ES2204224A1 - Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria. - Google Patents

Plasmido util como control interno de la reaccion en cadena de la polimerasa (pcr) para el diagnostico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la deteccion y/o cuantificacion de dicha bacteria.

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ES2204224A1 ES200100757A ES200100757A ES2204224A1 ES 2204224 A1 ES2204224 A1 ES 2204224A1 ES 200100757 A ES200100757 A ES 200100757A ES 200100757 A ES200100757 A ES 200100757A ES 2204224 A1 ES2204224 A1 ES 2204224A1
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Abstract

Plásmido útil como control interno de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de agrobacterium tumefaciens y su empleo en la detección y/o cuantificación de dicha bacteria. El plásmido comprende una construcción de ADN constituida por un fragmento de secuencia de nucleótidos correspondiente a la región tmr del pTi de A. tumefaciens, y en el interior del cual se encuentra inserto un fragmento de una secuencia de nucleótidos correspondiente a una segunda región. del pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr. El plásmido es útil como control interno de un método para la detección por PCR de A. tumefaciens. De aplicación en el diagnóstico de infecciones causadas por A. tumefaciens.

Description

Plásmido útil como control interno de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de Agrobacterium tumefaciens y su empleo en la detección y/o cuantificación de dicha bacteria.
Campo de la invención
La invención se relaciona, en general, con la detección de patógenos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En particular, la invención se refiere a un plásmido, útil como control interno en un método para la detección por PCR de Agrobacterium tumefaciens, que comprende un fragmento de la región tmr del plásmido Ti (pTi) de A. tumefaciens y en el interior del cual se encuentra inserto un fragmento de una segunda región de dicho pTi distinta a la región tmr.
Antecedentes de la invención
La amplificación enzimática de ADN por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Saiki et al. [1985; Science 230:1350-1354], ha sido modificada por Mullis y Faloona [1987; Meth. Enzymol. 55:335-350] y simplificada para su uso automatizado [K.B. Mullis, patentes norteamericanas US 4.683.195 (1987) y US 4.683.202 (1987)].
La PCR ha sido aplicada en el campo de la biotecnología con múltiples objetivos entre los que se encuentran el diagnóstico de enfermedades y la detección de patógenos en diferentes ambientes. Una de las aplicaciones de la técnica PCR es el diagnóstico de enfermedades de plantas, de tal forma que se está utilizando para la detección de numerosos patógenos tal y como se describe en la revisión realizada por Henson y French [Ann. Rev. Phytop., 1993, 31:81-109]. Sin embargo, en las muestras vegetales suelen aparecer compuestos que afectan a las reacciones de amplificación de ADN, de tal manera que muchas veces es imposible determinar si la falta de obtención de amplificado [producto de amplificación] es consecuencia de la ausencia de una secuencia diana para los cebadores específicos, o de la mala calidad del extracto de ADN obtenido.
La inclusión en las reacciones de amplificación enzimática por PCR de moléculas de ADN que se pueden amplificar con los mismos cebadores que la secuencia diana, ha sido utilizada en diferentes modelos con el fin de controlar las reacciones de amplificación y para cuantificar las cantidades iniciales de la secuencia diana [Talenti et al., 1992, J. Virol. Methods 39:259-268; Ballagi-Pordany y Belak, 1996, Mol. Cell. Probes 9:347-356; Hu et al., 1995, Phytopath. 85:1468-1472. En el caso de Agrobacterium, sin embargo, no se conocen referencias de su aplicación a la detección de Agrobacterium tumefaciens [A. tumefaciens] en plantas usando cebadores de secuencias del ADN-T que es la región del plásmido bacteriano que se integra en la célula vegetal y cuya detección implica la infección de Agrobacterium.
A. tumefaciens es una bacteria gram(-) que causa tumores en numerosas plantas dicotiledóneas. Esta bacteria infecta a la planta a través de una herida o incisión y, debido al plásmido Ti (inductor de tumores) que contiene, puede formar dicho tumor en distintas partes de la planta. El plásmido Ti (pTi) es un plásmido de gran tamaño [150-200 kilobases (kb)], de las cuales 20-23 kb se integran en el genoma del huésped, aparentemente al azar, constituyendo el ADN-T (transferido) que se transfiere al huésped y que lleva los genes necesarios para la síntesis de opinas y los genes que le confieren las propiedades oncogénicas [M. Izquierdo, Ingeniería Genética, Ediciones Pirámide, S.A., 1993, 198-204].
