ES2203435T3 - Una composicion hipoalergenica conteniendo peptidos tolerogenicos que inducen la tolerancia oral. - Google Patents
Una composicion hipoalergenica conteniendo peptidos tolerogenicos que inducen la tolerancia oral.Info
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Abstract
Una composición hipoalergénica para la inducción de tolerancia a las proteínas en individuos de riesgo a la aler- gia a las proteínas, la cual contiene (i) una base de un ma- terial "no alergénico" a las proteínas hidrolizado a fondo, y/o (ii) una base de aminoácidos libres, la cual composición comprende como ingrediente activo por lo menos un péptido tolerogénico de una proteína alergénica, en donde dichos péptidos tolerogénicos están presentes en forma de (i) frac- ciones peptídicas tolerogénicas aisladas de la hidrólisis de material proteínico que contiene la proteína alergénica y/o (ii) péptidos tolerogénicos sintéticamente preparados, en una cantidad tal que el ratio de actividad tolerogénica respecto
Description
Una composición hipoalergénica conteniendo
péptidos tolerogénicos que inducen la tolerancia oral.
Esta invención se refiere a una composición hipo
alergénica que contiene péptidos tolerogénicos específicos de
proteínas, la cual composición puede inducir tolerancia oral a las
proteínas nativas. Se refiere también al empleo de péptidos
tolerogénicos de proteínas lácteas para la preparación de una
composición que induce la tolerancia inmunológica a las proteínas
lácteas.
Durante el proceso normal de nutrición, las
proteínas de la dieta se presentan al sistema inmune por medio del
intestino, junto con una insensibilidad inmunológica a los
nutrientes ingeridos. Este fenómeno vital, llamado tolerancia oral,
es eficiente para la gran mayoría de las personas. Si la tolerancia
oral falla, tiene lugar la alergia a los alimentos, lo cual requiere
la estricta evitación del alimento incriminado.
La evitación del alimento en cuestión representa
una dura tarea para los pacientes adultos con alergia a los
alimentos. Por ejemplo, para eliminar estrictamente la leche de vaca
de la dieta de niños alérgicos podría ser incluso muy difícil,
especialmente si no es posible o no se desea la alimentación con
leche materna.
Las alergias a la leche de vaca y a las fórmulas
que contienen leche de vaca adaptadas a las necesidades de los
niños, son debidas al hecho de que las proteínas de la leche de vaca
difieren de las proteínas de la leche de la madre y pueden
constituir alergenos. Entre las proteínas del suero de leche de
vaca, la \beta-lactoglobulina es el componente
principal y es un fuerte alergeno.
Juntamente con la alimentación con leche materna,
la recomendación primaria para la prevención, se prescriben
sistemáticamente fórmulas hipoalergénicas a los recién nacidos
"como protección", principalmente los niños asintomáticos con
padres atópicos.
En contraste con las fórmulas adaptadas, en las
fórmulas hipoalérgicas las proteínas de la leche de vaca han sido
hidrolizadas para disminuir la potencial alergenicidad. Este método
se ha demostrado que es eficiente para prevenir la sensibilización
por proteínas nativas presentes en las fórmulas adaptadas.
Así, en la patente US 4.293.571 se preparó,
mediante hidrólisis pancreática, la coagulación de las proteínas no
hidrolizadas mediante un tratamiento térmico y ultrafiltración para
eliminar las proteínas residuales coaguladas y los macropéptidos que
podían constituir alergenos. También la patente US 5.039.532
proporciona un procedimiento perfeccionado para la preparación de un
hidrolizado de proteínas de leche animal substancialmente reducido
en alergenos, en el cual un producto a base de suero de leche de
vaca fue sometido a hidrólisis enzimática.
Se han propuesto dos diferentes tipo de fórmulas
hipoalergénicas para los bebés de alto riesgo: fórmulas parcialmente
hidrolizadas y fórmulas hidrolizadas a fondo, diferenciadas por la
extensión de la hidrólisis de las proteínas nativas.
Pero, como está claro por la técnica citada más
arriba, el objetivo principal hasta la fecha para el tratamiento de
las alergias a la leche de vaca, ha sido encontrar preparaciones que
no induzcan una respuesta alérgica, es decir, que proporcionen
formulaciones no alergénicas. No obstante, aunque estas
formulaciones han permitido a personas alérgicas a la leche de vaca
evitar una respuesta alérgica, no solucionan el problema de que una
persona pueda beber productos lácteos inalterados.
Ultimamente, se ha investigado el hecho de que
las formulaciones lácteas parcialmente hidrolizadas no tienen
solamente una alergenicidad reducida sinó que inducen además una
tolerancia inmunológica a las proteínas de la leche (patente EP 0
827 679). Las fórmulas hidrolizadas a fondo están especialmente
pensadas para el tratamiento de pacientes alérgicos a las proteínas
de la leche de vaca, pero su capacidad para inducir a largo plazo la
tolerancia oral está cuestionada.
Así, la patente EP 0 629 350 describe el empleo
de hidrolizados no alergénicos de proteína de suero de leche de
vaca, de los cuales se dice que son capaces de inducir tolerancia a
la proteína de la leche de vaca. Aunque esta solicitud de patente
indica que los hidrolizados de proteína de suero de leche de vaca
substancialmente exentos de proteínas alergénicas podrían emplearse
para inducir tolerancia a las proteínas de leche de vaca en niños
con riesgo de alergia a la leche de vaca, los presentes inventores
descubrieron al analizar otros hidrolizados de proteína de suero de
leche de vaca no alergénicos, que la no alergenicidad no se traducía
necesariamente en la capacidad de inducir tolerancia a las proteínas
de leche de vaca. En efecto, se descubrió que algunas de las
formulaciones que presentaban el más alto grado de no alergenicidad,
eran inadecuadas para inducir tolerancia a las proteínas de la leche
de vaca.
