ES2204262B1 - Moduladores de los receptores a 3 de adenosina. - Google Patents

Moduladores de los receptores a 3 de adenosina.

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Abstract

Moduladores de los receptores A_{3} de adenosina.
Los compuestos de las fórmulas descritas donde R, R^1, R^{2}, R^{3} y A tienen los significados que se dan en la descripción, están provistos de actividad agonista selectiva con el receptor de adenosina A_{3}. Estos compuestos pueden usarse en una composición farmacéutica para tratar desórdenes causados por una activación excesiva del receptor A, o pueden usarse en una aplicación diagnóstica para determinar el enlace relativo de otros compuestos al receptor A_{3}. Los compuestos pueden ser etiquetados, por ejemplo, con etiquetas fluorescentes o radio-etiquetas, y las etiquetas se usan in vivo o in vitro para determinar la presencia de células tumorales que poseen una concentración elevada de receptores adenosina A_{3}.

Description

Moduladores de los receptores A_{3} de adenosina.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a determinados derivados de pirazol-triazol-pirimidina, triazol-triazol-pirimidina e imidazol-triazol-pirimidina y su utilización en la práctica de la medicina como moduladores de los receptores A_{3} de adenosina.
Antecedentes de la invención
Farmacológicamente se han caracterizado tres tipos principales de receptores de adenosina, clasificados como A_{1}, A_{2} y A_{3}. Los receptores A_{1} se acoplan a las proteínas G_{1} que inhiben adenilato ciclasa y también se ha demostrado que se acoplan a otros sistemas de secundarios de mensajeros, incluyendo la inhibición o estimulación del recambio de fosfoinositol y la activación de canales de iones. Los receptores A_{2} están a su vez divididos en dos subtipos, A_{2A} y A_{2B} en los que los agonistas de adenosina activan adenilato ciclasa con una afinidad alta y baja respectivamente. La secuencia de los receptores A_{3} se identificó por primera vez en ensayos realizados en una genoteca de cDNA de testículos de ratas y dicha secuencia, clonada posteriormente por homología con otros receptores acoplados a la proteína G de una genoteca de cDNA de cerebro de rata, demostró corresponderse a un novedoso receptor funcional de adenosina.
El descubrimiento del receptor A_{3} abre nuevas perspectivas terapéuticas en el sector de las purinas. Particularmente, el receptor A_{3} participa en procesos de inflamación, hipotensión y degranulación mastocitaria. Aparentemente, este receptor juega un papel en el sistema nervioso central. El agonista selectivo del receptor A_{3} IB-MECA induce la depresión funcional y, en caso de administración crónica, protege contra la isquemia cerebral. Se ha descubierto que los agonistas selectivos del A_{3} a altas concentraciones podrían inducir apoptosis en las células HL-60 de la leucemia humana. Estos y otros descubrimientos han convertido al receptor A_{3} en un objetivo terapéutico prometedor. El interés en los antagonistas selectivos del receptor A_{3} yace en su potencial antiinflamatorio o como agentes antiisquémicos en el cerebro. Recientemente, los antagonistas A_{3} han estado sometidos a desarrollos como fármacos antiasmáticos, antidepresivos, antiarrítmicos, protectores renales, antiparkinson y para la mejora cognitiva.
Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar compuestos y procedimientos de preparación y uso, que sean agonistas, agonistas parciales, o antagonistas del receptor A_{3} de la adenosina.
En la presente invención se presentan los compuestos útiles como moduladores potentes y selectivos del receptor A_{3} de adenosina, con actividad como antagonistas de este receptor, así como los procedimientos para su preparación y uso.
Los compuestos tienen la siguiente fórmula general:
1
o
2
donde:
A es imidazol, pirazol o triazol;
R es -C(X)R_{1}, -C(X)-N(R_{1})_{2}, -C(X)OR_{1}, -C(X)SR_{1}, -SO_{n}R_{1}, -SO_{n}OR_{1}, -SO_{n}SR_{1} o –SO_{n}-N(R_{1})_{2};
R_{1} es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, heteroarilo, heterocíclico, alquenilo inferior, alcanoilo inferior o, si se enlaza con un átomo de nitrógeno, forma entonces con este átomo de nitrógeno un anillo de azetidina o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos como N, O, S;
R_{2} es hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo o arilo sustituido;
R_{3} es furano, pirrol, tiofeno, benzofurano, bencipirrol, benzotiofeno, sustituidos opcionalmente con uno o más sustituyentes como los aquí presentados para obtener anillos de heteroaril sustituido;
X es 0, S o NR^{1};
n es 1 o 2;
sus análogos radiomarcados o marcados con fluorescente, y
sus sales farmacéuticamente aceptables.
Preferiblemente R^{1} será hidrógeno; alquilo de C1 a C8; alquenilo de C2 a C7, alquinilo de C2 a C7, cicloalquilo de C3 a C7, alquilo sustituido de Cl a C5 con uno o más átomos de halógeno, grupos hidroxi, alcoxi de C1 a C4, cicloalquilo de C3 a C7 o grupos de fórmula –NR^{1}_{2}, -C(O)NR^{1}_{2}, arilo, aril sustituido en el cual la sustitución se selecciona del grupo formado por alcoxi de C1 a C4, alquilo de C1 a C4, nitro, amino, ciano, haloalquilo de C1 a C4, haloalcoxi de C1 a C4, carboxi, carboxiamida; aralquilo de C7 a C10 en la que la porción de arilo puede sustituirse con uno o más de los sustituyentes indicados anteriormente para el grupo arilo; un grupo de fórmula -(CH_{2})m-Het, donde Het es un anillo heterocíclico aromático o no aromático de 5-6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo formado por N, O y S y m es un entero de 1 a 5.
Los grupos alquilo de C1 a C8 preferidos son metilo, etilo, propilo, butilo e isopentilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo de C3 a C7 incluyen ciclopropilo, ciclopentilo y ciclohexilo. Ejemplos de grupos alquilo de C1 a C5 sustituidos con grupos cicloalquilo de C3 a C7 incluyen cicloheximetilo, ciclopentilmetilo y 2-ciclopentiletil. Ejemplos de grupos alquilo de C1 a C5 sustituidos incluyen 2-hidroxietilo, 2-metoxietilo, trifluorometilo, 2-fluoroetilo, 2-cloroetilo, 3-aminopropilo, 2-(4-metil-1-piperacina)etil, 2-(4-morfolinil)etil, 2-aminocarboniletil, 2-dimetilaminoetilo, 3-dimetilaminopropilo. El arilo será preferiblemente fenilo, sustituido opcionalmente con grupos Cl, F, metoxi, nitro, ciano, metilo, trifluorometilo, difluorometoxi. Ejemplos de grupos heterocíclicos con anillo de 5 a 6 miembros que contengan N, O ó S incluyen piperazinilo, morfolinilo, tiazolilo, pirazolilo, piridilo, furilo, tienilo, pirrolilo, triazolilo, tetrazolilo. Ejemplos de grupos aralquilo de C7 a C10 comprenden bencilo o fenetilo sustituidos opcionalmente por uno o más de los sustituyentes seleccionados de C1, F, metoxi, nitro, ciano, metilo, trifluorometilo y difluorometoxi. Preferiblemente, R1 será hidrógeno, alquilo de C1 a C8, arilo o aralquilo de C7 a C10, sustituidos opcional y preferiblemente con átomos halógenos. Preferiblemente X será O, R2 será alquilo C2-C3 o alquilo sustituido y R3 será furano.
Los compuestos especialmente preferidos son aquéllos en los que R es un grupo fenetilo en el que el anillo de fenilo se ha sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo formado por cloruro, átomos de fluoruro, grupos metoxi, nitro, ciano, metilo, trifluorometilo y difluorometilo.
Los posibles significados de A pueden representarse mediante las siguientes fórmulas estructurales:
3
Los compuestos pueden utilizarse en un método para modular los receptores A_{3} de adenosina en mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los procedimientos suponen administrar una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I suficiente para moderar los receptores A_{3} de la adenosina en los mamíferos. Los usos de los compuestos incluyen:
\bullet
tratamiento de la hipertensión;
\bullet
tratamiento de afecciones inflamatorias como la artritis reumatoide y la soriasis;
\bullet
tratamiento de afecciones alérgicas como la fiebre del heno y la rinitis alérgica;
\bullet
degranulación mastocitaria;
\bullet
agentes antitumorales;
\bullet
tratamiento de la hipoxia cardiaca y
\bullet
protección contra la isquemia cerebral;
\bullet
usos diagnósticos, por ejemplo, para determinar la presencia de una o más de las afecciones médicas anteriormente descritas, o en un examen de detección para determinar la efectividad que tienen otros compuestos para unirse al receptor A_{3} Ado (por ejemplo, mediante inhibición competitiva según determinen diferentes ensayos de unión), según se describe en Jacobson y Van Rhee, Purinergic approaches to experimental therapy, Jacobson and Javis, ed. Wiley, Nueva York, 1997, págs. 101-128; Mathot et al., Brit. J. Pharmacol., 116:1957-1964 (1995); van der Wenden et al., J. Med. Chem., 38:4000-4006 (1995); y van Calenberg, J. Med Chem., 40:3765-3772 (1997), el contenido de los cuales se incorpora aquí como referencia.
Los compuestos también pueden utilizarse en un método para inhibir total o parcialmente la adenilatociclasa (A_{3}) en un mamífero, incluyendo los seres humanos. Los procedimientos suponen administrar una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula 1 suficiente para inhibir total o parcialmente la adenilatociclasa en mamíferos. Los compuestos también puede marcarse y utilizarse para detectar la presencia de células tumorales que contengan ligandos del receptor A_{3} de adenosina en un paciente o en una muestra celular, poniendo en contacto las células con el compuesto marcado, permitiendo que el compuesto se una los receptores A_{3} y detecte la presencia del marcado.
Los compuestos pueden utilizarse en una formulación farmacéutica que incluya un compuesto de fórmula I y uno o más excipientes. Se pueden utilizar diversos intermedios químicos para preparar los compuestos.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un gráfico que muestra la saturación de la unión de [^{125}I]AB-MECA (fmol/mg de proteína) a los receptores A_{3} humanos, expresados en células HEK 293, frente la concentración molar de [^{125}I]AB-MECA.
La figura 2 es un gráfico que muestra la saturación de la unión de [^{125}I]AB-MECA (fmol/mg de proteína) a los receptores A_{3} humanos, expresados en la línea de células JURKAT, frente a la concentración molar de [^{125}I]AB-MECA. Como muestra la figura, la densidad detectada del receptor A_{3} fue aproximadamente de 300 fmol/mg de proteína en las membranas de células Jurkat al utilizar [^{125}I]AB-MECA.
Las figuras 3 y 4 son gráficos que muestran la saturación de la unión de un análogo tritiado de un compuesto 47 -5-[[4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8 -propil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (compuesto 102) (fmol/mg de proteína) a los receptores A_{3} expresados en la línea de células JURKAT frente a la concentración molar del compuesto 102. Los datos de estas figuras muestran la presencia de receptores A_{3} de adenosina de altas densidades en células tumorales humanas. Por ejemplo, se detectó aproximadamente 1300 fmol/mg de proteína en células Jurkat y 650 fmol/mg de proteína en células HL60. Por lo tanto, el compuesto 102 es una herramienta mucho más sensible que [^{125}I]AB-MECA a la hora de detectar receptores A_{3} de adenosina. Estos descubrimientos han facilitado la determinación de la presencia de receptores A_{3} en muchos tumores humanos.
Descripción detallada de la invención
La presente solicitud describe componentes que resultan útiles como moduladores potentes y selectivos de receptores de adenosina, con actividad como agonistas A_{3} y, en algunos casos, como antagonistas A_{3}, así como procedimientos para su preparación y uso.
Los compuestos pueden utilizarse en un método para modular los receptores A_{3} de adenosina en mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los procedimientos suponen administrar una cantidad efectiva de compuesto de fórmula I suficiente para moderar los receptores A_{3} de adenosina del mamífero.
Los compuestos pueden utilizarse en una formulación farmacéutica que incluya un compuesto de fórmula I y uno o más excipientes. Se pueden utilizar varios intermedios químicos para preparar los compuestos.
Definiciones
Según se utiliza aquí, un compuesto es un agonista de un receptor A_{1} de adenosina si puede inhibir totalmente la adenilatociclasa (A_{3}) y desplazar a [^{125}I] -AB-MECA en un estudio por unión competitiva.
Según se utiliza aquí, un compuesto es un agonista parcial de un receptor A_{3} de adenosina si puede inhibir parcialmente la adenilatociclasa (A_{3}) y desplazar a [^{125}1] -AB-MECA en un estudio por unión competitiva.
Según se utiliza aquí, un compuesto es un antagonista de un receptor A_{3} de adenosina si puede evitar la inhibición producida por un agonista y desplazar a [^{125}I]-AB-MECA en un estudio por unión competitiva.
Según se utiliza aquí, un compuesto es selectivo para el receptor A_{3} si la relación de actividad A_{1}/A_{3} y A_{2}/A_{3} es mayor de 50, preferiblemente entre 50 y 100 y más preferiblemente, mayor de 100.
Según se utiliza aquí, el concepto "alquilo" hace referencia a grupos alquilo monovalentes lineales, ramificados o cíclicos con entre 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 1 y 10 átomos de carbono ("alquilo inferior") y más preferiblemente entre 1 y 6 átomos de carbono. Este concepto se ejemplifica por grupos como metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, -butilo, iso-butilo, n-hexilo, entre otros. Las palabras "alquileno" y "alquileno inferior" hacen referencia a radicales divalentes del alcano correspondiente. Además, según se utiliza aquí, otras porciones cuyos nombres derivan de alcanos como alcoxilo, alcanoilo, alquenilo, cicloalquenilo, etc., al ser modificadas por "inferiores" presentan cadenas de carbono de diez o menos átomos de carbono. En los casos en los que el número mínimo de carbonos es mayor que uno, por ej. alquenilo (mínimo de dos carbonos) y cicloalquilo (mínimo de tres carbonos), se entiende que "inferior" significa el número mínimo de carbonos.
