ES2203572T3 - Procedimiento de purificacion de fosfatidilserina. - Google Patents

Procedimiento de purificacion de fosfatidilserina.

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ES2203572T3 ES01124577T ES01124577T ES2203572T3 ES 2203572 T3 ES2203572 T3 ES 2203572T3 ES 01124577 T ES01124577 T ES 01124577T ES 01124577 T ES01124577 T ES 01124577T ES 2203572 T3 ES2203572 T3 ES 2203572T3
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Abstract

Procedimiento de purificación de fosfatidilserina que tiene la fórmula (I) en la que R1 y R2, pueden ser iguales o diferentes y son un grupo acilo C10-C30, X es un OH o OM, en el que M se escoge del grupo de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y alquil amonio, y en el que la porción de serina está en la forma racémica D, L, y preferiblemente en la forma L, comprendiendo la extracción de dichas fosfatidilserinas a partir de una disolución en un disolvente hidrocarbonado con una mezcla de agua y un disolvente polar orgánico.

Description

Procedimiento de purificación de fosfatidilserina.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de purificación de fosfatidilserina, un fosfolípido que es que es útil en particular para la preparación de composiciones farmacéuticas usadas en el tratamiento de síndromes involutivos del cerebro de naturaleza variada, pero también en la preparación de formulaciones de determinados liposomas y de composiciones dietéticas basadas en lecitinas naturales.
Estado de la técnica
La fosfatidilserina es un fosfolípido presente ampliamente en la naturaleza; es uno de los principales componentes de las membranas celulares en organismos animales y está presente particularmente en grandes cantidades en tejidos cerebrales de mamíferos. La bibliografía médica menciona propiedades interesantes de la fosfatidilserina, entre las cuales la más trascendente hace relación a su efectividad en mejorar las habilidades mnemotécnicas.
La trans-fosfatidilación de fosfatidilcolina con serina en presencia de la enzima D-fosfolipasa de acuerdo con el siguiente esquema es la reacción más conveniente para la producción industrial de fostatidilserina.
1
La reacción puede llevarse a cabo tanto en un ambiente acuoso, como se describe en el documento EP-1048738 como en un sistema que contiene además de una fase acuosa, un disolvente orgánico inmiscible con agua, preferiblemente tolueno; este segundo procedimiento se describe en la patente de EE.UU. 5.700.668.
Independientemente del procedimiento de transfosforilación usado, la fosfatidilserina que puede aislarse al final del procedimiento contiene en cualquier caso grandes cantidades de impurezas hidrófilas, como serina, colina y sus sales que están presentes en la fase acuosa.
Otro aspecto que debe ser remarcado es que, mediante la medida de la actividad enzimática del tipo de productos de D-fosfolipasa de acuerdo con el procedimiento descrito en la bibliografía relacionada (Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)), se ha determinado que cada gramo de producto tiene una actividad enzimática de aproximadamente 2 unidades internacionales.
Cumpliendo los criterios estrictos de pureza, la eliminación de dichas impurezas del producto es muy importante.
Los procedimientos que son comúnmente usados para eliminar las sustancias hidrófilas de las disoluciones orgánicas de fosfolípidos han probado ser inefectivas. En realidad, mediante la extracción de una disolución de tolueno de la mezcla fosfolipídica obtenida como se describe en la patente de EE.UU. 5.700.668, con la misma cantidad de agua, y después separando las dos fases, se ha descubierto que el contenido de serina en la fase orgánica y la actividad D-fosfolipasa son prácticamente inalterados con respecto a los valores encontrados antes de la extracción con agua.
De modo similar, la elución de la misma disolución orgánica en una columna cromatográfica que contiene una cromatografía de sílice acondicionada con tolueno, en el que el producto de elución es completado con tolueno, resulta en una muy pequeña eliminación de serina y de la actividad enzimática del fosfolípido.
En otro experimento, a la disolución orgánica de fosfatidilserina que se purifica debido a la serina se le añade acetona: el producto precipitado muestra, después de ser analizado, una proporción de serina respecto a fosfatidilserina sustancialmente inalterado con respecto al producto de partida.
Por ello, existe siempre el problema relacionado con la disponibilidad de un procedimiento de purificación efectivo de fosfatidilserinas preparadas mediante trans-fosfatidilación de fosfatidilcolina con serina en presencia de la enzima D-fosfolipasa, y que contienen como impurezas componentes hidrófilos, proteínas y sales inorgánicas.
Resumen de la invención
El solicitante ha encontrado de modo sorprendente que las impurezas hidrófilas, proteínas y sales inorgánicas pueden ser eliminadas exitosamente de una disolución de fosfatidilserina en un disolvente orgánico mediante la extracción con agua, proporcionando un disolvente polar orgánico que se añade al sistema.
El objetivo de la siguiente invención es por lo tanto, un procedimiento de purificación de fosfatidilserinas, que tienen la fórmula
2
