ES2204899T3 - Modelos de animales transgenicos para la enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE LA CONSTRUCCION DE MODELOS ANIMALES PARA EVALUAR LOS POSIBLES TRATAMIENTOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. LOS MODELOS SE CARACTERIZAN POR SU GRAN SIMILITUD CON LAS CONDICIONES NATURALES DE APARICION DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, BASADAS EN LA EXPRESION DE LAS TRES FORMAS DE PROTEINA PRECURSORA BETA-AMILOIDE (PPA), PPA695, PPA751 Y PPA770, Y EN VARIAS MUTACIONES PUNTUALES BASADAS EN MUTACIONES NATURALES, COMO LAS MUTACIONES DEL AMINOACIDO 717 EN LA ENFERMEDAD FAMILIAR DE ALZHEIMER (EFA) EN LONDRES E INDIANA, Y MUTACIONES PREDICHAS EN EL GEN PPA. LOS CONSTRUCTOS DE GEN PPA SE PREPARAN UTILIZANDO EL PROMOTOR NATURAL, O PROMOTORES INDUCIBLES COMO EL PROMOTOR DE METALOTIONINA DEL RATON QUE PUEDEN REGULARSE CON LA ADICION DE METALES PESADOS COMO EL ZINC AL AGUA O A LA DIETA DEL ANIMAL, Y PROMOTORES COMO EL PROMOTOR DE ENOLASA ESPECIFICA DE LA NEURONA DE RATA, PROMOTOR DEL GEN ACTINA BETA HUMANO, PROMOTOR DEL GEN HUMANO DE PLAQUETA DERIVADA DEL CRECIMIENTO DE FACTOR B (PDCF-B), PROMOTOR DEL GEN DE CANAL SODIO DE RATA, PROMOTOR DEL GEN DE PROTEINA BASICA DE MIELINA DEL RATON, PROMOTOR DEL GEN DE DISMUTASA DE SUPEROXIDO DE COBRE-ZINC HUMANO Y PROMOTOR DEL GEN REGULADOR DE TIPO POU MAMALIANO. LOS CONSTRUCTOS SE INTRODUCEN EN EMBRIONES ANIMALES USANDO TECNICAS ESTANDAR COMO LA MICROINYECCION. LAS CELULAS ANIMALES SE PUEDEN AISLAR DE LOS ANIMALES TRANSGENICOS O PREPARAR EMPLEANDO LOS MISMOS CONSTRUCTOS CON TECNICAS ESTANDAR COMO LIPOFECCION O ELECTROPORACION. LOS ANIMALES TRANSGENICOS O LAS CELULAS ANIMALES SE USAN PARA DETECTAR COMPONENTES QUE ALTERAN EL CURSO PATOLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER EVALUADOS POR SUS EFECTOS SOBRE LA CANTIDAD E HISTOPATOLOGIA DE PPA Y PEPTIDA BETA-AMILOIDE EN LOS ANIMALES Y POR ALTERACIONES CONDUCTUALES.

Description

Modelos de animales transgénicos para la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

Se describe la tecnología transgénica para la producción de animales que presenten los síntomas de la enfermedad humana de Alzheimer, ya sea a través de la expresión de la proteína precursora del Alzheimer como de una versión modificada de la misma.

La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden degenerativo del cerebro; fue descrito por primera vez por Alois Alzheimer en 1907, después de examinar a uno de sus pacientes, que sufría una severa disminución de las funciones cognitivas y padecía una demencia generalizada ("The early story of Alzheimer Disease", editado por Bick K. Amaducci L. y Pepeu G. (Raven Press, Nueva York, 1987). Esta enfermedad es la principal causa de demencia en las personas de edad avanzada. Los pacientes con EA presentan una creciente pérdida de la memoria y de las funciones intelectuales, que van evolucionando hasta el punto de volverlos incapaces de comportarse como individuos normales. Simultáneamente a la pérdida de capacidades intelectuales, el paciente presenta trastornos de la personalidad, alteraciones en su conducta social y esquizofrenia ("A guide to the understanding of Alzheimer's Disease and related disorders", editado por Jorm, A.F; (New York University Press, Nueva York 1987). La EA es una enfermedad devastadora, tanto para el enfermo como para su entorno familiar, ya que no hay un tratamiento paliativo o preventivo efectivo que evite la neurodegeneración progresiva. Los problemas más frecuentes del paciente con Alzheimer son: incapacidad para vestirse sin ayuda, agitación diurna, incontinencia urinaria y trastornos del sueño. Los familiares han informado asimismo sobre episodios de desconcierto, ansiedad, depresión, y sobre una progresiva retracción a la vida social.

El impacto de la EA sobre la sociedad y la economía nacional es enorme. Se espera que la demencia en la población de edad avanzada de los Estados Unidos se incremente en un 41% para el año 2000. Resulta una enfermedad cara para los sistemas sanitarios, que deben aportar cuidados institucionales y suplementarios para los pacientes, con un coste anual estimado en 40

\textdollar

billones (Jorm, 1987; Fisher, L.M: New York Times, 23 de Agosto de 1989, D1 "Alzheimer's disease", editado por Reisberg, B., (The Free Press, Nueva York y Londres, 1983). Estos factores suponen que se deba implementar una acción de prevención para disminuir la incidencia de la EA, asignando recursos a la investigación de la misma.

A nivel macroscópico, el cerebro de los pacientes con EA es generalmente más pequeño de lo normal, llegando algunas veces a pesar menos de 1.000 gramos. A nivel microscópico, los síntomas histopatológicos de la EA incluyen nódulos neurofibrilares (NNF), placas neuríticas y degeneración neuronal. Los pacientes con la EA muestran una degeneración de las células nerviosas del córtex frontal y temporal, de las neuronas piramidales del hipocampo, de las neuronas de la parte media, media-central y cortical del núcleo de la amígdala, de las neuronas noradrenérgicas en el locus ceruleus, y de las neuronas del sistema colinérgico del presencéfalo basal. La pérdida neuronal en el sistema colinérgico que se da en la EA, supone el correspondiente déficit de los marcadores colinérgicos presinápticos (Reisberg, 1983; "Alzheimer's Disease and related disorders, research and development" editado por Kelly W.E., (Charles C. Thomas, Springfield, IL. 1984).

La EA se asocia con la presencia de placas neuríticas, que llegan a medir hasta 200 \mum de diámetro, en el córtex, el hipocampo, el subículum, la circunvolución del hipocampo, y la amígdala. Uno de los principales componentes de las placas neuríticas es el amiloide, sustancia susceptible de tinción mediante Rojo Congo (Reisberg, 1983: Kelly, 1984). Las placas amiloideas son extracelulares, aparecen coloreadas en rosa o en color óxido, sobre un campo claro, y son birrefringentes a la luz polarizada. Las placas están compuestas por fibrillas de polipéptido y es frecuente encontrarlas alrededor de los vasos sanguíneos, reduciendo así el suministro de sangre a varias de las neuronas del cerebro.

Se han sugerido varios factores como posibles mecanismos de la neuropatía EA: la predisposición genética, la acción de agentes infecciosos, la presencia de toxinas, de metales, y los traumas craneales. Sin embargo, las evidencias de las que se dispone indican con toda claridad dos distintos tipos de predisposición genética a la EA. En primer lugar, el análisis molecular ha aportado evidencias de mutaciones en el gen de la proteína precursora del amiloide (APP) en ciertas familias con predisposición a la EA (Goate, y col., Nature 349, 704-706 (1991); Murrell, J. y col. Science 254, 97-99, 1991; Chartier-Harlin, M-C, y col. Nature 353, 844-846 (1991). En segundo lugar, para otras familias con una clara predisposición genética a la EA, se aportan mapas de la mutación del cromosoma 21 que es diferente a la del locus del APP (Tanzi, R.E., y col. Nature, 331, 528-530 (1988).

Las placas de amiloide están presentes de forma abundante en los pacientes con la EA y en individuos con el Síndrome de Down que sobreviven después de los 40 años. Las placas también están presentes en el cerebro normal de las personas de edad avanzada, aunque en una proporción inferior. Estas placas están constituidas por el péptido \beta amiloide (\beta péptido) (Glenner y Wong, y col. Biochem Biophys. Res. Comm. 120, 885-890 (1984), que es también la principal proteina constituyente de los depósitos cerebrovasculares y de los nódulos neurofibrilares. El \beta péptido es un material filamentoso, dispuesto en láminas beta plegadas, con un peso molecular de 4.2-4.5 kd. Es un péptido hidrófobo que consta de 39-42 aminoácidos. La determinación de su secuencia de aminoácidos llevó a la clonación del ADNc de la APP (Kang y col., Nature 325, 733-735 (1987); Goldgaber y col., Science 235, 877 - 880 (1987); Robakis y col. Proc. Natl. Acad. Sci 84, 4190-4194 (1987); Tanzi y col., Nature 331, 528-530 (1988) y del ADN genómico de la APP (Lemaire y col. Nucl. Acids Res. 17: 517-522; Yoshikai y col. Gene 87, 257-263 (1990). Se han aislado las tres formas de ADNc de la APP (APP695, APP751, APP770), y las tres se originan a partir de un único ARN precursor por medio del corte y empalme alternativo. El gen se extiende por más de 175 Kb y tiene 18 exones (Yoshikai, y col., 1990). La APP contiene tres dominios extracelulares, una región transmebranosa y un dominio citoplásmico. El \beta péptido consta exactamente de 28 aminoácidos fuera de la membrana y de 14 residuos del dominio transmembranoso hidrófobo. Por lo tanto, el \beta péptido es un producto de la escisión de la APP que se encuentra presente de forma normal en el cerebro y en otros tejidos, como por ejemplo: el corazón, los riñones y bazo. Sin embargo, los depósitos de \beta péptido por lo general sólo están presentes en el cerebro, a pesar de que Joachim y col., Nature 341: 226-228 (1989) han informado sobre depósitos de \beta péptido fuera del cerebro: en la piel, el intestino y los tejidos subuctáneos de muchos pacientes con la EA.

