ES2202864T3

ES2202864T3 - Agonistas de la somatostatina para disminuir el peso corporal.

Info

Publication number: ES2202864T3
Application number: ES98924317T
Authority: ES
Inventors: Michael Anthony Clore Lab. CAWTHORNE; Yong-Ling Liu; Matthew V. Sennitt
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-05-13
Also published as: WO1998051331A9; EP0981363A1; US7662784B2; CA2290592A1; ATE245998T1; US7034003B1; DE69816808D1; WO1998051331A1; AU7655098A; US20060205647A1; EP0981363B1; DK0981363T3; DE69816808T2; PT981363E

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para reducir el peso corporal en un paciente. El procedimiento incluye la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una somatostatina o de un agonista de la somatostatina al paciente. Una composición farmacéutica/cosmética comprende somatostatina o un agonista de la somatostatina. Dichos productos se utilizan para preparar dichas composiciones para reducir el peso corporal en un ser humano o en un mamífero.

Description

Agonistas de la somatostatina para disminuir el peso corporal.

Esta invención trata del uso del agonista del receptor de tipo-2 de la somatostatina o de un agonista del receptor de tipo-5 de la somatostatina en la formulación de una composición útil para reducir el peso corporal en los cuerpos humanos o de animales mamíferos.

Antecedentes de la invención

Se estima que 35 millones de estadounidenses tienen un sobrepeso de al menos 20% (Biotechnology 13:1060-1063 (1195)), un nivel en el que los riesgos para la salud son significativamente elevados. Prácticamente el doble de este número de estadounidenses creen que tienen sobrepeso. Una situación similar se describe en cualquier otra parte. Por ejemplo, en el Reino Unido, aproximadamente un tercio de las mujeres y el 43% de los hombres tienen sobrepeso, con al menos una de cada seis mujeres y uno de cada ocho hombres diagnosticados médicamente como obesos (Purnell, S., Highfield, The Daily Telegraph, Sept. 30, 1995). Existen, por lo tanto, razones estéticas y de salud para controlar el peso.

En la población médicamente obesa, la condición es más severa y a menudo se asocia con una miríada de serios problemas médicos, tales como diabetes mellitus no dependiente de insulina, hipertensión, dislipidemia, enfermedad coronaria y desórdenes músculo-esqueléticos. Por lo tanto, la obesidad no es solamente un problema de un incremento pasivo en la masa adiposa. Se ha sugerido que las alteraciones metabólicas subyacentes en la obesidad pueden estar abiertas a la intervención terapéutica (Goldstein, D.J. y col., Am. J. Clin. Nutr., 60:647-657 (1994)).

Resumen de la invención

La presente invención trata del uso de un agonista de la somatostatina como se define en la reivindicación 1 en la formulación de una composición para disminuir el peso corporal en un paciente (por ejemplo, un mamífero como un ser humano). El agonista de la somatostatina puede administrarse por vía parenteral, por ejemplo, administrarse por vía intravenosa, subcutánea o mediante la implantación de una formulación de liberación mantenida. En una forma de realización, el paciente es obeso (por ejemplo, como se define bien mediante el 20-25% por encima del peso corporal normal (Statistical Bulletin, Metropolitan Life Insurance Co., Vol. 40, pág. 1 (1959) o como se define mediante el índice de masa corporal (BMI) mayor que el 25% sobre el índice normal y que incluye factores de riesgos o un BMI mayor que el 30% sobre el índice normal (véase, por ejemplo, Bray, GA y Gray, DS, Diabetes/Metabolism Review 4:653-679 (1988); Flynn y col., Proc. Nutritional Society 50:413 (1991)). En otra forma de realización, el paciente es diabético no dependiente de insulina (es decir, diabético de tipo-2).

El término "agonista de la somatostatina" se definirá más adelante. Una cantidad terapéuticamente efectiva depende de la condición de tratamiento, la vía de administración elegida y la actividad específica del compuesto usado y, finalmente, será decidida por el facultativo o veterinario encargado (por ejemplo, entre 5 :g/día y 5 mg/día). En una forma de realización el agonista de la somatostatina se administra al paciente hasta que el paciente ha perdido la cantidad de peso corporal requerida (por ejemplo, el paciente ya no es médicamente obeso). En otra forma de realización, el agonista de la somatostatina se administra durante toda la vida del paciente (por ejemplo, manteniendo el peso corporal normal o criterios de valoración secundarios). En otra forma de realización, el agonista de la somatostatina se administra con propósito estético.