Según se utiliza aquí, la palabra "alquilo sustituido" hace referencia a un grupo alquilo, preferiblemente con 1 a 10 átomos de carbono (alquilo inferior sustituido), que tiene de 1 a 5 sustituyentes, preferiblemente de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados del grupo formado por alcoxi, alcoxi sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, acilo, acilamino, ciano, aciloxi, amino, amino sustituido, aminoacilo, aminoaciloxi, oxiacilamino, ciano, halógeno, hidroxil, ceto, tioceto, carboxil, carboxialquilo, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, arilo, ariloxi, heteroarilo, heteroariloxi, heterocíclico, hidroxiamino, alcoxiamino, nitro, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO_{2}-alquilo, -SO_{2}-alquilo sustituido, -SO_{2}-arilo, -SO_{2}-heteroarilo, y mono- y di-alquilamino, mono- y di(alquilo sustituido)amino, mono y di -arilamino, mono y di -heteroarilamino, mono y di-aminoheterocíclico y aminas asimétricas disustituidas con diferentes sustituyentes seleccionados de alquilo, arilo, heteroarilo y heterocíclico. Según se utiliza aquí, otras porciones con el prefijo "sustituido" incluyen uno o más de los sustituyentes enumerados anteriormente.
Según se utiliza aquí, "alcarilo" hace referencia a un grupo alquilo con un sustituyente arilo. La unión se realiza a través del grupo alquilo. "Aralquilo" hace referencia a un grupo arilo con un sustituyente alquilo, en la que la unión se realiza a través del grupo arilo.
Según se utiliza aquí, la palabra "alcoxi" hace referencia al grupo "alquil-O-", donde alquil significa lo que se ha definido anteriormente. Los grupos alcoxi preferidos incluyen, a modo de ejemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi, n-butoxi, tert-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n-hexoxi, 1,2-dimetilbutoxi, entre otros.
Según se utiliza aquí, la palabra "alquenilo" hace referencia a grupos alquenilo que tienen preferiblemente entre 2 y 10 átomos de carbono y más preferiblemente entre 2 y 6 átomos de carbono y que tiene como mínimo 1 y preferiblemente entre 1-2 centros de insaturación de alquenilo. Los grupos alquenilo preferidos incluyen etenilo (-CH=CH_{2}), n-propenilo (-CH_{2}CH=CH_{2}). iso-propenilo (-C(CH_{3})=CH_{2}), entre otros.
Según se utiliza aquí, la palabra "alquinilo" hace referencia a grupos alquinilo que tienen preferiblemente entre 2 a 10 átomos de carbono y más preferiblemente entre 2 y 6 carbonos y que tienen como mínimo 1 y preferiblemente entre 1-2 centros de insaturación de alquinilo.
Según se utiliza aquí, la palabra "acilo" hace referencia a los grupos alquilo-C(O)-, alquilo sustituido-C(O)-, cicloalquilo-C(O)-, cicloalquilo sustituido -C(O)-, arilo-C(O)-, heteroarilo-C(O)- y heterocíclico-C(O)- donde alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, arilo, heteroarilo y heterocíclico se definen en este documento.
Según se utiliza aquí, la palabra "acilamino" hace referencia al grupo -C(O)NRR donde cada R es independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo, o heterocíclico, donde alquilo, alquilo sustituido, arilo, heteroarilo, o heterocíclico significan lo definido anteriormente en este documento.
Según se utiliza aquí, la palabra "arilo" hace referencia a un grupo carbocíclico aromático insaturado de 6 a 14 átomos de carbono con un anillo simple (por ejemplo, fenilo) o anillos múltiples condensados (fusionados) (por ej., naftilo o antrilo). Los arilos preferidos incluyen fenilo, naftilo, entre otros. A menos que quede limitado por la definición del sustituyente de arilo, dichos grupos arilo pueden sustituirse opcionalmente con entre 1 a 5 sustituyentes y preferiblemente entre 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo formado por hidroxi, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, aciloxi, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxilalquilo, ciano, halo, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterocíclico, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO_{2}-arilo, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO_{2}-alquilo, -SO_{2}-alquilo sustituido, -SO2-arilo, -SO_{2}-heteroarilo, trihalometilo. Los sustituyentes preferidos incluyen alquilo, alcoxi, halo, ciano, nitro, trihalometilo y tioalcoxi.
Según se utiliza aquí, la palabra "cicloalquilo" hace referencia a grupos alquilo cíclicos de entre 3 a 12 átomos de carbono que tienen un anillo cíclico único o múltiples anillos condensados. Dichos grupos cicloalquilo incluyen, a modo de ejemplo estructuras de un anillo como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo, entre otros, o estructuras de anillos múltiples como adamantilo, entre otros.
Según se utilizan aquí, las palabras "halo" o "halógeno" hacen referencia a fluoro, cloro, bromo y yodo, siendo preferiblemente fluoro o cloro.
Según se utiliza aquí, la palabra "heteroarilo" hace referencia a un grupo carbocíclico aromático con entre 1 a 15 átomos de carbono y entre 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo formado por oxígeno, nitrógeno y sulfuro en como mínimo un anillo (si hay más de un anillo).
A menos que la definición del sustituyente de heteroarilo lo limite de otro modo, dichos grupos heteroarilo pueden sustituirse opcionalmente con entre 1 a 5 sustituyentes y preferiblemente entre 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo formado por hidroxi, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, amino, aminoacilo, aciloxi, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxialquilo, ciano, halo, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterocíclico, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO-heteroarilo, -SO_{2}-alquilo, -SO_{2}-alquilo sustituido, -SO_{2}-arilo, -SO_{2}-heteroarilo y trihalometilo. Los sustituyentes preferidos incluyen alquilo, alcoxi, halo, ciano, nitro, trihalometilo y tioalcoxi. Dichos grupos heteroarilo pueden tener un solo anillo (por ej. piridilo o furilo) o bien múltiples anillos condensados (por ej., indolizinilo o benzotienilo).
"Heterociclo" o "heterocíclico" hacen referencia a un grupo monovalente saturado o insaturado con un solo anillo o anillos múltiples condensados, con entre 1 a 15 átomos de carbono y entre 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo formado por nitrógeno, sulfuro y oxígeno en el anillo.
A menos que la definición del sustituyente heterocíclico lo limite de otro modo, dichos grupos heterocíclicos pueden sustituirse de modo opcional con 1 a 5 sustituyentes seleccionados del grupo formado por alquilo, alquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, arilo, ariloxi, halo, nitro, heteroarilo, tiol, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, trihalometilo, entre otros. Dichos grupos heterocíclicos pueden tener un solo anillo o múltiples anillos condensados.
En cuanto a cualquiera de los grupos mencionados que contengan 1 o más sustituyentes, se entiende, por supuesto, que dichos grupos no contienen ninguna sustitución o patrones de sustitución estéricamente impedidos y/o sintéticamente no factible.
Según se utilizan aquí, "derivados de ácidos carboxílicos" y "derivados de ácido sulfónico" hacen referencia a -C(X)R_{1}, -C(X)-N(R_{1})_{2}, -C(X)OR_{1}, -C(X)SR_{1}, - SO_{n},R_{1}, -SO_{n},OR_{1}, -SO_{n},SR_{1} o –SO_{n}-N(R_{1})_{2}, donde X es O, S o NR^{1}, donde R^{1} es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido o arilo y sus derivados activados, como anhídridos, ésteres y haluros como cloruros, bromuros y yoduros, que pueden utilizarse para acoplar los derivados del ácido carboxílico y del ácido sulfónico a la 5'-amina mediante química de acoplamiento estándar.
"Sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto de las Fórmulas IA, IB o IC, las cuales se derivan de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en el sector y que incluyen, sólo a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio, entre otros. Cuando la molécula contiene una funcionalidad básica se pueden utilizar sales de ácidos orgánicos o inorgánicos como hidrocloruro, hidrobromuro, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato, entre otros, como sal farmacéuticamente aceptable.
El concepto "grupo protector" o "grupo de bloqueo" hace referencia a cualquier grupo que al estar unido a uno o más grupos hidroxilo, amino o carboxilo de los compuestos (incluyendo intermedios de éstos como aminolactamas, aminolactonas, etc.) evitan la reacción de dichos grupos. Dichos grupos protectores pueden eliminarse mediante química convencional o pasos enzimáticos para reestablecer el grupo hidroxilo, amino o carboxilo. Los grupo de bloqueo eliminables preferidos incluyen sustituyentes convencionales como t-butioxicarbonil (t-BOC), benziloxicarbonil (CBZ), entre otros, que pueden eliminarse mediante condiciones convencionales compatibles con la naturaleza del producto.
En el presente se utilizan las siguientes abreviaturas: Abreviaturas: [^{125}I)AB-MECA, [^{125}I]N^{6} -(4-amino-3-yodobencil)adenosina-5'N-metiluronamida; (R)-PIA, (R)-N^{6}-(fenilisopropil)adenosina; DMSO, dimetisulfóxido; I-AB-MECA, N^{6}-(4-amino-3-yodobencil) adenosina-5'-N-metiluronamida; Ki, constante de inhibición del equilibrio; NECA, 5'-N-etilcarboxamido adenosina; THF, tetrahidrofurano; Tris, tris(hidroximetil)aminometano.
Preparación del compuesto
Aquéllos que se dedican a la química orgánica sabrán que los grupos funcionales reactivos y frágiles deben a menudo protegerse previamente a una reacción, o secuencia de reacciones, determinada, y luego restablecerlos a sus formas originales una vez se ha finalizado la última reacción. Normalmente, los grupos se protegen convirtiéndolos en un derivado relativamente estable. Por ejemplo, un grupo hidroxilo puede convertirse en un grupo éter y un grupo amina en una amida o carbamato. Los procedimientos para proteger y desproteger, también conocidos como "de bloqueo" y "de desbloqueo", son bien conocidos y ampliamente utilizados en el sector, véase, por ej., T. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley, Nueva York (1981) o Protective Groups in Organic Chemistry, Ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, Londres (1973).
Los compuestos se preparan preferiblemente haciendo reaccionar un compuesto de Fórmula II indicada a continuación con un derivado de ácido carboxílico o ácido sulfónico adecuado utilizando la química conocida.
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Los compuestos de Fórmula II pueden prepararse mediante los siguientes Esquemas I y II, ilustrados a continuación, donde R^{3} es furano.
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Esquema I
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Reactivos: A) trietil ortoformato; B) hidrazida del ácido 2-furoico, 2-metoxietanol; C) PhOPh, 260°C; D) 10% HCl, a reflujo; E) cianamida, pTsOH, N-metilpirrolidona.
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Esquema II
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Reactivos: F) Hidrazida del ácido furoico, difeniléter; E) cianamida, pTsOH, N-metilpirrolidona.
Los compuestos de la fórmula II pueden prepararse mediante la ruta indirecta descrita en el Esquema I o bien mediante la ruta directa descrita en el Esquema II. La materias primas adecuadas para ambos esquemas son orto- aminonitrilos heterocíclicos de fórmula III, preparados normalmente según los procedimientos sintéticos conocidos en la bibliografía e indicados en el libro de E. C. Taylor y A. McKillop (vol. 7 de la serie Advances in Organic Chemistry, Ed. Interscience, 1970).
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Los orto-aminonitrilos III se transforman en los imidatos correspondientes de la fórmula IV por reacción con un exceso de etil ortoformato a temperatura de reflujo entre 8 a 10 horas. La reacción, una vez evaporado el etil ortoformato, lleva a la obtención elevada de los imidatos IV sustancialmente puros correspondientes según demuestran los análisis IR y ^{I}H NMR realizados en los productos de reacción crudos.
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Los imidatos de fórmula IV se someten a una secuencia de dos reacciones permitiendo la obtención de gran cantidad de estructuras tricíclicas de fórmula VI.
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La secuencia de reacción incluye: a) reacción con hidrazida del ácido 2-furoico en una solución de 2-metoxietanol a temperatura de reflujo durante 8-10 horas para obtener los compuestos intermedios de la fórmula V; b) ciclización térmica de este último en los compuestos correspondientes de fórmula VI, al calentarlo en difeniléter a una temperatura de 260°C entre 30 minutos a 1 hora.
Los compuestos tricíclicos VI se hidrolizan con HCI a reflujo entre 1 a 3 horas para producir triazoles VII, que se ciclizan finalmente en los compuestos deseados II con cianamida en N-metilpirrolidona a reflujo en presencia de ácido para-toluensulfónico (Esquema I).
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En algunos casos, se pueden obtener triazoles VII calentando directamente en orto-aminonitrilo de difeniléter III con hidrazida de ácido 2-furoico. Los triazoles VII se ciclizan según se ha descrito anteriormente en el Esquema II). En los siguientes esquemas III, IV y V, se presenta más detalladamente la síntesis de los compuestos de fórmula II, donde A es un anillo de triazol.
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Esquema III Síntesis de derivados de la 5-amino-2(2-furil)-1,2,3 -triazol [5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina con sustituyentes en la posición 7.
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Esquema IV Síntesis de derivados de la 5-amino-2(2-furil)-1,2,3 -triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina con sustituyentes en la posición 8.
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Reactivos: A) Hidrazida del ácido furoico, PhOPh, 260°C, B) NH_{2}CN, pTsOH, N-metilpirrolidona.
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Esquema V Síntesis de derivados de la 5-amino-2(2-furil)-1,2,3 -triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina con sustituyentes en la posición 9.
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Reactivos: A) Hidrazida del ácido furoico, PhOPh, 260°C, B) NH_{2}CN, pTsOH, N-metilpirrolidona.
Finalmente, los compuestos II que contienen 5-amina se hacen reaccionar con ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ácidos carboxílicos activados, ácidos sulfónicos activados, ácidos tiocarboxílicos, ácidos tiocarboxílicos activados, entre otros, para formar los compuestos deseados. Los ácidos carboxílicos activados incluyen haluros ácidos, ésteres, anhídridos y otros derivados que se sabe reaccionan con aminas para formar amidas. Los ácidos sulfónicos activados incluyen haluros de sulfonilo como cloruros de sulfonilo.
En todos los casos no es necesario utilizar derivados del ácido carboxílico activado y del ácido sulfónico. Los ácidos por sí mismos pueden acoplarse a las aminas a través de la química de acoplamiento estándar, por ejemplo, utilizando diciclohexil-diimida (DCI) y otros agentes de acoplamiento utilizados normalmente. Las condiciones de acoplamiento más adecuadas para formar enlaces de amida son bien conocidas por los expertos en la síntesis de péptidos.