en la que R_{1} y R_{2}, pueden ser iguales o diferentes y son un grupo acilo C_{10}-C_{30}, X es un OH o OM, en el que M se escoge del grupo de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y alquil amonio, y en el que la porción de serina está en la forma racémica D, L, y preferiblemente en la forma L, constando la extracción de dichas fosfatidilserinas a partir de una disolución en un disolvente hidrocarbonado con una mezcla de agua y un disolvente polar orgánico.
Descripción detallada de la invención
En el caso específico de las fosfatidilserinas preparadas de acuerdo con la descripción contenida en la patente de EE.UU. 5.700.668 mediante transfosfatidilación un sistema de dos fases que consta de una fase acuosa y una fase de tolueno, el procedimiento de acuerdo con la invención puede ser llevado a cabo directamente en la fase de tolueno después de separar éste de la fase acuosa al final de la reacción.
En el caso de fosfatidilserinas preparadas siguiendo otros procedimientos, el procedimiento de purificación puede ser llevado a cabo ventajosamente mediante la agitación del producto en una mezcla que contiene un disolvente orgánico, agua y un disolvente polar orgánico.
También en este caso el fosfolípido en cuestión está presente en la fase hidrocarbonada, mientras que las impurezas hidrófilas son encontradas en la fase acuosa.
Después de separar las fases la fosfatidilserina puede ser aislada usando procedimientos conocidos como la precipitación con acetona.
De acuerdo con el siguiente procedimiento se pueden usar disolventes aromáticos o alifáticos como disolventes hidrocarbonados, entre los disolventes aromáticos se prefiere tolueno o xileno, entre los disolventes alifáticos se prefiere usar n-heptano, n-hexano o ciclohexano.
Como disolventes polares orgánicos se pueden usar disolventes alcohólicos, que contienen por ejemplo de 1 a 5 átomos de carbono. De acuerdo con la forma de realización de la invención preferida, dicho disolvente alcohólico se elige entre alcoholes secundarios y ternarios, usando preferentemente isopropanol.
La extracción de acuerdo con la invención puede ser llevada a cabo a temperaturas entre 0 y 70ºC, y preferentemente entre 20 y 30ºC.
La cantidad de disolvente hidrocarbonado se encuentra entre 4 y 30 litros/kg de fosfolípido a purificar, y preferiblemente entre 6 y 12 litros.
La proporción de volumen entre el agua y el disolvente hidrocarbonado se encuentra entre 0,2 y 5 y preferiblemente entre 0,3 y 1. La proporción de volumen entre el disolvente polar orgánico y el disolvente hidrocarbonado se encuentra entre 0,2 y 2; y preferiblemente entre 0,3 y 1,2.
El procedimiento descrito puede ser aplicado a fosfatidilserinas con diferentes cadenas acíclicas y permite purificar ambos productos derivados de la trans-fosfatidilación de fosfatidilcolinas de origen natural como semilla de soja, colza o yema de huevo, y fosfatidilcolinas sintetizadas con ácidos grasos, tanto saturados como el ácido mirístico, ácido palmítico y ácido esteárico, como insaturados como ácido oleico o ácido linoleico.
Los siguientes ejemplos simplemente apuntan hacia la descripción de la presente invención sin limitarse a su propósito.
Ejemplo 1 Preparación de fosfatidilserina en un sistema de dos fases
Se introducen en un matraz junto con 3 l de tolueno 400 g de una fracción no desgrasada de lecitina de soja, que contiene un 32% de fosfatidilcolina y un 50% de triglicéridos,. Se prepara por separado una disolución de 22,7 g de cloruro cálcico, 27,6 g de acetato sódico trihidratado y 62,5 g de L-serina en 1,3 l de una disolución de D-fosfolipasa con una actividad de 3 KU/l. La disolución se lleva a pH=4,2 con ácido acético. Las dos disoluciones son unidas y mantenidas bajo agitación a 25ºC durante 8 horas. Después de la filtración, las dos fases son separadas, una décima parte de la fase de tolueno es concentrada a vacío (la parte sobrante se usa en los experimentos descritos en los ejemplos 2,3,4,5); el residuo se añade a 500 ml de acetona a temperatura ambiente. El producto se filtra y se seca, obteniendo así 27 g de una mezcla de fosfolípidos con un contenido de fosfatidilserina del 50%.
El análisis mediante TLC (fase móvil: mezcla de cloroformo, metanol, agua y un 28% de disolución acuosa de amoniaco 300:100:10:12; detector: ninhidrina) muestra la presencia de un 1,5% de L-serina en el producto final.
La presencia de D-fosfolipasa en el producto se determina con un procedimiento descrito en la bibliografía (Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)); encontrándose una actividad de 2,1 UI/g.
Ejemplo 2 Purificación de fosfatidilserina mediante la extracción con i-propanol y agua
Se usan 330 ml de una disolución de tolueno preparada como se describe en el Ejemplo 1. Esta disolución se añade con 240 ml de i-propanol y 150 ml de agua. Se agita todo a temperatura ambiente y se deja asentar, entonces se separan las fases. La fase de tolueno se concentra y su residuo se añade bajo agitación a 500 ml de acetona.
El producto tiene un contenido de L-serina de 0,3%. La D-fosfolipasa se encuentra por debajo del límite de determinación usado en el procedimiento (0,1 UI/g).
Ejemplo 3 Purificación de fosfatidilserina mediante la extracción con i-propanol y agua en diferentes proporciones
Se usan 330 ml de la disolución de tolueno preparada como se describe en el Ejemplo 1. Esta disolución se añade con 150 l de isopropanol y 240 ml de agua. Se agita todo a temperatura ambiente y se deja asentar, entonces se separan las fases. La fase de tolueno se concentra y su residuo se añade bajo agitación a 500 ml de acetona.
