ES2202880T3 - Macrolidos con actividad antitumoral. - Google Patents
Macrolidos con actividad antitumoral.Info
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Abstract
El compuesto al que se hace referencia en esta memoria como IB-96212, que tiene esetructura (I) se puede obtener cultivando una cepa de Micromonospora spl ES25-008, disponible con el número de acceso CECT-3333, que se puede hidrolizar para dar IBG-96212B de estructura (II). El sustituyente azúcar, que es L-rodinosa, puede él mismo derivarse o el azúcar puede estar sustituido, en cualquier caso dando lugar a más derivados de IB-96212 que tienen un grupo distinto de L-rodinosa en la posición del azúcar.
Description
Macrólidos con actividad antitumoral.
La presente invención se refiere a un nuevo
compuesto que es un macrólido y es aislado del caldo de cultivo de
un nuevo organismo microbiano marino. La presente invención se
refiere además a la producción del nuevo compuesto mediante
fermentación aeróbica bajo condiciones controladas y a su
aislamiento y purificación, así como a compuestos derivados y a
aspectos adicionales basados en el descubrimiento de actividades
antitumorales y otras actividades.
Los macrólidos llamados oligomicinas y
homooligomicinas son conocidos por J. Antibiotics 46:
1334-1341, 1993; J. Antibiotics 45: 171 - 179, 1992
y J. Antibiotics 49: 1275 - 1277, 1996.
Sigue habiendo necesidad de nuevos compuestos
antiproliferativos para el tratamiento de varios tumores humanos,
debido al hecho de que las de un gran número de líneas celulares
cancerosas, incluyendo las que presentan el fenotipo MDR (MDR =
resistentes a drogas múltiples), no son tratadas con eficacia por
droga alguna.
Otro objetivo adicional de esta invención es el
de aportar composiciones farmacéuticas destinadas a ser
administradas a un paciente que necesite tratamiento con el
compuesto activo.
Los productos microbianos son interesantes porque
su producción industrial está perfectamente establecida en la
actualidad. Por consiguiente, otro objetivo de esta invención está
dirigido a la producción del compuesto activo y a su aislamiento y
purificación a partir del caldo de fermentación resultante, así
como a su hidrólisis para su conversión en un compuesto aglicónico y
a su derivatización para su conversión en compuestos afines.
Esta invención aporta un compuesto que tiene una
estructura del tipo de la de un macrólido, al que se llama
IB-96212 y que tiene la fórmula siguiente:
Se aporta también un proceso para obtener
IB-96212, y el proceso preferido comprende el paso
de cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir
IB-96212 en un medio nutritivo acuoso con fuentes y
sales de carbono y nitrógeno asimilables, bajo condiciones
aeróbicas en inmersión controladas. Es también parte de esta
invención el propio caldo resultante, ya sea no purificado o bien
parcialmente purificado y que tiene actividad antitumoral. El
compuesto IB-96212 puede ser recuperado y
purificado a partir del caldo cultivado. El compuesto y el caldo de
fermentación demuestran tener una interesante actividad contra
varias células cancerosas humanas entre las que se encuentran las
células de leucemia sensitivas y resistentes a drogas múltiples
(MDR). Adicionalmente, el IB-96212 presenta
actividad antibiótica contra algunas bacterias grampositivas.
De este compuesto IB-96212 puede
ser retirado por hidrólisis un tridesoxiazúcar identificado como
L-rodinosa, dejando el compuesto aglicónico activo
IB-96212B que tiene el sistema de anillo de
macrólido de 26 miembros del núcleo del IB-96212
progenitor.
Así, la invención aporta además el compuesto
IB-96212B con la estructura:
El IB-96212B tiene una actividad
equiparable a la del IB-96212 progenitor.
En el compuesto IB-96212, el
tridesoxiazúcar que identificamos como L-rodinosa
puede ser él mismo derivatizado, o bien el azúcar puede ser
sustituido, siendo en cualquier caso obtenidos adicionales derivados
de IB-96212 que tienen un grupo distinto de
L-rodinosa en la posición del azúcar. Así, más
ampliamente, la presente invención aporta un compuesto de la
fórmula general:
donde R es hidrógeno o un grupo
sustituyente.
\newpage
Ilustrativamente, R es hidrógeno o un grupo
seleccionado de entre los miembros del grupo que consta de un grupo
sacárido, un grupo hidrocarbilo, un grupo acilo, un grupo
heterociclilo o algún otro sustituyente adecuado. La naturaleza del
grupo sustituyente no es decisiva. El grupo sacárido es
convenientemente un mono-, di- o trisacárido, que puede ser un
desoxisacárido. El hidrocarbilo puede ser alquilo, cicloalquilo,
arilo, aralquilo o alquilarilo, y especialmente alquilo de
C_{1}-C_{6},
ciclo-(C_{4}-C_{8})-alquilo,
fenilo, naftilo o bencilo. El grupo heterociclilo puede ser un
anillo de 4 a 8 miembros que tenga de 1 a 4 heteroátomos, y en
especial un anillo de 5 ó 6 miembros que tenga 1 ó 2 heteroátomos
elegidos de entre los miembros del grupo que consta de oxígeno,
azufre y nitrógeno. El grupo hidrocarbilo, el grupo acilo o el
grupo heterociclilo puede ser él mismo sustituido, por ejemplo con
1, 2 ó 3 sustituyentes elegidos de entre los miembros del grupo que
consta de alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de
C_{1}-C_{6}, halógeno, hidroxi, amino u otros
grupos.
