ES2203088T3 - Nuevos inhibidores y reguladores negativos de metaloproteinasas de matriz. - Google Patents
Nuevos inhibidores y reguladores negativos de metaloproteinasas de matriz.Info
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Abstract
Un inhibidor y regulador negativo de metaloproteinasas de matriz que contiene la estructura cíclica del motivo peptídico CXXHWGFXXC en el que las cisteínas forman un enlace disulfuro y X es cualquier residuo de aminoácido.
Description
Nuevos inhibidores y reguladores negativos de
metaloproteinasas de matriz.
La presente invención se refiere a nuevos
inhibidores y reguladores negativos de metaloproteinasas de matriz
(MMP), al proceso de preparación de estos inhibidores, a las
composiciones farmacéuticas que contienen estos inhibidores y
reguladores negativos, al uso de los nuevos inhibidores de
metaloproteinasas de matriz para la fabricación de preparaciones
farmacéuticas y de investigación, a un método para inhibir y
regular negativamente los inhibidores de MMP in vitro, y al
uso de los nuevos inhibidores de MMP en los procedimientos
bioquímicos de aislamiento y purificación de metaloproteinasas de
matriz.
Las metaloproteinasas de matriz (MMP) constituyen
una superfamilia de enzimas proteolíticas genéticamente
relacionadas y capaces de degradar a casi todos los componentes de
la matriz extracelular y la membrana basal que restringen el
movimiento celular. Las MMP también procesan serpinas, citocinas y
factores de crecimiento así como algunos componentes de la
superficie celular (Woessner, 1991;
Birkendal-Hansen, 1995; Chandler et al.,
1997). Se cree que las MMP tienen una función clave como
intermediarias en la remodelación tisular y la migración celular
durante la morfogénesis y situaciones fisiológicas como la
cicatrización de heridas, la implantación del trofoblasto y la
ruptura menstrual del endometrio.
Las MMP también están implicadas en el
procesamiento y la modificación de fenómenos moleculares como la
remodelación tisular, la angiogénesis y el procesamientos de
citocinas, factores de crecimiento y sus receptores (Chandler et
al.,1997). Las MMP también participan en la liberación y el
procesamiento proteolítico del factor de necrosis tumoral
(TNF-\alpha) unido a membranas por parte de
monocitos inducidos por el factor de virulencia bacteriana. Este
evento está mediado por una metaloproteinasa unida a membrana, la
TACE (enzima activadora del TNF-\alpha). De esta
forma, los inhibidores de MMP, como los nuevos péptidos que se
presentan en esta invención, pueden, entre otras cosas, evitar la
activación del TNF-\alpha ya que bloquean a estas
enzimas activadoras (Shapira et al., 1997).
Se ha demostrado en varios estudios que la
expresión y la actividad de las MMP se elevan patológicamente hasta
superar el escudo antiproteinasas del cuerpo en una serie de
enfermedades como cáncer, metástasis, artritis reumatoide,
esclerosis múltiple, periodontitis, osteoporosis, osteosarcoma,
osteomielitis, bronquiectasis, enfermedad obstructiva pulmonar
crónica y enfermedades cutáneas y oculares. Se piensa que las
enzimas proteolíticas, en especial las MMP, contribuyen al daño de
la destrucción de tejidos asociado con estas enfermedades.
Hay una gran variedad de otros trastornos en los
cuales la degradación / destrucción de proteínas extracelulares
tienen una función muy importante. Ejemplos de dichas enfermedades
incluyen las artritis, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA), quemaduras, heridas como úlceras por decúbito y úlceras
varicosas, fracturas traumatismos, úlcera gástrica, afecciones de
la piel como acné y soriasis, lesiones liquenosas, epidermólisis
ampollar, aftas (úlceras orales reactivas), enfermedades dentales
como afecciones periodontales, periimplantitis, quistes de
mandíbula y otros, y enfermedades relacionadas con el tratamiento de
conductos o tratamiento endodóntico, la resorción radicular externa
e intrínseca, caries, etc.
Se conocen al menos 20 miembros de la
superfamilia de las MMP (Birkendal-Hansen, 1995; Pei
y Weiss, 1996; Llano et al., 1997) y el número de miembros
de la superfamilia de las MMP, junto con su origen celular, está en
constante crecimiento. Cada una de las enzimas MMP contienen un
supuesto sitio tridentado de unión a Zn^{2+} que se cree que
constituye el sitio activo de la enzima. Hace muy poco tiempo se
descubrieron tres nuevos miembros de la familia de MMP mediante la
búsqueda, en bibliotecas de ADNc, de homologías a regiones
conservadas de los genes de MMP conocidos; se les llamó
metaloproteinasas de matriz de tipo membrana -1, -2 y -3
(MT-MMP -1,
-2 y -3). Cada una de las MT-MMP, como casi todas las MMP caracterizadas previamente, contienen, con base en las secuencias de aminoácidos predichas, (i) un candidato a secuencia líder, (ii) una región de propéptido que incluye una secuencia PRCGXPD muy conservada que ayuda a estabilizar el cimógeno de la MMP en un estado carente de actividad catalítica, (iii) un dominio catalítico de unión a cinc y (iv) un dominio similar a hemopexina cercano a sus extremos C. Además, en un patrón que se asemeja al descrito para la estromelisina 3, cada una de las MT-MMP contiene un corto inserto de aminoácidos, emparedada entre sus dominios propéptido y catalítico, que codifica un motivo potencial de reconocimiento por parte de los miembros de la familia de las convertasas de proproteína. Sin embargo, a pesar de la considerable similitud con otros miembros de la familia de las MMP, sólo las MT-MMP contienen extensiones de aproximadamente 75-100 aminoácidos en sus extremos C, cada una de las cuales incluye un tramo hidrofóbico que es congruente con la presencia de un dominio transmembrana (TM). Así, en contraste con todas las demás MMP, las MT-MMP se expresan como ectoenzimas asociadas a membrana más que como proteínas solubles (Pei y Weiss, 1996).
-2 y -3). Cada una de las MT-MMP, como casi todas las MMP caracterizadas previamente, contienen, con base en las secuencias de aminoácidos predichas, (i) un candidato a secuencia líder, (ii) una región de propéptido que incluye una secuencia PRCGXPD muy conservada que ayuda a estabilizar el cimógeno de la MMP en un estado carente de actividad catalítica, (iii) un dominio catalítico de unión a cinc y (iv) un dominio similar a hemopexina cercano a sus extremos C. Además, en un patrón que se asemeja al descrito para la estromelisina 3, cada una de las MT-MMP contiene un corto inserto de aminoácidos, emparedada entre sus dominios propéptido y catalítico, que codifica un motivo potencial de reconocimiento por parte de los miembros de la familia de las convertasas de proproteína. Sin embargo, a pesar de la considerable similitud con otros miembros de la familia de las MMP, sólo las MT-MMP contienen extensiones de aproximadamente 75-100 aminoácidos en sus extremos C, cada una de las cuales incluye un tramo hidrofóbico que es congruente con la presencia de un dominio transmembrana (TM). Así, en contraste con todas las demás MMP, las MT-MMP se expresan como ectoenzimas asociadas a membrana más que como proteínas solubles (Pei y Weiss, 1996).
