ITMI20002631A1

ITMI20002631A1 - Processo di purificazione di fosfatidilserina

Info

Publication number: ITMI20002631A1
Application number: IT2000MI002631A
Authority: IT
Inventors: Ferra Lorenzo De; Pietro Massardo
Original assignee: Chemi Spa
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2000-12-05
Publication date: 2002-06-05
Also published as: US20020103393A1; EP1213294B1; SI1213294T1; ES2203572T5; PT1213294E; DE60100565T3; JP2002193982A; USRE43764E1; EP1213294A1; DE60100565T2; JP4156228B2; ES2203572T3; ATE246692T1; IT1319679B1; DE60100565D1; US6645742B2; EP1213294B2; DK1213294T3

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo :

"Processo di purificazione di fosfatidilserina"

CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda un processo di purificazione di fosfatidilserina, un fosfolipide utile in particolare per la preparazione di composizioni farmaceutiche per il trattamento di sindromi cerebrali involutive di diversa natura, ma anche per la preparazione di particolari formulazioni liposomiali e di composizioni dietetiche a base di lecitine naturali.

STATO DELL’ARTE

La fosfatidilserina è un fosfolipide ampiamente distribuito in natura; è uno dei componenti principali delle membrane cellulari degli organismi animali ed è particolarmente abbondante nei tessuti cerebrali dei mammiferi. Nella letteratura medica sono riportate interessanti proprietà della fosfatidilserina; tra queste la più significativa riguarda l'efficacia nel migliorare le capacità di memoria.

La transfosfatidilazione della fosfatidilcolina con serina in presenza dell'enzima fosfolipasi D secondo lo schema qui di seguito riportato, è la reazione più conveniente per la produzione industriale di fosfatidilserina.

La reazione può essere condotta sia in ambiente acquoso, come descritto nella domanda di brevetto italiano N. MI99A000895, che in un sistema in cui è presente, oltre ad una fase acquosa, anche un solvente organico immiscibile con l’acqua, preferibilmente il toluene ; questa seconda procedura è descritta nel brevetto statunitense N. 5,700,668.

Quale che sia la procedura di transfosfatidilazione impiegata, la fosfatidilserina che si isola al termine del processo è risultata in ogni caso contenere quantità non trascurabili di impurezze idrofiliche, quali la serina, la colina, e i loro sali presenti nella fase acquosa.

Un altro fatto degno di nota è che, sottoponendo il prodotto della reazione alla misura dell’attività enzimatica del tipo fosfolipasi D secondo la metodica descritta in letteratura ( Biotechn . Techn., 7, 795 (1993)), si trova che in ogni grammo di prodotto sono presenti circa 2 unità internazionali di attività enzimatica.

Coerentemente con la generale richiesta di criteri di purezza stringenti, la rimozione di tali impurezze dal prodotto finale riveste notevole importanza.

I metodi comunemente impiegati per la rimozione di sostanze ìdrofiliche da soluzioni organiche di fosfolipidi si sono dimostrati inefficaci. Infatti, estraendo una soluzione toluenica della miscela di fosfolipidi ottenuta come descritto nel brevetto statunitense N. 5,700,668, con un uguale quantitativo di acqua, e separando poi le fasi, si trova che il contenuto di serina nella fase organica e l’attività della fosfolipasi D sono praticamente inalterate rispetto a quelle trovate prima dell’estrazione con acqua.

In modo simile, l’eluizione della medesima soluzione organica su una colonna cromatografica contenente silice per cromatografia, condizionata in toluene, dove l’eluizione del prodotto è completata con toluene, porta ad una rimozione praticamente trascurabile della serina e dell'attività enzimatica dal fosfolipide.

In un altro esperimento, alla soluzione organica di fosfatidilserina da purificare per la presenza di serina è stato aggiunto acetone: è precipitato in questo caso un prodotto che, analizzato, mostrava un rapporto sostanzialmente invariato tra serina e fosfatidilserina rispetto al prodotto di partenza.

Resta pertanto aperto il problema di disporre di un efficace processo di purificazione di fosfatidilserine preparate mediante transfosfatidilazione della fosfatidilcolina con serina in presenza dell'enizima fosfolipasi D e contenenti come impurezze composti idrofilici, proteine e sali inorganici. SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Ora la Richiedente ha sorprendentemente trovato che si possono efficacemente rimuovere le impurezze idrofiliche, le proteine e i sali inorganici da una soluzione di fosfatidilserina in un solvente organico mediante estrazione con acqua, a condizione che si aggiunga al sistema un solvente organico polare.

