ES2203177T3

ES2203177T3 - Nuevo procedimiento para preparar sustancias de modificacion de superficies.

Info

Publication number: ES2203177T3
Application number: ES99944936T
Authority: ES
Inventors: Elisabeth Scholander
Original assignee: Carmeda AB
Current assignee: Carmeda AB
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1999-09-08
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2019-09-08
Also published as: KR100669132B1; JP2003507082A; BR9913516A; EP1112097B1; DE69909104T2; AU757913B2; PT1112097E; WO2000013718A1; CA2342991A1; DE69909104D1; DK1112097T3; EP1112097A1; BR9913516B1; CA2342991C; KR20010088799A; NO984143L; AU5765299A; ATE243538T1; US6461665B1; JP4152075B2

Abstract

Un método para producir una modificación en la superficie de un sustrato, que tiene una actividad antitrombogénica mejorada, que comprende al menos la siguiente etapa de: hacer reaccionar (A) grupos funcionales en una superficie que se ha de hacer no trombogénica con (B) heparina, modificada para contener grupos funcionales complementarios, para formar enlaces covalentes, caracterizado por activar dicha heparina para potenciar su actividad cuando se fija a una superficie, en una etapa previa a la reacción de (A) con (B), a través de un procedimiento seleccionado del siguiente grupo de procedimientos: (i) calentar en el intervalo desde 40ºC hasta la temperatura de ebullición del disolvente; (ii) tratamiento a un pH elevado, es decir, en el intervalo de pH 9-14; (iii) tratamiento con al menos un catalizador nucleófilo.

Description

Nuevo procedimiento para preparar sustancias de modificación de superficies.

La presente invención se refiere a un método para preparar una modificación mejorada de un sustrato no trombogénico para superficies previstas para entrar en contacto con fluidos o tejidos corporales, o componentes de los mismos.

Antecedentes de la invención

Cuando la superficie de un dispositivo médico tal como un catéter, un oxigenador de sangre, 'stent' o similar se coloca en el cuerpo, o en contacto con fluidos corporales, se inicia una serie de diferentes reacciones, algunas de las cuales dan como resultado la coagulación de la sangre sobre la superficie del dispositivo. Al objeto de contrarrestar este grave efecto adverso, se ha administrado a los pacientes, durante largo tiempo y de forma sistémica, heparina, un compuesto anticoagulante bien conocido, antes de introducir dispositivos médicos en su cuerpo, o en contacto con sus fluidos corporales, con el fin de asegurar un efecto antitrombótico.

Trombina es uno de los diversos factores de coagulación todos los cuales actúan conjuntamente para dar como resultado la formación de trombos sobre superficies ajenas al paciente que están en contacto con la sangre. La antitrombina es el inhibidor de coagulación más destacado. Neutraliza la acción de la trombina y de otros factores de coagulación, restringiendo o limitando de esta forma la coagulación sanguínea. La heparina potencia de manera llamativa la velocidad con la que la antitrombina inhibe los factores de coagulación.

Sin embargo, el tratamiento sistémico con dosis altas de heparina se asocia, a menudo, con importantes efectos secundarios, entre los cuales predomina la hemorragia. Otras complicaciones poco frecuentes, pero importantes de la terapia con heparina es el desarrollo de una respuesta alérgica denominada trombocitopenia inducida por heparina, que puede dar lugar tanto a hemorragias como a trombosis arterial. El tratamiento con heparina exige, asimismo, un frecuente control de los niveles en plasma y los correspondientes ajustes de dosis. La reversión de heparina con protamina es otra complicación.

Por consiguiente, se han buscado soluciones en las que no fuera necesaria la heparinización sistémica del paciente. Se ha considerado posible alcanzar este objetivo a través de la modificación en la superficie, utilizando las propiedades anticoagulantes de la heparina. De esta forma, se han desarrollado diversas tecnologías en las que se deposita una capa de heparina sobre la superficie de los dispositivos médicos, con lo cual la superficie se torna no trombogénica.

La heparina es un compuesto polisacárido portador de grupos sulfato de carga negativa en las unidades sacáridas. Se intentó, por lo tanto, la fijación iónica de heparina a superficies policatiónicas, pero estas modificaciones de superficie carecían de estabilidad, dando lugar a la ausencia de función, puesto que la heparina se desprendía de la superficie.

Posteriormente, se han preparado distintas modificaciones de superficie, en las que la heparina se unió covalentemente a los grupos de superficie.