En los artículos de Woessner (1991); Krane
(1994), Birkendal-Hansen et al (1993) y
Birkendal-Hansen (1995) se puede encontrar una
revisión completa de los miembros de la familia de las MMP, su
activación, modos de acción, su inhibición por diversas proteínas
naturales (inhibidores endógenos) y compuestos sintéticos así como
detalles de la intervención de miembros de la familia de las MMP en
diversas condiciones patológicas y enfermedades; la descripción
completa se incorpora en la presente memoria como referencia. En el
alcance de la presente invención, la expresión metaloproteinasas de
matriz (MMP) se refiere a todas las MMP descubiertas.
\newpage
La gelatinasa A o MMP-2 de 72 kDa
y la gelatinasa B o MMP-9 de 92 kDa se describieron
en un principio como colagenasas tipo IV, ya que parecían ser
enzimas esenciales para la degradación de la membrana basal
(Tryggvason et al., 1987). Las células necesitan atravesar
la membrana basal del endotelio para entrar y salir de la
circulación. Este también es un paso clave fundamental en la
cascada metastática que las células tumorales deben completar antes
de poder metastatizar a órganos distantes. La MMP-2
y la MMP-9 podrían tener también una función en
otros pasos de la cascada metastática como en la angiogénesis
(Hanahan y Folkman, 1996; Volpert et al., 1998) y en la
invasión tumoral local (Stetler-Stevenson et
al., 1993).
Dado que las MMP son blancos potenciales para la
intervención terapéutica, hay una gran cantidad de trabajo dirigido
al diseño de inhibidores sintéticos de metaloproteinasas. Se han
desarrollado muchos compuestos inhibidores de MMP que contienen
grupos reactivos quelantes de cinc como tiol, hidroxamato, EDTA,
fosfonamidato, fosfinato, etc. (Beckett et al., 1996).
Algunos de los miméticos de péptidos han demostrado efectos
positivos en modelos animales de metástasis, artritis y otras
enfermedades inflamatorias. La invasión por células tumorales
también se puede inhibir mediante los inhibidores nativos de las MMP
como el TIMP-1 (inhibidor tisular de
metaloproteinasa) y el TIMP-2. Las MMP también se
pueden inhibir con péptidos que imiten la muy conservada región
prodominio de las MMP que es importante para su latencia (Park et
al., 1991; Melchiori et al., 1992; Fotouhi et
al., 1994). Además, se ha determinado que se pueden inhibir MMP
con tetraciclinas y sus formas químicamente modificadas no
antimicrobianas (CMT), así como los derivados de la antraciclina
(Golub et al., 1992; Sorsa et al., 1994).
Aunque la discusión anterior demuestra que
algunos inhibidores de las MMP existen y ya han sido investigados,
los ensayos están mayormente en etapa experimental y no hay hasta
el momento ningún inhibidor de MMP como fármaco terapéutico o
profiláctico para ninguno de los estados patológicos y enfermedades
que podrían estar conectadas con las MMP. Se han detectado efectos
secundarios adversos para los inhibidores de MMP antes mencionados,
por ejemplo, toxicidad (péptidos sintéticos), actividades
antimicrobianas (tetraciclinas), etc.
Una vía alterna al diseño molecular racional es
la búsqueda en bibliotecas de péptidos al azar u otras sustancias
químicas con el fin de encontrar compuestos líderes capaces de
unirse a moléculas diana. En particular, las bibliotecas de
péptidos que se presentan en la superficie de los bacteriófagos han
producido a menudo péptidos capaces de unirse a proteínas diana. Sin
embargo, ha resultado más difícil aislar inhibidores de proteinasas
de bibliotecas de péptidos cortos, tal vez debido a que las
proteinasas degradan muy fácilmente a estos péptidos cortos. Más
bien las bibliotecas de péptidos presentadas por fagos se han
utilizado para obtener información de la secuencias escindidas por
una proteinasa (Matthews y Wells, 1993; Smith et al.,
1995).Se han desarrollado inhibidores de proteinasas mediante la
expresión en la superficie del fago y la selección de grandes
dominios de inhibidores de proteinasas en los cuales se han
dispuesto al azar algunos residuos del sitio activo (Roberts et
al., 1992; Dennis et al., 1995).
Los autores de la presente invención han aislado
ahora con éxito nuevos péptidos inhibidores de MMP, particularmente
de MMP-9 y MMP-2, utilizando
bibliotecas de péptidos presentadas por fagos a los cuales se les
agregó una restricción conformacional mediante enlaces disulfuro
diseñados. Los inhibidores de MMP más activos son capaces de
inhibir la migración de células endoteliales in vitro, así
como la invasión de células tumorales, de forma que constituyen
potenciales compuestos líder para el diseño de péptidos miméticos
para bloquear las MMP. Los péptidos también se pueden utilizar en
matrices para cromatografía en columna para los procedimientos de
aislamiento y purificación bioquímica de las MMP.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es proporcionar nuevos inhibidores de metaloproteinasas de matriz y
ligandos de unión basados en la estructura cíclica (enlace
disulfuro entre las cisteínas) del motivo peptídico CXXHWGFXXC que
corresponde a la secuencia presentada en la SEC ID nº 1 de la lista
de secuencias y en la que X es cualquier residuo de aminoácido.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar nuevos inhibidores y reguladores negativos de
metaloproteinasas de matriz basados en la estructura cíclica de los
motivos peptídicos
CRRHWGFEFC
que corresponde a la secuencia presentada en la
SEC ID nº 2, y
CTTHWGFTLC
que corresponde a la secuencia presentadas en la
SEC ID nº 3.
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica que contiene una cantidad del o de los
nuevos inhibidores / reguladores negativos de metaloproteinasas de
matriz que sea efectiva para reducir las actividades, activaciones,
funciones y expresiones de una o más MMP, especialmente
MMP-2 y/o MMP-9, y un excipiente
aceptable desde el punto de vista farmacéutico y bioquímico. Las
composiciones farmacéuticas que contienen nuevos inhibidores /
reguladores negativos de MMP de acuerdo con la invención pueden
utilizarse en forma sistémica, local o tópica. También incluyen
todas las combinaciones potenciales (formas farmacéuticas
combinadas) con otros inhibidores de MMP, otros fármacos y
moléculas o sustancias empleadas para dirigirlos hacia tumores.