Normalmente, puede utilizarse la química anteriormente mencionada para preparar 8-(Ar)alquil-2-(2 -furil)-pirazol [4,3-e]-1,2,3-triazol[1,5-c]pirimidinas cuando se utiliza 3-ciano-2-aminopirazoles como materia prima. Puede hacerse reaccionar el 3-ciano-2-aminopirazoles con un haluro de alquilo (RX) en un solvente polar aprótico como dimetil formamida (DMF) para proporcionar un grupo R a uno de los nitrógenos del anillo. El compuesto resultante se calienta a reflujo con trietil ortoformato para conseguir un etil éster de imina, que puede hacerse reaccionar con hidrazida furoica, utilizando preferiblemente una trampa Dean-Stark para la eliminación azeotrópica del agua producida en la reacción, para obtener 8-(Ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,3-triazol[1,5-c]pirimidinas. Los productos pueden purificarse por cromatografía, por ejemplo (EtOAc/hexano 1:1), para su utilización en el proceso químico posterior.
El producto de esta reacción puede hacerse reaccionar con un ácido adecuado, como HCl, a reflujo, seguido por la reacción con cianamida en un solvente como N-metilpirrolidona con ácido sulfónico paratolueno catalítico a temperaturas elevadas para obtener 5-amino-8-(Ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidinas.
Estos compuestos con amina sustituida pueden hacerse reaccionar con los isocianatos adecuados para formar compuestos de urea, ácidos carboxílicos activados como haluros ácidos para obtener amidas, ácidos sulfónicos activados como haluros de ácido sulfónico para formar sulfonamidas, u otros derivados reactivos de ácidos carboxílicos o de ácido sulfónico para formar los compuestos deseados.
Los compuestos triazol-triazol-pirimidina pueden preparase utilizando una química similar, pero partiendo de una azida correctamente funcionalizada y haciéndola reaccionar con H_{2}NC(O)CH_{2}CN para formar el anillo heterocíclico inicial, seguido por la reacción del grupo amida con un agente deshidratante como POCI_{3} para formar un nitrilo. El ciano-aminotriazol resultante puede hacerse reaccionar del mismo modo que los 3-ciano-2-aminopirazoles indicados anteriormente para preparar triazol-triazol-pirimidinas.
Síntesis de los análogos radiomarcados
Los compuestos pueden marcarse con cualquier agente de radiomarcado adecuado. Los ejemplos de agentes de radiomarcado adecuado incluyen ^{3}H y ^{14}C, aunque se puede utilizar cualquier agente de radiomarcado no tóxico utilizado normalmente en los estudios farmacocinéticos. Los medios para incorporar el radiomarcado a los compuestos orgánicos son bien conocidos por los expertos.
Cuando los compuestos son 5-[[fenil sustituido)amino]carbonil]amino-8-(ar)alquil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina o bien compuestos 5-amino-8-(ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina, la incorporación de un marcador de tritio resulta bastante directa.
En una representación, una materia prima adecuada es un compuesto en el que el grupo (ar)alquilo incluye un enlace doble en la posición 8. Este enlace doble puede hacerse reaccionar con tritio en presencia de un catalizador adecuado, por ejemplo, paladio sobre carbón u otro catalizador de hidrogenación conocido.
Por ejemplo, 5-[[4-metoxifenil)amino]carbonil] amino-8-(1,2-ditritiopropil)-2-(2-furil)-pirazol [4,3-e] 1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (compuesto 102) puede preparase añadiendo tritio a través del doble enlace de 5-[[4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-1-propenil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (compuesto 101). A continuación se discutirá el compuesto 102 respecto a varios estudios sobre afinidad en células cancerígenas JURKAT.
Alternativamente, el marcado de tritio puede estar presente en los compuestos utilizados para hacer reaccionar el grupo 5-amino para formar las amidas, ureas u otros grupos en posición 5. Por ejemplo, los isocianatos utilizados para preparar los compuestos 5-aminocarbonilamino descritos aquí pueden incluir un tritio u otros marcados, por lo que pueden incorporarse fácilmente al producto final.
En otra representación, el marcado puede incorporarse a la molécula mientras se está formando el sistema de anillos. Según se ha indicado anteriormente respecto a la síntesis de los compuestos de Fórmula II, varios compuestos tricíclicos de Fórmula VI se hidrolizan con HCI para dar triazoles de Fórmula VII, que se ciclizan con cianamida a reflujo en presencia de ácido paratoluensulfónico, como se ilustra en el Esquema I. Es relativamente directo incorporar un marcador ^{14}C en esta etapa de la síntesis usando una cianamida marcada ^{14}C.
Pueden prepararse los compuestos yodados, por ejemplo, incorporando un yodo radioactivo en el compuesto aromático usado para hacer reaccionar con el grupo 5-amina. La incorporación de yodo en los anillos aromáticos es bien conocida por los expertos. Resulta bastante directo incorporar un átomo de yodo en los compuestos aromáticos utilizados para hacer reaccionar con el grupo 5-amina para preparar los compuestos aquí descritos.
En consecuencia, se pueden preparar fácilmente análogos radiomarcados adecuados utilizando simplemente las prácticas habituales.
Síntesis de análogos marcados con fluorescente
Al igual que con los compuestos radiomarcados, la síntesis de los compuestos marcados con fluorescente es relativamente directa. Preferiblemente, los grupos fluorescentes están presentes en la posición R2, a pesar de que también es factible la sustitución en la posición R3. En una representación, el/los grupo(s) fluorescente(s) incluye(n) un anillo de furano que puede adherirse a la posición R3. De forma alternativa pueden usarse otros anillos aromáticos. Los marcadores fluorescentes son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden incorporarse a los compuestos aquí descritos mediante la utilización de la química conocida.
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Procedimientos para utilizar los compuestos
Los compuestos pueden utilizarse en todas las indicaciones como agonistas y antagonistas del receptor A_{3}, incluyendo:
\bullet
tratamiento de la hipertensión;
\bullet
tratamiento de afecciones inflamatorias como artritis reumatoide y soriasis,
\bullet
tratamiento de afecciones alérgicas como la fiebre del heno y la rinitis alérgica;
\bullet
degranulación mastocitaria;
\bullet
agentes antitumorales;
\bullet
tratamiento de la hipoxia cardiaca; y
\bullet
protección contra la isquemia cerebral,
según se describe, por ejemplo, en Jacobson, TIPS Mayo 1998, págs. 185-191, cuyo contenido se incorpora como referencia.
El uso preferido de estos compuestos se encuentra en la detección y/o tratamiento del cáncer. Como se discutirá más adelante, las células tumorales han demostrado expresar el receptor A_{3}. Se cree que este receptor protege a las células de daños isquémicos cuando no reciben la irrigación sanguínea adecuada. Muchos fármacos comercializados así como otros fármacos en desarrollo se enfocan hacia la inhibición de la expresión del VEGF, que corta la irrigación sanguínea de las células tumorales. No obstante, el agonismo de los receptores A_{3} de la adenosina pueden proporcionar un efecto protector, evitando la muerte de las células tumorales aunque las células no reciban la suficiente irrigación sanguínea. Al administrar antagonistas de estos receptores junto con anti-VEGF u otros compuestos antiangiogénicos, se puede cortar la nueva irrigación sanguínea de las células tumorales, así como reducir la protección contra daños isquémicos que les proporciona el agonismo de los receptores A_{3}.
Los compuestos pueden administrarse al paciente a través de cualquier medio médico aceptable. Los medios adecuados de administración incluyen la vía oral, rectal, tópica o parenteral (incluyendo la subcutánea, intramuscular o intravenosa), a pesar de que es preferible la administración oral o parenteral.
La cantidad de compuesto necesaria para que sea efectivo como modulador de un receptor de la adenosina dependerá, por supuesto, del mamífero que deba tratarse y queda en última instancia a discreción del médico o veterinario. Los factores que hay que tener en cuenta incluyen la afección a tratar, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, el peso corporal del mamífero, su área superficial, edad y estado de salud general y el compuesto que va a administrarse. No obstante, una dosis efectiva se encuentra en el intervalo de alrededor de 0,1 \mug/kg a alrededor de 10 mg/kg por peso corporal por día, preferible en el intervalo de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 3 mg/kg al día.
La dosis total diaria debe administrarse en una dosis única, dosis múltiples, por ej. de dos a seis veces al día, o por infusión intravenosa con una duración determinada. Las dosis por encima o por debajo de los intervalos mencionados se encuentran dentro del alcance de la presente invención y pueden administrarse al paciente de ser necesario. Por ejemplo, en el caso de un mamífero de 75 kg, el intervalo de dosis podría ser de alrededor de 75 mg a alrededor de 220 mg al día y la dosis típica se encontraría alrededor de 150 mg por día. Si se indican múltiples dosis bajas, el tratamiento podría componerse de 50 mg de un compuesto administrado 3 veces al día.
En otra representación, los compuestos radiomarcados pueden administrarse al paciente con objeto de realizar en ensayo para determinar la presencia o ausencia de células cancerígenas que expresan receptores A_{3}. Los compuestos aquí descritos presentan una relativa alta afinidad con el subtipo de receptor A_{3} y pueden administrarse convenientemente al paciente. Una vez los compuestos se enlazan con los receptores A_{3} presentes en las células tumorales, se puede determinar la situación de los compuestos ubicando los compuestos radiomarcados. Los dispositivos para determinar la ubicación y densidad de los compuestos radiomarcados son bien conocidos por los expertos en la materia.
La utilización de compuestos radiomarcados y/o marcados con fluorescencia durante la cirugía para la eliminación de tejido cancerígeno puede ser ventajosa. A menudo, los cirujanos deben asegurarse de la completa eliminación de tejido cancerígeno. Los compuestos radiomarcados o marcados con fluorescencia pueden administrarse al paciente antes o durante la cirugía y se unirán a las células cancerígenas presentes en el paciente. El tiempo de administración variará dependiendo de otros factores, de la toma de un compuesto determinado para detectar unas células tumorales determinadas y de la ubicación del tumor en el cuerpo. El cirujano contará con un ensayo relativamente directo para determinar la presencia de células cancerígenas residuales una vez eliminado el tumor. La presencia de células cancerígenas residuales puede determinarse midiendo la fluorescencia o radioactividad en el lugar de la operación, utilizando dispositivos analíticos bien conocidos por los expertos en la materia.
La detección de células cancerígenas in vitro puede realizarse mediante la administración de compuestos a una suspensión de células en un medio de cultivo celular, dejando que los compuestos se enlacen con los receptores A_{3} de la adenosina de las células cancerígenas y detectando posteriormente el marcado.
Formulaciones
Los compuestos descritos anteriormente se administrarán preferiblemente en una formulación que incluya un compuesto activo, es decir, un compuesto de Fórmula I, junto con un vehículo aceptable en función del modo de administración. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia.
Las composiciones pueden incluir de forma opcional otros ingredientes terapéuticamente activos como antivirales, agentes antitumorales, antibacterianos, antiinflamatorios, analgésicos e inmunodepresores. El vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de que debe ser compatible con el resto de ingredientes de la formulación y no debe resultar nocivo para el receptor.
Las formulaciones pueden incluir vehículos adecuados para su administración oral, rectal, tópica o parenteral (incluyendo la administración subcutánea, intramuscular e intravenosa). Los vehículos preferidos son aquellos que resultan adecuados para la administración oral o parenteral.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen una preparación acuosa estéril del compuesto activo que será preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. De este modo, dichas formulaciones podrán contener agua destilada, dextrosa al 5% en agua destilado o solución salina. Las formulaciones útiles también incluyen soluciones concentradas o sólidos que contienen el compuesto de Fórmula I que, al diluirse con un solvente adecuado, proporcionan una solución adecuada para la administración parenteral antes mencionada.
En el caso de administración enteral, el compuesto puede incorporarse a un vehículo inerte en pequeñas unidades como cápsulas, sellos, comprimidos o grageas, todas ellas conteniendo una cantidad predeterminada del compuesto activo; en polvo o granulado; o una suspensión o solución en un líquido acuoso o no acuoso, por ej. un jarabe, un elixir, una emulsión o bebida. Los vehículos adecuados pueden ser almidones o azúcares e incluir lubricantes, aromatizantes, ligantes y otros materiales de la misma naturaleza.
Se puede producir comprimido por compresión o moldeado, añadiendo opcionalmente uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos pueden prepararse comprimiendo el compuesto activo en una máquina adecuada presentándolos en forma suelta, por ejemplo en polvo o granulado, mezclándolo opcionalmente con ingredientes accesorios, por ej. ligantes, lubricantes, diluyentes inertes, agentes de superficie activa o agentes de dispersión. Los comprimidos también pueden conseguirse mediante el moldeado en una máquina apropiada, mezclando el compuesto activo en polvo con cualquier vehículo adecuado.
Se puede conseguir un jarabe o suspensión añadiendo el componente activo a una solución acuosa concentrada de un azúcar, por ej. sucrosa, a la que también pueden añadirse otros ingredientes accesorios. Dichos ingredientes accesorios pueden incluir aromatizantes, un agente para retrasar la cristalización del azúcar o un agente para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, por ej. como un alcohol polihídrico, por ejemplo, glicerol o sorbitol.
Los compuestos también pueden administrarse localmente mediante la aplicación tópica de una solución, pomada, crema, gel, loción o material polimérico (por ejemplo, un Pluronic™ de BASF), que pueden prepararse según los métodos tradicionales utilizados en farmacia. Además de la solución, pomada, crema, gel, loción o base polimérica y del ingrediente activo, dichas formulaciones tópicas también pueden contener conservantes, perfumes e ingredientes farmacéuticos activos adicionales.
Las formulaciones para la administración rectal pueden presentarse como supositorios con un vehículo convencional, por ej. manteca de coco o Witepsol S55 (marca registrada de Dynamite Nobel Chemical, Alemania), como base del supositorio.
De forma alternativa, el compuesto puede administrarse en liposomas o microesferas (o micropartículas). Los procedimientos para preparar los liposomas y microesferas para su administración a un paciente son bien conocidos por los expertos en la materia. La patente estadounidense núm. 4.789.734, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia, describe procedimientos para encapsular materiales biológicos en liposomas. Básicamente, el material se disuelve en una solución acuosa, se añaden los fosfolípidos y lípidos adecuados, junto con surfactantes de ser necesario, y el material se dializa o expone a ultrasonidos, según convenga. En G. Gregoriadis, Capítulo 14, "Liposomes", Drug Carriers in Biology and Medicine, págs. 287-341 (Academic Press, 1979) se hace una revisión de los métodos conocidos. Las microesferas formadas por polímeros o proteínas son bien conocidas por los expertos en la materia y pueden prepararse para pasar del tracto gastrointestinal directamente al torrente sanguíneo. De forma alternativa, puede incorporarse el compuesto y las microesferas, o compuesto de microesferas, implantarse para una liberación lenta durante un periodo de tiempo que oscile entre días y meses. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses núm. 4.906.474, 4.925.673 y 3.625.214, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia.