Rappresenta pertanto oggetto della presente invenzione il processo per la purificazione di fosfatidii seri ne di formula (I)

dove R1 e R2, uguali o diversi tra loro, sono un gruppo acile C10-C30 ; X è OH oppure OM, dove M è scelto nel gruppo costituito da metalli alcalini, metalli alcalino-terrosi, ammonio e alchilammonio,

e dove la porzione serinica è in forma D, L o racemica, e preferibilmente in forma L,

comprendente l’estrazione di dette fosfatidilserine da una soluzione in un solvente idrocarburico con una miscela costituita da acqua ed un solvente organico polare.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Nel caso specifico delle fosfatidilserine preparate secondo quanto descritto nel brevetto statunitense N. 5,700,668 mediante transfosfatidilazione in sistema bifasico costituito da una fase acquosa e una fase toluenica, il processo secondo l'invenzione può essere condotto direttamente sulla fase toluenica dopo averla separata dalla fase acquosa al termine della reazione.

Nel caso di fosfatidilserine preparate seguendo altre metodiche, la purificazione può essere condotta altrettanto vantaggiosamente dibattendo il prodotto in una miscela costituita da un solvente idrocarburico, acqua e un solvente organico polare.

Anche in questo caso il fosfolipide di interesse sarà presente nella fase idrocarburica, mentre le impurezze idrofìliche si ritroveranno nella fase acquosa.

Dopo la separazione delle fasi, l’isolamento della fosfatidilserina si può realizzare seguendo tecniche note come la precipitazione con acetone. Secondo il presente processo come solvente idrocarburico si possono utilizzare solventi aromatici o alìfaticì ; tra ì solventi aromatici è preferito il toluene o lo xilene; tra i solventi alifatici è preferibile usare il n-eptano, il n-esano o il cicloesano.

Come solvente organico polare si possono impiegare solventi alcolici, contenenti ad esempio da 1 a 5 atomi di carbonio. Secondo forme di realizzazione preferite dell’invenzione, il solvente alcolico è scelto tra alcoli secondari e terziari ; più preferibilmente si usa isopropanolo.

L'estrazione secondo l’invenzione può essere condotta a temperature comprese tra 0 e 70°C, e preferibilmente tra 20 e 30°C.

La quantità di solvente idrocarburico è compresa tra 4 e 30 litri per ogni chilogrammo di fosfolipide da purificare, e preferibilmente tra 6 e 12 litri. Il rapporto in volume tra il quantitativo di acqua e quello di solvente idrocarburico è compreso tra 0.2 e 5, e preferibilmente tra 0.3 e 1. Il rapporto in volume tra il quantitativo di solvente organico polare e quello di solvente idrocarburico è invece compreso tra 0.2 e 2, e preferibilmente tra 0.3 e 1.2.

La procedura descritta può essere applicata a fosfatidilserine con differenti catene aciliche e permette di realizzare la purificazione sia di prodotti derivanti dalla transfosfatidilazione di fosfatidilcoline di origine naturale come la soia, il ravizzone o il tuorlo d’uovo, che fosfatidilcoline sintetizzate con acidi grassi, saturi come l’acido miristicò, l'acido paimitico o l'acido stearico, e insaturi come l’acido oleico o l'acido linoleico.

I seguenti esempi sono riportati a scopo illustrativo e non limitativo della presente invenzione.

ESEMPIO 1

Preparazione di fosfatidilserina in sistema bifasico

400 g di una frazione di lecitina di soia non deoleata costituita per il 32% da fosfatidilcolina e per il 50% da trigliceridi è caricata in un pallone insieme a 3 I di toluene. A parte si prepara una soluzione di 22.7 g di calcio cloruro, 27.6 g di sodio acetato triidrato e 62.5 g L-serina in 1.3 I di una soluzione di fosfolipasi D di attività pari a 3 KU/I. La soluzione viene portata a pH = 4.2 con acido acetico. Le due soluzioni vengono unite e mantenute sotto agitazione a 25°C per 8 ore. Dopo filtrazione le fasi vengono separate un decimo della fase toluenica viene concentrato sotto vuoto (la parte restante viene utilizzata per la sperimentazione descritta negli esempi 2, 3, 4, 5); il residuo viene aggiunto a 500 mi acetone a temperatura ambiente. Il prodotto viene filtrato e seccato. Si ottengono 27 g di una miscela di fosfolipidi con tenore di fosfatidilserina del 50%. L'analisi TLC (eluente: miscela costituita da cloroformio, metanolo, acqua, e soluzione acquosa di ammoniaca al 28% 300:100:10:12 ; rivelatore: ninidrina) mostra la presenza del 1.5% di L-serina nel prodotto finale.