Aunque Lo, C.W. y Kleiman, R.E. - (American
Journal of Clinical Nutrition ("Revista americana de nutrición
clínica"), 1996, 63 (4), 646S-650S) sugiere que
la fórmula para niños conteniendo péptidos telerogénicos podría
emplearse para el tratamiento de enfermedades alérgicas o para la
supresión del desarrollo de transtornos autoinmunológicos, está
claro que faltó a la técnica la información necesaria para
desarrollar fórmulas que fueran adecuadas al máximo para la
inducción de tolerancia.
Esta invención proporciona una composición
hipoalergénica para la inducción de tolerancia a la proteína en
individuos de riesgo de alergia a la proteína, la cual composición
contiene (i) una base de proteínas hidrolizadas a fondo "no
alergénicas", y/o (ii) una base de aminoácidos libres,
comprendiendo dicha composición como ingrediente activo por lo menos
un péptido tolerogénico de una proteína alergénica, en donde
dichos péptidos tolerogénicos están presentes en
forma de (i) fracciones de hidrólisis peptídicas tolerogénicas
aisladas de un material proteínico que contiene la proteína
alergénica y/o (ii) péptidos tolerogénicos sintéticamente
preparados, en una cantidad tal que el ratio de actividad
tolerogénica con respecto a la antigenicidad residual es por lo
menos 2 x 10^{-2}.
Esta composición contiene una fuente de nitrógeno
que puede proporcionar del 7 al 25% de la energía total, una fuente
de hidratos de carbono que puede proporcionar por lo menos del 28 al
66% de la energía total, una fuente de lípidos que puede
proporcionar por lo menos del 25 al 60% de la energía total y por lo
menos un péptido tolerogénico de diferentes proteínas.
Una ventaja importante de esta composición es la
de inducir tolerancia oral en individuos "de riesgo", con el
fin de evitar una eventual sensibilización mediante el empleo de
tolerógenos nativos. Además, los péptidos tolerogénicos derivados de
la hidrólisis de la proteína ofrecen propiedades hipoalergénicas y
propiedades tolerogénicas e inducen la tolerancia oral a niveles
humorales y celulares.
Esta composición va particularmente dirigida a
individuos de riesgo de alergia a la proteína de la leche.
Otro aspecto de la presente invención es el
empleo de péptidos tolerogénicos de proteínas de la leche para la
preparación de una composición hipoalergénica dirigida a los
mamíferos susceptibles de alergia a la leche de vaca.
En una primera versión los péptidos tolerogénicos
son de origen lácteo y particularmente de la
\beta-lactoglobulina
(\beta-LG), \alpha-lactalbúmina,
albúmina de suero bovino o tienen como origen la caseína.
Para la preparación de dichas composiciones, se
emplean péptidos tolerogénicos en forma de fracción peptídica
conteniendo los siguientes péptidos:
H_{2}N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH,
H_{2}N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K,
-K-COOH o
H_{2}N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH a partir de la \beta-lactoglobulina.
H_{2}N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH a partir de la \beta-lactoglobulina.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para la preparación de péptidos tolerogénicos de utilidad en
la inducción de tolerancia a la proteína en individuos de riesgo de
alergia a la proteína, en donde:
- (i)
- un material proteínico que contiene la proteína alergénica se hidroliza a un grado de hidrólisis de aproximadamente 10 a 50%;
- (ii)
- a continuación se trata para inactivar la actividad enzimática residual;
- (iii)
- la solución de hidrolizado de proteína se clarifica y se somete a un tratamiento de precipitación o se pasa por una columna de cromatografía rellena con una resina apropiada para extraer fracciones peptídicas tolerogénicas.
En la presente invención, el término tolerancia
se entiende como un estado de insensibilidad específica
inmunológica. Tanto los caminos humorales (anticuerpos) como
inducidos por células (linfocitos....) de la respuesta inmunológica
pueden suprimirse mediante una inducción de tolerancia. Un fallo de
la tolerancia oral se considera que es la causa subyacente de la
alergia a ciertos alimentos.
El término alergeno se entiende como una proteína
o macropéptido capaz de iniciar reacciones alérgicas en los humanos,
particularmente en niños de riesgo o niños de teta. Los niños se
consideran "de riesgo" de alergia a la proteína, cuando un
padre o los dos padres o un hermano es atópico.
El término péptidos tolerogénicos significa
fragmentos proteicos, correspondientes a partes de la proteína
nativa, con un tamaño de 200 a 6000 Da (3 a 50 aminoácidos), y de
preferencia entre 500 a 3000 Da, que son capaces de inducir una
tolerancia oral específica a las proteínas nativas.
El término base "no alergénica" significa
una fuente de nitrógeno que contiene una composición de aminoácidos
bien equilibrada. La "no alergenicidad" se define para las
proteínas de la leche como la alergenicidad residual de las
proteínas individuales del suero de leche de vaca que no excedan de
1 ppm, y como la alergenicidad residual de las caseínas totales que
no excedan de 10 ppm.
La composición hipoalergénica puede contener como
fuente de nitrógenos, péptidos o aminoácidos libres y
particularmente proteínas de la leche tales como proteínas de suero
de leche de vaca, \alpha-lactalbúmina,
\beta-lactoglobulina, albúmina de suero bovino,
ácido caseínico, caseinatos o \alpha, \beta,
\kappa-caseína, por ejemplo. La fuente de
nitrógeno puede proporcionar por lo menos del 7 al 25% de la energía
total.
Como fuente de hidratos de carbono, pueden
emplearse la lactosa, sacarosa, almidón o maltodextrina. Los
hidratos de carbono pueden proporcionar por lo menos del 28 al 66%
de la energía total.
Los aceites vegetales o el aceite de mantequilla
se emplean de preferencia como fuente de lípidos, los cuales pueden
proporcionar por lo menos del 25 al 60% de la energía total.
Pueden añadirse vitaminas, oligoelementos y
minerales en una cantidad suficiente para satisfacer las exigencias
diarias.
La composición de acuerdo con la presente
invención comprende como ingrediente activo por lo menos un péptido
tolerogénico de la proteína alergénica, estando dicho péptido
tolerogénico seleccionado por su capacidad para inducir la
tolerancia oral.