El cultivo preferido para obtener
IB-96212 es una nueva cepa llamada
ES25-008, y sus caracteres químicos, bioquímicos y
morfológicos demuestran que pertenece al género
Micromonospora, estando clasificada taxonómicamente como
Micromonospora sp.
Como se ha descrito anteriormente, se ha
descubierto que los compuestos IB-96212 e
IB-96212B son eficaces en la inhibición de la
actividad proliferativa de varias líneas celulares de leucemia
humana y murina (líneas celulares resistentes a drogas múltiples
(MDR) así como líneas celulares sensitivas), así como contra otros
tumores humanos. Resulta de ello que otros compuestos de la fórmula
general indicada conservarán tal actividad.
La Figura 1 es un cromatograma de HPLC (HPLC =
cromatografía de líquidos de alta resolución) de
IB-96212 purificado;
la Figura 2 es un espectro ultravioleta (UV) de
IB-96212 purificado;
la Figura 3 es un espectro infrarrojo (IR) de
IB-96212 purificado;
la Figura 4 es un espectro de resonancia
magnética nuclear (RMN) protónica (de 1H) de
IB-96212 purificado;
la Figura 5 es un espectro de resonancia
magnética nuclear (RMN) de carbono-13 (13C) de
IB-96212 purificado;
la Figura 6 es un espectro de masa de
IB-96212 purificado;
la Figura 7 es un espectro de RMN HMBC de
IB-96212 tomado en acetona- d_{6};
la Figura 8 es un espectro de RMN COSY de
IB-96212 tomado en acetona- d_{6};
la Figura 9 es un espectro de RMN HMQC a 132 Hz
de IB-96212 tomado en
acetona-d_{6};
la Figura 10 muestra las correlaciones de RMN de
IB-96212B;
la Figura 11 es un espectro de masa de
IB-96212B;
la Figura 12 es un espectro de RMN HMBC de 60ms
de IB-96212B tomado en
acetona-d_{6};
la Figura 13 es un espectro de RMN HMBC de 110ms
de IB-96212B tomado en
acetona-d_{6};
la Figura 14 es un espectro de RMN COSY de
IB-96212B tomado en acetona- d_{6}; y
la Figura 15 es un espectro de RMN HMQC a 145 Hz
de IB-96212B tomado en
acetona-d_{6}.
El microorganismo utilizado para la producción de
IB-96212 y por consiguiente de
IB-96212B es preferiblemente la cepa
ES25-008 de Micromonospora sp., del cual ha
sido depositado un cultivo en la Colección Española de Cultivos
Tipo en la Universidad de Valencia, España, con el número de
registro de entrada CECT 3333. Este depósito ha sido efectuado al
amparo de lo dispuesto por el Tratado de Budapest, y se le ha dado
la fecha de depósito del 4 de agosto de 1997. El organismo fue
aislado de una esponja marina no identificada. Los métodos
taxonómicos aquí descritos son los indicados en la Tabla 1. Todos
los cultivos fueron incubados a 27ºC, y fueron efectuados registros
de los resultados semanalmente hasta 21 días.
\newpage
1. Medios para los estudios de la morfología
colonial
Medios ISP Nº 2, 3, 5 y 6: Shirling &
Gotlieb. (7).
Medio ATCC Nº 172: Catálogo de la ATCC (ATCC =
Colección Americana de Cultivos Tipo)
Agar Czapek Difco
Agar Bennet, Waksman. (9)
Agar con un 1,5% de agua, Luedemann (5)
Todos los medios fueron suplementados con un 50%
de agua de mar artificial
Medio ISP Nº 1, Shirling & Gotlieb. (7)
Resistencia al NaCl: ATCC 172 con un 0, 2, 4, 7 y
10% de NaCl.
Utilización del carbono: ISP-9,
E. B. Shirling & D. Gotlieb. (7)
Análisis de los ácidos grasos, Van der Auwera et
al. (8)
Análisis del azúcar de las células intactas,
Guerrant y Moss. (3)
La siguiente es una descripción del
organismo:
Tras 21 días a 28ºC se observó crecimiento en
caldo ISP2 y 172 suplementado con agua de mar artificial (ASW).
Fueron observados varios tonos de naranja en los distintos medios
estudiados. No se formó micelio aéreo. El micelio del sustrato era
ramificado. Se dan esporas terminales aisladas en el micelio del
sustrato. Las esporas eran esféricas. En algunos medios y tras al
menos 14 días de incubación puede detectarse cierto sobrecrecimiento
de la masa de micelios.
Ni en los medios sólidos ni en los medios
líquidos fueron formados pigmentos difusibles por la cepa
ES25-008. La resistencia al NaCl era de más de un
4%. La gama de temperaturas de crecimiento óptimo estaba situada
entre 25ºC y 35ºC. El organismo creció sobre glucosa, sucrosa,
xilosa y manosa como única fuente de carbono, si bien fue negativo
el crecimiento sobre rafinosa, inositol, galactosa, fructosa,
melibiosa, etanol, glicerol y ramnosa, y fue dudoso el crecimiento
sobre manitol.
