ES2203072T3

ES2203072T3 - Composiciones farmaceuticas que comprenden peg-asparaginasa para el tratamiento de infecciones por vih.

Info

Publication number: ES2203072T3
Application number: ES99906749T
Authority: ES
Inventors: Vassilios I. Avramis; Lewis Cohen
Original assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-02-09
Filing date: 1999-02-09
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2019-02-09
Also published as: DE69909747T2; DK1053012T3; EP1053012B1; CA2319356A1; ZA991029B; DE69909747D1; AU752434B2; ATE245444T1; WO1999039732A1; JP2002502826A; EP1053012A1; AU2658499A

Abstract

El uso de un compuesto de PEG-ASNasa junto con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de proteasa, compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, en el que dichos compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido son seleccionados entre hidroxiurea (HU), BW-348U87, tiosemicarbazona de 3-aminopiridina-2-carboxaldehído (3- AP), Amidox (VF 236; NSC-343341; N, 3, 4- trihidroxibencencarboximidamida), BILD 1257 (2-bencil-3- fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4, N4- tetrametilen) asparaginil-L-(3, 3-tetrametilen) aspartil-L- (4-metil)leucina), BILD 1357 (1-[1(R)-etil-2, 2- dimetilpropilamida] de ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N- metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4, N4- tetrametilen)asparaginil-L-(3, 3-tetrametilen)aspártico), BILD 1633, BILD 733 (3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3- metil)valil-L- [3-(pirrolidin-1- ilcaronil)]alanil-L- (1- carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil) leucinol, BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3- (metil)valil-L-(N4, N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3, 3- tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)- [5(S)- [3-[todo-cis) -2, 6- dimetilciclohexil] ureido]- 2(S)-(3, 3-dimetil-2-oxobutil)- 6, 6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2, 2- dimetilpropilcarbamol]metil] ciclopentanocarboxílico), Cl-F- araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabino furanosil) adenina, DDFC (2¿-desoxi-2¿, 2¿- difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360; N, 3, 4- trihidroxibenzamida), Eurd (3¿-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N¿- aminoguanina), LY 207702 (2¿, 2¿-difluoro-2¿-desoxi ribofuranosil-2, 6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3, 4- diclorofenil)amino]carbonil]2, 3-dihidro-5- benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2¿- desoxi-2¿-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil) amino]carbonil]-2, 3-dihidro-IH- inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3¿-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N, 3-4, 5- tetrahidroxibencen carboximidamida), en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas al medicamento.

Description

Composiciones farmacéuticas que comprenden PEG-Asparaginasa para el tratamiento del VIH.

Campo de la invención

La invención está dirigida al uso de una composición farmacéutica que comprende un compuesto PEG-ASNasa y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de proteasa, determinados compuestos ribonucleótidos inhibidores de reductasa y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, y un vehículo aceptable farmacéuticamente para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH).

El Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) es un retrovirus y es el agente de la enfermedad compleja que incluye la destrucción progresiva del sistema inmune (síndrome de inmunodeficiencia adquirida; SIDA) y la degeneración del sistema nervioso central y periférico. Este retrovirus era conocido previamente como LAV, HTLV-III, o ARV. Ha habido diversas terapias para tratar la infección por VIH, incluyendo terapias en combinación con regímenes de fármacos. Los compuestos inhibidores de proteasa en combinación con compuestos inhibidores de transcriptasa inversa (RT, del inglés "Reverse Transcriptasa") han tenido éxito tanto in vitro como in vivo en pacientes infectados con el virus. Los compuestos inhibidores de proteasa interfieren con la producción de nuevos virus infecciosos. Una característica común de la replicación del retrovirus del VIH es el procesado post-translacional de poliproteínas precursoras mediante una proteasa codificada víricamente para generar las proteínas víricas maduras requeridas para la formación y la función de los virus. La inhibición de este procesado evita la producción de nuevos virus infecciosos.

La inhibición de la proteasa de VIH por inhibidores de proteasa puede impedir la integración de linfocitos T infectados durante la primera fase del ciclo vital del VIH-1, así como inhibir el procesado proteolítico del virus durante su etapa final. Los inhibidores de proteasa de VIH han sido revisados de forma amplia (A. Tomasselli y col., Chimica Oggi, 6-27 20 (1991) y T. Meek, J. Enzyme Inhibition 6: 65-98 (1992)). De forma rutinaria, la replicación retrovírica presenta un procesado post-translacional de poliproteínas. Este procesado se lleva a cabo mediante enzimas de proteasa de HTV codificadas víricamente. Este proceso post-translacional da como resultado polipéptidos maduros que posteriormente ayudarán en la formación y en la función de virus infecciosos. Si este procesado molecular es inhibido, entonces la producción normal de VIH se interrumpe. Por lo tanto, se ha descubierto que los inhibidores de proteasa de VIH pueden funcionar como agentes víricos anti-VIH.

Los retrovirus están ampliamente extendidos en vertebrados y son conocidos por causar una variedad de enfermedades en el hombre y en animales, incluyendo el VIH, leucemias y linfomas. Toda la familia de retrovirus se caracteriza por la presencia de una única enzima, la transcriptasa inversa (RT), que transcribe el ARN genómico del virus en una copia de ADN de cadena doble. Por lo tanto, se están dirigiendo considerables esfuerzos hacia el control del VIH por medio de la inhibición de la transcriptasa inversa de VIH, requerida para la replicación del virus. (V. Merluzzi y col., "Inhibition of the HIV-1 Replication by a Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor", Science, 25, 1411 (1990)). Por ejemplo, un compuesto terapéutico usado actualmente, el AZT, es un inhibidor de la transcriptasa inversa del virus (Patente de EE.UU. Nº 4 724 232). Desafortunadamente, muchos de estos compuestos sufren problemas de toxicidad, falta de biodisponibilidad o tienen una vida in vivo demasiado corta, resistencia vírica, o combinaciones de ellos.

También se conoce que la inhibición de transcriptasa inversa de VIH (en inglés, HIV-RT) por combinaciones de fármacos análogos a nucleósidos indica que no pueden inhibir por sí solos la función RT por completo, sino que en vez de eso pueden conducir a la aparición de cepas víricas resistentes al fármaco. Estas cepas de mutantes de fuga repueblan y hacen que la terapia de análogos de nucleósido no sea eficaz. La adición de compuestos inhibidores de proteasa a terapias de combinación de análogos de nucleósidos ha ayudado a reducir la carga vírica durante un periodo de tiempo prolongado.

La reductasa de ribonucleótidos es una enzima regulada alostéricamente que convierte los difosfatos de nucleósido en sus correspondientes difosfatos desoxinucleósidos a través de un mecanismo regulador complejo que incluye una o varias rutas de transferencia de electrones. (Holmgren A. Hydrogen donor system for E. Coli Ribonucleoside diphosphate reductase dependent upon glutathione, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1976, 73, 2275-9; Therlander L., Reductase of Ribonucleotides, Ann. Rev. Biochem. 1979, 46, 133-58; Ashley G. W., Stubbe, J., Current ideas on the chemical mechanism of ribonucleotide reductase, Pharmac. Ther. 1985, 30, 301-29; Stubbe J., Ribonucleotide Reductase: Amazing and confusing, J. Biol. Chem. 1990, 265, 5329-32). La reducción del ribonucleótido mediante reductasa de ribonucleótido permite a las polimerasas de ADN utilizar los desoxiribonucleótidos (dNTPs) durante el proceso de replicación de ADN. La actividad de la reductasa de ribonucleótido está bien coordinada con el proceso de proliferación celular y se ve marcadamente incrementada en la fase final G1 y en la fase inicial S cuando tiene lugar la síntesis de ADN en masa. (Corey J. G., Whitford Jr., T. W., Ribonucleotide reductase and DNA synthesis in Ehrlich ascites tumor cancer cells, Cancer Res., 1972, 32, 1301-6; Hammerstan E., Reichard P., Saluste E., Pyrimidine nucleosides as precursors of pyrimidines in polynucleotides, J. Biol. Chem., 1950, 183, 105-109). El importante papel de la reductasa de ribonucleótido en la síntesis de ADN la convierte en un objetivo de los agentes quemoterapéuticos. Recientemente se ha descubierto una de clase de 2-hidroxi-1H-isoindol-1,3-diona (HISID) que ha demostrado tener actividad inhibidora de la reductasa de ribonucleótido (Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Acta Oncológica, 33, 8, 953-61, 1994; Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Rec. Adv. Chemoth 1: 995-996, 1994; Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5: 664-679).

La PEG-asparaginasa (la forma de polietileno glicosilado del E. coli-ASP) ha demostrado ser útil como agente quemoterapéutico. En particular, se ha descubierto que la PEG-aspariginasa es una preparación alternativa con una vida media de circulación más larga que el E. coli L-asparaginasa y ha sido útil en la quemoterapia multiagente para la leucemia linfoblástica aguda infantil. (Ettinger L. J., Ettinger A. G., Avramis V. I., Gaynon P. S., BioDrugs, 7, 1, 30-39, 1997). También, la PEG-ASNasa puede incrementar el efecto antileucémico en la recaída de CNS aislado. (Malgolowkin M., Ortega S., Carcich D. A., Steele D., Tischer D., Franklin J., Nandy P., Periclou A., Cohen L. J., Avramis V. I., Proceedings of ASCO, 17, 1998).

La PEG-ASNasa es un conjugado de asparaginasa con polietilenglicol. Esta conjugación se produce a través de pegilación, un proceso en el que los polipéptidos, tales como las enzimas o las hormonas, se acoplan a polietilénglicol de tal forma que se produce una composición de polipéptidos soluble en agua no inmunogénica activa fisiológicamente. El polietilénglicol protege al polipéptido frente a la pérdida de actividad y la composición puede ser inyectada en el sistema circulatorio de un mamífero con una respuesta sustancialmente no inmunogénica. El proceso de pegilación se describe en detalle en la Patente de EE.UU. Nº 4 179 337, titulada "Non-Immunogenic Polypeptide", presentada el 28 de Julio de 1997, y publicada el 18 de Diciembre de 1979, que se incorpora aquí al completo como referencia. El enlace covalente entre el polímero y el péptido se ve afectado a menudo haciendo reaccionar derivados de PEG-succinimida con grupos amino sobre el exterior de las moléculas de proteína. También se describen otros métodos en la Patente de EE.UU. Nº 4 179 337, en Pollack y col., JACS, 98, 289 (1976), en la Patente de EE.UU. Nº 4 847 325 y en cualquier otro dentro de la técnica.

Sumario de la invención

Los solicitantes han descubierto que la PEG-asparaginasa (PEG-ASNasa) funciona eficazmente por sí sola y sinérgicamente funciona en combinación con uno o más de los siguientes, compuestos inhibidores de proteasa, compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, o determinados compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido, para tratar la infección de VIH.

Por consiguiente, en su aspecto principal, la invención está dirigida a un uso de un compuesto de PEG-ASNasa y de al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: compuestos inhibidores de proteasa, determinados compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, como se establece en la Reivindicación 1.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la inhibición de RT de VIH en células T CEM/0 (\pm PHA) tratadas sólo con concentraciones IC_{50} de PEG-ASNasa o sólo con Saquinavir (SAQ) o con una combinación.

La Figura 2 representa la citotoxicidad de Saquinavir sobre células T (CEM/0), después de 72 horas, para diferentes concentraciones de fármaco.

La Figura 3 representa la citotoxicidad sobre células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir por sí solos, y en una combinación secuencial (PEG-ASNasa seguida de Saquinavir), para diferentes concentraciones de fármaco.

La Figura 4 representa la citotoxicidad sobre células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir por sí solos, y en una combinación secuencial (Saquinavir seguido de PEG-ASNasa), para diferentes concentraciones de fármaco.

La Figura 5 representa la citotoxicidad sobre células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir por sí solos, y en combinación simultánea, para diferentes concentraciones de fármaco.

La Figura 6 representa el sinergismo sobre células T de la PEG-ASNasa y del Saquinavir en combinación simultánea para diferentes concentraciones de fármaco.