\newpage
La presente invención también incluye el uso de
los nuevos inhibidores de metaloproteinasas de matriz para la
fabricación de preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de
estados dependientes de metaloproteinasas de matriz, y también su
empleo, por ejemplo como ligandos de afinidad para los
procedimientos bioquímicos de purificación y aislamiento de MMP.
Entre las condiciones dependientes de MMP se incluyen, entre otras,
heridas, quemaduras, fracturas, lesiones, úlceras, progresión de
cáncer y metástasis en tejidos conjuntivos y hueso, periodontitis,
gingivitis, peri-implantitis, quistes, tratamiento
de conductos radiculares, resorción interna y externa del canal
radicular, caries, SIDA, úlcera corneal, úlcera gástrica, aftas,
traumatismo, acné, soriasis, aflojamiento de prótesis óseas de
cadera, osteomielitis, osteoporosis, remodelación tisular,
angiogénesis, artritis (reumatoide, reactiva y osteoartritis),
enfermedades pulmonares (bronquiectasis, enfermedad obstructiva
pulmonar crónica y otras enfermedades pulmonares).
La presente invención también se refiere a un
proceso para la preparación de nuevas metaloproteinasas de matriz
el cual implica la síntesis de péptidos por el proceso estándar de
Merrifield en fase sólida.
La nueva estructura CXXHWGFXXC, de acuerdo con la
invención no presenta similitud con inhibidores de MMP descritos
anteriormente, aunque las actividades de los CTTHWGFTLC se parezcan
a las propiedades de las tetracicilinas químicamente modificadas
(CMT) como se describirá más adelante. Los péptidos que contienen
la nueva estructura se derivaron de la expresión de una biblioteca
CX_{9} de una sola cisteína y presentan una secuencia consenso
HWGF. Todas contenían una segunda cisteína y presentan una
estructura cíclica CXXHWGFXXC. Los experimentos de unión de fagos
indicaron que los fagos clonados se unían a MMP-9
con una afinidad considerable.
Los péptidos cíclicos según la invención
inhibieron la degradación de sustratos de gelatina y caseína por
parte de la MMP-2 y MMP-9 con
IC_{50} de 5-10 \mug/ml. Entre una serie de
péptidos sintetizados, los que contenían la secuencia HWGF:
CRRHWGFEFC y CTTHWGFTLC, fueron los más prometedores como
inhibidores de la MMP-9. Estos dos péptidos que
contienen HWGF también inhibieron la MMP-2. El
hecho de que los péptidos se seleccionaron con base en la
MMP-9, pero también pueden inhibir fuertemente a la
MMP-2, indica que los péptidos reconocen un sitio
de unión que es muy similar entre MMP-9 y
MMP-2.
El péptido más activo desarrollado que contiene
HWGF (CTTHWGFTLC) inhibió la migración celular estudiada en medios
normales que contenían suero y bloqueó la migración de células
endoteliales humanas, así como la invasión de células HT1080 de
fibrosarcoma y C8161 de melanoma a través de una membrana basal
reconstituida. Estos hallazgos implican que tanto las células
cancerosas como las endoteliales podrían utilizar mecanismos
dependientes de MMP muy similares para migrar, y que este mecanismo
es sensible a los efectos de regulación negativa de CTTHWGFTLC. La
gran actividad de CTTHWGFTLC podría deberse, al menos en parte, al
hecho de que el péptido puede inhibir no sólo una enzima activa,
sino que puede interferir con la autoactivación de
proMMP-9 y proMMP-2 purificadas,
tal como se muestra más adelante mediante el uso de sustratos de
gelatina y caseína. El péptido también puede regular negativamente
la producción de MMP-9. En contraste con los datos
de unión del fago, en los cuales no se pudo observar la unión del
fago a proMMP-9, el péptido sintético CTTHWGFTLC se
une a proMMP-9, como lo indica el aislamiento en un
solo paso de proMMP-9 a partir de capa leucocítica
humana mediante cromatografía de afinidad con el péptido acoplado a
sefarosa. En general, es posible que por su unión a proMMP el
péptido pueda dificultar la verdadera activación proteolítica por
otras proteinasas, que es el mecanismo probable de activación
durante la invasión celular.
Los péptidos lineales correspondientes resultaron
prácticamente inactivos, como lo demuestra la pérdida de actividad
después de la reducción y alquilación de las cisteínas. Los
inhibidores de MMP especialmente preferidos de acuerdo con la
presente invención son entonces los inhibidores peptídicos cíclicos
CTTHWGFTLC y CRRHWGFEFC, que inhiben la actividad de
MMP-2 y MMP-9 como se demuestra más
adelante.
Como ya se estableció, los nuevos inhibidores
peptídicos cíclicos que han sido desarrollados por los autores de
la invención son compuestos líderes útiles para diseñar miméticos
peptídicos para bloquear las MMP y la migración celular. El motivo
CXXHWGFXXC puede usarse también para desarrollar inhibidores más
selectivos hacia miembros individuales de la familia de MMP, ya que
MMP-2 y MMP-9 se inhibieron en forma
diferente por los dos péptidos CXXHWGFXXC: MMP-2 se
inhibió más fuertemente con CTTHWGFTLC, mientras que
MMP-9 se inhibió preferentemente con CRRHWGFEFC.
Los inhibidores selectivos dirigidos, por ejemplo, hacia
MMP-2, podrían resultar más eficientes para prevenir
la diseminación de tumores ya que, en muchos sistemas
experimentales, el potencial metastático de las células tumorales
se correlaciona con la actividad de MMP-2 más que
con la actividad de MMP-9. Finalmente, el tamaño
reducido de los péptidos cíclicos dirigidos contra MMP se puede
utilizar para transportar fármacos hacia los tumores. Se ha
encontrado que los péptidos de bibliotecas de fago dirigidos contra
receptores en la vasculatura del tumor son útiles como
transportadores de fármacos citotóxicos hacia tumores en ratones.
Las MMP son receptores potenciales para una quimioterapia dirigida,
ya que habitualmente se sobreexpresan en tumores, en comparación
con los tejidos normales, y parecen estar implicadas en el proceso
de angiogénesis.