Los péptidos tolerogénicos pueden obtenerse por
hidrólisis enzimática de un material proteínico que contiene
proteínas alergénicas que son responsables de las alergias en
individuos de riesgo, seguido del aislamiento de las fracciones
peptídicas tolerogénicas. Esta fracciones peptídicas enriquecidas en
dichos péptidos tolerogénicos pueden ser obtenidas por separación
del hidrolizado de proteína. Los péptidos tolerogénicos pueden
también estar presentes en la composición en forma de péptidos
tolerogénicos preparados sintéticamente.
La composición contiene una cantidad suficiente
para inducir la tolerancia oral, la cual es de preferencia tal que
permite una completa inducción de la tolerancia oral, a saber tal
que evita cualquier reacción después del DBPCFC (prueba de
alimentación controlada con un placebo doble ciego) realizada con
leche de vaca. En consecuencia, los péptidos tolerogénicos pueden
estar presentes en una cantidad de 0,01% a 10% (fuente de nitrógeno
de la proteína), por ejemplo y de preferencia 0,1 a 0,2% de los
péptidos totales.
En el caso particular de tolerancia a las
proteínas de la leche, la composición puede contener péptidos
tolerogénicos de origen lácteo tales como por ejemplo, la
\beta-lactoglobulina o caseínas. Los péptidos
tolerogénicos pueden así estar en forma de una fracción peptídica
que comprende por lo menos uno de los siguientes péptidos:
H_{2}N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH,
H_{2}
N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K,-K-COOH,
o
H_{2}N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH,
de la
\beta-lactoglobulina.
\beta-lactoglobulina.
En una versión preferida, un método para la
preparación de péptidos tolerogénicos comprende los siguientes
pasos:
- (i)
- se hidroliza un material proteínico conteniendo la proteína alergénica, hasta un grado de hidrólisis de aproximadamente 10 a 50%;
- (ii)
- a continuación se trata para inactivar la actividad enzimática residual;
- (iii)
- la solución del hidrolizado de proteína se clarifica y se somete a un tratamiento de precipitación o se pasa por una columna cromatográfica rellena de una resina apropiada, con lo que se recuperan fracciones peptídicas tolerogénicas.
Este método preferido se adapta bien al
tratamiento de hidrolizados preparados con varias concentraciones de
proteína (N_{tot}% = N x 6,38) para modificar el ratio de la
actividad tolerogénica con respecto a la antigenicidad residual del
material proteínico. Si se define arbitrariamente que la
antigenicidad de una proteína nativa es de 10^{6} (o sea 10^{6}
\mug/g de proteína) y que la respuesta tolerogénica es de 1, para
una proteína nativa, este ratio es 10^{-6}. Por lo tanto, el ratio
que califica la actividad tolerogénica de una fracción dada o de un
péptido tolerogénico debe ser por lo menos de 2 x 10^{-2}.
El material proteínico que va a ser tratado puede
ser cualquier composición que contenga un material de proteína y en
particular una solución o dispersión de proteínas de la leche:
proteínas de suero de leche de vaca, proteínas de suero ácido de
leche de vaca, proteínas de suero dulce de leche de vaca,
concentrados de proteínas de suero de leche de vaca, aislado de
proteínas de suero de leche de vaca, polvo de suero de leche de vaca
desmineralizado o caseinatos, por ejemplo.
En general, el contenido en proteína puede variar
en un margen de aproximadamente 70 a 95% en peso, pero el material
de partida es de preferencia lo más rico posible en proteína.
Las proteínas presentes en el material proteínico
pueden modificarse con enzimas proteolíticas, en hidrolizado de
proteína con un alto grado de hidrólisis (N
\alpha-amino/N_{tot}) de preferencia
aproximadamente 10-50%.
Las enzimas proteolíticas pueden ser por ejemplo,
de origen animal o vegetal (pepsina, quimotripsina, tripsina,
extracto de mucosa intestinal, extractos pancreáticos, quimosina,
papaína, bromelaína, ficina), de origen bacteriano o fúngico (serina
y metaloproteasas a partir de Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis,Aspergillus orysae, Aspergillus
wentii y proteasas ácidas a partir de Aspergillus orizae,
Aspergillus wentii, Mucor miehei, Mucor
pusillus, Endothia parasitica) o una combinación de las
mismas.
Durante la hidrólisis la concentración de
material proteínico en solución o en suspensión es de preferencia
alrededor de 5-20% en peso y podría ser pasteurizado
antes de introducir las proteasas. El ratio enzima/proteína puede
ser 0,1-10% peso/peso y de preferencia
aproximadamente 0,25 a 4%.
La hidrólisis puede efectuarse a una temperatura
de aproximadamente 35ºC a 65ºC, durante 30 minutos a 10 horas, de
preferencia 30 minutos a 4 horas a valores del pH en el margen de
2,5 a 11, de preferencia 4,5, 7,0, 8,0 y 8,5. Si se desea, el pH de
la solución puede ajustarse y regularse con ácido cítrico, HCl de
calidad alimenticia o NaOH, NH_{4}OH, KOH,
Ca(OH)_{2}, por ejemplo, a una concentración de 2N,
puro o mezclado.
A continuación, el hidrolizado de proteína puede
someterse a un tratamiento térmico de aproximadamente 0,1 a 10
minutos a una temperatura de aproximadamente 70 a 110ºC para la
inactivación de las enzimas residuales (es decir, proteasas).
La solución del hidrolizado de proteína así
obtenido puede clarificarse mediante centrifugación y/o
ultrafiltración para eliminar las proteínas insolubles e intactas
respectivamente, y se recupera la solución transparente. Es posible
emplear a escala industrial diferentes tipos de membranas (espiral,
tubular, plana, permite las fibras) hechas con diferentes materiales
(minerales, polisulfonas, ....) y con diferentes límites de
separación entre 1.000 y 100.000 daltons. En función de la clase de
enzima, las condiciones de hidrólisis y el tipo de membranas, la
modificación de las fracciones tolerogénicas podría ser suficiente
con sólo este paso.
La solución del hidrolizado transparente
recuperada puede, si se desea, concentrarse mediante evaporación
hasta un contenido en sólido seco de 10-50% para un
subsiguiente tratamiento o secado por pulverización si el
enriquecimiento en péptidos tolerogénicos es suficiente.