En el hidrolizado de células intactas de la cepa
ES25-008 estaba presente ácido
meso-2,6-diaminopimélico.
La composición de ésteres metílicos de ácidos
grasos es como se indica a continuación en la Tabla 2:
| 13:0 | i-14:0 | 14:0 | i-15:0 | n-15:0 | 15:0 | i-16:1 | i-16:0 | 16:1 | 16:0 |
| <1 | <1 | <1 | 8.21 | 1.00 | 1.09 | <1 | 35.07 | <1 | 1.12 |
| i-17:1 | i-17:0 | n-17:0 | 17:1 | 17:0 | i-18:1 | i-18:0 | cis-18:1 | 18:0 |
| <1 | 3.18 | 3.39 | 29.48 | 7.88 | 1.44 | <1 | 2.30 | <1 |
El espectro de azúcares de las células intactas
puso de manifiesto la presencia de xilosa, ribosa y glucosa cuando
se efectuó el pertinente análisis por cromatografía de gases.
Fueron detectadas trazas de arabinosa. Este espectro agrupa esta
cepa dentro del grupo D de Lechevalier et al. (4). Otros azúcares
detectados fueron manosa, galactosa, n-inositol y
manosamina. El polialcohol arabitol y el ácido murámico eran otros
componentes celulares. No se detectó madurosa.
Sobre la base de las características precedentes,
el cultivo ha sido determinado como una especie del género
Micromonospora que no guarda similitud con ninguna de las
cepas de tipo conocido de este género que están disponibles en las
colecciones internacionales. El mayor parecido según el análisis
cromatográfico de ácidos grasos era con la Micromonospora
chalcea ATCC 31395 con una similitud de tan sólo un 80%.
Si bien se prefiere claramente el organismo
depositado, la presente invención no queda restringida o limitada a
esta cepa en particular o a estos organismos en particular. Es la
intención de los presentes inventores incluir cualesquiera otros
organismos, cepas o mutantes que produzcan
IB-96212.
Al ser cultivado bajo condiciones controladas en
un medio adecuado, el microorganismo Micromonospora sp.
ES25-008 produce el antibiótico
IB-96212. Esta cepa es cultivada en un medio
nutritivo acuoso, bajo condiciones aeróbicas y mesofílicas,
preferiblemente a una temperatura de entre 24ºC y 35ºC y a un pH de
6,0 a 8,0. Para el cultivo del organismo pueden ser utilizados los
de una amplia variedad de medios de cultivo líquidos, siendo medios
útiles aquéllos que incluyen una fuente de carbono asimilable tal
como almidón, dextrina, melazas de azúcar, glicerol, glucosa,
sucrosa y fuentes similares, una fuente de nitrógeno asimilable tal
como proteínas, hidrolizados proteínicos, harinas desgrasadas,
jarabe de maíz y fuentes similares, y aniones y cationes
inorgánicos útiles tales como los de sodio, magnesio, potasio,
amonio, sulfato, cloruro, fosfato, carbonato y aniones y cationes
similares. Pueden ser también añadidos oligoelementos. La aireación
se logra preferiblemente suministrando aire al medio de
fermentación. La agitación es efectuada por una hélice mecánica. Se
ha comprobado que son perfectamente adecuados para llevar a cabo el
cultivo de este organismo los tanques de fermentación
convencionales. Para incrementar la producción y evitar la
espumación puede ser necesario efectuar una adición de nutrientes y
un control del pH así como añadir agentes antiespumantes durante
las distintas etapas de la fermentación.
Los pasos requeridos que son necesarios para la
producción de IB-96212 por parte del organismo
preferido son los siguientes:
Comenzar con micelio congelado o liofilizado.
Obtener una masa miceliana cultivando las células iniciales en
matraces sacudidores con un medio de cultivo que contenga algunos
de los ingredientes anteriormente descritos a temperaturas
mesofílicas y en condiciones aeróbicas, pudiendo este paso ser
repetido varias veces según sea necesario, y el material
recolectado será usado como un inóculo para sembrar uno o varios
tanques de fermentación con medio de cultivo apropiado, y si se
desea, estos tanques pueden ser utilizados también como inóculo, y
este paso puede ser repetido varias veces cuando ello sea necesario,
o bien estos tanques pueden servir de etapa de producción, en
dependencia del volumen de caldo que sea necesario. El medio de
producción puede ser a veces distinto del usado como inóculo.
