según la invención puede
estar unido, además, con una secuencia conocida o presumida como
T-dependiente con o sin MDP, o sus derivados, o
alternativamente unida o englobada en los liposomas. Puede ser
administrada así en estos medios acuosos o aceitosos, por vía oral,
en forma de inyección subcutánea, intramuscular o transmucosa, por
"pellets" (polímeros biodegradables que contienen el producto)
y por implantación de sistemas de ensanchamiento por microbombas.
Otros adyuvantes, tales como el PAO solo o asociado con la lecitina
(EP445710), Zn(OH)_{2} o HBW 538
(DRUGS.EXP.CLIN.RES.17(9) 1991 445-450)
asociado a Al(OH)_{3} pueden estar asociados, de
forma covalente o no, al péptido GH transportador.
\newpage
Finalmente, bien entendido, sobre una misma
molécula transportadora, pueden fijarse varios fragmentos peptídico
según la invención, sin que por ello se vea afectado el efecto
potenciador.
Los "péptidos GH" o los péptidos GH unidos a
los péptidos transportadores pueden ser sintetizados por vía
química, por métodos conocidos por un técnico en la materia, como
por ejemplo el método de Merrifield.
Una aproximación tal que propone una inmunización
activa es una técnica que presenta numerosas ventajas en comparación
con la administración de anticuerpos. En efecto, una inmunización
activa permite, en el instante de la vacunación un efecto perenne
después de que la administración de anticuerpos no tiene un efecto
transitorio; además, la producción de péptidos es sensiblemente
menos costosa que la de los anticuerpos o la de la GH nativa.
Entra igualmente en el campo de la presente
invención un ácido nucleico recombinante que incorpora una secuencia
nucleótida que codifica un hapteno constituido de todas o parte de
las secuencias que van de la posición 104 a la posición 113 de la
hormona de crecimiento GH, y llegado el caso, un péptido
transportador, siendo adecuado dicho ácido nucleico recombinante
para la producción de las construcciones peptídicas según la
invención, en las células procariotas o eucariotas. Un ácido
nucleico recombinante de este tipo puede utilizarse:
- -
- o bien para transferir de las células procariotas o eucariotas y hacerlas producir in vitro dichos péptidos;
- -
- o bien como principio activo de un medicamento potenciador de la GH; los péptidos son entonces producidos in vivo por un mecanismo similar al descrito en WANG B. y col. (1993).
La presente invención trata igualmente una
composición inmunogena que comprende un fragmento peptídico, o un
ácido nucleico recombinante, descrito anteriormente.
En una composición de este tipo, puede añadirse
un adyuvante, que o bien se une o no a un péptido como se describe
anteriormente. Una composición según la invención puede ser
utilizada de forma ventajosa como aditivo alimentario para estimular
el crecimiento y/o la lactancia de los animales, principalmente los
bovinos, ovinos, porcinos y otros vertebrados (peces, marsupiales,
humanos...). Puede estar destinada a una administración oral, por
ejemplo, en forma de aditivo alimentario o a una administración
rectal, subcutánea, intramuscular o transmuscular, "pellets" y
sistemas de microbombas; en particular los liposomas pueden ser
utilizados a título de vector en una composición que incorpora el
péptido GH, unido o no con un transportador y el adyuvante.
Para un efecto promotor del crecimiento o de la
lactación en los animales, la composición está formulada de tal
manera que el péptido de la invención sea administrado a razón de
0,01 \mug a 10 \mug por Kg. Los péptidos y las composiciones de
la invención pueden ser utilizadas igualmente en el hombre en la
fabricación de un medicamento contra los problemas del crecimiento,
que resultan del déficit en la hormona de crecimiento endógena o de
una perturbación del metabolismo de esta última. Las formulaciones
de estas composiciones serían igualmente tal y como se definen
anteriormente.
Sin ser limitativos, los ejemplos y las figuras
muestran a continuación el efecto particular ventajoso de las
construcciones peptídicas de la invención, y principalmente en
comparación con otros promotores del crecimiento.
En una etapa preliminar, era necesario
seleccionar entre los diferentes anticuerpos monoclonales dirigidos
contra la bGH, aquellos que presentaban una cierta afinidad por
estos. Estos parecían ser, en efecto, aquéllos que eran más
susceptibles de interferir, de modo positivo o negativo, en la
actividad biológica de la hormona.