Técnica anterior

Uno de los procedimientos más eficaces para convertir un dispositivo médico en no trombogénico se consigue mediante la fijación covalente de un fragmento de heparina a una superficie modificada del dispositivo médico. El método general y sus mejoras se describen en las siguientes patentes europeas: EP-AB-0086186, EP-B-0086187 y EP-B-0495820.

Estas patentes describen la preparación de sustratos para la modificación en las superficies que se consiguen, en primer lugar, por medio de la escisión selectiva de la cadena de polisacáridos de heparina por oxidación con ácido nitroso, que conduce a la formación de grupos aldehído terminales. En segundo lugar, se introduce una o más capas modificadoras de la superficie, portadoras de grupos amino, sobre la superficie del dispositivo médico y, a continuación, los grupos aldehído de la cadena polisacárida reaccionan con los grupos amino primarios sobre las capas modificadoras de superficie, seguido por una reducción de las bases de Schiff intermedias frente a enlaces amino secundarios estables con, por ejemplo, cianoborohidruro.

Esta tecnología ha permitido preparar modificaciones de superficie anti-trombogénicas estables y bien definidas para dispositivos médicos.

Se conocen otras muchas modificaciones de superficie que declaran conseguir resultados iguales o, incluso, mejores, tales como las descritas, por ejemplo, en el documento EP-A-0200295 (documentos US 4.600.652, US 6.642.242), basadas en sustratos que tienen una capa de urea de poliuretano a la que se puede unir, por enlaces covalentes, la heparina modificada para contener grupos aldehído mediante oxidación con ácido nitroso o peryodato.

Una tecnología similar se describe en el documento EP-A-0404515, en la que la superficie del sustrato está recubierta con una urea de poliuretano fluorada, rica en aminas, antes de la inmovilización de un agente antitrombótico, tal como una heparina con aldehídos activados.

Otra modificación antitrombogénica de superficie que se puede mencionar se describe en el documento EP-B-0309473. La superficie del dispositivo se modifica mediante el recubrimiento con una capa de lisozima o un derivado de la misma, a la que se adhiere heparina.

Todavía otra modificación en la superficie para producir artículos antitrombogénicos se describe en el documento US-4.326.532. En este caso, la superficie antitrombogénica recubierta con una capa comprende un sustrato polímero, una quitosana unida al sustrato polímero y un agente antitrombogénico fijado al revestimiento de quitosana. La Patente Japonesa Abierta al Público nº 04-92673 se refiere a un hemofiltro antitrombogénico que utiliza también una capa de quitosana para fijar la heparina.

En el documento EP-A-0481160 se describen materiales antitrombogénicos útiles para recubrir artículos médicos, materiales que comprenden un anticoagulante unido a un colágeno procesado.

Otro procedimiento para preparar superficies antitrombogénicas se describe en el documento WO97/07843, en el que la heparina se mezcla con suficiente peryodato para que no reaccionen más de dos unidades de azúcar por molécula de heparina, añadiendo esta mezcla a un sustrato con superficie modificada de un dispositivo médico, cuya modificación en la superficie contiene grupos amino.

Esta enumeración de procedimientos de la técnica anterior para preparar superficies antitrombogénicas no es, en absoluto, exhaustiva, pero demuestra claramente lo difícil que resulta preparar estos artículos médicos recubiertos, que exhiban las propiedades necesarias para ser utilizados con éxito en pacientes, concretamente una elevada actividad antitrombogénica suficiente y de larga duración, estabilidad del recubrimiento y ausencia de cambios adversos de las propiedades del sustrato a recubrir.

Por lo tanto, existe todavía la necesidad en la técnica de mejoras de los recubrimientos antitrombogénicos que hagan que los artículos médicos recubiertos con ellos sean no trombogénicos de forma estable, fiable y reproducible, y con un potente efecto antitrombogénico prolongado.

Definición de la invención

Un objeto principal de la presente invención es mejorar la actividad antitrombogénica de la heparina inmovilizada sobre la superficie. Este y otros objetos se consiguen por medio de la invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

De esta forma, se ha descubierto sorprendentemente ahora que es posible mejorar adicionalmente la actividad antitrombogénica de modificaciones conocidas de la superficie, por medio de un procedimiento sencillo y económico. La mejora se puede medir como una bioactividad superior de la heparina cuando la heparina, tratada de acuerdo con la invención, se fija a la superficie.