La solución del hidrolizado de proteína puede
someterse a un tratamiento de precipitación mediante un disolvente,
ácido o sales, por ejemplo, seguido de una centrifugación. En el
tratamiento de precipitación la concentración de la solución del
hidrolizado aumenta el rendimiento y reduce las cantidades de
disolvente. Por ejemplo, el etanol puede añadirse para obtener una
concentración final entre 15-60% volumen/volumen a
una temperatura de aproximadamente 4ºC a 25ºC. Después de una hora
de incubación, puede efectuarse una centrifugación (30 minutos a
4500 g) para separar los péptidos solubles y los insolubles. En
función del proteolizado podemos emplear la precipitación con ácido
(fosfórico o clorhídrico, por ejemplo) o la precipitación
fosfo-cálcica. A continuación, los disolventes
pueden eliminarse por evaporación y las sales, por ejemplo, por
electrodiálisis.
La solución transparente y la fracción insoluble,
de preferencia, se recuperan.
La solución del hidrolizado de proteína así
obtenida puede pasarse por una columna rellena con una resina de
adsorción, intercambiadora iónica o hidrofóbica a una velocidad de
flujo de 0,1-4 volúmenes de columna por hora, a una
temperatura de aproximadamente 4ºC a 60ºC. Antes del tratamiento
cromatográfico, el hidrolizado de proteína puede concentrarse para
proporcionar una solución que tenga un contenido en sólido seco de
8-35% en peso.
Durante la cromatografía, una fracción del
péptido se absorbe dentro de la resina mediante el paso de la
solución de hidrolizado dentro de la columna rellena con el
conveniente soporte a la velocidad de 0,1-4
volúmenes de columna por hora. Es posible emplear a escala
industrial los diferentes tipos de cromatografía como: intercambio
iónico, interacciones hidrofóbicas, fases invertidas, adsorción
(hidroxiapatita, carbón activo, resinas hidrofóbicas a base de
poliestireno ....) o cromatografía covalente, por ejemplo.
En el tratamiento cromatográfico, la cantidad de
solución de hidrolizado por litro de columna rellena de resina,
puede ser hasta de 5 litros con respecto a los sólidos secos del
10%. De preferencia, se pasa una solución de hidrolizado que tenga
20-1000 g de sólido seco por litro de resina, por la
columna rellena de resina. El tratamiento cromatográfico puede
efectuarse a un pH de aproximadamente 2 a 10 de preferencia
6-8, para la solución clarificada del hidrolizado.
El tratamiento cromatográfico puede efectuarse a una temperatura de
aproximadamente 4ºC a 60ºC.
Por ejemplo, el tratamiento cromatográfico para
seleccionar fracciones tolerogénicas a partir de la
\beta-lactoglo-bulina, puede
consistir en el empleo de:
- -
- una resina fuertemente catiónica equilibrada con HCl 0,1N a una velocidad de flujo de 1 volumen/hora. La fracción no retenida se eluyó con 3 volúmenes de agua, la segunda fracción (fracción que contiene los péptidos tolerogénicos) se eluyó con NaOH 0-0,5N, y la tercera fracción se eluyó con HCl 0,1N.
- -
- una resina de fase invertida (C18) equilibrada con agua pura. La fracción no retenida se eluyó con agua, a continuación paso a paso (20% y 40% de etanol) se recuperaron la segunda y la tercera.
- -
- una resina fuertemente aniónica equilibrada con NaOH 0,1N. La fracción no retenida se eluyó con 3 volúmenes de agua. La segunda fracción se eluyó con HCl 0,5N, la tercera con NaOH 0,1N.
El método más preferido consiste en tratar con
resina una solución neutra, en cuyo caso no es necesario ningún
ajuste del pH después del paso de hidrólisis y el contenido de sal
del producto será menor.
Para concluir el tratamiento cromatográfico, la
columna puede eluirse con agua pura, a continuación, agua
conteniendo sales, tampón, ácidos, bases o disolventes orgánicos a
una temperatura de 4-60ºC. La elución se realiza
paso a paso o mediante un gradiente de concentración. Las soluciones
que han pasado a través de la columna se recuperan. Si es necesario,
se recuperan las sales, disolventes, ácidos, bases de la solución
recuperada, y las soluciones recuperadas pueden concentrarse hasta
un contenido en sólidos, seco, de 35-65% y secarse
por pulverización.
Estos péptidos son por tanto, fragmentos
específicos que corresponden a una parte de la secuencia de proteína
nativa o a una parte de los péptidos trípticos específicos de la
proteína hidrolizada.
Estos péptidos tolerogénicos pueden emplearse
para la preparación de una composición que induce la tolerancia oral
a las proteínas nativas, dicha composición está dirigida a los
mamíferos susceptibles de alergia a las proteínas y particularmente
a los humanos y animales domésticos.
Los siguientes ejemplos se dan en concepto de
ilustración solamente y de ninguna manera han de considerarse como
limitantes del objeto de la presente solicitud.
La figura 1 representa la inducción específica de
tolerancia oral en ratones alimentados con TTH
\beta-LG, con F2 o con F(7+9). A: respuesta
humoral (barras oscuras) y mucosal (barras grises)
anti-\beta-LG IgE. B: respuesta
\beta-LG-específica DTH.
(\bullet) son incrementos individuales de la planta del pie y (-)
son las medias de 10 ratones por grupo. C: respuestas proliferativas
específicas (\beta-LG) y no específicas (PHA) de
células esplénicas. Linfocitos esplénicos de ratones alimentados con
solución salina (\vardiamondsuit), con TTH
\beta-LG (\blacksquare), con F2
(\blacktriangle), o con F(7+9) (\bullet), se aislaron y
seguidamente se estimularon con concentraciones decrecientes de
antígenos. La incorporación de ^{3}H timidina se midió después de
120 horas de cultivo. Los resultados de la incorporación de
(^{3}H)Tdr se expresaron en cpm, como la media de cultivos
por triplicado, la media con el blanco substraído se registró en la
gráfica respectivamente frente a la concentración de
\beta-LG o PHA.