El agonista de la somatostatina puede inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, en la sangre del sujeto al que se está tratando. Sin embargo, se apreciará fácilmente por aquellos expertos en la materia que la vía, tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, "entérica", transdérmica, transmucosa, o composiciones de polímero de liberación mantenida (por ejemplo, polímero de ácido láctico o copolímero de micropartículas o implante), profusión, nasal, oral, etc., variará con las condiciones de tratamiento y la actividad y biodisponibilidad del agonista de la somatostatina que se use.

Mientras sea posible que el agonista de la somatostatina se administre como un compuesto puro o sustancialmente puro, puede presentarse como una formulación o preparación farmacéutica. Las formulaciones que se usan en la presente invención, para humanos y animales, comprenden cualquiera de los agonistas de la somatostatina que se describen más adelante, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables de éstos y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos.

El vehículo debe ser aceptable en el sentido de que sea compatible con el(los) ingrediente(s) activo(s) de la formulación (por ejemplo, capaz de estabilizar péptidos) y de que no sea deletéreo para el sujeto que se trate. Deseablemente, la formulación no debería incluir agentes oxidantes u otras substancias con las que se sabe que los péptidos son incompatibles. Por ejemplo, los agonistas de la somatostatina en su forma cíclica (por ejemplo, enlaces "cisteína" disulfuro internos) están oxidados; por lo que, la presencia de agentes reductores como excipientes podrían llevar a la apertura del puente "cisteína" disulfuro. Por otro lado, condiciones altamente oxidantes pueden llevar a la formación de sulfóxido de cisteína y a la oxidación del triptófano. En consecuencia, es importante seleccionar cuidadosamente el excipiente. El pH es otro factor clave y puede ser necesario tamponar el producto bajo condiciones ligeramente acídicas (pH 5 a 6).

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de monodosis y pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los procedimientos incluyen las etapas de traer el(los) ingrediente(s) activo(s) en asociación con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios.

En general, las formulaciones de comprimidos o polvos se preparan mediante la mezcla uniforme e íntima del ingrediente activo con vehículos sólidos divididos en trozos muy pequeños y luego, si es necesario, como en el caso de los comprimidos, se le da al producto la forma y el tamaño deseados.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa), por otro lado, comprenden convenientemente soluciones acuosas estériles del (de los) ingrediente(s) activo(s). Preferiblemente, las soluciones son isotónicas con la sangre del sujeto que se ha de tratar. Dichas formulaciones pueden prepararse, convenientemente, disolviendo el(los) ingrediente(s) activo(s) sólido(s) en agua para producir una solución acuosa y dar dicha solución estéril. La formulación puede presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo, en ampollas o viales sellados.

Las formulaciones adecuadas para las administraciones parenterales de liberación mantenida (por ejemplo, formulaciones de polímero biodegradable como los poliésteres que contienen residuos de ácido láctico o glicólico) se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EEUU nº 3.773.919 y 4.767.628 y la publicación PCT del documento nº WO94/15587.

La somatostatina o el agonista de la somatostatina puede administrarse con otros agentes anti-obesidad tales como la fentermina, el dietilpropión, metanfetamina, fendimetrazina, fenmetrazina, dietilpropion, fentermina, mazindol, dextranfetamina, fentermina, bezfetamina, orlistat, agonistas 3-adrenérgicos (por ejemplo, BTA-234 y SR58611A), sibutramina, henilpropanolamina, dexfenturamina, leptina o bromocriptina.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas y de las reivindicaciones.

Abreviaturas

\exists-Nal = \exists-naftilalanina

\exists-Pal = \exists-piridilalanina

hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina

hArg(Et)_{2} = N, N'-guanidino-(dimetil)-homoarginina

hArg(CH_{2}CF_{3})_{2} = N, N'-guanidino-bis-(2,2,2,-trifluoroetil)- homoarginina