La infección de plantas dicotiledóneas por A. tumefaciens puede ocasionar cuantiosas pérdidas, por lo que la detección rápida y eficaz de dicha bacteria o de las secuencias de ADN-T presentes en las células vegetales transformadas tiene una importancia crítica para establecer el diagnóstico y evitar la propagación de la enfermedad. Además, también sería conveniente disponer de un ensayo sencillo y eficaz adecuado para detectar A. tumefaciens de forma rutinaria, con el fin de garantizar que la salud de las plantas no está comprometida.
Sin embargo, los diferentes métodos existentes para la detección de A. tumefaciens no rinden resultados totalmente satisfactorios. En particular, los métodos basados en la tecnología PCR no permiten eliminar falsos negativos ni discriminar si las muestras ensayadas cumplen las condiciones adecuadas para la amplificación.
Existe, por tanto, la necesidad de disponer de un método para la detección de A. tumefaciens, basado en la tecnología PCR, que supere los inconvenientes señalados.
Compendio de la invención
La solución propuesta por esta invención supera los inconvenientes previamente mencionados y comprende el desarrollo de un método para la detección por PCR de A. tumefaciens que comprende el empleo de un control interno de la PCR constituido por un plásmido que contiene una construcción de ADN con un fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens y un fragmento de una segunda región del pTi, distinta a la región tmr. Para ello, se utilizan los cebadores para amplificar una parte de la secuencia de nucleótidos de la región tmr.
Dicho control interno permite determinar la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa termoestable, semicuantificar la cantidad de bacteria en la muestra inicial y, además, facilita el diagnóstico de la infección causada por A. tumefaciens en una muestra, al permitir discriminar las muestras que carecen de las condiciones adecuadas para la amplificación y que corresponderían a falsos negativos.
El método desarrollado por esta invención garantiza la obtención de, al menos, un producto de amplificación si el extracto de ADN tiene las condiciones adecuadas para la PCR. Para ello, se añade un plásmido que contiene una secuencia amplificable con los mismos cebadores que la secuencia tmr del pTi de A. tumefaciens que se utiliza en el diagnóstico.
Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un plásmido que comprende una construcción de ADN que contiene un fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens y un fragmento de una segunda región del pTi, distinta a la región tmr.
Un objeto adicional de esta invención lo constituye. dicha construcción de ADN.
Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para la detección de A. tumefaciens que comprende el empleo de un control interno de la PCR constituido por dicho plásmido.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el esquema para la construcción del plásmido objeto de esta invención, en concreto el identificado como pGtmrns, adecuado como control interno de la PCR en un método para detectar A. tumefaciens por PCR. Leyendas de la Figura: (a) ligación, (b) transformación, (c) extracción de plásmidos, (d) clones de E. coli con el fragmento tmr, (e) digestión con Hpa I, y (f) clones de E. coli con el fragmento tmr y ns.
La Figura 2 muestra los amplificados obtenidos utilizando los cebadores de la región tmr añadiendo 0,15 pg de pGtmrns en la mezcla de PCR, a partir de tumores de distintas especies de plantas inoculadas: albaricoquero (carril 1), híbrido GF677 (carril 2), híbrido GxN15 (carril 3), híbrido GxN22 (carril 4), melocotonero (carril 5). El carril 6 corresponde al marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Gibco BRL).
La Figura 3 muestra los amplificados obtenidos con los cebadores de la región tmr añadiendo 0,15 pg de pGtmrns a la mezcla de PCR, a partir de tumores de distintas especies de plantas naturalmente infectadas: melocotonero (carriles 2 y 3), viña (carriles 4 y 5) y manzano (carriles 6 y 7) Los carriles 1 y 8 corresponden al marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Gibco BRL).
La Figura 4 muestra los amplificados obtenidos a partir de suspensiones de la cepa C58 de A. tumefaciens en extractos de planta de híbrido melocotonero x almendro GF677 añadiendo 0,15 pg de pGtmrns a cada mezcla de PCR. Los carriles del 2 al 10 correponden a diluciones de la bacteria desde 0 ufc/ml (unidades formadoras de colonias/mililitro) hasta 10^{8} ufc/ml. El carril 1 corresponde al marcador VI de peso molecular de Boehringer Mannheim.