La Figura 7 representa el índice de combinación (IC) en CEM/0 de la combinación secuencial de Saquinavir seguido de PGE-ASNasa, y de la combinación secuencial de PEG-ASNasa seguida de Saquinavir, y de la combinación simultánea de PEG-ASNasa y Saquinavir.

La Figura 8 representa el agotamiento de las concentraciones de Asparagina, Glutamina y ácido Aspártico en células T CEM/0 tras exposición a diferentes concentraciones de PEG-ASNasa durante 24 horas.

La Figura 8a una curva de calibrado de la densidad óptica (DO) de diferentes concentraciones de HTV-1 RT.

La Figura 9 representa el número de copias de ARN de VIH por pelets de células tras exposición de las células a PEG-ASNasa y Saquinavir por sí solos y en combinación.

La Figura 9a representa el Log_{10} del número de copias de ARN de VIH por pelets de células tras exposición de las células a PEG-ASNasa y Saquinavir por sí solos y en combinación.

La Figura 10 representa las curvas de calibrado para el ensayo Elisa de RT de VIH.

La Figura 11 representa el ensayo cuantitativo de ARN de VIH-1 de células T CEM tratadas con regímenes sencillos de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y MISID, y con regímenes combinados de Saquinavir y PEG-ASNasa, AZT, Saquinavir y PEG-ASNasa, y MISID, AZT, Saquinavir y PEG-ASNasa.

Descripción detallada de la invención

Como se han usado anteriormente, y a lo largo de la descripción de la invención, deberá entenderse que los siguientes términos, a no ser que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados:

"Análogo" significa un compuesto que comprende una forma químicamente modificada de un compuesto específico o de una clase suya, y que mantiene las actividades farmacéutica y/o farmacológica características de dicho compuesto o clase.

"Carboxi" significa un grupo HO(O)C- (ácido carboxílico).

"Compuestos de la invención", y expresiones equivalentes, están dirigidas a abarcar compuestos de la invención como los descritos aquí con anterioridad, expresión que incluye los profármacos, las sales farmacéuticamente aceptables, y los solvatos, por ejemplo hidratos, donde el contexto lo permita. Del mismo modo, las referencias a intermedios, tanto si ellos por sí mismos están reivindicados o no, están dirigidas a abarcar sus sales, y solvatos, donde el contexto lo permita. En aras de la claridad, de vez en cuando se indican en el texto ejemplos particulares cuando el contexto lo permita, pero estos ejemplos son puramente ilustrativos y no se pretende que excluyan otros ejemplos cuando el contexto lo permita.

"Derivado" significa un compuesto modificado químicamente en el que la modificación se considera rutinaria para el químico con conocimientos ordinarios en la técnica, tales como un éster o una amida de un ácido, grupos protectores, tales como el grupo bencilo para un alcohol o para un tilo, y como el grupo terc-butoxicarbonilo para una amina.

"Cantidad efectiva" significa una cantidad de un compuesto/composición de acuerdo con la presente invención efectiva para producir el efecto terapéutico deseado.

"Formulaciones adecuadas para administración nasal o por inhalación" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas a un paciente nasalmente o por inhalación. La formulación puede contener un vehículo, en forma de polvo, que tiene un tamaño de partícula por ejemplo en el intervalo de 1 a 500 micrómetros (incluyendo los tamaños de partícula en un intervalo entre 20 y 500 micrómetros en incrementos de 5 micrómetros tal como 30 micrómetros, 35 micrómetros, etc.). Las formulaciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para la administración en la forma de, por ejemplo, un spray nasal o una gotas nasales, incluyen disoluciones acuosas o aceitosas del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración en aerosol pueden ser preparadas de acuerdo con los métodos convencionales y puede ser suministradas junto con otros agentes terapéuticos. La terapia por inhalación es fácilmente administrada mediante inhaladores de dosis medida.

"Formulaciones adecuadas para la administración oral" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas oralmente a un paciente. Las formulaciones pueden ser presentadas como unidades discretas tales como cápsulas, caches o pastillas cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un polvo o gránulos; en disolución o en una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida aceite en agua o una emulsión líquida agua en aceite. El ingrediente activo también puede presentarse como un bolo, un electuario o una pasta.

"Formulaciones adecuadas para la administración parenteral" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas parenteralmente a un paciente. Las formulaciones son estériles e incluyen emulsiones, suspensiones, disoluciones de inyección acuosas y no acuosas, que pueden contener agentes suspendedores y agentes espesantes y antioxidantes, tampones, bacteriostats y solutos que hacen isotónica a la formulación, y que tienen un pH adecuadamente ajustado, con la sangre del recipiente pretendido.

"Formulaciones adecuadas para administraciones rectales" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas rectalmente a un paciente. Preferiblemente, la formulación está en la forma de supositorios que pueden ser preparados mezclando los compuestos útiles de acuerdo con esta invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilénglicol o una cera de supositorio, que son sólidos a las temperaturas ordinarias pero líquidos a la temperatura del cuerpo y, por lo tanto, se funden en la cavidad rectal o vaginal y liberan su componente activo.

"Formulaciones adecuadas para la administración sistémica" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas sistémicamente a un paciente. Preferiblemente, la formulación se administra por inyección, que incluye transmuscular, intravenosa, intraperitoneal, y subcutánea. Para la inyección, los compuestos útiles de acuerdo con la invención se formulan en disoluciones líquidas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la disolución de Hank o la disolución de Ringer. Además, los compuestos pueden estar formulados en forma sólida y ser redisueltos o suspendidos inmediatamente antes de su uso. También se incluyen las formas liofilizadas. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdermales, o los compuestos pueden ser administrados oralmente. Para la administración transmucosal o transdermal, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que han de permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, sales de bilis y derivados de ácido fusídico para la administración transmucosal. Además, se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La administración transmucosal puede ser a través del uso de sprays nasales, por ejemplo, o de supositorios. Para la administración oral, los compuestos son formulados en las formas convencionales para la administración oral tales como cápsulas, pastillas, y tónicos.

"Las formulaciones adecuadas para administración tópica" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas tópicamente a un paciente. La formulación puede ser presentada como un ungüento tópico, pomadas, polvos, sprays e inhalantes, geles (basados en agua o en alcohol), cremas, como se conoce generalmente en la técnica, o puede estar incorporada en una matriz base para la aplicación en un parche, que permitiría una liberación controlada del compuesto a través de la barrera transdermal. Si se formulan como un ungüento, los ingredientes activos pueden ser empleados tanto con una base ungüento parafínica como con una miscible con agua. Alternativamente, los ingredientes activos pueden ser formulados en una crema con una base de crema aceite en agua. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo incluyen gotas de ojo en las que el ingrediente activo se disuelve y se suspende en un vehículo apropiado, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base con sabor, usualmente sacarosa o acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.

"Formulaciones adecuadas para la administración vaginal" significa formulaciones que están en una forma adecuada para ser administradas vaginalmente a una paciente. La formulación puede presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en spray que contienen además del ingrediente activo vehículos tales como los conocidos en la técnica por ser apropiados.

"Forma de dosis líquida" significa que la dosis de compuesto activo a administrar al paciente está en forma líquida, por ejemplo, emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosis líquida pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes solubilizadores y emulgentes, como por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, en particular, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán o mezclas de estas sustancias, y otros parecidos.

"Paciente" incluye tanto humanos como otros mamíferos.

"PEG-ASNasa" significa el compuesto inhibidor de la síntesis de proteína, asparaginasa, conjugado con polietilénglicol (PEG). Preferiblemente, el polietilénglicol tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 1000 y 100000 daltons, más preferiblemente entre 4000 y 40000 daltons, dependiendo, por ejemplo, del peso molecular del compuesto inhibidor de la síntesis de proteína empleado en particular. Puesto que el objetivo de la modificación es obtener una proteína conjugada con actividad biológica retenida, con una vida media in vivo incrementada en comparación con el compuesto inhibidor de la síntesis de proteína sin conjugar, y con una inmunogenicidad reducida, el peso molecular del polímero se elegirá para optimizar estas condiciones. Preferiblemente, el homopolímero PEG está sustituido en un extremo con un grupo alquilo pero también puede estar sin sustituir. Preferiblemente el grupo alquilo es un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, y más preferiblemente un grupo metilo. Preferiblemente, el polímero es un homopolímero de PEG sustituido con un metilo y tiene un peso molecular de aproximadamente 4000 a 40000 daltons. Más preferiblemente, la PEG-ASNnasa es un compuesto vendido bajo el nombre de ONCASPAR por Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer.

"Composición farmacéutica" significa una composición que comprende un compuesto de la invención y al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en portadores, diluyentes, adyuvantes, excipientes, o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes conservantes, rellenos, agentes desintegrantes, agentes de mojado, agentes emulgentes, agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes de sabor, agentes de perfume, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes lubricantes y agentes dispersantes, dependiendo de la naturaleza del modo de administración y de las formas de dosis. Ejemplos de agentes de suspensión incluyen alcoholes isostearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar agar y tragacanto, o mezclas de estas sustancias. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y otros parecidos. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y otros parecidos. Se puede provocar la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable por el uso de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos aceptables incluyen agua, etanol, polioles, mezclas suyas adecuadas, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Ejemplos de excipientes incluyen lactosa, azúcar de leche, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de dicalcio. Ejemplos de agentes desintegrantes incluyen almindón, ácidos algínicos y determinados silicatos compuestos. Ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio, talco, así como polietilenglicoles de alto peso molecular.

\newpage

"Farmacéuticamente aceptable" significa que es, dentro del alcance del juicio médico, adecuado para uso en contacto con las células de humanos y animales inferiores sin una toxicidad, una irritación, una respuesta alérgica y otros parecidos no justificados, y están de acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

"Formas de dosis farmacéuticamente aceptables" significa formas de dosis del compuesto de la invención, e incluye, por ejemplo, pastillas, polvos, elixires, jarabes, preparaciones líquidas, que incluyen suspensiones, sprays, pastillas para inhalación, lozenges, emulsiones disoluciones, gránulos, cápsulas y supositorios, así como preparaciones líquidas para inyecciones, que incluyen preparaciones de liposomas. De forma general, las técnicas y las formulaciones pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

"Profármacos farmacéuticamente aceptables" como se usa aquí significa aquellos profármacos de los compuestos útiles de acuerdo con la invención que son, dentro del alcance del juicio médico, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin una toxicidad, una irritación, una respuesta alérgica, y otros parecidos sin justificar, acordes con una relación beneficio/riesgo razonable, y eficaces para el uso que les pretende, así como de las formas zwitteriónicas, si es posible, de los compuestos de la invención. El término "profármaco" significa compuestos que se transforman fácilmente in vivo para dar lugar el compuesto padre de la invención, por ejemplo por hidrólisis en la sangre. Los grupos funcionales que pueden ser transformados in vivo fácilmente, mediante ruptura metabólica, forman una clase de grupos reactiva frente al grupo carbonilo de los compuestos de esta invención. Incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como alcanoilos (tal como acetilo, propionilo, butirilo, y otros parecidos), aroilos sustituidos y sin sustituir (tales como benzoilo y benzoilo sustituido), alcoxicarbonilos (tales como etoxicarbonilo), trialquilsililos (tales como trimetil y trietilsililo), monoésteres formados con ácidos dicarboxílicos (tales como succinilo), y otros parecidos. Debido a la facilidad con la que se rompen in vivo los grupos metabólicamente rompibles de los compuestos útiles según esta invención, los compuestos que portan dichos grupos actúan como profármacos. Los compuestos que portan los grupos metabólicamente rompibles tienen la ventaja de que pueden presentar una biodisponibilidad mejorada como resultado de una mayor solubilidad y/o de una mayor velocidad de absorción conferida al compuesto padre en virtud de la presencia del grupo metabólicamente rompible. Las siguientes referencias proporcionan una profunda discusión sobre profármacos: Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed. Elsevier, 1985; Methods in Enzymology, K. Widder y col., ed. Academic Press, 42, p. 309-396, 1985; A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen y H. Bundgaard, ed. Chapter 5; "Design and Applications of Prodrugs" p. 113-191, 1991; Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgaard, 8, p. 1-38, 1992; Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, p. 285, 1988; Chem. Pharm. Bull., N. Nakeya y col., 32, p. 692, 1984; Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi y V. Stella, Vol. 14 de la A.C.S. Symposium Series, y Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Roche, ed. American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987, que se incorporan aquí como referencia.