Así, como resultado de la invención, los estados
dependientes de MMP pueden tratarse o prevenirse con los nuevos
inhibidores de MMP solos o combinados con otros fármacos que
normalmente se usan en relación con la enfermedad o trastorno en
cuestión. Entre ellos están, por ejemplo, las tetraciclinas, las
tetraciclinas modificadas químicamente (Golub et al., 1992),
los bisfosfonatos, así como moléculas dirigidas y transportadoras
hacia los sitios de los tumores, como los péptidos de unión a
integrinas (Arap et al., 1998). La cantidad de los nuevos
inhibidores de metaloproteinasas de matriz que se vaya a usar en
las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente
invención varía según el inhibidor específico empleado, el paciente
y la enfermedad a tratar, así como la vía de administración.
Los nuevos inhibidores de MMP de la presente
invención no han mostrado toxicidad cuando se inyectaron en animales
y no afectan el número ni la viabilidad celular según se determinó
por exclusión del colorante azul trípano.
La presente invención también se refiere a un
método para inhibir las metaloproteinasas de matriz in vitro,
que implica agregar a un sistema in vitro el o los nuevos
inhibidores de metaloproteinasas de matriz en una cantidad efectiva
para inhibir la actividad MMP.
Un objeto adicional de la invención es un método
para aislar y purificar metaloproteinasas de matriz con la ayuda del
o de los nuevos inhibidores de metaloproteinasas de matriz.
La Fig. 1 muestra los resultados de la inhibición
de la degradación de [^{125}I]-gelatina mediada
por MMP-9 utilizando péptidos sintéticos. La
MMP-9 activada con APMA se preincubó con CRRHWGFEFC
y CTTHWGFTLC a las concentraciones indicadas, durante 1 h, antes de
agregar el sustrato de [^{125}I]-gelatina.
Después de la gelatinólisis durante 1 h, se determinaron las cuentas
liberadas al medio. El resultado muestra medias de mediciones por
duplicado. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos
independientes.
La Fig. 2 muestra la gelatinólisis inducida por
MMP o sus proformas activadas por APMA. Las concentraciones del
péptido CRRHWGFEFC cíclico y lineal fueron 10 \mug/ml. El
resultado muestra medias de experimentos por duplicado.
La Fig. 3 muestra la inhibición mediante
CTTHWGFTLC (A, B) y CRRHWGFEFC (C, D) de la degradación de caseína
mediada por MMP-2. Después de 1 h de tratamiento
previo con los péptidos, la MMP-2 activada con APMA
(A, C) o proMMP-2 (B, D) se incubó con la caseína
durante 2 h. Se utilizó \beta-caseína 52 \muM
como sustrato de las MMP. Lo que se muestra es la tinción con azul
Coomassie de la \beta-caseína de 21 kDa (pista 1)
y sus fragmentos (pistas 2-9) separados por
SDS-PAGE (A, B); el CTTHWGFTLC se usó en las
siguientes concentraciones: (2) 0 \mug/ml, (3) 75, (4) 50, (5)
25, (6) 10, (7) 5, (8) 1 y (9) 0,5 \mug/ml en las pistas
2-9, respectivamente. (C, D); las concentraciones
de CRRHWGFEFC fueron 0, 250, 100, 50, 25, 10, 1 y 0,5 \mug/ml,
respectivamente.
La Fig. 4 muestra la unión de
proMMP-9 al péptido CTTHWGFTLC acoplado a sefarosa.
Se aplicó un lisado de células de capa leucocítica humana a cada
péptido-sefarosa y las proteínas unidas se
analizaron en geles con SDS seguidos por tinción con azul Coomassie
(pistas 1-2) o inmunotransferencia con anticuerpos
anti-MMP-9 (pistas
5-6). Las pistas 1 y 5 muestran las proteínas
eluidas de la CTTHWGFTLC sefarosa. Las pistas 2 y 6 muestran las
proteínas eluidas de la GACLRSGRGCGA-sefarosa. La
pista 3 muestra la tinción de proteínas del lisado celular. La
pista 4 muestra los marcadores de peso molecular de 200, 92, 76 y
55 kDa.
La Fig. 5 muestra cómo el CTTHWGFTLC inhibe la
migración de las células de fibrosarcoma HT1080. Las células se
trataron previamente durante 2 h con CTTHWGFTLC a las
concentraciones indicadas, o con 500 \mug/ml del péptido no
relacionado EVGTGSCNLECVSTNPLSGTEQ que se usó como testigo. Las
células se cultivaron en cámaras Transwell y se les permitió migrar
durante 20 h en un medio que contenía l0% de suero. Las células que
atravesaron hasta la superficie inferior del filtro se tiñeron y se
escaneó el área del filtro. Los resultados muestran la densidad
óptica media \pm S.D. de pocillos por triplicado. La densidad
óptica de la Transwell testigo sin células fue de 0,000.
La Fig. 6 muestra la comparación de la eficacia
de los inhibidores de MMP, CTTHWGFTLC y CMT-8, para
impedir la migración de células de melanoma C8161. Las células se
trataron previamente con CTTHWGFTLC, CMT-8, o con el
testigo de EVGTGSCNLECVSTNPLSGTEQ y se los permitió migrar durante
20 h en cámaras Transwell. Las células que migraron a la superficie
inferior del filtro se tiñeron y escanearon. Los resultados
muestran la densidad óptica media \pm S.D. de pocillos por
triplicado.
La Fig. 7 muestra la inhibición de la migración
de células endoteliales por CTTHWGFTLC. Se permitió que las células
endoteliales migraran durante 18 h en presencia de 20% de suero
para las HUVEC, o de 10% de suero para la línea Eahy926. Se
presenta el número relativo de células que cruzaron hasta la
superficie inferior de las cámaras Transwell. Los resultados
muestran medias \pm SD de pocillos por triplicado.
La Fig. 8 muestra la inhibición por CTTHWGFTLC de
la invasión de Matrigel por parte de células tumorales. Se permitió
que las células C8161 o HT1080 invadieran a través de Matrigel
durante 24 h en un medio que contenía 10% de suero. Las
concentraciones de CTTHWGFTLC y del testigo de
EVGTGSCNLECVSTNPLSGTEQ fueron 500 \mug/ml. Las células invasoras
se contaron y el número relativo de células se expresa como media
\pm S.D. de pocillos por triplicado.
La Fig. 9 muestra que el crecimiento del
carcinoma de mama se inhibe claramente por el péptido
CTTHWGFTLC.
La Fig. 10 muestra el cimograma de gelatina de
medio acondicionado para células de melanoma. El péptido
CTTHWGFTLC, pero no el péptido testigo, inhibe la formación de la
MMP-9 activa de 82 kDa.
Las Figuras 11A, 11B y 11C muestran células
MB-435 de carcinoma de mama desarrolladas durante 2
días en 10% de suero en ausencia o presencia del péptido
CTTHWGFTLC.