Descripción detallada de la invención
Esta invención proporciona un plásmido, útil como control interno en la detección por PCR de A. tumefaciens, en adelante plásmido de la invención, que comprende una construcción de ADN constituida por un fragmento de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región tmr del pTi de A. tumefaciens, y en el interior del cual se encuentra inserto un fragmento de una secuencia de nucleótidos correspondiente a una segunda región del pTi de A. tumefaciens distinta a dicha región tmr. Dicha segunda región del pTi puede ser cualquier región del pTi, preferentemente, una región del pTi que posea una proporción de nucleótidos con guanina y citosina similar a la de la región tmr que se desea amplificar de A. tumefaciens. En una realización particular de esta invención, dicha segunda región de pTi es un fragmento de la región de virulencia (vir) del pTi de A. tumefaciens.
Dicha construcción de ADN (o ADN recombinante) constituye un objeto adicional de esta invención.
El plásmido de la invención puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
- seleccionar un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens;
- insertar dicho fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens en un plásmido base;
- seleccionar un fragmento de la secuencia de nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta a dicha región tmr; e
- insertar dicho fragmento de la secuencia de nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr dentro del fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens contenido en el plásmido base.
La región tmr del pTi de A. tumefaciens corresponde a la región de la síntesis de citoquininas [Melchers y Hooykaas, 1987, Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, 4:167-220; Sheng y Citovsky, 1996, Plant Cell, 8:1699-1710]. La selección del fragmento de la región tmr a amplificar en la PCR se basa principalmente en criterios de especificidad, es decir, se selecciona una secuencia que esté presente únicamente en el patógeno que se desea detectar [A. tumefaciens], que sea fácilmente amplificable y que el amplicón pueda ser observado en un gel de agarosa [150-700 pares de bases (pb)]. En una realización particular de esta invención, se ha amplificado un fragmento de la región tmr de 172 pb que corresponde a una secuencia seleccionada por criterios de especificidad. Una vez obtenido el primer fragmento y clonado en el plásmido se localiza un enzima de restricción que sea capaz de cortar en un solo sitio del fragmento clonado, que no corte en ningún otro sitio del plásmido y que no corte en ninguna de las secuencias localizadas en los cebadores empleados para la amplificación de la región tmr. El fragmento amplificado con los cebadores FGPtmr530 y FGPtmr701' [Nesme et al., 1989, PCR detection of an original endosymbiont: the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. 4^{th} International Colloquium on Endocytobiology and Symbiosis, Villeurbanne (Francia)] contiene un único sitio de reconocimiento para el enzima de restricción Hpa I [véase el Ejemplo 1].
Como plásmido base puede utilizarse cualquier molécula de ADN lineal o circular covalentemente cerrado que puede, replicarse autónomamente y que pueda portar la construcción, de ADN proporcionada por esta invención. En una realización particular de esta invención, dicho plásmido base es el plásmido pGEM (Promega).
La inserción del fragmento de la secuencia de: nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens en el plásmido base se puede efectuar tras linearizar dicho plásmido base por digestión con un enzima de restricción apropiado.
El fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región del pTi distinta a la región tmr se inserta entre los dos sub-fragmentos de la secuencia de nucleótidos de dicha región tmr contenidos en el plásmido base y resultantes de la digestión con el enzima de restricción cuyo sitio de reconocimiento se encuentra en dicho fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens [véase la Figura 1]. En una realización particular de esta invención, el segundo fragmento clonado en el interior del plásmido en medio de la región tmr, es de un tamaño de 201 pb y corresponde a una zona de la región de virulencia del pTi.
Los plásmidos de la invención así obtenidos pueden ser utilizados para transformar células apropiadas, de las que se puede extraer el plásmido que contiene los fragmentos derivados del pTi de A. tumefaciens por métodos convencionales.
En el Ejemplo 1 se describe la construcción del plásmido pGtmrns, cuyo esquema se muestra en la Figura 1.
El plásmido de la invención puede utilizarse como control interno en la detección por PCR de A. tumefaciens en muestras sospechosas de estar infectadas con dicha bacteria. Por tanto, la invención proporciona un método para la detección por PCR de A. tumefaciens, del tipo que incluye la incorporación de un control interno de la PCR, que comprende añadir el plásmido de la invención como control interno.