"Sales farmacéuticamente aceptables" significa las sales ácidas de adición o las sales básicas de adición inorgánicas y orgánicas relativamente no tóxicas, de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden ser preparadas in situ durante el aislamiento y la purificación final de los compuestos. En particular, las sales ácidas de adición pueden ser preparadas haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y aislando la sal formada de ese modo. Sales ácidas de adición ejemplares incluyen las sales de hidrobromuro, de hidrocloruro, de sulfato, de bisulfato, de fosfato, de nitrato, de acetato, de oxalato, de valerato, de oleato, de palmitato, de estearato, de laurato, de borato, de benzoato, de lactato, de fosfato, de tosilato, de citrato, de maleato, de fumarato, de succinato, de tartrato, de naftilato, de mesilato, de glucoheptonato, de lactiobionato, de sulfamatos, de malonatos, de salicilatos, de propionatos, de metilen-bis-b-hidroxinaftoatos, de gentisatos, de isetionatos, de di-p-toluoiltartratos, demetanosulfonatos, de etanosulfonatos, de bencenosulfonatos, de p-toluensulfonatos, de ciclohexilsulfamatos y de quinateslaurilsulfonato, y otras parecidas. (Véase, por ejemplo, S. M. Berge y col., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66: p. 1-19 (1997) que se incorpora aquí como referencia). Las sales de adición básicas también pueden ser preparadas haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma ácida con una base orgánica o inorgánica adecuada y aislando la sal formada de ese modo. Las sales de adición básicas incluyen sales metálicas y de amina farmacéuticamente aceptables. Las sales metálicas adecuadas incluyen las sales de sodio, de potasio, de calcio, de bario, de cinc, de magnesio y de aluminio. Se prefieren las sales de sodio y de potasio. Las sales de adición básicas inorgánicas adecuadas se preparan a partir de bases metálicas que incluyen hidruro de sodio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de cinc. Las sales de adición básicas de amina adecuadas se preparan a partir de aminas que tienen una basicidad suficiente para formar una sal estable, y preferiblemente incluyen aquellas aminas que se usan frecuentemente en la química de la medicina debido a su baja toxicidad y a su aceptabilidad para el uso médico, amoníaco, etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, omitina, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperacina, tris(hidroximetil)-aminometano, hidróxido de tetrametilamonio, trietilamina, dibencilamina, efenamina, dehidroabietilamina, trimetilamina, etilamina, aminoácidos básicos, por ejemplo, lisina y arginina, y diciclohexilamina, y otros parecidos.

"Forma de dosis sólida" significa que la forma de dosis del compuesto útil de acuerdo con la invención es en forma sólida, por ejemplo, cápsulas, pastillas, píldoras, polvos, o gránulos. En dichas formas de dosis sólidas, el compuesto útil de acuerdo con la invención es mezclado con al menos un excipiente (o vehículo) inerte habitual tal como el citrato de sodio o el fosfato de dicalcio o (a) rellenos o extensores, como por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, (b) ligantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alignatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes desintegrantes, como por ejemplo, agar agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, determinados silicatos compuestos y carbonato sódico, (e) retardantes de disolución, como por ejemplo parafina, (f) aceleradores de absorción, como por ejemplo compuestos de amonio cuaternario, (g) agentes de mojado, como por ejemplo alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes, como por ejemplo, caolín y bentonita, (i) lubricantes, como por ejemplo talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, (j) agentes opacifizantes, (k) agentes tamponantes, y agentes que liberan el(los) compuesto(s) útil(es) de acuerdo con la invención en una determinada parte del tracto intestinal de una forma retardada.

"Solvato" significa una asociación física de un compuesto de esta invención con una o más moléculas de disolvente. Esta asociación física incluye enlaces de hidrógeno. En determinados ejemplos será posible aislar el solvato, por ejemplo cuando una o más moléculas de disolvente se incorporan en la estructura cristalina del sólido cristalino. "Solvato" abarca tanto los solvatos en fase disolución como los solvatos aislables. Ejemplos de solvatos incluyen hidratos, etanolatos, metanolatos, y otros parecidos.

En una realización específica, el término "aproximadamente" o "en torno a" significa dentro de un 20%, preferiblemente dentro de un 10%, y más preferiblemente dentro de un 5% de un valor o intervalo dado.

Realizaciones preferidas

Una realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al menos un compuesto inhibidor de la proteasa.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al menos un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido a partir del grupo definido más adelante.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos un compuesto inhibidor de la proteasa y al menos un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos un compuesto inhibidor de la proteasa y al menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido y al menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa, al menos un compuesto inhibidor de la proteasa, al menos un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido y al menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.

Otra realización preferida de acuerdo con la invención es un uso en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humano (VIH) de un compuesto de PEG-ASNasa y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de la proteasa, dichos compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótido y compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, los compuestos inhibidores de la proteasa son seleccionados entre Saquinovir, Nelfinavir, Endinovere, Indinavir, Ritonavir, Crixivan, Viracept, Norvir, y VX-478.

De acuerdo con una realización más preferida de la invención, el compuesto inhibidor de la proteasa en Saquinovir.

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, los compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH son seleccionados entre AZT (Retrovir, zidovudine), ddl (Videx, didanosine), ddC (Hivid, zalcitabine), d4T (Zerit, stavudine) y 3TC (Epivir, lamivudine).

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, el compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH es AZT.

\newpage

Los compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótido son seleccionados entre Hidroxiurea (HU), BW-348U87, 3-aminopiridina-2-carboxaldehído tiosemicarbazona (3-AP) Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-trihidroxibencencarboxi midamida), BILD 1257 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametileno)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-4-metil)leucina), BILD 1357 (1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida] de ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametileno) asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspártico), BILD 1633, BILD 733 (3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-[3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcarbonil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-1-(4-metil)leucinol), BILD 1263 (ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol),
BILD 1351 (1-[1(S)-[5(S)-[3-[(all-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico]), CI-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 3243
60; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-iso-quinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilen)histidina), Parabactin, Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,3-dihidro-1H-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapine (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidrobencen carboximidamida), y un compuesto de fórmula I.

Otra realización preferida de la invención es una composición que comprende una combinación de un compuesto de PEG-ASNasa y al menos un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido como se ha definido con anterioridad y al menos un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar kits que tienen una pluralidad de ingredientes activos (con o sin vehículo) que, en conjunto, pueden ser utilizados eficazmente para llevar a cabo las nuevas terapias de combinación de la invención.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una nueva composición farmacéutica que es eficaz, por sí misma, para la utilización en una terapia de combinación beneficiosa debido a que incluye una pluralidad de ingredientes activos que pueden ser utilizados en concordancia con la invención.

Sin estar limitado a la teoría, se cree que la invención opera con el siguiente mecanismo. Las células T son las células principales en el cuerpo de un mamífero que está infectado con el virus VIH. Se considera que las células T son las fábricas víricas para la infección de VIH. Con el objetivo de reinfectar nuevas células T, el virus de VIH debe entrar en la célula T y debe ser capaz de replicarse. La replicación vírica y el proceso de encapsulación requiere la participación de enzimas intracelulares. La PEG-ASNasa, un compuesto inhibidor de la síntesis de proteínas específico para células de linaje tímico, se muestra muy útil en la inhibición de la síntesis de las enzimas requeridas para la replicación y el montaje de componentes del virus de VIH y para proporcionar otros efectos antiproliferativos relacionados con el virus VIH. Además, una combinación de PEG-ASNasa y uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un compuesto inhibidor de la proteasa, un compuesto inhibidor de la RT de VIH, y un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótido, tiene un efecto sinérgico en la reducción de la carga vírica durante prolongados periodos de tiempo. El mecanismo intracelular por el cual se cree que la PEG-ASNasa opera es evitar que una célula T infectada con el virus VIH sintetice proteínas víricas e intracelulares afectando de forma adversa el suministro del aminoácido asparagina (Asn). De este modo, tratando las células T infectadas con una asparaginasa tal como la PEG-ASNasa, se inhibe la síntesis de proteínas celulares y víricas. Estas proteínas son necesarias para la transcripción y la traducción de los genes codificados víricamente a partir del provirus, ADN de origen vírico integrado en ADN de mamífero. Una vez que el ARN de origen vírico es transcrito mediante polimerasas de ARN a partir del provirus, hay dos rutas que pueden ser seguidas. Este ARN puede ser usado por ribonucleótidos para producir proteínas de origen vírico, tales como la RT de VIH. Después, el mismo ARN puede ser procesado por proteína-rev en ARN genómico de HTV-1. Este ARN estará unido a una RT de VIH ya sintetizada y cuando dos de dichas moléculas están presentes juntas constituyen el material genómico de un nuevo virus VIH, las proteasas de VIH participan en el procesado de las proteínas de origen vírico para dar lugar al paquete vírico final. El nuevo virus VIH-1 puede entonces salir de la célula T como un nuevo y completo virus. De este modo, un compuesto inhibidor de la proteasa en combinación con una asparaginasa tal como la PEG-ASNasa, puede inhibir los procesos requeridos para la replicación vírica del VIH-1 de un modo sinérgico.

Las composiciones y métodos de terapia de la presente invención son útiles en la inhibición de la proteasa de VIH, en la prevención o el tratamiento de la infección por VIH y en el tratamiento de las condiciones patológicas posteriores tales como el SIDA. El tratamiento del SIDA o la prevención o el tratamiento de la infección por VIH se define incluyendo, pero sin limitarlo, por el tratamiento de un amplio abanico de estados de infección por VIH; SIDA, complejo relacionado ARC (SIDA), tanto sintomáticos como asintomáticos y exposiciones reales o potenciales a VIH. Por ejemplo, los compuestos de la invención son útiles en el tratamiento de la infección por VIH después de que se sospeche una exposición pasada a VIH por, por ejemplo, transfusión de sangre, intercambio de fluidos corporales, mordiscos, pinchazos accidentales con agujas, y exposición a la sangre de un paciente durante la cirugía.

En el método de tratamiento o de prevención de acuerdo con la invención el compuesto de PEG-ASNasa y opcionalmente un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto inhibidor de la proteasa, un compuesto inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH y un compuesto inhibidor de la reductasa de ribonucleótidos, puede ser administrado de diferentes modos, tal como en terapias de combinación empleando opcionalmente procedimientos médicos. Por ejemplo, un compuesto de PEG-ASNasa y opcionalmente uno o más compuestos del grupo que consiste en compuestos inhibidores de la proteasa, compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH y compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótidos, puede ser administrado a un paciente concomitantemente o a tiempos diferentes puesto que son administrados de tal modo que en determinados periodos de tiempo hay presentes en el paciente cantidades farmacéuticamente efectivas de ambos compuestos de tal modo que se produce un efecto terapéutico de acuerdo con la invención.

De este modo, un objetivo adicional de la invención es proporcionar un kit para tratar o prevenir un estado fisiológico asociado al VIH, comprendiendo dicho kit una pluralidad de recipientes separados, en los que al menos uno de dichos recipientes contiene un compuesto de PEG-ASNasa y al menos otro de dichos contenedores contiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en compuestos inhibidores de la proteasa, compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH y compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótidos, y dichos recipientes contienen opcionalmente un vehículo farmacéutico, kit que puede ser utilizado eficazmente para llevar a cabo terapias de combinación de acuerdo con la invención.

De este modo, un objetivo adicional de la invención es proporcionar un kit para tratar o prevenir un estado fisiológico asociado con el VIH, comprendiendo dicho kit una pluralidad de recipientes separados, en los que al menos uno de dichos recipientes contiene un compuesto de fórmula I y al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en compuestos de PEG-ASNasa, compuestos inhibidores de la proteasa, compuestos inhibidores de la transcriptasa inversa de VIH y compuestos inhibidores de la reductasa de ribonucleótidos, y dichos recipientes contienen opcionalmente un vehículo farmacéutico, kit que puede ser utilizado eficazmente para llevar a cabo terapias de combinación de acuerdo con la invención.