En la Tabla 3 están descritos medios típicos que
pueden ser usados para el desarrollo del inóculo y para la
producción de IB-96212.
| Medio de inóculo | Medio de producción | ||
| Glucosa | 5 g | Glucosa | 5 g |
| Almidón | 20 g | Almidón | 20 g |
| Extracto de buey | 3 g | Soja en polvo | 15 g |
| Extracto de levadura | 5 g | Extracto de levadura | 5 g |
| Triptona | 5 g | Triptona | 2 g |
| CaCO_{3} | 4 g | CaCO_{3} | 4 g |
| NaCl | 4 g | NaCl | 4 g |
| Na_{2}SO_{4} | 1 g | Na_{2}SO_{4} | 1 g |
| Kcl | 0,5 g | Kcl | 0,5 g |
| MgCl_{2} | 2 g | MgCl_{2} | 2 g |
| K_{2}HPO_{4} | 0,5 g | K_{2}HPO_{4} | 0,5 g |
| Agua del grifo hasta | 1.000 ml | Agua del grifo hasta | 1.000 ml |
La producción de IB-96212 puede
ser supervisada mediante análisis del caldo intacto contra la línea
celular de la leucemia murina P-388 o bien por
HPLC.
El antibiótico IB-96212 puede ser
aislado de la torta de micelios mediante extracción con una
adecuada mezcla de disolventes tal como
CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O. La actividad queda concentrada en la
capa inferior. Los extractos de dos extracciones repetidas pueden
ser combinados y evaporados hasta la sequedad in vacuo.
La separación y purificación del
IB-96212 a partir del extracto activo bruto puede
ser efectuada mediante el uso de la adecuada combinación de técnicas
cromatográficas convencionales.
El fraccionamiento puede ser guiado por la
actividad antitumoral de las fracciones, o por cromatografía en
capa fina (TLC) visualizada con vainillina en H_{2}SO_{4}
concentrado o por HPLC analítica con detector de diodo. Los
análisis por HPLC son llevados a cabo a temperatura ambiente (Waters
RCM 8x10, cartucho 8C18 10) usando como fase móvil metanol:agua
92:8 y una velocidad de flujo de 2 mm/min. y con registro a 225 nm.
En estas condiciones, el tiempo de retención de
IB-96212 es de 3,64 min. como se muestra en la Fig.
1.
Sobre la base de los análisis detallados de sus
varias características espectrales, el compuesto puro puede ser
identificado como IB-96212 (véanse los datos
reproducidos en las figuras 2 a 6).
El espectro ultravioleta presenta absorción a 225
nm como se indica en la Fig. 2.
En la Fig. 3 de los dibujos acompañantes está
ilustrado el espectro de absorción de infrarrojos en KBr.
Los espectros de RMN de 1H y de 13C están
ilustrados en la Fig. 4 y en la Fig. 5, respectivamente.
En la Fig. 6 está ilustrado el espectro de masa
por bombardeo atómico rápido que presentaba un pico de
(M+Na)^{-} a 1021.
Se tabulan de la manera siguiente los datos de
RMN de ^{1}H para IB-96212:
| posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] | posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] |
| 1 | 33 | 3.52 (1H) | |
| 2 | 5.80 (1H, d, 15.5) | 34 | 1.35 (1H m) |
| 3 | 6.74 (1H, dd, 10.5, 15.5) | 1.68 (1H, m) | |
| 4 | 2.37 (1H, dt, 6.5, 10.0) | 35 | 0.94 (3H, t, 7.5) |
| 5 | 3.62 (1H, d, 9.0) | 36 | 1.13 (3H, d, 6.5) |
| 6 | 1.73 (1H, m) | 37 | 0 77 (3H, d, 7.0) |
| 7 | 4.02 (1H, d, 9.0) | 38 | 1.40 (1H, m) |
| 8 | 3.62 (1H, d, 9.0) | 1.64 (1H, m) | |
| 9 | 3.54 (1H) | 39 | 1.42 (1H, m) |
| 10 | 4.07 (1H, dd, 4.5, 8.05) | 1.54 (1H, m) |
| posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] | posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] |
| 11 | 3.46 (1H) | 40 | 0.91 (3H, t, 7.0) |
| 12 | 41 | 0.96 (3H, d, 6.5) | |
| 13 | 3.78 (1H, dd, 1.5, 6.5) | 42 | 1.25 (1H, m) |
| 14 | 1.82 (1H, m) | 1.42 (1H, m) | |
| 15 | 1.98 (1H, m) | 43 | 3.68 (1H, m) |
| 2.19 (1H, m) | 44 | 1.08 (3H, d, 6.5) | |
| 16 | 5.42 (1H, ddd, 3.5, 10.5, 14.5) | 45 | 0.75 (3H, d, 7.0) |