De forma más detallada, el método proporcionado por esta invención para la detección por PCR de A. tumefaciens en una muestra sospechosa de contener dicha bacteria, comprende las etapas de:
a) añadir a los tubos de un termociclador la muestra a analizar, el plásmido de la invención (que actúa como control interno de la PCR), los cebadores necesarios para amplificar un fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens, y el resto de reactivos necesarios para realizar la PCR;
b) introducir los tubos en el termociclador; y
c) programar en el termociclador un ciclo térmico adecuado para que tenga lugar la reacción de amplificación enzimática por PCR de un fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens.
El método proporcionado por la presente invención se caracteriza por el empleo del plásmido de la invención como control interno de la PCR y por el empleo de unos cebadores para amplificar un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens. Dicho método puede ser utilizado en la detección y/o cuantificación de A. tumefaciens en todo tipo de muestras, especialmente en muestras de origen vegetal. En una realización particular, la muestra a analizar por el método de esta invención puede ser una muestra vegetal sospechosa de estar infectada con A. tumefaciens, o bien una muestra de un material vegetal que quiere garantizarse que está libre de dicha bacteria. Alternativamente, la muestra a ensayar puede ser una muestra de agua o de suelo.
El plásmido de la invención, que actuará como control interno de la PCR ha sido definido previamente.
Como cebadores directo (5') e inverso (3') se deben usar unos oligonucleótidos apropiados, complementarios a unas secuencias de nucleótidos presentes en la región tmr del plásmido Ti de A. tumefaciens, con una longitud suficiente (de unos 20 nucleótidos aproximadamente) para su hibridación, de forma estable y específica, con dichas secuencias, que permiten a la ADN polimerasa termoestable iniciar la síntesis de la cadena complementaria y amplificar selectivamente un fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens, tales como los descritos por Nesme et al. citado supra. Uno de los cebadores debe ser complementario únicamente a una secuencia de nucleótidos contenida en uno de los sub-fragmentos resultantes tras la digestión enzimática del fragmento de la región tmr del pTi con el enzima de restricción apropiado durante la construcción del plásmido de la invención, y el otro cebador debe ser complementario únicamente a una secuencia de nucleótidos contenida en el otro sub-fragmento de la región tmr. De esta manera se garantiza la obtención de un primer producto de amplificación [correspondiente a la amplificación del fragmento de la región tmr que contiene en su interior el fragmento de la región del pTi distinta a la región tmr presente en el plásmido de la invención comprendida entre dichos cebadores]. En caso de que la muestra ensayada estuviera infectada con A. tumefaciens, se obtendría un segundo producto de amplificación correspondiente a la amplificación del fragmento de la región tmr comprendida entre dichos cebadores, procedente del A. tumefaciens que infecta la muestra ensayada o de las células vegetales transformadas por dicha bacteria. Este segundo producto de amplificación tendría un menor tamaño que el primero puesto que no contiene en su interior el fragmento de la región del pTi distinta a la región tmr presente en el plásmido de la invención (control interno de la PCR). Ambos productos de amplificación pueden ser fácilmente separados por métodos convencionales, por ejemplo, mediante la aplicación de una corriente eléctrica, en un gel de agarosa al 2%. La inclusión del plásmido de la invención como control interno garantiza la presencia de un producto de amplificación siempre que el extracto de ADN tenga la calidad adecuada para que la actividad de la ADN polimerasa termoestable pueda tener lugar.
Los reactivos restantes necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación enzimática por PCR comprenden un tampón para la reacción, una DNA polimerasa termoestable, los desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs), Mg^{2+}+ y agua.
El tampón puede ser cualquiera de los habitualmente utilizados en PCR.
Como ADN polimerasa termoestable puede utilizarse cualquier enzima que catalice la síntesis de una cadena de ADN a partir de un ADN que actúe como molde, a temperatura elevada, por ejemplo, la ADN polimerasa de Thermophilus aquaticus (Taq pol), la ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl pol), la ADN polimerasa de Thermus thermophilus, o la ADN polimerasa de Thermococcus litoralis.
Los dNTPs incluyen desoxiadenosin-trifosfato (dATP), desoxicitosin-trifosfato (dCTP), desoxiguanidin-trifosfato (dGTP) y desoxitimidin-trifosfato (dTTP).
Como fuente de Mg^{2+} puede añadirse cloruro magnésico.
Los reactivos necesarios para la PCR son productos comerciales o, en el caso de los cebadores, son oligonucleótidos con unas secuencias concretas que pueden ser sintetizados mediante técnicas convencionales, y que fueron descritos por Nesme et al. citado supra.