Para la obtención de estos anticuerpos, se ha
utilizado una técnica rápida de inmunización que permite obtener
anticuerpos monoclonales específicos descrito por Holmdahl y col.
(1985) y Mirza y col. (1987). La bGH se ha utilizado como
antígenos.
Los anticuerpos obtenidos han sido caracterizados
en lo que se refiere a:
- -
- La isotopía
- -
- La reactividad en RIA con la bGH marcada con yodo 125
- -
- La reactividad con ELISA (titración aditiva, captura)
- -
- Los reactivos en WESTERN-BLOT.
Los anticuerpos han sido purificados a
continuación a partir de ascites por la técnica descrita en Bruck y
col. (1982), y una vez ha terminado la purificación, las soluciones
de anticuerpos obtenidos han sido el objeto de una
microelectroforesis sobre gel desnaturante en SDS (PHAST SYSTEM).
Esta operación tiene por objeto controlar el aislamiento de las
inmunoglobulinas.
Se ha determinado por una técnica rápida la
capacidad de los MAb purificados para formar concentraciones
importantes de los complejos inmunes con la bGH en solución, por un
método descrito principalmente por Massart. Esta reactividad es
medida por la capacidad de los anticuerpos para formar un complejo
con la bGH marcada con I^{125} en la condición de precipitación en
presencia de PEG (polietileno glicol).
Esto ha permitido seleccionar un anticuerpo que
presenta la reactividad deseada y denominada 2H4 que ha estudiado en
cuanto a su afinidad con la bGH. Los resultados de las
características físico-químicas de este anticuerpo
son expuestos en la tesis de S. Massart y la tabla I siguiente.
| Nº clon | Estado Anticuerpo | Isotipo | RIA | Reacc. Titra. | ELISA Capt. | Reacc. W.B. | ||
| (1) | (2) | (3) | ||||||
| 2H4 | S,A | IgG1(A) | +++ | +++ | ++++ | 10,3 | 9,3 | ++ |
S: sobrenadante del cultivo
A: líquido de ascite
(A): Isotipo que es determinado a
partir del líquido de ascite diluido y no de sobrenadante de
cultivo.
++: precipitación media
+++:
precipitación fuerte
++++: precipitación muy
fuerte
React.Titr.: Titulación de los MAb
anti-GH de los líquidos de ascita (representa el
valor de DO observada que se expone de 0,200(1) a
2.000(10))
ELISA Capt.: captador de la bGH biotinada
con la ayuda de los anticuerpos observados sobre plástico
(representa el número de diluciones de anticuerpos que muestran la
DO máxima observada).
b) Cartografía del epitopo reconocido por el
anticuerpo 2H4:
Los trabajos descritos anteriormente han
permitido por tanto determinar el epitopo del MAb 2H4 por estudios
de cartografía epitópicos realizados principalmente según Beattie y
Holder (1994).
Una batería de péptidos de 8 ácidos aminados ha
sido sintetizada y puesta en reacción con los anticuerpos
monoclonales. Los péptidos que se unen a los anticuerpos han sido
identificados por espectrometría. El peso molecular de los complejos
anticuerpos-péptidos es claramente más elevado que
los de los péptidos solos.
Por tanto, se ha demostrado también que el sitio
de fijación en los anticuerpos era el péptido
104-113 de la
\hbox{estructura} de la
GH.
Esta región 104-113 se sitúa al
nivel del la hélice alfa Nº3 de la GH, región muy poco estudiada de
la hormona GH, a razón del hecho de que los péptidos de esta hélice
presentan una débil actividad de radioreceptores (Scanes y col., Ed.
1995). Se sabe sin embargo que los péptidos de esta región presentan
una actividad promotriz de crecimiento significativo, la hélice
\alpha3 es otra región del segundo sitio de enlace de la proteína
de enlace GH (GHBP). En efecto, para que la GH se una a su receptor
hepático, es necesario que constituya un dímetro con dos GH BP con
el fin de inducir el efecto promotor de crecimiento según el modelo
de Fuh, (1992) (Science, 256, 1677-1678). En
ausencia de esta dimerización de la GH o GHBP, ningún antagonista de
acción se produce y no se obtiene por tanto ningún efecto promotor
del crecimiento. Se puede suponer en cuanto a que los anticuerpos
potenciadores facilitan o modifican este enlace de GHPP a nivel del
sitio del enlace, lo que podría explicar el efecto ventajoso de este
"péptido GH".