Las formas alternativas más grandes de la APP (APP751, APP770) constan de de todos los dominios de la APP695 más uno o dos dominios adicionales. La APP751 consta de todos los aminoácidos de la APP695 más un aminoácido 56 adicional que tiene una homología con los inhibidores de serin-proteasa (KP1) de la familia Kunitz (Tanzi y col., 1988; Weidermann y col. Cell 57: 115-126 (1989); Kitaguchi y col., Nature 331:530-532 (1988); Tanzi y col., Nature 329, 156 (1987). La APP770 contiene la APP751 y un dominio aminoácido 19 adicional, homólogo al antígeno OX-2 de la superficie de la célula neuronal (Weidermann y col., Cell 57: 115-126 (1989); Kitaguchi y col., (1988). La APP se modifica después de la traducción por medio de la supresión de la secuencia líder y de la adición de grupos sulfato y sacárido.

Van Broeckhaben y col., Science 248: 1120-1122 (1990) han demostrado que el gen de la APP está estrechamente relacionado con la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (HCHWA-D) de dos familias holandesas. Este hecho se pudo confirmar al encontrar una mutación puntual en la región codificadora de la APP en dos pacientes holandeses (Levy y col., Science 248:1124-1128 (1990). La mutación consistía en la sustitución de una glutamina por ácido glutámico en la posición 22 del \beta péptido (posición 618 de la APP695). Además, algunas familias muestran una predisposición genética a la enfermedad de Alzheimer, una condición a la que se hace referencia como Enfermedad de Alzheimer Familiar (EAF) y que es resultado de las mutaciones que suponen una sustitución del aminoácido de la posición 717 de la longitud completa de la proteína. (Goate, y col., 1991; Murrell y col., 1991; Chartier-Harlin y col., 1991). Estas mutaciones co-segregan la enfermedad de tipo familiar y están ausentes en las familias que presentan un comienzo tardío de la EA.

No hay modelos animales reconocidos que permitan el estudio de la EA, a pesar de que el envejecimiento en los primates no humanos parece desarrollar placas amiloideas de \beta péptido en el parénquima cerebral y en las paredes de algunos vasos meníngeos y corticales. A pesar de que los primates y las especies caninas pueden servir como modelos animales, su mantenimiento resulta caro y necesitan largos períodos de estudio. En los animales no se producen mutaciones espontáneas con el suficiente grado de similitud con la EA como para resultar útiles como modelos experimentales. Se han propuesto varios modelos en los que se pueden inducir algunos síntomas similares a la EA mediante electrolisis, transplante de muestras de cerebro con EA, aporte de cloruro de aluminio, de análogos del ácido kaínico o de la colina (Kisner y col., Neurobiol. Aging 7: 287-292 (1986); Mistry J. S., y col., J. Med Chem. 29; 337-343 (1986). Flood y col., Proc. Ntl. Acad. Sci. 88:3363-3366 (1986), informaron sobre los efectos amnésicos que aparecían en ratones con cuatro péptidos de síntesis homólogos al \beta péptido. Dado que ninguno de estos comparte con la EA ningún otro síntoma en común, ni bioquímico ni patogénico, no es muy probable que puedan aportar mucha información útil sobre la etiología o el tratamiento de la enfermedad.

Se han producido ratones transgénicos con el promotor de la APP humana ligado a la \beta-galactosidasa de E. Coli (Wirak, D.O., y col., The EMBO J. 10; 289-296 (1991), también se han producido ratones transgénicos que expresan el ADNc de la APP751 humana (Quon, D., y col., Nature 352, 239-241 (1991) o un subfragmento del ADNc que incluye el \beta péptido (Wirak, D.O., y col., Science 253, 323-325 (1991); Sandhu, F.A., y col. J. Bio. Chem. 266, 21331-21334 (1991); Kawabata, S. Nature 354: 476-478 (1991). Los resultados obtenidos en los diferentes estudios parecen depender de la procedencia del promotor y de la secuencia de codificación de la proteína utilizada. Por ejemplo, Wirak y col. (1991) encontraron que en ratones transgénicos que expresaban una forma del \beta péptido, se observaba una reacción ante los anticuerpos preparados para actuar contra la APP de los depósitos intracelulares del material "similar al amiloide", pero no se encontraron otros síntomas histopatológicos de la enfermedad. La naturaleza intracelular del material que reacciona ante los anticuerpos, y la falta de otros síntomas, sugirieron que este animal transgénico en concreto no era un sistema que sirviese como un modelo fiable de la enfermedad de Alzheimer. Kawabata y col. (1991), informaron sobre la producción de placas de amiloide, de nódulos neurofibrilares, y de la aparición de necropsia neuronal en sus animales transgénicos. En cada uno de estos estudios, se expresaba el mismo fragmento de péptido: el \beta péptido más los restantes 56 aminoácidos C-terminales de la APP. Wirak y col. (1991), usaron el promotor humano de la APP, mientras que Kawabata y col. (1991) utilizaron el promotor humano del thy-1. Se observaron depósitos extracelulares de material reactivo ante el anticuerpo preparado contra la APP en los ratones transgénicos que expresaban el ADNc de la APP751 a partir del promotor de la enolasa específica de la neurona de Quon, D. y col. Nature 352, 239-241 (1991). Lo que no se pudo demostrar fue si los depósitos contenían toda la longitud de la APP751 o del \beta péptido o ambos, imposibilitando por lo tanto establecer cualquier correlación entre estos depósitos y aquellos presentes en la enfermedad de Alzheimer. Quon y col. (1991) también afirman que la proteína codificada por el ADNc de la APP695 que se expresa a partir del promotor de la enolasa específico de las neuronas no forma depósitos extracelulares inmunoreactivos. Estos resultados dan lugar a la posibilidad de que, a pesar de que el \beta péptido esté incluido en el precursor de la APP695, el uso del promotor de la enolasa específica de las neuronas junto con el ADNc de la APP695 puede no resultar un modelo fidedigno de la enfermedad de Alzheimer. Es más, en su particular modelo transgénico, la presencia de depósitos de APP inmunorreactivos no está relacionada ni con la edad ni con la dosificación del gen.

La enfermedad de Alzheimer es un síndrome complejo, que incluye aspectos patológicos y alteraciones del comportamiento. Un modelo realmente útil de la enfermedad debería tomar en cuenta toda esta complejidad. Hay múltiples proteínas que se expresan a partir del gen, con predominancia de algunas formas en un tejido dado. En el cerebro, la forma predominante es la 695, pero también están presentes los ARNm de las formas adicionales (Golde y col., Neuron 4: 253-267 (1990). No se sabe si la proporción entre las diferentes formas cambia con la edad del individuo. Las distintas formas de proteína que son resultado de los cortes y empalmes alternativos, tales como la del dominio Kl y/o del dominio OX-2, pueden estar presentes o no en la proteína madura. Es más, el \beta péptido es consecuencia de un proceso posterior a la traducción de la proteína precursora. Este proceso puede variar tanto en el momento como con las edades del individuo, y puede verse afectado por mutaciones que no repercutan directamente en la estructura del \beta péptido como, por ejemplo, las mutaciones que se producen en la posición 717 del aminoácido de la longitud total de la proteína (Groate y col., 1991; Murrell y col., 1991; Chartier-Harlin y col., 1991) observadas en la enfermedad de Alzheimer familiar. Tomando en cuenta estas consideraciones, la producción de modelos animales universales para la enfermedad de Alzheimer exige la construcción de modelos animales que tomen en cuenta los efectos de las mutaciones conocidas sobre el fenotipo que resulta de la expresión de estas formas, y la posibilidad de que cambie la proporción de las diferentes formas durante el período de vida del animal.

El WO 92/06187está relacionado con los roedores transgénicos que resultan útiles para el estudio de la enfermedad de Alzheimer y que tienen un transgen que incluye al promotor de la metalotioneína I de los mamíferos, operativamente ligado a una secuencia de nucleótidos que codifica la APP operativamente ligada la 3ª región no traducida de la hormona del crecimiento de los mamíferos.

El WO 92/13069 está relacionado con un ADN que codifica la APP que presenta la sustitución de un aminoácido en el residuo 717 de la APP770.

El EP 0 451 700 se refiere a los ratones transgénicos que tienen una APP con una construcción de minigene.

Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención es el proporcionar un modelo de la enfermedad de Alzheimer en roedores, que esté construido usando tecnología transgénica.

Es un propósito adicional de la presente invención el proveer de roedores transgénicos que reflejen con precisión la expresión de las diferentes formas de la proteína precursora del amiloide.

También es un objetivo adicional de la presente invención el proveer de roedores transgénicos caracterizados por ciertas anormalidades genéticas en la expresión de la proteína precursora del amiloide.