| 17 | 6.03 (1H, dd, 10.5, 14.5) | 46 | 0.92 (3H, d, 7.0) |
| 18 | 6.01 (1H, dd, 10.5, 14.5) | 47 | 0.78 (3H, d, 6.0) |
| 19 | 5.16 (1H, dd, 10.0, 14.5) | 48 | 0.82 (3H, d, 7.0) |
| 20 | 2.26 (1H, dt, 10.0) | 5-OH | 4.21 (1H, s) |
| 21 | 1.40 (1H, m) | 7-OH | 4.90 (1H, s) |
| 1.64 (1H, m) | 9-OH | 3.50 (1H, s) | |
| 22 | 0.92 (1H, m) | 10-OH | 4.50 (1H, d, 4.5) |
| 1.58 (1H, m) | 11-OH | 3.53 (1H, s) | |
| 23 | 3.92 (1H, d, 10.5) | 12-OH | 3.75 (1H, s) |
| 24 | 1.95 (1H, m) | 13-OH | 4.43 (1H, d, 6.5) |
| 25 | 4.8 1 (1H, dd, 5.0, 11.5) | 33-OH | 3.38 (1H, d, 6.0) |
| 26 | 1.75 (1H) | 43-OH | 3.39 (1H, d, 6.0) |
| 27 | 1' | 6 4.54 (1H, dd, 1.5, 7.7) | |
| 28 | 1.40 (1H, m) | 2' | 1.43 (1H, m) |
| 1.75 (1H, m) | 2.09 (1H, dt, 2.0, 8.5) | ||
| 29 | 1.49 (1H, m) | 3' | 1.46 (1H, m) |
| 1.65 (1H, m) | 1.93 (1H, m) | ||
| 30 | 1.49 (1H, m) | 4' | 3.15 (1H, sep, 5.0) |
| 31 | 3.82 (1H, d, 10.5) | 5' | 3 31 (1H, dq, 2.5, 6.0) |
| 32 | 1.66 (1H, m) | 6' | 1.24 (3H, d, 6.0) |
Se tabulan de la manera siguiente los datos de
RMN de ^{1}H para IB-96212B:
| posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] | posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] |
| 1 | 33 | 3.55 (1H, m) | |
| 2 | 5.80 (1H, d, 15.5) | 34 | 1.37 (1H, m) |
| 3 | 6.75 (1H, dd, 10.0, 15.5) | 1.70 (1H, m) | |
| 4 | 2.45 (1H, dt, 6.5, 10.0) | 35 | 0.95 (3H, t, 7.5) |
| 5 | 3.65 (1H) | 36 | 1.14 (3H, d, 6.5) |
| 6 | 1.75 (1H, m) | 37 | 0.85 (3H, d, 7.0) |
| 7 | 3.94 (1H, d, 8.0) | 38 | 1.45 (1H, m) |
| 8 | 3.62 (1H) | 1.59 (1H, m) | |
| 9 | 3.63 (1H) | 39 | 1.35 (1H, m) |
| 10 | 4.14 (1H, d, 6.5) | 1.55 (1H, m) | |
| 11 | 3.50 (1H) | 40 | 0.88 (3H, t, 7.0) |
| 12 | 41 | 0.98 (3H, d, 6.5) | |
| 13 | 3.78 (1H, broad s) | 42 | 1.25 (1H, m) |
| 14 | 1.85 (1H, m) | 14.5 (1H, m) | |
| 15 | 2.10 (1H, m) | 43 | 3.80 (1H, m) |
| 2.22 (1H, m) | 44 | 1.08 (3H) | |
| 16 | 5.45 (1H, ddd, 3.5, 10.5, 14.5) | 45 | 0.78 (3H, d, 7.0) |
| 17 | 6.01 (1H, dd, 10.0, 14.5) | 46 | 0.93 (3H, d, 7.0) |
| posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] | posición | \deltaH [mult int, J (Hz)] |
| 18 | 6.08 (1H, dd, 10.0, 14.5) | 47 | 0.80 (3H, d, 6.0) |
| 19 | 5.18 (1H, dd, 10.5, 14.5) | 48 | 0.83 (3H, d, 7.0) |
| 20 | 2.35 (1H, dt, 10.0) | 5-OH | |
| 21 | 1.46 (1H, m) | 7-OH | |
| 1.65 (1H, m) | 9-OH | ||
| 22 | 1.02 (1H, m) | 10-OH | |
| 1.60 (1H, m) | 11-OH | ||
| 23 | 3.96 (1H, d, 10.5) | 12-OH | |
| 24 | 1.93 (1H, m) | 13-OH | 4.24 (1H, broad s) |
| 25 | 4.90 (1H, dd, 5.5, 11.5) | 3340H | 3.40 (1H, d, 6.4) |
| 26 | 1.75 (1H) | 4340H | 3.43 (1H, d) |
| 27 | 1' | ||
| 28 | 1.40 (1H, m) | 2' | |
| 1.77 (1H, m) | 3' | ||
| 29 | 1.50 (1H, m) | 4' | |
| 1.65 (1H, m) | |||
| 30 | 1.52 (1H, m) | 5' | |
| 31 | 3.84 (1H, d, 10.0) | 6' | |
| 32 | 1.68 (1H, m) | 4'-OH |
Se tabulan de la manera siguiente los datos de
RMN de ^{13}C para IB-9212 e
IB-96212B:
| posición | IB-96212\delta_{C} | IB-96212B\delta_{C} | posición | IB- 96212\delta_{C} | IB-96212B\delta_{C} |
| 1 | 165.2 | 165.3 | 28 | 33.1 | 32.8 |
| 2 | 122.7 | 122.5 | 29 | 28.8 | 28.8 |
| 3 | 150.7 | 150.7 | 30 | 31.7 | 31.7 |
| 4 | 42.5 | 42.0 | 31 | 74.1 | 74.2 |
| 5 | 80.8 | 80.6 | 32 | 39.9 | 39.9 |
| 6 | 36.4 | 36.5 | 33 | 73.6 | 73.6 |
| 7 | 77.5 | 78.6 | 34 | 28.8 | 28.8 |
| 8 | 83.5 | 74.0 | 35 | 9.7 | 9.7 |
| 9 | 71.6 | 73.0 | 36 | 18.4 | 18.2 |
| 10 | 69.1 | 71.0 | 37 | 4.5 | 4.9 |
| 11 | 70.9 | 72.1 | 38 | 38.0 | 38.4 |
| 12 | 76.7 | 77.5 | 39 | 17.2 | 17.2 |
| 13 | 68.0 | 70.6 | 40 | 15.2 | 15.2 |
| 14 | 34.0 | 34.3 | 41 | 15.0 | 15.1 |
| 15 | 39.2 | 39.2 | 42 | 46.9 | 46.7 |