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar modificaciones de superficie del sustrato, que tenga una actividad antitrombogénica mejorada, en el que la mejora se alcanza mediante el tratamiento de la heparina a una temperatura elevada, o a un pH elevado, o en contacto con catalizadores nucleófilos tales como aminas, alcoholes, tioles, o grupos amina, hidroxilo o tiol inmovilizados, antes de fijar dicha heparina a la superficie que se debe modificar.

Como resulta evidente de la técnica anterior mencionada, se conocen diferentes métodos para producir una capa modificadora de la superficie, portadora de grupos activos, a la que se puede unir o fijar heparina, y que la heparina preparada de acuerdo con la presente invención, y que posee propiedades antitrombogénicas superiores, se puede utilizar en conexión con cualquier método de la técnica anterior para preparar capas a las que se puede fijar la heparina.

De manera opcional, el dispositivo médico cuya modificación de la superficie se debe introducir, se puede producir a partir de uno o varios materiales en los que los grupos funcionales activos estén directamente disponibles en la superficie, sin la necesidad de introducir en la superficie una capa adicional que lleve grupos funcionales a los que la heparina se pueda fijar. La heparina preparada de acuerdo con la presente invención, y que posee propiedades antitrombogénicas superiores, se puede utilizar también en conexión con estos materiales.

El procedimiento de esta invención se puede describir de manera más general para incluir diferentes materiales portadores de grupos funcionales, o diferentes métodos de la técnica anterior para tratar la superficie, con el fin de poner a disposición grupos mediante los cuales la heparina, opcionalmente tratada para contener, por ejemplo, grupos aldehído, ácido carboxílico o amino, se pueda unir a dicha superficie, preferentemente, mediante enlaces covalentes.

De esta forma, el método para producir una modificación en la superficie del sustrato, que dé como resultado una mejor actividad antitrombogénica, comprenderá, al menos, hacer reaccionar

(A): grupos funcionales en una superficie que se ha de hacer antitrombogénica, con

(B): heparina, modificada para contener grupos funcionales complementarios, de manera que forme enlaces covalentes,

en donde

dicha heparina se activa para potenciar su actividad cuando está unida a la superficie, en una etapa previa a la reacción de (A) con (B), por medio de un procedimiento seleccionado del siguiente grupo de procedimientos:

(i): calentar en el intervalo desde 40ºC hasta la temperatura de ebullición del disolvente;

(ii): tratamiento a un pH elevado, es decir, en el intervalo de pH 9-14;

(iii): tratamiento con al menos un catalizador nucleófilo.

Algunos de los procedimientos se pueden combinar para dar la misma o, incluso, una actividad potenciada de la heparina unida a la superficie. Así, el procedimiento (i) se puede combinar, de manera ventajosa, con el procedimiento (ii) o (iii).

La expresión "catalizadores nucleófilos" se utiliza para indicar que no tiene lugar ninguna reacción química verdadera entre la heparina y el catalizador nucleófilo utilizado en el procedimiento. Ejemplos de compuestos utilizables como "catalizadores nucleófilos", según la presente invención, son aminas tales como acetato de amonio (NH_{4}Ac) u otros compuestos que contengan nitrógeno, tales como aminoácidos y compuestos orgánicos alifáticos o cíclicos, compuestos que contengan hidroxilo, tales como alcoholes; compuestos que contengan sulfhidrilo, tales como tioles. Otros posibles catalizadores nucleófilos según la invención son compuestos polímeros portadores de grupos amino, hidroxilo o sulfhidrilo tales como, por ejemplo, iminas de polietileno. Otros ejemplos de posibles catalizadores nucleófilos, según la invención, comprenden grupos amino, hidroxilo o tioles inmovilizados, como se encuentran en sustratos de intercambio iónico o geles cromatográficos sustituidos, como lo saben los expertos en la técnica. Se prefiere muy especialmente utilizar catalizadores nucleófilos que contengan nitrógeno tales como aminas libres o aminas inmovilizadas sobre la superficie.

Se pretende que los grupos complementarios en (B) citado anteriormente se relacionen con los grupos funcionales mencionados en (A), entendiéndose que estos dos grupos deben ser capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes. Un ejemplo de grupos que forman enlaces covalentes son los grupos amino y aldehído y, en este caso, el esquema de reacción anteriormente mencionado debe ir seguido de una etapa adicional de estabilización de la base de Schiff así formada. El experto en la técnica será consciente de otras parejas de grupos funcionales que pueden formar enlaces covalentes.