Resumen de la invención

Se describe la construcción de modelos de roedores transgénicos para el ensayo de tratamientos potenciales para la enfermedad de Alzheimer. Los modelos están caracterizados por una mayor similitud con las condiciones existentes en la aparición natural de la enfermedad de Alzheimer, basándose en la habilidad para controlar la expresión de una o de más de tres formas de la proteína precursora del \beta-amiloide (APP): APP695, APP751, APP770; o de subfragmentos de la misma, así como también de varias mutaciones puntuales basadas en las mutaciones que se producen naturalmente, como ser las mutaciones de la EAF en el aminoácido 717, y las mutaciones pronosticadas en el gen de la APP. Las construcciones del gen de la APP se preparan usando el promotor de la APP de origen humano, de ratones o de ratas, que se ha producido de forma natural, así como también los promotores inducibles, como ser el promotor de la metalotioneína del ratón que se puede ajustar por medio de la adición de metales pesados, como el zinc, al agua o la dieta de los animales. La expresión neuronal específica de las construcciones se logra usando el promotor específico de la enolasa de las neuronas de las ratas.

Las construcciones se introducen en los embriones de roedores utilizando técnicas estándar, como la microinyección o las células madre embrionarias de roedores. Los modelos basados en cultivos celulares también se pueden preparar mediante dos métodos: los cultivos celulares se pueden aislar de roedores transgénicos o se pueden preparar a partir de cultivos celulares establecidos utilizando las mismas construcciones con técnicas estándar de transfección celular.

Las construcciones de la invención son aquellas que se especifican en la Reivindicación 11.

Los promotores se pueden seleccionar a partir de: el promotor del gen humano de la APP, el promotor del gen de la APP de los ratones, el promotor del gen de la APP de las ratas, el promotor del gen de la metalotionina, el promotor del gen de la enolasa específica de las neuronas de las ratas, el promotor del gen humano de la \beta actina, el promotor del gen de la cadena del factor de crecimiento humano derivado de las plaquetas B (PDGF-B), el promotor del gen del canal de sodio de la rata, el promotor del gen de la proteína básica de la mielina del ratón, el promotor del gen humano de la superóxido dismutasa cobre-zinc, y el promotor del gen regulador del dominio POU de los mamíferos.

Los roedores o células de mamíferos transgénicas de la invención son los descritos en la Reivindicación 1.

Estas construcciones se pueden introducir en los roedores transgénicos y luego ser combinadas por medio de la cruza de animales que expresen las diferentes construcciones.

Las células transgénicas de roedores, o de mamíferos, se usan para ensayar compuestos que alteren el curso patológico de la Enfermedad de Alzheimer, evaluándolos según sus efectos sobre la cantidad y la histopatologia de la APP y del \beta péptido en los animales, así como también por las alteraciones que producen en el comportamiento.

Breve descripción de los dibujos

Las porciones cerradas de los dibujos indican las porciones de codificación de aminoácidos de las construcciones. Las porciones rellenas indican los diversos dominios de la proteína, tal y como se indica en el texto que acompaña a la ilustración. Las líneas indican las secuencias de los clones, que son las secuencias 5ª o 3ª no traducidas, secuencias genómicas flanqueantes o intrones. La ruptura en el trazado de la línea a la izquierda de las construcciones de las Figuras 7 y 8 indica la presencia de una larga secuencia de ADN.

La Figura 1a es una representación esquemática de la secuencia de codificación del ADNc de la APP 770.

La Figura 1b es una representación esquemática de la secuencia de codificación del ADNc de la APP770 que porta una mutación en la posición 717.

La Figura 2a es una representación esquemática de la secuencia de codificación del ADNc de la APP751.

La Figura 2b es una representación esquemática de la secuencia de codificación del ADNc de la APP751 que porta una mutación en la posición 717.

La Figura 3a es una representación esquemática de la secuencia de codificación de la APP695.

La Figura 3b es una representación esquemática de la secuencia de codificación del ADNc de la APP695 que porta una mutación en la posición 717.

La Figura 4a es una representación esquemática de la secuencia de codificación en la porción del grupo carboxilo terminal de la APP.

La Figura 4b es una representación esquemática de una secuencia de codificación de la porción carboxilo terminal de la APP que porta una mutación en la posición 717.

La Figura 5 es una representación esquemática de una secuencia de codificación de la porción del \beta péptido de la APP.

La figura 6a es una representación esquemática de una combinación genómica/secuencia de codificación del ADNc que permite el corte y empalme alternativo entre los exones del Kl y el OX-2.

La Figura 6b es un esquema de una combinación genómica/secuencia de codificación del ADNc que porta una mutación en la posición 717 y permite un corte y empalme alternativo de los exones del Kl y el OX-2.

La Figura 7a es un esquema de una secuencia de codificación de la APP humana en un YAC.

La Figura 7b es un esquema de una secuencia de codificación de la APP humana que porta una mutación en la posición 717 en un YAC.

La Figura 8 es una representación esquemática de la alteración genética del gen de la APP del ratón, lograda mediante una recombinación homóloga dirigida entre el gen de la APP del ratón en una célula ES de ratón y un vector portador del ADNc de la APP humana (tanto de la forma normal como de la mutante de la EAF) en la porción 9 del exón del gen. Como resultado de este acto de recombinación, se sustituyen las secuencias del gen de la APP cromosómica residente del ratón fuera del punto de recombinación del exón 9 por las secuencias humanas análogas.

Las Figuras de la 1 a la 5 y la 7 y la 8 sólo sirven con propósitos ilustrativos.

Descripción detallada de la invención

Las construcciones de células transgénicas de roedores y mamíferos se preparan utilizando los métodos y materiales que se describen a continuación.

Origen de los materiales

Las endonucleasas de restricción se obtienen de los proveedores comerciales convencionales, como ser: New England Biolabs (Beverly, MA), Promega Biological Research Products (Madison, WI), y Stratagene (La Jolla, CA), etc. Los materiales radioactivos se obtienen de los proveedores comerciales convencionales, como ser: Dupont/NEN o Amersham. Los oligonucleótidos diseñados a medida para las mutagénesis puntuales se pueden obtener de cualquiera de los diversos proveedores comerciales para este tipo de materiales, como Bio-Synthesis Inc. Lewisville, TX. Los equipos para llevar a cabo las mutagénesis puntuales se pueden adquirir a través de proveedores comerciales como Promega Biologycal Research Products, Stratagene, etc. Los clones de ADNc, incluyendo las formas del ARNm de la APP para la APP695, la APP751 y la APP770, se obtuvieron directamente del Dr. Dmitry Godgaber, NIH. Los bancos de DNA se pueden adquirir de proveedores comerciales como Stratagene, La Jolla, CA, o Clontech, Palo Alto, CA. Las células PC12 Y 3T3 se obtuvieron de ATCC (#CRL1721 y #CCL92, respectivamente). Se obtuvo un linaje celular PC12 adicional del Dr. Charles Marotta de la Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, y McLean Hospital. Los medios de cultivo celular estándar apropiados para el linaje celular se obtuvieron de los proveedores comerciales convencionales, como Gibco/BRL. Las células madre murinas, cepa D3, se obtuvieron del Dr. Rolf Kemler (Doetschman y col. J. Embryol Exp. Morphol 87, 27 (1985). La lipofectina para la transfección del ADN y el fármaco G418 para la selección de transformantes estables se pueden obtener de Gibco/BRL.

Aislamiento del promotor humano de la APP

Se seleccionó un banco de cósmido, construido a partir de ADN placentario humano en el vector cósmido pWE15, por medio de hibridación con una sonda etiquetada^{32p}, preparada para una nick translation (Maniatis y col. Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989) del clon del ADNc de la APP770. Los clones que se hibridaron con la sonda fueron seleccionados, purificados y caracterizados por medio de un mapa de restricción, hibridación y secuenciado del ADN. A partir de uno de dichos clones, que contenía una 5ª región flanqueante larga, se aisló un fragmento de restricción del ADN, de NotI a NruI, de aproximadamente
25 kb. Este fragmento termina en dos nucleótidos situados antes del codón del iniciador de la metionina de la región de codificación de la proteína del Alzheimer. Este fragmento, o un subfragmento del mismo, es el origen del promotor humano de la APP para las construcciones descritas en este documento. Los fragmentos análogos de ADN aislados usando los mismos métodos a partir de bancos genómicos de ratón, o de rata, son el origen de los promotores del ratón o la rata.

Definición de los clones del ADNc de la APP

El clon del ADNc de la APP-695 es de la forma de ADNc descrita por Kang y col. Nature 325:733-735 (1987), y es la forma de la proteína del Alzheimer presente en el cerebro con una mayor predominancia. El clon del ADNc de la APP-751 es de la forma descrita por Ponte, P., Nature 331: 525-527 (1988). El clon del ADNc de la APP770 es de la forma descrita por Kitaguchi y col., Nature 331:530-532 (1988). Esta forma contiene un inserto de 225 nucleótidos relacionados con la forma 695. El inserto de nucleótido 225 codifica el dominio Kl así como también el dominio

\hbox{OX-2.}

Definición del locus genómico de la APP

La caracterización del fago y de los clones de cósmido de los clones del ADN genómico humano, se listan en la tabla de más abajo, con un tamaño mínimo del gen del Alzheimer establecido originalmente en, por lo menos, 100 kb. En el gen de la APP hay un total de 18 exones (Lemaire y col. Nucl. Acid Res. 17; 517:522, 1989; Yoshikai y col, 1990). Estos resultados, tomados en conjunto, indican que el tamaño mínimo del gen del Alzheimer es de 175 kb.

(Tabla pasa a página siguiente)

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Construcción de los transgenes

Los clones portadores de varias porciones de la secuencia del gen humano de la APP mostrados en las Figs. 1-5, se construyen de forma análoga. En primer lugar se clona la señal de adición del polyA del virus SV40 como un par base 253 BclI en un fragmento BamHI de un vector modificado de la serie pUC (Reddy y col. Science 200; 494-502 (1978). A continuación, se insertan las secuencias codificadoras del ADNc (770, 751 ó 695). Se determina la correcta orientación y el contenido de los fragmentos insertados por medio del mapa de restricción de la endonucleasa y la secuenciación limitada.