hArg(CH_{3},hexil) = N,N'-guanidino-(metil, hexil)-homoarginina

Lys(Me) = N'-metil lisina

Lys(iPr) = N'-isopropil lisina

AmPhe = aminometilfenilalanina

AchxAla =aminociclohexilalanina

Abu = \forall-ácido aminobutírico

Tpo = 4-tiaprolina

MeLeu = N-metil leucina

Orn = ornitina

Nle = norleucina

Nva = norvalina

Trp(Br) = 5-bromo-triptófano

Trp(F) = 5-fluoro-triptófano

Trp(NO_{2}) = 5-nitro-triptófano

Gaba = ácido \gamma aminobutírico

Bmp = \exists-mercaptopropionil

Ac = acetil

Pen = penicilamina

Descripción detallada de la invención

Se cree que un experto en la materia puede, basándose en la descripción de la presente invención, utilizar la presente invención en su extensión más amplia. Las siguientes formas de realización específicas son, por lo tanto, para interpretarse como meramente ilustrativas y no limitantes del resto de la descripción en absoluto.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente invención tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por alguien experto en la materia a la cual pertenece esta invención.

La somatostatina y sus agonistas

La somatostatina (factor inhibidor de la liberación de la somatotropina o SRIF) tiene una isoforma de 14 aminoácidos (somatostatina-14) y una isoforma de 28 aminoácidos (somatostatina-28). Véase Wilson, J. & Foster, D., Williams Textbook of Endocrinology, pág. 510 (7ª ed., 1985). El compuesto es un inhibidor de la secreción de la hormona del crecimiento y se aisló originalmente del hipotálamo. Brazeau y col., Science 179:77(1973). La somatostatina nativa tiene un efecto de duración muy corta in vivo ya que es rápidamente inactivada por endo- y exopeptidasas. Se han preparado muchos análogos nuevos con el fin de mejorar la duración del efecto, su actividad biológica y su selectividad (por ejemplo, para el receptor concreto de la somatostatina) de esta hormona. Dichos análogos se denominarán "agonistas de la somatostatina" en la presente invención.

Se han aislado diversos receptores de la somatostatina (SSTRs), por ejemplo, SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 y SSTR-5. El agonista de la somatostatina de la presente invención es un agonista de SSTR-5 o un agonista de SSTR-2. Lo que se entiende por un "agonista de SSTR-5" o un "agonista de SSTR-2" es un compuesto que (1) tiene una alta afinidad Ki menor que 2nM, o menor que 1nM para el SSTR-5 o el SSTR-2, respectivamente (por ejemplo, como se define mediante el ensayo de unión a receptor descrito más adelante) y (2) disminuye el peso corporal de un paciente (por ejemplo, como se define mediante el ensayo biológico descrito más adelante). El agonista de la somatostatina puede, además, ser selectivo para un receptor concreto de somatostatina, por ejemplo, tiene una alta afinidad para un subtipo de receptor concreto de somatostatina en comparación con otros subtipos de receptores. En una forma de realización, el receptor de la somatostatina es un agonista selectivo de SSTR-5 o un agonista selectivo de SSTR-2. Lo que se entiende por un agonista selectivo de SSTR-5 es un agonista de la somatostatina que (1) tiene una mayor afinidad en la unión (es decir, Ki) a SSTR-5 que a SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3 o a SSTR-4 y (2) disminuye el peso corporal de un paciente (por ejemplo, como se define mediante el ensayo biológico descrito más adelante). En una forma de realización, el agonista selectivo de SSTR-5 tiene una Ki para SSTR-5 que es al menos 2 veces (por ejemplo, al menos 5 veces o al menos 10 veces) menor que su Ki para el receptor SSTR-2 (por ejemplo, como se define mediante el ensayo de unión al receptor descrito más adelante).

Los agonistas de la somatostatina que pueden usarse para practicar el procedimiento terapéutico de la presente invención incluye, pero no está limitada a, aquellas cubiertas por las fórmulas o aquellas específicamente descritas en las publicaciones que se presentan a continuación.

Solicitud EP nº P5164EU (Inventor: G. Keri);

Van Binst, G. y col. Peptide Research 5:8 (1992);

Horvath, A. y col. Resumen, "Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity",22^{nd} European peptide Symposium, 13-19 de septiembre, 1992, Interlaken, Suiza;

Solicitud PCT WO91/09056 (1991);

Solicitud EP 0363589A2 (1990);

Patente de EEUU nº 4.904.642 (1990);

Patente de EEUU nº 4.871.717 (1989);

Patente de EEUU nº 4.853.371 (1989);

Patente de EEUU nº 4.725.577 (1988);

Patente de EEUU nº 4.684.620 (1987);