Después de introducir en el termociclador los tubos cargados con la mezcla para la PCR, se programa un ciclo térmico adecuado para que tenga lugar la PCR hasta obtener los productos de la amplificación. Para ello, el termociclador se programa para que realice un ciclo térmico que comprende:
- calentar la mezcla de la PCR a una temperatura y durante un periodo de tiempo adecuado para provocar la desnaturalización del ADN;
- realizar un número variable y repetido de ciclos de PCR a las temperaturas y tiempos de desnaturalización, anillamiento y elongación adecuados; y
- terminar la PCR manteniendo la mezcla de reacción a la temperatura de elongación durante un periodo de tiempo adecuado.
La PCR implica la realización de un número adecuado de ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento, comprendiendo cada ciclo las etapas de:
- desnaturalización térmica del ADN bicatenario, que depende de la temperatura de separación de las cadenas del ADN bicatenario formado;
- anillamiento de los cebadores que flanquean el fragmento de ADN a amplificar, que depende de la temperatura de hibridación de dichos iniciadores al ADN molde; y
- elongación de los cebadores anillados con la ADN polimerasa, que depende de la temperatura de funcionamiento de la ADN polimerasa termoestable.
El número de ciclos a realizar depende del grado de amplificación del fragmento de ácido nucleico que se pretende obtener.
Los productos resultantes de la amplificación se pueden someter a un análisis adecuado, por ejemplo, por técnicas electroforéticas convencionales, para detectar la presencia de A. tumefaciens en la muestra ensayada y, opcionalmente, para cuantificar la cantidad de dicha bacteria presente en la muestra infectada.
La concentración de bacteria inicial se puede cuantificar estableciendo la razón entre las cantidades de cada uno de los dos amplificados, del control interno y de la secuencia diana y comparando esta proporción con la obtenida en una recta de calibración obtenida previamente partiendo de cantidades conocidas de la bacteria.
El método de control de la PCR proporcionado por esta invención ha sido evaluado para detectar A. tumefaciens en tumores de plantas tanto inoculadas experimentalmente como en tumores aparecidos en plantas tras una infección natural con dicha bacteria [véanse los Ejemplos 2-4]. Además, se ha comprobado que la sensibilidad de la técnica no disminuye con la inclusión de esta molécula de control interno, presentando niveles similares de detección a la misma técnica de PCR sin la presencia de dicho control interno.
El método proporcionado por esta invención permite la detección y/o semi-cuantificación de A. tumefaciens en una muestra sospechosa de contener dicha bacteria de forma simple y eficaz, y proporciona una elevada sensibilidad y especificidad.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar formas concretas de realizar el objeto de la presente invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
Ejemplo 1 Construcción de un plásmido que contiene un fragmento de la región tmr del pTi de A. tumefaciens y un fragmento de la región vir de dicho pTi
Para la obtención del control interno se amplifica el fragmento de 172 pb (tmr) de la cepa C58 de A. tumefaciens [depositada por ejemplo en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso ATCC 33970 o en la Colección Francesa de Cultivos Tipo (CFBP) con el número de acceso CFBP 1903], utilizando los cebadores de Nesme et al. (1989) [PCR detection of an original endosymbiont: the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. 4^{th} International Colloquium on Endocytobiology and Symbiosis, Villeurbanne (Francia)]. Una vez purificado este producto de PCR se liga en el plásmido pGEM-T (Promega) dando lugar al plásmido pGtmr [véase la Figura 1], para lo cual se incuba durante toda la noche a 16°C en un volumen de 10 \mul que contiene 1 \mul del tampón de ligación, 50 ng del vector, 3 unidades del enzima DNA-ligasa y 5 \mul del amplificado purificado. Con el producto de la ligación se transforman células de la cepa JM109 de Escherichia coli mediante choque térmico [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (EEUU)].
Las células transformadas se siembran en placas de LB/ampicilina/IPTG/X-Gal (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 1 l de agua, 100 \mug/ml de ampicilina, X-Gal) y se seleccionan las colonias blancas. Estas colonias se cultivaron en LB + ampicilina líquido (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 1 l de agua, 100 \mug/ml de ampicilina) a 37°C durante toda la noche para posteriormente realizar una extracción de plásmidos utilizando para ello un estuche (kit) comercial (Wizard minipreps Plus- Promega). Para asegurar que el plásmido contiene la secuencia del inserto, se realiza, además, una amplificación por PCR de los plásmidos obtenidos utilizando cebadores de la región tmr.