Los clones portadores de varias porciones con carboxilo terminal de la secuencia del gen humano de la APP que aparecen en las Figs. 4 y 5 se construyen por medio de varias etapas, además de las ya indicadas. Primero que nada, se digiere un clon del ADNc de la APP770 con Asp718, que divide después de la posición 56 (sistema de numeración de Kang y col., 1987). La 5ª extensión resultante, se completa usando la enzima de Klenow (Maniatis y col. 1989) y se liga a un hexanucleótido con la siguiente secuencia: AGATCT, el punto de reconocimiento para el BglII. Después de la división con BglII, que también corta después de la posición 1769 y de la religadura, se conserva el marco de lectura de la traducción de la proteína. La proteína así truncada y codificada contiene la secuencia líder, seguida por aproximadamente 6 aminoácidos que preceden al \beta péptido, a los que siguen el \beta péptido y los 56 aminoácidos terminales de la APP. El clon de la Fig. 5 se crea a través de la introducción, por medio de una mutagénesis puntual, del nucleótido 1913 del clon de la Fig 4a (sistema de numeración de Kang y col. 1987) en un T, creando, por lo tanto, un codón de terminación directamente enseguida del último codón de aminoácido del \beta péptido. Cada una de las secuencias del ADNc de la APP de los clones que se muestran en las Figs. 1-5 contiene un único punto NruI, con dos nucleótidos en dirección ascendente a partir del codón del iniciador de la metionina que se usa para la inserción de los diferentes promotores utilizados para completar cada construcción. Todo lo anterior se aplica únicamente con propósitos ilustrativos a las Figuras de la 1 a la 5.

También se construyen clones de expresión idénticos a éstos, pero portando mutaciones en el aminoácido 717 del largo total de la proteína, el punto de la mutación de la EAF. Las mutaciones en el aminoácido 717 se crean por mutagénesis puntual (Vincent y col., Genes y Devel 3; 334-347 (1989) e incluyen mutaciones del tipo normal del codón val a uno de los siguientes codones: ile, phe, gly, tyr, leu, ala, pro, trp, met, ser, thr, asn, g/n.

El método preferido para la construcción de la combinación ADNc/clones de expresión genómica de la Figura 6 es el siguiente: por medio de una mutagénesis puntual se convierte el punto TaqI de la posición 860 (sistema de numeración de Kang y col. 1967) de un ADNc de la APP770 en un punto XhoI. La escisión del plásmido resultante con XhoI corta por el nuevo punto XhoI y por un punto preexistente en 930, y libera la secuencia de codificación del Kl y el OX-2.

El plásmido así generado sirve como aceptante para el módulo de corte y empalme alternativo del Kl y el OX-2. El módulo de corte y empalme alternativo se crea a través de una serie de etapas de clonación. En primer término, por medio de una mutagénesis puntual, se convierte el punto TaqI de la posición 860 (sistema de numeración de Kang y col. 1987) del clon genómico que contiene el exón 6 y el intrón adyacente en sentido descendente, en un punto XhoI. La división del plásmido resultante con XhoI corta por el nuevo punto XhoI y un nuevo punto XhoI dentro del intrón adyacente. Se clona este fragmento en el punto XhoI de un vector plásmido. En segundo lugar, se divide mediante XhoI (posición 930) el clon genómico que contiene el exón 9 y el intrón adyacente en dirección ascendente, y se clona en el punto XhoI de un vector plásmido. Estos dos fragmentos de unión exón/intrón se liberan de sus respectivos esqueletos plásmidos mediante escisión con XhoI, o también con BamHl o con BglII, y se clonan en el punto XhoI de un vector plásmido. El fragmento XhoI resultante se divide con BamHI o con BglI y se inserta el segmento BamHI de 6.6 kb (Kitaguchi y col., 1988), que contiene la región codificadora del Kl y el OX-2 junto con las secuencias flanqueantes del intrón. Después de la escisión con XhoI, se inserta este segmento de ADN en el punto del XhoI del ADNc de la APP770 construido según se indica anteriormente. Estas etapas de clonación generan una combinación de ADNc/clon de expresión genómica que permite a las células de un roedor transgénico regular la inclusión de los dominios Kl y OX-2 por medio de un mecanismo natural de corte y empalme alternativo. Se construye un gen análogo, portador de una mutación en el aminoácido 717, utilizando la forma mutada del ADNc de la APP770 descrita anteriormente.

Actividad de los promotores de genes

Se usan diferentes secuencias del promotor para controlar la expresión de las secuencias codificadoras de la APP. Se cree que la capacidad para regular la expresión del gen de la APP en los roedores transgénicos resultará útil para evaluar el papel de los diferentes productos del gen de la APP en la EA. Se piensa que la capacidad para regular la expresión del gen de la APP en las células cultivadas, resultará útil en la evaluación de la expresión y el procesado de los diferentes productos del gen de la APP y que podría proporcionar una base para la evaluación de fármacos en células cultivadas.

El promotor de la metalotionina (MT) está bien caracterizado, ha sido empleado en roedores transgénicos y su expresión se puede regular por medio de la modulación de los niveles de zinc y de hormona glucocorticoide (Palmiter y col. Nature 300, 611-615 (1982).

El promotor humano de la APP también está caracterizado con respecto a su expresión en el CNS (Wirak y col. 1991). Se supone que este promotor es útil para una reproducción precisa de la expresión temporal y espacial de las secuencias de la APP humana en los roedores con CNS transgénico. Además del promotor humano de la APP, se usa el promotor de la APP de los ratones y de las ratas junto a las diferentes secuencias codificantes de la APP normal y mutante. A pesar de que el promotor humano de la APP ha demostrado tener actividad en las regiones pertinentes del cerebro de los ratones transgénicos (Wirak y col., 1991), se piensa que el uso de un promotor de la APP de ratón, o de rata, en una rata transgénica ofrecerá un patrón aún más fidedigno de su expresión en el CNS de los animales transgénicos.

Se usa el promotor específico del gen de la enolasa neuronal de la rata como una alternativa para el control de la expresión de la APP humana en las neuronas. Se ha demostrado que este promotor es el rector de la expresión directa de las secuencias de codificación en las neuronas (Forss-Petter y col., Neuron 5; 197-197 (1990).

Otras de las alternativas que se pueden usar para controlar la expresión de la APP humana en las neuronas, incluyen al promotor del gen de la \beta actina (Ray y col., Genes and Development 5:2265-2273 (1991), al promotor del gen de la cadena del factor de crecimiento humano derivado de las plaquetas B (PDGF-B) (Sasahara y col. Cell 64:217-227 (1991), al promotor del gen del canal de sodio de la rata (Maue y col., Neuron 4; 223-231 (1990), al promotor del gen humano de la superóxido dismutasa cobre-zinc (Ceballos-Picot y col. Brain Res. 552; 198-214 (1991), y a los promotores de los miembros de la familia de los genes reguladores del dominio POU de los mamíferos (Xi y col., Nature 340; 35-42 (1989). El dominio POU es la región de similitud entre los cuatro factores de transcripción de los mamíferos Pit-1, Oct-1, Oct-2 y Unc-86, y representa una porción del dominio ADN-fijación. Se sabe, o se cree, que estos promotores dan como resultado la expresión específicamente dentro de las neuronas de los animales transgénicos.

La expresión de la APP humana en células cerebrales no neuronales puede ser regida por el promotor de la proteína básica de la mielina de los ratones. (Readhead y col., Cell 48; 703-712 (1987).

Cromosomas artificiales de levadura (sólo con fines ilustrativos)

Las construcciones que aparecen en la Figura 7 están construidas de la manera siguiente: cuando se clonan grandes segmentos de ADN genómico humano en ciertos vectores, se los puede propagar en las células de levadura como unidades con replicación autónoma. Dichos segmentos portados por el vector se llaman cromosomas artificiales de levadura (YAC; Burke y col. Science 236; 806 (1987). Hay un banco de YAC humanos disponible a nivel comercial (Clontech, Palo Alto, CA), con un tamaño medio de inserto de 250.000 pares de bases (gama de 180.000 a 500.000 pares de bases). Se puede aislar un clon del gen del Alzheimer directamente de un YAC, seleccionándolo del banco con el ADNc humano de la APP770. Se deberá confirmar la inclusión de todas las regiones esenciales del gen en el clon mediante un análisis por PCR.

Se establece el clon de la APP en el YAC que aparece en la Figura 7a en las células madre embrionarias (ES) de roedores, seleccionándolo por medio de la resistencia a la neomicina, codificada en el vector YAC. Las células ES portadoras del clon de la APP-YAC se usan para producir ratones transgénicos por medio de los métodos establecidos que se describen más abajo, en "Ratones Transgénicos" y "Métodos con Células Madre Embrionarias de Roedores". El gen de la APP-YAC que porta una mutación en el aminoácido 717 (Fig. 7b) se produce a través de la generación de un banco de YAC utilizando el ADN genómico de una persona afectada por una mutación en el aminoácido 717 (Fig. 7b). Se identifica el clon y se lo establece en células ES de roedores tal y como se ha descrito anteriormente.