La figura 2 representa las secuencias primarias
asignadas a los péptidos trípticos identificados en el hidrolizado
de \beta-lactoglobulina. Las barras verticales
representan el enlace de disulfuro.
En el primer ejemplo siguiente, se efectuaron
experimentos para seleccionar los péptidos tolerogénicos de
\beta-LG.
La \beta-LG se digirió con
tripsina tratada con TPCK en condiciones seleccionadas para provocar
una digestión suave. El tamaño y la distribución de pesos
moleculares de los péptidos resultantes de nuestro modelo de
hidrólisis \beta-LG, osciló respectivamente de dos
a veintitrés aminoácidos, y de 247 a 2719 Da. Las propiedades
tolerogénicas de los péptidos resultantes han sido ensayadas en una
tolerancia oral en un modelo de ratón experimental.
Se obtuvieron ratones hembras Balb/c de
IFFA-Crédo (L'Abresle, Francia). Todos ellos fueron
criados y desarrollados con una dieta exenta de leche. Los ratones
tenían 3 semanas de edad al principio de los experimentos.
Con el fin de ser digerida, se disolvió
\beta-LG (220 gramos) en agua bidestilada a una
concentración final del 5%. La \beta-LG se digirió
con tripsina tratada con TPCK, empleando un ratio enzima/substrato
(E/S) de 1/100 (p/p) a 40ºC, pH 7,6 agitando continuamente. Después
de una hora de hidrólisis se añadió la misma cantidad de enzima para
dar un ratio E/S final de 2/100 (p/p). Después de 4 horas de
hidrólisis, se interrumpió la reacción mediante inactivación de
tripsina a 85ºC durante 5 minutos. El hidrolizado tríptico total de
la \beta-lactoglobulina (TTH
\beta-LG) se liofilizó a continuación. Los
productos de la digestión de la \beta-LG se
separaron mediante cromatografía preparativa sobre una resina
catiónica.
Se obtuvieron 15 diferentes fracciones, se
nanofiltraron individualmente para concentrar y eliminar las sales,
se diafiltraron, dializaron, liofilizaron y se almacenaron secas a
temperatura ambiente hasta la realización de los experimentos in
vivo.
Cada fracción se caracterizó además por su
contenido en péptido empleando la cromatografía líquida de alta
resolución de fase invertida. Considerando la TTH
\beta-LG como referencia, se apreció el
enriquecimiento y el empobrecimiento de los péptidos en cada
fracción por área detectada a 214 nm empleando inyecciones de iso
nitrógeno.
Se administraron oralmente a ratones de 22 días
de edad, mediante alimentación por sonda esofágica,
\beta-LG (5 mg/g de peso corporal), cantidades
varias de TTH \beta-LG o cantidades varias de
diferentes fracciones peptídicas de \beta-LG. Los
ratones de control fueron alimentados con agua salina. 5 días más
tarde, todos los ratones fueron inmunizados con
\beta-LG y OVA (ovoalbúmina grado V, Sigma), como un antígeno sin relación, para ensayar la especificidad de la respuesta inmunológica. 21 días después de la prueba sistémica, se efectuó la evaluación de la Delayed Type Hypersensitivity ("hipersensibilidad tipo retardada") (DHT), midiendo por duplicado el grueso de la planta izquierda del pie posterior antes y después de la inmunización con \beta-LG.
\beta-LG y OVA (ovoalbúmina grado V, Sigma), como un antígeno sin relación, para ensayar la especificidad de la respuesta inmunológica. 21 días después de la prueba sistémica, se efectuó la evaluación de la Delayed Type Hypersensitivity ("hipersensibilidad tipo retardada") (DHT), midiendo por duplicado el grueso de la planta izquierda del pie posterior antes y después de la inmunización con \beta-LG.
24 horas después de la inmunización con DTH, se
midieron los aumentos del grueso de la planta del pie de los
animales inyectados el día antes. Las diferencias entre estas dos
mediciones se expresaron en \Delta del grueso (milímetros) y se
emplearon en comparaciones de grupos. A continuación se extrajeron
muestras de sangre de todos los ratones, se extrajeron los bazos y
se reunieron de acuerdo con el grupo de tratamiento. Se realizaron
ensayos específicos de proliferación de esplenocitos para cada
grupo. Los contenidos intestinales se recogieron individualmente. Se
congelaron rápidamente a -80ºC, muestras de suero y muestras
intestinales hasta que se realizaron los ensayos. Se determinó la
IgE específica frente a la \beta-LG y frente a la
OVA tanto en la muestra de suero como en la muestra intestinal.
Se ensayaron diluciones de suero y fluido
intestinal por duplicado para determinar los anticuerpos IgE
anti-\beta-LG y
anti-OVA mediante análisis ELISA. Se emplearon
muestras reunidas de veinte ratones hembra no inmunizados como
controles negativos en cada placa. Los títulos se determinaron
mediante el cálculo de la dilución de la muestra que dio doce veces
la absorbancia del control negativo. Los títulos se expresaron como
el log_{10} del recíproco de la dilución.
Se homogeneizaron y purificaron soluciones de
células del bazo. Las células se cocultivaron en presencia de
\beta-LG o de fitohemaglutinina A. Se añadió (^{3}H)Tdr (Amersham, Zurich) en las 6 horas finales de cultivo, se recogió el contenido de las placas y se analizaron mediante contaje por centelleo. Los índices de estimulación se calcularon como el ratio de los valores del ensayo con substracción del blanco, y del control, expresados como la media de la incorporación de cpm (^{3}H)Tdr en cultivos por triplicado.
\beta-LG o de fitohemaglutinina A. Se añadió (^{3}H)Tdr (Amersham, Zurich) en las 6 horas finales de cultivo, se recogió el contenido de las placas y se analizaron mediante contaje por centelleo. Los índices de estimulación se calcularon como el ratio de los valores del ensayo con substracción del blanco, y del control, expresados como la media de la incorporación de cpm (^{3}H)Tdr en cultivos por triplicado.