La Fig. 12 muestra el efecto de CTTHWGFTLC (P291)
sobre la producción y expresión de gelatinasa de queratinocitos.
La Fig. 13 muestra el efecto de CTTHWGFTLC (P291)
sobre la migración de queratinocitos. La fotografía de las placas se
tomó después de 4 días de migración.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención,
sin embargo, no la limitan de ninguna manera.
La biblioteca CX_{9}, que expresa una sola
cisteína se preparó de acuerdo con los métodos descritos
previamente (Koivunen et al., 1994a; Koivunen et al.,
1994b y Koivunen et al., 1995) todos los cuales se
incorporan aquí como referencia.
La proMMP-9 se purificó de
neutrófilos humanos y se activó con acetato aminofenilmercúrico
(APMA) esencialmente como se describe por Hibbs et al.
(1985). Para la selección del fago de unión a MMP-9,
la MMP-9 activada con APMA se usó para recubrir
pocillos de microtitulación durante toda la noche a 4ºC utilizando
una concentración de 1 \mug/ml, después de lo cual los pocillos se
saturaron con albúmina de suero bovino al 5%. En la primera
selección, la biblioteca se incubó toda la noche a 4ºC en tampón
Tris HCl 50 mM/ NaCl 0,1 M (pH 7,5) (TBS) que contenía albúmina de
suero bovino al 1% y después de un lavado exhaustivo, los fagos
unidos se eluyeron con un tampón de pH bajo. En las selecciones
siguientes, los fagos amplificados se unieron durante 1 h a 22ºC.
Los clones escogidos al azar se amplificaron durante toda la noche
y se secuenciaron según se describe por Koivunen et al
(1994b). La unión de cada clon a la MMP-9 se
verificó por un ensayo de adhesión en el cual el fago clonado se
incubó durante 60 min en pocillos de microtitulación revestidos con
MMP o testigo. Los pocillos se lavaron cinco veces con TBS que
contenía Tween 20 al 0,5%. Los fagos unidos se cuantificaron por
la adición de 50 ng por pocillo de anticuerpo
anti-M13 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) marcado con un
quelato de europio (Wallac Ltd., Turku, Finlandia). Después de una
incubación de 45 min seguida de lavado, se midió la fluorescencia
con un fluorímetro 1230 Arcus (Wallac Ltd., Turku, Finlandia).
De la biblioteca CX_{9} se derivaron tres
secuencias de unión a MMP-9, CRRHWGFEFC, CTTHWGFTLC
y
CSLHWGFWWC. Las tres contenían una segunda cisteína y presentaban una estructura cíclica CXXHWGFXXC. A pesar de varios intentos, sólo se pudieron aislar tres fagos que contenían HWGF, aparentemente debido al carácter dominante del motivo LRSGRG en los clones seeleccionados. Por lo tanto, s construyó una biblioteca de péptidos, en la cual se colocaron tetrapéptidos al azar (y por ende también HWGF) flanqueados en ambos lados por residuos cisteína, los cuales podrían formar varios puentes disulfuro y, por lo tanto, restringir la conformación del péptido. Esta biblioteca CX_{3}CX_{4}CX_{2}C expresaba tres tamaños diferentes de anillo peptídico con dos, tres y cuatro residuos al azar. Al seleccionar con MMP-9, esta biblioteca proporcionó los motivos WGF, YGF y FGF, que son similares a la secuencia consenso HWGF excepto, porque no se conserva la histidina.
CSLHWGFWWC. Las tres contenían una segunda cisteína y presentaban una estructura cíclica CXXHWGFXXC. A pesar de varios intentos, sólo se pudieron aislar tres fagos que contenían HWGF, aparentemente debido al carácter dominante del motivo LRSGRG en los clones seeleccionados. Por lo tanto, s construyó una biblioteca de péptidos, en la cual se colocaron tetrapéptidos al azar (y por ende también HWGF) flanqueados en ambos lados por residuos cisteína, los cuales podrían formar varios puentes disulfuro y, por lo tanto, restringir la conformación del péptido. Esta biblioteca CX_{3}CX_{4}CX_{2}C expresaba tres tamaños diferentes de anillo peptídico con dos, tres y cuatro residuos al azar. Al seleccionar con MMP-9, esta biblioteca proporcionó los motivos WGF, YGF y FGF, que son similares a la secuencia consenso HWGF excepto, porque no se conserva la histidina.
Los autores de la invención sintetizaron los
péptidos cíclicos correspondientes a los motivos de fago del
Ejemplo 1 que mostraron la mayor afinidad por MMP-9
y determinaron la actividad como inhibidores de metaloproteinasas
de los péptidos sintéticos mediante ensayos de degradación de
gelatina y caseína.
Los péptidos se sintetizaron en una Applied
Biosystems modelo 433A (Foster City, CA) utilizando la química Fmoc
y se ciclaron en ácido acético al 5% (pH 6,0) que contenía 20% de
dimetilsulfóxido durante toda la noche a temperatura ambiente con
mezcladura constante. Después de una dilución 1:2 con ácido
trifluoroacético al 0,1%, los péptidos se purificaron mediante HPLC
de fase inversa. Las estructuras de los péptidos se confirmó por
espectrometría de masas. Los péptidos se almacenaron en una
solución origen de 100 mg/ml en H_{2}0, y se diluyeron con
tampones de pH neutro inmediatamente antes de usarse.
Para los análisis de degradación de gelatina y
caseína, las MMP-2 y MMP-9
purificadas (50-100 ng) se incubaron primero durante
60 min con diferentes concentraciones de los inhibidores peptídicos,
después de lo cual se agregó un sustrato de
\beta-caseína de 21 kDa (52 \muM) o
[^{125}I]-gelatina. Después de incubar durante 2
h a 22ºC, la degradación de la caseína se analizó mediante
electroforesis en gel con SDS. La degradación de
[^{125}I]-gelatina se determinó por el recuento
de la radiactividad en el sobrenadante después de precipitar la
gelatina no degradada con ácido tricloroacético al 20%.
Entre una serie de péptidos sintetizados, se
encontró que los que contenían el motivo HWGF, CRRHWGFEFC y
CTTHWGFTLC, eran los inhibidores más prometedores de la
MMP-9. En el ensayo de degradación de
[^{125}I]-gelatina, el CRRHWGFEFC fue el más
activo de los dos péptidos e inhibió a la MMP-9
activada con APMA con una concentración inhibidora semimáxima
(IC_{50}) de aproximadamente 10 \mug/ml (Fig. 1).