| 16 | 131.6 | 131.5 | 43 | 65.3 | 65.4 |
| 17 | 133.1 | 133.2 | 44 | 24.8 | 24.8 |
| 18 | 132.1 | 132.3 | 45 | 6.7 | 6.5 |
| 19 | 137.5 | 137.5 | 46 | 12.4 | 12.3 |
| 20 | 41.8 | 41.2 | 47 | 18.2 | 18.1 |
| 21 | 33.1 | 33.1 | 48 | 9.8 | |
| 22 | 32.2 | 31.7 | 1' | 104.4 | |
| 23 | 68.9 | 68.7 | 2' | 31.0 | |
| 24 | 36.7 | 37.0 | 3' | 31.9 | |
| 25 | 76.7 | 76.6 | 4' | 71.4 | |
| 26 | 38.7 | 38.8 | 5' | 77.6 | |
| 27 | 99.1 | 99.1 | 6' | 18.7 |
Inicialmente sobre la base de los datos de las
Figuras 1 a 6, asignamos la estructura ilustrada en nuestra
presentación de patente GB de prioridad, pero haciendo uso de los
datos adicionales de las Figuras posteriores tanto para IB- 96212
como para IB-96212B, llegamos a la estructura de
IB-96212 como sigue:
El sustituyente del azúcar puede ser retirado
mediante hidrólisis para dejar el compuesto
IB-96212B de fórmula:
El azúcar de IB-96212 puede ser
derivatizado de manera convencional, o bien el
IB-96212B puede ser derivatizado de manera
convencional para sustituir el azúcar con otro grupo sustituyente,
obteniendo con ello un compuesto de la fórmula:
donde R puede ser variado como se
desee.
El compuesto IB-96212 presenta
buena actividad antibacteriana contra Micrococcus luteus y
alguna actividad contra Staphylococcus aureus y Bacillus
subtilis pero a concentraciones más altas. La actividad
antimicrobiana del compuesto IB-96212 fue estudiada
incubando cepas seleccionadas con distintas concentraciones de
IB-96212 en medio líquido de
Mueller-Hinton a 35ºC.
Los compuestos IB-96212 e
IB-96212B despliegan buena actividad antitumoral
contra varias líneas de células cancerosas de mamífero. La actividad
antitumoral ha sido detectada in vitro cultivando las
células tumorales siguiendo la metodología descrita por Bergeron et
al. (2) y por Schroeder et al. (6). Ha sido observada actividad
contra varios tumores humanos tales como la leucemia, el carcinoma
de colon, el carcinoma de pulmón no células pequeñas, el melanoma y
tumores similares.
Algunos tumores eran más sensitivos que otros.
Por ejemplo, se comprobó que las células de leucemia y las células
de leucemia resistentes a drogas múltiples eran al menos 100 veces
más sensitivas que el carcinoma de colon.
La actividad in vivo fue también valorada
en grupos de ratones hembra con P388, mediante inyección cada día
de los días 1 a 5, habiendo sido obtenidos los siguientes
resultados que están indicados en la Tabla 4.
| mg/kg total | peso corporal | variación del peso | día de la muerte | tiempo de supervivencia | |||
| dosis inyec. | total | día 0 | día 5 | ||||
| IB-96212 | 0.02 | 0.1 | 21.6\pm0.5 | 22.6\pm0.5 | 0.8 | 2,6,10,10,13 | 8.2\pm3.8 |
| IB-96212 | 0.01 | 0.05 | 20.6\pm1.0 | 21.7\pm0.7 | 1.1 | 9,11,13,13,14 | 12.0\pm1.8 |
| IB-96212 | 0.005 | 0.025 | 22.0\pm1.2 | 22.9\pm0.6 | 0.8 | 10,10,11,11,13 | 11.0\pm1.1 |
| POS | 21.0\pm1.2 | 21.4\pm1.1 | 0.5 | 8,8,8,8,8,9,9,9 | 8.4\pm0.5 |
La presente invención se refiere también a
preparaciones farmacéuticas que contienen como ingrediente activo
compuesto IB-96212 o IB-96212B u
otro derivado de la fórmula general indicada, así como a los
procesos para su preparación.
Los ejemplos de composiciones farmacéuticas
incluyen cualesquiera formas sólidas (tabletas, píldoras, cápsulas,
gránulos, etc.) o líquidas (soluciones, suspensiones o emulsiones)
que tengan una composición adecuada para la administración oral,
tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro, o las
composiciones pueden tener que ser estériles cuando sean
administradas por vía parenteral.