Se empleó una inhibición ELISA para determinar
los epitopos \beta-LG en el hidrolizado de
\beta-LG y en las fracciones de
\beta-LG. Los títulos de la
\beta-lactoglobulina se calcularon a partir de una
curva estándar de \beta-LG a una dilución 5 veces,
efectuada en cada placa.
Se compararon las respuestas DTH, y las
respuestas IgE séricas e intestinales, empleando ensayos ANOVA de un
único factor.
Con el fin de aislar los péptidos tolerogénicos a
partir de TTH \beta-LG, se han obtenido grandes
cantidades de fracciones trípticas de \beta-LG
mediante cromatografía preparativa. A partir de cada una de ellas se
recogieron 15 fracciones (F1-F15) y se juntaron
respectivamente. Previamente se han determinado las secuencias
asignadas de los péptidos trípticos de \beta-LG
(figura 2).
- \bullet No pudo detectarse en las fracciones F1, F5 y F15 ningún enriquecimiento específico de péptidos
- \bullet Se enriquecieron 3 diferentes péptidos T6, T17 y T18 presentes en la fracción F2; pero no se concentraron en ninguna de las otras fracciones.
- \bullet De manera similar, el T7 se enriqueció específicamente en la fracción F6.
Aparte de estos péptidos, concentrados en
solamente una fracción dada, algunos otros fueron enriquecidos en
varias fracciones. Este fue el caso del T21, por ejemplo, claramente
detectado en altas proporciones en las fracciones F7, F9 y F10
(tabla 1).
| Fracciones | F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 |
| Masas (g) | 52 | 13.9 | 11 | 11.8 | 2.57 | 1.94 | 4.37 |
| Péptidos | T6 | T20 | |||||
| significativamente | - | T17 | T23 | T23 | - | T7 | T21 |
| enriquecidos | T18 | T9 | T24 | ||||
| F8 | F9 | F10 | F11 | F12 | F13 | F14 | F15 |
| 13.1 | 5.01 | 6.53 | 1.05 | 3.46 | 1.9 | 2.67 | 28.8 |
| T9 | |||||||
| T12 | T12 | T10 | T11 | T10 | T10 | T10 | - |
| T24 | T21 | T21 | T11 | T11 |
Se reunieron fracciones de acuerdo con la
similitud de sus péptidos enriquecidos y en proporción a sus
respectivas masas, y a continuación se ensayaron in vivo.
- -
- Las F1, F2, F5 y F15 se consideraron como que habían sido alimentadas individualmente debido a que no compartieron el enriquecimiento de péptidos con las otras fracciones.
- -
- Las F3 y F4 se juntaron debido a la alta concentración de T23;
- -
- Las F8 y F9 se mezclaron para ensayar la actividad tolerogénica de T12;
- -
- Las F7 y F9 se juntaron de acuerdo con el enriquecimiento de T20 y T21;
- -
- Las F6, F11, F12, F13 y F14 se juntaron entre sí, cada una enriquecida en T9, T10 y T11.
Se evaluaron las respuestas cualitativas de las
propiedades tolerogénicas generadas a partir de la alimentación de
los diferentes grupos de fracciones a dos diferentes concentraciones
(0,5 ó 0,125 mg/g de peso corporal). Se determinó la inducción o
ausencia de inducción de las respuestas tolerogénicas a la
\beta-LG por la importancia estadística de la
respuesta inmunológica.
Dos de las ocho fracciones ensayadas mostraron
ser activas tanto en la reducción de respuestas a la IgE
anti-\beta-LG sérica como a la
proliferación específica de esplenocitos:
- -
- F2, cuando se ha dado oralmente a 0,125 mg/g de peso corporal,
- -
- F(7+9), a las dos dosis ensayadas
De acuerdo con nuestros criterios cuantitativos,
las respuestas séricas e intestinales a los IgE
anti-\beta-LG, DHT, y la
proliferación específica de esplenocitos, se ha inducido tolerancia
oral en ratones alimentados bien con F2 o bien con F(7+9)
(figura 1).
Para los dos grupos alimentados con fracciones,
los títulos séricos IgE
anti-\beta-LG, 3,58 +/- 0,18 y
3,21 +/- 0,29 respectivamente para F2 y F(7+9), no fueron
tan bajos como cuando se indujeron mediante alimentación con TTH
\beta-LG (2,68 +/-0,05) (figura 1A). Sin embargo,
niveles específicos de IgE fueron significativamente menores que los
títulos de los ratones de control (4,16 +/- 0,05)(p<0,05). La IgE
intestinal específica disminuyó también en ratones alimentados con
TTH \beta-LG (1,66 +/- 0,32) o alimentados con las
dos fracciones trípticas \beta-LG (1,1 +/- 0,34 y
1,9 +/- 0,21 respectivamente para F2 y F(7+9) confirmando la
regulación a la baja inducida oralmente comparada al grupo de
control (2,32 +/- 0,64). La figura 1B muestra que la DTH específica
fue claramente reducida en los ratones alimentados con TTH
\beta-LG (0,074 mm) de cada una de las dos
fracciones tolerogénicas (0,063 mm y 0,062 mm respectivamente para
F2 y F(7+9) en comparación a la hipersensibilidad local
medida en los ratones de control alimentados solamente con solución
salina (0,164 mm).
Para confirmar la inducción lograda de la
tolerancia oral sobre la inmunidad celular, se efectuaron ensayos de
proliferación de esplenocitos específicos y no específicos. Las
figuras 1C y D muestran que la alimentación de los ratones con
cualquiera de las dos fracciones \beta-LG
elegidas, así como con la TTH \beta-LG, provocó
una severa disminución de la respuesta proliferativa a la
\beta-LG en comparación con la observada a partir
de los esplenocitos aislados de los ratones de control alimentados
con solución salina. Efectivamente, los índices de estimulación
fueron 0,225, 0,174 y 0,341 respectivamente para los ratones
alimentados con la TTH \beta-LG, F2, y
F(7+9). Como se esperaba, la respuesta proliferativa no
específica debida a la estimulación por PHA no fue afectada por el
diferente régimen de alimentación.