Los experimentos in vivo realizados en el
campo de la presente invención han sido agrupados en 19 lotes, a
razón de 5 ratas por lote de ratas hembra hipofisectomizadas de la
raza Wistar. Estos animales han sido hipofisectomizados a la edad de
4 semanas y mantenidos a continuación en observación durante una
semana. Durante una semana de observación suplementaria, se procedió
a pesarlas y los animales que habían ganado más de 5 gramos al cabo
de la séptima semana fueron eliminados. Se consideró en efecto que
la hipofisectomía de estos animales era incompleta. No eran aptos
por tanto a ser utilizados en el campo de los trabajos
presentes.
Cada animal seleccionado recibió un tratamiento
substitutivo de la hormona tiroidea T4 y de la cortisona. Estas
hormonas son administradas normalmente por vía subcutánea a razón de
50 \mug/100g de peso corporal para la cortisona y de 1 \mug/100
g de peso corporal para la T4. Se observó generalmente un ligero
aumento de peso de los animales seguido de la inyección de estas
hormonas. Este tratamiento de complementación hormonal fue aplicado
durante una semana, durante la cual se procedió todos los días a los
pesos cotidianos. Estos animales fueron desde entonces aptos para
ser utilizados por una evaluación comparativa de la actividad
somatogénica de la bGH incubada o no con diferentes construcciones
peptídicas que tiene por péptido GH la secuencia
104-113 o la secuencia 35-53,
descrita en EP 284406.
A lo largo de esta evaluación que se efectuó
durante 50 días, se ha buscado medir, por el aumento de peso y el
nivel de IGF-I, el crecimiento de la actividad
hormonal de la GH porcina administrada en forma de complejo con los
anticuerpos dirigidos contra el péptido 104-113,
comparado con el péptido 35-53 de la GH.
El péptido 104-113 se ha vuelto
inmunógeno por copulación con diferentes moléculas portadoras de
origen peptídico para formar las construcciones peptídicas descritas
a continuación y han sido inyectadas seguidamente a los individuos,
copulados o no con sus adyuvantes de orígenes diversos,
principalmente péptidos derivados del MDP, de los aceites minerales,
de los productos de origen bacteriano o diversos hidróxidos. Esta
inyección se ha efectuado en forma de una composición que comprende
dichas construcciones peptídicas a razón de 0,01 \mug a 10 \mug
de composición por Kg (masa de la rata).
Paralelamente, las ratas testigo
hipofisectomizadas igualmente recibieron inyecciones de GH porcino a
razón de 0,01 \mug a 10 \mug por Kg, o bien en presencia de
inmunoglobulinas normales (testigos negativos), o bien en presencia
de anticuerpos dirigidos contra el péptido 35-53 de
la GH (testigos supuestos positivos).
Los dos inmunógenos
(35-53-OVA y
35-53-SRIF) se han descritos en la
solicitud de patente europea EP 284406 como eficaces para la
obtención de anticuerpos capaces de aumentar la actividad de la GH
en las ratas Wistar hipofisectomizadas. En los experimentos
presentes, el péptido 35-53 de la GH se ha vuelto
inmunógeno por el mismo tipo de copulaciones covalentes que para el
péptido 104-113.
Los inmunógenos
104-113-OVA;
104-113-LysMDP,
104-113-SRIF,
104-113-SRIF-LysMDP
han sido comparados por tanto con los inmunógenos que tienen los
mismos tipos de conjugados (moléculas transportadoras o adyuvantes)
pero cuyo péptido 104-113 ha sido sustituido por el
péptido 35-53.
Los métodos utilizados por la conjugación de OVA
y de SRIF pueden ser estos descritos en la solicitud de patente
EP284406. Además, la copulación en LysMDP puede realizarse según el
método descrito por Carelli y col-, en la patente europea EP
89290.