La presenza di fosfolipasi D nel prodotto è stata determinata con un metodo di letteratura ( Biotechn . Techn., 7, 795 (1993)); si è trovata una attività di 2.1 Ul/g.

ESEMPIO 2

Purificazione di fosfatidilserina mediante estrazione con i-propanolo e acqua

Si utilizzano 330 mi della soluzione toluenica preparata come descritto nell'Esempio 1. A questi si aggiungono 240 mi di i-propanolo e 150 mi di acqua. Si agita a temperatura ambiente, si lascia decantare e si separano le fasi. La fase toluenica viene concentrata e il residuo aggiunto sotto agitazione a 500 mi di acetone.

Il prodotto ha un contenuto di L-Serina dello 0.3%. La fosfolipasi D è inferiore al limite di determinazione del metodo (0.1 Ul/g).

ESEMPIO 3

Purificazione di fosfatidilserina mediante estrazione con i-propanolo e acqua in diversi rapporti

Si utilizzano 330 mi della soluzione toluenica preparata come descritto nell’Esempio 1. A questi si aggiungono 150 mi di isopropanolo e 240 mi di acqua. Si agita a temperatura ambiente, si lascia decantare e si separano le fasi. La fase toluenica viene concentrata e il residuo aggiunto sotto agitazione a 500 mi di acetone.

Il prodotto ha un contenuto di L-serina dello 0.2%. La fosfolipasi D è inferiore al limite di determinazione del metodo (0.1 Ul/g).

ESEMPIO 4

Purificazione di fosfatidilserina mediante estrazione con etanolo e acqua Si utilizzano 330 mi della soluzione toluenica preparata come descritto nell’Esempio 1. A questi si aggiungono 150 mi di etanolo e 150 mi di acqua. Si agita a temperatura ambiente, si lascia decantare e si separano le fasi. La fase toluenica viene concentrata e il residuo aggiunto sotto agitazione a 500 mi di acetone.

ESEMPIO 5

Preparazione di fosfatidilserina in sistema bifasico acqua/n-eptano e purificazione con i-propanolo e acqua

40 g dello stesso tipo di lecitina di soia impiegata come materia prima nell'Esempio 1 è caricata in un pallone insieme a 300 mi di n-eptano. A parte si prepara una soluzione di 2.3 g di calcio cloruro, 2.8 g di sodio acetato triidrato e 6.3 g L-serina in 0.13 I di una soluzione di fosfolipasi D di attività pari a 3 KU/I. La soluzione viene portata a pH = 4.2 con acido acetico. Le due soluzioni vengono unite e mantenute sotto agitazione a 25°C per 24 ore. Dopo filtrazione le fasi vengono separate; alla fase eptanica vengono aggiunti 150 mi di i-propanolo é 150 mi di acqua. Dopo agitazione e decantazioni le fasi vengono separate. La fase eptanica si concentra a pressione ridotta. Il residuo viene aggiunto a 500 mi di acetone a temperatura ambiente. Il prodotto viene filtrato e seccato. Si ottengono 26.5 g di una miscela di fosfolipidi con tenore di fosfatidilserina del 48%.

I) prodotto ha un contenuto di L-serina dello 0.2%. La fosfolipasi D è inferiore al limite di determinazione del metodo (0.1 Ul/g).

ESEMPIO 6

Preparazione di fosfatidilserina mediante transfosfatidilazione in assenza di solvente organico

40 g di una miscela di fosfolipidi ottenuta per estrazione con alcol etilico della lecitina di soia, il cui principale costituente è la fosfatidilcolina (65%), sono stati caricati in un imbuto separatore insieme ad una soluzione preparata sciogliendo 60 g di cloruro di calcio in 800 mi di acqua; la miscela è stata mantenuta in agitazione a 25°C per un'ora. Dopo 4 ore in quiete 700 mi di fase acquosa sono stati scaricati dal rubinetto di fondo. A parte è stata preparata una soluzione con 64 g di L-serina in 130 mi di tampone acetato 0.1 M a pH 4.5. A questa soluzione sono stati aggiunti 300 mg di fosfoiipasi D in forma liofilizzata di attività di 1.0 Ul/mg. La soluzione risultante è stata aggiunta alla dispersione acquosa di fosfolipidi precedentemente preparata. La miscela è stata mantenuta in agitazione a 45°C per 3 ore. Per filtrazione si separa il prodotto di reazione che, dopo lavaggio con acqua pesa 60 g.

Una aliquota è stata seccata per la determinazione della serina e della fosfoiipasi D. E’ risultato che la serina è pari al 7% in peso e l’attività della fosfoiipasi D di 2 Ul/g.