A continuación, se procede a la digestión del pGtmr con el enzima de restricción Hpa I (Boehringer-Mannheim) que corta en un solo sitio del pGtmr dentro del fragmento clonado. Se comprueba que la digestión ha tenido lugar separando los plásmidos en geles de agarosa al 0,8% en tampón TAE 0,5X (2,42 g de Tris base, 0,57 ml de ácido acético glacial, 1 ml de EDTA (ácido etilendiaminatetraacético), pH 8]. Se desfosforilan los plásmidos con fosfatasa alcalina (C.I.P., Promega) añadiendo 2,5 \mu1 de plásmido linearizado y agua mililQ estéril hasta alcanzar un volumen de 25 \mul. Esta mezcla se somete a 3 pasos de 15 minutos a 37°C, 15 minutos a 55°C y 15 minutos a 37°C con 1 \mu1 más de fosfatasa. El pGtmr linearizado y defosforilado se purifica utilizando un protocolo común con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y precipitación en etanol [Sambrook et al., citado supra].
Para obtener el segundo inserto que se quiere subclonar se procede a obtener un amplificado de 201 pb (ns) realizando un nested-PCR. Para ello, en primer lugar, se obtiene un amplificado a partir de la región virC utilizando una pareja de cebadores descrita por Sawada et al. [1995, Applied and Environmental Microbiology 61:828-831]. A partir de ese producto de amplificación y utilizando otra pareja de cebadores se genera el fragmento de 201 pb buscado mediante una reacción de PCR. En esta última amplificación se usa el enzima pfu DNA polimerasa, que deja extremos romos en el producto de amplificación para facilitar el proceso de ligación posterior. Este nuevo fragmento se purifica mediante un protocolo corriente con fenol:cloroformo y se precipita con etanol [Sambrook et al., citado supra]. El amplificado purificado se liga con el pGtmr linearizado y defosforilado a 16°C durante toda la noche siguiendo un protocolo como el descrito anteriormente, dando lugar al plásmido pGtmrns. Con el producto de la ligación se transforman células de la cepa DH5\alpha' de E. coli mediante electroporación en condiciones de 25 \muF, 2,5 Kv y 200 \Omega. Se seleccionan las colonias aparecidas en placas de LB + ampicilina líquido (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 1 l de agua, 100 \mug/ml de ampicilina, 15 g de agar) a partir de las cuales se realizan amplificaciones por PCR con los cebadores de la región del tmr y del ns para la elección de clones con el inserto apropiado. Se selecciona una colonia que contiene el plásmido con los dos insertos y se realiza una extracción de plásmidos utilizando el método antes mencionado. El inserto compuesto por los dos amplificados (tmr-ns) se secuencia utilizando el estuche comercial kit T7-Sequencing® (Pharmacia-Biotech), siguiendo las instrucciones del fabricante, para determinar su tamaño y con el fin de comprobar que la secuencia obtenida corresponde exactamente a la de los dos fragmentos insertados.
Ejemplo 2 Detección por PCR de A. tumefaciens en tumores de plantas inoculadas con dicha bacteria
Se realizó este Ejemplo para comprobar la eficacia del método de la invención en la detección por PCR de A. tumefaciens en muestras procedentes de tumores aparecidos en plantas inoculadas experientalmente con la cepa 325-4 de A. tumefaciens [esta cepa pertenece a la colección del IVIA, y originalmente se aisló de un tumor aparecido en un melocotonero, que corresponde al biovar 1 de Agrobacterium y contiene un plásmido Ti de tipo nopalina] de las siguientes especies: híbridos melocotoneros x almendro GF677, GxN15 y GxN22, melocotonero y albaricoquero.
Para ello, en primer lugar se procede a extraer el ADN de la muestra vegetal mediante un protocolo de extracción que comprende:
a)
extraer el ADN de la muestra mediante agitación en un tampón de extracción [TrisClNa 200 mM, NaCl 250 mM, EDTA (dietilendiamina del ácido tetraacético) 25 mM, 0,5% de SDS (dodecilsulfato sódico) y 2% de PVP (polivinilpirrolidona)];
b)
centrifugar a 2.000 rpm y recuperar el sobrenadante;
c)
calentar el sobrenadante a 93°C;
d)
centrifugar a 13.000 rpm y recuperar el sobrenadante;
e)
mezclar el sobrenadante con isopropanol (volumen a volumen);
f)
precipitar el ADN; y
g)
resuspender el ADN en agua.