Los péptidos que contenían HWGF también
inhibieron la actividad gelatinolítica mediada por
proMMP-9 que se autoactiva durante la incubación con
gelatina. La Fig. 2 muestra que se obtuvo más de un 50% de
inhibición de la actividad de proMMP-9 con el
péptido CRRHWGFEFC a una concentración de 10 \mug/ml. Para
evaluar la importancia del enlace disulfuro en la actividad del
péptido CRRHWGFEFC, los autores de la invención prepararon la
versión lineal del péptido por reducción y alquilación de los
residuos cisteína según se describe por Koivunen et al
(1993). La linearización del péptido tuvo como resultado la pérdida
de actividad inhibitoria sobre proMMP-9, así como
sobre la enzima activada con APMA (Fig. 2).
La proMMP-2 se purificó de
fibroblastos gingivales humanos en medio de cultivo libre de suero.
Los dos péptidos que contienen HWGF, CRRHWGFEFC y CTTHWGFTLC,
también inhibieron la MMP-2, y a una concentración
de 10 \mug/ml el péptido cíclico CRRHWGFEFC bloqueó la
gelatinólisis mediada tanto por proMMP-2 como por
MMP-2 activada con APMA (Fig. 2). El péptido lineal
que se utilizó como testigo resultó prácticamente inactivo.
También usaron \beta-caseína
como sustrato de las gelatinasas y analizaron los productos de
degradación mediante electroforesis en gel con SDS. Los dos
péptidos que contienen HWGF evitaron efectivamente la degradación de
caseína mediada por las MMP. Para MMP-2, los
péptidos CTTHWGFTLC y CRRHWGFEFC tuvieron valores de IC_{50} de
aproximadamente 5 \mug/ml y 25 \mug/ml, respectivamente
(Figuras 3A y 3C). La proMMP-2 no preactivada con
APMA también provocaba la degradación de caseína y esta actividad
fue bloqueada por los péptidos con las mismas IC_{50} de 5
\mug/ml y 25 \mug/ml, respectivamente (Figuras 3B y 3D). La
caseinólisis mediada por MMP-9 fue inhibida de
forma similar por los péptidos en concentraciones micromolares
bajas, excepto que el CRRHWGFEFC resultó un inhibidor ligeramente
más potente para esta MMP que el CTTHWGFTLC. Estos péptidos
(0-200 \mug/ml) no inhibieron la metaloproteinasa
de matriz de membrana-1 (MT1-MMP),
lo que constituye una evidencia de la importancia de las
gelatinasas (MMP-9 y -2) en la invasión tumoral y la
destrucción de la membrana basal.
Para demostrar que los péptidos sintéticos
seleccionados de las bibliotecas de fago reconocen a la
MMP-9 los autores de la invención llevaron a cabo
una cromatografía de afinidad con los péptidos acoplados a
sefarosa.
La resina de cromatografía de afinidad de
CTTHWGFTLC se preparó por acoplamiento entre 2 mg de péptido y 1 ml
de sefarosa activada con CNBr de acuerdo con las instrucciones del
fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se lisaron células de capa
leucocítica humana obtenidas de la Cruz Roja Finesa en TBS 50 mM
con 1% de octilglucósido, y e sembraron 20 ml del extracto libre de
células en cada péptido sefarosa. Las columnas se lavaron hasta que
la DO_{280} fue menor que 0,01. Las proteínas unidas se eluyeron
con tampón de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,2, en
presencia de octilglucósido al 1%. El pH se neutralizó después con
base Tris 1 M. Se analizaron 20\mul de las fracciones mediante
electroforesis en gel con SDS en geles de acrilamida al 8% en
condiciones reductoras. Las proteínas se tiñeron con azul Coomassie.
Para el análisis de inmunotransferencia, se incubaron filtros de
nitrocelulosa con anticuerpos policlonales
anti-MMP-9 en una dilución 1:500
durante 1 h y después con anticuerpos secundarios
anti-conejo en una dilución 1:1000 durante otra
hora. Para la visualización se utilizó un sistema de
quimioluminiscencia amplificada (Amersham, Buckinghamshire,
Inglaterra).
Los extractos de leucocitos se aplicaron a
columnas de sefarosa acoplada con CTTHWGFTLC y las proteínas unidas
se analizaron mediante electroforesis en gel con SDS e
inmunotransferencia con anticuerpos
anti-MMP-9. La columna con el
péptido se unió un conjunto de polipéptidos, uno de los cuales era
la proMMP-9 de 92kDa (Fig. 4). La
proMMP-9 unida a CTTHWGFTLC sefarosa migró en geles
con SDS como un doblete de 92kDa (pista 1), las dos formas fueron
inmunorreactivas a los anticuerpos
anti-MMP-9(pista 6). Se puede
observar un doblete similar en inmunotransferencias de
MMP-9 de medios de cultivo acondicionados por varias
líneas de células tumorales (no se muestran los datos). La péptido
sefarosa también se unió a un conjunto de polipéptidos que migraron
a 55-65 kDa, cuya identidad se desconoce y que no
fueron estudiados adicionalmente.
Los autores de la invención escogieron utilizar
el péptido CTTHWGFTLC para probar la efectividad de los nuevos
inhibidores de MMP que contienen HWGF dado que tiene mejor
solubilidad.
La línea de células endoteliales HUVEC (células
endoteliales de vena umbilical humana, obtenidas de ATCC,
Rockville, MD) se cultivó en medio RPMI 1640 que contenía
penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), HEPES
10 mM, 30 \mug/ml de suplemento para cultivo de células
endoteliales (Biomedical Technologies, Stoughton, MA), y suero fetal
bovino al 20%. Las células HT1080 de fibrosarcoma (ATCC, Rockville,
MD), células C8161 de melanoma y células Eahy926 (derivadas de
HUVEC) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco que
contenía los antibióticos, suero de ternero fetal al 10%, y un
aditivo de hipoxantina/aminopterina/timidina para las células
Eahy926. Los cultivos celulares se recolectaron con tripsina y EDTA
(células endoteliales) o EDTA solo (otras células), se lavaron y se
resuspendieron en el medio completo con suero que se indicó
anteriormente.
La migración de células al azar se estudió con
placas Transwell (Costar, Cambridge, MA) con un tamaño de poro de
8,0 \mum y 6,5 mm de diámetro que se equilibraron con el medio
que contiene suero durante 2 h antes de usar. La invasión por
células tumorales se estudió con cámaras de Boyden de 6,4 mm de
diámetro recubiertas previamente con Matrigel (Becton Dickinson,
Bedford, MA) y equilibradas con el medio que contiene suero. Se
agregaron 750 \mul del medio con contenido en suero en los
compartimientos inferiores del equipo de migración. En los ensayos
de migración al azar, las células se incubaron previamente durante
2 h en presencia de los péptidos en la concentración indicada y se
cultivaron 20.000 células en la placa Transwell en un volumen de
100 \mul. Para la invasión sobre Matrigel, en cada pocillo se
sembraron 100.000 células en un volumen de 500 \mul con o sin los
péptidos. Después de cultivar las células durante
16-20 h, éstas se fijaron en metanol, se lavaron y
se tiñeron con azul de toluidina. Las células se retiraron de la
superficie superior de la membrana con un hisopo de algodón y las
células que habían migrado a la cara inferior de la membrana se
contaron con un microscopio o se cuantificaron mediante un
escáner.