Alteración genética del gen de la APP del ratón (sólo con fines ilustrativos)

La homología entre la secuencia de nucleótidos de los genes humanos y murinos de la proteína del Alzheimer es de, aproximadamente, el 85%. Hay tres diferencias entre los aminoácidos de la región codificadora del \beta péptido de las dos secuencias. El residuo val que aparece mutado en el aminoácido 717 se mantiene tanto en ratones como en ratas y en humanos. Los ratones de tipo silvestre no desarrollan la enfermedad de Alzheimer, ni depósitos, ni placas análogas a aquellas presentes en los CNS de los seres humanos enfermos de Alzheimer. Por lo tanto, es posible que sea la forma humana del B péptido, pero no la forma de los roedores, la que es capaz de provocar la enfermedad. Se puede usar la recombinación homóloga (Capecchi, MR Science 244; 1288-1292 (1989) para convertir el gen del Alzheimer del ratón in situ en un gen que codifique el B péptido humano. Esta recombinación se dirige hacia un punto situado hacia abajo de los dominios Kl y OX-2, por ejemplo, dentro del exón 9, de manera que se puedan emplear los mecanismos naturales de corte y empalme alternativo, apropiados para todas las células del animal transgénico, para la expresión del producto final del gen.

Para producir modelos transgénicos que expresen tanto la forma normal como la mutante de la APP, se usan tanto la forma normal (Fig. 8, esquema "a") como la mutante (Fig. 8, esquema 2"b") del ADNc humano. El vector de recombinación se construye a partir de un ADNc humano de la APP (forma 695 o 770), ya sea del tipo normal o del que contiene una mutación en el aminoácido 717. La escisión del vector de recombinación, por ejemplo en el punto XhoI del exón 9, promueve una recombinación homóloga en las secuencias inmediatamente adyacentes (Capecchi, 1989).

Formas mutantes de las proteínas APP

También se construyen clones de expresión idénticos a estos pero portando mutaciones en el aminoácido 717 del largo total de la proteína, el punto de las mutaciones de la EAF. Las mutaciones del aminoácido 717 se crean mediante mutagénesis puntual (Vincent y col. 1989) e incluyen mutaciones del codón val del tipo normal a uno de los siguientes codones: ile, phe, gly, tyr, leu, ala, pro, trp, met, ser, thr, asn, gln. También se han descrito mutaciones del val-717 a ile, phe y gly (Goate y col., 1991; Murrel y col., 1991; Chartier-Harlin y col., 1991). Ninguna de estas mutaciones que se producen de forma natural son aminoácidos cargados o inertes. Por lo tanto, se piensa que la sustitución del val-717 por algún otro de los aminoácidos mencionados también puede promover el síndrome de la EAF y tener propiedades que puedan ser útiles en los modelos animales de la EA.

Preparación de construcciones para transfecciones y microinyecciones

Se dividen los clones para la microinyección por medio de las enzimas adecuadas, como por ejemplo: Sal1, Not1, etc., y se someten los fragmentos de ADN a electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampón TBE (Maniatis y col. 1989). Las bandas de ADN se visualizan mediante la tinción con bromuro de etidio, se las divide y se las coloca en una bolsa de diálisis que contenga acetato de sodio 0,3 M, a un pH 7,0. Se electroleviga el ADN en las bolsas de diálisis, se lo extrae con fenol-cloroformo (1:1), y se lo precipita por medio de dos volúmenes de etanol. Se redisuelve el ADN en 1 ml de tampón con baja salinidad (NaCl 0,2 M, Tris^{TM} 20mM, a un pH de 7,4, y EDTA 1 mM) y se lo purifica en una columna Elutip-D^{TM}. Primero que nada, se preinyecta la columna con 3 ml de tampón con alta salinidad (NaCl 1M, Tris^{TM} 20mM, a un pH 7,4, y EDTA 1 mM) y luego se efectúa un lavado con 5 ml de tampón con baja salinidad. Se pasan las soluciones de ADN a través de la columna tres veces para fijar el ADN a la matriz de la columna. Después de un lavado con 3 ml de tampón con baja salinidad, se arrastra el ADN con 0,4 ml de tampón con alta salinidad y se lo precipita mediante dos volúmenes de etanol. Se miden las concentraciones de ADN por absorción a 260 nm en un espectrofotómetro UV. Para la microinyección, se ajustan las concentraciones de ADN a 3\mug/ml en Tris^{TM} 5 mM, a un pH de 7,4 y EDTA 0,1 mM. También se describen tres métodos para la purificación del ADN para microinyectar en Hogan y col., Manipulating the mouse embryo (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986), en Palmiter y col. Nature 300, 611 (1982), en "The Qiagenologist, Application Protocols", 3ª edición, publicada por Qiagen, Inc., Chatsworth, CA., y en Mainatis y col., Molecular Cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Construcción de roedores transgénicos Fuentes de roedores

Los roedores adecuados para los experimentos transgénicos se pueden obtener de los proveedores comerciales habituales, como por ejemplo: Charles River (Wilmington, MA), Taconic (Germantown, NY) Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN), etc. Se prefieren las hembras Swiss Webster para la recuperación y transferencia de embriones. Se pueden usar los machos D6D2F_{1} para las cruzas y sementales Swiss Webster vasectomizados para estimular la pseudopreñez. También se pueden obtener los ratones y las ratas vasectomizados de los mismos proveedores.

Procedimientos de microinyección

En Hogan y col. "Manipulating the mouse embryo", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1086) se describen con detalle los procedimientos para la manipulación de los embriones de roedores y para la microinyección de ADN.

Ratones transgénicos

Se induce a superovular a las hembras de ratón con seis semanas de edad, utilizando para ello una inyección de 5 UI (0,1 cc, ip) de suero de gonadotropina (PMSG, Sigma) de yegua preñada, seguida a las 48 horas por una inyección de 6 UI (0,1 cc, ip) de gonadotropina coriónica humana (hCG; Sigma). Inmediatamente después de la inyección con hCG, se pone a las hembras con los machos. Veintiuna horas después de la hCG, se sacrifica a las hembras apareadas mediante asfixia con CO_{2} o por dislocación cervical y se recuperan los embriones de los oviductos seccionados y se los coloca en solución salina tampón de Dulbecco con un 5% de suero de albúmina bovina (BSA; Sigma). Se retiran los cúmulos de células circundantes con hialuronidasa (1 mg/ml). Se lavan entonces los embriones pronucleares, se colocan en una solución salina de Earle equilibrada que contenga un 0,5% de BSA (EBSS) y en una incubadora a 37,5ºC, con una atmósfera húmeda con un 5% de CO_{2} y un 95% de aire hasta el momento de la inyección.

Se aparean hembras adultas de ratón con ciclos aleatorios con los machos vasectomizados. Para este fin se pueden usar hembras Swiss Webster o de otras razas similares. Las hembras receptoras se aparean al mismo tiempo que las hembras donantes. En el momento de la transferencia del embrión se anestesia a las hembras receptoras con una inyección intraperitoneal de 0,015 ml de avertina al 2,5% por gramo de peso corporal. Se dejarán expuestos los oviductos mediante una única incisión en la línea media del dorso. Se hace luego una incisión a través de la pared del cuerpo directamente sobre el oviducto. Después se rasga la bolsa ovárica usando pinzas de relojero. Se colocan los embriones a transferir en DPBS y en la punta de una pipeta de porte (unos 10-12 embriones). La punta de la pipeta se inserta en el infundíbulo y se transfiere el embrión. Después de la transferencia, se cierra la incisión con dos suturas.

Ratas transgénicas

El procedimiento para generar ratas transgénicas es similar al utilizado con los ratones (Hammer y col. Cell 63; 1099-1112 (1990). Cuando las ratas tienen treinta días se les da una inyección subcutánea de 20 UI de PMSG (0,1 cc) y cuarenta y ocho horas más tarde se pone a cada hembra con un macho probado. Al mismo tiempo, se colocan las hembras de 40-80 días de edad en jaulas junto a machos vasectomizados. Esto va a proveer de madres adoptivas para la transferencia de embriones. A la mañana siguiente se controlan los tampones vaginales de las hembras. Se dejan aparte, hasta que sea el momento de la transferencia, a las hembras que se hayan apareado con machos vasectomizados. Se sacrifican las hembras donantes que se hayan apareado (CO_{2}, asfixia) y se les retiran sus oviductos, se los coloca en DPBS (solución salina tampón fosfato de Dulbecco) con un 0,5% de BSA y se recogen los embriones. Se quitan los cúmulos de células que circundan al embrión por medio de hialuronidasa (1mg/ml). Entonces, se lavan y se colocan los embriones en EBSS (solución salina equilibrada de Earle) conteniendo un 0,5% de BSA y en una incubadora hasta el momento de la microinyección.

Una vez que se han inyectado los embriones, los embriones vivos se cambian a DPBS para transferirlos a las madres adoptivas. Se hace una incisión en la línea media del dorso a través de la piel y queda expuesto el ovario; se accede al oviducto por medio de una incisión a través de la capa muscular situada directamente sobre el ovario. Se rasga la bolsa ovárica, se recogen los embriones con la pipeta de porte, y se inserta la punta de la pipeta de porte en el infundíbulo. Se transfieren aproximadamente unos 10-12 embriones a cada oviducto de rata a través del infundíibulo. Se sutura entonces la incisión, y se aloja individualmente a las madres adoptivas.