La detección de los anticuerpos
anti-péptidos y anti-GH ha sido
realizada igualmente según el método descrito en la solicitud de
patente europea EP284406.
La inyección subcutánea ha sido aplicada en los
días J-1, J-15 y
J-40 y las tomas de sangre han sido efectuadas en
los días J-1, J-7,
J-21, J-45 y una toma de sangre
final en J-50.
Lote 1: PBS (testigo negativo)
Lote 2: ACF (adyuvante completo de Freund, 2º
testigo negativo)
Lote 3: AIF (adyuvante incompleto de Freund, 3er
testigo negativo)
Lote 4: PBS + 104-113 conjugado
con OVA
Lote 5: ACF + 104-113 conjugado
con OVA
Lote 6: PBS + 35-53 conjugado
con OVA
Lote 7: ACF + 35-53 conjugado
con OVA
Lote 8: PBS + 104-113 conjugado
con SRIF
Lote 9: ACF + 104-113 conjugado
con SRIF
Lote 10: PBS + 35-53 conjugado
con SRIF
Lote 11: ACF + 35-53 conjugado
con SRIF
Lote 12: PBS + 104-113
conjugado con MDPLys
Lote 13: PBS + 35-53 conjugado
con MDPLys
Lote 14: PBS + 104-113
conjugado con SRIF conjugado con MDPLys
Lote 15: PBS + 354-53 conjugado
con SRIF conjugado con MDPLys
Lote 16: AIF + 104-113
conjugado con MDPLys
Lote 17: AIF + 35-53 conjugado
con MDPLys
Lote 18: AIF + 104-113
conjugado con SRIF conjugado con MDPLys
Lote 19: AIF + 35-53 conjugado
con SRIF conjugado con MDPLys
Se han realizado entonces comparaciones entre los
diferentes lotes:
- -
- Inducción de anticuerpos potenciadores según el método descrito en Massart (1989) páginas 27 y 34.
- -
- Inducción de anticuerpos anti-péptido, así como el nivel de anticuerpos anti-péptido que reconoce el GH nativa
- -
- La evolución ponderal
- -
- El nivel de IG-I plasmático
Al final del tratamiento, después de pesar a los
individuos en el conjunto de lotes, los animales fueron sacrificados
por decapitación sin anestesia para la determinación del nivel de
IGF-I y la evaluación ponderal y las respuestas de
IGF-I de los diferentes grupos experimentales han
sido comparadas sobre los diferentes lotes.
Para la determinación del nivel de
IGF-I, fue recogida sangre del tronco en tubos de
cristal. Después de la retracción del coágulo (2 horas a 4ºC), las
muestras fueron centrifugadas y los sueros fueron conservados a
–20ºC.
Se procedió entonces a la extracción de
IGF-I según el método descrito por Renaville y col.
(1993) página 444. El nivel de recuperación de IGF-1
por esta técnica fue del 93%; fueron eliminadas más del 99% de las
proteínas de enlace. El IGF-I así extraído fue
entonces dosificado por radioinmunoensayo utilizando el antisuero
Rab 2 (Renaville y col. (1993)).
Se puede resaltan en primer lugar la similitud
que existe entre los dos tipos de resultados, puesto que existe
efectivamente una correlación importante entre los aumentos
ponderales y las respuestas de IGF-1.
En efecto, en la dosis de 100 \mug/rata, la bGH
indujo niveles de IGF medios de 60 ng/ml. Este valor fue ocho veces
más elevado que los niveles de base en los animales
hipofisectomizados controlados.
Los resultados de esta experiencia mostraron que
las construcciones peptídicas con el péptido GH indujeron un aumento
de la actividad de la hormona. Este aumento fue reflejado por la
concentración de IGF-I obtenida que fue superior a
la de los animales inyectados por la bGH sola.
Los resultados de este experimento mostraron
igualmente que existe una correlación entre el nivel de anticuerpos
circulantes que reconocen la hormona nativa (GH) y la toma de peso
de las ratas inmunizadas. En particular, los lotes que recibieron
los péptidos eran conjugados en OVA e inyectados en presencia de
ACF, así como aquellos copulados directamente con MDPLys e
inyectados en el PBS separándose claramente de los otros lotes. OVA
fue por tanto mejor transportador que SRIF, incluso cuando este
último estaba acoplado a su vez con MDPLys.