El péptido CTTHWGFTLC logró bloquear la migración
de diversas líneas celulares estudiadas en presencia de 10 ó 20% de
suero. En el ensayo la prueba de migración al azar en la placa
Transwell, el péptido inhibió, en forma dependiente de la
concentración, la movilidad de las células HT1080 de fibrosarcoma
(Fig. 5). En concentraciones de 500 y 100 \mug/ml, el péptido
logró inhibiciones de 80 y 40%, respectivamente. Con fines de
control se sintetizó el péptido con la secuencia alterada
CWLTFTHGTC, pero no se pudo usar debido a su escasa solubilidad en
tampones acuosos. Por lo tanto se usaron tres péptidos no
relacionados y muy solubles, EVGTGSCNLECVSTNPLSGTEQ,
CQWNNDNPLFKEAEEEVMNPKFAES y RAVRALWRC. Ninguno de estos péptidos
testigo afectó la migración celular en concentraciones de 500
\mug/ml (Fig. 5, y datos que no se muestran). Se encontró que el
CTTHWGFTLC no bloqueaba las integrinas de la superficie celular ya
que el péptido no impedía la fijación inicial y la distribución de
las células sobre sustratos de fibronectina, colágeno IV o
Matrigel. No se observó una disminución significativa de la
viabilidad celular después de uno o dos días de cultivo celular en
presencia del péptido (no se muestran los datos). De forma similar,
el CTTHWGFTLC inhibió la migración al azar de células C8161 de
melanoma, en un máximo de 80% con una concentración de 500
\mug/ml (Fig. 6). Ninguno de los tres péptidos testigo afectó la
migración celular.
También estudiaron los autores de la invención el
efecto de CTTHWGFTLC sobre la migración al azar de células
endoteliales en el ensayo con placas Transwell (Fig. 7). A una
concentración de 200 \mug/ml, los péptidos inhibieron 85 y 60% la
migración de células Eahy926 y HUVEC, respectivamente, e incluso
lograban una inhibición parcial a una concentración de 20 \mug/ml.
El péptido RAVRALWRC no bloqueó la migración celular.
Finalmente se examinó la capacidad del CTTHWGFTLC
para impedir la invasión de Matrigel por parte de células HT1080 y
C8161. En ambas líneas celulares el péptido impidió enérgicamente
la invasión y la inhibición alcanzó un máximo de 90% a 500
\mug/ml, la mayor concentración estudiada (Fig. 8). Ninguno de los
tres péptidos testigo afectó la invasión de Matrigel.
Se desarrollaron ratones portadores de carcinomas
de mama humano por inoculación de 1 x 10^{6} células
MDA-B-435 en la capa adiposa
mamaria. Al cabo de 4 semanas se calculó el volumen de los tumores
a partir de los diámetros en las tres dimensiones. Los ratones se
dividieron en dos grupos de cinco animales cada uno. Un grupo se
trató con 200 \mug de CTTHWGFTLC en un volumen de 200 \mul
administrado adyacente al tumor tres veces por semana. Al segundo
grupo se le administró el péptido cíclico testigo CVRNSLAC. Los
volúmenes tumorales se midieron semanalmente; los resultados se
muestran después de un tratamiento de tres semanas con el péptido
(Fig. 9). Los resultados muestran que el péptido CTTHWGFTLC inhibe
claramente el crecimiento del carcinoma de mama.
Se cultivaron células C8161 de melanoma durante
48 h en placas de 24 pocillos en un medio con 10% de suero. El
péptido CTTHWGFTLC se incluyó en las concentraciones indicadas en la
Fig. 10 (500 - 10 \mug/ml) y el péptido testigo RAVRALWRC a 500
\mug/ml. El medio acondicionado se analizó mediante
electroforesis en gel con SDS, seguida de un cimograma de gelatina.
El CTTHWGFTLC disminuyó, de forma dependiente de la concentración,
los niveles de la MMP-9 activa de 82 kDa, pero no
afectó los niveles de la proMMP-2 de 72 kDa.
Se cultivaron células MB-435 de
carcinoma de mama durante 48 h en medio con 10% de suero en
ausencia o en presencia del péptido CTTHWGFTLC, después de lo cual
las células se analizaron por microscopía óptica. Los péptidos
sintéticos no relacionados estudiados a las mismas concentraciones
no tuvieron efecto sobre la morfología de las capas de células. La
morfología de células esféricas se puede detectar en las primeras
16 a 24 h después de aplicar CTTHWGFTLC, pero no es evidente en los
cultivos cortos (Figuras 11A a l1C); el péptido no tuvo efecto
sobre la fijación inicial de las células a la superficie en tiempos
de 1 a 2 h.
Para evaluar el efecto de CTTHWGFTLC sobre la
viabilidad celular, se sembraron 100.000 células en placas de 24
pocillos en 1 ml de medio con suero de ternero fetal al 10% y 500
\mug/ml de CTTHWGFTLC o un péptido testigo no relacionado.
Después de 20 ó 40 h de cultivo, la viabilidad se determinó por
tinción con azul trípano o con el reactivo MTT de acuerdo con las
instrucciones del fabricante (Sigma, St. Louis). Para los estudios
de adhesión celular, los pocillos de microtitulación se cubrieron
con fibronectina (Cruz Roja Finesa), colágeno tipo IV (Sigma) o
Matrigel, y se bloquearon con BSA. Las células (100.000 células por
pocillo) se incubaron junto con 500 \mug/ml de CTTHWGFTLC o un
péptido testigo en un medio libre de suero durante 1 h. Después de
lavar dos veces con PBS se tiñeron y contaron las células
unidas.
No se encontró que el péptido afectara el número
o la viabilidad celular medida por la exclusión de azul trípano y
no mostró toxicidad cuando se inyectó en animales. El péptido no
impidió la fijación inicial de las células sobre el Matrigel, el
colágeno o la fibronectina.