Métodos de células madre embrionarias (ES) de roedores Introducción del ADNc en las células ES de roedores

En Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, Ed. E. J. Robertson (IRL Press, 1987) se describen con detalle los métodos para el cultivo de células ES y la consiguiente producción de roedores transgénicos para la introducción del ADN en las células por medio de diversos métodos como ser: la electoporación, la precipitación del fostafo de calcio/ADN, y la inyección directa. Hay varios métodos para lograr la selección de los clones requeridos de células ES que contengan el transgén. En los casos que impliquen una integración aleatoria de los genes, se coprecipita un clon de APP con un gen codificador de la resistencia a la neomicina. Se lleva a cabo la transfección por medio de uno de los distintos métodos descritos en detalle por Lovell-Badge, en Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, Ed. E. J. Robertson (IRL Press, 1987) o en Potter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161 (1984). Los métodos preferidos son: la precipitación del fosfato de calcio/ADN, la inyección directa, y la electroporación. En estos procedimientos, se extienden 0,5 X 10^{6} células ES en placas de cultivo de tejidos y se las transfecta con una mezcla del clon linealizado de la APP y 1 mg de ADN del pSV2neo (Southern and Berg. J. Mol. Appl. Gen. 1; 327-341 (1982) precipitado en presencia de 50 mg de lipofectina en un volumen final de 100 \mul. Las células se nutren con un medio selectivo que contenga un 10% de suero fetal bovino en DMEM, suplementado con G418 (entre 200 y 500 \mug/ml). Se aislan las colonias de células resistentes al G418 usando aros de clonación y se las expande. Se extrae el ADN de los clones resistentes al fármaco y se usan las técnicas de transferencia de Southern, utilizando una sonda de ADNc de la APP770 para identificar a los clones que portan las secuencias APP. En algunos ensayos, se usan los métodos de la PCR para identificar los clones que puedan presentar interés.

También se pueden integrar las moléculas de ADN introducidas en las células ES de roedores en el cromosoma por medio del proceso de recombinación homóloga, descrita por Capecchi, (1989). La inyección directa supone una alta eficiencia en la integración. Se identifican los clones deseados por medio de una PCR del ADN preparado a partir de grupos de células ES inyectadas. Se identifican las células positivas de los grupos por medio de una PCR posterior a la clonación celular (Zimmer y Gruss, Nature 338; 150-153 (1989). La introducción de ADN mediante electroporación es menos eficiente y requiere de una etapa de selección. Joyner y col. Nature 338, 153-156 (1989) y Capecchi, (1989) han descrito los métodos para la selección positiva de la recombinación (por ejemplo: neo resistencia) y la doble selección positiva-negativa (por ejemplo, la neo resistencia y la resistencia al ganciclovir) y la consecuente identificación de los clones requeridos por medio de una PCR.

Recuperación de embriones de roedores e inyección de células ES de roedores

Para obtener embriones para la implantación de células ES de roedor, se usan hembras de ratón con ciclos aleatorios, o superovuladas, apareadas con machos. Cuando se usan ratones, es preferible utilizar para estos fines la cepa C57B. Se recuperan los embriones de ratón de la edad adecuada a los 3,5 días del apareamiento que resulte fructífero. Las hembras apareadas se sacrifican por asfixia con CO_{2} o por dislocación cervical, se extraen los embriones de las trompas del útero abiertas y se los coloca en el medio esencial de Dulbecco modificado mediante el agregado de un 10% de suero de ternera para inyectar con células ES. Se inyectan aproximadamente 10-20 células en los blastocistos usando una microaguja de vidrio con un diámetro interno de aproximadamente 20 \mum.

Transferencia de embriones de roedor a pseudopreñadas Hembras de ratones

Se aparean hembras adultas de ratón con ciclos aleatorios con machos vasectomizados. Para este propósito se pueden usar razas de ratón como la Swiss Webster, la ICR u otras. Se aparean las hembras receptoras de manera que cuando se las necesite para implantarles los blastocistos que contienen las células ES de roedores, hayan pasado de 2,5 a 3,5 días después del apareamiento. En el momento de la transferencia del embrión, se anestesia a las hembras con una inyección intraperitoneal de 0,015 ml de avertina, al 2,5%, por gramo de peso corporal. Se dejan al descubierto los ovarios haciendo una incisión en la pared del cuerpo, directamente sobre el oviducto y se dejan expuestos el ovario y el útero. Se hace un agujero en la trompa uterina con una aguja calibrada a través de la cual se transfieren los blastocitos. Después de la transferencia, se empujan hacia dentro del cuerpo el ovario y el útero y se cierra la incisión con dos suturas. Si se han de hacer transferencias adicionales se repite el procedimiento en el otro lado.

Identificación de ratones y ratas transgénicos

Se quitan muestras de la cola (1-2 cm) de los animales de tres semanas. Se prepara y se analiza el ADN tanto por medio de la técnica de Southern como a través de una PCR para detectar a los fundadores transgénicos (F_{0}) y a su progenie (F_{1} y F_{2}).

Estudios patológicos

Se sacrifican, mediante asfixia producida por CO_{2}, los distintos animales F_{0}, F_{1} y F_{2} que portan el transgen microinyectado y se los analiza inmunohistológicamente en busca de placas neuríticas y nódulos neurofibrlares (NNFs) en el cerebro. Se fijan los cerebros de ratones y de ratas de cada una de las líneas transgénicas con paraformaldehído al 4% y se seccionan en un crióstato. Se tiñen las secciones con anticuerpos reactivos ante la APP y/o el B péptido. En segundo lugar, se usan los anticuerpos conjugados con fluorescina, rhodamina, peroxidasa del rábano picante o fosfatasa para detectar el anticuerpo primario. Estas pruebas permiten la identificación de las placas de amiloide y la regionalización de estas placas en áreas específicas del cerebro. Las placas cuyos tamaños van desde 9 a 50 \mum se producen, de forma característica, en los cerebros de los pacientes con EA, ubicándose en el córtex cerebral, pero también se pueden observar en la materia gris a mayor profundidad, incluyendo el núcleo de la amígdala, el cuerpo estriado y del diencéfalo. También se tiñen las secciones con otros anticuerpos de diagnóstico para las placas del Alzheimer, antígenos de reconocimiento como el Alz-50, tau, A2B5, neurofilamentos, enolasa específica de las neuronas, y otros que son característicos de las placas del Alzheimer (Wolozin y col., Science 232, 648 (1986); Hardy y Allsop, Trends in Pharm. Sci. 12, 383-388 (1991); Selkoe, Ann. Rev. Neurosci. 12, 463-490 (1989); Arai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2249-2253 (1990); Majocha y col., Amer. Assoc. Neuropathology Abs; 99, 22 (1988); Masters y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 4245-4249; Majocha y col., Can J. Biochem Cell Biol 63; 577-584 (1985). También se lleva a cabo la tinción con tioflavinas y Rojo congo para analizar la co-localización de los depósitos de \beta péptido dentro de las placas neuríticas y los NNFs.

Análisis de la expresión de la APP y del \beta péptido

ARNm: se aisla el ARNm por medio del método de extracción ácida del tiocianato de guanidina fenol-cloroformo (Chomczynsky y Sacchi, Anal Biochem 162; 156-159 (1987) a partir de los linajes celulares y de los tejidos de animales transgénicos para así determinar los niveles de expresión por medio de las técnicas de Northern.

Proteína: Se detectan la APP y el \beta péptido usando los anticuerpos policlonales y monoclonales que son específicos para el dominio extra-citoplásmico, la región del \beta péptido, y el C-terminal.

Análisis con la técnica de Western: Se aislan las fracciones proteínicas de homogeneizados de tejido y de lisados celulares y se someten al análisis de transferencia de Western según describen Harlow y col., Antibodies: A laboratory manual, (Cold Spring Harbor, NY, 1988); Brown y col. J. Neurochem; 40: 299-308 (1983); y Tate-Ostroff y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 86; 745-749 (1989). A continuación sólo se hace una breve descripción.

Se desnaturalizan las fracciones de las proteínas con tampón de muestra de Laemmli y se las somete a electroforesis en geles de SDS-Poliacrilamida. Se transfieren luego las proteínas a filtros de nitrocelulosa por medio de electrotransferencia. Se bloquean los filtros, se incuban con anticuerpos primarios, y finalmente se los hace reaccionar con anticuerpos secundarios conjugados con enzimas. La posterior incubación con el sustrato cromogénico adecuado revela la posición de las proteínas APP.

Estudios patológicos y del comportamiento Estudios patológicos

Se lleva a cabo la inmunohistología y la tinción con tioflavina S tal y como se describe en este mismo documento.

Hibridaciones in situ : Se usan sondas radioactivas o etiquetadas enzimáticamente para detectar in situ el ARNm. Las sondas están graduadas a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud para una mejor penetración de las células. Más abajo, se describe brevemente el procedimiento de Chou y col., J. Psych. Res. 24; 27-50 (1990) para muestras fijadas e incluidas en parafina, a pesar de que se pueden emplear procedimientos similares a éste con muestras seccionadas de material congelado. Se desenceran con xileno los portaobjetos de parafina para la hibridación in situ, y se los rehidrata por medio de una serie graduada de etanoles y finalmente se enjuagan con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Posteriormente se fijan las secciones en fresco con paraformaldehido al 4%. Se lavan dos veces los portaobjetos con PBS durante 5 minutos para quitar el paraformaldehido. Luego, se permeabilizan las secciones por medio de un tratamiento con 20 \mum/ml de solución de proteinasa K. Se vuelven a fijar las secciones con paraformaldehido al 4%, y se acetilan las moléculas básicas que pueden dar lugar a un aglutinamiento en el fondo de la sonda, con una solución 0,1M de trietanolamina, 0,3 M de anhidrido acético durante 10 minutos. Se lavan los portaobjetos en PBS, luego se los deshidrata con una serie graduada de etanoles y se los seca al aire. Las secciones se hibridan usando una sonda de antiflujo, utilizando una sonda de flujo como control. Después del lavado apropiado, se detectan las sondas cebadas radiactivas mediante autoradiografía o se detectan las sondas etiquetadas enzimáticamente mediante la reacción con los sustratos cromogénos adecuados.