Las micropartículas preferidas son las preparadas a partir de polímeros biodegradables, como poliglicólida, policáctida y sus copolímeros. Los expertos en la materia podrán determinar rápidamente un vehículo adecuado dependiendo de varios factores, incluyendo la velocidad de liberación del fármaco y la dosis que se deseen en el producto.
Las formulaciones pueden presentarse cómodamente en monodosis y prepararse según cualquiera de los métodos conocidos en farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el compuesto activo con un vehículo formado por uno o más ingredientes accesorios. Por lo general, las formulaciones se preparan asociando uniforme y estrechamente el compuesto activo con un vehículo líquido o con un vehículo sólido finamente dividido y, de ser necesario, darle forma al producto con la forma de dosificación deseada.
Además de los ingredientes antes mencionados, las formulaciones pueden incluir uno o más ingrediente(s) accesorio(s) utilizados en el sector de las formulaciones farmacéuticas, por ej. diluyentes, tampones, agentes aromatizantes, ligantes, agentes de superficie activa, espesantes, lubricantes, agentes de suspensión, conservantes (incluyendo antioxidantes), entre otros.
Determinación del grado de actividad de los compuestos
La actividad de los compuestos puede determinarse rápidamente mediante la experimentación rutinaria utilizando cualquiera de los ensayos que se indican a continuación.
Ensayo de unión al receptor A_{1} y A_{2} de adenosina en ratas Preparación de las membranas
Se decapitan ratas Wistar macho (200-250 g) y se disecciona su cerebro (médula cerebral, núcleo estriado y cerebelo) en hielo. Se pueden alterar los tejidos celulares en un Polytron (posición 5) en 20 vol de 50 mM Tris HCl, pH 7,4. Entonces se puede centrifugar el homogenado a 48.000 g durante 10 min y puede volver a suspenderse el pellet en Tris-HCL con 2 IU/ml adenosina deaminasa, tipo VI (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., EE.UU.). Tras una incubación durante 30 minutos a 37°C pueden centrifugarse las membranas y almacenarse los pellets a -70°C. Los tejidos del estriado pueden homogenizarse en un Polytron en 25 vol de 50 mM tampón Tris HCl que contenga 10 mM MgCl_{2} pH 7,4. El homogenado puede centrifugarse entonces a 48.000 g durante 10 minutos a 4°C y resuspendido en un tampón Tris HCl con 2 IU/ml adenosina deaminasa. Tras una incubación durante 30 minutos a 37°C, se pueden centrifugar las membranas y guardar el pellet a -70°C.
Ensayos de unión de radioligandos
La unión de [^{3}H]-DPCPX (1,3-dipropil-8-ciclopentilxantina) a las membranas del cerebro de una rata puede realizarse básicamente según el método descrito previamente por Bruns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 5547-5551 1980. Se pueden realizar experimentos de desplazamiento en 0,25 ml de tampón con un contenido de 1 nM de [^{3}H]-DPCPX, 100 \mum de membranas de cerebro de rata diluidas (100 \mug de proteína/ensayo) y como mínimo 6-8 concentraciones diferentes de compuestos examinados. Se puede determinar la unión no específica en presencia de 10 \muM de CHA (N^{6}ciclohexiladenosina) que representa siempre \leq 10% de la unión total. Los tiempos de incubación son normalmente de 120 min. a 25°C.
La unión de [^{3}H]-SCH 58261 (5-amino-7-(2 -feniletil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina) a las membranas del núcleo estriado de rata (100 \mug de proteína/ensayo) puede realizarse según los procedimientos descritos en Zocchi et al., J. Pharm. and Exper. Ther. 276:398-404 (1996). En los estudios de competencia deberían utilizarse como mínimo 6-8 concentraciones de compuestos examinados. La unión no específica puede determinarse en presencia de 50 \muM de NECA (5'-(N-etilcarboxamida)adenosina). El tiempo de incubación es normalmente de 60 min. a 25°C.
La unión y la radioactividad libre pueden separarse filtrando la mezcla de ensayo a través de unos filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B usando un cosechador de células Brandel (Gaithersburg, MD, EE.UU.). La mezcla de incubación puede diluirse en 3 ml de tampón de incubación helado, filtrada rápidamente al vacío y puede lavarse el filtro tres veces con 3 ml de tampón de incubación. Se puede medir la radioactividad unida al filtro, por ejemplo, mediante espectrometría de centelleo líquido. Se puede determinar la concentración de proteínas, por ejemplo, según un método Bio-Rat (Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976)) con albúmina bovina como estándar de referencia.
Análisis de unión del receptor A_{3} de adenosina clonado de humanos
Análisis de unión del receptor: Los ensayos de unión pueden realizarse según los procedimientos descritos en Salvatore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10365-10369 (1993). En los estudios de saturación, un alícuota de membranas (8 mg de proteína/ml) de células HEK-293 transfectadas con el receptor humano recombinante de adenosina A_{3} (Research Biochemical International, Natick, MA, EE.UU.) puede incubarse con 10-12 concentraciones diferentes de [^{125}I]AB-MECA en un intervalo de 0,1 a 5 nM. Los experimentos de competencia pueden realizarse por duplicado con un volumen final de 100 \mul en tubos de ensayo con contenido de 0,3 nM de [^{125}I]AB-MECA, 50 nM de tampón Tris HCl, 10 mM MgCl_{2}, pH 7,4 y 20 \mul de membranas diluidas (12,4 mg proteína/ml) y como mínimo 6-8 concentraciones diferentes de ligandos examinados.
El tiempo de incubación fue de 60 minutos a 37°C, según los resultados de experimentos conducidos con anterioridad. La unión y la radioactividad libre se separan filtrando la mezcla de estudio a través de un filtro de fibra de vidrio Whatman GF/B usando un cosechador de células Brandel. Se definió la unión no específica como unión en presencia de 50 \muM R-PIA y representaba alrededor del 30% de la unión total. La mezcla de incubación se diluyó con 3 ml de tampón de incubación frío, se filtró al vacío y se lavó el filtro tres veces con 3 ml de tampón de incubación. La radioactividad unida al filtro se midió con un contador Beckman gamma 5500B \gamma. Se puede determinar la concentración de proteínas según un método Bio-Rad (3) con albúmina bovina como estándar de referencia.
Análisis de los datos
Los valores de la constante de unión inhibitoria K_{i} pueden calcularse de los de IC_{50} según la ecuación de Cheng y Prusoff (Cheng y Prusoff, Biochem. Phamacol. 22:3099-3108 (1973)), K_{i} = IC_{50}/(1+[C*]/K_{D}*), donde [C*] es la concentración del radioligando y K_{D}* su constante de disociación.
Para realizar el análisis informatizado de los experimentos de saturación e inhibición puede utilizarse programa LIGAND para el ajuste de curvas de mínimos cuadrados no lineares (Munson y Rodbard, Anal. Biochem. 107:220-239 (1990)). Los datos se expresan normalmente como media geométrica, con unos límites de confianza de entre el 95% al 99% entre paréntesis.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran aspectos de la presente invención, pero no deben tomarse como limitaciones a la misma. Los símbolos y convenciones utilizados en estos ejemplos pretender ser coherentes con los utilizados en la literatura química contemporánea internacional, como por ejemplo, el Journal of the American Chemical Society ("J. Am. Chem. Soc.") y Tetrahedron.
Ejemplo 1 Preparación de 8-(Ar)alquil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidinas (Compuestos 18-25)
Se prepararon 8-(Ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidinas según la estrategia sintética que ilustra el Esquema VI.
Esquema VI Procedimientos generales para la preparación de 8-(Ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidinas (18-25)
Reactivos: a) NaH, DMF, RX; b) HC (OEt)_{3}, reflujo; c) Hidrazida del ácido 2-furoico, MeO(CH_{2})_{2}OH; d) Ph_{2}O, 260°C, cromatografía flash.
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En la preparación de los compuestos 18-25, se trató una solución de 1 (10 mmol) en 40 ml de DMF enfriado a 0°C con NaH (60% en aceite, 12 mmol) en muchas partes durante 10 minutos. Transcurridos 45 minutos, se añadió el haluro de (ar)alquilo apropiado (12 mmol), se dejó calentar la mezcla de reacción a 25°C y se agitó durante 3-5 h (TLC: EtOAc 1:1). Se dejó templar la reacción añadiendo H_{2}O (80 ml) y se extrajo la capa acuosa con EtOAc (5 x 25 ml). Las capas orgánicas se recombinaron, secaron (Na_{2}SO_{4}), filtraron y concentraron a presión reducida, para asegurarle al pirazol alquilado (2-9) una mezcla inseparable de isómeros N^{1} y N^{2} (relación aproximada de 1:4). Esta mezcla de N^{1} y N^{2} -4-ciano-5-amino pirazoles sustituidos (2-9) se disolvió en trietil ortoformato (60 ml) y se llevó a reflujo la solución bajo nitrógeno durante 8 horas. Se eliminó el solvente mediante vacío y se disolvió el residuo oleoso formado por la mezcla de imidatos (10-17) y se añadió 2-metoxietanol (50 ml) e hidrazida del ácido 2-furoico (13 mmol). Se llevó a reflujo la mezcla durante 5-10 horas y, una vez enfriada, se eliminó el solvente mediante presión reducida y se ciclizó el residuo oleoso oscuro de nuevo para su purificación en difenil éter (50 ml) a 260°C utilizando un Dean-Stark para la eliminación azeotrópica del agua producida en la reacción. Transcurridas 1,5 horas, se vertió la mezcla en hexano (300 ml) y se dejó enfriar. Se filtró el precipitado y se purificó por cromatografía (EtOAc/hexano 1:1). De este modo, se obtuvo una buena producción general del producto principal (N^{8} alquilado) (18-25).
Siguiendo este procedimiento general se prepararon los siguientes compuestos:
8-Metil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (18)
producción 45%; sólido amarillo, p.f. 155-156°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1615, 1510 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 4.1 (s, 1H); 6.32 (m, 1H); 7,25 (m, 1H); 8,06 (m, 1H); 8,86 (s, 1H), 9,38 (s, 1H).
8-Etil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (19)
producción 50%; sólido amarillo pálido, p.f. 188-189°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1620, 1500 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 1,67 (t, 2H, J = 7); 4,53 (q, 2H, J =7); 6,59(m, 1H); 7,23 (m, 1H), 7,64 (s, 1H); 8,34 (s, 1H); 9,10 (s, 1H).
8-Propil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (20)
producción 60%; sólido amarillo, p.f. 189-190°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1600, 1505 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 0.98 (t, 2H, J = 7); 2,03 -2,10 (m, 2H); 4,41 (q, 2H, J=7); 6,60 (m, 1H); 7,24 (m, 1H); 7,64 (s, 1H), 8, 32 (s, 1H); 9,10 (s, 1H).
8-Butil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (21)
producción 50%; sólido amarillo pálido, p.f. 245-247°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1610, 1500 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 0.9 (m, 3H); 1.3 (m, 2H); 1,9 (m, 2H); 4,5 (t, 2H, J=7,2); 6,2 (m, 1H), 7,3 (m, 1H); 8,0 (m, 1H); 8,9 (s, 1H); 9,4 (s, 1H).
8-Isopentil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (22)
producción 54%; sólido amarillo pálido, p.f. 235-237°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1635, 1510, 1450 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 1.0 (d, 6H, J=6,2); 1.5-1,9 (m, 3H); 4,6 (t, 2H, J=7,4); 6,6(m, 1H); 7,3 (m, 1H), 7,7 (m, 1H); 8,8 (s, 1H); 9,1 (s, 1H).
8-(2-isopentenil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c] pirimidina (23)
producción 48%; sólido amarillo, p.f. 210-212°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1625, 1500, 1430 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 1.79 (s, 3H); 1,87 (s, 3H); 5,05 (d, 2H, J=6); 5.55-5,63 (m, 1H); 6,60 (m, 1H); 7,24 (m, 1H); 7,64 (s, 1H); 8,34 (s, 1H); 9,1 (s, 1H).
8-2-feniletil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (24)
producción 56%; p.f. 268-270°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1600, 1510, 1450 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 3,32 (t, 2H, J=6,7); 4,72 (t, 2H, J=6,7); 6,73 (s, 1H); 7.23 (m, 5H); 7,95 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 9,41 (s, 1H). Anal. (C_{18}H_{14}N_{6}O)C,H,N.
8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (25)
producción 63%; sólido amarillo p.f. 165-166°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 1630, 1500, 1440 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 2,34-2,48 (m, 2H); 2,67 (t, 3H, J=7,5); 4,43 (t, 2H, J=7,5); 6.61 (m, 1H); 7,16-7.32 (m, 6H); 7,64 (d, 1H, J=2); 8,29 (s, 1H); 9,02 (s, 1H).
Ejemplo 2 Preparación de 5-Amino-8-(ar)alquil-2-(2-furil) -pirazol [4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidinas (Compuestos 33-40]
Se puede preparar 5-Amino-8-(ar)alquil-2-(2 -furil)-pirazol [4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidinas según la estrategia sintética ilustrada en el siguiente Esquema VII.
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Esquema VII Procedimientos generales para la preparación de 5-Amino-8-(ar)alquil-2-(furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol[l,5-c]pirimidinas (33-40)
Reactivos: a) HCl, reflujo, b) NH_{2}CN, 1-metil-2-pirrolidona, pTsOH, 140°C
En la preparación de los compuestos 33-40, se lleva a reflujo durante 3 horas una solución de la mezcla de triazol-pirimidina (18-25) (10 mmol) en una solución acuosa al 10% de HCl (50 ml). Se enfría y se neutraliza la solución con una solución saturada de NaHCO_{3} a 0°C. Los compuestos (26-33) se extrajeron con EtOAc (3 x 20 ml), se secaron las capas orgánicas con Na_{2}SO_{4} y se evaporaron al vacío. La amina cruda obtenida (26-33) se disolvió en N-metilpirrolidona (40 ml), y se añadió cianamida (60 mmol) y ácido sulfónico de p-tolueno (15 mmol) y se calentó la mezcla a 160°C durante 4 horas. Transcurrido ese tiempo se volvió a añadir cianamida (60 mmol) y se calentó la solución durante la noche. Entonces de diluyó la solución con EtOAc (80 ml) y se filtró el precipitado (exceso de cianamida); se concentró el filtrado bajo presión reducida y se lavó con agua (3 x 30 ml). Se secó la capa orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó bajo vacío. Se purificó el residuo por cromatografía (EtOAc/petróleo ligero 1:2) para conseguir que el producto deseado (34-41) sea un sólido.