Debe entenderse que esta invención cubre todas las combinaciones apropiadas de los agrupamientos particulares y preferidos referidos hasta ahora.

Los compuestos de acuerdo con la invención, por ejemplo, los materiales de partida, los intermedios o los productos, se preparan como se describe aquí o mediante la aplicación o adaptación de métodos conocidos, por los que se entiende métodos usados hasta ahora o descritos en la bibliografía.

Los compuestos útiles de acuerdo con la invención son suministrados opcionalmente en la forma de sales. Aquellas sales que son farmacéuticamente aceptables son de particular interés puesto que son útiles en la administración de los compuestos precedentes con fines médicos. Las sales que no son farmacéuticamente aceptables son útiles en los procesos de fabricación, para fines de aislamiento y purificación, y en algunos casos, para su uso en la separación de formas estereoisméricas de los compuestos de esta invención. Esto último es particularmente válido para sales de amina preparadas a partir de aminas ópticamente activas.

Cuando el compuesto útil de acuerdo con la invención contiene un grupo carboxi, o un bioisóstero suficientemente ácido, se pueden formar sales de adición básicas y son sencillamente una forma más conveniente para el uso; y en la práctica, el uso de la forma en sal equivale inherentemente a usar la forma ácida libre.

También, si el compuesto útil de acuerdo con la invención contiene un grupo básico, o un bioisóstero suficientemente básico, se pueden formar las sales de adición básicas y son sencillamente una forma más conveniente para el uso; y en la práctica, el uso de la forma en sal equivale inherentemente a usar la forma básica libre.

Los compuestos precedentes útiles de acuerdo con la invención también pueden ser mezclados con otro compuesto terapéutico para formar composiciones farmacéuticas (con o sin diluyente o vehículo) que, cuando son administradas, proporcionan una administración simultánea de una combinación de ingredientes activos dando como resultado una terapia de combinación de la invención.

Siempre que sea posible que los compuestos útiles de acuerdo con la invención sean administrados solos es preferible presentarlos como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas útiles de acuerdo con la presente invención, tanto para uso veterinario como para uso humano, comprenden al menos un compuesto de la invención, como se ha definido anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

En determinadas realizaciones preferidas, los ingredientes activos necesarios en terapias de combinación pueden ser combinados en una única composición farmacéutica para la administración simultánea.

La elección del vehículo y el contenido de la sustancia activa en el vehículo se determinan generalmente en concordancia con la solubilidad y las propiedades químicas del compuesto activo, el modo particular de administración y la provisiones a observar en la práctica farmacéutica. Por ejemplo, excipientes tales como la lactosa, el citrato sódico, el carbonato cálcico, el fosfato dicálcico y agentes desintegrantes tales como el almidón, ácidos algínicos y determinados silicatos complejos combinados con lubricantes tales como el estearato de magnesio, el laurilsulfato de sodio y el talco pueden ser usados para preparar pastillas. Para preparar una cápsula, es ventajoso usar lactosa y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se usan suspensiones acuosas pueden contener agentes emulgentes o agentes que faciliten la suspensión. También pueden usarse diluyentes tales como la sacarosa, el etanol, el polietilénglicol, el propilenglicol, el glicerol y el cloroformo o mezclas de ellos.

La fase aceitosa de las emulsiones de esta invención puede estar constituida por ingredientes conocidos en una forma conocida. Puesto que la fase aceitosa puede comprender simplemente un emulgente (también conocido como un emulsificante), deseablemente comprende una mezcla de al menos un emulgente con una grasa o un aceite o con ambos, una grasa y un aceite. Preferiblemente, se incluye un emulgente hidrofílico junto con un emulgente lipofílico que actúa como un estabilizante. También se prefiere incluir tanto un aceite como una grasa. Juntos, el(los) emulgente(s) con o sin estabilizante(s) forman la cera emulsificante, y la cera junto con el aceite y la grasa forman el ungüento emulsificante base que forma la fase aceitosa dispersa de una formulación de una crema. Emulgentes y estabilizantes de emulsión adecuados para el uso en la formulación de la presente invención incluyen Tween® 60, Span® 80, alcohol cetostearilíco, alcohol bencílico, alcohol miristílico, monoestearato de glicerilo y laurilsulfato de sodio.

Si se desea, la fase acuosa de la crema base puede incluir, por ejemplo, al menos 30% p/p de un alcohol polihídrico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilos tales como el propilenglicol, el butano-1,3-diol, el manitol, el sorbitol, el glicerol y el polietilénglicol (incluyendo el PEG400) y mezclas de ellos. Deseablemente, las formulaciones tópicas pueden incluir un compuesto que potencie la absorción o la penetración del ingrediente activo a través de la piel o de otras áreas afectadas. Ejemplos de dichas potenciadores de penetración dermal incluyen dimetilsulfóxido y otros análogos relacionados.

La elección de aceites o grasas adecuados para la formulación se basa en alcanzar las propiedades cosméticas deseadas. De este modo, preferiblemente la crema no debería ser grasienta, no debería manchar y debería ser un producto lavable de consistencia adecuada para evitar el derrame desde tubos u otros recipientes. Se pueden usar ésteres mono o dibásicos de alquilo de cadena lineal o ramificada, tales como miristato de diisopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocida como Cromadol CAP, siendo los tres últimos los ésteres preferidos. Estos pueden ser usados solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se pueden usar lípidos de elevado punto de fusión tales como parafina blanca suave y/o parafina líquida u otros aceites minerales.

También se pueden emplear composiciones sólidas como relleno en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando excipientes tales como la lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular, y otros parecidos.

Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en una formulación adecuada a animales y a humanos mediante administración tópica o sistémica, incluyendo oral, por inhalación, rectal, nasal, bucal, sublingual, vaginal, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradermal, intratecal y epidural), intracisternal y intraperitoneal. Se apreciará que la ruta preferida puede variar, por ejemplo, con la condición del recipiente.

Las formulaciones pueden prepararse en forma de dosis unitaria por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Dichos métodos incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son preparadas asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo y los vehículos líquidos o los vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y a continuación, si es necesario, afinando el producto.

Se puede hacer una pastilla por compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las pastillas comprimidas se pueden preparar comprimiendo el ingrediente activo en una máquina adecuada en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un ligante, un lubricante, un diluyente inerte, un conservante, un agente activo superficialmente o un agente dispersante. Se pueden hacer pastillas moldeadas moldeando una mezcla de compuestos en polvo humedecidos con un diluyente inerte líquido en una máquina adecuada. Opcionalmente, las pastillas pueden recubrirse o marcarse y pueden ser formuladas de tal modo que proporcionen una liberación del ingrediente activo de su interior de una forma lenta y controlada.

Las composiciones sólidas para la administración rectal incluyen supositorios, formulados de acuerdo con métodos conocidos, y que contienen al menos un compuesto de la invención.

Si se desea, y para una distribución más eficaz, los compuestos pueden ser microencapsulados en, o unidos a, un sistema de liberación lenta o de entrega dirigida tal como una matriz de polímero biodegradable y biocompatible (por ejemplo, poli(d,1-lactido co-glicólido)), liposomas, y microesferas, y ser inyectados subcutáneamente o intramuscularmente mediante una técnica denominada depósito subcutáneo o intramuscular para proporcionar una lenta liberación continua del compuesto(s) durante un periodo de 2 semanas o más. Los compuestos pueden ser esterilizados, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o por incorporación de agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden ser disueltas en agua esterilizada, o algún otro medio estéril inyectable inmediatamente antes de su uso.

Los niveles de dosis reales del ingrediente activo en las composiciones de la invención pueden variarse de tal modo que se obtenga una cantidad de ingrediente activo que es eficaz para obtener la respuesta terapéutica deseada para una composición particular y un método de administración particular. Por tanto, el nivel de dosis seleccionado depende del efecto terapéutico deseado, de la ruta de administración, de la duración deseada para el tratamiento y de otros factores.

La dosis diaria total de los compuestos útiles de acuerdo con esta invención administrada a un hospedante en dosis única o dividida puede ser en cantidad, por ejemplo, desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal diariamente y preferiblemente de 0,01 a 10 mg/kg\cdotdía. Las composiciones de dosis unitaria pueden contener dichas cantidades de dichos submúltiplos así como pueden ser usadas para constituir la dosis diaria. Deberá entenderse, sin embargo, que el nivel de dosis específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo y la ruta de administración, las velocidades de absorción y excreción, la combinación con otros fármacos y la gravedad de la enfermedad en particular que se esté tratando.

La cantidad de cada componente administrado es determinada por el personal clínico teniendo en consideración la etiología y la gravedad de la enfermedad, el estado y la edad del paciente, la potencia de cada componente y otros factores.

Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o de multidosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales con tapones elastoméricos, y pueden ser almacenadas en un estado congelado-secado (liofilizado) que requiere sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las disoluciones y las suspensiones de inyección extemporánea pueden ser preparadas a partir de polvos estériles, gránulos y pastillas del tipo descrito anteriormente.

Los compuestos de la invención, sus métodos o preparación y su actividad biológica aparecerán más claramente a partir del examen de los siguientes ejemplos que se presentan sólo a modo ilustrativo y que no deben considerarse limitantes de la invención en cuanto a su alcance.

Los procedimientos para evaluar la actividad biológica de los compuestos o composiciones de acuerdo con la invención son llevados a cabo como describe aquí o mediante la aplicación o adaptación de procedimientos conocidos, por los que se entiende procedimientos usados hasta ahora o descritos en la bibliografía.

Experimental Metodología general para el ensayo de transcriptasa inversa de VIH, no radiactivo (Boehringer Mannheim)

El siguiente es un procedimiento general para el ensayo de transcriptasa inversa de VIH:

Día Uno

\bullet: Las muestras son sobrenadantes y pelets obtenidos de los matraces de fármaco \pm virus (incubación durante siete días). No son desactivados por el calor.

\bullet: Centrifugar las muestras a 2000 g durante 30 minutos a 4ºC. Usar 2500 rpm para alcanzar 2000 g.

\bullet: Transferir el sobrenadante a un tubo etiquetado estéril.

\bullet: Añadir 0,5 ml de disolución de PEG

: Usar NaCl 1,2 M como diluyente de PEG.

: Disolución de PEG: 30% p/v, 30 g en 100 ml.

\bullet: Mezclar vigorosamente.

\bullet: Incubar o/n a 0ºC (sobre hielo en el refrigerador).

Días Dos

\bullet: Centrifugar 500 \mul de las muestras a 8000 g durante 10 minutos a 4ºC. Usar 8000 rpm para alcanzar 8000 g.

\bullet: Eliminar el sobrenadante. Ser cuidadoso al eliminar todas las gotas de PEG de las muestras.

\bullet: Añadir 40 \mul de disolución tampón de lisis.

\bullet: Resuspender el pelet completamente.

\bullet: Transferir la suspensión a un tubo de reacción fresco.

\bullet: Incubar a temperatura ambiente (25ºC) durante 30 minutos.

\bullet: Hacer las diluciones estándar:

\newpage

Etapa	VIH-1-RT	Tampón de Lisis	Conc. de VIH-1-RT (ng/pocillo)
0	0	150 MI	0
1	10 \mul (Disolución 1)	390 MI	2,0
2	150 \mul De la Etapa 1	150 MI	1,0
3	150 \mul De la Etapa 2	150 MI	0,5
4	150 \mul De la Etapa 3	150 MI	0,25
5	150 \mul De la Etapa 4	150 MI	0,125
6	150 \mul De la Etapa 5	150 MI	0,0625

\bullet: Transferir 40 \mul de los patrones a los tubos de reacción (n = 7 x 2).

\bullet: Hacer la disolución tampón de reacción:

: Reconstituir el molde (vial 4) en 430 \mul de agua en autoclave.

: Añadir 1 ml de tampón de incubación por vial de nucleótidos (vial 3).

: Añadir 100 \mul del molde reconstituido (vial 4) al vial de la disolución de nucleótidos (vial 3).

\bullet: Añadir 20 \mul de tampón de reacción a todos los tubos, desconocidos y patrones.

\bullet: Incubar durante hasta 15 horas a 37ºC en una rejilla en la incubadora.