Patente de EEUU nº 4.650.787 (1987);

Patente de EEUU nº 4.603.120 (1986);

Patente de EEUU nº 4.458.755 (1986);

Solicitud EP 0203031A2 (1986);

Patente de EEUU nº 4.522.813 (1985);

Patente de EEUU nº 4.486.415 (1984);

Patente de EEUU nº 4.485.101 (1984);

Patente de EEUU nº 4.435.385 (1984);

Patente de EEUU nº 4.395.403 (1983);

Patente de EEUU nº 4.369.179 (1983);

Patente de EEUU nº 4.360.516 (1982);

Patente de EEUU nº 4.358.439 (1982);

Patente de EEUU nº 4.328.214 (1982);

Patente de EEUU nº 4.316.890 (1982);

Patente de EEUU nº 4.310.518 (1982);

Patente de EEUU nº 4.291.022 (1981);

Patente de EEUU nº 4.238.481 (1980);

Patente de EEUU nº 4.235.886 (1980);

Patente de EEUU nº 4.224.190 (1980);

Patente de EEUU nº 4.211.693 (1980);

Patente de EEUU nº 4.190.648 (1980);

Patente de EEUU nº 4.146.612 (1979);

Patente de EEUU nº 4.133.782 (1979);

Patente de EEUU nº 5.506.339 (1996);

Patente de EEUU nº 4.261.885 (1981);

Patente de EEUU nº 4.728.638 (1988);

Patente de EEUU nº 4.282.143 (1981);

Patente de EEUU nº 4.215.039 (1980);

Patente de EEUU nº 4.209.426 (1980);

Patente de EEUU nº 4.190.575 (1980);

Patente EP nº 0389180 (1990);

Solicitud EP nº 0505680 (1982);

Solicitud EP nº 0083305 (1982);

Solicitud EP nº 0030920 (1980);

Solicitud PCT nº WO88/05052 (1988);

Solicitud PCT nº WO90/12811 (1990);

Solicitud PCT nº WO97/01579 (1997);

Solicitud PCT nº WO91/18016 (1991);

Solicitud del Reino Unido nº GB2.095.261 (1981); y

Solicitud francesa nº FR2.522.655 (1983).

Los ejemplos de los agonistas de la somatostatina incluyen, pero no están limitados a, los siguientes análogos de la somatostatina que se describen en los antecedentes citados arriba:

(Secuencias pasan a página siguiente)

2

3

4

5

6

Adviértase que para todos los agonistas de la somatostatina descritos en la presente invención, cada residuo de amimoácido representa la estructura de -NH-C(R)H-CO-, en la que R es la cadena lateral (por ejemplo, CH_{3} en la Ala) excepto en la Thr-ol que significa -NH-CH(CH(CH_{3})OH)-CH_{2}-OH y en la Pro que significa proliníl. Las líneas entre los residuos de aminoácidos representan los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos. Además, donde el residuo de aminoácido es ópticamente activo, se entiende que está en forma L a menos que la forma D se designe expresamente. Se forma un puente disulfuro entre dos de los tioles libres (por ejemplo, residuos Cys, Pen o Bmp); sin embargo, no se muestra.

El uso de agonistas lineales de la somatostatina de la siguiente fórmula está también dentro del ámbito de la invención:

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en la que

A^{1} es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, \exists-Nal, \exists-Pal, Trp, Phe, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{2} es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, \exists-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{3} es piridil-Ala, Trp, Phe, \exists-Nal, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{6} es Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Thr, Abu o Ser;

A^{7} es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, \exists-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{8} es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, Phe, \exists-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

cada R_{1} y R_{2}, independientemente, es H, acilo inferior o alquilo inferior; y R_{3} es OH o NH_{2}; a condición de que al menos uno de A^{1} y A^{8} y uno de A^{2} y A^{7} debe ser un aminoácido aromático; y, además, a condición de que A^{1}, A^{2}, A^{7} y A^{8} no pueden ser todos aminoácidos aromáticos.