La medición de los epitopos de
\beta-LG efectuada para las diferentes fracciones
mediante inhibición ELISA mostraron que las cantidades de epitopos
de \beta-LG presentes por gramo de proteínas eran
muy diferentes de una fracción a otra, oscilando de 15 \mug/g de
proteína para F1 hasta 9240 \mug/g de proteína para la F13. Estos
resultados indican también que los sitios antigénicos y
tolerogénicos pueden estar diferentemente situados, lo cual sugiere
que la alergenicidad y la tolerogenicidad pueden estar desacopladas.
Esquemáticamente, pueden describirse tres diferentes tipos de
fracciones:
- -
- un primer tipo, representado por la fracción F2, que incluye péptidos básicos con un alto potencial tolerogénico asociado a una antigenicidad muy baja,
- -
- en el otro extremo, un tipo de fracción F13 que contiene péptidos ácidos, altamente antigénicos y desprovista de actividad tolerogénica, y finalmente,
- -
- en una posición media, los péptidos presentes en las fracciones F7 y F9, inductores de tolerancia pero teniendo todavía una notable antigenicidad.
Las fracciones F2 y la mezcla F(7+9)
fueron ambas tolerogénicas. La antigenicidad de las fracciones
tolerogénicas F2, F7 y F9 fueron menores que las del hidrolizado
total. Remarcablemente, la antigenicidad de la tolerogénica F2 se
encontró que era 53 veces menor que la antigenicidad de la TTH
\beta-LG. En estas dos fracciones tolerogénicas,
los tamaños de los péptidos potencialmente tolerogénicos se
distribuyeron entre 8 aminoácidos para T6 y 23 aminoácidos para T21,
dando unos respectivos pesos moleculares entre 915 y 2719 Da.
Para ser tolerogénicos, parece que los péptidos
necesiten un equilibrio preciso entre la dosis, el tamaño, la
secuencia y la estructura. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido
descrita en la literatura una correlación entre la estructura del
péptido y las propiedades tolerogénicas.
Con el fin de obtener péptidos tolerogénicos, se
disolvió 1 kg de aislado de proteína de suero de leche de vaca en 7
litros de agua a 50ºC. El pH se ajustó a 7,5 con KOH 2N. El volumen
se ajustó a 14 litros con agua a 50ºC para obtener una solución al
7% con respecto al polvo.
Se añadieron 10 g de la enzima tripsina +
quimotripsina, y la solución se hidrolizó durante 120 minutos. El pH
se mantuvo mediante una solución alcalina de KOH 2N y NaOH 2N.
Después de la hidrólisis, la solución se calentó a 80ºC durante 10
minutos. La solución se enfrió a 40ºC y se ultrafiltró con membranas
de 40.000 Da de separación.
El permeato transparente se trató con una resina
catiónica de forma que el volumen final de la resina fue de
aproximadamente 180 ml. La resina se lavó y se equilibró con NaOH
0,1N con una velocidad de flujo de 300 ml/hora. Se pasaron por la
columna 100 ml del permeato transparente de 40.000 Da. La fracción
no retenida se eluyó mediante 540 ml de agua pura. La segunda y la
tercera se eluyeron mediante 900 ml de HCl 0,5N y 540 ml de NaOH
0,1N respectivamente.
Los péptidos tolerogénicos están presentes en la
fracción F2 por ejemplo, en una cantidad suficiente para prevenir
cualquier reacción después de realizar la DBPCFC con leche de
vaca.
1 kg de caseinato de sodio se disolvió en 7
litros de agua a 50ºC. El pH se ajustó a 7,5 con KOH 2N. El volumen
se ajustó a 10 litros con agua a 50ºC para obtener una solución al
10% con respecto al polvo.
\newpage
Se añadieron 40 g de enzima Alcalasa, y la
solución se hidrolizó durante 120 minutos. El pH se mantuvo mediante
una solución alcalina de KOH 2N y NaOH 2N. A continuación de la
hidrólisis, se calentó la solución a 80ºC durante 10 minutos. La
solución se enfrió a 40ºC y se ultrafiltró con membranas de
polietilsulfona de 10.000 Da de separación.
Cromatografía de fase invertida: 300 ml de
permeato transparente se pasaron por una columna equilibrada con una
velocidad de flujo de 3 ml/minuto. La fracción no retenida se eluyó
con 300 ml de agua, a continuación la segunda fracción se eluyó con
200 ml de gradiente de etanol 0-20%. Finalmente la
tercera fracción se eluyó con 200 ml de gradiente de etanol
20-40%. La columna se regeneró mediante 400 ml de
gradiente de etanol 40-80% v/v y se equilibró con
500 ml de agua pura.
El procedimiento fue el mismo que se ha descrito
en el ejemplo 3, excepto que la cantidad de enzima y la membrana de
separación se cambiaron por Alcalase 20 g y 40.000 Da
respectivamente. La subsiguiente cromatografía sobre una resina
catiónica se efectuó como sigue: se lavaron 150 ml de resina 3
veces con 500 ml de agua pura, a continuación se vertieron en una
columna cuyo volumen final de resina fue de 180 ml. La resina se
lavó y se equilibró con NaOH 0,1N a una velocidad de flujo de 300
ml/hora. 100 ml del permeato transparente de 40.000 Da se pasaron
por la columna a una velocidad de flujo de 300 ml/hora. La fracción
no retenida se eluyó mediante 540 ml de agua pura. La segunda y la
tercera fracción se eluyeron mediante 900 ml de HCl 0,5N y 540 ml de
NaOH 0,1N respectivamente.
El procedimiento fue el mismo que se ha descrito
en el ejemplo 3, excepto que el tratamiento con fase invertida se
cambió por una cromatografía sobre una resina fuertemente aniónica
en la forma siguiente: se lavaron 150 ml de resina 3 veces con 500
ml de agua pura, a continuación se vertieron en una columna en donde
la resina se lavó y equilibró con HCl 0,1N a una velocidad de flujo
de 180 ml/hora. 100 ml del ultrafiltrado transparente se pasaron por
la columna a una velocidad de flujo de 180 ml/hora. La fracción no
retenida se eluyó mediante 540 ml de agua pura. La segunda y la
tercera fracción se eluyeron mediante 3 volúmenes de columna de NaOH
0,5N y 5 volúmenes de columna de HCl 0,1N respectivamente.