Día Tres

\bullet: Crear un molde para el ensayo Elisa usando wordperfect.

\bullet: Abrir los paquetes de hojas de metal y construir un módulo de mtp (placa de microtitulación) usando el marco y las tiras proporcionadas en el kit.

: Desconocidos n =

: Patrón n =

: por tanto, especimenes totales n =

: Tiras que tienen 8 pocillos cada una, por tanto se necesitan _____tiras

Nota

Tienes que redondear hacia arriba hasta el múltiplo de 8 más próximo.

\bullet: Transferir 60 \mul desde los tubos de reacción hasta los correspondientes pocillos del módulo mtp como para el molde.

\bullet: Cubrir el mtp con la tira de cobertura proporcionada.

\bullet: Incubar a 37ºC en la incubadora durante 1 hora.

\bullet: Si es necesario, hacer la disolución de lavado:

Nota

La disolución proporcionada es una disolución 10x, por tanto debe ser diluida usando agua de autoclave.

: Hacer una botellas de disolución de lavado añadiendo 225 ml de agua de autoclave a la botella proporcionada. Mezcla bien. Mantener en hielo durante el ensayo.

\bullet: Eliminar la disolución completamente por decantación.

\bullet: Lavar la placa 5x usando 250 \mul por aclarado con un tiempo de remojo de 30 segundos antes de decantar.

\bullet: Hacer la disolución de trabajo anti-excavación de vaina

: Hacer la disolución de anti-excavación de vaina.

: Añadir 500 \mul de agua de autoclave al vial de anti-excavación de vaina (vial nº 6) almacenado a 4ºC, no congelar.

: Hacer la disolución de anti-excavación de vaina de trabajo.

: Calcular el volumen necesario:

_____ pocillos x 200 \mul = _____ ml

: Usar 50 \mul de disolución de anti-excavación de vaina (vial nº 6) para cada 4,95 ml de tampón de dilución conjugado (disolución nº 8).

: Añadir ____ ml de disolución de anti-excavación de vaina (vial nº 6)

: A ____ ml de tampón de dilución conjugado (disolución nº 8).

\bullet: Añadir 200 \mul de disolución de trabajo anti-excavación de vaina por pocillo de la mtp.

\bullet: Cubrir la mtp con la tira de cobertura proporcionada.

\bullet: Incubar a 37ºC en la incubadora durante 1 hora.

\bullet: Eliminar completamente la disolución por decantación.

\bullet: Hacer la disolución de sustrato abts con potenciador

: Hacer la disolución de substrato abts

: Disolver la mezcla de polvo de abts (vial nº 10) en la botella del tampón de sustrato (botella nº 9)

: Calcular el volumen necesario:

____ pocillos x 200 \mul = _____ ml

: Añadir la cantidad apropiada de potenciador a la disolución. Usar 1 mg de potenciador de sustrato (vial nº 11) para cada 1 ml de disolución de sustrato de abts (botella nº 9).

: Añadir _____ mg de potenciador de sustrato (vial nº 11) a ____ ml de disolución de sustrato de abts (botella nº 9).

\bullet: Añadir 200 \mul de disolución de sustrato de abts con potenciador por pocillo de la mtp.

\bullet: Hacer la lectura de la placa a 405 nm (longitud de onda de referencia 490 nm) a 10, 20, y 30 minutos.

Ejemplo 1 Régimen de combinación del compuesto de PEG-ASNasa y de Saquinavir Materiales y métodos

La línea de células usada para estos estudios es CCRF/CEM/O, una línea de células humanas T-leucémicas. La PEG-ASNasa (ONCASPAR) es proporcionada por Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir está disponible comercialmente. Se enriquece un medio RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con 10% de suero fetal de ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), 5% de disolución tampón Hepes y 5% de aminoácidos no esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones de fármaco son como sigue:

\newpage

PEG-ASNasa IC_{50} sola	0,4 UI/ml
Saquinavir IC_{50} solo	25 \muM
Combinación PEG/SAQ IC_{50}: 0,233 UI/ml +15,52 \muM

Brevemente, se estimulan 2 x 10^{6} células/ml con medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con 5% CO_{2}. También, el mismo número de células es incubadas en un medio libre de PHA (fitohemaglutinina) durante 48 horas para servir como control negativo. En este punto, las células son inoculadas con el virus VIH-1 como en el protocolo estándar. Se añade PEG-ASNasa y/o Saquinavir a las células en las concentraciones apropiadas (véase anteriormente). Las células de control son resuspendidas en un medio libre de fármacos durante lo que dure la exposición que duró siete días. En el quinto día, se retiraron dos alícuotas de 1 ml del medio de los matraces y fueron almacenadas en nitrógeno líquido. En el séptimo día, otras dos alícuotas de 1 ml de medio fueron retiradas de los matraces y almacenadas en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son peletizadas y almacenadas a -80ºC.

Las muestras producidas en este experimento son numeradas y a continuación se les evalúa la RT de VIH usando el Ensayo de Transcriptasa Inversa, no radiactivo (Boehringer Mannheim). Se determina la curva del patrón y se calculan los niveles de RT de VIH de las muestras experimentales.

Resultados

La observación principal a partir de los ensayos de RT de VIH es estos especimenes de células T es que no hay RT de VIH/virus en el sobrenadante de las células T CEM/O después del tratamiento. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 1.

Los pelets de células T en sí mismos son examinados para evaluar la RT de VIH intracelular. La PEG-ASNasa a una concentración de 0,4 UI/ml (concentración IC_{50} aproximada) demostró aproximadamente un 30% de inhibición de RT de VIH. El Saquinavir, el compuesto inhibidor de la proteasa de VIH, por sí solo a una concentración 25 \muM (concentración IC_{50} aproximada) agotó la actividad de RT de VIH en aproximadamente un 70% en comparación con la RT de VIH del control de cultivos de células sin tratar. Por último, hemos demostrado que la combinación simultánea de PEG-ASNasa y de Saquinavir es sinérgica, por tanto las concentraciones IC_{50} de estos fármacos en combinación son de 0,233 UI/ml y de 14,5 \muM, respectivamente. Estas concentraciones son mucho menores que sus respectivos valores IC_{50} en células T CEM/O. El régimen de combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir inhibió intracelularmente la RT de VIH en aproximadamente un 82,3% en comparación con los valores de control sin tratar.

Discusión

Puesto que las células T no liberaron VIH-1 en el sobrenadante después de estos tratamientos con fármacos, parece que la PEG-ASNasa y el Saquinavir no sólo son sinérgicos contra las células T, sino que también son selectivamente sinérgicos contra el VIH-1. Estos fármacos son suficientemente supresores de la liberación de nuevas partículas de VIH-1 al medio (suero equivalente o plasma de los pacientes). El hecho de que menores concentraciones de la combinación sean más supresoras de la RT de VIH que el más activo de los dos fármacos Saquinavir a una concentración mayor, sugiere firmemente que la combinación está inhibiendo al VIH de forma selectiva a un nivel de pro-virus.

Debido a que estos fármacos y su combinación suprime/inhibe intracelularmente la RT de VIH, esto sugiere que inhiben al VIH-1 a un nivel de pro-virus. En otras palabras, el provirus de HIV integrado está produciendo mARN, el cual no se traduce en proteínas víricas, y, por tanto, la inhibición de la producción de RT o de las partículas de virus completas a ser liberadas en el medio. De este modo, sobre una base teórica, no se podría alcanzar una infección adicional por VIH-1 de las células no infectadas.

Experimento 2

Determinación de la citotoxicidad Materiales y métodos

Para este experimento se usa una línea de células T humanas leucémicas, denominadas a partir de aquí como CEM/O. La PEG-ASNasa se obtiene a partir de Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. bajo el nombre comercial Oncaspar®. El Saquinavir se obtiene a partir de Roche Laboratories bajo el nombre comercial de Invirase®. El medio RPMI-1640 obtenido a partir de Irvine Scientific, Irvine CA, es enriquecido con un 10% con Suero Fetal de Ternero obtenido a partir de Gemini Biosource, Calabazas, CA, con un 5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no esenciales obtenidos a partir de Irvine Scientific, Irvine CA.

Se lleva a cabo un experimento para determinar la citotoxicidad del Saquinavir y de la PEG-ASNasa. Para determinar la citotoxicidad de cualquiera de los compuestos por sí solo, se incuban 2 x 10^{5} células/ml en placas de 24 pocillos con las siguientes concentraciones de fármaco:

\newpage

PEG-ASNasa	1,0; 0,75; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1; 0,03 UI/ml
Saquinavir	10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8} M

Resultados

La concentración de PEG-ASNasa que produce una estado citostático en las células CEM/O in vitro es aproximadamente de 0,5 UI/ml. Las concentraciones de PEG-ASNasa de 1 y 0,75 UI/ml produjeron una muerte celular significativa y son citotóxicas para las células CEM/O tras 72 horas. Las concentraciones de 0,03, 0,1, 0,2, 0,3 y 0,4 UI/ml son ligeramente efectivas para evitar el crecimiento celular en comparación con el ritmo de crecimiento del control (células sin tratar). Sin embargo, las células tratadas con PEG-ASNasa a 0,5 UI/ml mostraron una línea de crecimiento celular relativamente plana. De este modo, se produce un efecto citostático con esta concentración tras 72 horas. Por lo tanto, se usa un intervalo de concentraciones de PEG-ASNasa que incluye 0,5 UI/ml en las investigaciones del régimen de combinación. Se muestra un efecto citotóxico de la PEG-ASNasa, dependiente del fármaco, de la concentración y del tiempo, sobre esta línea de células T.

Se determina que la IC_{50} del Saquinavir en las células CEM/O es 26 \muM después de un periodo de incubación de 72 horas. Los resultados se muestran en la Figura 2. Experimentos múltiples independientes con Saquinavir establecieron una IC_{50} entre 21 y 28 \muM. Concentraciones de Saquinavir entre 0,001 y 1 \muM no produjeron muerte celular. Concentraciones de 10 \muM produjeron sólo un 8,76% de muerte celular en comparación con las muestras de control sin tratar. La concentración más alta probada, 100 \muM, mató al 99,50% de las células en comparación con las células de control. De este modo, se usa un intervalo de concentraciones de Saquinavir entre 1 y 40 \muM en los experimentos posteriores para investigar la terapia de combinación de Saquinavir y PEG-ASNasa en células CEM/O.

Experimento 3

Estudios iniciales de combinación secuencial de saquinavir y PEG-ASNasa Materiales y métodos

En este experimento, el intervalo de concentraciones descrito se usa para investigar el régimen de combinación de Saquinavir y PEG-ASNasa. Para los estudios de combinación secuencial de PEG-ASNasa seguida de Saquinavir, se incuba células con las concentraciones de PEG-ASNasa proporcionadas más adelante durante 24 horas. A continuación se añade Saquinavir, en las concentraciones proporcionadas más adelante, a las células apropiadas durante otras veinticuatro (24) horas más, llevando el tiempo total de exposición a cuarenta y ocho (48) horas. La exposición involucró 2 x 10^{5} células/ml que son incubadas en un matraz de cultivo de tejido con las concentraciones de los fármacos investigados como se muestra más adelante. Los resultados se presentan en la Figura 3. Las concentraciones de fármaco usadas son como sigue:

PEG-ASNasa	1,020; 0,765; 0,510; 0,255 y 0,0255 UI/ml
Saquinavir	40, 30, 20, 10 y 1 \mu M

En todos los estudios in vitro, las células de control negativo son incubadas en un medio libre de fármacos durante el mismo periodo y bajo las mismas condiciones que las muestras experimentales. La densidad de células se mide por conteo de células usando un Contador Coulter acoplado con un Canalizador Coulter para cada uno de los matraces experimentales a 24, 48 y 72 horas después de la incubación. Adicionalmente, se llevan a cabo pruebas de Exclusión de Azul Trypan para cada una de estas condiciones experimentales. Los números de células son corregidos para la viabilidad determinada por la prueba de Azul Trypan y son presentados como un porcentaje del control sin tratar.