ESEMPIO 7

Purificazione della fosfatidilserina otenuta nell'Esempio 6

Aliquote da 5 g ciascuna del prodotto umido ottenuto come descritto nell’Esempio 6 sono state usate per prove di purificazione mediante dissoluzione in una miscela di solventi costituita da acqua, un solvente idrocarburico (solvente 1 ) e un solvente alcolico (solvente 2).

In tutte le prove la fosfatidilserina è presente, dopo agitazione e decantazione, unicamente nella fase idrocarburica. La fase idrocarburìca è stata concentrata e precipitata da acetone. I prodotti essiccati sono stati analizzati misurando il tenore di serina e l'attività fosfolipasi D. Nella seguente Tabella 1 sono riportate le condizioni di purificazione della fosfatidilserina utilizzate, e le quantità di serina e fosfolipasi D presenti nel prodotto finale.

ESEMPIO 8

Preparazione e purificazione di dioleoilfosfatidilserina (DOPS)

40 g di dioleoilfosfàtidilcolina (DOPO) vengono caricati in un pallone insieme a 0.3 I di toluene. A parte si prepara una soluzione di 2.3 g di calcio cloruro, 2.8 g di sodio acetato triidrato e 6.3 g L-serina in 0.13 I di una soluzione di fosfolipasi D di attività pari a 3 KU/I. La soluzione viene portata a pH = 4.2 con acido acetico. Le due soluzioni vengono unite e mantenute sotto agitazione a 25°C per 8 ore. Si separano le fasi, alla fase superiore si aggiungono 240 mi di i-propanolo e 150 mi di acqua. Si agita a temperatura ambiente, si lascia decantare e si separano le fasi. La fase toluenica viene concentrata e il residuo aggiunto sotto agitazione a 500 mi acetone. Il solido si filtra e si essicca sotto vuoto ottenendo 39 g DOPS come sale di calcio.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Processo per la purificazione di fosfatidii se ri ne di formula (I)

dove R1 e R2, uguali o diversi tra loro, sono un gruppo acile C10-C30 ; X è OH oppure OM, dove M è scelto nel gruppo costituito da metalli alcalini, metalli alcalino-terrosi, ammonio e alchilammonio, e dove la porzione serinica è in forma D, L o racemica, e preferibilmente in forma L, comprendente l’estrazione di dette fosfatidilserine da una soluzione in un solvente idrocarburico con una miscela costituita da acqua ed un solvente organico polare.
2. Il processo secondo la rivendicazione 1 in cui detto solvente idrocarburico è scelto tra toluene, xilene, n-eptano, n-esano o cicloesano.
3. Il processo secondo la rivendicazione 1, in cui detto solvente idrocarburico è usato in una quantità compresa tra 4 e 30 litri per ogni chilogrammo di fosfatidilserina da purificare.
4. Il processo secondo la rivendicazione 3, in cui detto solvente idrocarburico è usato in quantità compresa tra 6 e 12 litri per ogni chilogrammo di fosfatidilserina da purificare.
5. Il processo secondo la rivendicazione 1, in cui detto solvente organico polare è un solvente alcolico.
6. Il processo secondo la rivendicazione 5, in cui detto solvente alcolico è scelto tra gli alcoli contenenti da 1 a 5 atomi di carbonio.
7. Il processo secondo la rivendicazione 5, in cui detto solvente alcolico è scelto tra gli alcoli secondari e terziari.
8. Il processo secondo la rivendicazione 5, in cui detto solvente alcolico è i-propanolo.
9. Il processo secondo la rivendicazione 1, in cui detto solvente organico polare è usato in quantità compresa tra 0.2 e 2 litri per ogni litro di solvente idrocarburico usato.
10. Il processo secondo la rivendicazione 9, in cui detto solvente organico polare è usato in quantità compresa tra 0.3 e 1.2 litri per ogni litro di solvente idrocarburico usato.
11. Il processo secondo la rivendicazione 1 , in cui la quantità di acqua utilizzata è compresa tra 0.2 e 5 litri per ogni litro di solvente idrocarburico usato.
12. Il processo secondo la rivendicazione 11, in cui la quantità di acqua utilizzata è compresa tra 0.3 e 1 litro, per ogni litro di solvente idrocarburico usato.
13. Il processo secondo la rivendicazione 1, in cui detta estrazione è condotta ad una temperatura compresa tra 0 e 70°C.
14. Il processo secondo la rivendicazione 13, in cui detta estrazione è condotta ad una temperatura compresa tra 20 e 30°C.
15. Il processo secondo la rivendicazione 1 , in cui dette fosfatidilserine di formula (I) sono preparate mediante transfosfatidilazione di fosfatidilcoline dì orìgine naturale o dì sintesi.