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Los ejemplos de agonistas lineales para usarse en el procedimiento de esta invención incluyen:

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Si se desea, uno o más radicales químicos, por ejemplo, un derivado de azúcar, un alquilo mono o poli-hidroxi C_{2}-C_{12}, grupos acilo mono o poli-hidroxi C_{2}-C_{12} o un derivado de la piperazina, puede unirse al agonista de la somatostatina, por ejemplo, al aminoácido N-terminal. Véase la solicitud PCT WO88/02756, solicitud europea 0329295 y solicitud PCT nº WO94/04752. Ejemplos de un agonista de la somatostatina que contienen sustituciones químicas en el N-terminal son:

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Síntesis de agonistas de la somatostatina

Los procedimientos para sintetizar agonistas de la somatostatina están bien documentados y están dentro de las habilidades de una persona experta en la materia.

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La síntesis de secuencias de aminoácidos cortas está bien establecida en la técnica peptídica. Por ejemplo, la síntesis de H-D-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH_{2}, descrito arriba, puede conseguirse mediante el siguiente protocolo establecido en el Ejemplo I de la solicitud de patente europea 0395417A^{1}. La síntesis de los agonistas de la somatostatina con el N-terminal sustituido pueden conseguirse, por ejemplo, mediante el protocolo establecido en el documento WO88/02756, la solicitud de patente europea nº 0329295 y la publicación PCT nº WO94/04752.

Ensayos de unión al receptor de la somatostatina

Están descritos los clones de ADNc de SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4 y SSTR-5 humanos (SSTR-1 y SSTR-2 en Yamada, Y. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:251-255 (1992); SSTR-3 en Yamada y col., Mol. Endocrinol. 6:2136-2142 (1993); y SSTR-4 y SSTR-5 en Yamada y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 844-852 (1993)) y están disponibles además en la Colección de Cultivos Americana (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) (ATTC nº 79044 (SSTR-1), nº 79046 (SSTR-2) y nº 79048 (SSTR-3)). Basándose en los mapas restricción de endonucleasas de la región codificante completa de cada ADNc de SSTR puede escindirse mediante una digestión adecuada con endonucleasas de restricción (Maniatis, T. y col., Molecular Cloning - A Laborator Manual, CSHL, 1982). Las endonucleasas de restricción están disponibles en New England Biolabs (Beverly, MA). Este fragmento de ADN se insertó en el vector de expresión de mamíferos, pCMV (Russell, D. y col., J. Biol. Chem., 264:8222-8229 (1989)), usando técnicas estándar de biología molecular (véase, por ejemplo, Maniatis, T. y col., Molecular Cloning - A Laborator Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) para producir el plásmido de expresión, pCMV-SSTR-1 humano a través de pCMV SSTR-5 humano. Otros vectores de expresión de mamíferos incluyen pcDNAI/Amp (Invitrogen, Sandlesy, CA). Los plásmidos de expresión se introdujeron en bacterias huéspedes adecuadas, E. coli HB101 (Stratagene, La Jolla, CA) y los ADNs plasmídicos, para la transfección, se prepararon en gradientes de Cloruro de Cesio.

Las células CHO-K1 (de ovario de hámster chino) se obtuvieron de la ATCC (ATCC nº CCL61). Las células se cultivaron y mantuvieron en medio Ham's F12 (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal, en condiciones de cultivo estándar. Para la transfección, las células se plantaron a una densidad de 1 x 10^{6}/placa de 60 cm (Baxter Scientific Products, McGaw Park, IL.). La transfección del ADN se llevó a cabo usando el método de coprecipitación con fosfato de calcio (Ausubel, F.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987). El plásmido pRSV-neo (ATCC; ATCC nº 37198) se incluyó como marcador para la selección a 1/10 de la concentración del plásmido de expresión. Las líneas celulares clonales CHO-K1 que habían heredado el ADN transfectado de forma estable se seleccionaron por crecimiento en el medio Ham's F12 que contenía 10% de suero bovino fetal y 0,5 mg/ml de G418 (Sigma). Las células se clonaron (ring-cloned) y se expandieron en el mismo medio para el análisis.

La expresión del SSTR-1 humano a través de receptores SSTR-5 en las células CHO-K1 se detectó mediante análisis por Northern Blot del ARN total preparado a partir de las células (Sambrook, J.E. y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Ed.2, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) y mediante la unión al receptor usando somatostatina-14[I^{125}-Tyr^{11}] como ligando. Las líneas celulares transfectadas que expresaban los receptores SSTR humanos se expandieron clonalmente en cultivo y se usaron en el siguiente protocolo de unión a SSTR.