También se probó la secuencia inversa. Los resultados son presentados en la Figura 4. Se administra Saquinavir y se incuban las células durante veinticuatro (24) horas seguido de la adición de PEG-ASNasa y un periodo de incubación adicional de veinticuatro (24) horas, llevando el tiempo total de exposición a cuarenta y ocho (48) horas. Diferente de la secuencia de fármacos, la metodología es la misma que se ha mencionado inmediatamente antes. También se ha ensayado el régimen de combinación simultánea usando la misma metodología. Los resultados se presentan en las Figuras 5, 6 y 7. El experimento de la metodología combinada simultánea tenía una exposición de las muestras de cuarenta y ocho (48) horas de exposición combinada simultánea.

Resultados

Cada régimen probado mostró efectos sinérgicos para determinados intervalos ensayados. El régimen combinado secuencial de PEG-ASNasa seguido de Saquinavir mostró a sinergia de 1,72 después de cuarenta y ocho horas de exposición. Esta es similar a las sinergias mostradas en el otro régimen secuencial y en el régimen simultáneo. La invención muestra el muy deseable resultado de producir un sinergismo óptimo a un nivel que permite la supervivencia de algunas células.

Experimento 4

Determinación de los niveles de aminoácidos Materiales y métodos

Se llevan a cabo experimentos para determinar el nivel de aminoácidos en suspensiones de células y en el medio celular para determinar el efecto de la PEG-ASNasa sobre los niveles de aminoácidos, particularmente los niveles de asparagina, glutamina, y ácido aspártico.

Se añaden muestras de 50 \mul de medio y 10 \mul de ácido aminoadópico 1 mM a 450 \mul de metanol frío en tubos de microfuga de 1,5 ml. Las mezclas se llevan a esta de vórtice y son centrifugadas a 8700 g durante dos minutos. Los sobrenadantes son transferidos a tubos de ensayo de vidrio de borosilicato (13 x 100 mm) y son liofilizados. Los especimenes son almacenados a -20ºC hasta que son analizados mediante HPLC. Antes del análisis de HPLC, las muestras son disueltas en un tampón que contiene un 95% de hidrogenofosfato de disodio 7 nM y un 5% de acetonitrilo.

Resultados

Después de una exposición de 24 horas de células CEM/O a varias concentraciones de PEG-ASNasa, se observa un agotamiento significativo de asparagina (Asn). El nivel de asparagina es inferior al 3,0% del control sin tratar. También se observa en el experimento que usa la mayor concentración de PEG-ASNasa un agotamiento de glutamina (gln) dependiente de la dosis hasta niveles que son inferiores al 3,0% del control sin tratar. Los niveles de ácido aspártico (Asp) son elevados en comparación con el control sin tratar hasta niveles que representan un incremento del 200 hasta el 300%. Los resultados se muestran en la Figura 8. La curva de calibrado usada para calcular la cantidad de RT de VIH se muestra en la Figura 8a.

Incluso a los niveles más bajos de PEG-ASNasa ensayados, se observa un agotamiento de Asn después de veinticuatro horas. Este es consistente con la capacidad de la PEG-ASNasa para matar células T ilícitas por agotamiento de aminoácidos vitales, particularmente la asparagina. La PEG-ASNasa también agota los niveles de Gln lo que puede ser importante en el mecanismo de destrucción de las células T.

Experimento 5

Determinación del efecto de la exposición de ARN de VIH en pelets de células T a una combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir

Este experimento se lleva a cabo usando un procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materiales que en el Experimento 1, sin embargo se mide la exposición de ARN de VIH en pelets de células T a una combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir. Los resultados de este experimento se muestran en las Tablas 1 y 2 y en las gráficas 9 y 9a. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 2 representa PEG-ASNasa.

Estos resultados muestran que la PEG-ASNasa no tuvo un efecto aparente sobre la producción de ARN de VIH-1, mientras que tuvo un efecto moderado inhibiendo la RT de VIH del mismo cultivo de células en el día 7 (véase experimento 5a). Por tanto, la PEG-ASNasa está inhibiendo la biosíntesis de proteínas incluso al nivel de la RT de VIH (véase experimento 5a). El Saquinavir por sí solo tiene un efecto inhibidor sobre la producción de ARN de VIH-1, inhibiendo aproximadamente el 36% en comparación con el control (figuras 9 y 9a). La combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir, en concentraciones sinérgicamente reducidas, dio como resultado la inhibición de aproximadamente el 12% de la RT de VIH (véase experimento 5a). Es más, en los mismos cultivos, la combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir, en concentraciones reducidas, produjo ARN de HTV-1 no detectable hasta los límites inferiores del ensayo de 400 copias de ARN por pelet. Estos datos demuestran que el inhibidor de proteína (PEG-ASNasa) más el inhibidor de proteasa de HTV-1 (Saquinavir) actúan no sólo de forma sinérgica sino también de forma selectiva contra la RT de VIH y, más importante, de forma selectiva contra la producción de ARN de VIH-1.

Experimento 5a

Determinación del efecto de la PEG-ASNasa \pm Saquinavir sobre los niveles de RT de VIH en pelets de células infectadas por VIH-1

Este experimento se lleva a cabo usando un procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materias que en el Experimento 7, sin embargo se mide la exposición del virus VIH de los pelets de células T a PEG-ASNasa y a Saquinavir por sí solos, y en combinación. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 2a. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 2a representa PEG-ASNasa.

Estos resultados muestran que la PEG-ASNasa tenía un efecto moderado en la inhibición de RT de VIH. Por tanto, la PEG-ASNasa está inhibiendo la biosíntesis de proteínas incluso a nivel de RT de VIH. El Saquinavir por sí solo también tiene un efecto inhibidor sobre la RT de VIH-1, inhibiendo aproximadamente el 15% en comparación con el control. La combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir, en concentraciones sinérgicamente reducidas, dio como resultado la inhibición de aproximadamente el 12% de la RT de VIH.

Experimento 6

Determinación de la inhibición de ARN de VIH en el sobrenadante de células T CEM/O mediante un régimen de combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir

El Experimento 5 ilustra los resultados de la exposición de ARN de VIH en pelets de células T a una combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir. Sin embargo, el procedimiento experimental no eliminó la partícula de HTV-1 del sobrenadante para simular la exposición continua de las células T al virus VIH-1. De este modo, siempre hay virus VIH-1 en el sobrenadante de los cultivos de células T.

Se ha descubierto que la combinación de PEG-ASNasa y Saquinavir inhibía en un grado significativo el ARN de VIH en los pelets de células, y, en algunos pocillos, el ARN de VIH no podía ser cuantificado después de los tratamientos con la combinación de fármacos PEG + SAQ, por tanto, habíamos alcanzado la completa inhibición del ARN de VIH.

Se analiza el ARN de VIH de los sobrenadantes de las células T del experimento 5 y los resultados se muestran en las Tablas 3 y 4. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 3 representa PEG-ASNasa. La PEG por sí sola inhibió el ARN de VIH en los sobrenadantes en aproximadamente el 60% y el SAQ en aproximadamente el 68%. La combinación de PEG + SAQ redujo el ARN de VIH en el sobrenadante en aproximadamente el 75% en comparación con el control sin tratar. Este modelo de inhibición de ARN se ajusta bien con los indicados en los experimentos previos que presentaban inhibición de RT de VIH y de ARN de VIH en el mismo experimento.

Puesto que estos fármacos no "matan" el virus VIH en el sobrenadante, la reducción del ARN de VIH solo se puede lograr mediante "pérdida" debida a la infección y a la no regeneración, vía replicación, debido a la inhibición del ciclo de replicación del virus originada por estos fármacos, específicamente no se produce ARN de VIH intracelularmente para ser exportado al medio como partículas de virus VIH completas.

Experimento 7

Determinación del efecto de la PEG-ASNasa \pm Saquinavir \pm AZT \pm MISID (PL-7) sobre los niveles de RT de VIH en Pelets de células infectadas por VIH-1 Materiales y métodos

La línea de células usada para este experimento es CEM/O, una línea de células T leucémicas humanas. La PEG-ASNasa (ONCASPAR) es suministrada por Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir está disponible comercialmente. El AZT se compra a Sigma. El MISID, un inhibidor de la reductasa de ribonucleótido, es sintetizado siguiendo el procedimiento descrito en Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5: 664-679. Se enriquece el medio RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con un 10% de Suero Fetal de Ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), con un 5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones usadas son las siguientes:

PEG-ASNasa IC_{50} sola	0,40 UI/ml
Saquinavir IC_{50} solo	25 \muM
AZT	1 \muM
MISID (PL-7)	0,685 \muM
Combinación PEG IC_{50}	0,23 UI/ml
Combinación SAQ IC_{50}	14,52 \muM

Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control negativo. En este punto se inocula las células con el virus VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el sobrenadante, un estado experimental que simula el estado clínico in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que están siempre bajo una exposición constante a las partículas de VIH-1. Estas partículas de virus son liberadas por células T ya infectadas y/o por nodos linfáticos de pacientes.

Los fármacos experimentales se añaden a las células en las concentraciones apropiadas al mismo tiempo que la inoculación vírica o 90 minutos después de la incubación vírica, tiempo suficiente para que las células T sean infectadas y comiencen a producir nuevas partículas del virus VIH-1. Las células de control son resuspendidas en un medio libre de fármacos por la duración de la exposición que duró siete días. Sólo se obtienen alícuotas del medio de los matraces de control en el 5º día tras Rx. En el 7º día, se eliminan tres alícuotas del medio de los matraces, de 1 ml cada una, y se almacenan en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son divididas en tres partes y a continuación son peletizadas y almacenadas a -80ºC.

Las muestras producidas a partir de este experimento son numeradas. Se ensayan los pelets celulares de los matraces de incubación vírica de 90 minutos para evaluar la RT de VIH usando un kit ELISA para el Ensayo de Transcriptasa Inversa, no radiactivo (Boehringer Mannheim). Se determina la curva patrón (véase Figura 10) y se calculan los niveles de RT de VIH de las muestras experimentales. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 5 representa PEG-ASNasa.

Resultados y Discusión: La primera observación a partir de los ensayos ELISA de la RT de VIH en estos especimenes procedentes de los pelets celulares de células T CEM/O es que hay una actividad de RT de VIH disminuida debido al tratamiento con fármacos, en comparación con las células de control sin tratar. La inhibición más dramática de la RT de VIH es causada por AZT, un inhibidor de transcriptasa inversa análoga a nucleósido. Realmente, nuestro diseño experimental inicial y la búsqueda de una partícula vírica de VIH de tipo natural, sin mutaciones sobre la RT de VIH que confieran resistencia al AZT, se muestra con estos resultados de que el AZT por sí solo es muy activo contra esta cepa vírica.

La PEG-ASNasa o el Saquinavir, usados como monoterapia en concentraciones IC_{50}, inhibieron la RT de VIH en un 54% y en un 83%, respectivamente. Estos valores son similares a los determinados en experimentos anteriores.

El MISID (PL-7), un nuevo inhibidor de reductasa de ribonucleótido (RR), usado por sí solo en concentración IC_{50} (0,685 \muM), también demostró una inhibición del 73% de la RT de VIH. Esta es la primera evidencia de que un miembro de esta clase de inhibidores RR ha demostrado actividad anti-VIH además de su actividad antileucémica. La razón bioquímica para la inhibición de VIH por esta clase de compuestos es el agotamiento intracelular de los focos de dNTP. La escasez o la reducción de los focos de dNTP inhibirá la función de la RT de VIH, convirtiendo el ARN de VIH en ADN provírico antes de la integración en el ADN genómico de un mamífero.

Las combinaciones de PEG + SAQ dieron como resultado una completa inhibición de la RT de VIH en este experimento. Las combinaciones de tres fármacos, AZT + PEG + SAQ, dieron como resultado la completa inhibición de la RT de VIH en dos de los tres pocillos, y el valor del tercer pocillo es inhibido en un 95,3% del control. La explicación bioquímica de esta combinación de fármacos es que el AZT inhibirá la infección adicional por RT de VIH y que esta inhibición será potenciada por el ya muy eficaz efecto anti-RT de VIH del régimen de PEG + SAQ. Puesto que los números están próximos al 100% de inhibición de RT de VIH es extremadamente difícil demostrar una mejora en la inhibición de los tres fármacos sobre el régimen de dos fármacos en este sistema modelo de células T infectadas con un virus VIH de tipo natural. En experimentos con VIH parcialmente resistente a AZT, como aparece en los pacientes, el régimen puede demostrar la validez del anterior silogismo bioquímico.