El procedimiento según la presente invención para preparar una modificación en la superficie del sustrato en sustratos médicos que no sean portadores de grupos funcionales en su superficie, se puede describir, más detalladamente, de la forma siguiente:

(a): tratar la superficie a modificar, para formar una capa que comprende grupos funcionales sobre la superficie,

(b): tratar la heparina, modificada para contener grupos funcionales complementarios, según la técnica anterior, en una etapa adicional, seleccionada del siguiente grupo de procedimientos:

(ii): tratamiento a un pH elevado, es decir, en el intervalo de pH 9-14;

(iii): tratamiento con al menos un catalizador nucleófilo

para potenciar la actividad de la heparina cuando está unida a la superficie, y

(c): hacer reaccionar la capa resultante de la etapa (a) con la heparina modificada según la etapa (b) para inmovilizar la heparina con enlaces covalentes a la superficie.

La capa de la etapa (a) anterior se puede formar usando diferentes compuestos, tales como compuestos polímeros como poliuretanos, poliaminas tales como polietilen-imina, quitosana u otros polisacáridos o polímeros que contienen grupos funcionales reactivos. De forma alternativa, es posible utilizar diferentes capas de compuestos polímeros, por ejemplo, dos de cargas opuestas, para lograr una capa de un determinado grosor o textura. En este caso, la capa final debe llevar grupos activos libres que se puedan hacer reaccionar con los grupos complementarios de la heparina. Los polímeros pueden estar opcionalmente reticulados en las primeras capas.

Por documentos de la técnica anterior resultarán evidentes diferentes ejemplos de métodos mediante los que se puede modificar la supe de un sustrato, haciéndose referencia a las descripciones y ejemplos incluidos en dichas patentes y otras publicaciones para las instrucciones detalladas de trabajo, para preparar dichas modificaciones que se han de hacer en la superficie.

\newpage

Los sustratos con más posibilidades de beneficiarse de la heparina modificada con los procedimientos según la presente invención son dispositivos médicos tales como oxigenadores, filtros hemáticos y bombas de sangre, catéteres y sondas, e implantes tales como 'stents', injertos vasculares y válvulas cardiacas.

De esta forma, las superficies tratadas pueden ser polímeros, vidrio, metal, materiales de fibras naturales, cerámica o cualquier otro material que disponga de las propiedades adecuadas para el uso previsto, como sabe el experto en la técnica.

De forma muy preferida, la primera parte del procedimiento se lleva a cabo del modo descrito en los documentos EP-B-0086186, EP-B-0086187 o EP-B-0495820 o WO97/07834, y comprende, en general, las siguientes etapas:

(A):

(a): añadir a la superficie que se ha de modificar una capa de un polímero que comprenda grupos amino, y

(b): opcionalmente, reticular la capa de la etapa (a) con un agente reticulante bifuncional;

(c): añadir a la capa de la etapa (b) una capa de polímero aniónico;

(d): opcionalmente, repetir las etapas (a), (b) y (c) al menos una vez,

(e): seguida de una etapa final (a), y

(B):

(f): modificar la heparina a través de oxidación con ácido nitroso o peryodato, para que comprenda grupos aldehído.

Adicionalmente, el procedimiento se distingue por la siguiente etapa, que es nueva y claramente diferente, en comparación con la técnica anterior:

(g): tratar la heparina que contiene aldehídos en solución acuosa en una etapa adicional, seleccionada del siguiente grupo de procedimientos:

(ii): tratar a un pH elevado, es decir, en el intervalo de pH 9-14;

(iii): tratamiento con al menos un catalizador nucleófilo.

para potenciar la actividad de la heparina cuando esté unida a la superficie.

Preferentemente, el procedimiento se prosigue de la forma descrita en la técnica anterior, antes mencionada:

(h): haciendo reaccionar la capa resultante de la etapa (a) o (e) con la heparina que contiene aldehídos, adicionalmente tratada, de la etapa (g).

Los sustratos de superficie modificada preparados de acuerdo con esta invención también están comprendidos por la presente invención.

Los procedimientos (i), (ii) y (iii) se pueden llevar a cabo con cualquier disolvente, pero se prefiere especialmente realizarlos en solución acuosa, pero, en circunstancias especiales, puede resultar adecuado el uso de disolventes orgánicos, opcionalmente junto con formadores de complejos, o mezclas de soluciones acuosas y orgánicas.