Las membranas se prepararon mediante homogeneización de las células transfectadas en 20 ml de Tris-HCl 50mM enfriado en hielo con un homogeneizador POLYTRON (posición 6, 15seg). Se añadió tampón hasta obtener un volumen final de 40ml y el homogeneizado se centrifugó en un rotor Sorval SS-34 a 39.000 g durante 10 min a 0-4ºC. Se decantó el sobrenadante resultante y se descartó. Se rehomogeneizó el sedimento en tampón enfriado en hielo, se diluyó y se centrifugó como antes. El sedimento final se resuspendió en el Tris-HCl 10mM y se mantuvo en hielo para el ensayo de unión al receptor.

Las alícuotas de la preparación de membrana se incubaron durante 30 min a 30ºC con somatostatina-14[I^{125}-Tyr^{11}] (2000 Ci/mmol; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) en HEPES 50 mM (pH 7,4) que contenía un agonista de la somatostatina estándar a distintas concentraciones (por ejemplo, de 10^{-11} hasta 10^{-6}), albúmina de suero bovino (fracción V) 10 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), MgCl_{2} (5mM), Trasylol (200 KIU ml),bacitracina (0,02 mg/ml) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (0,02 mg/ml). EL volumen final del ensayo fue 0,3 ml. Las incubaciones se determinaron mediante filtración rápida a través de filtros GF/C (pre-empapados en polietilenimina 0,3% durante 30 min) usando un manifold de filtración Brandel. Cada tubo y cada filtro se lavaron después tres veces con las alícuotas de 5ml de tampón enfriado en hielo. La unión específica se definió como la SRIF-14[I^{125}-Tyr^{11}] total unida menos aquélla unida en la presencia de 1000 nM. Los valores de Ki para los agonistas de la somatostatina ensayados se calcularon usando la siguiente fórmula: Ki=IC_{50} /[1+(LC/LEC)] donde IC_{50} es la concentración de somatostatina estándar requerida para inhibir el 50% de la unión específica al radioligando somatostatina-14[I^{125}-Tyr^{11}], LC es la concentración del radioligando (0,05 nM) y LEC es la constante de disociación del equilibrio del radioligando
(0,16 nM). Los valores de Ki (nm) para los agonistas de la somatostatina ensayados se muestran en la tabla 1.

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	hSSTR-1	hSSTR-2	hSSTR-3	hSSTR-4	hSSTR-5
Somatostatina-14	2,26	0,23	1,2	1,8	1,41
Somatostatina-28	2,38	0,30	1,3	7,93	0,4
Ocreotida	875	0,57	26,8	5029	6,78
BIM-23014	2414	0,75	97,9	1826	5,21
BIM-23052	97,6	11,96	5,6	127	1,22
BIM-23190	9120	0,35	215	7537	11,1
BIM-23197	6016	0,19	26,8	3897	9,81
BIM-23272	47,7	3,23	10,9	753	1,01
BIM-23284	27,9	19,3	35,6	58,6	0,85
BIM-23295	86,9	6,19	9,7	3,4	0,34
BIM-23313	15,1	4,78	25,5	55,3	0,30
BIM-26268	1227	15,06	545	3551	0,42

Estudios de pérdida de peso

El estudio del tratamiento crónico (6 días) con BIM-23268 sobre la ganancia/pérdida de peso corporal se examinó en un modelo animal de obesidad, las ratas Zucker obesas (fa/fa) (obtenidas de Harlan-Olac, Bicester, Oxon, R.U. Véase Bray, G., Federation Proceedings 36: 148-153 (1997). Once ratas macho Zucker obesas que pesaban aproximadamente 450 g. se dividieron al azar en dos grupos y se registraron sus pesos corporales iniciales. Los animales se estabularon por parejas en un ciclo normal de 12 horas de luz: 12 horas de oscuridad a 20-21ºC y se alimentaron ad libitum durante la noche.

En el caso del grupo asignado para recibir el tratamiento con el fármaco, las ratas recibieron el agonista selectivo del receptor de la somatostatina de tipo-5 BIM-23268C a 3 mg/kg, mediante inyección subcutánea dos veces al día, a las 10:00 a.m. y a las 5 p.m. El otro grupo se trató con una inyección subcutánea de o,1 ml/100 g de suero salino dos veces al día, a las 10:00 a.m. y a las 5:00 p.m. Los animales se sometieron al tratamiento con el BIM-23268 o el suero salino durante un total de seis días.