Se han preparado los siguientes compuestos siguiendo este procedimiento general:
5-Amino-8-metil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina (34)
producción 53%, sólido amarillo p.f. 167-168°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3500-2950, 1680, 1645, 1610, 1560, 1455 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 4,12 (s, 3H); 6,70 (m, 1H); 6,99 (bs, 2H); 7,18 (m, 1H); 7,81 (s, 1H); 8,42 (s, 1H).
5-Amino-8-etil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol [1,5-c] pyrimidina (35)
producción 65%, sólido amarillo p.f. 249-250°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3430-2950, 1680, 1655, 1620, 1550, 1450 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 1,46 (t, 2H, J=7); 4,30 (d, 2H, J=7); 6,72 (m, 1H); 7,18 (m, 1H); 7.93 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,62 (s, 1H).
5-Amino-8-propil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol [1, 5-c] pyrimidina (36)
producción 57%, sólido amarillo pálido p.f. 209-210°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3400-2900, 1660, 1645, 1610, 1545, 1430 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 0,83 (t, 2H, J=7); 1,81-1,91 (m, 2H); 4,22 (d, 2H, J=7); 6,71 (m, 1H); 7.19 (m, 1H); 7,63 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,61 (5, 1H).
5-Amino-8-butil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol [1, 5-c] pyrimidina (37)
producción 47%, sólido blanco p.f. 200-203°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3500-2900, 1685, 1640, 1620, 1550, 1450 cm^{-1}, ^{1}H NMR (DMSO d_{6}) \delta 0,9 (t, 3H); 1,2 (m, 2H); 1,8 (m, 2H); 4.2 (t, 2H); 6,7 (m, 1H); 7,2 (m, 2H); 7,6 (s, 1H); 8,0 (s, 1H); 8.6 (s, 1H).
5-Amino-8-isopentil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c]pirimidina (38)
producción 60%, sólido blanco grisáceo, p.f. 212-213°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3500-2850, 1670, 1650, 1615, 1560, 1455 cm^{-1}, 1H NMR (CDCl_{3}) \delta: 0,96 (d, 6H, J=6,4); 1,59 (m, 1H); 1,86 (m, 2H); 4,32 (t, 2H, J=6,4); 6,58 (m, 1H); 6,72 (bs, 2H); 7,21 (d, 1H, J=4,2); 7,63 (d, 1H, J=1,2); 8,10 (s, 1H).
5-Amino-8-(2-isopentenil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol [1, 5-c] pirimidina (39)
producción 58%, sólido amarillo pálido, p.f. 178-179°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3520-2950, 1665, 1640, 1610, 1555, 1450 cm^{-1}, 1H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,74 (s, 3H); 1,77 (s, 3H); 4,87 (d, 2H, J=7); 5,43- 5,46 (m, 1H); 6,72 (m, 1H) 7,18 (m, 1H); 7,62 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,55 (s, 1H).
5-Amino-8-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazol [4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c] pirimidina (40)
producción 45%, sólido blanco, p.f. 183-185°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3500-2900, 1670, 1645, 1620, 1530, 1455 cm^{-1}, 1H NMR (DMSO d_{3}) \delta: 3,21 (t, 2H, J=6,4); 4,53 (t, 2H, J=6,4); 6,7 (s, 1H); 7,1-7,4 (m, 6H); 7,65 (bs, 2H) 7,93 (s, 1H); 8,45 (s, 1H).
5-Amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol [1, 5-c] pirimidina (41)
producción 57%, sólido amarillo pálido, p.f. 168-170°C (EtOAc-petróleo ligero); IR (KBr): 3510-2950, 1665, 1640, 1615, 1520, 1455 cm^{-1}, 1H NMR (DMSO d_{3}) D: 2,14-2,21 (m, 2H); 2,54 (t, 2H, J=7); 4,29 (t, 2H, J=6,4); 6,71 (s, 1H); 7,14-7,32 (m, 6H) 7,64 (bs, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,64 (s, 1H).
Ejemplo 3 Preparación de 5-[[(fenil sustituido)amino]carbonil]amino-8-(ar)alquilo-2 -(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (Compuestos 42-57)
Se pueden preparar 5-[[fenil sustituido) carbonil]amino-8 -(ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazollo[1,5-c] pirimidinas según la estrategia sintética mostrada en el Esquema VIII que viene a continuación.
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Esquema VIII Procedimientos generales para la preparación de 5-[[(fenil sustituido)amino]carbonil]amino-8-(ar)alquil -2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (42-57)
En la preparación de los compuestos 42-57, se disuelve el compuesto amino apropiado (34-41) (10 mmol) en THF acabado de destilar (15 ml) y se añade el isocianato adecuado (13 mmol). Se llevó la mezcla a reflujo bajo atmósfera de argón durante 18 horas. Se retiró el solvente bajo presión reducida y se purificó el residuo mediante cromatografía flash (EtOAc-petróleo ligero 4-6) para obtener los compuestos 42-57 deseados. Siguiendo este procedimiento general se pudo preparar los siguientes compuestos:
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-metil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina (42)
producción 98%; sólido amarillo pálido, p.f. 142-145°C (Et_{2}-petróleo ligero); I (KBr): 3210-2930, 1660, 1630, 1610, 1500, cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 4,21 (s, 3H); 6,60 (m 1H); 7,11 (d, 1H, J=8); 7,13-7,28 (m, 2H); 7,55 (d, 1H, J=8); 7,65 (s, 1H); 7,78 (d, 1H, J=2); 8,22 (s, 1H); 8,61 (bs, 1H); 11,24 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-metil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (43)
producción 99%; sólido amarillo pálido, p.f. 193-195°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3200-2900,1664, 1625, 1600, 1500 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 3,81(s, 3H); 4,20 (s, 3H); 6,61 (m, 1H); 6,85 (d, 2H, J=9); 7,26 (m, 1H); 7,55 (d, 2H, J=9); 7,65(s, 1H); 8,21(s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-etil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (44)
producción 98%; sólido amarillo pálido, p.f. 204-205°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3220-2930, 1660, 1620, 1600, 1500 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,71 (t, 3H, J = 7); 4,50 (q, 2H, J=7); 6,67 (m, 1H), 7,20 (d, 1H, J=8); 7,31 (m, 1H); 7,61 (d, 1H, J=8); 7,70 (s, 1H); 7,84 (s, 1H); 8,30 (s, 1H); 8,67 (bs, 1H); 11,30 (bs, 1H).
5-[[(3-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-etil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (45)
producción 99%; sólido amarillo pálido, p.f. 200-201°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3250-2950, 1665, 1620, 1610, 1520 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,71 (t, 3H, J = 7); 3,85 (s, 3H); 4,49 (s, 3H); 6,65 (m, 1H); 6,88 (d, 2H, J = 9); 7,26 (m, 1H), 7,58 (d, 2H, J = 9); 7,69 (s, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 10,99 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-propil-2(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (46)
producción 95%; sólido amarillo pálido, p.f. 138-139°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3210-2920, 1655, 1615, 1600, 1510 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,71 (t, 3H, J = 7); 2,04 (m, 1H); 4,36 (q, 2H, J=7); 6,62 (m, 1H); 7,12 (d, 1H, J=8); 7,27 (m, 1H); 7,56 (d, 1H, J=8); 7,66 (s, 1H); 7,80 (s, 1H); 8,24 (s, 1H); 8,62 (bs, 1H); 11,08 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-propil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina (47)
producción 98%; sólido amarillo pálido, p.f. 146-148°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3230-2950, 1660, 1620, 1600, 1530 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 0,98 (t, 3H, J = 7); 2,04-2,08 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,35 (t, 2H, J = 7); 6,61 (m, 1H); 6,89 (d, 2H, J = 9); 7,25 (m, 1H); 7,56 (d, 2H, J = 9); 7,65 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,95 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-butil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina (48)
producción 97%; sólido blanco, p.f. 210-212°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3240-2970, 1650, 1610, 1510 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,00 (t, 3H, J=7); 1,39-1,41 (m, 2H); 1,99-2,03 (m, 2H); 4,41 (q, 2H, J = 7); 6,63 (m, 1H); 7,14 (d, 1H, J=8); 7,29 (m, 1H); 7,56 (d, 1H, J=8); 7,80 (s, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,26 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-butil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (49)
Producción 96%; sólido blanco, p.f. 197-198°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3250-2960, 1665, 1610, 1660, 1520, cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 0,98 (t, 3H, J = 7); 1,38-1,42 (m, 2H); 2,02-2,05 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,39 (t, 2H, J = 7); 6, 63 (m, 1H); 6, 92 (d, 2H, J = 9); 7,25 (d, 2H, J = 9); 7,67 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,60 (bs, 1H), 10,95 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-isopentil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (50)
producción 97%; sólido amarillo pálido, p.f. 199-200°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3230-2950, 1665, 1660, 1510 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,01 (d, 6H, J = 7,5); 1,49-1,51 (m, 1H); 1,88-2,03 (m, 2H); 4,42 (t, 2H, J=7); 6,62 (m, 1H); 7,13 (d, 1H, J = 8), 7,34 (m, 1H); 7,57 (d, 1H, J= 8); 7,67 (s, 1H); 7,80 (s, 1H); 8,24 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,25 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-isopentil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (51)
producción 98%; sólido blanco, p.f. 192-193°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3230-2970, 1660, 1615, 1600, 1500 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 0,99 (d, 6H, J = 7, 5); 1,58-1,22 (m, 1H); 1,87-1,97 (m, 2H); 3,82 (s, 3H); 4,40 (t, 2H, J = 7); 6,62 (m, 1H); 6,91 (d, 2H, J = 9); 7,23 (m, 1H); 7,58 (d, 2H, J = 9); 7,66 (s, 1H); 8,23 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,94 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-(2-isopentenil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (52)
producción 99%; sólido blanco, p.f. 204-205°C (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3245-2960, 1650, 1600, 1510 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,84 (s, 3H); 1,88 (s, 3H); 5,01 (d, 2H, J = 8); 5,57 (m, 1H); 6,62 (m, 1H); 7,12 (d, 1H, J = 8); 7,29 (m, 1H); 7,56 (d, 1H, J = 8); 7,66 (s, 1H); 7,80 (s, 1H); 8,26 (s, 1H); 8,60 (bs, 1H); 11,26 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-(2-isopentenil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (53)
producción 96%; sólido amarillo pálido, p.f. 198-199ºC (Et_{2}O-petróleo ligero); I (KBr): 3235-2950, 1665, 1620, 1600, 1510 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 1,83 (s, 3H); 1,87 (s, 3H); 3,81 (s, 3H); 4,97 (d, 2H, J = 7); 5,57 (m, 1H); 6,61 (m, 1H); 6,93 ( d, 2H, J = 9); 7,24 (m, 1H); 7,54 (d, 2H, J = 9); 7,66 (s, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,58 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina (54)
producción 98%; sólido blanco, p.f. 186-187°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3250-2970, 1660, 1610, 1515 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 3,33 (t, 2H, J=7); 4,62 (t, 2H, J = 7); 6,60 (m, 1H); 7,19-7,35 (m, 7H); 7,57 (d, 1H, J = 8); 7,61 (s, 1H); 7,81 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 8,63 (bs, 1H); 11,27 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil) amino]carbonil]amino-8-(2-feniletil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina (55)
producción 99%; sólido blanco, p.f. 180-181°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3245-2960, 1660, 1615, 1600, 1500 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 3,42 (t, 2H, J = 7); 3,82 (s, 3H); 4,60 (t, 2H, J = 7); 6,60 (m, 1H); 6,93 (d, 2H, J = 9); 7,09 (m, 2H); 7,20-7,28 (m, 4H); 7,56 (d, 2H = 8); 7,60 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 8,59 (bs, 1H); 10,96 (bs, 1H).
5-[[(3-clorofenil)amino]carbonil]amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina (56)
producción 99%, sólido amarillo pálido, p.f. 183-184°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3245-2960, 1665, 1610, 1515 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 2,46 (m, 2H); 2,73 (t, 2H, J = 7); 4,43 (t, 2H, J = 7); 6,66 (m, 1H); 7,19-7,40 (m, 8H); 7,59 (d, 1H, J = 8); 7,64 (s, 1H); 7,85 (m, 1H); 8,25 (s, 1H); 8,67 (bs, 1H); 11,30 (bs, 1H).
5-[[(4-metoxifenil)amino]carbonil]amino-8-(3-fenilpropil) -2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina (57)
producción 98%, sólido amarillo pálido, p.f. 174-175°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3240-2950, 1665, 1615, 1510 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 2,46 (m, 2H); 2,73 (t, 2H, J = 7); 4,42 (t, 2H, J = 7); 6,67 (m, 1H); 6,96 (d, 2H, J = 9); 7,22-7,41 (m, 6H); 7,60 (d, 2H, J = 8); 7,64 (s, 1H); 8,25 (s, 1H), 8,65 (bs, 1H); 11,16 (bs, 1H).
Ejemplo 4 Preparación de 5-[(Bencil)carbonil]amino-8-(ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina(Compuestos 58-59)
Se puede preparar 5-[(bencil)carbonil]amino-8-(ar)alquil-2 -(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina según la estrategia sintética que se muestra en el siguiente esquema IX.
Esquema IX Procedimientos generales para la preparación de 5-(bencil)carbonil]amino-8-(ar)alquil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (58-59)
En la preparación de compuestos 58-59, se disolvió el compuesto amino apropiado (38 o 41) (10 mmol) en THF acabado de destilar (15 ml) y se le añadió el haluro ácido adecuado (13 mmol) y trietilamina (13 mmol). Se llevó la mezcla a reflujo bajo atmósfera de argón durante 18 horas. Se eliminó el solvente bajo presión reducida y se disolvió el residuo en EtOAc (30 ml) y
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se lavó dos veces con agua (15 ml). La fase orgánica se secó en Na_{2}SO_{4} y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía flash (EtOAc-petróleo ligero 4:6) para conseguir los compuestos 58,59 deseados. Siguiendo este procedimiento general se prepararon los siguientes compuestos:
5-[(bencil)carbonil]amino-8-isopentil-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina (58)
producción 85%, sólido amarillo pálido, p.f. 144-145°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3255-2930, 1673, 1620, 1610, 1520 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 0,98 (d, 6H, J = 7,5); 1,60 (m, 1H); 1,91 (m, 1H); 4,40 (t, 2H, J = 7), 4,53 (s, 2H); 6,60 (m, 1H); 7,18 (m, 1H); 7,26-7,39 (m, 5H); 7,64 (s, 1H); 8,22 (s, 1H); 9,11 (bs, 1H).