El tiempo necesario para el procedimiento de calentamiento (i) no es crucial. Supuestamente, la activación que se puede alcanzar dependerá de la combinación de tiempo y temperatura. Así, en una realización, la temperatura se encuentra en el intervalo de 40-60ºC y, más preferentemente, de 50-70ºC. En una segunda realización, ésta se mantiene a 60ºC.

El procedimiento (ii) se efectúa a pH 9-14, más preferentemente, pH 9-12. Resulta más adecuado usar el intervalo de pH de 9-11.

Ventajas

Por medio de la presente invención, se pueden lograr las siguientes ventajas: actividad no trombogénica mejorada y, en consecuencia:

\newpage

-: se puede alcanzar una ausencia suficiente de trombogenicidad con cantidades menores de heparina inmovilizada. Esto es especialmente importante para materiales y dispositivos asociados con dificultades para inmovilizar grandes cantidades de heparina;

-: es posible obtener una mayor ausencia de trombogenicidad con la misma cantidad de heparina inmovilizada. Esto es especialmente importante en aplicaciones con potentes estímulos trombogénicos, por ejemplo, en situaciones con bajo riego sanguíneo y aplicaciones tales como catéteres e injertos vasculares con luz estrecha, o en casos en los que el paciente requeriría, de lo contrario, heparinización sistémica adicional.

La presente invención se explica de manera más detallada en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Se trató heparina de calidad farmacopeica con ácido nitroso, básicamente de la forma descrita en el documento EP-B-0086186. Después de la oxidación, la solución de reacción se dividió en cuatro partes (cada una de 60 ml), que se trataron de acuerdo con una de las siguientes etapas:

1.: Neutralización con NaOH 4M a pH 7.

2.: Ajuste a pH 2,5 con HCl 2M y conservación a 40ºC durante 1 hora; a continuación, neutralización con NaOH 4M a pH 7.

3.: Ajuste a pH 10 con NaOH 4M y conservación a 40ºC durante 1 hora. Seguidamente, se neutralizó a pH 7 con HCl 4M.

4.: Neutralización con NaOH 4M a pH 7. La solución se llevó a 0,1M con NH_{4}Ac y se mantuvo a 40ºC durante 1 hora. A continuación, la solución se evaporó para retirar NH_{4}Ac. El residuo se disolvió en 60 ml de agua y el pH se ajustó a 7.

Las preparaciones de heparina se sometieron a ensayos de actividad anticoagulante (inhibición de trombina mediada por antitrombina):

Preparación de heparina tras tratamiento con ácido nitroso	Actividad de heparina UI/mg
1. pH 7	121
2. pH 2,5	125
3. pH 10	116
4. pH 7, NH_{4}Ac	123

Se heparinizaron sondas de polietileno (d.i. 2 mm) básicamente según el documento EP 0086186, ensayando la fijación de antitrombina.

Preparación de heparina tras tratamiento con ácido nitroso	Fijación de AT sobre la superficie
	heparinizada pmol/cm^{2}
1. pH 7	35
2. pH 2,5	36
3. pH 10	109
4. pH 7, NH_{4}Ac	59

Conclusiones:

\bullet: La heparina oxidada con el tratamiento de ácido nitroso en un entorno alcalino a pH 10, de acuerdo con la presente invención, dando lugar a una actividad de heparina altamente potenciada (más de 3 veces más alta), tras la inmovilización sobre una superficie, en comparación con la heparina oxidada con ácido nitroso tratada a pH 7, según la técnica anterior. La actividad de la heparina, previa a la inmovilización, no se ve afectada.

\bullet: La heparina oxidada con el tratamiento de ácido nitroso con NH_{4}Ac, antes de la inmovilización, da como resultado una actividad algo elevada, en tanto que el tratamiento a pH bajo carece de efectos.

Ejemplo 2

Se trató heparina de calidad farmacopeica con ácido nitroso, básicamente de la forma descrita en el documento EP-B-0086186 y, a continuación, se neutralizó a pH 7 con NaOH 4M y se liofilizó.

Se heparinizaron sondas de polietileno con soluciones de heparina oxidada con ácido nitroso, sometida a alguno de los siguientes tratamientos.

1.: Ausencia de tratamiento previo.

2.: Disuelta en agua y mantenida a 50ºC durante 16 horas antes de su uso.

3.: Mantenida a pH 10 y 50ºC.

4.: Disuelta en agua y hecha circular sobre una superficie aminada (sonda aminada) a 50ºC durante 18 horas antes de su uso.