A continuación, se añaden 5 \mul del extracto de ADN a un cóctel de PCR compuesto por:
Tampón 10X [KCl 500 mM, Tris-ClH 200 mM, pH 8,4]: 5 \mul (microlitros) x n muestras
MgCl_{2} 50 mM: 3 \mul x n muestras
FGPtmr530 10 \muM: 0,5 \mul x n muestras
FGPtmr701' 10 \muM: 0,5 \mul x n muestras
dNTPs (20 mM cada uno): 1 \mul x n muestras
Formamida: 0,5 \mul x n muestras
Taq polimerasa: 0,4 \mul x n muestras
pGtmrns (control interno): 0,1 \mul x n muestras
Agua: 34 \mul x n muestras
La amplificación se lleva a cabo en un termociclador mediante 40 ciclos cada uno de ellos de etapas de 1 minuto a 93°C, 1 minuto a 60°C y 2 minutos a 72°C. Estos ciclos van precedidos de una etapa de desnaturalización del ADN a 93°C y seguidos de una etapa de elongación de 72°C durante 10 minutos.
Los productos de la amplificación se separan en geles de agarosa al 2% en tampón TAE y se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2 donde se observan los productos de amplificación obtenidos utilizando los cebadores de la región tmr y añadiendo 0,15 pg de pGtmrns (control interno) a la mezcla de PCR, a partir de tumores de distintas especies de plantas inoculadas: albaricoquero (carril 1), híbrido GF677 (carril 2), híbrido GxN15 (carril 3), híbrido GxN22 (carril 4), melocotonero (carril 5). El carril 6 corresponde al marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Gibco BRL) Como puede apreciarse, se detecta un fragmento de 373 pb que corresponde al control interno.
Este ensayo puso también de manifiesto que la sensibilidad de la técnica no disminuye con la inclusión del control interno presentando niveles similares de detección a la misma técnica de PCR sin la presencia del plásmido pGtmrns.
Ejemplo 3 Detección por PCR de A. tumefaciens en tumores de plantas naturalmente infectadas con dicha bacteria
Se realizó este Ejemplo para comprobar la eficacia del método de la invención en la detección por PCR de A. tumefaciens en muestras procedentes de tumores aparecidos en plantas de manzano, vid y melocotonero naturalmente infectadas con A. tumefaciens.
La extracción del ADN de la muestra vegetal se efectúa siguiendo el protocolo de extracción mencionado en el Ejemplo 2. Asimismo, el cóctel de la PCR, las condiciones de realización de la PCR, y la separación y visualización de los productos de amplificación, son las mismas que las mencionadas en el Ejemplo 2.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3 donde se observan los productos de amplificación obtenidos utilizando los cebadores de la región tmr y añadiendo 0,15 pg de pGtmrns (control interno) a la mezcla de PCR, a partir de tumores de distintas especies de plantas naturalmente infectadas con A. tumefaciens, concretamente, melocotonero (carriles 2 y 3), viña (carriles 4 y 5) y manzano (carriles 6 y 7). Los carriles 1 y 8 corresponden al marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (Gibco BRL). Se observan unas bandas a 373 pb debidas a la amplificación del fragmento de la región de tmr del control interno (pGtmrns) y otras a 172 pb debidas a amplificación del fragmento de la región de tmr del pTi de A. tumefaciens que había infectado a las muestras ensayadas.
Ejemplo 4 Cuantificación de A. tumefaciens en tumores de plantas infectadas con dicha bacteria
Se realizó este Ejemplo para comprobar la eficacia del método de la invención en la cuantificación de A. tumefaciens en muestras procedentes de tumores aparecidos en híbridos melocotonero x almendro GF677 inoculados experimentalmente con concentraciones diferentes de la cepa C58 [ATCC 33970, CFBP 1903] de A. tumefaciens [0-10^{8} ufc/ml].