A las 10:00 a.m. de cada día, se retiraba la comida y se sustituía con 100 g de pienso pesado con exactitud (una dieta estándar de ratas de laboratorio, dieta de rata y ratón Beekay, Bantin & Kingman, Hull, Humberside, R.U.). La cantidad de comida que quedaba a las 10:00 a.m. del día siguiente se pesaba con exactitud, se registraba y se sustituía por comida fresca.

Los animales se pesaron cada día durante el periodo de los seis días de tratamiento a las 5:00 p.m. La media del peso del grupo control sin tratar fue 414,09 al comienzo del experimento y después de seis días fue 418,89. La media del peso del grupo tratado con BIM-23268 fue 413,6 al comienzo del experimento y permaneció en 413,6 después de seis días. La media de consumo de comida del grupo control fue 26,0 g/rata/día y en el grupo de BIM-23268 fue 25,9 g/rata/día.

Estos resultados mostraron que la ganancia de peso corporal fue menor en los animales tratados con BIM-23268. El efecto sobre el cambio de peso corporal no se debió a un efecto tóxico del agente, ya que el grupo tratado aparecía saludable y no hubo diferencias en la cantidad de comida consumida durante el periodo completo de tratamiento.

Criterios de valoración secundaria de eficacia

Debido a la cantidad de peso que debe perderse para conseguir una alteración clínicamente importante con riesgo de diversas secuelas de la obesidad, las directrices de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) para la evaluación de los fármacos para controlar el peso han recomendado que se monitoricen criterios de valoración adicionales que muestren una disminución en los factores de riesgo, tales como la lipemia.

Las ratas obesas Zucker (fa/fa) se trataron como en el ejemplo 1 anterior. El último día de tratamiento (día 6), la comida se retiró a las 5:00 p.m. y se mantuvo en ayuno a las ratas durante la noche. A las 9:00 a.m. del día siguiente, los animales se sometieron a la prueba de tolerancia de glucosa, dándoles 0,8 g/kg de glucosa por vía oral. Se tomaron muestras de sangre periódicas 400:1 de la vena caudal (Peterson, R.G., ILAR News, 32:16-19 (1990)) 60 min y 30 min antes y 30, 60, 90 y 120 min después de la administración de la glucosa (0,8 g/kg por vía oral). Se añadió apoprotinina (Traysylol, Bayer, UK, Haywards Health W. Sussex, R.U.) y heparina (Sigma Chemical Co., Pooñe, Dorset, R.U.) a las muestras de sangre a una concentración final de 400 KIU/ml y 100 unidades/ml, respectivamente. Las fracciones de plasma se prepararon a partir de estas muestras mediante centrifugación a 4000x G en una microfuga para la estimación de los triglicéridos y del glicerol. Las muestras se almacenaron luego a -80ºC hasta que se analizaron.

El glicerol y los triglicéridos plasmáticos se determinaron usando el kit de ensayo colorimétrico Sigma Enzymatic (Tinder)(Cat#337-B, Sigma Chemical Co., Poole, Dorset, R.U.) y la absorbancia se midió a 540 nm en un espectrofotómetro.

Después de seis días de tratamiento con BIM-23268C a 3 mg/kg dos veces al día mediante inyección subcutánea, disminuyeron significativamente el glicerol y los triglicéridos, como ejemplifican las muestras tomadas a tiempo 30 y 60 minutos antes de la administración total de la glucosa. Véase la Fig.1 y la Fig.2. La administración de glucosa por vía oral no tuvo efecto significativo sobre los lípidos plasmáticos. El grupo tratado con BIM-23628C mostró el glicerol y los triglicéridos significativamente más bajos a lo largo del periodo de 2 horas de la prueba. Los resultados sugirieron que BIM-23268C, después de un periodo de tratamiento de 6 días a la dosis prescrita fue efectivo en reducir la hipertrigliceridemia.