Se prepararon sintéticamente los péptidos
tolerogénicos T6 y T17 contenidos en la fracción tolerogénica F2. El
T13 contenido en una fracción no tolerogénica fue también
sintetizado como un control negativo. La inducción de tolerancia
oral de estos pétidos fue ensayada en ratones como se ha descrito en
el ejemplo 1c) excepto que la dosis fué de 20 mcg/g de peso
corporal.
| Péptidos | anti-\beta-LG IgE/control | Índice de estimulación | Índice de estimulación |
| tolerado | (proporción) | (GLM) | |
| T17 | 2,67/3,39 | 0,305 | 0,405 |
| T6 | 3,24/3,39 | 0,53 | 0,285 |
| T6-T17 (unidos) | 3,40/3,39 | 0,92 | 0,81 |
| T13 (control negativo) | 3,20/3,39 | 1,17 | 0,87 |
La administración oral de T6 o T17 induce una
tolerancia celular (inhibición específica de la proliferación de
linfocitos). El T17 induce también una tolerancia humoral mediante
una significativa disminución específica
anti-b-LG IgE.
La administración oral de T13 (control negativo)
no induce ninguna tolerancia.
Estos dos péptidos T6
(H_{2}N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH
y T17
(H_{2}N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K,-K-COOH)
tienen un alto potencial tolerogénico asociado a una muy baja
antigenicidad. Puede emplearse en una composición alimenticia o
farmacéutica para la inducción de tolerancia a las proteínas en
individuos de riesgo de alergia a las proteínas.
La composición para 100 g de polvo contiene 12,5%
de péptidos (péptidos sintetizados T6 o T17 o péptidos tolerogénicos
como se han preparado en el ejemplo 2, representan aproximadamente
0,1 a 0,2% del total de péptidos), 26% de grasas, 56% de hidratos de
carbono (incluyendo la lactosa 39%, maltodextrina 11%, almidón 6%),
trazas de vitaminas y oligoelementos para satisfacer las exigencias
diarias, 2,5% de minerales y 3% de humedad.
13 g de este polvo se mezclan en 100 ml de agua.
La composición obtenida es una fórmula para niños particularmente
dirigida a los niños de riesgo a la alergia por la leche de
vaca.
Con el fin de obtener una fórmula tolerogénica
para niños, preparamos la siguiente mezcla que contenía para 100 ml
de fórmula, 1,6% de péptidos (péptidos tolerogénicos como se han
preparado en el ejemplo 2), representan aproximadamente 0,1 a 0,2%
de l total de péptidos), 3,4% de grasa, 7,4% de hidratos de carbono
(incluyendo la lactosa 5,2%, maltodextrina 1,4%, almidón 0,8%),
trazas de vitaminas y oligoelementos para satisfacer las exigencias
diarias, 0,3% de minerales y 79,9% de agua.
Con el fin de obtener una preparación
tolerogénica de pequeño volumen, preparamos la siguiente mezcla que
contenía para 30 ml de preparación, desde aproximadamente 0,003%
hasta aproximadamente 0,015% de péptidos tolerogénicos (péptidos
tolerogénicos como se han preparado en el ejemplo 2, representan el
100% del total de péptidos), 7,4% de hidratos de carbono
(incluyendo la maltodextrina 1,4% y sacarosa 6%), 92,5% de agua y
perfume. Con el fin de inducir la tolerancia oral, esta preparación
debe administrarse 1 a 5 veces al día, a recién nacidos "de
riesgo" de alergia a la leche de vaca bien alimentados con una
fórmula hipoalergénica o con el pecho.
Claims (7)
1. Una composición hipoalergénica para la
inducción de tolerancia a las proteínas en individuos de riesgo a la
alergia a las proteínas, la cual contiene (i) una base de un
material "no alergénico" a las proteínas hidrolizado a fondo,
y/o (ii) una base de aminoácidos libres, la cual composición
comprende como ingrediente activo por lo menos un péptido
tolerogénico de una proteína alergénica, en donde dichos péptidos
tolerogénicos están presentes en forma de (i) fracciones peptídicas
tolerogénicas aisladas de la hidrólisis de material proteínico que
contiene la proteína alergénica y/o (ii) péptidos tolerogénicos
sintéticamente preparados, en una cantidad tal que el ratio de
actividad tolerogénica respecto a la antigenicidad residual es por
lo menos de 2 x 10^{-2}.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, la cual contiene una cantidad de péptido
tolerogénico de 0,01% a 10%, y de preferencia 0,1% a 0,2% de la
fuente de nitrógeno total de las proteínas de la composición.
3. Una composición de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, dirigida a los mamíferos susceptibles de
alergia a la leche de vaca, la cual contiene una fracción peptídica
que comprende
(H_{2}N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH,
H_{2}N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K,-K-COOH
o
H_{2}N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH
de \beta-lactoglobulina.
4. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, la cual contiene una fuente de
nitrógeno que proporciona del 7 al 25% de la energía total, una
fuente de hidratos de carbono que proporciona del 28 al 66% de la
energía total, una fuente de lípidos que proporciona del 25 al 60%
de la energía total, minerales y vitaminas para satisfacer las
exigencias diarias y por lo menos uno de dichos péptidos
tolerogénicos, el cual se añade en una cantidad eficiente para
inducir la tolerancia oral.
5. El péptido tolerogénico
H_{2}N-I-D-A-L-N-E-N-K-COOH
de la \beta-lactoglobulina, que tiene la propiedad
de inducir la tolerancia oral a las proteínas de la leche.
6. El péptido tolerogénico
H_{2}N-V-L-V-L-D-T-D-Y-K,-K-COOH
de la \beta-lactoglobulina, que tiene la
propiedad de inducir la tolerancia oral a las proteínas de la
leche.
7. El péptido tolerogénico
H_{2}N-T-P-E-V-D-D-E-A-L-E-K-F-D-K-COOH
de la \beta-lactoglobulina, que tiene la
propiedad de inducir la tolerancia oral a las proteínas de la
leche.
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| EP99200130 | 1999-01-19 |
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