5-[(bencil)carbonil]amino-8-(3-fenilpropil)-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c)pirimidina (59)
producción 95%, sólido amarillo pálido, p.f. 116-117°C (Et_{2}O-petróleo ligero); IR (KBr): 3250-2900, 1675, 1625, 1600, 1500 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta: 2,39 (m, 2H); 2,67 (t, 2H, J = 7); 4,37 (t, 2H, J = 7); 4,53 (s, 2H); 6,61 (m, 1H); 7,16-7,43 (m, 11H); 7,65 (s, 1H); 7,64 (s, 1H); 8,19 (s, 1H); 9,12 (bs, 1H).
Ejemplo 5 Preparación de 1-sustituido-4-ciano-5-aminopirazoles
Según los procedimientos descritos en J. Org. Chem. 1956, 21, 1240; J. Am. Chem. Soc. 1956, 78, 784 y las referencias aquí citadas, se pueden preparar los siguientes compuestos a partir de etoximetilen-malonodinitrilo comercial e hidrazinas N1 sustituidas, que también están disponibles comercialmente:
1-metil-4-ciano-5-aminopirazol
1-n-butil-4-ciano-5-aminopirazol
1-isopentil-4-ciano-5-aminopirazol
1-(2-ciclopentil) etil-4-ciano-5-aminopirazol
1-hidroxietil-4-ciano-5-aminopirazol
1-fenil-4-ciano-5-aminopirazol
1-tert-butil-4-ciano-5-aminopirazol
1-feniletil-4-ciano-5-aminopirazol
1-(2-clorofenil) -4-ciano-5-aminopirazol
Estos compuestos pueden usarse como intermedios para preparar compuestos pirazol-triazol-pirimidina según se describe aquí.
Ejemplo 6 Preparación de 1-sustituido-4-ciano-3-aminopirazoles
Partiendo de 4-ciano-5-aminopirazol, preparado partiendo del procedimiento indicado en Chem. Pharm. Bull, 1970, 18, 2353 o en J. Heterocyclic Chem. 1979, 16, 1113, se pueden preparar 1-sustituido-4-ciano-aminopirazoles por alquilación directa con el haluro de alquilo correspondiente en dimetil formamida a 80°C entre 1 y 2 horas en presencia de carbonato de potasio anhidro. De la mezcla de reacción, que contiene los dos isómeros de posición alquilados N1 y N2 en una relación de alrededor de 1:2, el isómero N2 puede aislarse por una cristalización única o cromatografía de columna con elución de gel de sílice en mezclas de acetato de etilo y éter de petróleo.
Mediante estos procedimientos se pueden preparar los siguientes compuestos:
1-metil-4-ciano-3-aminopirazol
1-butil--4-ciano-3-aminopirazol
1-bencil-4-ciano-3-aminopirazol
1-isopentil-4-ciano-3-aminopirazol
1-feniletil-4-ciano-3-aminopirazol
Estos compuestos pueden usarse como intermedios para preparar los compuestos pirazol-triazol-pirimidina aquí descritos.
Ejemplo 7 Preparación de feniletil-4-ciano-3-aminopirazoles
a) Se añade una suspensión de carbonato de potasio anhidro (30 mmol) en DMF (50 ml) con 3-amino-4-ciano pirazol (20 mmol), se calienta a una temperatura de 80°C durante 30 minutos. A la suspensión se le añade bromuro de fenetilo (25 mmol) y se calienta a 80°C durante 2 h. Una vez enfriado a temperatura ambiente, la mezcla se evapora al vacío hasta sequedad y el residuo resultante se recoge con agua destilada (100 ml) y se extrae con acetato de etilo (3 x 50 ml). Los extractos orgánicos combinados se desecan con sulfato de sodio anhidro y se evaporan al vacío hasta sequedad. El residuo resultante está formado por una mezcla en proporción 1:3 de 1-feniletil-4-ciano-5 -aminopirazol (20%) y de 1-feniletil-4-ciano-3-aminopirazol (60%) que pueden usarse como en el Ejemplo 9, o bien cromatografiados en una columna de gel de sílice usando como diluyente una mezcla acetato de etilo/hexano para conseguir: 1-feniletil-4-ciano-5-aminopirazol, P.F. 172-173°C; (20%); ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,04 (t, 2H); 4,12 (t, 2H); 5,85 (sb, 2H); 7,21-7,30 (m, 5H); 7,41 (s, 1H); 1-\beta -feniletil-4-ciano-3-aminopirazol, P.F. 98-100°C (60%); ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 3,07 (t, 2H); 4,10 (t, 2H); 4,23 (sb, 2H); 7,17 (s, 1H); 7,00-7,28 (m, 5H).
b) Se lleva a reflujo una solución de 1-\beta-feniletil -4-ciano-5-aminopirazol (20 mmol) en trietil ortoformato (40 ml) bajo atmósfera de nitrógeno durante 8 h. El exceso de ortoformato se evapora al vacío hasta sequedad y el aceite amarillo residual se disuelve en éter etílico y se percola en gel de sílice para dar el iminoéter correspondiente (producción del 98%). El residuo obtenido tras la evaporación del ortoformato es prácticamente puro y se usa directamente en el siguiente paso. Se lleva a reflujo entre 5 y 10 una solución del iminoéter (20 mmol) y de hidrazida de ácido 2-furoico (2,5 gr., 22 mmol) en 2-metoxietanol (50 ml) h. Una vez enfriada, la solución se evapora hasta sequedad para conseguir un residuo oleoso que se somete a ciclización térmica en difeniléter (50 ml) usando un aparato Dean-Stark para la eliminación azeotrópica del agua formada durante la reacción. Pasadas 1,5 h., se comprueba la reacción en TLC (acetato de etilo:éter de petróleo 2:1) y cuando el compuesto de partida esté completamente ausente, se enfría la mezcla y se le añade hexano. Se filtra y cristaliza el precipitado resultante para obtener 7-(\beta-feniletil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c]-pirimidina, P.F. 174-175°C (20%) ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,23 (t, 2H) 4,74 (t, 2H); 6,75 (s, 1H); 7,14-7,17 (m, 5H); 7,28 (s, 1H); 7,98 (s, 1H); 8,53 (s, 1E); 9,56 (s, 1H).
De forma parecida, partiendo de 1-\beta-feniletil-4-ciano-3-aminopirazol, se preparó 8-(\beta-feniletil)-2-(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]-pirimidina; P.F. 268-279°C (600A) ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,32 (t, 2H); 4,72 (t, 2H); 6,73 (s, 1H); 7,23 (m, 5H); 7,95 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 9,41 (s, 1H).
c) Se lleva a reflujo una suspensión del producto obtenido en el paso b) (10 mmol) en 10% HCl (5,0 ml) bajo agitación durante 3 h. Una vez enfriada, la solución se alcaliniza con hidróxido de amonio concentrado a 0°C y el precipitado se filtra o se extrae con acetato de etilo (3 x 100 ml), se seca y se evapora al vacío hasta sequedad para obtener el correspondiente 1-(\beta-feniletil)-4 -[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-yl]-5-amino pirazol, p.f. 175-176°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,15 (t, 2H); 4,48 (t, 2H); 5,78 (s, 1H); 6,37 (s, 1H); 6,68 (s, 1H); 7,1 (s, 1H); 7,27-7,28 (m, 5H); 7,82 8s, 1H); 14,51 (sb, 2H): de forma parecida se obtiene 1-(\beta-feniletil)-4-[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-yl) -3-aminopirazol (, p.f. 205-206°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,12 (t, 2H); 4,46 (t, 2H); 5,75 (s, 1H); 14,41 (sb, 2H).
d) Se añade cianamida (60 mmol) a una suspensión de amina del paso c) (10 mol en N-metilpirrolidona (40 ml) seguido de ácido sulfónico de p-tolueno (15 mmol)). Se calienta la mezcla a 160°C bajo agitación. Transcurridas 4 h se añade una segunda porción de cianamida (60 mmol) y se continúa calentando durante la noche. Entonces, se trata la mezcla con agua caliente (200 ml) y el precipitado se filtra, se lava con agua y se cristaliza con etanol para obtener el correspondiente 5-amino-7-(\beta-feniletil)-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina p.f. 225-226°C. ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,21 (t, 2H); 4,51 (t, 2H); 6,65 (s, 1H); 7,1-7,44 (m, 5H, átomo y 1H); 7,65 (sb, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,45 (s, 1H).
De manera similar se consiguió 5-amino-8-(\beta -feniletil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina p.f. 212-213°C. ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,21 (t, 2H); 4,53 (t, 2H); 6,7 (s, 1H); 7,1-7,4 (m, 5H, átomo y 1H); 7,56 (sb, 2H); 7,93 (s, 1H); 8,45 (s, 1H); 8,45 (s, 1H).
Ejemplo 8 Preparación de 4-ciano-5-amino-1,2,3-triazoles
Se añade una suspensión de carbonato de potasio (0,23 mol) en DMSO (70 ml) con cianoacetamida (70 mmol) y p-fluorobencilazida (54,5 mmol). La solución resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 h y se vierte en un gran volumen de agua (1,5 1). El sólido separado se filtra, se lava con agua y seca en horno a 70°C para obtener 1-(p-fluorobencil)-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol (producción del 961%). P.F.: 198-199°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 7,5-7,1 (m, 6H); 6,4 (s, 2H), 5,4 (s, 2H). Se añade una suspensión de amida (0,005 mol), agitada y enfriada a 0°C, en DMF (5 ml), con oxicloruro fosforoso (0,01 mol). La solución resultante se agita durante 5 minutos a 0°C, 10 minutos a 25°C y 15 minutos a 80°C. Una vez enfriada a temperatura ambiente, se añaden 5 ml de N HCl y se lleva la mezcla a reflujo durante 5 minutos. 1-(p-fluorobencil)-4 -ciano-5-amino-1,2,3-triazol se separa de la solución enfriada (producción 90%). P.F. 185-186°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 7,3-7,0 (m, 6H), 5,5 (s, 2H); IR (KBr): 3400, 3200, 2220, 1655 cm^{-1}.
De manera análoga, se prepararon los siguientes compuestos:
1- ó 2-bencil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
1- ó 2-(o-fluorobencil)-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
1- ó 2-(p-fluorobencil)-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
1- ó 2-butil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
1- ó 2-isopentil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
1- ó 2-(2-metoxietil)-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
2-heptil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol
1- ó 2-octil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol.
Estos compuestos pueden usarse como intermedios para preparar los compuestos triazol-triazol-pirimidina aquí descritos.
Ejemplo 9 Preparación de heterociclos etoximetilenamino
La preparación de heterociclos etoximetilenamino de fórmula IV se realiza llevando a reflujo los orto-aminonitrilos respectivos con etil ortoformato. A modo de ejemplo, se presenta la preparación de 4-ciano-5 -(etoximetilenamino)-1-butilpirazol. Se calienta una solución de 4-ciano-5-amino-1-butilpirazol (20 mmol) en trietil ortoformato (40 ml) a su temperatura de reflujo bajo atmósfera de nitrógeno durante 8 h. El exceso de ortoformato se evapora al vacío hasta sequedad y el aceite amarillo residual se disuelve en éter de etilo y se utiliza gel de sílice como diluyente para obtener el compuesto puro (producción 87%). En muchos casos, el residuo obtenido tras la evaporación del ortoformato es sustancialmente puro y se usa de ese modo en el siguiente paso. IR (nujol): 3140, 2240, 1640 cm^{-1}; ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 8,4 (s, 1H); 7,9 (s, 1H); 4,5 (t, 2H); 4,3 (q, 2H); 1,8 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 1,4 (t, 3H); 0,9 (t, M).
Ejemplo 10 Ciclización de heterociclos etoximetilenamino
Se lleva a reflujo entre 5 y 10 h una solución del heterociclo etoximetilenamino (20 mmol) e hidrazida de ácido 2-furoico (2,5 g, 22 mmol) en 2-metoxietanol. Una vez enfriada, la solución se evapora hasta estar totalmente seca para obtener un aceite residual que se somete a ciclización térmica en difenil éter (50 ml) mediante un frasco de fondo redondo con un aparato Dean-Stark, para la eliminación azeotrópica del agua formada durante la reacción. Pasado un tiempo variable (entre 3 y 5 h) se comprueba la solución por TLC (2:1 acetato de etilo:éter de petróleo) y una vez ha desaparecido el producto inicial, se enfría la mezcla y se añade hexano. El precipitado resultante se filtra y cristaliza con el disolvente adecuado. En algunos casos, un aceite viscoso se separa de la solución, que entonces se decanta y se extrae posteriormente. El residuo oleoso se cromatografía en gel de sílice y se diluye con mezclas de acetato de etilo/éter de petróleo, para obtener el compuesto tricíclico VI.
A modo de ejemplo, se presentan las características analíticas y espectroscópicas de algunos compuestos preparados según estos procedimientos:
7-butil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e], 2,4-triazol[1,5c]pirimidina
^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 9,6 (s, 1H); 8,6 (m, 1H); 7,4 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,5 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 1,3 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).
8-butil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e],2,4-triazol[1,5c]pirimidina
^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 9,4 (s, 1H); 8,9 (s, 1H); 8,0 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,2 (m, 1H); 4,5 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 0,9 (m, 3H). En el espectro 2D-NMR (NOESY), la resonancia de la señal N-CH_{2} a 4,5 presenta picos de cruce con la señal C9-H resonando a 8,0.
7-isopentil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
^{1}H NMR (CDCl_{3}): 9,1 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 7,7 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,6 (m, 1H); 4,6 (t, 2H); 1,18-1,7 (m, 3H); 1,0 (d, 6H).
8-isopentil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c]pirimidina.
9.1 (s, 1H); 8,8 (s, 1H); 7,7 (m, 1H); 7,3 (m, 1H); 6,6 (m, 1H); 4,6 (t, 2H); 1,9-1,5 (m, 3H); 1,0 (d, 6H).
Siguiendo este procedimiento se prepararon los siguientes compuestos:
7-metil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-metil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-(2-clorofenil)-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-fenietil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-tert-butil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-(ciclopentil)etil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-bencil-2(2-furil)-pirazol-[4,3-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-bencil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-(2-fluorobencil)-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-(4-fluorobencil)-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-butil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-isopentil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-(metoxi)etil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
7-heptil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina
7-octil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-bencil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-(2-fluorobencil)-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-(4-fluorobencil)-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-butil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-isopentil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-hexil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-heptil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
8-octil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
9-bencil-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina
9-(2-fluorobencil)-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina.