La copulación directa de los péptidos con MDPLys
ofreció buenos resultados cuando se administró con PBS que con AIF.
Deberá indicarse igualmente que en los lotes que reciben el péptido
35-53, el lote 7 ofreció un resultado superior a los
lotes 13 y 17, pero sin embargo menos eficientes que los lotes 5 y
12.
(1) Aston y col. "Potention of the
somatogenic and lactogenic activity of human GH with Mab"
(1986) J. Endocrinol. 110
381-388.
(2) Aston y col. "Enhancement of the
bovine GH activity with Mab" (1987) Mol. Immunol.
24; 143-150.
(3) Beattie y col. Mol. Endocrinol.
(1994) 8; 1103-1110;
(4) Bruck y col. (1982) "The Step
purification of mouse Mab from ascitic fluid by DEAE affigel blue
chromatography" J. Of 53, Immunological Methodology
313-316.
(5) Fuh y col. Science
(1994), 256, 1677-1678.
(6) Holder y col. "Effects of GH,
prolactin and thyroxine on body weight,
somatomedin-like activity and in vivo
sulphation of cartilage in hypopituitary Snell dwarf mice"
(1980) J. Endocrinol. 85; 34'-47.
(7) Holder y col. "Monoclonal
antibody-mediated Enhancement of GH activity in
vivo" (1980) J. Endocrinol. 107;
R9-12.
(8) Holmdahl y col. "A rapid and
efficient immunisation protocol for production of monoclonal
antibodies reactive with autoantigens" (1985) J.
Immunol. Meth. 83; 379-384.
(9) Maiter y col., (1989)
Endocrinology, 124, 2604-2611.
(10) Massart S Thèse de Doctorat "Etude
de l'influence in vivo de Mab anti-bGH sur
l'activité somatogénique de l'hormone b-GH"
(1989) Faculté des Sciences Agronomiques de
Gembloux-Belgique.
(11) Massart y col. (1993) "Mab
to bGH potentiate hormonal activity in vivo by enhancing GH
binding to hepatic somatogenic receptors" J. Endocrinology
139, 383-393.
(12) Mirza y col. "A comparation of
spleen and lymph node cells as fusion partners of the raising of Mab
after different routes of immunisation" (1987) J.
Immunol. Meth. 105; 235-243.
(13) Renaville y col. (1993)
"Changes in the hypophysial gonadal axis during the onset of
puberty in young buls" J. of Reproduction and Fertility
99, 443-449.
(14) Scanes y col. "Growth Hormone
Chemistry" (1995) Growth Hormone, Ed. Harvey S. Scanes
C.G. & Daugahaday W.H., CRC Press, London, pp.
1-25.
(15) Sinigaglia y col. (1988)
Nature; vol. 336, 778-780.
(16) Tans y col. (1994) "Uptake
by rat liver of bGH free o bound to a Mab", Bio Cell
82, 45-49.
(17) Wallis y col. (1997), "Mab
to bGH potentiate effects of the hormone on
somatomedin-C levels and growth of hypophysectomised
rats" Biochem. Biophys. Res. Comm. 149;
187-193.
(18) Wang y col. (1993) PNAS
90 4156-4160.
Claims (11)
1. Construcción peptídica que tiene un efecto
potenciador de la actividad biológica de la hormona de crecimiento
GH, caracterizada porque consta de una de las siguientes
estructuras:
- a)
- al menos un hapteno constituido total o parcialmente de las secuencias que van de la posición 104 a 113 de dicha hormona de crecimiento, unida de modo covalente a un péptido transportador,
- b)
- la estructura en a) asociada o no de modo covalente a un adyuvante,
- c)
- al menos un hapteno constituido total o parcialmente de las secuencias que van de la posición 104 a 113 de dicha hormona de crecimiento, asociada o no de modo covalente a un adyuvante.