El producto tiene un contenido de L-serina de 0,2%. La D-fosfolipasa se encuentra por debajo del límite de determinación usado en el procedimiento (0,1 UI/g).
Ejemplo 4 Purificación de fosfatidilserina mediante la extracción con etanol y agua
Se usan 330 ml de la disolución de tolueno preparada como se describe en el Ejemplo 1. Esta disolución se añade con 150 l de etanol y 150 ml de agua. Se agita todo a temperatura ambiente y se deja asentar, entonces se separan las fases. La fase de tolueno se concentra y su residuo se añade bajo agitación a 500 ml de acetona.
El producto tiene un contenido de L-serina de 0,2%. La D-fosfolipasa se encuentra por debajo del límite de determinación usado en el procedimiento (0,1 UI/g).
Ejemplo 5 Preparación de fosfatidilserina en un sistema de dos fases agua/n-heptano y purificación con i-propanol y agua
40 g de la misma lecitina de soja usada como material de partida en el Ejemplo 1 se introducen en un matraz junto con 300 ml de n-heptano. Se prepara por separado una disolución de 2,3 g de cloruro cálcico; 2,8 g de acetato sódico trihidratado y 6,3 g de L-serina en 0.13 l de una disolución de D-fosfolipasa con una actividad de 3 KU/l. La disolución se lleva a pH=4,2 con ácido acético. Las dos disoluciones son unidas y mantenidas bajo agitación a 25ºC durante 24 horas. Después de la filtración, las fases son separadas; la fase de heptano se añade con 150 ml de i-propanol y 150 ml de agua. Después de la agitación y el asentamiento las dos fases son separadas. La fase de heptano se concentra a baja presión. El producto se filtra y se seca, obteniendo así 26,5 g de una mezcla de fosfolípidos con un contenido en fosfatidilserina del 48%.
El producto tiene un contenido de L-serina de 0,2%. La D-fosfolipasa se encuentra por debajo del límite de determinación del procedimiento (0,1 UI/g).
Ejemplo 6 Preparación de fosfatidilserina mediante trans-fosfatidilación en ausencia de un disolvente orgánico
40 g de una mezcla de fosfolípidos obtenida mediante extracción con alcohol etílico de lecitina de soja, cuyo componente principal es fosfatidilcolina (65%) se introducen en un embudo separador junto con una disolución preparada mediante la disolución de 60 g de cloruro cálcico en 800 ml de agua; la mezcla se mantiene bajo agitación a 25ºC durante una hora. Después de 4 horas un resto de 700 ml de la fase acuosa son descargados a través de la llave inferior. Se prepara por separado una disolución que contiene 64 g de L-serina en 130 ml de tampón acetato 0,1 M a pH=4,5. Esta disolución se añade con 300 mg de D-fosfolipasa en una forma liofilizada con una actividad de 1,0 UI/mg. La disolución resultante se añade a la dispersión acuosa de fosfolípidos previamente preparados. La mezcla se mantiene bajo agitación a 45ºC durante 3 horas. El producto de la reacción se separa mediante filtración; después de ser lavado con agua pesa 60 g.
Se seca una alícuota para determinar serina y D-fosfolipasa. El resultado es que el contenido de serina es de un 7% por peso y la actividad de D-fosfolipasa es de 2 UI/g.
Ejemplo 7 Purificación de fosfatidilserina como se obtiene en el ejemplo 6
Alícuotas de 5 g del producto húmedo obtenido como se describe en el Ejemplo 6 se utilizan para ensayos de purificación mediante la disolución en una mezcla de disolventes que contienen agua, un disolvente hidrocarbonado (disolvente 1) y un disolvente alcohólico (disolvente 2).
En todos los ensayos la fosfatidilserina está presente, después de la agitación y el asentamiento, sólo en la fase hidrocarbonada. La fase hidrocarbonada se concentra y precipita con acetona. Los productos secados son analizados mediante la medida del contenido en serina y la actividad de la D-fosfolipasa. La siguiente Tabla 1 muestra las condiciones de purificación usadas para fosfatidilserina y las cantidades de serina y D-fosfolipasa que están presentes en el producto final.
TABLA 1 Purificación de fosfatidilserina
Ensayo 1 2 3 4 5 6
Disolvente 1 n-heptano n-heptano n-heptano n-heptano n-heptano tolueno
Cantidad de disolvente
1 (ml) 50 50 50 50 50 50
Disolvente 2 metanol i-propanol i-propanol i-propanol i-propanol i-propanol
Cantidad de disolvente
2 (ml) 60 15 15 30 30 50
Cantidad de agua (ml) 25 15 30 15 30 40
Serina en el producto
final (%) 1,0 0,8 0,2 1,3 0,3 0,6
D-fosfolipasa en el
producto final (UI/g) <0,1 <0,1 <0,1 0,1 <0,1 <0,1
Ejemplo 8 Preparación y purificación de dioleoilfosfatidilserina (DOPS)
40 g de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) se introducen en un matraz junto con 0,3 l de tolueno. Se preparan por separado una disolución de 2,3 g de cloruro cálcico; 2,8 g de acetato sódico trihidratado y 6,3 g de L-serina en 0.13 l de una disolución de D-fosfolipasa con una actividad de 3 KU/l. La disolución se lleva a pH=4,2 con ácido acético. Las dos disoluciones son unidas y mantenidas bajo agitación a 25ºC durante 8 horas. Las fases son entonces separadas, la fase superior se añade con 240 ml de i-propanol y 150 ml de agua. El conjunto se agita a temperatura ambiente y se deja asentar, entonces las fases son separadas. La fase de tolueno se concentra y su residuo se añade bajo agitación a 500 ml de acetona. El sólido es filtrado y secado a vacío, obteniendo así 39 g de DOPS como sal de calcio.
El producto tiene un contenido de L-serina del 0,2%. La D-fosfolipasa se encuentra por debajo del límite de determinación usado en el procedimiento (0,1 UI/g).