Valoración de la eficacia en pacientes

El efecto del agonista de la somatostatina en la obesidad puede examinarse en pacientes mediante la valoración del peso corporal total, el índice de masa corporal, el contenido de tejido adiposo total, el contenido de tejido subcutáneo, el contenido de tejido adiposo visceral (véase, por ejemplo, Zamboni, M., Amer. J. Clin. Nutr. 60:682-687 (1994). El efecto del agonista de la somatostatina puede medirse además con otros criterios de valoración secundarios, tales como la sensibilidad a insulina (véase, por ejemplo, Bergman, R.N. y col., Endocrin. Rev. 6:45-86 (1985); Turner, R.C., Diabetes 44:1-10 (1995)), la presión sanguínea (véase, por ejemplo, Maheux, P., Hypertension 24:695-698 (1994)), los lípidos plasmáticos (véase, por ejemplo, Dubrey, S.W. y col., Diabetes 43:831-835 (1994)) y otros criterios de valoración aceptables recomendados por el documento con las directrices para la evaluación del control de peso con fármacos de la FDA (1994)(véase también, Drug & Market Development 6:36 (1994)).

Otras formas de realización

La siguiente descripción no se limita a formas de realización específicas de esta invención. Sin embargo, estará claro que se pueden hacer variaciones y modificaciones de la invención en lo que atañe a alguna o todas las ventajas de la invención.

Claims

1. Uso de un agonista del receptor de la somatostatina de tipo-2 o de un agonista del receptor de la somatostatina de tipo-5, en el que dicho agonista del receptor de la somatostatina de tipo-2 o de tipo-5 tiene una Ki menor que 2nM para el receptor de la somatostatina de tipo-2 o de tipo-5, respectivamente, en la formulación de una composición farmacéutica para usarse para reducir el peso corporal excesivo en un ser humano o en un animal mamífero.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho agonista de la somatostatina es un agonista selectivo para el receptor de la somatostatina de tipo-2.

3. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho agonista de la somatostatina es un agonista selectivo para el receptor de la somatostatina de tipo-5.

4. Uso de la reivindicación 2, en el que dicho agonista selectivo del receptor de somatostatina de tipo-2 tiene una Ki para el receptor de la somatostatina de tipo-2 que es al menos 10 veces menor que la Ki para los receptores de somatostatina de tipo-1, tipo-3, tipo-4 y tipo-5.

5. Uso de la reivindicación 3, en el que dicho agonista selectivo del receptor de la somatostatina de tipo-5 tiene una Ki para el receptor de somatostatina de tipo-5 que es al menos 10 veces menor que la Ki para los receptores de somatostatina de tipo-1, tipo-2, tipo-3 y tipo-4.

6. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición se formula para la administración a un humano diabético no dependiente de insulina.

7. Uso según la reivindicación 1 en el que el agonista de la somatostatina es:

(Secuencias pasan a página siguiente)

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8. Uso según la reivindicación 1 en el que el agonista de la somatostatina es:

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en el que

A^{1} es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, \beta-Nal, \beta-Pal, Trp, Phe, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{2} es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, \beta-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{3} es piridil-Ala, Trp, Phe, \beta-Nal, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{6} es Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Thr, Abu o Ser;

A^{7} es Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Phe, \beta-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, o-X-Phe o p-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

A^{8} es un isómero D o L de Ala, Leu, Ile, Val, Nle, Thr, Ser, Phe, \beta-Nal, piridil-Ala, Trp, 2,4-dicloro-Phe, pentafluoro-Phe, p-X-Phe u o-X-Phe, en los que X es CH_{3}, Cl, Br, F, OH, OCH_{3} o NO_{2};

cada R_{1} y R_{2}, independientemente, es H, acilo inferior o alquilo inferior; y R_{3} es OH o NH_{2}; a condición de que al menos uno de A^{1} y A^{8} y uno de A^{2} y A^{7} deben ser un aminoácido aromático; y además, a condición de que A^{1}, A^{2}, A^{7} y A^{8} no pueden ser todos aminoácidos aromáticos.

9. Uso según la reivindicación 8 en el que el agonista de la somatostatina lineal es:

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10. Uso según la reivindicación 1 en el que el agonista de la somatostatina es

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11. Uso según la reivindicación 1, 2 ó 3 en el que dicha composición se formula para la administración a un paciente que es obeso.

12. Un procedimiento para mejorar la apariencia corporal de un sujeto en el que se administra una composición estética que comprende una cantidad estéticamente efectiva de un agonista del receptor de tipo-2 de la somatostatina o un agonista del receptor de tipo-5 de la somatostatina, en la que dicho agonista del receptor tipo-2 o tipo-5 de la somatostatina tiene una Ki menor que 2nM para el receptor de tipo-2 o de tipo-5 de la somatostatina, respectivamente, en una cantidad total efectiva para conseguir una disminución en el peso corporal estéticamente beneficiosa.