9-(4-fluorobencil)-2(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina.
Estos compuestos pueden usarse como intermedios para preparar las triazol-triazol-pirimidinas y pirazol-triazol-pirimidinas aquí descritas.
Ejemplo 11 Preparación de 5-amino-7-[aralquilo)]-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidinas
Se añade una suspensión de las aminas de fórmula VII (10 mmol) en N-metilpirrolindona (40 ml) con cianamida (60 mmol) seguido de ácido sulfónico de p-tolueno (15 mmol). Se calienta la mezcla a 160ºC con agitación magnética. Pasadas 4 h, se añade una segunda porción de cianamida (60 mmol) y se continúa el calentamiento durante la noche. Entonces se trata la mezcla con agua caliente (200 ml) y se filtra el sólido precipitado, se lava con agua y se cristaliza con etanol. Si no tiene lugar la precipitación, la solución se extrae con acetato de etilo (4 x 100 ml), se lavan los extractos con salmuera (2 x 50) y se secan y se evaporan al vacío hasta sequedad. El residuo se cromatografía en una columna de gel de sílice usando acetato de etilo como diluyente.
A continuación, se indican los datos analíticos y espectroscópicos de algunos compuestos preparados según este procedimiento:
5-amino-7-butil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c]pirimidina. P.F. 157-158°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,1 (s, 1H); 8,0 (s, 2H); 7,9 (m, 1H); 7,2 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,2 (t, 2H); 1,9 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).
5-amino-8-butil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c]pirimidina. P.F. 183-185°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,6 (s, 1H); 8,0 (s, 1H); 7,6 (s, 2H), 7,2 (m, 1H); 6,7 (m, 1H); 4,2 (t, 2H); 1,8 (m, 2H); 1,2 (m, 2H); 0,9 (t, 3H).
5-amino-7-bencil-2-(2-furil)-1,2,3-triazol[5,4-e] 1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina. P.f. 295-297°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,5 (s, 2H); 8,0 (s, 1H); 7,3 (m, 6H); 6,7 (m, 1H); 5,7 (s, 2H).
5-amino-7-o-fluoro-bencil-2-(2-furil)-1,2,3 -triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina P.f. 310-312°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,5 (s, 2H); 8,0 (s, 1H); 7,3 (m, 5H); 6,8 (s, 1H); 5,75 (s, 2H).
5-amino-7-metil-(2-furil)-1,2,3-triazol[4,3-e]1,2,4 -triazol[1,5-c]pirimidina; p.f. 210-213°C. 5-amino-7-tert-butil-(2-furil)-1,2,3-triazol[4,3-e] 1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina; p.f. 238-240°C.
5-amino-2-(2-furil)-pirazol [4,3-e]-1,2,4-triazol [1,5-c] pirimidina; p.f. 248-250°C.
5-amino-7-(2-hidroxietil)-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e] 1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina; p.f. 258-260°C.
5-amino-7-fenil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina; p.f. 295-297°C.
5-amino-7-isopentil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol [1,5-c]pirimidina; p.f. 208-210°C.
5-amino-8-isopentil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol [1,5-c]pirimidina; p.f. 295-297°C.
5-amino-7-fenetil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol [1,5-c]pirimidina; p.f. 225°C.
5-amino-7-benciloxietil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4 -triazol [1,5-c]pirimidina.
5-amino-7-[\beta-(4-isobutilfenetil)]-2-(2-furil) -pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina; p.f. 207-210°C.
Estos compuestos pueden hacerse reaccionar con un derivado de ácido o ácido sulfónico adecuado para conseguir los compuestos de fórmula I aquí presentados.
Ejemplo 12 Preparación de sustituido-4-carboxamido-5-amino-1,2,3-triazoles
Se añade p-fluorobencilazida (15,1 g, 0,1 mol) y cianacetamida (10,8 g, 0,13 mol) en este orden a una suspensión de carbonato de potasio en polvo (57,5 g, 0,42 mol) en dimetilsulfóxido (150 ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 1 h. Se vierte la mezcla en 3 litros de agua y el sólido que se separa, se filtra y se lava con agua para obtener 22,47 g (96%) de p-fluorobencil -4-carboxamido-5-aminol,2,3-triazol. P.F.: 198-199°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 7,5-7,1 (m, 6H); 6,4 (s, 2H); 5,4 (s, 2H).
De forma análoga se obtiene, 2-fluoro-6 -clorobencii-4-carboxamida-5 amino-1,2,3-triazol; p.f. 230-231°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 5,40 (s, 2H); 6,47 (sb, 2H); 7,00-7,52 (m, 6H).
3-fluorobencil-4-carboxamida-5 amino-1,2,3 -triazol; p.f. 211-211°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 5,46 (s, 2H); 6,47 (sb, 2H); 7,00-7,52 (m, 6H).
2-fluorobencil-4-carboxamida-5 amino-1,2,3 -triazol; p.f. 195-197°C.
2-(\beta-feniletil)-4-carboxamida-5 amino-1,2,3 -triazol; p.f. 181-183°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,04 (t, 2H); 4,35 (t, 2H); 6,30 (sb, 2H), 7,20-7,47 (m, 7H).
Ejemplo 13 Preparación de 4-ciano-5-amino-1,2,3-triazoles sustituidos
A una suspensión de 1-p-fluorobencil-4 -carboxamido-5-amino-1,2,3-triazol (23,4 g, 0,2 mol) en DMF (100 10 ml), agitada magnéticamente a 0°C, se le añade 20,8 ml (0,2 mol) de POCl_{3}. Se agita la solución durante 5 h a 0°C, 10 h a temperatura ambiente y finalmente 15 h a 80°C. Una vez enfriada, se añade 1 N HCl (100 ml) y la solución resultante se lleva a reflujo durante 5 h. Una vez enfriada se precipita 1,5 p-fluorobencil-4-carboxamido-5-amino -1,2,3-triazol (18,54 g, 90%). P.F. 185-186°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}):7,3-7,0 (m, 6H); 5,5 (s, 2H); IR (KBr): 3400, 3220, 2220, 1655 cm^{-1}.
De forma análoga se obtienen los siguientes compuestos:
2-fluoro-6-clorobencil-4-ciano-5-amino-1,2,3 -triazol; P.F. 181-185°C ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 5,40 (s, 2H); 7,26-7,50 (m, 5H).
3-fluorobencil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol; P.F. 195-197°C ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 5,44 (s, 2H); 7,00-7,43 (m, 6H).
2-fluorobencil-4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol; P.F. 195-197°C.
1-(\beta-feniletil)- 4-ciano-5-amino-1,2,3-triazol; P.F. 149-150°C ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,04 (t, 2H); 4,36 (t, 2H); 7,03 (sb, 2H); 7,23-7,28 (m, 5H).
Ejemplo 14 Preparación de 4[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-yl] -5-amino-1,2,3-triazoles sustituidos
Una suspensión de 1-p-fluorobencil-4-ciano-5 -amino-1,2,3-triazol (20 mmol) e hidrazida del ácido 2-furoico (22 mmol) en difenil éter (30 ml) se agita y se calienta a reflujo (260°C) con un aparato Dean-Stark hasta que el compuesto de partida desaparezca (TLC, 1 a 2 h). Una vez enfriada la mezcla se diluye en éter de petróleo y el precipitado resultante se filtra o separa por decantación y se cromatografía en una columna de gel de sílice utilizando como eluyentes acetato de etilo y éter de petróleo en una proporción de 2:1.
1-p-fluorobencil-4 [3 (2-furil) -1,2,4-triazol-5-yl] -5amino-1,2,3-triazol; p.f. 266-268°C ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 14,5 (s, 1H); 7,8 (s, 1H); 7,4-7,1 (m, 5H), 6,6 (s, 1H); 6,5 (s, 2H), 5,5 (s, 2H).
De forma análoga se obtiene 1-(\beta-feniletil) - 4[3(2-furil)-1,2,4-triazol-5-yl]-5-amino-1,2,3-triazol (50%); p. f. 200-202°C ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 3,07 (t, 2H); 4,16 (t, 2H); 5,50 (sb, 2H); 6,61 (s, 1H), 6,95 (s, 1H); 7,2-7,4 (m, 5H); 7,78 (s, 1H); 13,8 (sb, 1H).
Ejemplo 15 Preparación de 5-amino-2-(2-furil)1,2,3-triazol [5,4-e] 1,2,4-triazol [1,5-c] pirimidinas con sustituyentes en la posición 7
A una suspensión de 1-p-fluorobencil-4[3(2 -furil)1,2,4-triazol-5-yl-5 amino-1,2,3 triazol (0,325 g, 1 mmol) en N- metilpirrolidona (4 ml) se le añade cianamida (6 mmol) seguida de ácido sulfónico de p-tolueno (1,5 mmol). Se calienta la mezcla a 160°C con agitado magnético. Pasadas 4 h, se añade una segunda porción de cianamida (6 mmol) y se continúa el calentamiento durante la noche. Entonces la mezcla se trata con agua caliente (20 ml) y el sólido precipitado se filtra, se lava con agua y se cristaliza con etanol. Si no tiene lugar ninguna precipitación, la solución se extrae con acetato de etilo (4 x 10 ml), los extractos se lavan con salmuera (2 x 5 ml), se secan y se evaporan al vacío hasta sequedad. Entonces el residuo se cromatografía en una columna de gel de sílice con acetato de etilo como diluyente para conseguir 105 mg (producción 30%) de 5-amino-7-p-fluoro -bencil-2-(2-furil)1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c] pirimidina. P.F.: 266-268°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,5 (sb, 2H); 7,95 (s, 1H); 7,4-7,1 (m, 6H); 6,7 (s, 1H); 5,7 (s, 2H).
De forma análoga, se obtuvo:
5-amino-7-o-fluorobencil-2-(2-furil)1,2,3 -triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina. P.F.: 310°C.
5-amino-7-(2-fluoro-6-clorobencil)-2-(2-furil)1,2,3 -triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina. P.F.: 218-220°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,51 (sb', 2H); 7,98 (s, 1H); 7,55-7,28 (m, 4H); 6,77 (m, 1H); 5,73 (s, 2H).
5-amino-7-(m-fluorobencil)-2-(2-furil)1,2,3 -triazol[5,4-e]1,2,4-triazol[1,5-c]pirimidina. P.F.: 280-283°C; ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 8,45 (bs, 2H); 7,98 (s, 1H); 7,4-7,1 (m, 5H); 6,76 (s, 1H); 5,75 (s, 2H).
5-amino-7-(\beta-fenietil)-2-(2-furil)1,2,3-triazol[5,4-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina. P.F.: 269-271°C; ^{1}H NMR
(DMSO-d_{6}): 8,4 (sb, 2H); 7,98 (s, 1H); 7,3-7,15 (m, 6H); 6,8 (s, 1H); 4,71 (t, 2H); 3,31 (t, 2H).
Ejemplo 16 Compuestos adicionales
Usando la química descrita anteriormente, se prepararon los siguientes compuestos adicionales:
18
Comp. No. R R1
60 H H
61 H 4-MeO-Ph-NHCO
62 H 3-Cl-Ph-NHCO
63 t-C4H9 H
64 t-C4H9 4-MeO-Ph-NHCO
65 t-C4H9 3-Cl-Ph-NHCO
66 CH3 Ph-NHCO
67 CH3 4-SO3H-Ph-NHCO
68 CH3 3,4-Cl2-Ph-NHCO
69 CH3 3,4-(OCH2-O)-Ph-NHCO
70 CH3 4-(NO2)-Ph-NHCO
71 CH3 4-(CH3)-Ph-NHCO
72 CH3 Ph-(CH2)-CO
73 C2H5 Ph-NHCO
74 C2H5 4-SO3H-Ph-NHCO
75 C2H5 3,4-Cl2-Ph-NHCO
76 C2H5 3,4-(OCH2-O)-Ph-NHCO
77 C2H5 4-(NO2)-Ph-NHCO
78 C2H5 4-(CH3)-Ph-NHCO
79 C2H5 Ph-(CH2)-CO
80 n-C3H7 Ph-NHCO
81 n-C3H7 4-SO3H-Ph-NHCO
82 n-C3H7 3,4-Cl2-Ph-NHCO
(Continuación)
Comp. No. R R1
83 n-C_{3}H_{7} 3,4-(OCH_{2}-O)-Ph-NHCO
84 n-C_{3}H_{7} 4-(NO_{2})-Ph-NHCO
85 n-C_{3}H_{7} 4-(CH_{3})-Ph-NHCO
86 n-C_{3}H_{7} Ph-(CH_{2})-CO
87 n-C_{4}H_{9} Ph-NHCO
88 n-C_{4}H_{9} 4-SO_{3}H-Ph-NHCO
89 n-C_{4}H_{9} 3,4-Cl_{2}-Ph-NHCO
90 n-C_{4}H_{9} 3,4-(OCH_{2}-O)-Ph-NHCO
91 n-C_{4}H_{9} 4-(NO_{2})-Ph-NHCO
92 n-C_{4}H_{9} 4-(CH_{3})-Ph-NHCO
93 2-(\alpha-naftil)etiI Ph-(CH_{2})-CO
94 2-(\alpha-naftil)etiI H
95 2-(\alpha-naftil)etiI 4-MeO-Ph-NHCO
96 2-(\alpha-naftil)etiI 3-Cl-Ph-NHCO
97 2-(2,4,5-tribromo-fenil)etil H
98 2-(2,4,5-tribromo-fenil)etil 4-MeO-Ph-NHCO
99 2-(2,4,5-tribromo-fenil)etil 3-Cl-Ph-NHCO
100 2-propen-1-il 4-MeO-Ph-NHCO
Ejemplo 17 Evaluación de la actividad biológica de los compuestos
Muchos de los compuestos descritos anteriormente han sido estudiados para comprobar su afinidad con los receptores de rata A_{1} y A_{2} y con los receptores humanos A_{3} mediante los siguientes estudios.