Estudios del comportamiento

Se emplean tests de comportamiento para evaluar los déficits en la capacidad de aprendizaje y en la memoria. Un ejemplo de dichos tests es el de los laberintos de Morris Water (Morris, Learn Motivat, 12; 239-260 (1991). En este procedimiento, se coloca al roedor en una piscina circular llena de agua con una plataforma de escape sumergida exactamente debajo de la superficie del agua. Se coloca un marcador visible en la plataforma de manera que el roedor pueda encontrarlo navegando hacia una referencia visual próxima. Alternativamente, se dará a los roedores una forma del test más compleja, en la cual no hay referencias formales que indiquen la ubicación de la plataforma. De esta forma, el roedor debe aprender la ubicación de la plataforma en relación con las referencias visuales distales.

Los procedimientos que se aplican para testar a las ratas transgénicas son similares a los usados para los ratones transgénicos.

Selección de compuestos para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer

Se usan las células de roedores y de mamíferos transgénicos para evaluar compuestos, investigando su efecto potencial en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y utilizando para ello la metodología estándar. Se le administra el compuesto a los roedores, o se introduce en el medio de cultivo, durante un período de tiempo y en diferentes dosificaciones, se examinan luego las células de roedores o de mamíferos buscando alteraciones en la expresión de la APP, en la histopatología o en el comportamiento utilizando para ello los procedimientos descritos anteriormente.

Ejemplo 1 Expresión del pMTAPP-1 en células NIH3T3 y PC12

El clon pMTAPP-1 es un ejemplo de vector de expresión, que se muestra en la Fig. 1a, donde el promotor usado es el promotor de la metalotionina. Los linajes de células establecidos han sido obtenidos por medio de la transfección de los llnajes celulares NIH3T3 y PC12 (ATCC#CCL92 y CRL1721). Se extienden 0.5 x 10^{6} células en placas de
100 mm y se las transfecta con una mezcla de 5 mg del fragmento SalI y 1 mg de ADN del pSV2neo (46) precipitado en presencia de 50 mg. de lipofectina (Gibco, BRL) con un volumen final de 100 \mul. Se usaron placas recubiertas de polilisina para las células PC12, ya que normalmente no se adhieren bien a las placas de cultivo de tejidos. Las células se nutrieron con un medio de selección que contenía un 10% de suero fetal bovino en DMEM o RPMI y un suplemento de G418. Se usaron quinientos mg/ml (peso biológico) y 250 mg/ml de G418 para seleccionar células de las formas de colonia NIH3T3 y PC12, respectivamente. Quince días después de la transfección, se aislaron las colonias de células resistentes al G418 usando aros de clonación y expandiéndolas en probetas. Se detectó la presencia de ADNc de la APP en las células por medio de una PCR, utilizando el procedimiento de Mullis y Faloona, Methods Enzymol, 155; 335-350 (1987).

Se analizó mediante inmunotinción la expresión de la APP en 25 colonias de cada linaje celular (Majocha y col. 1988). Se cultivaron las células hasta la subconfluencia y se las fijó en una solución que contenía un 4% de paraformaldehído, 0,12 M de NaCl y 20 mM de Na_{3}PO_{4}, con un pH7.Se incubaron durante toda la noche con un anticuerpo monoclonal primario contra una secuencia de \beta péptido sintético (Masters y col., 1985) proporcionado por el Dr. Ronald Majocha, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, seguido por un anticuerpo antiratón conjugado con biotina (Jackson InmunoResearch Labs, PA). Luego se llevó a cabo una inmunotinción por medio de la adición de peroxidasea de avidina-rábano picante (HRP) (Vector Labs, Burlingame, CA) y diaminobencidina como cromógeno (Majocha y col. 1985). Los resultados indicaron que el vector pMTAPP-1 expresaba la APP tanto en las células NIH3T3 como en las PC12.

Ejemplo 2 Expresión del pEAPP-1 en células PC12

El pEAPP-1es un ejemplo del promotor del gen humano de la APP de 25 kb enlazado a, y controlando la expresión de, el ADNc humano de la APP770, tal y como se muestra en la construcción de la Figura 1a. El ADN de esta construcción fue transfectado en células PC12 como se describe más arriba. Algunos clones de las células transfectadas con pEAPP-1 mostraban una diferenciación del fenotipo morfológicamente similar a la mostrada por las células PC12 tratadas con el factor de crecimiento nervioso (NGF). Las células PC12 normalmente son células completamente redondas y planas. Las que habían sido trasnfectadas con pEAPP-1 tienen prolongaciones citoplasmáticas que las asemejan a las neuritas. Las células PC12 tratadas con NGF presentan extensiones neuríticas sumamente largas. Se seleccionaron y se propagaron trece clones de células PC12 transfectadas con pEAPP-1.Ocho de esos clones celulares mostraron el fenotipo espontáneo de diferenciación, con los clones 1-8, 1-1, y 1-4 mostrando los fenotipos más evidentes. La tinción de células PC12 transfectadas con pEAPP-1con un anticuerpo contra el \beta péptido tal y como se ha descrito, indicó que aquellas células que mostraban la diferenciación también expresaban la APP. Dado que las células PC12 transfectadas con el clon pMTAPP1 no mostraban este fenotipo, incluso cuando se expresaba el ADNc de la APP770, estos resultados sugieren que la expresión de la APP770 del promotor humano tiene nuevas propiedades en lo que se refiere a la fisiología de la célula.

Ejemplo 3 Expresión del pMTA4 en células PC12

El pMTA4 es un ejemplo del tipo de construcción que se muestra en la Figura 4a, donde el promotor utilizado es el promotor de la metalotionina. La proteína codificada en esta construcción difiere ligeramente de la representada en la Figura 4. Se digirió un clon de ADNc de la APP770 con Asp718 el cual divide después de la posición 56 (sistema numérico de Kang y col., 1987). La 5ª extensión resultante se completó utilizando la enzima de Klenow (Maniatis). Se escindió la misma preparación de ADN con EcoRI, que también corta después de la posición 1795 y la 5ª extensión resultante se completó utilizando la enzima de Klenow (Maniatis). La auto-ligadura de esta molécula da como resultado un clon de expresión en el cual la proteína truncada y por lo tanto codificada, contiene la secuencia líder seguida por una versión acortada del \beta péptido que comienza con la secuencia phe-arg-val-gly-ser-of del B péptido, seguida por los 56 aminoácidos terminales de la APP. El ADN de esta construcción es transfectado en células PC12 según se ha descrito.

Ejemplo 4 Generación de ratones transgénicos que expresan la APP bajo el control del promotor MT-1

Se obtuvieron los ratones transgénicos por medio de una microinyección del vector pMTAPP1 del ADN en embriones pronucleares de ratón. El pMTAPP1 es un ejemplo del tipo de construcción que aparece en la Fig. 1a, el cual está ligado operativamente al promotor de la metalotionina. Los procedimientos para la microinyección en los embriones de ratón se describen en "Manipulating the mouse embryo", por B. Hogan y col. (1986). Más abajo se da únicamente una breve descripción de los procedimientos a emplear.

Los ratones se obtuvieron de Taconic Laboratories (German Town, Nueva York). Se usaron hembras de Swiss Webster para la recuperación e implantación de embriones. Se usaron B6D2F_{1} para el apareamiento y Swiss Webster vasectomizados como sementales para simular la pseudopreñez.

Recuperación de embriones de ratón: Se indujo a superovular a hembras de ratón de entre 4 a 8 semanas de edad, usando 5 UI de suero de gonadotropina de yegua preñada (PSMG; Sigma) seguido, 48 horas después, por 5 UI de gonadotropia coriónica humana (hCG; Sigma). Las hembras se pusieron con machos inmediatamente después de la inyección con hCG. Se recogieron los embriones de ratón de los oviductos abiertos de las hembras apareadas, 21 horas después de la hCG, colocándolos en solución salina tampón fosfato de Dulbecco con un 0,5% de suero de albúmina bovina (BSA: Sigma). Se quitaron los cúmulos de células circundantes con hialuronidasa (1mg/ml). Luego se lavaron los embriones de ratón pronucleares, se los colocó en una solución salina equilibrada de Earle conteniendo un 0,4% de BSA (EBSS) y en una incubadora a 37,5ºC, con una atmósfera humidificada con un 7% de CO_{2}, un 5% de O_{2}, y un 88% de N_{2} hasta el momento de la inyección.

Microinyección: Para la microinyección, se disolvió ADN Sal1 purificado Elutip-D^{TM} en 5mM de Tris (pH 7,4) y 0,1 mM de EDTA a una concentración de 3\mug/ml. Se extrajeron microagujas y pipetas de porte de tubos de coagulación de Fisher (Fisher) de un extractor de pipetas DKI modelo 720. Se rompieron luego las pipetas de porte a aproximadamente 70\mum (O.D.) y se las pulió a fuego hasta un I.D. de alrededor de 30\mum en una microforja Narishige (modelo MF-83). Se montaron las pipetas en micromanipuladores Narishige que se sujetaron a un microscopio Nikon Diaphot. Se llenó la pipeta de inyección rellena de aire con una solución de ADN a través de su punta, después de romper la punta contra la pipeta de porte. Se colocaron los embriones de ratón, en grupos de 30 a 40, en gotas de
100 \mul de EBBS bajo aceite de parafina para la micromanipulación. Se orientó y se sostuvo un embrión de ratón con la pipeta de porte. Se insertó entonces la pipeta de inyección en el pronúcleo del macho (normalmente el más grande). Si la pipeta no podía abrirse paso a través de la membrana de forma inmediata, se golpeaba suavemente la plataforma para ayudar a la penetración. Se inyectaba entonces el núcleo y se controlaba la inyección a través de la inflamación del núcleo. Enseguida de la inyección, el grupo de embriones de ratón se colocaba en EBSS hasta su transferencia a las hembras receptoras.