2. Construcción peptídica según la reivindicación
1, caracterizada porque la secuencia del hapteno es
seleccionada entre las siguientes secuencias:
TSDRVYEKL
GTSDRVYEK
SDRVYEKL
TSDRVYEK
GTSDRVYE
3. Construcción peptídica según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque el péptido
transportador es seleccionado entre los péptidos que tienen las
secuencias siguientes:
323-339 de la ovalbúmina,
378-398 o 379-398
o 378-397 o 378-396 o
378-395 del péptido CS.T3,
45-60 de la proteína 1A del virus
sincitial respiratorio,
120-140 de la proteína que
envuelve el ARN genómico del virus de la hepatitis B.
4. Construcción peptídica según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el adyuvante
es el muramil-dipéptido (MDP) o uno de sus derivados
tal como el MDP-Lysina, llegado el caso unido de
formo covalente a la extremidad carboxílica de dicho hapteno.
5. Ácido nucleico recombinante que incorpora una
secuencia de nucleótidos que codifica un hapteno constituido total o
parcialmente de las secuencias que van de la posición 104 a la
posición 113 de la hormona de crecimiento GH y llegado el caso, un
péptido transportador, siendo adecuado dicho ácido nucleico
recombinante para la producción de las construcciones peptídicas
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las células
procariotas o eucariotas.
6. Composición que comprende una construcción
peptídica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Composición según la reivindicación 6,
caracterizada porque comprende una construcción peptídica
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un
adyuvante.
8. Utilización de una composición según una
cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en la fabricación de
aditivos alimenticios.
9. Utilización según la reivindicación 8,
caracterizada porque la composición está formulada en
liposomas.
10. Utilización de composiciones según una
cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en la preparación de
aditivos alimenticios que permiten estimular el crecimiento y la
lactancia de los vertebrados que la ingieren.
\newpage
11. Utilización del ácido nucleico recombinante
según la reivindicación 5 para la fabricación de una composición
destinada a la inmunización activa de vertebrados.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9600956A FR2744123B1 (fr) | 1996-01-26 | 1996-01-26 | Molecules biologiquement actives plus particulierement peptidiques ayant un effet potentialisateur de l'activite biologique de l'hormone de croissance |
| FR9600956 | 1996-01-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2202571T3 true ES2202571T3 (es) | 2004-04-01 |
Family
ID=9488527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97901145T Expired - Lifetime ES2202571T3 (es) | 1996-01-26 | 1997-01-22 | Moleculas biologicamente activas de tipo peptidico que inducen un efecto potenciador de la actividad biologica de la hormona de crecimiento. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6455049B1 (es) |
| EP (1) | EP0877807B1 (es) |
| JP (1) | JP2000509964A (es) |
| CN (1) | CN1130459C (es) |
| AR (1) | AR005559A1 (es) |
| AT (1) | ATE243749T1 (es) |
| AU (1) | AU722064B2 (es) |
| BR (1) | BR9707067A (es) |
| CA (1) | CA2243845C (es) |
| DE (1) | DE69723055T2 (es) |
| ES (1) | ES2202571T3 (es) |
| FR (1) | FR2744123B1 (es) |
| NZ (1) | NZ326401A (es) |
| WO (1) | WO1997027298A1 (es) |
| ZA (1) | ZA97614B (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPQ387599A0 (en) | 1999-11-05 | 1999-12-02 | Metabolic Pharmaceuticals Limited | Product and method for control of obesity |
| FR2833012B1 (fr) * | 2001-12-04 | 2004-01-30 | Centre Nat Rech Scient | Peptides agonistes de l'hormone de croissance et leurs applications |
| GB201321242D0 (en) * | 2013-12-02 | 2014-01-15 | Immune Targeting Systems Its Ltd | Immunogenic compound |
| US9119832B2 (en) | 2014-02-05 | 2015-09-01 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating mild brain injury |