Claims (17)

1. Procedimiento de purificación de fosfatidilserina que tiene la fórmula (I)
3
en la que R_{1} y R_{2}, pueden ser iguales o diferentes y son un grupo acilo C_{10}-C_{30}, X es un OH o OM, en el que M se escoge del grupo de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y alquil amonio, y en el que la porción de serina está en la forma racémica D, L, y preferiblemente en la forma L, comprendiendo la extracción de dichas fosfatidilserinas a partir de una disolución en un disolvente hidrocarbonado con una mezcla de agua y un disolvente polar orgánico.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho disolvente hidrocarbonado se escoge entre tolueno, xileno, n-heptano, n-hexano o ciclohexano.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho disolvente hidrocarbonado se usa en una cantidad entre 4 y 30 litros/kg de fosfatidilserina a ser purificada.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho disolvente hidrocarbonado se usa en una cantidad entre 6 y 12 litros/kg de fosfatidilserina a ser purificada.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho disolvente polar orgánico es un disolvente alcohólico.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho disolvente alcohólico se escoge entre alcoholes que contienen de 1 a 5 átomos de carbono.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho disolvente alcohólico se escoge entre alcoholes secundarios y terciarios.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho disolvente alcohólico es i-propanol.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho disolvente polar orgánico se usa en una cantidad entre 0,2 y 2 litros/kg de disolvente hidrocarbonado usado.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho disolvente polar orgánico se usa en una cantidad entre 0,3 y 1,2 litros/kg de disolvente hidrocarbonado usado.
11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cantidad de agua usada se encuentra entre 0,2 y 5 litros/kg de disolvente hidrocarbonado usado.
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la cantidad de agua usada se encuentra entre 0,3 y 1 litros/kg de disolvente hidrocarbonado usado.
13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha extracción se lleva a cabo a temperatura entre 0 y 70ºC.
14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha extracción se lleva a cabo a temperatura entre 20 y 30ºC.
15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la fosfatidilserina de fórmula (I) se prepara mediante transfosfatidilación de fosfatidilcolinas de origen natural o sintético.
16. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 15, que comprende la agitación de dicha fosfatidilserina de fórmula (I) en una mezcla que contiene dicho disolvente hidrocarbonado, agua y dicho disolvente polar orgánico.
\newpage
17. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque, después de separar las fases, la fosfatidilserina se aísla mediante precipitación con acetona.
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