La dosificación correcta de una composición
farmacéutica de IB-96212, IB- 96212B o un derivado
variará según la formulación concreta, el modo de aplicación y el
situs, el huésped y el tumor que en concreto se traten. Deberán ser
tomados en consideración otros factores tales como la edad, el peso
corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la
velocidad de excreción, el estado del huésped, las combinaciones de
drogas, las sensitividades reactivas y la gravedad de la
enfermedad. La administración puede ser llevada a cabo de manera
continua o periódica dentro de la dosis máxima tolerada.
Se ilustra a continuación más ampliamente la
presente invención haciendo referencia a los ejemplos siguientes,
que servirán de ayuda para comprender la presente invención pero no
deberán ser interpretados como limitaciones de la misma. A no ser
que se especifique lo contrario, todos los porcentajes aquí
indicados son porcentajes en peso. Todas las temperaturas son
expresadas en grados Celsius. Todas las incubaciones son efectuadas
a 28ºC, y los matraces son sacudidos en un sacudidor orbital. Todos
los medios y recipientes son estériles, y todos los procesos de
cultivo son asépticos.
Cultivo Madre: Se conserva congelado en glicerol
al 20% caldo entero de un cultivo puro de Micromonospora sp.
ES25-008.
Inóculo: Es usado un cultivo congelado o un
cultivo inclinado en avanzado crecimiento (5% volumétrico) para
sembrar 100 ml de medio de siembra anteriormente descrito contenido
en un matraz de sacudimiento de 250 cm^{3}. El matraz es incubado
durante 48 horas. 500 ml del mismo medio en matraz Erlenmeyer de 2 l
son sembrados con un 10% del inóculo de la primera etapa. El matraz
es incubado durante 48 horas.
Fermentación: Con 2,5 l de inóculo de la segunda
etapa se siembran 50 l de medio de producción ya descrito en un
tanque de fermentación de 17 l. La fermentación es efectuada
durante 96 horas con agitación a 400 rpm y un caudal de aire de 0,5
V/V.M. Se verifica la producción de metabolito secundario mediante
análisis del caldo entero contra P-388 o por
HPLC.
Aislamiento: 10 l de caldo entero recolectado
fueron filtrados para separar la biomasa y otros sólidos. La torta
de micelios fue sometida a extracción dos veces con un disolvente
mixto (2,4 l) de CHCl_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (2:1:1), quedando
la actividad concentrada en la capa inferior. El disolvente
orgánico fue concentrado y evaporado hasta la sequedad in
vacuo, habiendo sido así obtenidos 450 mg de extracto bruto.
El extracto fue sometido a cromatografía sobre
gel de sílice usando como disolvente eluyente una mezcla de hexano
y acetato de etilo. Fueron eluídos con hexano/acetato de etilo
30:70 44 mg de una fracción con actividad antitumoral. Se logró una
purificación adicional mediante cromatografía en columna sobre gel
de sílice, y la actividad fue eluída con cloroformo/metanol 92:8,
habiendo sido así obtenidos 19 mg de sustancia seca. La última
purificación fue efectuada mediante cromatografía en columna sobre
fase invertida C18 usando metanol/agua 90:10 como disolvente
eluyente, habiendo sido así obtenidos 12 mg de
IB-96212 puro.
Hidrólisis para la conversión en
IB-96212B: 31 mg de IB-96212 fueron
disueltos en 3 ml de CHCl_{3}:CH_{3}OH 1:1 y fueron añadidos a
10ml de una solución al 15% de H_{2}SO_{4}, y la mezcla fue
mantenida en reflujo por espacio de 3 horas. La mezcla de reacción
fue diluida con 15 ml de agua y fue sometida a extracción dos veces
con 25 ml de CHCl_{3}, para obtener 30 mg de producto de reacción
que fue analizado por cromatografía sobre gel de sílice y eluído
con CHCl_{3}:CH_{3}OH 96:4. Como producto de la hidrólisis
fueron obtenidos 20 mg de la aglicona.
Actividad biológica: Las células empleadas para
los experimentos de la actividad antitumoral fueron
P-388 (cultivo en suspensión de un neoplasma
linfoide de ratón DBA/2) A-549 (cultivo monocapa de
un carcinoma de pulmón macrocítico humano), HT-29
(cultivo monocapa de un carcinoma de colon humano) y
MEL-28 (cultivo monocapa de un melanoma humano) y
las otras líneas celulares indicadas.
Fueron sembradas células P-388 en
cavidades de 16 mm a razón de 1x10^{4} células por cavidad en
partes alícuotas de 1ml de MEM 5FCS que contenía la concentración
de droga indicada. Los de un conjunto aparte de cultivos sin droga
fueron sembrados como control del crecimiento para asegurar que las
células permaneciesen en la fase exponencial de crecimiento. Todas
las determinaciones fueron efectuadas por duplicado. Después de tres
días de incubación a 37º en atmósfera de CO_{2} al 10% con una
humedad de un 98%, las cavidades fueron coloreadas con violeta
cristal al 0,1%. La IC50 fue calculada comparando el crecimiento en
las cavidades con droga con el crecimiento en las cavidades de
control sin la droga.