Se sembraron 30.000 células HaCat (línea celular
de queratinocitos humanos no tumorígenos y transformados
espontáneamente, Ryle et al., 1989) en los pocillos de
placas de 96 pocillos (Nunclon, Dinamarca) en 50 \mul de KGM y se
dejóque se fijaran durante 24 h en atmósfera húmeda a 37ºC. Las
células se expusieron a KGM o a KGM con contenido en
50-500 \mug/ml de CTTHWGFTLC con o sin 10 ng/ml
de TGF\beta. Un conjunto de cultivos se trató con 1, 10 ó 20
ng/ml de TGF\beta solo. Después de 24 h se recolectó el medio y se
almacenó a -20ºC hasta su análisis mediante un cimograma (Heussen y
Dowdie, 1980). Se colocaron 12 \mul de los medios de cultivo y se
hicieron migrar en geles de poliacrilamida al 10% con SDS con 1,0
mg/ml de gelatina marcada con
2-metoxi-2,4-difenil-3(2H)-furanona
(O'Grady et al., 1984). La lisis de gelatina se vigiló con
luz ultravioleta de onda larga y los geles se fotografiaron. Se
utilizó un densitómetro computarizado (MCI D-M4,
Imaging Research Inc., St. Catherines, Ontario, Canadá) para medir
la cantidad de gelatinasas a partir de los geles fotografiados. Las
células en las placas se fijaron con formaldehído all 4% (v/v) en
PBS con sacaros al 5% (p/v), y se tiñeron con 0,1% de cristal
violeta en ácido bórico (pH 6,0) durante 20 min. Después de desteñir
con ácido acético al 10%, se midieron las absorbancias a 595 nm con
un lector de placas Multiscan MS (Version 4.0, Labsystems,
Helsinki, Finlandia). El número relativo de células obtenido por
este método se usó cuando se contó la cantidad de gelatinasas por
célula. Sólo la MMP-9 dio una velocidad de escisión
mensurable con el fin de calcular la cantidad de enzima por célula.
Los resultados que se presentan en la Fig. 12 la media de dos
experimentos.
Se cubrieron placas de 24 pocillos (Costar,
Cambridge, MA, EE.UU.) con 50 \mug/ml de fibronectina (FN; de
plasma humano; Sigma, F-2006, St. Louis, MO,
EE.UU.) en PBS (pH 7,4). Se colocaron cilindros metálicos en los
pocillos recubiertos y se sembraron 50.000 células HaCat en los
cilindros en medio KGM (en 50 \mul). Se permitió que las células
se fijaran al sustrato durante 24 h a 37ºC en atmósfera húmeda. Se
retiraron los cilindros y las células no adherentes se eliminaron
mediante lavado con el medio de cultivo, el medio se reemplazó por
KGM que contenía diferentes concentraciones de CTTHWGFTLC o
TGF\beta. Se permitió que las células migraran hacia afuera del
disco durante 4 días a 37ºC. El medio se recolectó y las células se
fijaron con formaldehído al 4% (v/v) en PBS que contenía sacarosa
al 5% (p/v), y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en ácido
bórico (pH 6,0). Los pocillos se fotografiaron y la migración se
midió por recuento del área de células emigradas utilizando el
programa NIH Image 1.45 en un ordenador Macintosh. En la Fig. 13 se
muestra una fotografía de las placas después de 4 días de migración
y las áreas calculadas de las células que migraron. Los resultados
son la media de dos experimentos por duplicado.
Texto libre en la lista de secuencias
Para la SEC ID nº 1:
aa variable, Xaa en la posición 2 puede ser
cualquier aminoácido
aa variable, Xaa en la posición 3 puede ser
cualquier aminoácido
aa variable, Xaa en la posición 8 puede ser
cualquier aminoácido
aa variable, Xaa en la posición 9 puede ser
cualquier aminoácido
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<110> Helsinki University Licensing Ltd
Oy
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<120> Nuevos inhibidores y reguladores
negativos de metaloproteinasas de matriz
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<213> Desconocido
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<220>
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<222> 2
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<223> aa variable, el Xaa en la posición 2
puede ser cualquier aminoácido
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<220>
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<221> DOMINIO
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<223> aa variable, el Xaa en la posición 3
puede ser cualquier aminoácido
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> 8
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<223> aa variable, el Xaa en la posición 8
puede ser cualquier aminoácido
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<221> DOMINIO
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<222> 9
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<223> aa variable, el Xaa en la posición 9
puede ser cualquier aminoácido
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<400> 1
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\sa{Cys Xaa Xaa His Trp Gly Phe Xaa Xaa
Cys}
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<213> Desconocido
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Cys}
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<400> 3
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\sa{Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu
Cys}
Claims (13)
1. Un inhibidor y regulador negativo de
metaloproteinasas de matriz que contiene la estructura cíclica del
motivo peptídico CXXHWGFXXC en el que las cisteínas forman un enlace
disulfuro y X es cualquier residuo de aminoácido.
2. El inhibidor y regulador negativo de
metaloproteinasas de matriz de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que el motivo peptídico es CRRHWGFEFC.
3. El inhibidor y regulador negativo de
metaloproteinasas de matriz de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el motivo peptídico es CTTHWGFTLC.
4. Una composición farmacéutica que contiene un
inhibidor y regulador negativo de metaloproteinasas de matriz según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
5. El uso de un inhibidor y regulador negativo de
metaloproteinasas de matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de estados dependientes de
metaloproteinasas de matriz (MMP).
6. El uso según la reivindicación 5 para la
fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
estados dependientes de MMP-2,
MMP-9, o ambas.
7. Un proceso para la preparación de un inhibidor
o regulador negativo de metaloproteinasas de matriz según la
reivindicación 1, proceso que comprende la síntesis del péptido
mediante la técnica de Merrifield en fase sólida.
8. Un inhibidor y regulador negativo de
metaloproteinasas de matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para usarse como producto farmacéutico.
9. El uso de un inhibidor y regulador negativo de
metaloproteinasas de matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de una composición
farmacéutica para inhibir las formaciones, síntesis, activaciones,
expresiones, funciones y acciones de las metaloproteinasas de
matriz.
10. El uso según la reivindicación 9 para la
fabricación de una composición farmacéutica para inhibir las
expresiones, formaciones, activaciones y acciones de la
MMP-2 y/o MMP-9.
11. Un método para inhibir y regular
negativamente las metaloproteinasas de matriz in vitro, que
comprende agregar a un sistema in vitro un inhibidor y
regulador negativo de metaloproteinasas de matriz según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una cantidad tal que
resulte efectiva para inhibir y regular negativamente la actividad
MMP.
12. El método según la reivindicación 11 en el
que las metaloproteinasas de matriz a inhibir y regular
negativamente son MMP-2 y/o
MMP-9.
13. El uso de un inhibidor y regulador negativo
de metaloproteinasas de matriz según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en los procedimientos bioquímicos de
aislamiento y purificación de metaloproteinasas de matriz.
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