Ensayo de unión del receptor A_{1} y A_{2} de adenosina en ratas
Se decapitó ratas macho Wistar (200-250 g) y se diseccionó en hielo el cerebro y el estriado. Los tejidos se alteraron en un homogeneizador Polytron en posición 5 durante 30 seg. a 25 volúmenes de 50 nM Tris HCl, ph 7,4, con 10 nM de MgCl_{2}. Se centrifugó el homogenado a 48.000 durante 10 minutos y se resuspendió el pellet en el mismo tampón con 2 IU/mL adenosina deaminasa. Pasados 30 minutos de incubación a 37°C, se centrifugaron las membranas y se guardaron los pellet a -80°C. Antes de su congelación, se retiró un alíquota del homogenado para analizar las proteínas con albúmina bovina como estándar de referencia. Los análisis de unión se realizaron sobre el cerebro y las membranas del núcleo estriado de ratas, respectivamente, en presencia de 10 nM MgCl_{2} a 25°C. Todas las soluciones tampón se ajustaron para mantener un pH constante de 7,4.
Se realizaron experimentos de desplazamiento en 500 \mum de tampón Tris HCl con contenido en 1 nM del ligando del receptor selectivo de adenosina A_{1} [^{3}H]CHA(N^{6}-ciclohexil adenosina) y membranas de cerebro de rata (150-200 \mug de proteína/estudio).
Se realizaron experimentos de desplazamiento en 500 \mum de tampón Tris HCl con 10 nM MgCl_{2}, 0,2 nM del ligando del receptor selectivo A_{2A} de adenosina [^{3}H]SCH58261 (5-amino-7-(2-feniletil)-2(2-furil)-pirazol[4,3-e]-1,2,4 -triazol[1,5-c]pirimidina) y membranas del estriado de rata (80-100 \mug de proteína/ensayo). Para determinar los valores IC_{50} (donde IC_{50} es la concentración del inhibidor que desplaza el 50% del ligando marcado) el compuesto de análisis se añadió por triplicado a las muestras del ensayo de unión a un mínimo de seis concentraciones diferentes. La separación de la unión del radioligando libre se realizó por filtración rápida a través de filtros Whatman GF/B que fueron lavados tres veces con tampón helado. La radioactividad unida a los filtros se midió por espectrometría de centelleo líquido después de añadir 5 ml de Aquassure. La unión no específica se definió como unión en presencia de 10 \mum R-PIA (N^{6}(fenilisopropil)adenosina) y 10 \muM NECA (5'-etilcarboxamido)adenosina), respectivamente, y siempre representó un 10% de la unión total. El tiempo de incubación osciló entre 150 min. a 0°C y 75 min. a 30°C según los resultados de experimentos realizados previamente. Los valores Ki se calcularon de la ecuación Cheng-Prusoff. Todos los datos de unión se analizaron mediante el programa informático LIGAND para el ajuste de curvas de regresión no lineal.
Ensayo de unión del receptor A_{3} de adenosina clonado de humanos
Se utilizó un alícuota de membranas (8 \mum de proteína/ml) de células HEK-293 transfectadas con el receptor A_{3} recombinante humano de adenosina para realizar los ensayos de unión. La Figura 1 muestra una saturación típica de [^{125}I]AB-MECA (N^{6}(4-amino-3-yodobencil)-5'- (N-metilcarbamoil)adenosina) de las células HEK-293. Los experimentos de inhibición se realizaron por duplicado con un volumen final de 100 \mul en tubo de ensayo con contenido de 0,3 nM [^{125}I] AB-MECA, 50 nM tampón Tris HCl, 10 mM MgCl_{2}, ph 7,4, y 20 \mul de membranas diluidas (12,4 mg de proteína/ml), y como mínimo 6-8 concentraciones diferentes de antagonistas típicos del receptor de adenosina. La unión no específica se definió en presencia de 50 \mum R-PIA y supuso alrededor del 30% de la unión total. El tiempo de incubación fue de 60 min. a 37°C, según los resultados de experimentos conducidos previamente. La radioactividad unida y libre se separó filtrando la mezcla de ensayo a través de filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B usando un cosechador de células Brandel.
Resultados y discusión
Se realizaron estudios de unión de radioligandos de los compuestos 34-59 para detectar su afinidad respecto a los receptores A_{1}, A_{2} de cerebro de rata, y a los receptores A_{3} humanos, y los resultados se resumen en la Tabla 1.
Los datos demuestran que los compuestos a los que les faltan grupos voluminosos (compuestos 38, 40 y 41) en la posición N^{5} muestran gran afinidad por los receptores A_{2A} de adenosina, con poca selectividad respecto A_{1} y baja afinidad por el subtipo de receptor humano A_{3} de adenosina, y que los compuestos con una cadena de fenilcarbamoilo sustituido en la posición N_{5} poseen afinidad a escala nanomolar con el subtipo de receptores hA_{3} con diferentes grados de selectividad respecto el subtipo de receptores A_{1} y A_{2}, En particular, la porción 4-metoxifenilcarbamoilo (compuestos 51, 55 y 57) confiere una mayor afinidad, de un orden de magnitud de alrededor de 3, en comparación con la porción 3-clorofenilcarbamoilo (compuestos 50, 54 y 56).
La introducción en la posición N^{8} de cadenas con características estéricas diferentes, permite el diseño de derivados con una elevada potencia en receptores humanos A_{3} de adenosina y una mejor selectividad en comparación con los subtipos de receptores A_{1} y A_{2A}.
La Figura 1 muestra una curva de saturación de [^{125}I]AB-MECA al receptor A_{3} de adenosina y la linearidad de la representación de Scatchard en el diagrama es indicativa, en nuestras condiciones experimentales, de la presencia de una clase de centros de unión con un valor K_{D} de 0,9 \pm 0,01 nM y un valor Bmax de 62 \pm 1 fmol/mg de proteína (n = 3).
19
20
21
Los datos demuestran que los sustituyentes de cadena corta (C_{1-3}) en la posición 8 de los compuestos 5-[[fenil sustituido)amino] carbonil]amino-8-(ar)alquil-2-(2 -furil)-pirazol[4,3-e]1,2,4-triazol [1,5-c]pirimidina aquí descritos, en particular, los grupos metil, etil y propil, se prefieren a cadenas más largas como las de los grupos pentil y hexil. Particularmente, los compuestos 45 y 47, los compuestos sustituidos con 8-metil, 8-etil y 8-propil, 5-(4-metoxifenil) mostraron la afinidad y selectividad más elevada, y además, se considera que poseen la afinidad y selectividad más elevada para el subtipo de receptor humano A_{3} de adenosina (hA_{3}) de cualquier compuesto sintetizado.
Las cadenas de metilo, etilo y propilo pueden sustituirse con grupos fenil o fenil sustituido, y aún así presentarían una afinidad y selectividad bastante elevada para el subtipo de receptor A_{3}, aunque la afinidad se reduce por un factor de entre 10 y 100. No obstante, el compuesto con una cadena \beta-feniletil en N^{8} y cadena 4-MeO-fenilcarbamoilo en la posición N^{5} (compuesto 55) mostraron un valor relativamente bueno en cuanto a afinidad y selectividad (K_{i}hA_{3} = 1,47 nM, rA_{1}/hA_{3} = 872, rA_{2A}/hA_{3} = 951).
Incluso con una presencia relativamente alta de grupos pentil presente en los compuestos 50 y 51, los compuestos muestran una afinidad relativamente alta para el receptor A_{3} (81,10 y 29,57 nm, respectivamente), a pesar de que la selectividad cae en un factor de alrededor de 10 a 100.
Estudios previos demostraron que la afinidad de compuestos 5-amino-8-(ar)alquil-2-(2-furil)-pirazol[4,3-3] 1,2,4-triazol[1,5-c]-pirimidina para el subtipo de receptor A_{2} de adenosina tendían a aumentar en función del tamaño del grupo en la posición 8. Al parecer la tendencia opuesta funciona para la afinidad de los compuestos aquí descritos para el subtipo de receptor A_{3}. Los sustituyentes C_{1-3} parecen representar las características estéricas y lipofílicas ideales para su interacción con el subtipo de receptor A_{3}.
Ejemplo 18 Experimentos de unión con un compuesto radiomarcado
Se realizó una serie de experimentos de unión en varias líneas de células tumorales, utilizando 0,5 nM [^{125}I]AB-MECA, con una unión no específica determinada en presencia de 50 \muM R-PIA o 200 Mm NECA, en las membranas celulares de las líneas de células. La unión específica se determinó restando la unión no específica de la unión total. Las líneas de células fueron HL 60, NB4, SKN-MC, SKN-Be2C, SKN-SH y JURKAT. Los resultados de los experimentos de unión se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2
Líneas de Unión Unión no Unión Porcentaje
células total específica específica de unión
(cpm) específica
HL 60 3484 2791 693 20
NB4 3377 2740 637 19
SKN-MC 7528 6220 1308 17
SKN-Be2C 6000 4585 1415 24
SKN-SH 2671 2580 91 3
JURKAT 7599 4753 2846 38
Los resultados se muestran en forma de gráfico en la Figura 2.
Las líneas de células Jurkat parecieron dar los mejores resultados de todas las líneas de células analizadas. Se realizó un experimento de saturación usando líneas de células Jurkat a 37°C, con un periodo de incubación de una hora, usando [^{125}I]AB-MECA (0,125-1,5 nM), con unión no específica medida usando RPIA (50 \mum). El Kd (nM) fue 4 y el Bmax (fmol/mg proteína) fue 290. Los resultados también se muestran en la Figura 2.
Se realizó otro estudio para determinar si estaba presente el receptor Al. Se realizó un ensayo de desplazamiento a 0°C durante 150 minutos en células Jurkat usando [^{3}H] DPCPX, un antagonista Al específico (0,5 nM), con unión no específica determinada usando R-PIA (50 \muM). La unión total fue 13208, la unión no específica fue 2997 y la unión específica fue 10211 (77%). En consecuencia, se observó una cantidad significativa de unión A_{1}.
Los siguientes experimentos describieron por primera vez la caracterización de receptores A_{3} en algunas líneas de células tumorales humanas como la HL60, una leucemia promielocítica humana, y Jurkat, células T de la leucemia humana, usando el nuevo antagonista selectivo (Compuesto 102) aquí descrito. En estos estudios, se incubaron membranas (0,5 mg de proteína/ml) de células Jurkat y HL60 con 10-12 concentraciones diferentes del compuesto 102 desde 0,2 a 15 nM y 0,1 a 10 nM para las células Jurkat y HL60 respectivamente. La Figura 3 muestra la curva de saturación de la unión del compuesto 102 a los receptores A_{3} de adenosina en membranas de células Jurkat y la linearidad de la representación de Scatchard en el diagrama es indicativa de la presencia de una clase de centros de unión con un valor Kd de 1,9 \pm 0,2 nM y valor B_{max} de 1,30 \pm 0,03 pmol/mg de proteína (n = 3). La Figura 4 muestra la curva de saturación de la unión del compuesto 102 a los receptores de adenosina A_{3} en membranas HL60 y la linearidad de la representación de Scatchard en el diagrama es indicativa de la presencia de una clase de centros de unión con un valor Kd de 1,2 \pm 0,1 nM y B_{max} de 626 \pm 42 fmol/mg de proteína (n =3).
Estos resultados muestran que muchas líneas de células contienen un número relativamente elevado de receptores de adenosina. Como se sabe que el compuesto 102 une los receptores A_{3} con una elevada afinidad y selectividad, es probable que haya una presencia relativamente elevada de receptores A_{3} en las células tumorales.
Ejemplo 19 Formulaciones farmacéuticas (A) Sistema transdérmico - para 1000 parches
Ingredientes Cantidad
Compuesto activo 100 g
Fluido de silicona 450 g
Dióxido de silicona 2 g
coloidal
(B) Comprimido oral - Para 1000 comprimidos
Ingredientes Cantidad
Compuesto activo 50 g
Almidón 50 g
Estearato de magnesio 5 g
El compuesto activo y el almidón se granulan con agua y se secan. Se añade estearato de magnesio al granulado seco y se mezclan totalmente. Se comprime la mezcla en comprimidos.
(C) Inyección - para 1000, ampollas de 1 ml
Ingredientes Cantidad
Compuesto activo 10 g
Agentes tamponadores q.s.
Propilenglicol 400 mg
Agua para inyección q.s. / 1000 ml
El compuesto activo y los agentes tamponadores se disuelven en el propilenglicol a alrededor de 50°C. Entonces se añade el agua para inyección con agitación y la solución resultante se filtra y se vierte en ampollas que se sellan y se esterilizan mediante autoclave.
(D) Inyección continua - para 1000 ml
Ingredientes Cantidad
Compuesto activo 10 g
Agentes tamponadores q.s.
Agua para inyección q.s. / 1000 ml
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar sin contar más que con la experimentación habitual, muchos equivalentes a las representaciones específicas de la invención aquí descrita. Se pretende que dichos equivalentes queden abarcados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (8)

1. Compuesto de la siguiente fórmula:
22
o
23
caracterizado en que:
A es imidazol, pirazol o triazol;
R es -C(X)R1, -C(X) -N(R_{1})_{2}, -C(X)OR_{1}, -C(X)SR_{1}, - SO_{n}R_{1}, - SO_{n}OR_{1}, - SO_{n}SR_{1} o SO-N(R_{1})_{2};
R_{1} es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, heteroarilo, heterocíclico, alquenilo inferior, alcanoilo inferior, o, si se enlaza con un átomo de nitrógeno, forma entonces junto con este átomo un anillo de azetidina o un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos como N, O, S;
R^{2} es hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, aralquilo, aralquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido o arilo;
R^{3} es furano, pirrol, tiofeno, benzofurano, bencipirrol, benzotiofeno, opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo formado por hidroxilo, acilo, alquilo, alcoxi, alquenilo, alquinilo, alquilo sustituido, alcoxi sustituido, alquenilo sustituido, alquinilo sustituido, amino, amino sustituido, aminoacilo, aciloxi, acilamino, alcarilo, arilo, ariloxi, azido, carboxilo, carboxialquilo, ciano, halo, nitro, heteroarilo, heteroariloxi, heterocíclico, heterociclooxi, aminoaciloxi, oxiacilamino, tioalcoxi, tioalcoxi sustituido, tioariloxi, tioheteroariloxi, -SO-alquilo, -SO-alquilo sustituido, -SO-arilo, -SO- arilo sustituido, -SO-heteroarilo, -SO_{2}-alquilo sustituido, -SO_{2}-arilo, -SO_{2}-heteroarilo y trihalometilo;
X es O, S o NR^{1};
n es 1 o 2; y
sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que R se selecciona del grupo formado por ureas, amidas, tioureas, tioamidas y sulfonamidas.
3. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que R^{1} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo y arilo.
4. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que R^{2} se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquenilo y arilo.
5. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que R^{3} es furano.
6. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que X es O.
7. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que A es un anillo de triazol.
8. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado en que A es un anillo de pirazol.
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