| WO2017075535A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of treating neurodegenerative conditions |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5143726A (en) * | 1986-12-09 | 1992-09-01 | The Scripps Research Institute | T cell epitopes of the hepatitis B virus nucleocapsid protein |
| GB8718937D0 (en) * | 1987-08-11 | 1987-09-16 | Coopers Animal Health | Biologically active molecules |
| AU674881B2 (en) * | 1992-09-07 | 1997-01-16 | Biotechnology And Biological Sciences Research Council, The | Growth hormone potentiating molecules |
-
1996
- 1996-01-26 FR FR9600956A patent/FR2744123B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-01-22 NZ NZ326401A patent/NZ326401A/xx unknown
- 1997-01-22 DE DE69723055T patent/DE69723055T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-22 EP EP97901145A patent/EP0877807B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-22 AT AT97901145T patent/ATE243749T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-01-22 WO PCT/FR1997/000127 patent/WO1997027298A1/fr not_active Ceased
- 1997-01-22 US US09/101,912 patent/US6455049B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-22 JP JP09526604A patent/JP2000509964A/ja active Pending
- 1997-01-22 CA CA2243845A patent/CA2243845C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-22 BR BR9707067-0A patent/BR9707067A/pt unknown
- 1997-01-22 AU AU14492/97A patent/AU722064B2/en not_active Ceased
- 1997-01-22 ES ES97901145T patent/ES2202571T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-22 CN CN97191889A patent/CN1130459C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-24 AR ARP970100313A patent/AR005559A1/es active IP Right Grant
- 1997-01-24 ZA ZA97614A patent/ZA97614B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1209841A (zh) | 1999-03-03 |
| NZ326401A (en) | 2000-03-27 |
| AU1449297A (en) | 1997-08-20 |
| ZA97614B (en) | 1997-07-31 |
| CN1130459C (zh) | 2003-12-10 |
| AR005559A1 (es) | 1999-06-23 |
| WO1997027298A1 (fr) | 1997-07-31 |
| CA2243845A1 (fr) | 1997-07-31 |
| DE69723055T2 (de) | 2004-04-01 |
| FR2744123A1 (fr) | 1997-08-01 |
| FR2744123B1 (fr) | 1998-04-17 |
| ATE243749T1 (de) | 2003-07-15 |
| DE69723055D1 (de) | 2003-07-31 |
| EP0877807B1 (fr) | 2003-06-25 |
| US6455049B1 (en) | 2002-09-24 |
| JP2000509964A (ja) | 2000-08-08 |
| EP0877807A1 (fr) | 1998-11-18 |
| BR9707067A (pt) | 1999-12-28 |
| AU722064B2 (en) | 2000-07-20 |
| CA2243845C (fr) | 2012-10-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK328092A3 (en) | Method of improving of organoleptic properties of heat of ungelded males of domestic animals | |
| EP0284406B1 (en) | Biologically active molecules | |
| KR20220062080A (ko) | 전립선암 치료를 위한 면역요법 | |
| JPH08502062A (ja) | ワクチンおよび抗原結合体 | |
| ES2202571T3 (es) | Moleculas biologicamente activas de tipo peptidico que inducen un efecto potenciador de la actividad biologica de la hormona de crecimiento. | |
| JP2509312B2 (ja) | ペプチド構造体、それらを含む免疫原及び妊性の調節へのそれらの使用 | |
| JPH06293661A (ja) | ホルモン活性組成物 | |
| EP0303488B1 (en) | Biologically active molecules | |
| WO1989000166A2 (en) | Growth hormone related peptide | |
| US5401829A (en) | Biologically active molecules | |
| CN101797382B (zh) | 抗人前胃液素多肽免疫组合物 | |
| JP2002518033A (ja) | 農場動物の成長促進のための合成ソマトスタチン免疫原 | |
| PT95687A (pt) | Processo para a obtencao de peptido,anticorpo contra esse peptideo e metodo para potenciar a actividade da somatotropina porcina | |
| JP2000508293A (ja) | Ｆｓｈ作用の促進に有用な新規なペプチド | |
| DK173981B1 (da) | Farmaceutisk antigenetisk formulering | |
| Mockridge et al. | Enhancement of growth hormone (GH) activity by antisera prepared against analogues of an epitope peptide defined by a GH-enhancing monoclonal antibody | |
| JPH11502844A (ja) | 成長促進特性を持つペプチド | |
| US20090136527A1 (en) | Retro-inverso gonadotropin-releasing hormone peptide and vaccine composition | |
| Beattie et al. | Modulation of the Groth Hormone (GH) Axis by the Use of Antibodies to Hormones, Receptors and Binding Proteins | |
| PT94233B (pt) | Processo para a preparacao de peptidos biologicamente activos e composicoes farmeceuticas que os contem | |
| JPS60120824A (ja) | ホルモン活性処方物 |