Combinaciones de cuatro fármacos, MISID + AZT + PEG + SAQ, dieron como resultado una completa inhibición de la RT de VIH en dos de los tres pocillos, y el valor del tercer pocillo es inhibido en un 95% del control. Estos valores son superponibles al régimen de tres fármacos, debido al máximo de inhibición de RT de VIH. La explicación bioquímica para esta combinación es que el MISID, el inhibidor RR, agotará los focos de dNTP y esto potenciará la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP) contra la RT de VIH. Este efecto inhibidor aumentado será o aditivo o sinérgico con respecto al ya selectivamente sinérgico efecto de una proteína junto con inhibidores de proteasa contra ente virus. Puesto que el MISID por sí solo parece tener una considerable actividad anti-RT de VIH, creemos que este silogismo demostrará ser correcto en experimentos con partículas de VIH resistentes a uno o más de estos tipos de fármacos o en pacientes que estén infectados con variantes de VIH multirresistentes.

Por lo tanto, estos resultados muestran que los siguientes regímenes de 3 ó 4 fármacos, de AZT + PEG + SAQ o MISID + AZT + PEG + SAQ, actúan de forma sinérgica contra la RT de VIH.

Experimento 8

Determinación del efecto sinérgico de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y MISID (PL-7) sobre el sobrenadante de células CEM/O Materiales y métodos

La línea de células usada para este experimento es CEM/O, una línea de células T humanas leucémicas. La PEG-ASNasa (ONCASPAR) es suministrada por Rh\hat{o}ne-Poulenc Rorer. El Saquinavir (SQ) está disponible comercialmente. El AZT se compra a Sigma. El MISID, un inhibidor de reductasa de ribonucleótido, es como se ha descrito en Nandy P., Lien E. J., Avramis V. I., Med. Chem. Res. 1995, 5: 664-679. Se enriquece el medio RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA) con un 10% de Suero Fetal de Ternero (Gemini Biosource, Calabazas, CA), con un 5% de disolución tampón Hepes 1M y con un 5% de aminoácidos no esenciales (Irvine Scientific, Irvine, CA). Las concentraciones usadas son las siguientes:

\newpage

PEG-ASNasa IC_{50} sola	0,40 UI/ml
Saquinavir IC_{50} solo	25 \muM
AZT	1 \muM
MISID	0,685 \muM
Combinación PEG IC_{50}	0,23 UI/ml
Combinación SAQ IC_{50}	14,52 \muM

Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control negativo. En este punto se inocula las células con el virus VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el sobrenadante, una estado experimental que simula el estado clínico in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que están siempre bajo una exposición constante a las partículas de VIH-1. Estas partículas de virus son liberadas por células T ya infectadas y/o por nodos linfáticos de pacientes.

Las muestras producidas a partir de este experimento son numeradas. Se evalúa cuantitativamente el ARN de VIH de los pelets de células de los cultivos celulares (véase el Experimento 7) de los matraces de incubación vírica de 90 minutos usando un kit de ensayo, no radiactivo. Se determina la curva patrón y se calculan los niveles de ARN de HTV de las muestras experimentales como se ha descrito previamente.

Estos especimenes sobrenadantes son los procedentes de los cultivos de los pelets de células T del Experimento 7. Estos resultados se describen en el Experimento 7.

La primera observación a partir de los ensayos ELISA de RT de VIH en estos especimenes de los sobrenadantes de las células T CEM/O es que hay una actividad de RT de VIH disminuida en el séptimo día debido al tratamiento con fármacos, en comparación con las células de control sin tratar del mismo día. Es de importancia que los controles sin tratar para el 5º día (un valor) tuvieran una O.D. de RT de VIH mayor que para el 7º día. Examinamos los valores de O.D., que son todos inferiores que las concentraciones mínimas cuantificadas basadas en la linealidad de la curva de calibrado. Sólo uno de los especimenes sobrenadantes (nº 7), tratado sólo con PEG-ASNasa, obtuvo un valor O.D. en el ensayo superior al control negativo, y aún así inferior a la media de los tres sobrenadantes de cultivo de control sin tratar.

El SAQ (Especimenes nº 9 y nº 10), el AZT (Especimenes nº 11 y nº 13) y el MISID (Especimenes nº 15 y nº 16), como agentes sencillos (Véase la Tabla 6. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 6 representa PEG-ASNasa) causan una gran inhibición de la RT de VIH en términos cuantitativos (menos del 66% del valor del control Negativo de 0,075 O.D. o de 0,05 O.D.). Se observa una inhibición de la RT de VIH incluso mayor con la combinación de SAQ + PEG-ASNasa, tres especimenes nº 17, 18 y 19, en un espécimen del régimen de combinación de tres fármacos de PEG-ASNasa + SAQ + AZT, espécimen nº 22, y en todos los tres especimenes tratados con el régimen de combinación de cuatro fármacos de PEG-ASNasa + SAQ + AZT + MISID, nº 23, 24 y 25.

Nuestro diseño de experimentos inicial y nuestra búsqueda de una partícula de virus VIH de tipo natural, sin mutaciones de la RT de VIH que le confieran resistencia al AZT, se muestra de hecho con estos resultados de que el AZT por sí solo es muy activo contra esta cepa vírica.

El MISID, un nuevo inhibidor de reductasa de ribonucleótido (RR), usado por sí solo en la concentración IC_{50} (0,685 \muM), también demostró una inhibición significativa de la RT de VIH como agente sencillo y en combinación con los otros tres fármacos. Este es también el resultado en los pelets de células (véase el experimento 7) y es la primera evidencia de un miembro de esta clase de inhibidores de RR que demuestra actividad anti-VIH además de su actividad antileucémica tanto intracelularmente como en los especimenes sobrenadantes de estos cultivos de células T.

Las combinaciones de PEG + SAQ dieron como resultado la completa inhibición de la RT de VIH en este y en el anterior experimento en los pelets de células. En los experimentos previos hay un 96% de inhibición de la RT de VIH (véase el experimento 7). Las combinaciones de tres fármacos, AZT + PEG + SAQ, dieron como resultado la completa inhibición de la RT de VIH en dos de los tres pocillos, y el valor del pocillo es inhibido en un 95,3% del control, mientras que en los sobrenadantes se observa un comportamiento idéntico, especimenes nº 20-22.

Las combinaciones de cuatro fármacos, MISID + AZT + PEG + SAQ, dieron como resultado una completa inhibición de la RT de VIH en todos los tres especimenes sobrenadantes, cuyos valores se corresponden con los valores determinados en los pelets de células del mismo experimento. Estos valores son superponibles a los del régimen de tres fármacos, debido a la máxima inhibición de la RT de VIH, como se ha determinado anteriormente.

La explicación bioquímica para esta combinación es que el MISID, el inhibidor de RR, agotará los focos de dNTP y esto potenciará la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP), contra la RT de VIH. Este efecto inhibidor aumentado será o bien aditivo o bien sinérgico con los efectos ya selectivamente sinérgicos de una proteína más inhibidores de proteasa contra este virus. Puesto que el MISID por sí solo parece tener una considerable actividad anti-RT de VIH creemos que este silogismo se demostrará ser correcto en los experimentos con partículas de VIH resistentes a uno o más de estos tipos de fármacos o en pacientes que están infectados con variantes de VIH multirresistentes.

Experimento 9

Determinación del efecto sinérgico de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y MISID (PL-7) sobre Pelets de células CEM/O

Los especimenes proceden de los cultivos de pelets de células T y son del mismo experimento que aquellos que presentamos para los resultados de RT de VIH. Estos resultados se discuten en el Experimento 7 (pelets de células) y en el Experimento 8 (sobrenadante).

La primera observación a partir de los ensayos cuantitativos de ARN de VIH en estos especimenes de células T CEM/O es que hay una actividad de ARN de VIH disminuida en el séptimo día debido al tratamiento con fármacos, en comparación con las células de control sin tratar en el mismo día. Los resultados cuantitativos se muestran en la Tabla 7 y en la Figura 11. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 7 representa PEG-ASNasa.

La inhibición de ARN de VIH en términos cuantitativos causada por el AZT solo (especimenes nº 11 a 13) es superior (virus VIH-1 sensible a AZT), seguida por SAQ y MISID como agentes sencillos. Se observa una mayor inhibición de ARN de VIH por la combinación de SAQ + PEG-ASNasa, 38% del control, y a partir de la combinación de tres fármacos, PEG-ASNasa + SAQ + AZT, 30% del control. Los tres especimenes tratados con el régimen de combinación de cuatro fármacos, PEG-ASNasa + SAQ + MISID + AZT, nº 23, 24 y 25, presentan las mayores inhibiciones de ARN de VIH de este experimento, 20% del control, demostrando claramente la significativa contribución del inhibidor de reductasa de ribonucleótido, MISID.

El MISID, un nuevo inhibidor de reductasa de ribonucleótido (RR), usado por sí solo en la concentración IC_{50} (0,685 \muM), también demostró una significativa inhibición de ARN de VIH como agente sencillo y, más importante, en combinación con los otros tres fármacos. Este es también el resultado en los pelets de células (Experimento 6) y es la evidencia repetida de que un miembro de esta clase de inhibidores de RR ha demostrado una actividad anti-VIH además de su actividad antileucémica tanto intracelularmente como en los especimenes del sobrenadante de estos cultivos de células T.

La explicación bioquímica de esta combinación es que el MISID, el inhibidor de RR, agotará los focos de dNTP y esto potenciará la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP), contra la integración y replicación del VIH, reduciendo de este modo el ARN de VIH. Este efecto inhibidor aumentado será o bien aditivo o bien sinérgico con el efecto ya selectivamente sinérgico de una proteína más inhibidores de proteasa contra este virus. Puesto que el MISID por sí solo parece tener una considerable actividad inhibidora anti-ARN de VIH, creemos que el silogismo demostrará ser correcto en experimentos con partículas de VIH resistentes a uno o más de estas clases de fármacos o en pacientes que están infectados con variantes de VIH multirresistentes.

Experimento 10

Determinación del efecto sinérgico de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y MISID (PL-7) en la supresión de RT de VIH Materiales y métodos

Brevemente, 3 x 10^{6} células/ml son estimuladas con un medio PHA+ durante 48 horas a 37ºC con un 5% de CO_{2}. También, el mismo número de células es incubado en un medio libre de PHA durante 48 horas para servir como control negativo. En este punto se inocula las células con el virus VIH-1 según el protocolo estándar. Nótese que en este experimento, el sobrenadante que contiene VIH de células mononucleares periféricas (PBMC, del inglés "Peripheral Mononuclear Cells") sanas humanas estimuladas por PHA no es eliminado del cultivo de células CEM/O estimulado por PHA. Por tanto, el virus VIH-1 siempre está presente en el sobrenadante, un estado experimental que simula el estado clínico in vivo de las células T sin infectar recién producidas, que están siempre bajo una exposición constante a las partículas de VIH-1. En este experimento hemos observado títulos de VIH-1 mucho mayores que para nuestro ARN de VIH de control en las células T (véase el Experimento 9). Estas partículas de virus son liberadas por células T ya infectadas y/o por nodos linfáticos de pacientes.

Los fármacos experimentales se añaden a las células en las concentraciones apropiadas al mismo tiempo que la inoculación vírica o 90 minutos después de la incubación vírica, tiempo suficiente para que las células T sean infectadas y comiencen a producir nuevas partículas del virus VIH-1. Las células de control son resuspendidas en un medio libre de fármacos por la duración de la exposición que duró siete días. Sólo se obtienen alícuotas del medio de los matraces de control en el 5º día tras Rx. En el 7º día, se eliminan tres alícuotas del medio de los matraces, de 1 ml cada una, y se almacenan en nitrógeno líquido. Además, las células que quedan son divididas en tres partes y a continuación son peletizadas y almacenadas a -80ºC. Los especimenes del sobrenadante se obtienen de estos cultivos de células T y son congelados a -80ºC. Las muestras producidas a partir de este experimento son numeradas. Se evalúa cuantitativamente el ARN de VIH de los pelets de células de los cultivos celulares (véase el Experimento 9) de los matraces de incubación vírica de 90 minutos usando un kit de ensayo, no radiactivo. Aquí describimos los resultados cuantitativos de ARN de VIH procedentes de los sobrenadantes de estas células T. Se determina la curva patrón y se calculan los niveles de ARN de HTV de las muestras experimentales como se ha descrito previamente.