En la Tabla 5 están indicadas las actividades
expresadas como IC50 en mcg/ml
| Compuesto | P-388 | P388MDR | MIEL8226 | A-549 | HT-29 | MEL-28 | CV1 |
| IB-96212 | 0.0001 | 0.001 | 0.005 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 0.0002 |
| IB-96212B | 0.001 | 1 | 1.2 | 1 | 0.001 | ||
| cisplatino | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 5 | 2.5 | ||
| adriamicina | 0.02 | 1 | 0.002 | 0.05 | 0.02 | ||
| taxol | 0.2 | >2 | 0.002 | 0.002 | 0.002 | ||
| etopósido | 0.1 | 10 | 0.1 | 1 | 0.5 |
La actividad antimicrobiana del compuesto
IB-96212 fue estudiada incubando los
microorganismos sometidos a ensayo con IB-96212 en
medio líquido de Mueller- Hinton a 35ºC. La MIC fue determinada
mediante la aparición de turbidez en el medio de incubación tras 24
horas de incubación con IB-96212. En la Tabla 6
están indicados estos resultados. El IB-96212
presenta actividad bactericida contra bacterias grampositivas.
| Microorganismo | MIC(\mug/ml) |
| Escherichia coli | >100 |
| Klebsiella pneumoniae | >100 |
| Pseudomonas aeruginosa | >100 |
| Staphylococcus aureus | 100 |
| Bacillus subtilis | 100 |
| Micrococcus luteus | 0.4 |
Han sido citadas en la presente las referencias
siguientes:
- (1)
- American Type Culture Catalog 17th edition 1989. Rockville, Md. U.S.A.
- (2)
- Bergeron, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 121:848, 1984
- (3)
- Guerrant G. O., and C. W. Moss, Anal. Chem. 56:633, 1984
- (4)
- Lechevalier M. P., et al. J. Bacteriol. 105:313, 1971
- (5)
- Luedernann G. M. Personal Communication
- (6)
- Schroeder, et al., J. Med. Chem., 24:1078, 1981
- (7)
- Shirling B. E., and D. Goblieb. Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313, 1966
- (8)
- Van der Auwera et al. J. Microbiol. Methods 4:265, 1986
- (9)
- Waksman, S. A. The Actinomycetcs vol. II: 331, 1961
La presente invención ha sido descrita en
detalle, incluyendo las realizaciones preferidas de la misma. Sin
embargo, se comprenderá que tomando en consideración la presente
descripción los expertos en la materia pueden incorporar
modificaciones y/o mejoramientos.
Claims (13)
1. Compuesto de la fórmula general:
donde R es hidrógeno o un grupo
sustituyente.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que
R es hidrógeno o un grupo seleccionado de entre los miembros del
grupo que consta de un grupo sacárido, un grupo hidrocarbilo, un
grupo acilo o un grupo heterociclilo.
3. Compuesto según la reivindicación 1, que es el
compuesto al que aquí se denomina IB-96212 y tiene
la estructura siguiente:
o el compuesto al que aquí se denomina
IB-96212B, y que tiene la estructura
siguiente:
4. El compuesto al que aquí se denomina
IB-96212 según la reivindicación 1, donde:
la Figura 1 es un cromatograma de HPLC de
IB-96212 purificado;
la Figura 2 es un espectro ultravioleta (UV) de
IB-96212 purificado;
la Figura 3 es un espectro infrarrojo (IR) de
IB-96212 purificado;
la Figura 4 es un espectro de RMN protónica (de
1H) de IB-96212 purificado;
la Figura 5 es un espectro de RMN de
carbono-13 (13C) de IB-96212
purificado; y
la Figura 6 es un espectro de masa de
IB-96212 purificado.
5. Proceso que es para producir el compuesto
IB-96212 según la reivindicación 3 ó 4 y comprende
el paso de cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir
el compuesto IB-96212 en un medio nutritivo acuoso
bajo condiciones controladas.
6. El proceso de la reivindicación 5, que
comprende además los pasos de aislar y purificar el compuesto
IB-96212 a partir del caldo de cultivo.
7. El proceso de la reivindicación 5 ó 6, en el
que el microorganismo productor de IB-96212 es la
cepa de cultivo ES25-008 que está depositada en la
Colección Española de Cultivos Tipo con el número de registro de
entrada CECT- 3333.
8. Proceso que es para producir el compuesto
IB-96212B de la reivindicación 3 y comprende la
hidrólisis del compuesto IB-96212 de la
reivindicación 3.
9. Proceso para producir un compuesto según la
reivindicación 1 en el cual R no es hidrógeno, comprendiendo dicho
proceso la derivatización del compuesto de la reivindicación 1 en
el que R es hidrógeno.
10. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cánceres de
mamífero sensibles al compuesto.
11. Composición farmacéutica que comprende un
compuesto según la reivindicación 1.
12. Composición farmacéutica antitumoral que
comprende el compuesto IB- 96212 o IB-96212B en una
cantidad eficaz contra uno o varios tumores de mamífero.
\newpage
13. La cepa Micromonospora sp.
ES25-008 que ha sido depositada con el número de
registro de entrada CECT-3333.
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