La extracción del ADN, la realización de la PCR, la separación y visualización de los productos de amplificación se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 2.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4 donde se pueden observar los productos de la amplificación obtenidos a partir de suspensiones de la cepa C58 de A. tumefaciens en extractos de planta de híbrido melocotonero x almendro GF677 añadiendo 0,15 pg de pGtmrns a cada reacción de PCR. Los carriles del 2 al 10 corresponden a diluciones de la bacteria desde 0 ufc/ml hasta 10^{8} ufc/ml. El carril 1 corresponde al marcador VI de peso molecular de Boehringer Mannheim. Se observan unas bandas a 373 pb debidas a la amplificación del fragmento de la región de tmr del control interno (pGtmrns) y otras a 172 pb debidas a la amplificación del fragmento de la región de tmr del pTi de A. tumefaciens que había infectado experimentalmente a las muestras ensayadas.
Depósito de microorganismos
Un cultivo de células de E. coli transformadas con el plásmido pGtmrns, identificado como E. coli pGtmrns, ha sido depositado el 16 de diciembre de 1998 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Burjassot, Valencia, con el número de acceso CECT 5107.

Claims (7)

1. Un plásmido que comprende una construcción de ADN constituida por un fragmento de la secuencia de nucleótidos correspondiente a la región tmr del plásmido Ti (pTi) de Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens), y en el interior del cual se encuentra inserto un fragmento de una secuencia de nucleótidos correspondiente a una segunda región del pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr.
2. Plásmido según la reivindicación 1, en el que dicha segunda región del pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr es un fragmento de la región de virulencia (vir) del pTi de A. tumefaciens.
3. Plásmido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende las características del plásmido identificado como pGtmrns, depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con el número de acceso CECT 5107.
4. Un procedimiento para la obtención de un plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende las etapas de:
- seleccionar un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens;
- insertar dicho fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens en un plásmido base;
- seleccionar un fragmento de la secuencia de nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta a dicha región tmr; e
- insertar dicho fragmento de la secuencia de nucleótidos de una región del pTi de A. tumefaciens distinta a la región tmr, dentro del fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens contenido en el plásmido base.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho fragmento de la secuencia de nucleótidos de la región tmr del pTi de A. tumefaciens comprende un único sitio de reconocimiento para un enzima de restricción dado.
6. Un método para la detección por PCR de A. tumefaciens, del tipo que incluye la incorporación de un control interno de la PCR, que comprende añadir un plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un plásmido obtenible por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, como control interno.
7. Un método para la detección y cuantificación por PCR de A. tumefaciens, del tipo que incluye la incorporación de un control interno de la PCR, que comprende añadir un plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un plásmido obtenible por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, como control interno, separar y visualizar los productos de amplificación y comparar la intensidad de los productos de amplificación de la muestra con la intensidad de una curva de calibración obtenida previamente partiendo de cantidades conocidas de A. tumefaciens.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2026008983A1 (en) * 2024-07-02 2026-01-08 University Court Of The University Of St Andrews Control bacteria for molecular bacterial load assay

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010094A1 (en) * 1996-09-05 1998-03-12 Claudio Orlando Plasmids containing two or more competitors in sequence and their application in competitive-pcr techniques
EP0864657A1 (fr) * 1997-03-14 1998-09-16 Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires CNEVA Oligonucléotides dérivés des gènes vts de bactéries E. coli productrices de vérotoxines et leurs utilisations

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998010094A1 (en) * 1996-09-05 1998-03-12 Claudio Orlando Plasmids containing two or more competitors in sequence and their application in competitive-pcr techniques
EP0864657A1 (fr) * 1997-03-14 1998-09-16 Centre National d'Etudes Vétérinaires et Alimentaires CNEVA Oligonucléotides dérivés des gènes vts de bactéries E. coli productrices de vérotoxines et leurs utilisations

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUBERO, J.; MARTINEZ, M.C.; LLOP, P.; LOPEZ, M.M. A simple and efficient PCR method for the detection of Agrobacterium tumefaciens in plant tumours. Journal of Applied Microbiology. Abril 1999, Vol. 86, Nº 4, paginas 591-602. ISSN 1364-5072. *
CUBERO, J.; MARTÍNEZ, M.C.; LLOP, P.; LÓPEZ, M.M. A simple and efficient PCR method for the detection of Agrobacterium tumefaciens in plant tumours. Journal of Applied Microbiology. Abril 1999, Vol. 86, Nº 4, páginas 591-602. ISSN 1364-5072. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2026008983A1 (en) * 2024-07-02 2026-01-08 University Court Of The University Of St Andrews Control bacteria for molecular bacterial load assay

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