Resultados y discusión

Estos especimenes proceden de los cultivos de pelets de células T del mismo experimento que aquellos de los que hemos presentado los resultados de RT de VIH (véase el Experimento 8) y de ARN de VIH cuantitativo en células T (véase el Experimento 9).

La primera observación a partir de los ensayos cuantitativos de ARN de VIH en los especimenes de sobrenadante de células T CEM/O es que hay una actividad de ARN de HTV disminuida en el séptimo día debido al tratamiento con fármacos, en comparación con las células de control sin tratar para el mismo día. Los resultados cuantitativos se muestran en la tabla adjunta (Tabla 8). Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 8 representa PEG-ASNasa. Los niveles de ARN de HTV de control cuantitativos (copias genómicas de virus/ml) son superiores a los de los experimentos previos y son similares a los niveles del control sin tratar (214445 en pelets de células T frente a 195483 en los sobrenadantes).

La inhibición de ARN de VIH en términos cuantitativos causada por SAQ, AZT o MISID por sí solos (Especimenes nº 8 a 12), no es estadísticamente significativa entre ellos (virus HTV-1 sensible a AZT). Se observan porcentajes de inhibición similares de ARN de VIH en los sobrenadantes tanto para la combinación SAQ + PEG-ASNasa, como para la combinación de tres fármacos PEG-ASNasa + SAQ + AZT, en comparación con el control sin tratar. Sin embargo, todos los tres especimenes tratados con el régimen de combinación de cuatro fármacos, MISID + AZT + PEG-ASNasa + SAQ, nº 23, 24 y 25, tienen la mayor inhibición de ARN de VIH de este experimento, 50% del control, demostrando claramente la significativa contribución del inhibidor de reductasa de ribonucleótido, el MISID. Este último conjunto de datos confirma la observación anterior de la inhibición de ARN de VIH mostrada en los pelets de células T de un 20% del control (Experimento 9). Los datos procedentes de experimentos previos y esta evidencia indican que a mayor título de VIH restante en el sobrenadante, menor sería la inhibición del virus tanto en las células T como en el sobrenadante. En otras palabras, los datos sugieren que a) estos regímenes de combinación deben darse de forma continua en estas condiciones, es decir, en pacientes con un elevado número de copia de ARN de VIH y/o viremia, y b) se requiere la potenciación de AZT + SAQ tanto por un tercer inhibidor de RT, tal como 3TC, como por un inhibidor de RR, tal como MISID o hidroxiurea, para potenciar la actividad del trifosfato de AZT (AZTTP) contra la RT de VIH.

El MISID, un nuevo inhibidor de reductasa de ribonucleótido (RR), usado por sí solo en la concentración IC_{50} (0,685 \muM), también demostró una inhibición significativa del ARN de VIH como agente sencillo que es aproximadamente igual a la inhibición tanto de SAQ como de AZT. Más importante, el MISID mostró su significativa utilidad en combinación con los otros tres fármacos tanto contra RT de VIH en pelets de células T como en sobrenadantes (véase los Experimentos 7 y 8), respectivamente, y en la supresión el ARN de VIH restante en el sobrenadante (Tabla 8). Éste es también el resultado en los pelets de células T (véase los Experimentos 6 y 9) y es una evidencia repetida de que un miembro de esta clase de inhibidores de RR ha demostrado actividad anti-VIH además de su actividad antileucémica tanto intracelularmente como en los especimenes del sobrenadante de estos cultivos de células T.

La explicación bioquímica para esta combinación es que el MISID, el inhibidor de RR, agotará los focos de dNTP y esto potenciará la actividad del AZTTP, contra la transcripción inversa, la integración y la replicación de VIH-1, reduciendo de este modo el ARN de VIH. Este efecto inhibidor aumentado será o bien aditivo o bien sinérgico con el efecto ya selectivamente sinérgico de una proteína más inhibidores de proteasa contra este virus. Puesto que el MISID por sí solo parece tener una considerable actividad inhibidora anti-ARN de VIH, creemos que este silogismo se mostrará correcto en experimentos con partículas de VIH resistentes a una o más de estas clases de fármacos o en pacientes que están infectados con variantes de VIH multirresistentes.

Experimento 10

Determinación del efecto sinérgico de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC sobre la RT de VIH en Pelets de células CEM/O

Este experimento se lleva a cabo usando un procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materias que en el Experimento 9, sin embargo se usa 3TC en lugar de MISID. En este experimento se mide la exposición de RT de VIH en pelets de células T a una combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 9. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 9 representa PEG-ASNasa. Se muestra en la Tabla 9 que hay algo de inhibición de RT de HTV debida al Saquinavir y a la PEG-ASNasa por sí solos. Sin embargo, la combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC da como resultado la completa inhibición de la RT de VIH.

\newpage

Experimento 11

Determinación del efecto sinérgico de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC sobre el ARN de VIH en sobrenadantes de células CEM/O

Este experimento se lleva a cabo usando un procedimiento similar, y las mismas concentraciones de materias que en el Experimento 10, sin embargo se mide la exposición de ARN de VIH en sobrenadantes de células T a una combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 10. Debería resaltarse que "PEG" en la Tabla 10 representa PEG-ASNasa. Se muestra en la Tabla 10 que hay algo de inhibición de ARN de VIH debida al Saquinavir y a la PEG-ASNasa por sí solos (aproximadamente 55% y 73% del control, respectivamente). La combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir, y AZT da como resultado una mayor inhibición del ARN de VIH (aproximadamente 21% del control). Sin embargo, la combinación de PEG-ASNasa, Saquinavir, AZT y 3TC da como resultado la completa inhibición del ARN de VIH (0% del control) (véase la Tabla 10).

La presente invención puede ser manifestada en otras formas específicas sin distanciarse de su espíritu ni de sus atributos esenciales.

TABLA 1

1

TABLA 2

2

3

4

TABLA 4

5

6

7

8

9

10

11

Claims

1. El uso de un compuesto de PEG-ASNasa junto con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de proteasa, compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, en el que dichos compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido son seleccionados entre hidroxiurea (HU), BW-348U87, tiosemicarbazona de 3-aminopiridina-2-carboxaldehído (3-AP), Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-trihidroxibencencarboximidamida), BILD 1257 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucina), BILD 1357 (1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida] de ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspártico), BILD 1633, BILD 733 (3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcaronil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil)leucinol,
BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclo-
pentanocarboxílico), Cl-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabino furanosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil) amino]carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxibencen carboximidamida), en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas al medicamento.

2. El uso de un compuesto de PEG-ASNasa, comprendiendo dicho compuesto de PEG-ASNasa asparaginasa conjugada con el polietilenglicol y vendido con el nombre de ONCASPAR®, como único ingrediente activo en la fabricación de un medicamento para inhibir o tratar la infección del virus de inmunodeficiencia humano (VIH) o para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas al medicamento.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto de PEG-ASNasa está en combinación con al menos un compuesto inhibidor de proteasa.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto de PEG-ASNasa está en combinación con al menos un compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto de PEG-ASNasa está en combinación con al menos un compuesto inhibidor de transcriptasa inversa de VIH.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los compuestos inhibidores de proteasa son seleccionados entre Saquinovir, Nelfinavir, Indinavir, Endinovere, Ritonavir, Crixivan, Viracept, Norvir, y VX-478.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto inhibidor de proteasa es Saquinavir o Endinovere.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto inhibidor de proteasa es Saquinavir.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH son seleccionados entre AZT (Retrovir, zidovudina), ddl (Videx, didanosina), ddC (Hivid, zalcitabina), d4T (Zerit, estavudina) y 3TC (Epivir, lamivudina).

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH son AZT (Retrovir, zidovudina) y 3TC (Epivir, lamivudina).

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el compuesto inhibidor de transcriptasa inversa de VIH es AZT (Retrovir, zidovudina).

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en el que dicho medicamento es para inhibir la producción, o limitar la propagación, del VIH en una población de células expuestas a la composición.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en el que dicho medicamento es para la inhibición o el tratamiento de VIH.

14. Un kit para tratar o prevenir un estado fisiológico asociado al VIH, comprendiendo dicho kit una pluralidad de recipientes separados, en el que al menos uno de dichos recipientes contiene una compuesto de PEG-ASNasa y al menos otro de dichos recipientes contiene uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un compuesto inhibidor de proteasa, un compuesto inhibidor de transcriptasa inversa de VIH y un compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido, y opcionalmente dichos recipientes contienen un vehículo farmacéutico, en el que dichos compuestos inhibidores de reductasa de ribonucleótido son seleccionados entre hidroxiurea (HU), BW-348U87, tiosemicarbazona de 3-aminopiridina-2-carboxaldehído (3-AP), Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-trihidroxibencen carboximidamida), BILD 1257 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucina), BILD 1357 (1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida] de ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen) asparaginil-L-(3,3-tetrametilen) aspártico), BILD 1633, BILD 733 (3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcaronil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil)leucinol, BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico), Cl-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360; N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil)amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331; (2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino] carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxibencen carboximidamida).

15. Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto de PEG-ASNasa, un compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido, y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en compuestos inhibidores de proteasa y compuestos inhibidores de transcriptasa inversa de VIH, en la que dicho compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido es seleccionado entre hidroxiurea (HU), BW-348U87, tiosemicarbazona de 3-aminopiridina-2-carboxaldehído (3-AP), Amidox (VF 236; NSC-343341; N,3,4-trihidroxibencencarboximidamida), BILD 1257 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucina), BILD 1357 (1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilamida] de ácido 2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspártico), BILD 1633, BILD 733 (3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-(3-metil)valil-L-[3-(pirrolidin-1-ilcaronil)]alanil-L-(1-carboxiciclopentil)glicil-L-(4-metil)leucinol, BILD 1263 (2-bencil-3-fenilpropionil-L-(N-metil)valil-L-3-(metil)valil-L-(N4,N4-tetrametilen)asparaginil-L-(3,3-tetrametilen)aspartil-L-(4-metil)leucinol), BILD 1351 (ácido 1-[1(S)-[5(S)-[3-[todo-cis)-2,6-dimetilciclohexil]ureido]-2(S)-(3,3-dimetil-2-oxobutil)-6,6-dimetil-4-oxoheptanoilamino]-1-[1(R)-etil-2,2-dimetilpropilcarbamol]metil]ciclopentanocarboxílico), Cl-F-araA (2-cloro-9-(2-desoxi-2-
fluoro-beta-D-arabinofuranosil)adenina, DDFC (2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina), Didox (VF 147; NSC 324360;
N,3,4-trihidroxibenzamida), Eurd (3'-Etiniluridina), GTI 2040, GTI 2501, IMHAG (1-isoquinolilmetano-N-hidroxi-N'-aminoguanina), LY 207702 (2',2'-difluoro-2'-desoxiribofuranosil-2,6-diaminopurina), LY 295501 (N-[[3,4-diclorofenil) amino]carbonil]2,3-dihidro-5-benzofuransulfonamida), MDL 101731 (FMdC; KW 2331;(2E)-2'-desoxi-2'-(fluorometilencitidina), Parabactin Sulofenur (LY 186641; N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,3-dihidro-IH-inden-5-sulfonamida), TAS 106 (Ecyd; 3'-etinilcitidina), Triapina (OCX 191; OCX 0191), Trimidox (VF 233; N,3-4,5-tetrahidroxi bencencarboximidamida).

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que dicho compuesto de PEG-ASNasa y dicho compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido están en combinación con al menos un compuesto inhibidor de proteasa.

17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que dicho compuesto de PEG-ASNasa y dicho compuesto inhibidor de reductasa de ribonucleótido están en combinación con al menos un compuesto inhibidor de transcriptasa inversa de VIH.