Transferencia: Se aparearon hembras adultas con ciclos aleatorios con machos Swiss Webster vasectomizados. En el momento de la tranferencia, se anestesiaba a las hembras con avertin. Se dejaron expuestos los oviductos por medio de una única incisión en la línea media dorsal. Se hizo luego una incisión a través del cuerpo directamente sobre el oviducto. Se rasgó posteriormente la bolsa ovárica con pinzas de relojero. Los embriones de ratón a transferir se colocaron en DPBS y en la punta de una pipeta de porte (alrededor de 10-12 embriones). La punta de la pipeta se insertó en el infundíbulo y se transfirieron los embriones de ratón. Después de la transferencia, se cerró la incisión con dos suturas.

Análisis de los ratones para la integración transgénica: Se extrajeron las muestras de la cola, de alrededor de 1 cm. de longitud, para analizar el ADN, a las tres semanas de edad. Las muestras de cola fueron digeridas mediante incubación con vibración durante toda la noche a 55ºC, en presencia de 0,7 ml de Tris 5mM, con un pH 8,0, EDTA 100 mM, 0,5% de SDS y 350 \mug de proteinasa K. El material digerido fue extraído una vez con un volumen igual de fenol y otra con un volumen igual de fenol-cloroformo (mezcla 1:1). Las sustancias sobrenadantes se mezclaron con 70 \mul de acetato de sodio 3 M (0,6 pH) y se precipitó el ADN agregando un volumen igual de etanol al 100%. Los ADNs fueron centrifugados en una microcentrífuga, lavados una vez con un 70% de etanol, secados y disueltos en 100 \mul de tampón TE (Tris 10 mM, pH 8,0, y EDTA 1 mM).

Se redujeron 10-20 \mul de ADN con BamHI, se los sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1%, se los trasladó a papel de nitrocelulosa, y se los hibridó con un fragmento etiquetado^{-32p} de ADNc de la APP. Se identificaron los animales transgénicos mediante auto-radiografía de los filtros de nitrocelulosa hibridados. Se analizaron también los ADNs mediante una PCR llevada a cabo con cebadores sintéticos para generar un fragmento de 800 bp.

Se microinyectaron un total de 671 embriones pronucleares de ratón, de los cuales nacieron 73 crías vivas y 6 muertas. El análisis del ADN permitió identificar 9 ratones transgénicos (5 hembras y 4 machos) que fueron criados para generar animales transgénicos F_{1} y F_{2}. Estos animales se pueden analizar para encontrar la expresión del ARNm y de la proteína APP en diferentes tejidos y para detectar las alteraciones en el comportamiento y las anormalidades histopatológicas descritas anteriormente.

Claims (13)

1. Una célula transgénica de roedor, o de mamífero, que contenga una construcción genética que comprenda un promotor ligado operativamente a una combinación de ADNc/clon de expresión genómica,

en donde dicho clon de expresión contenga una secuencia de ADNc que codifique la APP770, o una secuencia de ADNc que codifique la APP770 con una mutación que se produzca de forma natural,

en donde una secuencia genómica del ADN de la APP, que conste del exón 6 y de una determinada cantidad del intrón adyacente en sentido descendente, que sea suficiente como para cortar y empalmar la región codificadora del Kl y del OX-2 y una cierta cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficientes para el corte y empalme, y el exón 9 y una cierta cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme, sea sustituida en la región correspondiente de la secuencia del ADNc que codifique la APP770, o del ADNc que codifique la APP770 con una mutación que se produzca de forma natural, y

en donde la construcción sea transcripta y cortada y empalmada alternativamente en las células de mamíferos para formar moléculas de ARNm que codifiquen y se traduzcan en APP695, APP751 y APP770.

2. Las células transgénicas de roedores o mamíferos, de la Reivindicación 1 en donde el promotor sea seleccionado de entre el grupo que consta de: el promotor humano de la APP, el promotor en ratones de la APP, el promotor en ratas de la APP, el promotor de la metalotionina, el promotor específico de la enolasa neuronal de la rata, el promotor del gen de la \beta actina, el promotor del gen de la cadena del factor de crecimiento humano derivado de las plaquetas B (PDGR-B), el promotor del gen del canal de sodio de la rata, el promotor del gen de la proteína básica de la mielina de los ratones, el promotor del gen humano de la superóxido dismutasa cobre-zinc, y el promotor del gen regulador del dominio POU de los mamíferos.

3. Las células transgénicas de roedor, o de mamífero, de la Reivindicación 1 en donde la construcción esté integrada en el cromosoma de la célula del roedor o del mamífero.

4. Las células cultivadas a partir del ratón transgénico de la Reivindicación 3.

5. El roedor de la Reivindicación 1 en donde el codón que codifica el residuo de la valina en el punto 717 de la proteína del tipo común de la APP770 ha sido mutado para codificar un amioácido seleccionado del grupo consistente en: ile, phe, gly, leu, ala, pro, trp, met, ser, thr, asn, y gin.

6. El roedor de la Reivindicación 1 en donde el promotor es el promotor de la APP de las mismas especies de origen que en el roedor.

7. Un método para hacer un modelo transgénico de la enfermedad de Alzheimer que comprenda la introducción en las células de roedor, o en embriones de roedor, de una construcción genética que incluye un promotor ligado operativamente a una combinación de ADNc/clon genómico de expresión

en donde dicho clon de expresión contiene una secuencia del ADNc que codifica la APP770, o una secuencia de ADNc que codifica la APP770 con una mutación producida de forma natural,

en donde una secuencia genómica del ADN de la APP, que consista en el exón 6 y una cantidad del intrón adyacente en sentido descendente suficiente para el corte y empalme, la región de codificación del Kl y del OX-2 y una cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficientes para el corte y empalme, y el exón 9 y una cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme, hayan sido sustituidos en la región correspondiente de la secuencia del ADNc que codifica la APP770, o del ADNc que codifica la APP770 con una mutación que se ha producido naturalmente, y

en donde la construcción se transcribe y se corta y empalma de forma alternativa en células de mamíferos para formar moléculas de ARNm las cuales codifican y son traducidas en APP695, APP751 y APP770.

8. El método de la Reivindicación 7 en donde el modelo transgénico es un roedor con alteraciones en su comportamiento.

9. Un método para comprobar la utilidad de un compuesto en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que incluya la determinación en una célula de roedor, o de mamífero, transgénico que haya sido expuesta al compuesto a probar y teniendo integrada en el cromosoma una construcción genética,

en donde la construcción comprenda un promotor ligado operativamente a una combinación de ADNc/clon de expresión genómica, en donde dicho clon de expresión contenga la secuencia de ADNc que codifique la APP770 o un ADNc que codifique la APP770 con una mutación que se ha producido de forma natural,

en donde una secuencia genómica del ADN de la APP consistente en el exón 6 y una cantidad del intrón adyacente en sentido descendente suficiente para el corte y empalme, las regiones de codificación del Kl y el OX-2 y una cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficientes para el corte y empalme, y el exón 9 y una cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme es sustituido en la secuencia del ADNc que codifique la APP770, o en la secuencia del ADNc que codifica la APP770 con una mutación producida naturalmente, y

en donde la construcción esté transcripta y cortada y empalmada de forma alternativa en la célula del roedor o del mamífero para formar ARNm el cual se traduce en APP695, APP751 y APP770.

si hay una expresión o procesado modificados de la APP, en donde la presencia de la expresión o el procesado alterados de la APP sea indicativa de un efecto del compuesto sobre la enfermedad de Alzheimer.

10. El método de la Reivindicación 9, utilizando roedores transgénicos que comprenda, además, la determinación de si los roedores transgénicos presentan alteraciones histopatológicas, o en su comportamiento, después de la administración del compuesto.

11. Una construcción genética que comprenda un promotor ligado operativamente a una combinación ADNc/clon genómico de expresión, en donde el clon de expresión comprenda una secuencia de ADNc que codifique la APP770, o la APP770 que incluya una mutación producida de forma natural, en donde una secuencia genómica del ADN de la APP que conste del exón 6 y de una cantidad del intrón adyacente en sentido descendente suficiente para el corte y empalme, la región de codificación del Kl y el OX-2 y una cantidad de cada uno de sus intrones en sentido ascendente y descendente suficiente para el corte y empalme, y el exón 9 y una cantidad del intrón adyacente en sentido ascendente suficiente para el corte y empalme, esté substituido en la secuencia del ADNc que codifica la APP770, o de la APP770 que incluya una mutación producida de forma natural, y en donde la construcción se transcribe y corta y empalma de forma alternativa en células de mamíferos para formar moléculas de ARNm las cuales codifican a, y se traducen en, la APP695, la APP751 y la APP770.

12. Una construcción genética conforme a la Reivindicación 11 en donde el promotor se selecciona de un grupo en el que figuren el promotor humano de la APP, el promotor de la APP del ratón, el promotor de la APP de la rata, el promotor de la enolasa específica de la neurona de la rata, el promotor del gen humano de la actina, el promotor del gen de la cadena del factor de crecimiento humano derivado de las plaquetas B (PDGF-B), el promotor del gen del canal de sodio de la rata, el promotor del gen de la proteína básica de la mielina del ratón, el promotor del gen humano de la superóxido dismutasa cobre-zinc, y el promotor del gen regulador del dominio POU en los mamíferos.

13. Una construcción genética conforme a la Reivindicación 11 en donde la construcción es capaz de integrarse en el cromosoma de la célula de mamífero.