La heparinización se llevó a cabo básicamente de la forma descrita en el documento EP-B-0086186. Se analizó en las sondas heparinizadas la fijación de antitrombina.

Preparación de heparina tras tratamiento con ácido nitroso	Fijación de AT sobre la su perficie
	heparinizada pmol/cm^{2}
1. Sin tratamiento	48
2. Mantenida a 50ºC durante 16	94
horas
3. Mantenida a pH 10 y 50ºC	109
4. Hecha circular a 50ºC durante 16 horas sobre superficie	122
aminada

Conclusión:

\bullet: Además de los efectos observados en el ejemplo 1, el tratamiento de heparina oxidada con ácido nitroso con calentamiento prolongado o por contacto con nucleófilos inmovilizados en superficie, tales como grupos amino, condujo a una actividad de heparina altamente potenciada cuando se inmovilizó sobre una superficie.

Ejemplo 3

En el presente Ejemplo se demuestra que la oxidación de heparina, empleando dos métodos diferentes, que son bien conocidos para el experto en la técnica, da lugar a una sorprendente absorción elevada de AT cuando se utiliza una heparina activada según esta invención.

Sondas de PVC, con un diámetro interno de 3 mm se sometieron a:

a): heparinización con una heparina oxidada con ácido nitroso, preparada de acuerdo con el documento EP-B-0086186 y sin tratamiento posterior;

b): heparinización con heparina oxidada con ácido nitroso según el documento EP-B-0086186 y sometida, seguidamente, a tratamiento alcalino (pH 10, a 40ºC durante 1 hora);

c): heparinización con heparina oxidada con peryodato, preparada de acuerdo con el documento WO97/07384 y sin tratamiento posterior;

d): heparinización con heparina oxidada con peryodato, de acuerdo con el documento WO97/07384 y sometida, a continuación, a tratamiento alcalino (pH 10, a 40ºC durante 1 h).

\newpage

	Sin tratamiento alcalino	Con tratamiento alcalino
	Absorción de AT pmol/cm^{2}	Absorción de AT pmol/cm^{2}
Heparina oxidada con ácido nitroso	46	105
Heparina oxidada con peryodato	44	78

Claims

1. Un método para producir una modificación en la superficie de un sustrato, que tiene una actividad antitrombogénica mejorada, que comprende al menos la siguiente etapa de:

hacer reaccionar

(A) grupos funcionales en una superficie que se ha de hacer no trombogénica con

(B) heparina, modificada para contener grupos funcionales complementarios, para formar enlaces covalentes,

caracterizado por

activar dicha heparina para potenciar su actividad cuando se fija a una superficie, en una etapa previa a la reacción de (A) con (B), a través de un procedimiento seleccionado del siguiente grupo de procedimientos:

(ii): tratamiento a un pH elevado, es decir, en el intervalo de pH 9-14;

(iii): tratamiento con al menos un catalizador nucleófilo.

2. Un método según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

tratar la superficie a modificar en una o más etapas para formar una capa que comprende grupos funcionales sobre la superficie.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que el pH se encuentra en el intervalo de 9-11.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que el pH es 10.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que el catalizador nucleófilo es NH_{4}Ac.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que los catalizadores nucleófilos contienen grupos amino inmovilizados.

7. Un método según la reivindicación 2, que comprende formar una capa sobre la superficie mediante

(A):

(a): añadir una capa de un polímero que comprenda grupos amino a la superficie que se ha de modificar;

(b): opcionalmente, reticular la capa de la etapa (a) con un agente reticulador bifuncional;

(c): añadir una capa de polímero aniónico a la capa de la etapa (b);

(d): opcionalmente, repetir las etapas (a), (b) y (c) al menos una vez,

(e): seguido por una etapa final (a), y

(B):

(f): modificar la heparina por una oxidación con ácido nitroso o peryodato para que comprenda grupos aldehído

caracterizado por

(g): activar la heparina que contiene aldehídos en una etapa adicional para potenciar su actividad cuando se fija a una superficie, seleccionándose dicha etapa (g) de activación del siguiente grupo de procedimientos:

(ii): tratamiento a un pH elevado, es decir, en el intervalo de pH 9-14;

(iii): tratamiento con al menos un catalizador nucleófilo,

y, finalmente

\newpage

(h): hacer reaccionar la capa resultante de la etapa (a) o (e) con la heparina que contiene aldehídos, adicionalmente tratada, de la etapa (g).

8. Un sustrato con superficie modificada producido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.